BRPI0809600B1 - Vírus atenuado útil para vacinas - Google Patents

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influenza
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Skiena Steve
Mueller Steffen
Futcher Bruce
Papamichail Dimitris
Robert Coleman John
Jeronimo Cello
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The Research Foundation Of State University Of New York
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Abstract

VÍRUS ATENUADO ÚTIL PARA VACINAS. Esta invenção fornece um vírus atenuado que inclui um genoma viral modificado contendo substituições de nucleotídeos montadas em múltiplos locais do genoma, em que as substituições introduzem códons sinônimos desotimizados no genoma. O vírus atenuado instantâneo pose ser usado em uma composição de vacina para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente. A invenção também fornece um método para sintetizar o vírus atenuado instantâneo. Além disso, esta invenção fornece um método para evitar que um paciente seja afligido por uma doença associada a vírus incluindo a administração de uma dose profilaticamente eficaz da composição de vacina incluindo o vírus atenuado instantâneo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA APLICAÇÕES RELACIONADAS
Esta inscrição reivindica prioridade sobre a Inscrição U.S. n° 60/909.389 encaminhada em 30 de março de 2007 e Inscrição U.S. n° 61/068.666 encaminhado em 7 de março de 2008, as quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
FINANCIAMENTO FEDERAL
A invenção foi feita com apoio do Governo dos Estados Unidos sob a Concessão n° AI15122 do Instituto Nacional de Saúde, EIA0325123 da Fundação Nacional de Ciência e T32-CA009176 do Instituto Nacional do Câncer. Dessa forma, o Governo dos Estados Unidos possui certos direitos sobre esta invenção.
AVISO DE DIREITOS AUTORAIS
Uma parte da divulgação deste documento de patente contém material sujeito a proteção de direitos autorais. O proprietário dos direitos autorais não faz objeção à reprodução em fac-símile por qualquer pessoa do documento ou divulgação da patente da forma como aparece no arquivo ou registros do Escritório de Patentes e Marcas Registradas, mas de resto reserva todos os direitos autorais.
ÁREA DA INVENÇÃO
A presente invenção se relaciona à criação de um vírus atenuado incluindo um genoma virai modificado contendo uma diversidade de substituições de nucleotídeos. As substituições de nucleotídeos resultam em uma troca de códons por outros códons sinônimos e/ou recomposição e variação de viés de par de códons.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os aperfeiçoamentos rápidos na tecnologia de síntese de DNA prometem revolucionar os métodos tradicionais utilizados na virologia. Uma das abordagens tradicionais usadas para eliminar as funções das diferentes regiões do genoma virai faz extenso mas laborioso uso da mutagênese dirigida ao local para explorar o impacto das pequenas variações de sequência dos genomas nas estirpes de vírus. No entanto, os genomas virais, especialmente de vírus de RNA, são relativamente curtos, muitas vezes com comprimento menor do que 10.000 bases, tornando-os receptivos a toda a síntese de genoma que utiliza a tecnologia atualmente disponível. As tecnologias microfluídicas recentemente desenvolvidas com base em chips podem realizar a síntese "de novo" em novos genomas projetados de acordo com a especificação por apenas algumas centenas de dólares cada um. Isso permite a geração de sequências de codificações totalmente novas ou a modulação de sequências existentes a um grau praticamente impossível com métodos tradicionais de clonagem. Tal liberdade de definição proporciona uma grande capacidade de redefinição em larga escala das sequências de codificação para: (1) estudar o impacto de mudanças em parâmetros tais como viés de códon, viés de par de códons e estrutura secundária de RNA na eficiência da tradução e replicação virai; (2) efetuar varreduras completas e eficientes de genomas em busca de elementos regulatórios desconhecidos e outros sinais necessários para uma reprodução virai bem sucedida; e (3) desenvolver novas biotecnologias para engenharia genética de estirpes virais e definição de vacinas antivirais.
Como consequência da degeneração do código genético, todos os aminoácidos menos dois na sequência de codificação de proteína podem ser codificados por mais de um códon. As frequências com que tais códons sinônimos são usados são desiguais e coevoluíram com o mecanismo de tradução da célula para evitar o uso excessivo de códons aquém do ideal que muitas vezes correspondem a tRNAs raros ou em desvantagem (Gustafsson et al., 2004). Isso resulta em um fenômeno denominado "viés de códons sinônimos", que varia bastante entre espécies evolutivamente distantes e possivelmente até mesmo em tecidos diferentes nas mesmas espécies (Plotkin et al., 2004).
A otimização de códon por métodos recombinantes (isto é, colocar o uso de códon sinônimo de um gene em correspondência com o viés de códon da célula hospedeira) tem sido muito usada para melhorar a expressão de espécies cruzadas (ver, por exemplo, Gustafsson et al., 2004). Embora o objetivo oposto de reduzir a expressão pela introdução intencional de códons sinônimos aquém dos ideais não tenha sido muito investigada, relatórios isolados indicam que a substituição de códons naturais por códons raros pode reduzir o nível de expressão de gene em diferentes organismos. Ver, por exemplo, Robinson et al., 1984; Hoekema et al., 1987; Carlini e Stephan, 2003; Zhou et al., 1999. Assim também, a introdução de códons sinônimos desotimizados em um genoma virai pode afetar negativamente a tradução de proteína e desta forma proporcionar um método para produzir vírus atenuados que seria útil para fazer vacinas contra doenças virais. Doença virai e vacinas.
Os vírus sempre foram uma das principais causas de morte e doenças no homem. Ao contrário de doenças bacterianas, as doenças virais não são suscetíveis a antibióticos, sendo assim mais difíceis de tratar. Desta forma, a vacinação tem sido a principal e mais robusta defesa da humanidade contra os vírus. Atualmente, algumas das mais antigas e graves doenças virais, tais como varíola e poliomielite (pólio) estão erradicadas (ou quase) por programas mundiais de imunização. No entanto, muitos outros vírus mais antigos, como rinovírus e influenza, são mal controlados e ainda criam problemas substanciais, embora tais problemas variem de ano para ano e de pais para país. Além disso, vírus novos, tais como o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) aparecem sistematicamente em populações humanas e com frequência causam pandemias fatais. Também existe potencial para vírus fatais criados ou alterados pelo homem, para introdução proposital como instrumento de guerra ou terrorismo.
A fabricação eficaz de vacinas continua sendo uma tarefa imprevisível. Existem três tipos principais de vacinas: vacinas subunitárias, vacinas inativadas (mortas) e vacinas vivas atenuadas. Para uma vacina subunitária, uma ou várias proteínas do vírus (por exemplo, uma proteína capsídea feita usando a tecnologia de DNA recombinante) são usadas como vacina. As vacinas subunitárias produzidas em Escherichia coli ou fermento são bastante seguras e não representam ameaça de doença viral. No entanto, sua eficácia pode ser baixa porque nem todas as proteínas virais imunogênicas estão presentes, e as que estão presentes podem não existir em suas conformações nativas.
Vacinas inativadas (mortas) são feitas pelo cultivo do vírus mais ou menos do tipo selvagem (wt) e depois o desativando, por exemplo, com formaldeído (como na vacina Salk contra pólio). É preciso muita experimentação para encontrar um tratamento de inativação que mate todos os vírus e ainda assim não prejudique a imunogenicidade da partícula. Além disso, permanecem problemas residuais de segurança no fato de que a facilidade para cultivar o vírus pode permitir que o vírus virulento escape ou que a inativação venha a falhar.
Uma vacina viva atenuada inclui um vírus que foi submetido a mutações, tornando-o menos virulento e utilizável para imunização. Vivos, os vírus atenuados têm muitas vantagens como vacinas: eles são frequentemente fáceis, rápidos e baratos de fabricar; eles são frequentemente fáceis de administrar (a vacina Sabin contra a pólio, por exemplo, era administrada por via oral em cubos de açúcar); e às vezes o crescimento residual do vírus atenuado permite imunização de "multidão" (imunização de pessoas em contato próximo com o paciente primário). Essas vantagens são particularmente importantes em uma emergência, quando uma vacina é necessária com urgência. A principal vantagem de uma vacina atenuada é que ela possui uma significativa frequência de reversão da virulência wt. Por esse motivo, a vacina Sabin já não é mais usada nos Estados Unidos.
Assim também, permanece uma necessidade de uma abordagem sistemática para vírus vivos atenuados que têm praticamente nenhuma possibilidade de reversão e desta forma proporcionam um método rápido, eficiente e seguro de fabricar uma vacina. A presente invenção satisfaz essa necessidade fornecendo uma abordagem sistemática, Engenharia de Vírus Atenuado Sintético (SAVE) para gerar vírus vivos atenuados que têm essencialmente nenhuma possibilidade de reversão porque contêm centenas ou milhares de pequenos defeitos. Este método é amplamente aplicável a uma larga gama de vírus e fornece uma abordagem eficaz para produzir uma ampla variedade de vacinas antivirais.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece um vírus atenuado que inclui um genoma virai modificado contendo substituições de nucleotídeos montadas em múltiplos locais do genoma, em que as substituições introduzem uma diversidade de códons sinônimos desotimizados no genoma. A substituição de códons sinônimos altera vários parâmetros, incluindo viés de códon, viés de par de códons, densidade de códons desotimizados e pares de códons desotimizados, estrutura secundária de RNA, teor de dinucleotídeo CpG, teor de C+G, locais de deslocamento do quadro de leitura na tradução, a presença ou ausência de sequências de reconhecimento de microRNA específico de tecido, ou qualquer combinação dos anteriores no genoma. Em razão do grande número de defeitos envolvidos o vírus atenuado da invenção fornece um meio de produzir vacinas vivas atenuadas de forma estável contra uma ampla variedade de doenças virais.
Em uma configuração, é fornecido um vírus atenuado que inclui uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína virai ou parte dela que seja idêntica à sequência correspondente de um vírus matriz, em que a sequência de nucleotideos do vírus atenuado contém os códons de uma sequência matriz da qual é derivado, e onde a sequência de nucleotideos é menos de 90% idêntica à sequência de nucleotideos do vírus matriz. Em outra configuração, a sequência de nucleotideos é menos de 80% idêntica à sequência do vírus matriz. A sequência de nucleotideos substituídos que proporciona a atenuação tem pelo menos 100 nucleotideos de comprimento, ou pelo menos 250 nucleotideos de comprimento, ou pelo menos 500 nucleotideos de comprimento, ou pelo menos 1000 nucleotideos de comprimento. O viés de par de códons da sequência atenuada é menor do que o viés de par de códons do vírus matriz e é reduzido em pelo menos cerca de 0,05 ou pelo menos cerca de 0,1 ou pelo menos cerca de 0,2.
O vírus a ser atenuado pode ser de animal ou planta. Em certas configurações, o vírus é humano. Em outra configuração, o vírus infecta múltiplas espécies. Certas configurações incluem, mas sem limitação, vírus de poliomielite, vírus influenza, vírus da Dengue, HIV, rotavirus e SARS.
Esta invenção também fornece uma composição de vacina para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente contendo o vírus atenuado e um portador farmaceuticamente aceitável. A invenção ainda fornece uma linha de célula hospedeira modificada especialmente preparada para permitir um vírus atenuado que é inviável numa célula hospedeira de tipo selvagem.
Além disso, a invenção fornece um método para sintetizar o vírus atenuado instantâneo incluindo (a) a identificação dos códons em múltiplas localizações em pelo menos uma parte não reguladora do genoma virai, códons os quais podem ser substituídos por códons sinônimos; (b) seleção de um códon sinônimo a ser substituído por cada um dos códons identificados; e (b) substituição de um códon sinônimo por cada um dos códons identificados.
Além disso, a invenção fornece um método para sintetizar o vírus atenuado instantâneo incluindo a mudança da ordem, dentro da região de codificação, de códons existentes que codificam o mesmo aminoácido para modular o viés de par de códons.
Ainda além disso, a invenção fornece um método para sintetizar o vírus atenuado instantâneo que combina os dois métodos anteriores.
De acordo com a invenção, as partículas do vírus atenuado são feitas pela transfecção dos genomas virais em células hospedeiras, onde são produzidas as partículas de vírus atenuado. A invenção fornece ainda composições farmacêuticas incluindo vírus atenuados que são adequados para imunização.
Esta invenção fornece ainda métodos para provocar uma resposta imunológica protetora em um paciente, para impedir que um paciente seja afligido por uma doença associada a vírus, e para atrasar o início, ou retardar o índice de progressão, de uma doença associada a vírus em um paciente infectado por vírus, incluindo a administração no paciente de uma dose profilaticamente ou terapeuticamente eficaz da composição da vacina instantânea.
A presente invenção fornece ainda um vírus atenuado que inclui um genoma virai modificado contendo substituições de nucleotídeos montadas em múltiplos locais do genoma, em que as substituições introduzem uma diversidade de códons sinônimos no genoma, em que as substituições de nucleotídeos são selecionadas por um processo incluindo os passos de inicialmente criar uma sequência de codificação atribuindo aleatoriamente códons sinônimos em posições permitidas de aminoácidos respectivos, calculando um escore de par de códons da sequência de codificação selecionando aleatoriamente e trocando ou (a) os pares de códons que codificam os mesmos aminoácidos ou (b) os códons sinônimos substitutos de acordo com uma função de otimização de arrefecimento simulado e repetindo o passo anterior até que não se observe melhoria adicional (nenhuma mudança no escore ou viés de pares) para um número específico ou suficiente de iterações, até que a solução convirja para um valor ótimo ou próximo do ótimo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Estatística de uso de códon em definições sintéticas de capsideo P1. O PV-SD mantém frequências de códon quase idênticas em comparação ao wt, enquanto maximiza as mudanças de posição de códon dentro da sequência. Em capsídeos PV-AB, o uso de códons não preferenciais foi maximizado. Os comprimentos das barras e os números atrás de cada barra indicam a ocorrência de cada códon na sequência. Como referência, são fornecidas as frequências normais de códon sinônimo humano ("Freq." expressa como percentual) para cada aminoácido na terceira coluna.
Figura 2. Alinhamento de sequência de PV(M). Regiões de codificação de capsideo PV-AB e PV-SD. As sequências de nucleotídeos de PV(M) (SEQ ID NO:1), PV-AB (SEQ ID NO:2) e PV-SD (SEQ ID NO:3) foram alinhadas usando a ferramenta de software on-line MultAlin. Os números acima da sequência se referem à posição dentro da sequência de capsídeo. O nucleotídeo 1 corresponde ao nucleotídeo 743 no genoma de vírus PV(M). Na sequência de consenso, a ocorrência do mesmo nucleotídeo em todas as três sequências é indicada por uma letra em caixa alta; a ocorrência do mesmo nucleotídeo em duas das três sequências é indicada por uma letra em caixa baixa; e a ocorrência de três diferentes nucleotideos nas três sequências é indicada por um ponto.
Figura 3. Fenótipos de vírus desotimizados em códon. (A) Visão geral das construções de vírus utilizadas neste estudo. (B) Cinética de crescimento de um passo nas monocamadas de célula HeLa. (C a H) Fenótipos de placa de vírus desotimizados em códon após 48 h (C a F) ou 72 h (G e H) de incubação; tingidas com anticorpo anti-SD1301 para visualizar as células infectadas. (C) PV(M), (D) PV- SD, (E) PV-AB, (F) PV-AB755"1513, (G e H) PV-AB2470"2954. As áreas de placa limpas estão contornadas por um aro de células infectadas (C e D). (H) Não há placas aparentes com PV-AB2470" 2954 após o tingimento com violeta cristal do poço mostrado no quadro G. (I e J) Microfotografias da borda de uma placa imunocorada produzida por PV(M) (I) ou um foco infectado produzido por PV-AB2470"2954 (J) após 48 h de infecção.
Figura 4. A desotimização de códon leva a uma redução da infectividade específica. (A) Eletroforese em gel de agarose do RNA genômico de vírion isolado a partir de partículas purificadas de vírus de PV(M) (caminho 1), PV-AB755"1513 (caminho 2) e PV- AB2470”2954 (caminho 3). (B) Proteína em gel SDS-PAGE tingida de prateado de partículas de vírus purificadas PV(M) (caminho 1), PV-AB755"1513 (caminho 2) e PV- AB2470" 2954 (caminho 3). As três maiores das quatro proteínas capsídeas (VP1, VP2 e VP3), demonstrando a pureza e as quantidades relativas de preparações de vírus. (C) Desenvolvimento de uma captura de vírus ELISA usando sonda de proteína de fusão (CD155-AP) receptora de vírus de poliomielite-fosfatase alcalina. Foram usados anticorpos específicos de vírus para revestir as placas de ELISA, e foram aplicadas amostras contendo uma concentração de vírus desconhecida seguida pela detecção com CDI 55-AP. As concentrações de vírus foram calculadas usando uma curva padrão preparada em paralelo com quantidades conhecidas de vírus wt (E) purificado. (D) As quantidades de vírus purificado e RNA de vírion extraído foram quantificadas por método espectrofotométrico e foi calculado o número de partículas ou equivalentes de genoma (1 genoma=1 vírion). Além disso, foram determinadas as concentrações de vírion por ELISA. A titragem contagiosa de cada vírus foi determinada por ensaio de placa/foco infectado, e a infectividade específica foi calculada como PFU/partícula ou FFU/particula.
Fig. 5. Tradução in vitro dos vírus desotimizados em códon e do tipo selvagem. O fenótipo PV-AB é determinado ao nível de tradução do genoma.(A) Uma tradução padrão in vitro no extrato HeLa S10, na presença de aminoácidos e tRNAs acrescentados de forma exógena, não revela diferenças nas capacidades de tradução de genomas desotimizados em códon em comparação com o PV(M) wt. Mostra uma autorradiografia de produtos de tradução rotulados [35S]metionina resolvidos em gel SDS-PAGE 12,5%. Não é mostrada a identidade de uma banda aberrante(*).(B) A tradução in vitro de um extrato HeLa S10 não dialisado sem a adição de aminoácidos e tRNA exógenos e na presença de mRNAs celulares concorrentes revela um defeito nas capacidades de tradução dos genomas PV desotimizados em códon. Mostra um Western blog de produtos de tradução 2C reativos a vírus de poliomielite (2CATPasθ,2BC e P2) resolvidos em gel SDS-PAGE 10%. As quantidades relativas dos produtos de tradução 2BC são expressas abaixo de cada caminho como percentuais da banda wt.
Fig 6. Análise da trad, in vivo em replicons indicadores dicistrônicos confirma o efeito prejudicial da desotimização de códon na tradução PV. (A) Esquema de replicons dicistrônicos. Várias sequências de codificação de capsideo P1 foram inseridas no gene de luciferase de vaga-lume (F-luc). As determinações dos níveis em mudança da expressão F-Luc em relação a um controle interno (R-Luc) permitem a quantificação do deslocamento de ribossomo através da região de capsideo P1. (B) Os RNAs de replicon foram transfectados em células HeLa e incubados por 7 h na presença de hidrocloreto de guanidina para bloquear a replicação de RNA. A taxa relativa de tradução através da região P1 foi inversamente proporcional à extensão da desotimização de códon. Enquanto as sequências de codificação capsídeas de duas construções viáveis de vírus, PV-AB2470"2954 e PV-AB2954"3388, permitem entre 60 e 80% de tradução wt, a eficiência de tradução abaixo de 20% é associada aos fenótipos letais observados com genomas PV-AB, PV-AB2470"3386 e PV-AB1513'2470. Os valores representam a média de 6 ensaios de 3 experimentos diferentes.
Figura 7. Determinação de viés de par de códons de ORFs humanos e virais. Os pontos representam a média de escore de par de códons por par de códons para um ORF traçado contra seu comprimento. O viés de par de códons (CPB) foi calculado para 14.795 genes humanos anotados. Pares de códons subrepresentados geram escores negativos. O CPB é representado para diversas construções P1 de vírus de poliomielite, representadas por símbolos com setas. A figura ilustra que a maior parte dos genes humanos se aglomera em torno de 0,1. É mostrado o CPB para PV(M)-Wt (rotulado "WT") (-0,02), PV-Max (+0,25) de capsídeos de vírus de poliomielite sintéticos customizados, PV-Min (-0,48) e PV(M)-wt:PV-Min capsídeos de quimera PV-Min755"2470 (="PV-MinXY") (-0.31) e PV-Min2470"3386 (="PV-MinZ") (- 0.20). Os vírus PV-SD e PV-AB são o resultado do viés de códon alterado, mas viés de par de códons não alterado.
Figura 8. Características da pólio desotimizada de par de códons. A cinética de crescimento de um passo revela a produção de PFU para PV-Min755"2470 e PV- Min2470’3385 qUθ £ rθduzido à ordem de 2,5 ordens de magnitude em comparação com PV(M)-Wt. No entanto, todos os vírus produzem um número semelhante de partículas virais (não mostradas nesta Figura). Como resultado, a proporção PFU/partícula é reduzida, de forma semelhante aos vírus desotimizados em códon PV-AB755"1513 e PV-AB2470"2954 (ver Figura 3B) (PFU é "Unidade Formadora de Placa"). Figure 9. Montagem de genomas virais quiméricos. Para "varrer" através de um genoma alvo (vermelho) pequenos segmentos são amplificados ou sintetizados e introduzidos no genoma wt (preto) pelo PCR que se sobrepõe.
Figura 10.0 sistema pol l-pol II de oito plasmídeos para a geração do vírus de influenza A. Oito plasmídeos de expressão contendo os oito cDNAs virais inseridos entre o promotor de pol I humano e o promotor de pol II são transfectados para as celas eucarióticas. Como cada plasmídeo contém dois promotores diferentes, tanto o pol I e o pol II celulares irão transcrever o modelo de plasmídeo, presumivelmente em compartimentos nucleares diferentes, o que irá resultar na síntese dos mRNAs e vRNAs virais. Após a síntese das proteínas de complexo de polimerase viral (PBI, PB2, PA, nucleoproteínas), o ciclo de replicação virai é iniciado. Por fim, a montagem de todas as moléculas virais diretamente (transcrição de pol II) ou indiretamente (transcrição de pol I e replicação virai) derivada da transcrição virai e do mecanismo de tradução resulta na interação de todas as moléculas sintetizadas (vRNPs e as proteínas estruturais HA, NA, Ml, M2, NS2/NEP) para gerar o vírus de influenza A contagioso. (Reproduzido de Neumann et al., 2000.) (Observação: existem outras formas de sintetizar influenza "de novo").
Figura 11. Genoma virai de pólio e Construções Virais Sintéticas. O genoma do vírus de poliomielite e quadros de leitura aberta das construções de vírus quimérico. Acima, um esquema do RNA genômico PV(M)-Wt de comprimento total. Abaixo, os quadros de leitura aberta de PV(M)-Wt, os vírus sintéticos customizados por CPB PV-Max, PV-Min e os vírus de quimera PV(M)-wt:PV-Min. Preto corresponde à sequência PV(M)-Wt, cinza à sequência SINTÉTICO PV-Min e o Riscado à PV-Max. As construções virais destacadas, PV-Min755"2470 (PV-MinXY) e PV-Min2470 3385 (PV- MinZ) foram ainda caracterizadas em razão de um fenótipo marcadamente atenuado.
Figura 12. As curvas de crescimento de um passo mostram uma cinética semelhante, produzindo uma quantidade semelhante de partículas com infectividade diminuída. (A) Foi usada uma MOI de 2 para infectar uma monocamada de células HeLa RI 9, o PFU nos pontos de tempo indicados (0, 2, 4, 7, 10, 24, 48 horas) foi medido por ensaio de placa. Símbolos correspondentes: (□) PV(M)-Wt, (•) PV-Max, (0) PV-Min755-1513, (x) PV-Minl 513-2470, (♦) PV-MinXY, (Δ) PV-MinZ. (B) Mostra a conversão do PFU/ml calculado em cada ponto de tempo para partículas/ml. Isso se obtém multiplicando o PFU/ml pela infectividade específica dos vírus respectivos. Símbolos correspondentes como em (A).
Figura 13. Modulação in vivo da tradução pela alteração de CPB. (A) A construção dicistrônica de RNA usada para quantificar o efeito in vivo que o CPB tem na tradução. O primeiro cístron utiliza um Local de Entrada de Ribossomo Interno (IRES) de vírus de hepatite C (HCV) induzindo a tradução de Renilla Luciferase (R- Luc). O primeiro cístron é o controle interno usado para normalizar a quantidade de RNA de entrada. O segundo cístron controlado pelo PV(M)-Wt IRES induz a tradução de Luciferase de Vaga-lume (F-Luc). A região rotulada "P1" na construção foi substituída pelo cDNA de cada um dos respectivos vírus P1. (B) Cada construção de RNA respectiva foi transfectada, na presença de 2mM de hidrocloreto de guanidina, em células HeLa RI 9 e após 6 horas foram medidos o R-Luc e F-Luc. Os valores de F-Luc/R-Luc foram normalizados em relação à tradução PV(M)-Wt (100%).
Figura 14. O perfil de inativação dos vírus sintéticos permanece inalterado. Para excluir a possibilidade de que a modificação do vies de par de códons de larga escala altere a morfologia bruta dos virions, como seria de se esperar se as proteínas capsídeas fossem dobradas incorretamente, foi testada a estabilidade térmica de PVMinXY e PV-MinZ. Um número igual de partículas foi incubado a 50°C e a infectividade remanescente quantificada após determinados períodos de tempo via ensaio de placa. Se os capsídeos dos vírus sintéticos fossem desestabilizados, esperaríamos um aumento na perda de viabilidade a 50°C em comparação com PV(M) wt. Não foi o caso. A cinética de inativação térmica de ambos os vírus sintéticos foi idêntica ao wt. Em contraste, o vírus Sabin-1 carrega diversas mutações na região do genoma que codifica o capsideo, o que, de forma apropriada, tornou este vírus menos estável ao calor em comparação com o PVI(M ) wt.
Figura 15. Neutralização da titragem de anticorpos após a vacinação. Um grupo de oito ratos CDI 55 tg, sete dos quais concluíram o regime, foram, cada um, inoculados por injeção intraperitoneal três vezes a intervalos semanais com 10® partículas de PV-MinZ (#) e PV-MinXY (♦) e a conversão de soro foi medida 10 dias após a vacinação final.. Uma linha horizontal através de cada grupo de dados marca a média de titragem de anticorpos neutralizantes para cada construção de vírus. A titragem de anticorpos antivírus de poliomielite foi medida por ensaio de microneutralização. (*) Não foi detectada neutralização de vírus para animais com vacinação simulada no mais baixo 1:8 testado.
Figura 16. Vírus influenza carregando segmento NP desotimizado por par de códons. (A) Os vírus A/PR8-NPMin são viáveis e produzem placas menores em células MDCK em comparação com o A/PR8 wt. (B) Os vírusA/PR8-NPM,n A/PR8 mostram cinética de crescimento retardada e titragens finais 3-5 vezes abaixo do A/ PR8 de tipo selvagem.
Figura 17. Vírus influenza carregando segmentos PBI ou HA e NP desotimizados por par de códons. (A) Os vírus A/PR8-PBIMin RR e A/PR8-HAM'n/NPMin são viáveis e produzem placas menores em células MDCK em comparação com o A/PR8 de tipo selvagem. (B) Os vírus A/PR8-PBIMin RR e A/PR8-HAMin/NPMin mostram cinética de crescimento retardada e titragens finais 10 vezes abaixo do A/PR8 de tipo selvagem. Figura 18. Atenuação de A/PR8-NP— em modelo de rato B ALB/c. (A) O vírus A/PR8-NPMintem patogenicidade reduzida em comparação com o vírusA/PR8 de tipo selvagem como determinado por perda de peso mediante vacinação. (B) Todos os ratos (oito de oito) vacinados com o vírus A/PR8-NPMin sobreviveram, ao passo que somente 25% (dois de oito) ratos infectados com A/PR8 estavam vivos 13 dias após a vacinação. (C) Ratos vacinados com vírus A/PR8-NPM,n estão protegidos do desafio com 100 x LD5ode vírus A/PR8 do tipo selvagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se relaciona à produção de vírus atenuados que podem ser usados como vacinas para proteger contra infecção e doença virai. Da mesma forma, a invenção fornece um vírus atenuado, que inclui um genoma virai modificado contendo substituições de nucleotideos montadas em diversos locais do genoma, em que as substituições introduzem uma diversidade de uma diversidade de códons sinônimos no genoma e/ou uma mudança na ordem dos códons existentes para o mesmo aminoácido (mudança de utilização de par de códon). Em ambos os casos, são retidas as sequências originais de aminoácido do tipo selvagem dos produtos de gene virai.
A maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon. Ver o código genético na Tabela 1. Por exemplo, a alanina é codificada por GCU, GCC, GCA, e 5 GCG. Três aminoácidos (Leu, Ser, e Arg) são codificados por seis códons diferentes, enquanto somente Trp e Met têm códons únicos. Códons "sinônimos" são códons que codificam o mesmo aminoácido. Assim, por exemplo, CUU, CUC, CUA, CUG, UUA, e UUG são códons sinônimos que codificam Leu. Códons sinônimos não são usados com igual frequência. Em geral, os códons usados com mais frequência em um organismo são aqueles para os quais o tRNA cognado é abundante e o uso desses códons intensifica o índice e/ou precisão da tradução de proteína. De forma correspondente, os rRNAs para os códons raramente utilizados são encontrados em níveis relativamente baixos, e acredita-se que o uso de códons raros reduz o índice de tradução e/ou precisão. Assim, para substituir um determinado códon em um ácido nucleico por um códon sinônimo mas usado com menor frequência é colocar um códon "desotimizado" no ácido nucleico.
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a O primeiro nucleotídeo em cada códon codificando um aminoácido em particular é mostrado na coluna mais à esquerda, o segundo nucleotídeo é mostrado na fila de cima; e o terceiro nucleotídeo é mostrado na coluna mais à direita.
Além disso, um determinado organismo tem preferência pelo códon mais próximo 5 vizinho de um determinado código A, referido a um viés na utilização de par de códons. Uma mudança de viés de par de códons, sem mudar os códons existentes, pode influenciar o índice de síntese de proteína e produção de proteína.
Em várias configurações da presente invenção, o vírus é um DNA, RNA de dupla fita ou única fita. Em outras configurações, o vírus infecta um animal ou uma planta. Em configurações preferidas, o animal é um humano. Sabe-se bem que um número maior de vírus animais causa doenças (ver abaixo). Certos vírus importantes do ponto de vista médico, como os que causam raiva, síndrome respiratória aguda grave (SARS) e gripe aviária também podem se espalhar para humanos a partir de seus hospedeiros não humanos.
Os vírus também constituem um grupo principal de patógenos de planta, e está em andamento uma pesquisa para desenvolver vetores virais para produzir plantas transgênicas. As vantagens de tais vetores incluem a facilidade de transformar plantas, a capacidade de transformar plantas maduras, o que previne a necessidade de regeneração de uma planta transgênica a partir de uma única célula transformada, e altos níveis de expressão de genes estrangeiros a partir das múltiplas cópias de vírus por célula. No entanto, uma das principais desvantagens desses vetores é que não foi possível separaras funções replicativas virais essenciais dos determinantes patogênicos do vírus. A estratégia SAVE aqui divulgada pode permitir um meio de engendrar vetores virais não patogênicos para transformação da planta.
Principais patógenos virais em humanos
Os patógenos virais são os agentes causadores de muitas doenças em humanos em outros animais. Exemplos bem conhecidos de doenças virais em humanos incluem o resfriado (causado por rinovírus humanos, HRV), gripe (vírus influenza), varicela (vírus varicella-zoster), sarampo (um paramixovírus), caxumba (um paraximovírus), poliomielite (vírus de poliomielite, PV), raiva (Lyssavírus), bolhas de herpes (Herpes Simplex Vírus [HSV] Tipo 1) e herpes genital (HSV Tipo 2). Antes da introdução de programas de vacinação para crianças, muitas dessas doenças eram comuns em crianças no mundo todo e ainda são uma significativa ameaça à saúde em alguns países em desenvolvimento. As doenças virais também incluem doenças mais sérias, como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), síndrome respiratória aguda grave (SARS) causada pelo coronavirus SARS, gripe aviária (subtipo H5N1 do vírus influenza A), Ébola (ebolavirus), febre hemorrágica Marburg (vírus Marburg), febre da dengue (sorotipo Flavivírus), encefalite do Nilo Ocidental (um flavivírus), mononucleose infecciosa, (vírus Epstein-Barr, EBV), hepatite (Vírus da Hepatite C, HCV; vírus da hepatite B, HBV) e febre amarela (flavivírus). Certos tipos de câncer também podem ser causados por vírus. Por exemplo, embora a maioria das infecções por vírus do papiloma humano (HPV) sejam benignas, descobriu-se que o HPV está associado com câncer cervical, e o sarcoma de Kaposi (KS), um tumor predominante em pacientes de AIDS, é causado pelo vírus de herpes associado a sarcoma de Kaposi (KSHV).
Como os vírus residem dentro de células e usam o mecanismo da célula hospedeira para se reproduzir, eles são difíceis de eliminar sem matar a célula hospedeira. A abordagem mais eficaz para combater as doenças virais tem sido a vacinação de pacientes com risco de infecção para proporcionar resistência à infecção. Para algumas doenças (por exemplo, varicela, sarampo, caxumba, febre amarela), estão disponíveis vacinas eficazes. No entanto, existe uma necessidade premente de desenvolver vacinas para outras doenças virais. A abordagem SAVE (Engenharia de Vírus Atenuado Sintético) aqui descrita para fazer vacinas é, em princípio, aplicável a todos os vírus para os quais está disponível um sistema de genética reversa. Esta abordagem é aqui exemplificada com foco na aplicação do SAVE para desenvolver vacinas de vírus atenuado para poliomielite, resfriado e gripe.
Qualquer vírus pode ser atenuado pelos métodos aqui divulgados. O vírus pode ser um vírus dsDNA (por exemplo, Adenovirus, Vírus de Herpes, Vírus de Varicela), vírus de DNA de sentido positivo (+) de fita única (por exemplo, Parvovirus), vírus RNA de fita dupla (por exemplo, Reovírus) virus RNA de sentido + de fita única (por exemplo, Picornavírus, Togavírus), um vírus RNA sentido negativo (-) de fita única (por exemplo, Ortomixovírus, Rhabdovírus), um vírus RNA sentido + de fita única com intermediário de DNA (por exemplo, Retrovirus), ou vírus de transcrição reversa de fita dupla (por exemplo, Hepadnavírus). Em certas configurações não limitantes da presente invenção, o vírus é um vírus de poliomielite (PV), rinovírus, vírus influenza incluindo gripe aviária (por exemplo, vírus influenza A do subtipo H5N1), coronavirus da síndrome respiratória aguda grave (SARS), Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV), Vírus da Hepatite B (HBV), Vírus da Hepatite C (HVC), vírus da bronquite infecciosa, ebolavirus, vírus Marburg, vírus da febre da dengue (sorotipos Flavivírus), vírus da doença do Nilo Ocidental, vírus Epstein-Barr (EBV), vírus da febre amarela, Ébola (ebolavirus), varicela (vírus varicella-zoster), sarampo (paraximovírus), caxumba (paraximovírus), raiva (Lyssavírus), vírus do papiloma humano, vírus de herpes associado a sarcoma de Kaposi, Virus Herpes Simples (HSV Tipo 1) ou herpes genital (HSV Tipo 2).
A expressão vírus "matriz" ou sequência de codificação de proteína "matriz" é usada aqui para se referir a genomas virais e sequências de codificação de proteína das quais são derivadas novas sequências, que podem ser mais ou menos atenuadas. Vírus e sequências matriz são normalmente protótipos ou isolados do "tipo selvagem" ou "de ocorrência natural" de variantes para as quais se deseja obter um vírus mais atenuado. No entanto, os vírus matriz também podem incluir mutantes especialmente criados ou selecionados no laboratório com base nas propriedades desejáveis reais ou percebidas. Assim também, vírus matriz que são candidatos para atenuação incluem mutantes do tipo selvagem ou vírus de ocorrência natural que tenham exclusões, inserções, substituições de aminoácidos similares, e também incluem mutantes que tenham substituição de códons. Em uma configuração, tal sequência matriz difere de um isolado natural em cerca de 30 aminoácidos ou menos. Em uma configuração, a sequência matriz difere de um isolado natural em cerca de 20 aminoácidos ou menos. Ainda em outra configuração, a sequência matriz difere de um isolado natural em cerca de 10 aminoácidos ou menos.
O PV atenuado pode ser derivado do vírus de poliomielite de tipo 1 (Mahoney; "PV(M)"), vírus de poliomielite tipo 2 (Lansing), vírus de poliomielite tipo 3 (Leon), vírus da vacina de poliomielite oral monovalente (OPV), ou vírus OPV trivalente. Em certas configurações, o vírus de poliomielite é PV-AB com a sequência genômica especificada em SEQ ID NO:2, ou PV-AB755"1513, PV-AB755"2470, PV-AB1513"3388, PV- AB2470"3386, PV-AB1513"2470, pv-AB2470"2954 ou PV-AB2954"3386. A nomenclatura reflete um genoma PV(M) no qual partes do genoma são substituídos por nucleotídeos de PV- AB. Os números sobrescritos indicam a quantidade de nucleotídeos de PV-AB que são substituídos.
Em várias configurações, o rinovírus atenuado é um rinovírus humano (HRV) derivado de HR V2, HRV 14, Rinovírus humano 10 Rinovírus humano 100; Rinovírus humano 11; Rinovírus humano 12; Rinovírus humano 13; Rinovírus humano 15; Rinovírus humano 16; Rinovírus humano 18; Rinovírus humano 19; Rinovírus humano IA; Rinovírus humano IB; Rinovírus humano 2; Rinovírus humano 20; Rinovírus humano 21; Rinovírus humano 22; Rinovírus humano 23; Rinovírus humano 24; Rinovírus humano 25; Rinovírus humano 28; Rinovírus humano 29; Rinovírus humano 30; Rinovírus humano 31 Rinovírus humano 32; Rinovírus humano 33; Rinovírus humano 34; Rinovírus humano 36; Rinovírus humano 38; Rinovírus humano 39; Rinovírus humano 40; Rinovírus humano 41; Rinovírus humano 43; Rinovírus humano 44; Rinovírus humano 45; Rinovírus humano 46; Rinovírus humano 47; Rinovírus humano 49; Rinovírus humano 50; Rinovírus humano 51; Rinovírus humano 53; Rinovírus humano 54; Rinovírus humano 55; Rinovírus humano 56; Rinovírus humano 57; Rinovírus humano 58; Rinovírus humano 59; Rinovírus humano 60; Rinovírus humano 61; Rinovírus humano 62; Rinovírus humano 63; Rinovírus humano 64; Rinovírus humano 65; Rinovírus humano 66; Rinovírus humano 67; Rinovírus humano 68; Rinovírus humano 7; Rinovírus humano 71; Rinovírus humano 73; Rinovírus humano 74; Rinovírus humano 75; Rinovírus humano 76; Rinovírus humano 77; Rinovírus humano 78; Rinovírus humano 8; Rinovírus humano 80; Rinovírus humano 81; Rinovírus humano 82; Rinovírus humano 85; Rinovírus humano 88; Rinovírus humano 89; Rinovírus humano 9; Rinovírus humano 90; Rinovírus humano 94; Rinovírus humano 95; Rinovírus humano 96 Rinovírus humano 98; Rinovírus humano 14; Rinovírus humano 17; Rinovírus humano 26; Rinovírus humano 27; Rinovírus humano 3; Rinovírus humano 8001 Finlândia Novembro 1995; Rinovírus humano 35; Rinovírus humano 37;+ Rinovírus humano 6253 Finlândia Setembro 1994; Rinovírus humano 9166 Finlândia Setembro 1995; Rinovírus humano 4; Rinovírus humano 42; Rinovírus humano 48; Rinovírus humano 9864 Finlândia Setembro 1996; Rinovírus humano 5; Rinovírus humano 52; Rinovírus humano 6; Rinovírus humano 7425 Finlândia Dezembro 1995; Rinovírus humano 69; Rinovírus humano 5928 Finlândia Maio 1995; Rinovírus humano 70; Rinovírus humano 72; Rinovírus humano 79; Rinovírus humano 83; Rinovírus humano 84; Rinovírus humano 8317 Finlândia Agosto 1996; Rinovírus humano 86; Rinovírus humano 91; Rinovírus humano 7851 Finlândia Setembro 1996; Rinovírus humano 92; Rinovírus humano 93; Rinovírus humano 97; Rinovírus humano 99; Rinovírus Antuérpia 98/99; Rinovírus humano 263 Berlin 2004; Rinovírus humano 3083/rhino/Hyogo/2005; Rinovírus humano NY-003; Rinovírus humano NY-028; Rinovírus humano NY-041; Rinovírus humano NY-042; Rinovírus humano NY-060; Rinovírus humano NY-063; Rinovírus humano NY-074; Rinovírus humano NY-1085; Rinovírus humano estirpe Hanks; Rinovírus humano sem tipo OK88-8162; enterivírus humano sp. exAmblyomma americanum; Rinovírus humano sp. ou Rinovírus humano UC.
Em outras configurações, o vírus atenuado da gripe é derivado do virus influenza A, vírus influenza B ou vírus influenza C. Em outras configurações o vírus influenza A pertence, mas não se limita, aos subtipos H10N7, HIONI, H10N2, H10N3, H10N4, H10N5, H10N6, H10N7, H10N8, H10N9, HI INI, H11N2, H11N3, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N2, H12N4, H12N5, H12N6, H12N8, H12N9, H13N2, H13N3, H13N6, H13N9, H14N5, H14N6, H15N2, H15N8, H15N9, H16N3, MINI, H1N2, H1N3, H1N5, H1N6, H1N8, H1N9, H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H3N9, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N7, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N3, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N7, H7N8, H7N9, H8N2, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 e subtipos não identificados.
Em outras configurações, o vírus influenza B pertence, mas não está limitado, ao subtipo Vírus Influenza B (B/Aichi/186/2005), Vírus Influenza B (B/Aichi/5/88), Vírus Influenza B (B/Akita/27/2001), Vírus Influenza B (B/Akita/5/2001), Vírus Influenza B (B/Alabama/1/2006), Vírus Influenza B (B/Alabama/2/2005), Vírus Influenza B (B/Alaska/03/1992), Vírus Influenza B (B/Alaska/12/1996), Vírus Influenza B (B/Alaska/ 16/2000), Vírus Influenza B (B/Alaska/16/2003), Vírus Influenza B (B/Alaska/1777/2005), Vírus Influenza B (B/Alaska/2/2004), Vírus Influenza B (B/Alaska/6/2005), Vírus Influenza B (B/Ann Arbor/1/1986), Vírus Influenza B (B/Ann Arbor/1994), Vírus Influenza B (B/Argentina/132/2001), Vírus Influenza B (B/Argentina/3640/ 1999), Vírus Influenza B (B/Argentina/69/2001), Vírus Influenza B (B/Arizona/1/2005), Vírus Influenza B (B/Arizona/12/2003), Vírus Influenza B (B/Arizona/13/2003), Vírus Influenza B (B/Arizona/135/2005), Vírus Influenza B (B/Arizona/ 14/2001), Vírus Influenza B 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Influenza B (B/Taiwan/S76/02), Virus Influenza B (B/Taiwan/S82/02), Virus Influenza B (B/Taiwan/103/2005), Virus Influenza B (B/Tehran/80/02), Virus Influenza B (B/Temple/B 10/1999), Virus Influenza B (B/Temple/BI 166/2001), Virus Influenza B (B/Temple/BI 181/2001), Virus Influenza B (B/Temple/B 1182/2001), Virus Influenza B (B/Temple/BI 188/2001), Virus Influenza B (B/Temple/BI 190/2001), Virus Influenza B (B/Temple/BI 193/2001), Virus Influenza B (B/Temple/B 17/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B 18/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B 19/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B20/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B21/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B24/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B3/1999), Virus Influenza B (B/Temple/B30/2003), Virus Influenza B (B/Temple/B7/1999), Virus Influenza B (B/Temple/B 8/ 1999), Virus Influenza B (B/Temple/B9/1999), Virus Influenza B (B/Texas/06/2000), Virus Influenza B (B/Texas/ 1/2000), Virus Influenza B (B/Texas/ 1/2004), Virus Influenza B (B/Texas/1/2006), Virus Influenza B (B/Texas/1/91), Virus Influenza B (B/Texas/10/2005), Virus Influenza B (B/Texas/11/2001), Virus Influenza B (B/Texas/12/2001), Virus Influenza B (B/Texas/14/1991), Virus Influenza B (B/Texas/14/2001), Virus Influenza B (B/Texas/16/2001), Virus Influenza B (B/Texas/ 18/2001), Virus Influenza B (B/Texas/2/2006), Virus Influenza B (B/Texas/22/2001), Virus Influenza B (B/Texas/23/2000), Virus Influenza B (B/Texas/3/2001), Virus Influenza B (B/Texas/3/2002), Virus Influenza B (B/Texas/3/2006), Virus Influenza B (B/Texas/37/1988), Virus Influenza B (B/Texas/37/88), Virus Influenza B (B/Texas/4/2006), Virus Influenza B (B/Texas/4/90), Virus Influenza B (B/Texas/5/2002), Virus Influenza B (B/Texas/57/2002), Virus Influenza B (B/Texas/6/2000), Virus Influenza B (B/Tokushima/101/93), Virus Influenza B (B/Tóquio/6/98), Virus Influenza B (B/Trento/3/02), Virus Influenza B (B/Trieste/1/02), Virus Influenza B (B/Trieste/1/03), Virus Influenza B (B/Trieste/ 15/02), Virus Influenza B (B/Trieste/ 17/02), Virus Influenza B (B/Trieste/19/02), Virus Influenza B (B/Trieste/2/03), Virus Influenza B (B/Trieste/25/02), Virus Influenza B (B/Trieste/27/02), Virus Influenza B (B/Trieste/28/02), Virus Influenza B (B/Trieste/34/02), Virus Influenza B (B/Trieste/37/02), Virus Influenza B (B/Trieste/4/02), Virus Influenza B (B/Trieste/8/02), Virus Influenza B (B/Trieste 14/02), Virus Influenza B (B/Trieste 18/02), Virus Influenza B (B/Trieste23/02), Virus Influenza B (B/Trieste24/02), Virus Influenza B (B/Trieste7/02), Virus Influenza B (B/ Ulan Ude/4/02), Virus Influenza B (B/Ulan- Ude/6/2003), Virus Influenza B (B/UlanUde/4/02), Virus Influenza B (B/Reino Unido/34304/99), Virus Influenza B (B/ Reino Unido/34520/99), Virus Influenza B (B/Uruguai/ 19/02), Virus Influenza B (B/Uruguai/19/05), Virus Influenza B (B/Uruguai/2/02), Virus Influenza B (B/Uruguai/28/05), Virus Influenza B (B/Uruguai/33/05), Virus Influenza B (B/Uruguai/ 4/02), Virus Influenza B 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(B/Washington/2/2000), Virus Influenza B (B/Washington/2/2004), Virus Influenza B (B/Washington/3/2000), Virus Influenza B (B/Washington/3/2003), Virus Influenza B (B/Washington/5/2005), Virus Influenza B (B/Wellington/01/1994), Virus Influenza B (B/Wisconsin/1/2004), Virus Influenza B (B/Wisconsin/1/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/ 10/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/15e/2005), Virus Influenza B (B/Wisconsin/ 17/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/2/2004), Virus Influenza B (B/Wisconsin/2/2006), Virus Influenza B (B/ Wisconsin/22/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/26/2006), Virus Influenza B (B/ Wisconsin/29/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/3/2000), Virus Influenza B (B/Wisconsin/3/2004), Virus Influenza B (B/Wisconsin/3/2005), Virus Influenza B (B/ Wisconsin/3/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/31/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/4/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/5/2006), Virus Influenza B (B/ Wisconsin/6/2006), Virus Influenza B (B/Wisconsin/7/2002), Virus Influenza B (B/Wuhan/2/2001), Virus Influenza B (B/Wuhan/356/2000), Virus Influenza B (BAW 194/2002), Virus Influenza B (B/Wyoming/ 15/2001), Virus Influenza B (B/Wyoming/16/2001), Virus Influenza B (B/Wyoming/2/2003), Virus Influenza B (B/Xuanwu/1/82), Virus Influenza B (B/Xuanwu/23/82), Virus Influenza B (B/Yamagata/1/73), Virus Influenza B (B/Yamagata/115/2003), Virus Influenza B (B/ Yamagata/1246/2003), Virus Influenza B (B/Yamagata/1311/2003), Virus Influenza B (B/Yamagata/16/1988), Virus Influenza B (B/Yamagata/ 16/88), Virus Influenza B (B/ Yamagata/222/2002), Virus Influenza B (B/Yamagata/KI 98/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K246/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K270/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K298/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K320/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K354/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K386/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K411/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K461/2001), Virus Influenza B (B/Yamagata/K490/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K500/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K501/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K508/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K513/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K515/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K519/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K520/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K521/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K535/2001), Vírus Influenza B (B/Yamagata/K542/2001), Vírus Influenza B (B/Yamanashi/166/1998), Vírus Influenza B (B/Yamanashi/166/98), Vírus Influenza B (B/Yunnan/123/2001), Vírus Influenza B (estirpe B/Alaska/12/96), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/ANN ARBOR/1/66 [ADAPTADO A FRIO]), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/ANN ARBOR/1/66 [TIPO SELVAGEM]), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/BA/78), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/BEIJING/1/87), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/INGLATERRA/222/82), Vírus Influenza B (estirpe B/Finlândia/145/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fmland/146/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fmland/ 147/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fínland/148/90), Vírus Influenza B (estirpe B/ fínland/149/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fmland/ 150/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fínland/151/90), Vírus Influenza B (estirpe B/fínland/24/85), Virus Influenza B (estirpe B/fínland/56/88), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/FUKUOKA/80/81), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/GA/86), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/GL/54), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/HONG KONG/8/73), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/HT/84), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/ID/86), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/LENINGRAD/179/86), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/M ARYL AND/59), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/MEMPHIS/6/86), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/NAGASAKI/1/87), Vírus Influenza B (estirpe B/Osaka/491/97), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/PA/79), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/RU/69), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/SINGAPORE/64), Vírus Influenza B (estirpe B/Tóquio/942/96), Vírus Influenza B (ESTIRPE B/VICTORIA/3/85), Virus Influenza B (ESTIRPE B/VICTORIAZ 87), Virus Influenza B(B/Rochester/02/2001), e outros subtipos. Em outras configurações, o virus influenza C pertence mas não está limitado ao subtipo Vírus Influenza C (C/Aichi/1/81), Vírus Influenza C (C/Aichi/1/99), Vírus Influenza C (C/Ann Arbor/1/50), Vírus Influenza C (C/Aomori/74), Vírus Influenza C (C/Califórnia/78), Vírus Influenza C (C/lnglaterra/83), Vírus Influenza C (C/Fukuoka/2/2004), Vírus Influenza C (C/Fukuoka/3/2004), Vírus Influenza C (C/Fukushima/1/2004), Vírus Influenza C (C/Grécia/79), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/246/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/247/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/248/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/249/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/250/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/251/2000), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/252/2000), Virus Influenza C (C/Hiroshima/252/99), Virus Influenza C (C/Hiroshima/290/99), Vírus Influenza C (C/Hiroshima/4/2004), Vírus Influenza C (CZ Hyogo/1/83), Vírus Influenza C (C/Johannesburg/1/66), Vírus Influenza C (C/Johannesburg/66), Vírus Influenza C (C/Kanagawa/1/76), Vírus Influenza C (C/Kanagawa/2/2004), Vírus Influenza C (C/Kansas/1Z79), Vírus Influenza C (C/Kyoto/1/79), Vírus Influenza C (C/Kyoto/41/82), Vírus Influenza C (C/Mississippi/80), Vírus Influenza C (C/Miyagi/1/90), Vírus Influenza C (C/Miyagi/1/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/1/94), Vírus Influenza C (C/Miyagi/1/97), Vírus Influenza C (C/Miyagi/1/99), Vírus Influenza C (C/Miyagi/12/2004), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/2000), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/92), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/94), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/96), Vírus Influenza C (C/Miyagi/2/98), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/2000), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/91), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/92), Virus Influenza C (CZ Miyagi/3/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/94), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/97), Vírus Influenza C (C/Miyagi/3/99), Vírus Influenza C (C/Miyagi/4/2000), Vírus Influenza C (C/Miyagi/4/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/4/96), Vírus Influenza C (CZ Miyagi/4/97), Vírus Influenza C (C/Miyagi/4/98), Vírus Influenza C (C/Miyagi/42/2004), Vírus Influenza C (C/Miyagi/5/2000), Virus Influenza C (C/Miyagi/5/91), Vírus Influenza C (C/Miyagi/5/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/6/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/6/96), Vírus Influenza C (C/Miyagi/7/91), Vírus Influenza C (C/Miyagi/7/93), Vírus Influenza C (C/Miyagi/7/96), Vírus Influenza C (C/Miyagi/77), Vírus Influenza C (C/Miyagi/8/96), Vírus Influenza C (C/Miyagi/9/91), Vírus Influenza C (C/Miyagi/9/96), Vírus Influenza C (C/Nara/1/85), Vírus Influenza C (C/Nara/2/85), Vírus Influenza C (C/Nara/82), Vírus Influenza C (C/New Jersey/76), Vírus Influenza C (C/Niigata/1/2004), Vírus Influenza C (C/Osaka/2/2004), Vírus Influenza C (C/porco/Beijing/115/81), Vírus Influenza C (C/Saitama/1/2000), Vírus Influenza C (C/ Saitama/1/2004), Vírus Influenza C (C/Saitama/2/2000), Vírus Influenza C (C/Saitama/3/2000), Vírus Influenza C (C/Sapporo/71), Vírus Influenza C (C/Shizuoka/79), Vírus Influenza C (C/Yamagata/1/86), Vírus Influenza C (C/Yamagata/1/88), Vírus Influenza C (C/Yamagata/10/89), Vírus Influenza C (C/Yamagata/13/98), Vírus Influenza C (C/Yamagata/15/2004), Vírus Influenza C (C/ Yamagata/2/2000), Vírus Influenza C (C/Yamagata/2/98), Vírus Influenza C (C/Yamagata/2/99), Vírus Influenza C (C/Yamagata/20/2004), Vírus Influenza C (C/Yamagata/20/96), Virus Influenza C (C/Yamagata/21/2004), Vírus Influenza C (C/ Yamagata/26/81), Vírus Influenza C (C/Yamagata/27/2004), Vírus Influenza C (C/Yamagata/3/2000), Vírus Influenza C (C/Yamagata/3/2004), Vírus Influenza C (C/ Yamagata/3/88), Vírus Influenza C (C/Yamagata/3/96), Vírus Influenza C (C/Yamagata/4/88), Vírus Influenza C (C/Yamagata/4/89), Vírus Influenza C (C/Yamagata/5/92), Virus Influenza C (C/Yamagata/6/2000), Vírus Influenza C (C/Yamagata/6/98), Virus Influenza C (C/Yamagata/64), Virus Influenza C (C/Yamagata/7/88), Virus Influenza C (C/Yamagata/8/2000), Virus Influenza C (C/Yamagata/8/88), Virus Influenza C (C/Yamagata/8/96), Virus Influenza C (C/Yamagata/9/2000), Virus Influenza C (C/Yamagata/9/88), Virus Influenza C (C/Yamagata/9/96), Virus Influenza C (ESTIRPE C/BERLIN/1/85), Virus Influenza C (ESTIRPE C/ENGL AND/892/83), Virus Influenza C (ESTIRPE C/GREAT LAKES/1167/54), Virus Influenza C (ESTIRPE C/JJ/50), Virus Influenza C (ESTIRPE C/PORCO/BEIJING/10/81), Virus Influenza C (ESTIRPE C/PIG/BEIJING/439/82), Virus Influenza C (ESTIRPE C/TAYLOR/1233/47), Virus Influenza C (ESTIRPE C/Y AMAGATA/ 10/81), Isavirus ou virus de anemia infecciosa de salmão, Thogotovirus ou Dhori virus, Batken vírus, Dhori vírus (ESTIRPE INDIAN/1313/61) ou Thogoto virus, Thogoto vírus (isolado SiAr 126) ou Thogotovirus não classificado , Araguari virus, Orthomyxoviridae não classificado ou vírus de praga de ave ou vírus suíno de influenza ou virus influenza não identificado e outros subtipos.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus delta e todos os gêneros relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Adenoviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados, por exemplo, mas sem limitação, adenovirus humano A, B, C.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Herpesviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados, por exemplo, mas sem limitação, vírus herpes simplex.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Reoviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Papillomaviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Poxviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Retroviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados. Por exemplo, mas sem limitação, Vírus da Imunodeficiência Humana
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Filoviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Paramyxoviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Orthomyxoviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Picornaviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Bunyaviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Nidovirales e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em diversas configurações, o vírus atenuado pertence à família de vírus Calciviridae e todos os gêneros, estirpes, tipos e isolados relacionados.
Em certas configurações, a substituição de códons sinônimos altera o viés de códon, viés de par de códons, densidade de códons desotimizados e pares de códons desotimizados, estrutura secundária de RNA, teor de dinucleotídeo CpG, teor de C+G, locais de deslocamento do quadro de leitura na tradução, a presença ou ausência de sequências de reconhecimento de microRNA específico, ou qualquer combinação dos anteriores no genoma. As substituições de códon podem ser engendradas em múltiplos locais distribuídos pelo genoma, ou nos múltiplos locais restritos a uma parte do genoma. Em outras configurações, a parte do genoma está na região de codificação de capsídeo.
Em configurações preferidas desta invenção, o vírus retém a capacidade de induzir uma resposta imunológica protetora em um hospedeiro animal. Em outras configurações preferidas, a virulência do vírus não reverte para o tipo selvagem.
Vírus de poliomielite, rinovírus e vírus influenza O Vírus de poliomielite, um membro da família Picornavírus, é um vírus pequeno não envelopado com genoma de RNA de sentido (+) com uma única fita, com 7,5 kb de comprimento (Kitamura et al. 1981). No momento de entrada na célula, o RNA genômico serve como um mRNA codificando uma única poliproteína que, após a sequência em cascata de eventos de separação autocatalítica, dá origem a um complemento completo de proteínas funcionais de vírus de poliomielite. O mesmo RNA genômico serve como modelo para a síntese de RNA de sentido (-), um intermediário para a síntese de novas fitas (+) que servem como mRNA, modelo de replicação ou RNA genômico destinado para encapsidação em virions de progénie (Mueller et al., 2005). Como aqui descrito, foi usado o sistema PV consagrado para tratar de questões gerais de estratégias de elaboração de otimização para a produção dos vírus sintéticos atenuados. O PV fornece um dos modelos moleculares mais importantes e mais bem entendidos para desenvolver estratégias antivirais. Em particular, existe um sistema de genética reversa pelo qual o ácido nucleico virai pode ser sintetizado in vitro por métodos completamente sintéticos e depois convertido em virions infecciosos (ver abaixo). Ademais, está disponível um modelo conveniente de rato (ratos CD155tg, que expressam o receptor humano para pólio) para testar a atenuação dos projetos sintéticos de PV como anteriormente descrito (Cello et al., 2002).
Vírus do tipo Rhino são também membros da família picornavírus e relacionados ao PV. Os Rinovírus Humanos (HRV) são os agentes causadores usuais do resfriado, e como tal são responsáveis por mais episódios de doença do que qualquer outro agente infeccioso (Hendley, 1999). Além do resfriado, o HRV também está envolvido em infecções de ouvido e seios da face, ataques de asma e outras doenças. Da mesma forma que o PV, o HRV inclui um vírus RNA de sentido positivo de fita única, cujo genoma codifica uma poliproteína autoprocessante. O RNA é traduzido através de um mecanismo interno de iniciação usando um Local de Entrada de Ribossomo Interno (IRES) para produzir proteínas estruturais que formam o capsideo, bem como proteínas não estruturais tais como as duas proteases virais, 2A e 3C d a polimerase dependente de RNA (Jang et al., 1989; Pelletier et al., 1988). Assim como o PV, o HRV tem um capsideo icosaédrico não envelopado, formado por 60 cópias das quatro proteínas capsídeas VP1-4 (Savolainen et al., 2003). O ciclo de replicação do HRV é também idêntico ao do vírus de poliomielite. A estreita semelhança com PV, combinada com o impacto significativo, quase onipresente na saúde humana, faz do HRV um candidato bastante atraente para gerar um novo vírus atenuado útil para imunização.
Apesar de décadas de pesquisa por empresas farmacêutica, nenhuma droga foi desenvolvida que tivesse sucesso contra o HRV. Isso se deve em parte à tolerância de risco relativamente baixa dos órgãos reguladores federais e do público para drogas que tratam uma infecção que não seja grave. Isto é, nem mesmo pequenos efeitos colaterais são aceitáveis. Assim, na ausência de uma droga, existe um claro desejo de uma vacina segura e eficaz contra o rinovírus. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina contra o rinovírus é extremamente desafiador, porque existem mais de 100 sorotipos de HRV, aproximadamente 30 dos quais circulam amplamente e infectam humanos regularmente. Uma vacina eficaz deve capacitar o sistema imunológico a reconhecer cada sorotipo para conferir real imunidade. A abordagem SAVE aqui descrita oferece uma solução prática para o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o rinovírus. Com base na previsibilidade do processo de elaboração SAVE, não seria caro elaborar e sintetizar 100 ou mais vírus do tipo rhino atenuados por SAVE, que em combinação constituiriam uma vacina.
Vírus influenza - Entre 1990 e 1999, o virus influenza causou aproximadamente 35.000 mortes a cada ano nos Estados Unidos. (Thompson et al., 2003). Juntamente com cerca de 200.000 hospitalizações, estima-se que o impacto na economia americana tenha ultrapassado 23 bilhões de dólares anuais (Cram et al., 2001). No mundo todo, de 300.000 a 500.000 pessoas morrem a cada ano em consequência de infecções pelo vírus da gripe (Kamps et al., 2006). Embora o vírus cause doenças em todas as faixas etárias, os índices de complicações mais graves são mais altos em crianças e pessoas acima de 65 anos de idade. O vírus Influenza tem potencial para mudar ou se recombinar em formas extremamente fatais, como aconteceu durante a grande epidemia de gripe de 1918, em que morreram cerca de 30 milhões de pessoas. Essa foi talvez a mais fatal epidemia de duração de um ano na história da humanidade.
Os vírus Influenza são divididos em três tipos, A, B e C. A antigenicidade é determinada por duas glicoproteínas na superfície do vírion envelopado: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Ambas as glicoproteínas mudam continuamente sua antigenicidade para fugir à imunidade humoral. Alterar as glicoproteínas permite que as estirpes de vírus continuem infectando indivíduos vacinados, que é o motivo para vacinação anual de grupos de alto risco. Além disso, os vírus humanos influenza podem substituir as glicoproteínas HA ou NA pelas de pássaros ou porcos, um reagrupamento de segmentos de gene, conhecido como mudança genética, levando a novos vírus (H1N1 para H2N2 ou H3N2, etc.) (Steinhauer e Skehel, 2002). Esses novos vírus, para os quais a população global está imunologicamente despreparada, são a causa das pandemias que matam milhões de pessoas (Kilbourne, 2006; Russell e Webster, 2005). A história do vírus influenza, juntamente com a ameaça atual do altamente patogênico vírus da gripe aviária, H5N1 (Stephenson e Democratis, 2006), destaca a necessidade de prevenir a doença do vírus influenza.
Atualmente, estão em uso duas vacinas contra influenza: uma vacina atenuada e viva (adaptada a frio; "FluMist") e um vírus inativado. A aplicação da vacina atenuada é restrita a crianças, adolescentes e adultos sadios (exceto mulheres grávidas), de 5 a 49 anos. Essa restrição de idade deixa de fora exatamente os que estão expostos aos maiores riscos da gripe. Além disso, o vírus atenuado FluMist tem a possibilidade de reversão, o que é comum para um vírus vivo. A produção da segunda e mais comumente administrada vacina inativada contra o vírus influenza é complexa. Além disso, esta vacina parece ser menos eficaz do que se espera na prevenção da morte na população idosa (> 65 anos) (Simonson et al., 2005). Esses fatos destacam a necessidade de novas estratégias para gerar vacinas contra o vírus influenza.
Genética reversa de picornavírus
A genética reversa geralmente se refere às abordagens experimentais para a descoberta da função de um gene que seguem na direção oposta às chamadas abordagens diretas da genética clássica. Isto é, enquanto as abordagens de genética direta buscam determinar a função de um gene elucidando a base genética da característica fenotípica, as estratégias baseadas em genética reversa começam com um gene isolado e buscam descobrir sua função investigando os possíveis fenótipos gerados pela expressão do gene wt ou mudado. Da forma usada no contexto de sistemas virais, sistemas de "genética reversa" se referem à disponibilidade de técnicas que permitem manipulação de genomas virais feitos de RNA. De forma breve, os genomas virais são isolados dos virions ou das células infectadas, convertidos para DNA ("cDNA") pela transcriptase reversa da enzima, possivelmente modificados como desejado, e revertidos, normalmente através do intermediário RNA, de volta para as partículas virais infecciosas. Este processo nos picornavírus é extremamente simples; na verdade, o primeiro sistema de genética reversa desenvolvido para qualquer vírus de RNA animal foi para PV (Racaniello e Baltimore, 1981). Os sistemas de genética reversa virai se baseiam na descoberta histórica de que o RNA genômico virai nu é infeccioso quando transfectado para uma célula adequada de mamífero (Alexander et al., 1958). A descoberta da transcriptase reversa e o desenvolvimento de técnicas de clonagem molecular nos anos 70 permitiu aos cientistas gerar e manipular cópias de cDNA de genomas virais de RNA. Mais comumente, toda a cópia cDNA do genoma é clonada de forma imediatamente posterior ao um promotor de polimerase RNA de foco T7 que permite a síntese in vitro do genoma RNA, que é depois transfectada para dentro de células para geração do vírus (van der Wert, et al., 1986). Alternativamente, o mesmo plasmídeo de DNA pode ser transfectado para células que expressam a polimerase do RNA T7 no citoplasma. Este sistema pode ser usado para vários patógeno virais incluindo PV e HRV.
Virologia molecular e genética reversa do virus influenza
O virus influenza, como o picornavirus, PV e HRV, é um virus RNA, mas de resto não relacionado e bem diferente do PV. Em contraste com o picornavirus, o influenza é um vírus de fita negativa. Além disso, o influenza consiste de oito segmentos de gene separados, indo de 890 a 2341 nucleotídeos (Lamb e Krug, 2001). Em parte por causa da organização de fita negativa e em parte por causa dos oito segmentos de gene separados, o sistema de genética reversa é mais complexo do que para o PV. No entanto, foi desenvolvido um sistema de genética reversa para o vírus influenza (Enami et al., 1990; Fodor et al., 1999; Garcia-Sastre e Palese, 1993; Hoffman et al., 2000; Luytjes et al., 1989; Neumann et al., 1999). Cada um dos oito segmentos de gene é expresso a partir de um plasmídeo separado. Este sistema de genética reversa é extremamente conveniente para uso na estratégia SAVE aqui descrita, porque o segmento de gene individual mais longo é menor do que 3 kb, e dessa forma fácil de sintetizar e manipular. Além disso, os diferentes segmentos de gene podem ser combinados e recombinados simplesmente misturando diferentes plasmídeos. Assim, a aplicação dos métodos SAVE são possivelmente ainda mais factíveis para o vírus influenza do que para o PV.
Uma recente mudança de paradigma na genética reversa virai ocorreu com a primeira síntese química de um genoma de vírus infeccioso pelos presentes inventores, através da montagem a partir de oligonucleotídeos de DNA sintético (Cello et al., 2002). Esta realização deixou claro que a maioria dos vírus ou todos para os quais está disponível um sistema de genética reversa podem ser sintetizados unicamente a partir de sua informação de sequência genômica, e promete uma flexibilidade sem precedentes na ressintetização e modificação desses vírus para atender os critérios desejados.
Síntese "de novo" de genomas virais
São usados algoritmos computadorizados para elaborar e sintetizar genomas virais "de novo". Esses genomas sintetizados, exemplificados pela síntese do PV atenuado aqui descrita, codificam exatamente as mesmas proteínas que os vírus de tipo selvagem (wt), mas usando códons sinônimos, parâmetros diversos, incluindo viés de códon, viés de par de códons, estrutura secundária de RNA e/ou conteúdo de dinucleotídeo, como alterados. Os dados apresentados mostram que essas mudanças independentes de codificação produzem vírus altamente atenuados, muitas vezes em razão da má tradução de proteínas. Tendo como alvo uma função elementar de todos os vírus, no caso, tradução de proteína, foi desenvolvido um método bastante genérico para produzir vírus atenuados, que são úteis para fazer vacinas, de forma previsível, segura, rápida e barata. Este método, chamado de "SAVE" (do inglês Synthetic Attenuated Virus Engineering, ou Engenharia de Virus Atenuado Sintético), é aplicável a uma ampla variedade de outros vírus que não o PV, para os quais existe necessidade médica de novas vacinas. Esses vírus incluem, mas sem limitação, rinovírus, influenza, SARS e outros coronavirus, HIV, HCV, vírus da bronquite infecciosa, ebolavirus, vírus Marburg, vírus da febre da dengue, vírus da doença do Nilo Ocidental, EBV, vírus da febre amarela, enterovirus que não o vírus de poliomielite, tais como ecovírus, vírus Coxsackie e enterovirus 71; vírus da hepatite A, aftovírus, como o vírus da febre aftosa, mixovirus, como vírus influenza, paramixovirus, como o vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus do sincício respiratório, flavivírus como o vírus da dengue, vírus da febre amarela, vírus da encefalite de St. Louis e vírus de carrapato, alfavírus, tais como vírus da encefalite Ocidental e Oriental, vírus da hepatite B, vírus da diarréia bovina e ebolavirus.
Demonstra-se aqui que tanto a desotimização de códon quanto de par de códon na região de codificação de capsideo de PV reduzem a aptidão do PV. A presente invenção não se limita a qualquer mecanismo molecular em particular subjacente à atenuação de virus pela substituição de códons sinônimos. No entanto, estão sendo realizadas experiências para entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes da desotimização de códon e par de códons na produção de vírus atenuados. Em particular, esta aplicação fornece provas que indicam que a desotimização de códon e desotimização de par de códons pode resultar numa tradução ineficiente. Também estão sendo desenvolvidos métodos de alto rendimento para a geração e triagem rápida de grandes números de construções virais.
Montagem de DNA de Larga Escala
Em anos recentes, os preços em queda e a crescente qualidade da síntese de oligonucleotídeos tornaram possível montar grandes segmentos de DNA (pelo menos de até cerca de 10 kb) a partir de oligonucleotídeos sintéticos. Fornecedores comerciais como Blue Heron Biotechnology, Inc. (Bothwell, WA) (e também muitos outros) atualmente sintetizam, montam, clonam, verificam a sequência e entregam um grande segmento de DNA sintético de sequência conhecida pelo preço relativamente baixo de cerca de 1,50 dólares por base. Assim, a compra de genomas virais sintetizados de fornecedores comerciais é uma opção conveniente e eficaz em termos de custo, e os preços continuam diminuindo rapidamente. Além disso, estão surgindo novos métodos de sintetizar e montar grandes moléculas de DNA a custo extremamente baixo (Tian et al., 2004). O laboratório Church foi pioneiro em um método que utiliza síntese paralela de milhares de oligonucleotídeos (por exemplo, em chips microfluídicos fotoprogramáveis ou em microarranjos disponíveis de Nimblegen Systems, Inc., Madison, Wl ou Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), seguida de redução de erro e montagem por PCR de sobreposição. Esses métodos têm o potencial de reduzir o custo de grandes DNAs sintéticos para menos de 1 por cento por base. A melhora na eficiência e precisão e a queda rápida no custo de síntese de DNA de larga escala fornecem um ímpeto para o desenvolvimento e ampla aplicação da estratégia SAVE.
Codificação alternativa, viés de códon e viés de par de códons
Codificação alternativa
Um determinado peptídeo pode ser codificado por um número maior de sequências de ácido nucleico.
Por exemplo, mesmo um típico oligopeptídeo curto de 10-mer pode ser codificado por aproximadamente 410 (cerca de 106, e as proteínas de PV podem ser codificadas por cerca de 10442 ácidos nucleicos diferentes. A seleção natural veio a escolher um desses possíveis 10442 ácidos nucleicos como o genoma de PV. Enquanto a sequência primária de aminoácidos é o nível de informação mais importante codificado por um determinado mRNA, existem tipos adicionais de informação com diferentes tipos de sequências de RNA. Aí se incluem elementos estruturais de RNA de função distinta (por exemplo, o elemento de replicação de atuação-cis ou CRE (Goodfellow et al., McKnight, 2003), sinais cinéticos de tradução (locais de pausa, locais de troca de quadro, etc.), sinais de poliadenilação, sinais de emenda, funções enzimáticas (ribozima) e, muito provavelmente, outras informações e sinais ainda não identificados.
Mesmo com a advertência de que sinais tais como CRE devem ser preservados, 10442 sequências de codificação proporcionam uma tremenda flexibilidade para fazer mudanças drásticas na sequência de RNA de pólio ao mesmo tempo em que preserva a capacidade de codificar a mesma proteína. Podem ser feitas mudanças no viés de códon ou viés de par de códons, e podem ser acrescentados ou removidos sinais de ácido nucleico e estruturas secundárias no RNA. Proteínas adicionais ou novas podem ser simultaneamente codificadas em quatros alternativos (ver, por exemplo, Wang et al., 2006).
Viés de códon
Enquanto a maioria dos aminoácidos pode ser codificada por vários códons diferentes, muitas vezes nem todos os códons são usados de forma igual: alguns são códons "raros", enquanto outros são códons "frequentes". Da forma aqui utilizada, um códon "raro" é um de pelo menos dois códons sinônimos codificando um aminoácido em particular que está presente em um mRNA a uma frequência significativamente mais baixa do que o códon usado com mais frequência para aquele aminoácido. Assim, o códon raro pode estar presente em uma frequência 2 vezes mais baixa do que o códon mais usado. De preferência, o códon raro está presente em uma frequência 3 vezes mais baixa, com preferência ainda maior 5 vezes mais baixa do que o códon mais usado para o aminoácido. Ao inverso, um códon "frequente" é um de pelo menos dois códons sinônimos codificando um aminoácido em particular que está presente em um mRNA a uma frequência significativamente mais alta do que o códon usado com mais frequência para aquele aminoácido. De preferência, o códon frequente está presente em uma frequência 2 vezes mais alta, com preferência ainda maior 3 vezes mais alta do que o códon menos usado para o aminoácido. Por exemplo, os genes humanos usam o códon de leucina CTG 40% do tempo, mas usam o CTA sinônimo somente 7% do tempo (ver Tabela 2). Assim, o CTG é um códon frequente, enquanto o CTA é um códon raro. De forma aproximadamente coerente com essas frequências de uso, existem 6 cópias no genoma para o gen do tRNA reconhecendo o CTG, enquanto existem somente 2 cópias do gene para o tRNA reconhecendo o CTA. De forma semelhante, os genes humanos usam os códons frequentes TCT e TCC para serina 18% e 22% do tempo respectivamente, mas o códon raro TCG somente 5% do tempo. O TCT e 5 o TCC são lidos, via oscilação, pelo mesmo tRNA, que tem 10 cópias de seu gene no genoma, enquanto o TCG é lido por um tRNA com apenas 4 cópias. É bem sabido que esses mRNAs que são traduzidos de forma bem ativa têm uma forte tendência de usar apenas os códons mais frequentes. Isso inclui genes para proteínas ribossômicas e enzimas glicolíticas. Por outro lado, os mRNAs para 10 proteínas não muito abundantes podem usar os códons raros. Tabela 2, Códon no Homo sapiens (fonte: HTTP://www,kazusa,or,jp/codon)
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A propensão dos genes de alta expressão de usar os códons frequentes é chamada de "viés de códon". Um gene de uma proteína ribossômica pode usar somente os 20 a 25 mais frequentes dos 61 códons, e ter um alto viés de códon (um viés de códon próximo de 1), enquanto um gene mal expressado pode usar todos os 61 códons e ter pouco ou nenhum viés de códon (um viés de códon perto de 0). Imagina-se que os códons usados com mais frequência sejam aqueles em que estejam expressas maiores quantidades do tRNA cognato e que o uso desses códons permite que a tradução ocorra de forma mais rápida, ou mais precisa, ou ambos. A proteína capsídea PV é traduzida de forma bastante ativa e tem um alto viés de códon.
Viés de par de códons
Uma característica distinta das sequências de codificação é o seu viés de par de códons. Isso pode ser ilustrado considerando-se o par de aminoácido Ala-Glu, que pode ser codificado por 8 pares de códons diferentes. Se nenhum outro fator além da frequência de cada códon individual (como mostrado na Tabela 2) for responsável pela frequência do par de códons, a frequência esperada de cada uma das 8 codificações pode ser calculada multiplicando-se as frequências dos dois códons relevantes. Por exemplo, por este cálculo, esperar-se-ia que o par de códons GCA-GAA ocorresse a uma frequência de 0,097 de todos os pares de codificação Ala-Glu (0,23 x 0,42; com base nas frequências da Tabela 2). Para relacionar a frequência esperada (hipotética) de cada par de códons em relação à frequência realmente observada do genoma humano, foi usado o banco de dados Consensus CDS (CCDS) de regiões de codificação humana anotadas de forma consistente, contendo um total de 14.795 genes humanos. Este grupo de genes é a representação mais abrangente de sequências de codificação humanas. Usando esse grupo de genes, as frequências de uso de códon foram recalculadas dividindose o número de ocorrências de um códon pelo número de todos as codificações de códons sinônimos para o mesmo aminoácido. Como esperado, as frequências foram estreitamente correlacionadas com as anteriormente publicadas, tais como as informadas na Tabela 2. Pequenas variações de frequência são possíveis em razão de um efeito de sobreamostragem nos dados fornecidos pelo banco de dados de uso de códon no Instituto de Pesquisa de DNA Kazusa (http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html) onde 84.949 sequências de codificação humanas foram incluídas no cálculo (muito mais do que o número real de genes humanos). As frequências de códon assim calculadas foram então usadas para 5 calcular as frequências de par de códons, primeiro multiplicando as frequências dos dois códons relevantes entre si (ver a frequência esperada na Tabela 3) e depois multiplicando este resultado pela frequência observada (em todo o grupo de dados CCDS) em que ocorre o par de aminoácidos codificado pelo par de códons em questão. No exemplo do par de códons GCA-GAA, este segundo cálculo dá uma 10 frequência esperada de 0,098 (em comparação com 0,97 no primeiro cálculo usando o grupo de dados Kazusa). Finalmente, as frequências reais de pares de códons como observadas em um grupo de 14.795 genes humanos foi determinada contando o número total de ocorrências de cada par de códons no grupo e dividindo-o pelo número de todos os pares de codificação sinônimos no grupo codificando para o 15 mesmo par de aminoácidos (Tabela 3; frequência observada). A frequência e os valores observados/esperados para o grupo completo de 3.721 (612) pares de códons, com base em um grupo de 14.795 genes humanos, são aqui fornecidas como Tabela Complementar 1.
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Se a proporção de frequência observada/frequência esperada do par de códons for maior do que um, diz-se que o par de códons está sobrerrepresentado. Se a proporção for menor do que um, diz-se que está subrepresentado. No exemplo, o par de códons GCA-GAA está sobrerrepresentado 1,65 vezes, enquanto o par de codificação GCC-GAA está subrepresentado mais de 5 vezes. Muitos outros pares de códons mostram um viés bastante forte; alguns pares estão subrepresentados, enquanto outros estão sobrerrepresentados. Por exemplo, os pares de códons GCCGAA (AlaGlu_ e GATCTG (AspLeu) são de três a seis vezes subrepresentados (os pares preferidos sendo GCAGAG e GACCTG respectivamente), enquanto os pares de códons GCCAAG (AlaLys) e AATGAA (AsnGlu) são sobrerrepresentados em cerca de duas vezes. É importante observar que o viés de par de códons não tem nada a ver com a frequência de pares de aminoácidos, nem com a frequência de códons individuais. Por exemplo, o par subrepresentado GATCTG (AspLeu) usa o códon Leu mais frequente (CTG).
O viés de par de códons foi descoberto em células procarióticas (ver Greve et al, 1989), mas desde então foi visto em todas as outras espécies examinadas, incluindo humanos. O efeito tem uma influência estatística bastante alta, e certamente não é apenas ruído. No entanto, sua importância funcional, se alguma, é um mistério. Uma proposta é a de que alguns pares de tRNAs interagem bem quando unidos no ribossomo, enquanto outros pares interagem mal. Como normalmente diferentes códons são lidos por diferentes tRNAs, os pares de códons podem ter tendência de evitar unir pares de tRNAs incompatíveis (Greve et al., 1989). Outra ideia é a de que muitos (mas não todos) pares subrepresentados têm um dinucleotídeo central CG (por exemplo, GCCGAA codificando AlaGlu) e o dinucleotídeo CG é sistematicamente subrepresentado em mamíferos (Buchan et al., 2006; Curran et al., 1995; Fedorov et al., 2002). Assim, os efeitos do viés de par de códons podem ser de dois tipos - um deles um efeito indireto da subrepresentação do CG no genoma mamífero e o outro relacionado à eficiência, velocidade e/ou precisão da tradução. Enfatize-se que a presente invenção não está limitada a qualquer tipo de mecanismo particular subjacente ao viés de par de códons.
Como discutido de forma mais completa abaixo, o viés de par de códons leva em consideração o escore para cada par de códons em uma sequência de codificação com média calculada por todo o comprimento da sequência de codificação. De acordo com a invenção, o viés de par de códons é determinado por
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Assim também, um viés de par de códons semelhante para uma sequência de codificação pode ser obtido, por exemplo, escores de par de códons minimizados por uma subsequência ou escores de par de códons moderadamente diminuídos por toda a extensão da sequência de codificação.
Como todos os 61 códons de sentido e todos os pares de códons de sentido certamente podem ser usados, não se esperaria que a substituição de um único códon raro por um códon frequente, ou um par de códons raros por um par de códons frequentes, tivesse muito efeito. Assim, muitas investigações anteriores de códon e de viés de par de códons foram feitas via informática, não experimentação. Uma investigação de viés de par de códons que se baseou em trabalho experimental foi o estudo de Irwin et al (1995), que descobriu, de forma contrária à intuição, que certos pares de códons sobrerrepresentados causaram tradução mais lenta. No entanto, esse resultado não pôde ser reproduzido por um segundo grupo (Cheng e Goldman, 2001), e também está em conflito com os resultados relatados abaixo.
Assim, os presentes resultados (ver abaixo) podem ser a primeira evidência experimental do papel funcional do viés de par de códons.
Certos experimentos aqui divulgados se relacionam à recodificação de sequências de genoma virai, tais como toda a região capsídea do PV, envolvendo cerca de 1000 códons, para incorporar separadamente tanto o viés de códon ruim quanto o viés de par de códons ruim no genoma. A lógica subjacente a esses experimentos é de que, se cada substituição cria um pequeno efeito, então todas as substituições juntas devem criar um efeito maior. De fato, ocorre que tanto o viés de códon desotimizado quanto o viés de par de códons desotimizado criam, separadamente, vírus inviáveis. Como será discutido com mais detalhe nos Exemplos, dados preliminares sugerem que uma tradução ineficiente é o principal mecanismo para reduzir a viabilidade de um vírus com viés de códon ou viés de par de códons ruim. Independente do mecanismo preciso, os dados indicam que a substituição de larga escala de códons sinônimos desotimizados em um genoma virai resulta em vírus severamente atenuados. Esse procedimento para produzir vírus atenuados foi chamado de SAVE (Engenharia de Vírus Atenuado Sintético).
De acordo com a invenção, a atenuação virai pode ser obtida por meio de mudanças no viés de par de códons bem como no viés de códon. No entanto, espera-se que o ajuste do viés de par de códons seja particularmente vantajoso. Por exemplo, a atenuação de um vírus através do viés de códon geralmente requer a eliminação dos códons comuns, de forma que a complexidade da sequência de nucleotídeos é reduzida. Em contraste, a redução ou minimização do viés de par de códons pode ser obtida enquanto se mantém uma maior diversidade de sequência, e consequentemente um maior controle sobre a estrutura secundária do ácido nucleico, temperatura de arrefecimento e outras propriedades físicas e bioquímicas.
O trabalho aqui divulgado inclui sequências reduzidas ou minimizadas de viés de par de códons atenuado nos quais os códons são embaralhados, mas o perfil de uso de códons permanece inalterado.
A atenuação virai pode ser confirmada de formas que são bem conhecidas por pessoas de conhecimento normal no ofício. Exemplos não limitantes incluem ensaios de placa, medidas de crescimento e mortalidade reduzida em animais de teste. A aplicação instantânea demonstra que os vírus atenuados são capazes de induzir respostas imunológicas protetoras em um hospedeiro.
Engenharia de Vírus Atenuado Sintético (SAVE)
O SAVE utiliza software de computador especificamente projetado e métodos modernos de síntese e montagem de ácido nucleico para recodificar e ressintetizar os genomas dos vírus. Esta estratégia fornece um método eficiente de produzir vacinas contra vírus importantes do ponto de vista médico para os quais se buscam vacinas eficazes.
Duas vacinas eficazes de poliomielite, uma vacina de poliomielite inativada (IPV) desenvolvida por Jonas Salk e uma vacina de poliomielite oral (OPV) incluindo vírus atenuado vivo desenvolvido por Albert Sabin, respectivamente, estão disponíveis desde os anos 50. Com efeito, um esforço global para erradicar a poliomielite iniciado em 1988 e dirigido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) teve sucesso em erradicar a poliomielite da maioria dos países do mundo. O número de casos diagnosticados anualmente foi reduzido de centenas de milhares para menos de dois mil em 2005, ocorrendo principalmente na índia e na Nigéria. No entanto, uma preocupação em relação ao amplo uso do OPV é que ele pode reverter para uma forma virulenta e, embora se acredite ser in evento raro, já foram relatados casos de poliomielite derivado de vacina (Georgescu et al.,1997; Kew et al., 2002; Shimizu et al., 2004). Na verdade, contanto que sejam usadas estirpes de vacinas vivas do vírus de poliomielite, cada uma carregando menos de 7 mutações atenuantes, existe a possibilidade de que esta estirpe venha a reverter para wt, e tal reversão representa uma séria ameaça à completa erradicação da poliomielite. Assim, a OMS 5 pode bem precisar de uma nova vacina contra poliomielite para combater o potencial de reversão nos estágios finais de seus esforços de erradicação de poliomielite, e isso fornece uma razão para os estudos aqui divulgados sobre a aplicação de SAVE no PV. No entanto, o PV foi selecionado principalmente porque é um excelente sistema de modelo para desenvolver o SAVE.
Durante a recodificação, os sinais essencial de ácido nucleico no genoma virai são preservados, mas a eficiência da tradução de proteína é sistematicamente reduzida pela desotimização do viés de códon, do viés de par de códons e outros parâmetros tais como estrutura secundária de RNA e teor de dinucleotídeo CpG, teor de C+G, locais de deslocamento do quadro de leitura na tradução, locais de pausa na tradução ou qualquer combinação dos anteriores. Essa desotimização pode envolver centenas ou milhares de mudanças, cada uma com um pequeno efeito. Em geral, a desotimização é realizada até o ponto em que o vírus ainda pode ser cultivado em algumas linhas de célula (incluindo linhas especificamente engendradas para serem permissivas a um vírus em particular), mas em que o vírus ainda é avirulento em animal ou humano normal. Tais vírus avirulentos são excelentes candidatos para uma vacina morta ou viva, já que codificam exatamente as mesmas proteínas que o vírus totalmente virulento e, assim, provocam exatamente a mesma resposta imunológica que o vírus totalmente virulento. Além disso, o processo SAVE oferece a perspectiva de ajuste fino do nível de atenuação; isto é, fornece a capacidade de 25 projetar vírus sintéticos que são desotimizados até uma medida aproximadamente previsível. Projeto, síntese e produção de partículas virais podem ser obtidos em um prazo de semanas uma vez que a sequência de genoma seja conhecida, o que tem importantes vantagens para a produção de vacinas em emergências em potencial. Além disso, espera-se que os vírus atenuados tenham praticamente nenhum potencial para reverter para a virulência em razão do número extremamente alto de mudanças nocivas de nucleotídeo envolvidas. Esse método pode ser geralmente aplicável a uma ampla gama de vírus, exigindo apenas conhecimento da sequência de genoma virai e um sistema de genética reversa para um vírus em particular.
Atenuação de vírus pela desotimização do viés de códon
Se for usada a razão de IC50 do método de células de controle/células de teste como acima descrito, então os compostos com valores de CSG menor ou igual a 1 não seriam geralmente considerados bom compostos clínicos candidatos, enquanto compostos com valores CSG maiores do que aproximadamente 10 seriam bem promissores e dignos de verificação adicional.
Como meio de engendrar vírus atenuados, a região de codificação de capsideo do vírus de poliomielite tipo 1 Mahoney [PV(M)] foi reengendrado fazendo-se mudanças no uso de códons sinônimos. A região capsídea inclui cerca de um terço do vírus e é traduzida de forma bem ativa. Foi criado um vírus mutante (vírus PV-AB) com um viés de códon bastante baixo em razão da substituição do maior número possível de códons frequentemente usados por códons sinônimos. Como controle, foi criado outro vírus (PV-SD) com o maior número possível de mudanças de códons sinônimos, mantendo o viés de códon original. Ver Figuras 1 e 2. Assim, o PV-SD é um vírus contendo essencialmente os mesmos códons que o wt, mas em posição embaralhada, codificando exatamente as mesmas proteínas. No PV-SD, não foi feita nenhuma tentativa para aumentar ou reduzir o viés de par de códons pelo procedimento de baralhamento. Ver Exemplo 1. Apesar de 934 mudanças de nucleotídeo na região de codificação de capsídeo, o PV-SD RNA produziu um vírus com características indistinguíveis do wt. Em contraste, nenhum vírus viável foi recuperado do PV-AB carregando 680 mutações silenciosas. Ver Exemplo 2.
Uma explicação trivial da inviabilidade do PV-AB e que apenas uma das mudanças de nucleotídeo é de certa forma letal, enquanto as outras 679 são inofensivas. Por exemplo, uma mudança de nucleotídeo poderia ser fatal por algum motivo catastrófico ou indesejado, tal como impedir a replicação. Essa explicação é improvável, no entanto. Embora o PV contenha importantes elementos reguladores, em seu RNA, como o CRE, sabe-se que nenhum desses elementos existe dentro da região de codificação do capsídeo. Isso é comprovado pela demonstração de que toda a região de codificação do capsídeo pode ser excluída sem afetar a replicação normal do genoma residual dentro da célula, embora, naturalmente, não possam ser formadas partículas virais (Kaplan e Racamiello, 1988).
Para tratar de questões relacionadas à inviabilidade de certos vírus reengendrados, foram subclonados subsegmentos da região de capsídeo do vírus PV-AB no vírus de tipo selvagem. Ver Exemplo 1 e Fig. 3. A incorporação de grandes segmentos subclonados (incluindo segmentos não sobrepostos) mostrou ser fatal, enquanto pequenos segmentos subclonados produziram vírus viáveis (com uma exceção) mas doentes. A "doença" é revelada por muitos ensaios: por exemplo, segmentos de viés de códon ruim causam titragens (Fig. 3B) e placas pequenas (Figuras 3C-H). É particularmente instrutivo que, em geral, segmentos grandes e fatais podem ser divididos em dois subsegmentos, ambos os quais estão vivos mas doentes (Figura 3). Esses resultados excluem a hipótese de que a inviabilidade se deve a apenas uma mudança; em vez disso, no mínimo, muitas mudanças devem estar contribuindo para o fenótipo.
Existe um segmento excepcional da posição 1513 a 2470. Este segmento é um tanto pequeno, mas sua inclusão no genoma do PV causa inviabilidade. Não se sabe atualmente se este fragmento pode ou não ser subdividido em subfragmentos que apenas causam doença e não inativam o vírus. É concebível que este segmento contenha uma mudança altamente nociva, possivelmente em um local de deslocamento do quadro de leitura de tradução.
Como um viés de códon ruim naturalmente sugere um efeito na tradução, foi testada a tradução das proteínas codificadas pelo vírus PV-AB. Ver Exemplo 5 e Fig. 5. Com efeito, todos os vírus doentes traduziram a proteína capsídea de forma ruim (Fig. 5B). A tradução foi menos eficiente em virus mais doentes, de forma coerente com a tradução ruim ser a causa para a doença. A tradução foi essencialmente melhor em níveis de wt em reações que foram complementadas com tRNAs e aminoácidos a mais (Fig. 5A), de forma coerente com o índice de reconhecimento de códons raros ser limitante.
Como um segundo teste para verificar se o viés de códon desotimizado estava causando tradução ineficiente, partes do capsídeo wt e desotimizado foram fundidas ao N-terminal da luciferase de vaga-lume em uma construção de indicador dicistrônico. Ver Exemplo 5 e Fig. 6. Nessas construções de fusão, a tradução da luciferase depende da tradução da proteína capsídea fundida de forma N-terminal. Novamente, descobriu-se que a tradução das proteínas capsídeas com códons desotimizados foi ruim, e foi pior em vírus mais doentes, sugerindo uma relação de causa e efeito. Assim, os dados sugerem que centenas de códons raros no vírus PV- AB causam inviabilidade em grande medida por causa da tradução ruim. Além disso, a tradução ruim observada in vitro e a doença viral observada em células cultivadas são também refletidas nas infecções de animais. Mesmo para um dos menos debilitados dos vírus desotimizados, o PV-AB2470"2954, o número de partículas virais necessário para causar doenças em ratos foi aumentado em cerca de 100 vezes. Ver Exemplo 4, Tabela 4. Burns et al. (2006) recentemente descreveram alguns experimentos semelhantes com a estirpe da vacina Sabin tipo 2 e chegaram a conclusões semelhantes. Burns et al sintetizaram um vírus desotimizados em códon completamente diferente (isto é, as sequências de nucleotídeos do vírus PV-AB aqui descritas e seus vírus "abcd" são bem diferentes) e no entanto tiveram um grau semelhante de debilitação usando ensaios semelhantes. Burns et al não testaram suas construções virais em organismos hospedeiros em relação à atenuação. No entanto, seu resultado confirma a visão de que o SAVE é previsível, e que os resultados não têm grande dependência da exata sequência de nucleotídeos.
Atenuação de vírus pela desotimização do viés de par de códons
De acordo com a invenção, o viés de par de códons pode ser alterado de forma independente do uso do códon. Por exemplo, em uma sequência de codificação de proteína de interesse, o viés de par de códons pode ser alterado pela redisposição direcionada de seus códons. Em particular, os mesmos códons que aparecem na sequência matriz, que podem ser de frequência variável no organismo hospedeiro, são usados na sequência alterada, mas em posições diferentes. Na forma mais simples, como os mesmos códons são usados na sequência matriz, o uso de códons sobre a região de codificação de proteína sendo levada em consideração permanece inalterada (assim como a sequência de aminoácidos codificados). No entanto, certos códons aparecem em novos contextos, isto é, precedidos e/ou seguidos por códons que codificam os mesmos aminoácido da sequência matriz, mas utilizando um grupo diferente de três nucleotideos. Numa situação ideal, a redisposição de códons resulta em pares de códons que são menos frequentes do que na sequência matriz. Na prática, a redisposição dos códons muitas vezes resulta em um par de códons menos frequente em um local e um par mais frequente em um segundo local. Com uma criteriosa redisposição dos códons, o viés de uso de par de códons por um determinado comprimento de sequência de codificação pode ser reduzido em relação à sequência matriz. Alternativamente, os códons poderiam ser redispostos de forma a produzir uma sequência que faça uso dos pares de códons que são mais frequentes no hospedeiro do que na sequência matriz.
O viés de par de códons é avaliado considerando cada par de códons um por um, atribuindo um escore a cada par de acordo com a frequência com que o par de códons é observada na sequências de codificação de proteína do hospedeiro, e depois determinando o viés de par de códons para a sequência, como aqui divulgado. Será constatado que se podem criar muitas sequências diferentes que têm o mesmo viés de par de códons. Ainda, o viés de par de códons pode ser alterado em maior ou menor extensão, dependendo da forma em que os códons são redispostos. O viés de par de códons de uma sequência de codificação pode ser alterado recodificando-se toda a sequência de codificação, ou recodificando-se uma ou mais subsequências. Da forma aqui utilizada, o "viés de par de códons" é avaliado em toda a extensão de uma sequência de codificação, muito embora apenas uma parte da sequência possa ser modificada. Como os pares de códons recebem escore no contexto do uso de códon pelo organismo hospedeiro, pode ser atribuído um valor de viés de par de códons às sequências virais de tipo selvagem e sequências virais mutantes. De acordo com a invenção, um vírus pode ser atenuado pela recodificação de todas ou parte das sequências de codificação de proteína do vírus de forma a reduzir seu viés de par de códons. De acordo com a invenção, viés de par de códons é uma propriedade quantitativa determinada a partir do uso de par de códons de um hospedeiro. Assim também, podem ser determinados valores absolutos de viés de par de códons para qualquer sequência de codificação de proteína virai. Alternativamente, podem ser determinadas mudanças relativas nos valores de viés de par de códons que relacionam uma sequência de codificação de proteína viral a uma sequência "matriz" da qual é derivada. Como os vírus vêm em diversos tipos (ou seja, tipos de I a VII pela classificação Baltimore) e os isolados naturais (isto é, virulentos) de diferentes vírus resultam em diferentes valores de viés de par de códons absoluto, são as mudanças relativas em viés de par de códons que são normalmente mais relevantes para determinar os níveis desejados de atenuação. Assim também, a invenção fornece vírus atenuados e métodos para fazê-los em que os vírus atenuados incluem genomas virais nos quais uma ou mais sequências de nucleotídeos de codificação de proteínas têm o viés de par de códons reduzido por mutação. Em vírus que codificam uma única proteína (isto é, uma poliproteína), toda ou parte da poliproteína pode ser mudado até um grau desejado para reduzir o viés de par de códons e toda ou parte da sequência mudada pode ser fornecida em uma construção virai recombinante. Para um vírus que codifica separadamente múltiplas proteínas, pode- se reduzir o viés de par de códons de todas as sequências de codificação de proteína simultaneamente ou selecionar apenas uma ou mais sequências de codificação de proteína para modificação. A redução em viés de par de códons é determinada sobre a extensão de uma sequência de codificação de proteína, e é de pelo menos cerca de 0,05, ou pelo menos cerca de 0,1, ou pelo menos cerca de 0,15, ou pelo menos cerca de0,2, ou pelo menos cerca de 0,3, ou pelo menos cerca de 0,4. Dependendo do vírus, o viés de par de códons absoluto, com base no uso de par de códons do hospedeiro, pode ser de cerca de -0,05 ou menos, ou cerca de -0,1 ou menos, ou cerca de -0,15 ou menos, ou cerca de -0,2 ou menos, ou cerca de -0,3 ou menos, ou cerca de -0,4 ou menos. Ficará aparente que o viés de par de códons também pode ser superposto na outra variação de sequência. Por exemplo, uma sequência de codificação pode ser alterada tanto para codificar uma proteína ou polipeptídio que contenha um ou mais mudanças de aminoácido quanto para ter um viés de par de códons alterado. Ainda, em alguns casos, podem-se embaralhar os códons para manter exatamente o mesmo perfil de uso de códons em uma sequência de codificação de proteína reduzida por viés de códons e em uma sequência de codificação de proteína matriz. Este procedimento destaca o poder das mudanças de viés de par de códons, mas não precisa ser seguido. Alternativamente, a seleção de códons pode resultar em uma mudança geral no uso de códons em uma sequência de codificação. Neste aspecto, observa-se que em certos exemplos aqui fornecidos (por exemplo, a elaboração do PV-Min), mesmo se o perfil de uso de códons não for modificado no processo de geração de uma sequência minimizada de viés de par de códons, quando uma parte dessa sequência for subclonada em uma sequência não mudada (por exemplo, PV-MinXY ou PV-MinZ), o perfil de uso de códons sobre a parte subclonada, e no híbrido produzido, não irá fechar com o perfil da sequência de codificação de proteína original não modificada. No entanto, essas mudanças no perfil de uso de códons possuem efeito mínimo no viés de par de códons. De forma semelhante, observa-se que, por si só, mudar uma sequência de nucleotídeos para codificar uma proteína ou polipeptídio com uma ou mais substituições de aminoácidos também tem pouca probabilidade de produzir uma sequência com mudança significativa no viés de par de códons. Consequentemente, as alterações de viés de par de códons podem ser reconhecidas mesmo em sequências de nucleotideos que tenham sido modificadas ainda mais para codificar uma sequência modificada de aminoácidos. Também cumpre observar que as mutações que, por si só, tenham a função de aumentar o viés de códon provavelmente não terão mais do que um pequeno efeito sobre o viés de par de códons. Por exemplo, como aqui divulgado, o viés de par de códons para um vírus de poliomielite mutante recodificado para maximizar o uso de códons não preferidos (PV-AB) é diminuído a partir de um tipo selvagem (PV-I(M)) em apenas cerca de 0,05. Também cumpre observar que tal sequência de codificação de proteína tem uma diversidade de sequência bastante diminuída. Ao contrário, uma substancial diversidade de sequência é mantida em sequências de viés de par de códons modificados da invenção. Além disso, a redução significativa de viés de par de códons que se obtém sem aumentar o uso dos códons raros sugere que, em vez de maximizar o uso dos códons não preferidos, como em PV-AB, seria benéfico redispor os códons não preferidos com um número suficiente de códons preferidos para reduzir o viés de par de códons de forma mais eficiente.
A extensão e a intensidade da mutação podem variar dependendo do comprimento do ácido nucleico de codificação de proteína e se todo ou parte pode ser mudado, e a redução desejada do viés de par de códons. Em uma configuração da invenção, uma sequência de codificação de proteína é modificada em uma extensão de pelo menos 100 nucleotideos, ou pelo menos cerca de 200 nucleotideos, ou pelo menos cerca de 300 nucleotideos, ou pelo menos cerca de 500 nucleotideos, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotideos.
Como discutido acima, a expressão vírus "matriz" ou sequência de codificação de proteína "matriz" é usada aqui para se referir a genomas virais e sequências de codificação de proteína das quais são derivadas novas sequências, que podem ser mais ou menos atenuadas. Assim também, um vírus matriz pode ser protótipo ou isolado ou variante ou mutante de "tipo selvagem" ou "de ocorrência natural" especificamente criado ou selecionado com base nas propriedades desejáveis reais ou percebidas.
Usando a síntese DNA "de novo", a região de codificação do capsídeo (a região P1 do nucleotídeo 755 ao nucleotídeo 3385) do PV(M) foi reelaborada para introduzir o maior número possível de pares de códons raramente usados (vírus PV-Min)(SEQ ID NO:4) ou o maior número possível de pares de códons frequentemente usados (vírus PV-MAX) (SEQ ID NO:5), preservando o viés de códon do vírus de tipo selvagem. Ver Exemplo 7. Isto é, as sequências designadas usam os mesmos códons que a sequência matriz, mas aparecem em ordem diferente. O vírus PV-Max mostrou cinética de crescimento de um passo e matança de células infectadas essencialmente idênticas ao vírus de tipo selvagem. (O fato de que a cinética de crescimento não é aumentada para um vírus maximizado por par de códons em relação a um tipo selvagem parece ocorrer também em outros vírus.) De forma inversa, as células transfectadas com o RNA mutante PV-Min não foram mortas, e nenhum vírus viável pode ser recuperado. A subclonagem de fragmentos (PV- Min755'2470) pv-Min2470"3386) ja regjão capsídea do PV-Min na formação do wt produziu vírus bastante debilitados, mas não mortos. Ver Exemplo 7 e Fig. 8. Este resultado confirma a hipótese de que mudanças nocivas de códon são de preferência distribuídas de forma ampla e demonstra a simplicidade e eficácia de variar a extensão da sequência desotimizada por par de códons que é substituída em um genoma de vírus matriz de tipo selvagem para variar o viés de par de códons para a sequência geral e a atenuação do produto virai. Como se viu com os vírus PV-AB, o fenótipo dos vírus PV-Min é um resultado da infectividade específica reduzida das partículas virais e não da baixa produção de vírus de progénie.
Vírus com viés de par de códons desotimizados são atenuados. Como exemplificado abaixo (ver Exemplo 8 e Tabela 5), os ratos CD155tg sobreviveram o desafio por injeção intracerebral do vírus atenuado em quantidades 1000 vezes mais altas do que seriam fatais para o vírus do tipo selvagem. Essas descobertas demonstram o poder da desotimização do viés de par de códons para minimizar a letalidade de um vírus. Além disso, a viabilidade do vírus pode ser equilibrada com a redução da infectividade escolhendo-se o grau de desotimização de viés de par de códons. Além disso, uma vez que tenha sido determinado um grau ou faixas de grau de desotimização de viés de par de códons que forneça as propriedades desejadas de atenuação, podem ser elaboradas sequências adicionais para atingir esse grau de viés de par de códons. Por exemplo, SEQ ID NO:6 fornece uma sequência de vírus de poliomielite com um viés de par de códons de cer4ca de -0,2, e mutações distribuídas por toda a região englobando as partes modificadas de PV-MinXY e PV- MinZ (isto é, py755"3385).
Algoritmos para elaboração de sequência
Os inventores desenvolveram vários novos algoritmos para elaboração de gene que otimizam a sequência de DNA para propriedades desejadas em particular e codificam simultaneamente para a dada sequência de aminoácidos. Em particular, foram desenvolvidos algoritmos para maximizar ou minimizar a estrutura secundária de RNA desejada na sequência (Cohen e Skiena, 2003) bem como acrescentando ou removendo de forma máxima grupos especificados de padrões (Skiena, 2001). A primeira questão surge ao elaborar vírus viáveis, enquanto a segunda é útil para inserir locais de restrição de forma ótima por motivos tecnológicos. Também foi estudada a extensão com que podem ser elaborados genes sobrepostos que simultaneamente codifiquem dois ou mais genes em quadros de leitura alternados 5 (Wang et al., 2006). Essa propriedade de diferentes polipeptídios funcionais sendo codificados em diferentes quadros de leitura de um único ácido nucleico é comum em vírus e pode ser explorada para fins tecnológicos tais como incluir genes de resistência antibiótica. Foi construída a primeira geração de ferramentas de elaboração de biologia 10 sintética, como descrito por Jayaraj et al. (2005) e Richardson et al. (2006). Esses se concentram principalmente em projetos de otimização para manufaturabilidade (isto é, oligonucleotídeos sem estruturas secundárias locais e repetições finais) em vez de sequências de otimização para atividade biológica. Essas ferramentas de primeira geração podem ser vistas como análogas às antigas Ferramentas VLSI 15 CAD construídas em torno de verificação de regras de projeto, em vez de dar suporte a princípios de projeto de mais alta ordem.
Como aqui exemplificado, pode ser usado um algoritmo de computador para manipular o viés de par de códons de qualquer região de codificação. O algoritmo tem a capacidade de embaralhar códons existentes e avaliar o CPB resultante, de 20 depois reembaralhar a sequência, opcionalmente travando pares de códons particularmente "valiosos". O algoritmo também utiliza uma forma de "arrefecimento simulado" para não ficar preso mínimos locais. Outros parâmetros, tais como a energia livre de dobra do RNA, podem opcionalmente estar sob o controle do algoritmo também, para evitar a criação de estruturas secundárias indesejadas. O 25 algoritmo pode ser usado para encontrar uma sequência com um viés de par de códons mínimo e, no caso de tal sequência não fornecer um vírus viável, o algoritmo pode ser ajustado para encontrar sequências com vies reduzidos, mas não minimizados. Naturalmente, também poderia ser produzida uma sequência virai viável usando apenas uma subsequência da sequência minimizada por computador. Seja ou não realizada com a ajuda de um computador, usando, por exemplo, um gradiente descendente, ou arrefecimento simulado, ou outra rotina de minimização. Um exemplo de procedimento de redispõe os códons presentes em uma sequência inicial pode ser representado pelos seguintes passos: 1) Obter sequência de genoma virai de tipo selvagem 2) Selecionar sequências de codificação de proteína para ser o alvo de projeto atenuado. 3) Travar segmentos de DNA conhecidos ou conjecturados com funções não codificadoras. 4) Selecionar a distribuição de códons desejada para os aminoácidos 15 remanescentes em proteínas reelaboradas. 5) Realizar baralhamento aleatório de posições de códon não travadas e calcular o escore de par de códons. 6) Reduzir (ou aumentar) ainda mais o escore de par de códons opcionalmente utilizando um procedimento de arrefecimento simulado. 20 7) Examinar o projeto resultante para identificar estrutura secundária excessiva e local de restrição indesejado: se sim -> vá para o passo (5) ou corrija ou projeto substituindo regiões problemáticas por sequências de tipo selvagem e vá para o passo (8). 8) Sintetizar a sequência de DNA correspondente ao projeto do vírus. 9) Criar construção viral e avaliar expressão: se muito atenuada, preparar construção subclone e ir para 9; se atenuada de forma insuficiente, ir para 2.
É fornecido o código fonte (script PERL) de uma rotina de arrefecimento simulado com base em computador.
Alternativamente, pode-se elaborar um procedimento que permita que cada par de aminoácidos seja desotimizado escolhendo um par de códons sem a exigência de que os códons sejam trocados de qualquer posição na sequência de codificação de proteína.
Mecanismos moleculares de atenuação virai: caracterização de PV atenuado usando métodos de alto rendimento.
Como descrito acima e em maior detalhe nos Exemplos, foram construídos dois vírus de poliomielite sintéticos atenuados codificando exatamente as mesmas proteínas que o vírus de tipo selvagem, mas tendo viés de códon alterado ou viés de par de códons alterado. Um vírus usa códons desotimizados; o outro vírus usa pares de códons desotimizados. Cada vírus tem muitas centenas de mudanças de nucleotídeo em relação ao vírus wt.
Os dados aqui apresentados sugerem que esses vírus são atenuados em razão de má tradução. Esta descoberta, se correta, tem consequências importantes. Primeiro, a aptidão/virulência reduzida de cada vírus se deve a pequenos defeitos em centenas de posições espalhadas pelo genoma. Assim, não existe essencialmente nenhuma chance de o vírus reverter para tipo selvagem, e assim o vírus é um bom ponto de partida para uma vacina viva ou morta. Segundo, se a aptidão/virulência for devida a efeitos aditivos de centenas de pequenos defeitos na tradução, esse método de reduzir a aptidão com mínimo risco de reversão deve ser aplicável a muitos outros vírus.
Embora se enfatize que a presente invenção não é limitada a qualquer modo de operação em particular do mecanismo molecular subjacente, estão em andamento estudos com o objetivo de distinguir essas hipóteses alternativas. As investigações em andamento envolvem o uso de métodos de alto rendimento para fazer a varredura de genomas de vários projetos de vírus atenuado tais como vírus de poliomielite e influenza desotimizados de códon e par de códons, e construir quimeras pela colocação de partes superpostas de 300-bp de cada vírus mutante em um contexto wt. Ver Exemplo 11. A função desses vírus quiméricos é então avaliada. A descoberta de que a maioria das quimeras é um pouco, mas não drasticamente, menos adequada do que o tipo selvagem, como sugerido pelos dados preliminares aqui divulgados, corrobora a hipótese de "perda incremental de função", em que muitas mutações nocivas são distribuídas pelas regiões cobertas pelas quimeras. De forma inversa, a descoberta de que a maioria das quimeras é semelhante ou idêntica a wt, enquanto uma ou apenas algumas quimeras são atenuadas como o mutante matriz, sugere que existem relativamente poucas posições na sequência em que a mutação resulta em atenuação e essa atenuação nessas posições é significativa.
Como descrito no Exemplo 12, são realizados experimentos para determinar como a desotimização por códon e par de códons influi na estabilidade e abundância de RNA, e identificar os parâmetros que prejudicam a tradução do genoma virai reengendrado. Uma compreensão da base molecular dessa perturbação irá destacar ainda mais a aplicabilidade da abordagem SAVE a uma ampla gama de vírus. Outro mecanismo concebível na perturbação da tradução é o deslocamento de quadro de leitura na tradução, onde o ribossomo começa a traduzir um quadro de leitura diferente, gerando um polipeptídio espúrio e tipicamente truncado, ao ponto em que encontra um códon de parada dentro do quadro. Os genomas de PV que carregam o segmento mutante AB do resíduo 1513 ao 2470 são não apenas inviáveis, mas também produzem uma nova banda de proteína durante a tradução in vitro de aproximadamente 42-44 kDa (ver Figura 5A). A capacidade deste fragmento 5 AB1513"2470 de inativar o PV, bem como a capacidade de introduzir produção da nova proteína, pode refletir a ocorrência de um evento de deslocamento do quadro de leitura e essa possibilidade também está sendo investigada. Um filtro para evitar a introdução de locais de deslocamento de quadro de leitura está embutido no software de projeto SAVE.
Investigações mais detalhadas de defeitos de tradução são conduzidas usando várias técnicas incluindo, mas sem limitação, perfil de polissomo, "pegada de dedo" e ensaio luciferase de proteínas de fusão, como descrito no Exemplo 12. Biologia molecular do vírus de poliomielite Enquanto estudos estão em andamento para desvendar os mecanismos por trás da 15 atenuação virai por SAVE, a desotimização de códon de larga escala da região de codificação do capsídeo do PV revelou percepções interessantes da biologia do PV em si. O que determina a proporção PFU/partícula (infectividade específica) de um vírus é uma questão bastante antiga. Em geral a falha em qualquer passo durante o ciclo de vida infeccioso antes do estabelecimento de uma infecção produtiva irá levar 20 a uma infecção abortiva e, desta forma, ao fim da partícula infeccionante. No caso do PV, foi demonstrado que aproximadamente 100 virions são necessários para resultar num evento infeccioso em células cultuadas (Joklik e Darnell, 1961; Schwerdt e Fogh, 1957). Isto é, das 100 partículas inoculadas, somente uma aproximadamente tem possibilidade de concluir com sucesso todos os passos no 25 nível de vinculação de receptor (passo 1), seguido por internalização e descorticação (passo 2), iniciação da tradução do genoma (passo 3), tradução da poliproteina (passo 4), replicação de RNA (passo 5) e encapsidação de progénie (passo 6).
No ciclo infeccioso dos vírus de tipo A-B aqui descritos, os passos 1 e 2 devem ser idênticos a uma infecção, já que seus capsídeos são idênticos. Igualmente, regiões 5 não traduzidas de 5' devem ter bom desempenho na montagem de um complexo de tradução (passo 3). A tradução de poliproteina virai, por outro lado (passo 4), é debilitada de forma severa em razão da introdução de um grande número de códons sinônimos aquém do ideal na região capsídea (Figuras 5 e 6). Pensa-se que o repetido encontro de códons raros pelo mecanismo de tradução causa a paralisação 10 do ribossomo já que, pelas leis da ação de massa o aminoacil-tRNA raro levará mais tempo para se difundir no local A do ribossomo. Como o prolongamento do peptídeo, em grande parte, é conduzido pela concentração de aminoacil-tRNA disponível, a dependência de um mRNA em muitos dos tRNAs raros, por consequência, aumenta o tempo de tradução (Gustafsson et al., 2004). Alternativamente, a excessiva 15 paralisação do ribossomo pode causar dissociação prematura do complexo de tradução do RNA e resultar numa proteína truncada destinada à degradação. Ambos os processos levam a um menor índice de síntese de proteína por molécula de mRNA por unidade de tempo. Enquanto os dados aqui apresentados sugerem que os fenótipos de vírus desotimizados em códon são determinados pelo índice de 20 tradução de genoma, podem ser possíveis outras explicações mecanísticas. Por exemplo, foi sugerido que as posições conservadas de códons sinônimos raros por toda sequência de capsideo viral no vírus da Hepatite A são de importância funcional para o correto dobramento do polipeptídio nascente pela introdução das pausas necessárias de tradução (Sanchez et al., 2003). Assim também, a alteração de larga 25 escala da composição de códon pode mudar de forma concebível alguns desses locais de pausa para resultar num aumento das proteínas capsídeas mal dobradas.
Não está claro se essas considerações também se aplicam ao capsídeo PV. Em caso afirmativo, esperar-se-ia um fenótipo alterado com o projeto PV-SD, no qual os códons wt fossem preservados, mas suas posições por todo o capsídeo fossem 5 completamente mudadas. Isto é, nenhum dos locais de pausa pretendido estaria na posição apropriada em relação à sequência de proteína. No entanto, não se observou nenhuma mudança de fenótipo e o PV-SD se traduziu e replicou em níveis de tipo selvagem. 3B).
Outra possibilidade é de que as alterações de códon em larga escala nos projetos 10 testados possam criar elementos fortuitos de RNA dominante negativo, tais como as estruturas secundárias estáveis, ou sequências que possam passar por interações disruptivas de longo alcance com outras regiões do genoma.
Presume-se que todos os passos antes da descorticação inclusive devem estar inalterados quando o wt e os vírus mutantes aqui descritos forem comparados. Isso 15 é confirmado pela observação de que o período de eclipse para todos esses isolados é semelhante (Figura 3B). Assim, a redução dramática da proporção PFU/partícula é provavelmente um resultado da capacidade reduzida de tradução dos genomas desotimizados, isto é, a deficiência dos vírus mutantes é determinada de forma intracelular.
Em geral se presume que a relativamente baixa proporção PFU/partícula dos picornavírus de 1/100 a 1/1.000 (Rueckert, 1985) é principalmente determinada por alterações estruturais no passo de vinculação do receptor, antes ou no nível de entrada na célula. A formação das partículas 135S que são pouco infecciosas pode ser a principal vilã por trás da ineficiência da infectividade do vírus de poliomielite 25 (Hogle, 2002). No entanto, alguns vírus mutantes parecem esquivar-se da conversão da partícula A sem resultar numa infectividade específica mais alta, uma observação que sugere que outros mecanismos pós-entrada podem ser responsáveis pela baixa proporção PFU/partícula (Dove e Racaniello, 1997).
Os dados apresentados fornecem clara evidência para tais interações pós-entrada 5 entre vírus e célula, e sugerem que esses, e não os eventos pré-entrada, contribuem para a distinta proporção PFU/partícula do vírus de poliomielite. Como todas as proteínas de replicação no vírus de poliomielite são localizadas posteriormente no P1 da poliproteína, elas dependem de forma crítica da conclusão bem sucedida da tradução de P1. Assim, baixar o índice de tradução de P1 baixa a tradução de todas 10 as proteínas de replicação na mesma medida. Isso, por sua vez, leva a uma provável redução na capacidade do vírus em fazer as modificações necessárias na célula hospedeira requerida para o estabelecimento de uma infecção produtiva, tal como a paralisação da tradução da célula hospedeira ou prevenção das respostas inatas da célula hospedeira. Enquanto a desotimização de códon, da forma aqui 15 descrita, tem probabilidade de efetuar tradução no passo de prolongamento de peptídeo, a iniciação reduzida de uma tradução também pode ser um poderoso determinante de atenuação, como foi demonstrado para mutações no local de entrada interno do ribossomo nas estirpes de vacina Sabin do vírus de poliomielite (Svitkin etal., 1993; 1985).
Com base nessas considerações, prevê-se que muitos dos fenótipos mutantes atribuíveis a defeitos na tradução do genoma ou replicação inicial do genoma na verdade se manifestam pela redução das proporções PFU/partícula. Este seria o caso contanto que o defeito resultasse em uma maior chance de infecção abortiva. Como em quase todos os estudos o ensaio de placa onipresente é o método de 25 detecção de vírus escolhido, uma redução na titragem de vírus aparente é muitas vezes equiparada a uma redução na produção de vírus em si. Isto pode ser uma cilada inerente que pode ser desculpada pelas dificuldades de caracterizar propriedades de vírus em nível de célula única. Em vez disso, a maioria dos ensaios é feita em uma grande população de células. Um resultado mais baixo do teste 5 escolhido (síntese de proteínas, replicação de RNA, produção de vírus como medida em PFU) é aceito sem contestação como indicador de produção mais baixa por célula, sem considerar que a produção de vírus em uma célula pode ser normal enquanto o número de células produzindo vírus é reduzido.
A produção quase idêntica de partículas por célula por vírus desotimizados em 10 códon indica que o total de proteína produzida após extensos períodos de tempo não é gravemente afetada, ao passo que o índice de produção de proteína foi drasticamente reduzido. Isso é refletido na demora da aparição do CPE, o que pode ser um sinal de que o vírus tem que passar por mais ciclos de replicação de RNA para reunir concentrações semelhantes de proteína de vírus intracelular. Parece que 15 os vírus desotimizados em códon são severamente deficientes em estabelecer uma infecção produtiva porque o índice de tradução inicial do genoma infectante que chega é reduzido. Como resultado desse baixo índice de tradução, as proteínas PV essenciais para desabilitar as respostas antivirais da célula (muito provavelmente proteinases 2Apro e 3Cpro) não são sintetizadas em quantidades suficientes para 20 ultrapassar este obstáculo crucial do ciclo de vida com velocidade suficiente. Em consequência, existe uma melhor chance para célula eliminar a infecção antes que a replicação virai possa acontecer e tomar conta da célula. Desta forma, a probabilidade de eventos de infecção produtiva é reduzida e o índice de infecção abortiva é aumentado. No entanto, no caso em que um vírus desotimizado em códon 25 não tenha sucesso em desabilitar a célula, este vírus irá produzir quantidades quase idênticas de progénie para o tipo selvagem. Os dados presentes sugerem que pode existir uma diferença fundamental entre a tradução inicial (do genoma de RNA que chega) e a tradução final durante a fase replicativa, quando a própria tradução da célula está bastante paralisada. Embora este possa ser um fenômeno geral, pode ser especialmente importante no caso de genomas desotimizados em códon. A paralisação da célula hospedeira muito provavelmente resulta em abundância excessiva de aminoacil-tRNAs livres, que podem superar o efeito imposto do uso de códon aquém do ideal, já que os genomas de PV já não têm que competir com os RNAs celulares por recursos de tradução. Isso, na verdade, pode ser análogo às 10 observações com o sistema modificado de tradução in vitro aqui descrito (Figura 5B).
Usando um extrato de tradução que não foi tratado por nuclease (e desta forma continha mRNAs celulares) e não complementado com aminoácidos exógenos ou tRNAs, foram observadas claras diferenças na capacidade de tradução de diferentes mutantes com projeto de capsídeo. Sob essas condições, os genomas virais têm 15 que competir com os mRNAs celulares em um ambiente onde os suprimentos são limitados. Em contraste, no extrato de tradução tradicional, nos quais os mRNAs endógenos foram removidos e os tRNAs e aminoácidos em excesso foram acrescentados, todos os RNAs do PV foram traduzidos de forma igual, independente de viés de códon (Fig. 5A). Essas duas condições diferentes in vitro podem ser 20 análogas à tradução in vivo durante as fases iniciais e finais na célula infectada por PV.
Uma descoberta essencial do presente estudo é a verificação de que, além dos passos durante a interação física e absorção do vírus, a proporção PFU/partícula também reflete bastante a capacidade do vírus de superar as respostas antivirais da 25 célula hospedeira. Isso sugere que os picornavírus são na verdade bastante ineficientes em vencer esta luta, e parecem ter tomado o caminho de evoluir pequenos genomas que podem rapidamente se replicar antes que a célula possa efetivamente responder. Como os dados mostram, atrasar os índices de tradução em apenas 30% no PV-AB2470’2954 (ver Figura 6) leva a um índice 1.000 vezes mais 5 alto de infecção abortiva como refletido na infectividade específica mais baixa (Figura 4D). Os picornavirus aparentemente não apenas se replicam no limiar da catástrofe de erro (Crotty et al, 2001; Holland et al, 1990) mas também no limiar de eliminação pelas defesas antivirais da célula hospedeira. Este efeito pode ter profundas consequências para o fenótipo patogênico de um picornavirus. Os 10 processos antivirais celulares responsáveis pelo aumento no índice de infecções abortadas por vírus desotimizados em códon não são completamente entendidos no momento. O PV mostrou tanto induzir quando inibir a apoptose (Belov et al., 2003; Girard et al., 1999; Tolskaya et al., 1995). De forma semelhante, o PV interfere no caminho do interferon dividindo o NF-KB (Neznanov et al., 2005). É plausível que um PV com um índice reduzido de tradução do genoma inicial ainda induza respostas antivirais da mesma forma que um vírus wt (indução de apoptose e interferon por omissão), porém, em razão da baixa síntese de proteínas, tenha um potencial reduzido para inibir esses processos. Este cenário iria aumentar a probabilidade de a célula abortar uma infecção nascente e poderia explicar os fenômenos observados.
Em nível de célula individual, a infecção de PV provavelmente será um fenômeno do tipo "tudo ou nada". A proteína viral e as sínteses de RNA provavelmente precisam estar em um âmbito de muito próximo a máximo alcance para garantir a infecção produtiva.
Composições de vacina de vírus atenuado
A presente invenção também fornece uma composição de vacina para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente contendo quaisquer dos vírus atenuados aqui descritos e um portador farmaceuticamente aceitável.
Deve-se entender que um vírus atenuado da invenção, onde usado para provocar uma resposta imunológica protetora em um paciente o para prevenir que um 5 paciente seja afligido por uma doença associada a vírus, é administrado ao paciente na forma de uma composição contendo adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável. Portadores farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos pelos versados no ofício e incluem, mas sem limitação, um ou mais de 0.01-0,1M e de preferência 0,05M de tampão fosfato, tampão fosfato-salino (PBS) ou 0,9% de salina. Tais portadores também incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Portadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, meios salinos e tampões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, glicol de polietileno, óleos vegetais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como etil oleato. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio lactado de Ringer e óleos fixos. Veículos intravenosos incluem fluidos e repositores de nutrientes, repositores de eletrólitos tais como os que se baseiam na dextrose de Ringer e similares. Composições sólidas podem incluir portadores sólidos não tóxicos tais como, por exemplo, glicose, sacarose, manitol, 20 sorbitol, amido, estearato de magnésio, celulose ou derivados de celulose, carbonato de sódio e carbonato de magnésio. Para administração em aerossol, como por via pulmonar e/ou intranasal, um agente ou composição é formulado de preferência com um surfactante não tóxico, por exemplo, ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos C6 a C22 ou glicerideos naturais e um propelente. Também podem ser 25 incluídos portadores adicionais, como lecitina, para facilitar a administração intranasal. Portadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir ainda pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umedecedores ou emulsionantes, conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, antimicrobiais, antioxidantes e agentes quelantes, que intensificam o prazo de 5 validade e/ou eficácia dos ingredientes ativos. As composições instantâneas podem, como é bem sabido no ofício, ser formuladas de forma a proporcionar liberação rápida, mantida ou demorada do ingrediente ativo após a administração a um paciente.
Em diversas configurações da composição de vacina instantânea, o vírus atenuado 10 (i) não altera substancialmente a síntese e processamento de proteínas virais na célula infectada; (ii) produz quantidades semelhantes de virions por célula infectada como vírus wt; e/ou (iii) exibe infectividade específica de virion substancialmente mais baixa do que o vírus wt. Em outras configurações, o vírus atenuado induz uma resposta imunológica substancialmente similar em um animal hospedeiro ao vírus wt 15 correspondente.
Esta invenção ainda fornece uma linha de célula hospedeira especialmente isolada ou engendrada para permitir um vírus atenuado que é inviável numa célula hospedeira de tipo selvagem. Como o vírus atenuado não consegue crescer em células hospedeiras normais (de tipo selvagem), ele é absolutamente dependente da 20 linha de célula auxiliar específica para crescimento. Isso fornece um nível bastante alto de segurança para a geração de vírus para a produção de vacina. Várias configurações da linha de células instantâneas modificadas permitem o crescimento de um vírus atenuado, em que o genoma da citada linha de célula foi alterado para aumentar o número de genes codificando tRNAs raros.
Em configurações preferidas, os códons raros são CTA (codificando para Leu), TCG (Ser) e CCG (Pro). Em diferentes configurações, um, dois ou todos os três desses códons raros são substituídos por códons frequentes sinônimos no genoma virai. Por exemplo, todos os códons Leu no vírus podem ser mudados para CTA, todos os códons Ser podem ser mudados para TCG; todos os códons Pro podem ser mudados para CCG; os códons Leu e Ser, ou Leu e Pro, ou Ser e Pro podem ser substituídos pelos códons raros identificados, ou todos os códons Leu, Ser e Pro podem ser modificados para CTA, TCG e CCGm respectivamente, em um único vírus. Além disso, uma fração dos códons relevantes, isto é, menos de 100%, podem ser mudados para os códons raros. Assim, a proporção de códons substituídos pode ser de cerca de 20%, 40%, 60%, 80% ou 100% do número total de códons.
Em certas configurações, essas substituições são feitas somente na região capsídea do vírus, onde um alto índice de tradução é muito importante. Em outras configurações, as substituições são feitas por todo o vírus. Em configurações adicionais, a linha de célula sobreexpressa tRNAs que se vinculam aos códons raros.
Esta invenção fornece ainda um método para sintetizar qualquer dos virus atenuados aqui descritos, o método incluindo (a) a identificação dos códons em múltiplas localizações em pelo menos uma parte não reguladora do genoma virai, códons os quais podem ser substituídos por códons sinônimos; (b) seleção de um códon sinônimo a ser substituído por cada um dos códons identificados; e (b) substituição de um códon sinônimo por cada um dos códons identificados.
Em certas configurações dos métodos instantâneos, os passos (a) e (b) são guiados por um algoritmo com base em computador para Engenharia de Vírus Atenuado Sintético (SAVE) que permite o projeto de um genoma virai variando os grupos de padrão especificados de distribuição de códon desotimizado e/ou distribuição de pares de códon desotimizados dentro dos limites preferidos. A invenção também fornece um método em que os grupos de padrões alternativamente ou adicionalmente incluem densidade de códons desotimizados e pares de códons desotimizados, estrutura secundária de RNA, teor de dinucleotídeo CpG, teor de C+G, quadros de codificação sobrepostos, distribuição de local de restrição, locais de deslocamento do quadro de leitura ou qualquer combinação dos anteriores.
Em outras configurações, o passo (c) é obtido pela síntese "de novo" do DNA contendo os códons sinônimos e/ou pares de códons e substituição da região correspondente do genoma com o DNA sintetizado. Em configurações adicionais, o genoma todo é substituído pelo DNA sintetizado. Ainda em configurações adicionais, uma parte do genoma é substituída pelo DNA sintetizado. Em mais outras configurações, a citada parte do genoma está na região de codificação de capsideo. Além disso, a presente invenção fornece um método para provocar uma resposta imunológica protetora em um paciente incluindo a administração de uma dose profilática ou terapeuticamente eficaz de qualquer das composições de vacina aqui descritas. Esta invenção também fornece um método para evitar que um paciente seja afligido por uma doença associada a vírus incluindo a administração de uma dose profilaticamente eficaz de qualquer das composições instantâneas de vacina. Em configurações dos métodos acima, o paciente foi exposto a um vírus patogênico. "Exposto" a um vírus patogênico significa contato com o vírus de tal forma que poderia resultar numa infecção.
A infecção fornece ainda um método para retardar o principio ou diminuir a velocidade de progressão de uma doença associada a vírus em um paciente infectado por vírus incluindo a administração ao paciente de uma dose terapeuticamente eficaz de qualquer das composições de vacina instantâneas.
Da forma aqui utilizada, "administrando" significa utilizando quaisquer dos diversos métodos e sistemas de administração conhecidos pelos versados no ofício. A administração pode ser realizada, por exemplo, de forma intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, oral, transmucosal, subcutânea, transdérmica, intradérmica, intramuscular, tópica, parenteral, por implante, intratecal, intralifática, intralesional, pericardial ou epidural. Um agente ou composição pode ser administrado em aerossol, tal como para administração pulmonar e/ou intranasal. A administração pode ser realizada, por exemplo, uma vez, diversas vezes e/ou por um ou mais períodos estendidos. Pode-se provocar uma resposta imunológica protetora em um paciente, por exemplo, administrando uma dose primária de vacina a um paciente, seguida, após um período adequado, por uma ou mais administrações subsequentes da vacina. Um período de tempo adequado entre administrações da vacina pode ser prontamente determinado por alguém versado na arte, e é normalmente da ordem 15 de diversas semanas a meses. No entanto, a presente invenção não se limita a qualquer método, rota ou frequência particular de administração.
Um "paciente" significa qualquer animal ou animal modificado artificialmente. Os animais incluem, mas sem limitação, humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, carneiros, porcos, cachorros, gatos, coelhos, furões, roedores tais como 20 ratos, camundongos e cobaias, e aves. Animais artificialmente modificados incluem, mas sem limitação, ratos SCID com sistemas imunológicos humanos e ratos transgênicos CD155tg expressando o receptor de vírus de poliomielite humano CD 155. Em uma configuração preferida, o paciente é um humano. As configurações preferidas de aves são as espécies domesticadas, incluindo, mas sem limitação, 25 galinhas, perus, patos e gansos.
Uma "dose profilaticamente eficaz" é uma quantidade qualquer de vacina que, quando administrada a um paciente com propensão a infecção virai ou desordem associada a vírus, induz no paciente uma resposta imunológica que protege o paciente de se infectar pelo vírus ou ser afligido pela desordem. "Proteger" o 5 paciente significa reduzir a possibilidade de que seja infectado pelo vírus, ou reduzir a possibilidade do início da desordem no paciente, em pelo menos duas vezes, de preferência em dez vezes. Por exemplo, se um paciente tem uma chance de 1% de se infectar com o vírus, a redução em duas vezes da possibilidade de o paciente se infectar com o vírus resultaria em o paciente ter uma chance de 0,50% de se infectar 10 com o vírus. De forma ainda mais preferível, uma "dose profilaticamente eficaz" induz no paciente uma resposta imunológica que impede completamente o paciente de se infectar com o vírus ou impede completamente o início de uma desordem no paciente.
Da forma aqui utilizada, uma "dose terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade 15 de uma vacina que, quando administrada a um paciente afligido com uma desordem contra a qual a vacina é eficaz, induz no paciente uma resposta imunológica que faz com que o sujeito tenha uma redução, moderação ou regressão da desordem e/ou seus sintomas. Em configurações preferidas, a recorrência da desordem e/ou seus sintomas é prevenida. Em outras configurações preferidas, o paciente é curado da 20 desordem e/ou seus sintomas.
Certas configurações de qualquer dos métodos de imunização instantânea e ou terapia incluem ainda a administração no paciente de pelo menos um adjuvante. Um "adjuvante" significa qualquer agente adequado para intensificar a imunogenicidade de um antígeno e aumentar a resposta imunológica em um paciente. Diversos 25 adjuvantes, incluindo adjuvantes particulados, adequados para uso com vacinas baseadas em proteína e ácido nucleico, e métodos de combinar adjuvantes com antígenos, são bem conhecidos pelos versados no ofício. Adjuvantes adequados para vacinas baseadas em ácido nucleico incluem, mas sem limitação, Quil A, imiquimod, resiquimod e lnterleucina-12 administrada em forma de proteína purificada ou ácido nucleico. Os adjuvantes adequados para uso com imunização de proteína incluem, mas sem limitação, sulfato de alumínio, adjuvante incompleto de Freund (FIA), saponina, Quil A e QS-21.
A invenção também fornece um kit para imunização de um paciente com vírus atenuado da invenção. O kit inclui o vírus atenuado, um portador farmaceuticamente aceitável, um aplicador e um material de orientação para uso. Em outras configurações, o vírus atenuado pode ser um ou mais vírus de poliomielite, um ou mais rinovírus, um ou mais vírus influenza, etc. Mais de um vírus pode ser preferido quando for desejável imunizar um hospedeiro contra um número de diferentes isolados de um vírus particular. A invenção inclui outras configurações de kits que são conhecidos dos versados no ofício. As instruções podem fornecer qualquer informação que seja útil para conduzir a administração dos vírus atenuados.
Naturalmente, deve ser entendido e esperado que possam ser feitas variações nos princípios da invenção aqui divulgados por alguém versado no ofício e se pretende que tais modificações sejam incluídas dentro do escopo da presente invenção. Os seguintes Exemplos ilustram mais ainda a invenção, mas não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma. Descrições detalhadas dos métodos convencionais como os utilizados na construção dos plasmídeos recombinantes, transfecção de células hospedeiras com construções virais, reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas imunológicas que podem ser obtidas de diversas publicações, incluindo Sambrook et al. (1989) e Coligan et al. (1994). Todas as referências aqui mencionadas são incorporadas em sua totalidade por referência nesta aplicação.
Detalhes completos das diversas publicações citadas nesta aplicação são fornecidas ao final da especificação imediatamente anterior às reivindicações. As divulgações 5 destas publicações são ora incorporadas em suas totalidades por referência nesta aplicação. No entanto, a citação de uma referência não deve ser interpretada como reconhecimento de que tal referência é modelo conhecido antes desta invenção.
EXEMPLO 1 Reengenharia da região capsídea dos vírus da poliomielite pela alteração do viés de códon Células, vírus, plasmídeos e bactérias
As monocamadas de célula HeLa R19 foram mantidas no meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado com 10% de soro de bezerro de bovino (BCS) a 37°C. Construções de cDNA infecciosas AU PV se baseiam no clone de 15 PVI(M) cDNA pT7PVM (Cao et al., van der Werf et al., 1986). Foram construídos plasmídeos de indicador dicistrônico usando pHRPF-Luc (Zhao e Wimmer 2001). Escherichia coli DH5α foi usada para transformação e propagação de plasmídeo. Os vírus foram amplificados pela infecção de monocamadas de célula HeLa RI 9 com 5 PFU por célula. As células infectadas foram incubadas em DMEM (2% BCS) a 37°C até que o completo efeito citopático (CPE) estivesse aparente por pelo menos 4 dias após a infecção. Após três séries de congelamento e descongelamento, o lisado foi limpo dos resíduos de célula por centrifugação de baixa velocidade e o sobrenadante, contendo o vírus, foi usado para passagem ou análise adicional. Clonagem das substituições de capsideo sintético e replicons de indicador dicistrônico
Dois fragmentos de genoma de cDNA de PV abrangendo o genoma entre os nucleotídeos 495 e 3636, com nome de SD e AB, foram sintetizados usando a tecnologia GeneMaker® (Biotecnologia Blue Heron). pPV-SD e pPV-AB foram gerados liberando os estojos de substituição do vetor de clonagem do fornecedor por 5 meio de digestão de PfIMI e inserção no vetor pT7PVM no qual o fragmento correspondente de PfIMI tinha sido removido. pPV-AB755"1513 e pPV-AB2470"3386 foram obtidos inserindo um fragmento de Bsml ou um fragmento de Nhel-EcoRI, respectivamente, do pPV-AB em um vetor pT7PVM igualmente digerido. Em pPV- ABi5i3"3386 e pPV-AB755"2470, o fragmento Bsml ou fragmento Nhel-EcoRI de pT7PVM, 10 respectivamente, substitui o fragmento respectivo do vetor pPV-AB. Substituição do fragmento de Nhel-EcoRI do pPB-AB1513"3386 pelo do pT7PVM resultou em pPV- AB2470'33ββ Finalmente, substituição dos fragmentos de SnaBI-EcoRI de pPV- AB2470"3386 e pT7PVM por outro produziu pPV-AB2954”3386 e pPV-AB2470"2954 respectivamente.
A clonagem das construções de indicador dicistrônico foi obtida introduzindo-se primeiro uma mutação silenciosa no pHRPF-Luc pela mutagênese direcionada pelo local usando oligonucleotídeos Fluc-mutRI(+)/Fluc-mutRI(-) para mudar um local EcoRI no quadro de leitura aberto de luciferase de vaga-lume e gerar pdiLuc-mRI. As regiões capsídeas de pT7PVM, pPV-AB1513"2470 e pPV-AB2470"2954 foram 20 amplificadas em PCR USANDO oligonucleotídeos RI-2A- Plwt(+)/Plwt-2A-RI(-). As sequências capsídeas de pPV-AB2470'3386 e pPV-AB2954"3386 ou pPV-AB foram amplificadas com RI-2A-Plwt(+)/PIAB-2A-RI(-) ou RI-2A-PIAB(+)/PIAB-2A- Rl(-), respectivamente. Os produtos PCR foram digeridos com EcoRI e inseridos em um novo local único EcoRI em pdiLuc-mRI para resultar em pdiLuc-PV, pdiLucAB1513"2470, 25 pdiLuc-AB2470’2954, pdiLuc-AB2470"3388, pdiLuc-AB2954"3386 e , pdiLuc-AB, respectivamente.
Oligonucleotídeos
Foram usados os seguintes oligonucleotídeos: Fluc-mutRI(+), 5'- GCACTGATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGG-S' (SEQ ID NO :6); Fluc-mutRI(-), 5'-CCAGTAGATCCAGAGGAGTTCATTATCAGTGC-S' (SEQ ID 5 NO:7); RI-2A-Plwt(+), 5- CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCTCAGGTTTCATCACAGAAAGTGGG-S' (SEQ ID NO:8); RI-2A-P1AB(+), 5’- CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCGCAAGTATCGTCGCAAAAAGTAGG-S (SEQ ID NO:9); Plwt-2A-RI(-), 5’- 10 TTCGAATTCTCCATATGTGGTCAGATCCTTGGTGG-AGAGG-3' (SEQ ID NO: 10); e P1AB-2A-RI(-), 5'-TTCGAATTCTCCATACGTCGTTAAATCTTTCGTCGATAACG- S' (SEQ ID NO: 11). Transcrição in vitro e transfecção de RNA Conduzidas pelo promotor T7, 2 μg do DNA plasmídeo EcoRI-linearizado foram 15 transcritas por polimedrase de RNA t7 (Stratagene) por 1 hora a 37°C. Um micrograma de vírus ou RNA de transcrição dicistrônica foi usado para transfectar 106 células HeLa RI 9 em uma placa de 35 mm de diâmetro de acordo com uma modificação do método DEAE-dextran (van der Werf et al. 1986). Após uma incubação de 30 minutos a temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e as 20 células foram incubadas a 37°C em 2 ml de DMEM contendo 2% de BCS até que o CPE apareceu, ou as células foram congeladas 4 dias após a transfecção para passagem adicional. As titragens de vírus foram determinadas por ensaio padrão de placa em células HeLa RI 9 usando uma cobertura semissólida de 0,6% de goma tragacanto (Sigma-Aldrich) em meio Eagle mínimo. 25 Projeto e síntese de vírus de poliomielite desotimizado em códon
Duas codificações sinônimas diferentes da região capsídea P1 do vírus da poliomielite foram produzidas, cada uma regida por diferentes critérios de projeto. Dois projetos foram limitados ao capsideo, já que foi conclusivamente demonstrado que toda a sequência de codificação de capsideo pode ser excluída do genoma de 5 PV ou substituída por sequências exógenas sem afetar a replicação do replicon subgenômico resultante (Johansen e Morrow, 2000; Kaplan e Racaniello, 1988). Assim, é bastante certo que nenhum elemento crucial regulatório não identificado de RNA se localiza na região capsídea, os quais possam ser afetados inadvertidamente pela modulação da sequência de RNA.
O primeiro projeto (PV-SD) buscou maximizar o número de mudanças de base de RNA preservando a exata distribuição de uso de códon da região P1 de tipo selvagem (Fig. 1). Para isso, foram trocadas as posições de códon sinônimo por cada aminoácido encontrando um emparelhamento bipartido de peso máximo (Gabow 1973) entre as posições e os códon, onde o peso de cada posição-par de 15 códons é o número de mudanças de base entre o códon original e códon candidato sinônimo para substituí-lo. Para evitar qualquer tendência posicionai do algoritmo de emparelhamento as localizações do códon sinônimo foram permutadas aleatoriamente antes de criar o gráfico de entrada e as localizações foram posteriormente restauradas. O programa de emparelhamento bipartido máximo 20 (Rothberg, 1985) foi usado para computar o emparelhamento. Um total de 11 locais úteis de restrição de enzima, cada 6 nucleotídeos, foram travados na sequência de genoma viral de forma a não participar na troca de localização de códon. A técnica de baralhamento de códons potencialmente cria locais adicionais de restrição que, de preferência, devem permanecer únicos no genoma de comprimento total 25 reconstituído resultante. Por esse motivo, a sequência foi adicionalmente processada substituindo códons para eliminar os locais indesejados. Isso resultou em nove mudanças adicionais de códon sinônimos que alteraram levemente a distribuição de frequência de códons. No entanto, nenhum códon teve sua frequência alterada em mais de 1 acima da sequência de tipo selvagem. No total, houve 934 de 2.643 nucleotídeos alterados no projeto de capsideo PV-SD quando comparados com a sequência P1 wt mantendo a sequência de proteínas idêntica ao domínio de codificação de capsideo (ver Figuras 1 e 2). Como o uso de códons não foi modificado, o teor de GC na sequência de codificação do capsideo PVM-SD permaneceu idêntica à do wt em 49%.
O segundo projeto, PV-AB, procurou alterar drasticamente a distribuição de uso de códons na região P1 wt. O projeto foi influenciado por trabalho recente sugerindo que o viés de códon pode impactar a expressão específica de tecido (Plotkin et al., 2004). A distribuição de uso de códons desejada foi derivada dos códons mais desfavoráveis observados em um grupo anteriormente descrito de genes específicos de cérebro (Hsiao et al., 2001; Plotkin et al., 2004). Uma região de codificação de capsideo foi sintetizada, maximizando o uso dos códon sinônimo mais raros para cada aminoácido particular como observado neste grupo de genes (Fig.1). Como para todos os aminoácidos menos um (Leu) o códon mais raro no cérebro corresponde aos códons mais raros entre todos os genes humanos como um todo, na verdade esperar-se-ia que este projeto iria fazer discriminação contra expressão em outros tecidos humanos também. No total, o capsideo PV-AB difere do capsideo wt em 680 posições de nucleotídeo (ver Figura 2). O teor de GC na região capsídea PVM-AB foi reduzida em 43% em comparação com 49% no wt.
EXEMPLO 2 Efeitos da desotimização em códon no crescimento e infectividade dos vírus de poliomielite Determinação de titragem do vírus por ensaio de foco infectado
As infecções foram feitas como para um ensaio de placa padrão. Após 48 ou 72 horas de incubação, a camada de goma tragacanto foi removida e os poços foram lavados duas vezes com tampão fosfato-salino (PBS) e fixados com metanol/acetona fria por 30 minutos. Os poços foram bloqueados em PBS contendo 10% de BCS, seguidos de incubação com uma diluição 1:20 de anticorpo monoclonal anti-#D de rato 125.2.3 (Paul et al, 1998) por 1 hora a 37°C. Após a lavagem, as células foram incubadas com anticorpo de cabra anticamundongo rotulado com peroxidase de raiz forte (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) E AS células infectadas foram visualizados usando o kit de substrato Vector VIP (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Foram contados os focos manchados, que são equivalentes a placas obtidas com vírus wt, e foram calculadas as titragens como no procedimento de ensaio de placa.
Os vírus de poliomielite desotimizados em códon mostram fenótipos crescidos severos
Dos dois projetos iniciais de substituição ORF de capsídeo (Figura 3A), somente o PV-SD produziu vírus viável. Em contraste, nenhum vírus viável foi recuperado de quatro transfecções independentes com RNA PV-AB, mesmo após três séries de passagens (Figura 3E). Pareceu que o viés de códon introduzido no genoma PV-AB foi severo demais. Assim, partes menores da sequência de codificação de capsídeo foram subclonadas na formação do PV(M) para reduzir os efeitos prejudiciais dos códons não preferidos. Desses subclones, o PV-AB2954' 3386 produziu 40h de CPE após a transfecção de RNA, enquanto o PV-AB755"1513 e o PV-AB2470"2954 exigiram uma ou duas passagens adicionais após a transfecção, respectivamente (em comparação com 24 h para o vírus de tipo selvagem). Curiosamente, estes vírus quiméricos representam os três subclones com as menores partes da sequência original AB, uma observação que sugere uma correlação direta entre o número de códons não preferidos e a aptidão do vírus.
A cinética de crescimento de um passo de todas as variantes de vírus viável foi determinada infeccionando as monocamadas de HeLa a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 com lisados de célula viral obtidos após um máximo de tuas passagens após a transfecção de RNA (Figura 3B). A MOI foi escolhida em razão da baixa titragem de PV-AB2470"2954 e para eliminar a necessidade de passagem adicional necessária para concentrar e purificar o material inoculante. Sob as condições usadas, todos os vírus tinham produzido CPE completo ou quase completo por 24 horas pós-infecção.
Apesar de 934 mutações de ponto único em sua região capsídea, o PV-SD se replicou a capacidade de wt (Figura 3B) e produziu placas de tamanho semelhante ao wt (Figura 3D). Enquanto o PV-AB2954"3386 cresceu com cinética próxima ao tipo selvagem (Figura 3B), o PV- AB755"1513 produziu placas diminutas e aproximadamente 22 vezes menos vírus infeccioso (Figura 2, 3B e F, respectivamente).
Embora com capacidade de causar CPE em infecções de alta MOI, ainda que com muita demora (80 a 90% de CPE após 20 a 24 horas), oPV-AB2470"2954 não produziu placa alguma sob as condições do ensaio padrão de placa (Figura 3H). Assim, este vírus foi quantificado usando um ensaio formador de placa, no qual os focos de células infectadas após 72 horas de incubação com condições de ensaio de placa foram contados imunoistoquimicamente com anticorpos para a polimerase virai 3D (Figura 3G). Após 48 horas de infecção, os focos infectados com PV-AB2470"2954 normalmente envolveram apenas dezenas a centenas de células (Figura 3J) com um diâmetro de foco de 0,2 a 0,5 mm em comparação a placas de 3 mm para o wt (Figuras 3C e D). No entanto, após mais 24 horas, o diâmetros dos focos cresceu de forma significativa (2 a 3 mm; Fig. 3G). Quando as células HeLa foram infectadas com PV-AB755'1513 e PV-AB2470'2954 a uma MOI de 1, o CPE apareceu entre 12 e 18 horas e 3 e 4 dias, respectivamente, em comparação com 8 horas com o wt (dados não exibidos).
Para quantificar o efeito cumulativo de um viés de códon em uma sequência de codificação de proteína, foi calculado um índice de desotimização relativa de códon (RCDI), o que é uma medida comparativa em relação à distribuição geral de códons no genoma humano. Um RCDI de 1/códon indica que um gene seque as frequências de códon humanas normais, enquanto qualquer desvio do viés de códon humano normal resulta em um RCDI maior do que 1. O RCDI foi derivado usando a fórmula: (i =1 a 64). CiFa é a frequência relativa observada na sequência de teste de cada códon i de todos os códons sinônimos para o mesmo aminoácido ( 0 a 1); CiFh é a a frequência relativa normal observada no genoma humano de cada códon i de todos os códons sinônimos para aquele aminoácido (0,06 a 1); NCié o número de ocorrências daquele códon i na sequência; e N é o número total de códons (aminoácidos) na sequência. Assim, um alto número de códons raros em uma sequência resulta em um índice maior. Usando esta fórmula, os valores de RCDI das várias sequências de codificação de capsídeo foram calculadas como sendo 1,14 para PV(M) e PV-SD,o que é bem próximo de uma distribuição humana normal. Os valores RCDI para as construções AB são 1,73 para PV-AB755'1513, 1,45 para PV-AB2470"2954, e 6,51 para o PV-AB parental. Para comparação, o RCDI para a probabilidade da proteína otimizada em códon mais conhecida, proteína fluorescente verde "humanizada" (GFP) foi de 1,31 em comparação com um RCDI de 1,68 para o gene gpf Aequora victoria original (Zolotukhin et al., 1996). De acordo com esses cálculos, uma sequência de codificação de capsídeo com um RCDI de <2 é associado com um fenótipo de vírus viável, enquanto um RCDI de > 2(PV-AB = 6,51, PV-AB1513 3385 = 4,04, PV- AB755"2470 = 3,61) resulta em um fenótipo letal.
EXEMPLO 3 Efeitos da desotimização em códon na infectividade específica dos vírus de poliomielite
Quantificação molecular de partículas virais: método direto da absorção OD2eo Placas de quinze centímetros de células HeLa (células 4 x 107) foram infectados com PV(M), PV-AB755"1513, ou PV-AB2470 2954 a uma MOI de 0,5 até que ocorresse um CPE completo (de um dia para outro versus 4 dias). O vírus associado à célula foi liberado por três ciclos sucessivos de congelamento/descongelamento. Os lisados de célula foram limpos por 10 minutos de centrifugação a 2.000 x g segundo de uma segunda centrifugação de 10 minutos a 14.000 x g por 10 minutos. Os sobrenadantes foram incubados por 1 hora a temperatura ambiente na presença de 10 μg/ml RNase A (Roche) para digerir qualquer RNA extraviral ou celular. Após a adição de 0,5% de dodecil sulfato de sódio e 2 mM EDTA, sobrenadantes contendo vírus foram sobrepostos em uma camada de 6 ml de sacarose (30% de sacarose em uma solução de sal equilibrada de Hanks [HBSS]; Invitrogen, Carlsbad, CA). Partículas de vírus foram sedimentadas por ultracentrifugação por 4 horas a 28.000 rpm usando um rotor de centrifugação SW28. Os sobrenadantes foram descartados e os tubos de centrifugação foram lavados duas vezes com HBSS deixando a camada de sacarose intacta. Após a remoção da última lavagem e da camada de sacarose, pelotas de vírus foram ressuspensas em PBS contendo 0,2% de SDS e % mM de EDTA. As titragens de infecção de vírus foram determinadas por ensaio de placa/ensaio de foco infectado (ver acima). As concentrações de partícula de vírus foram determinadas com um espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE) à densidade ótima a260 nm (OD260) e calculadas usando a fórmula 1 OD2eo unidade = 9,4 x 1012 partículas/ml (Rueckert, 1985). Além disso, o RNA de vírion foi extraído por três séries de extração de fenol e uma série de extração de clorofórmio. O RNA foi precipitado por etanol e ressuspenso em água ultrapura. A pureza do RNA foi confirmada por análise de gel de agarose tamponado-TAE, e a concentração foi determinada de forma espectrofotométrica. O número total de equivalentes de genoma na preparação correspondente de vírus foi calculada pela concentração determinada de RNA e o peso molecular do RNA. Assim, pôde ser calculada a quantidade relativa de virions por unidades infecciosa, assumindo que um equivalente de genoma virai protegido por RNase corresponda a uma partícula de vírus.
Quantificação molecular de partículas virais: Métodos ELISA Placas de poços Nunc Maxisorb 96 foram revestidas com 10 μg de anticorpo de coelho anti-PV(M) (Murdin e Wimmer, 1989) em 100 μl de PBS por 2 horas a 37C e mais 14 horas a 4°C, depois as placas foram lavadas três vezes rapidamente com 350 μl de PBS e bloqueadas com 350 de soro de bezerro de bovino em PBS por 1 hora a 37°C. Após três banhos rápidos com PBS, os poços foram incubados com 100 μl de lisados de célula contendo vírus ou controles em DMEM mais 2% de BCS por 4 horas a temperatura ambiente. Os poços foram lavados com 350 μl de PBS três vezes por 5 minutos cada um. Os poços foram então incubados por 4 horas a temperatura ambiente com 2 μg de proteína de fusão de CD155-fosfatase alcalina (AP) (He et al 2000) em 100 μl de DMEM - 10% de BCS. Após a última das cinco lavagens com PBS, foram adicionados 100 μl de 10 mM de Tris, pH 7,5 e as placas foram incubadas por 1 hora a 65°C. A determinação da fosfatase alcalina colorimétrica foi obtida pela adição de 100 μl de 9 mg/ml para-nitrofenilfosfato (em 2 M de dietanolamina, 1 mM MgCI2, pH 9,8). A atividade da fosfatase alcalina foi determinada e as concentrações de partícula de vírus foram calculadas em um leitor de placa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) de ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) a um comprimento de onda de 405-nm em uma curva padrão preparada em paralelo usando diluições seriais duplicadas de uma concentração conhecida de família de vírus purificada PV(M).
A proporção PFU/partícula é reduzida em vírus desotimizados em códon
O fenótipo muito mal crescido de PV-AB2470"2954 na cultura de célula e sua incapacidade de formar placas sugeriu um defeito no espalhamento célula a célula que pode ser coerente com uma infectividade específica mais baixa das partículas de vírus individuais.
Para testar esta hipótese, os vírus PV(M), PV-AB755"1513, e PV-AB2470"2954 foram purificados e a quantidade de partículas de vírus foi determinada de forma espectrofotométrica. As preparações purificadas de vírus foram quantificadas diretamente medindo-se o OD26o e as concentrações de partícula foram calculadas de acordo com a fórmula 1 OD26o unidade = 9,4 x 1012 partículas/ml (Figura 4D) (Rueckert, 1985). Adicionalmente, o RNA genômico foi extraído desses virions (Figura 4a) e quantificado a OD260 (dados não mostrados). O número de virions (1 vírion -1 genoma) foi então determinado pelo tamanho molecular de 2,53 x 106g/mol para o RNA genômico. Especificamente, o vírus foi preparado a partir de 4 x 107 células HeLa que foram infectadas com 0,5 MOI de vírus até a aparição do CPE completo, como descrito acima. Ambos os métodos de terminação de partícula . produziram resultados semelhantes (Figura 4D). Com efeito, descobriu-se que o PV(M) e o PV-AB755"1513 produziram quantidades aproximadamente iguais de virions, enquanto o pv-AB2470"2954 produziu entre 1/3 (pelo método UV direto (Fig. 4D) e 1/8 do número de virions em comparação com o PV(M) (pelo método de RNA genômico [dados não mostrados]). Em contraste, a amostra de vírus wt corresponde a aproximadamente 30 vezes e 3.000 vezes mais unidades infecciosas do que o PV- AB755-I513 θ pv-AB2470"2954 respectivamente (Figura 4D). Além disso, as proteínas capsídeas de virions purificados foram resolvidas por eletroforese em gel SDS poliacrilamida (PAGE) e visualizadas por tingimento prateado (Figura 4B). Esses dados também confirmam a conclusão de que, célula a célula, o PV-AB2470"2954 e o PV-AB755"1513 produzem quantidades semelhantes ou levemente reduzidas de progénie por célula (Figura 4B, caminho 3), enquanto sua proporção PFU/partícula é reduzida. A proporção PFU/partícula para um vírus pode variar significativamente dependendo dos métodos para determinar a contagem de placas (topo de célula para o ensaio de placa e a técnica particular de ensaio de placa) ou de partícula (espectrofotometria ou microscopia eletrônica). Foi determinada uma proporção PFU/partícula de 1/115 para PVI(M) usando o método aqui descrito, que se compara bem a determinações anteriores de 1/272 (Joklik e Darnell, 1961) (feito em células HeLa) e 1/87 (Schwerdt e Fogh, 1957) (em células primárias de rim de macaco).
Desenvolvimento de um ELISA específico de vírion
Para confirmar a proporção PFU/partícula observada com vírus de poliomielite desotimizados em códon, foi desenvolvido um novo ELISA específico de vírion (Figuras 4C e E) como uma forma de determinar a quantidade física de partículas virais intactas em uma amostra em vez da titragem infecciosa, que é uma variável 25 biológica. O ensaio se baseia em observação anterior que o ectodomínio do receptor de PV CD155 fundido a uma fosfatase alcalina placentária estável ao calor (CD155- AP) se liga de forma bastante firme e específica à partícula 160S (He et al., 2000). Considerando que as partículas PV 130S (partículas A) perdem sua capacidade de se ligar ao CD 155 de forma eficiente (Hogle, 2002), espera-se que nenhum outro intermediário capsideo ou subunidades capsídeas venham a interagir com o CD155- AP, desta forma garantindo especificidade para partículas intactas. Em confirmação a esta noção, os lisados de células que foram infectados com estirpe de vírus de varíola expressando o precursor capsideo P1 (Ansardi et al., 1993) não resultaram em nenhum sinal quantificável (dados não mostrados).
O método ELISA permite a quantificação das partículas de vírus em um exemplo básico como o lisado de célula após a infecção, o que deveria minimizar uma possível alteração da proporção PFU/particula por outros mecanismos durante o manuseio e purificação da amostra (inativação térmica/química, oxidação, degradação, etc.). Sob as condições atuais, a sensibilidade deste ensaio é de 15 aproximadamente 107 partículas virais, já que não há um passo de amplificação de sinal envolvido. Isso, por sua vez, resultou numa formação excepcionalmente baixa. Com este ELISA, as concentrações de partícula de PV puderam ser determinadas em amostras por retrocálculo em uma curva padrão preparada com PV(M) purificado de concentração conhecida (Fig. 4E). As determinações de partícula por ELISA concordaram bem com os resultados obtidos pelo método direto UV (Figura 4D).
Implicações dos resultados
O presente estudo demonstrou a utilidade da desotimização de codificação de códon em larga escala de sequências de codificação de capsideo de PV pela síntese "de novo" para a geração de vírus atenuados. O objetivo inicial era explorar o potencial 25 desta tecnologia como ferramenta para gerar vacinas vivas de vírus atenuado. Descobriu-se que os vírus desotimizados em códon têm uma infectividade específica muito baixa (Figura 4). A baixa infectividade específica (isto é, a chance de uma única partícula de vírus iniciar com sucesso um ciclo infeccioso em uma célula) resulta em uma infecção de vírus que se espalha mais devagar dentro do hospedeiro. Isso, por sua vez, dá mais tempo para o organismo hospedeiro montar uma resposta imunológica e limpar a infecção, o que é uma característica mais desejável em uma vacina de vírus atenuado. Por outro lado, os vírus desotimizados em códon geral quantidades semelhantes de progénie por célula em comparação com o vírus tipo selvagem, ao mesmo tempo em que são de 2 a 3 ordens de magnitude menos infecciosos (Figura 4). Isso permite a produção de partículas de vírus antigenicamente indistinguíveis do wt tão eficazes e de custo eficiente quanto à produção do próprio vírus wt. No entanto, em razão da baixa infectividade específica, o efetivo manuseio e processamento de tal preparação de vírus é muito mais seguro. Como há uma crescente preocupação sobre a produção de vírus virulento em quantidades suficientes sob altas condições de contenção e o risco associado de fuga do vírus da instalação de produção, seja por acidente ou por dolo, os vírus aqui descritos podem se mostrar bastante úteis como alternativas mais seguras na produção de vacinas de vírus inativadas. Como eles são 100% idênticos ao vírus wt em nível de proteína, é garantida uma resposta imunológica idêntica em hospedeiros que receberam vírus inativado.
EXEMPLO 4
Efeitos da desotimização em códon na neuropatogenia dos vírus de poliomielite Testes de neuropatogenia de ratos Grupos de quatro a cinco ratos CD155tg (estirpe Tg21) (Koike et al,1991) com idades de 6 a 8 semanas foram injetados de forma intracerebral, com diluições de vírus entre 102e 106 PFU/unidades de formação de foco (FFU) EM 30 μl PBS. Foram calculados valores de cinquenta por cento de dose letal (LD50) pelo método de Reed e Muench (1938). As titragens de vírus nos tecidos da espinha dorsal no momento da morte ou paralisia foram determinadas por ensaio de placa ou foco infectado.
Os vírus de poliomielite desotimizados em códon são neuroatenuados em nível de partícula em ratos CD155tg Para testar o potencial patogênico de vírus construídos neste estudo, ratos transgênicos CD 155 (Koike et al., 1991) foram injetados por via intracerebral com PV(M), PV-SD, PV- AB755"1513, e PV-AB2470'2954 em doses entre 102e 105PFU/FFU. Os 10 resultados iniciais foram desconcertantes já que, ao contrário do esperado, o PV- AB755'1513 e especialmente o PV-AB2470'2954 se mostraram tão neuropatogênicos quando o vírus wt ou até um pouco mais neuropatogênicos. Ver Tabela 4.
Figure img0007
a LD50 expresso como o número de unidades infecciosas, como determinado pelo ensaio de placa ou foco infeccioso, que resulta em letalidade de 50% após a 15 inoculação intracerebral. b LD50 expresso como o número de partículas de vírus, como determinado pela medida de OD26o, o que resulta em letalidade de 50% após a inoculação intracerebral. c Vírus recuperado da espinha dorsal de ratos infectados no momento da morte ou paralisia; expresso em PFU ou FFU/g de tecido, como determinado por ensaio de placa ou foco infeccioso. d Vírus recuperado da espinha dorsal de ratos infectados no momento da morte ou paralisia, expresso em partículas/g de tecido, derivado pela multiplicação de valores na terceira coluna pela característica de proporção partícula/PFU em cada vírus (Figura 4D).
Além disso, as quantidades de início de paralisia após a infecção com PV-AB755"1513 e PV-AB2470"2954 foram comparáveis ao do vírus wt (dados não mostrados). Também desconcertante foi a observação de que, no momento da morte ou paralisia, as cargas virais por ensaio de placa, as espinhas dorsais dos ratos infectados com PV- AB755'i5i3e PV-AB2470"2954 foram qθ βθ a βQθ vezes menores, respectivamente, do que as nos ratos infectados com o virus wt (Tabela 4). Assim, parece improvável que o PV-AB2470"2954, aparentemente replicando-se somente a 0,3% do vírus wt, teria o mesmo potencial neuropatogênico que o wt. No entanto, após ter estabelecido o relacionamento PFU alterado/partícula no PV-AB755"1513 e PV-AB2470"2954 (ver Exemplo 3), a quantidade de material inoculante poderia ser correlacionada com o número ideal de partículas inoculadas. Após efetuar esta correção, foi estabelecido que, com base em partícula, o PV-AB755"1513 e PV-AB2470"2954 são de 20 a 200 vezes neuroatenuados, respectivamente, em comparação com o wt. Ver Tabela 4. Além disso, com base em partícula, as cargas virais nas espinhas dorsais de ratos paralisados são muito semelhantes a todos os três vírus (Tabela 4). Também foi concluído que não foi possível reelaborar o gene de capsídeo de PV COM códons sinônimos que iriam especificamente discriminar contra a expressão no sistema nervoso central. Isso pode ser porque as diferenças específicas de tecido no viés de códon descrito por outros (Plotkin et al., 2004) são pequenas demais para gerar um fenótipo de vírus restritivo de tecido. Em um grupo de genes específicos de cérebro maior do que o usado por Plotkin et al., nenhum viés de códon específico de tecido apreciável foi detectado (dados não mostrados). No entanto, essa conclusão não deve vir em detrimento do fato de que os vírus de poliomielite produzidos pelo método desta invenção são de fato neuroatenuados em ratos em um fator de até 100 vezes. Isto é, 100 vezes mais partículas virais desotimizadas em códon ou par de códons são necessárias para resultar no mesmo dano no sistema nervoso central que o vírus wt.
EXEMPLO 5
Efeitos da desotimização em códon na tradução genômica de vírus de poliomielite Tradução in vitro e in vivo Neste estudo foram usados dois extratos citoplasmáticos SIO de célula HeLa. Um extrato padrão foi preparado pelo método de Molla et al. (1991). Produtos de tradução rotulados com [35S]metionina foram analisados por autorradiografia de gel. O segundo extrato foi preparado da forma anteriormente descrita (Kaplan e Racaniello, 1988), exceto que não foi dialisado e os mRNAs celulares endógenos não foram removidos com nuclease micrococal As reações com o extrato modificado não foram complementadas com os aminoácidos exógenos ou tRNAs. Os produtos de tradução foram analisados por imunoblot com anticorpo monoclonal anti-2C 91.23 (Pfister e Wimmer, 1999). As intensidades relativas das bandas 2BC foram determinadas por uma contagem de pixels da imagem de gel digitalizada usando software NIH-lmage 1.62. Em todos os casos, as reações de tradução foram programados com 200 ng dos diversos RNAs genômicos virais transcritos in vitro. Para análise da tradução in vivo, as células HeLa foram transfectadas com RNA de replicon dicistrônico transcrito in vitro como descrito acima. Para avaliar a tradução isolada da replicação de RNA, foram realizadas transfecções na presença de 2 rnM de hidrocloreto de guanidina. As células foram lisadas após 7 horas em tampão de lise passivo (Promega, Madison, Wl), seguido de um ensaio de luciferase duplo de vaga-lume (F-Luc) e Renilla (R-Luc) (Promega). A eficiência de tradução do segundo cístron (poliproteína P1-Fluc-P2-P3) foi normalizada através da atividade de luciferase de Renilla do primeiro cístron expressa sob controle do local de entrada interno do ribossomo (IRES) do Vírus da Hepatite C (HCV).
Os vírus desotimizados em códon são deficientes em nível de tradução do genoma Como os vírus sintéticos e o PV(M) wt são indistinguíveis em sua constituição de proteína e não foram alterados elementos reguladores conhecidos com base em RNA nos genomas de RNA modificados, esses projetos permitiram o estudo do efeito da tradução/replicação do genoma na atenuação sem afetar o tropismo da célula e do tecido ou as propriedades imunológicas do vírus. O genoma PV-AB foi elaborado sob a hipótese de que a introdução de muitos códons aquém do ideal na sequência de codificação de capsídeo levaria a uma redução da tradução do genoma. Como a região P1 está no N-terminal da poliproteína, a síntese de todas as proteínas não-estruturais posteriores é determinada pelo índice de tradução através da região P1. Para testar se de fato a tradução é afetada, foram realizadas traduções in vitro (Fig. 5). Inesperadamente, as traduções iniciais em um extrato padrão S10 citoplasmático com base em célula HeLa (Molla et al., 1991) não mostrou nenhuma diferença nas capacidades de tradução para qualquer dos genomas testados (Figura 5A). No entanto, como este sistema de tradução é otimizado para tradução máxima, ele inclui a adição exógena de aminoácidos e tRNAs em excesso, o que compensaria, de forma concebível, o viés de códon engendrado geneticamente. Assim, as traduções in vitro foram repetidas com um extrato de célula HeLa que não foi dialisado e nos quais os mRNAs celulares não foram removidos por tratamento de nuclease micrococal (Fig. 5B). As traduções neste extrato foram realizadas sem a adição de tRNAs exógenos ou aminoácidos. Assim, foi criado um ambiente que se assemelha mais ao da célula infectada, onde a tradução dos genomas de PV depende somente dos suprimentos celulares enquanto competem por recursos com os mRNAs celulares. Em razão da alta tradução de fundo do mRNA celular e a baixa taxa de incorporação de [35S]Met no extrato não dialisado, um grupo de produtos de tradução específico de vírus foi detectado por imunoblot com anticorpos anti-2C (Pfister e Wimmer, 1999). Essas condições modificadas resultaram numa redução dramática das eficiências de tradução dos genomas modificados que se correlacionaram com a extensão da sequência desotimizada. Enquanto a tradução do PV-SD foi comparável à do wt, a tradução dos três genomas não-infecciosos, PV- AB, PV-AB1513"3386, e PV-AB755"2470foi reduzida em aproximadamente 90% (Figura 5B). Burns et al. (2006) recentemente relataram experimentos relacionados aos aqui descritos. Esses autores alteraram o uso de códons a uma extensão muito mais limitada do que no presente estudo, e nenhum de seus vírus mutantes expressam um fenótipo letal. Curiosamente, Burns et al determinaram que a tradução não desempenha um papel importante nos fenótipos alterados de seus vírus mutantes, uma conclusão em divergência com os dados aqui apresentados. É provável que o ensaio de tradução in vitro usado por Burns et al, que utilizou um lisado de reticulócito de coelho tratado com nuclease complementado com extrato de célula HeLa desinfectado e aminoácidos em excesso, explique sua falha em detectar qualquer redução significativa na tradução. Cf. Fig. 5A.
Considerando a natureza, em última análise, artificial do sistema de tradução in vitro, o efeito de vários projetos de capsídeo na tradução em células também foi investigado. Para este fim, foram construídos replicons indicadores de vírus de poliomielite dicistrônicos (Fig. 6A) com base em um replicon dicistrônico anteriormente relatado (Zhao e Wimmer, 2001). Vários estojos de P1 foram inseridos imediatamente acima e no quatro com o gene de luciferase de vaga-lume (F-Luc). Assim, o IRES de vírus de poliomielite conduz a expressão de uma única poliproteína virai semelhante à do genoma viral, com exceção da proteína da luciferase de vaga-lume entre o capsídeo e a proteinase 2Apr0. A expressão do gene da Renilla luciferase (R-Luc) sob controle da HCV IRES fornece um controle interno. Todos os experimentos foram realizados na presença de 2 mM de hidrocloreto de guanidina, o que bloqueia completamente a replicação de genomas (Wimmer et al., 1993). O uso desse tipo de construção permitiu uma determinação precisa da expressão relativa do segundo cístron calculando a proporção F-Luc/R-Luc. Como a expressão F-Luc depende do trânsito bem sucedido do ribossomo através da região P1 posterior, ela fornece uma medida do efeito da sequência P1 inserida no índice de tradução de poliproteína. Com efeito, pelo uso desse método descobriu-se que as regiões modificadas de codificação de capsídeo, que eram associados a um fenótipo letal na formação do vírus (por exemplo, PV-AB, PV-AB1513"2470, e PV-AB2470"3386) reduziu o índice de tradução em aproximadamente 80 a 90% (Figura 6B). Os capsídeos de duas construções de vírus viáveis, PV-AB2470"2954 e PV-AB2954'3386, permitiu a tradução de 68% e 83% de níveis de wt, respectivamente. Os índices de tradução in vivo do primeiro cístron permaneceram constantes em todas as construções por um período de tempo entre 3 e 12 horas, sugerindo que a estabilidade do RNA não é afetada pelas alterações de códon (dados não mostrados). Em conclusão, os resultados desses experimentos sugerem que o vírus de poliomielite é extremamente dependente de uma tradução bastante eficiente, já que uma gota relativamente pequena na eficiência de tradução através da região P1 de 30%, como visto em AB2470"2954, resultou em um severo fenótipo de replicação de vírus.
EXEMPLO 6 Estabilidade genética de vírus de poliomielite desotimizados em códon
Em razão do efeito distribuído de muitas mutações em grandes segmentos de genoma que contribuem para o fenótipo, os vírus desotimizados em códon devem ter fenótipos geneticamente estáveis. Para estudar a estabilidade genética de vírus desotimizados em códon, e para testar a premissa de que esses vírus são geneticamente estáveis, os vírus são passados em células hospedeiras adequadas. Um benefício do atual teoria da "morte por 1000 cortes" do projeto de vacina é o risco reduzido de reversão para o tipo selvagem. Estirpes de vacina típicas diferem somente por poucas mutações de ponto dos vírus wt, e somente um pequeno subgrupo desses pode realmente contribuir para a atenuação. A evolução virai trabalha rapidamente para reverter um número tão pequeno de mutações ativas. Com efeito, tal reversão representa uma séria ameaça para o projeto da Organização Mundial de Saúde (OMS) de erradicar o vírus da poliomielite do globo. Enquanto for usada uma estirpe de vacina viva, existe uma chance muito real de que esta estirpe venha a reverter para wt. Tal reversão já foi observada como a fonte de novas deflagrações de poliomielite (Georgescu et al, 1997; Kew et al., 2002; Shimizu et al., 2004).
Com centenas a milhares de mutações de ponto nos atuais projetos sintéticos, existe pouco risco de reversão para estirpes wt. No entanto, a seleção natural é poderosa, e no momento da passagem, vírus sintéticos inevitavelmente evoluem. Estão sendo realizados estudos para determinar o ponto final dessa evolução, mas um resultado provável é de que fiquem presos em um local ótimo, não muito longe do projeto original.
Para validar essa teoria, vírus representativos reengendrados são passados em uma célula hospedeira até 50 vezes. Os genomas dos vírus evoluídos são sequenciados após 10, 20 e 50 passagens. Mais especificamente, é escolhida pelo menos uma quimera de exemplo de cada tipo de vírus desotimizado. A quimera inicial está bastante debilitada, mas não morta. Por exemplo, para o PV as quimeras poderiam ser PV-AB2470"2954 e PV-Min755"2470. De cada vírus inicial, dez placas são escolhidas. Cada uma das populações de vírus derivados de dez placas são passadas em grande quantidade um total de 50 vezes. Após a 10a, 20a e 50a passagem, os vírus purificados por dez placas são novamente escolhidos e seus genomas são ordenados juntamente com os genomas dos vírus de dez matrizes. Após a passagem, a aptidão dos 40 (30+10 por vírus matriz) vírus escolhidos é comparada a de suas matrizes examinando tamanho de placa e determinando as unidades de formação de placa/ml como cinética de crescimento de um passo. Isolados de passagem selecionados são testados quanto à patogenicidade nos organismos hospedeiros apropriados. Por exemplo, a patogenicidade dos vírus de poliomielite é testada em ratos CD155tg.
No momento da ordenação dos genomas, uma descoberta de que todas as 10 linhas de vírus têm certas mutações em comum iria sugerir que essas mudanças são particularmente importantes para a aptidão virai. Essas mudanças podem ser comparadas aos locais identificados por método pegada de dedo como os principais locais de pausa (ver Exemplo 9); a combinação de ambos os tipos de ensaio pode identificar códons mutantes que são um tanto prejudiciais à aptidão virai. De modo inverso, uma descoberta de que todas as linhas diferentes têm diferentes mutações iria confirmar a visão de que muitas das mudanças de códon mutante são bastante semelhantes em seus efeitos na aptidão. Até agora, após 10 passagens em células HeLa, PV-AB755"1513 e PV- AB2470"2954 não passaram por nenhum ganho perceptível de aptidão. As titragens infecciosas virais permaneceram tão baixas (107 PFU/ml e 106 FFU/ml) quando no começo do experimento de passagem, e o fenótipo de placa não mudou (dados não mostrados). A análise de sequência desses vírus passados está agora em andamento, para determinar se e que tipo de mudanças genéticas ocorreu durante a passagem. Burns et al. (2006) relataram que suas composições alteradas de códon foram amplamente conservadas durante 25 passagens seriais em células HeLa. Eles descobriram que, enquanto a aptidão para replicação nas células HeLa tanto do vírus Sabin 2 não modificado e dos vírus de substituição de códon aumentaram com seus números mais altos de passagem, a aptidão relativa dos vírus modificados permaneceu mais baixa do que dos vírus não modificados. Assim, todas as indicações são de que os vírus reelaborados pelo SAVE são geneticamente muito estáveis. Dados preliminares para vírus desotimizados em códon e par de códon da invenção sugerem que mudanças menos severas de códon distribuídas por um número maior de códons melhora a estabilidade genética dos fenótipos de vírus individuais e dessa forma melhora seu potencial para uso em vacinas.
EXEMPLO 7
Reengenharia da região capsídea dos vírus da poliomielite pela desotimização dos pares de códons Cálculo do viés de par de códons Cada par de códons dos possíveis 3721 não "de parada" contendo pares de códons (por exemplo, GTT-GCT) carrega um "escore de par de códons" ou "CPS" atribuído que é específico para um determinado "grupo de treinamento" de genes. O CPS de um determinado par de códons é definido como a razão logarítmica do número observado de ocorrências e do número que se esperaria nesse grupo de genes (neste exemplo, o genoma humano). Determinar o número real de ocorrências de um par de códons em particular (ou, Em outras palavras, a possibilidade de um par de aminoácidos em particular ser codificado por um par de códons em particular) é simplesmente uma questão de contar o número real de ocorrências de um par de códons em um grupo particular de sequências de codificação. A determinação do número esperado, no entanto, requer cálculos adicionais. O número esperado é calculado de forma a ser independente tanto da frequência de aminoácidos quanto do viés de códon de forma similar a Gutman e Hatfield. Isto é, a frequência esperada é calculada com base na proporção relativa do número de vezes que um aminoácido é codificado por um códon específico. Um valor de CPS positivo significa que o determinado par de códons é estatisticamente sobrerrepresentado e um CPS negativo indica que o par é estatisticamente subrepresentado no genoma humano. Para realizar esses cálculos dentro do contexto humano, foi usado o mais recente banco de dados Consensus CDS (CCDS) de regiões de codificação humanas contendo um total de 14.795 genes. Esse grupo de dados forneceu as frequências de códon e par de códons e de aminoácido e par de aminoácidos em escala genômica. Foi usado o paradigma de Federov et al. (2002) para aperfeiçoar ainda mais a abordagem de Gutman e Hatfield (1989). Isso permitiu o cálculo da frequência esperada de um determinado par de códons independente da frequência de códons e associações não aleatórias dos códons vizinhos codificando um par de aminoácidos em particular.
Figure img0008
No cálculo, Pij é um par de códons que ocorre com uma frequência de No(Pij) em seu grupo sinônimo. Ci e Ci são os dois códons incluindo Pij, ocorrendo com frequências F(Ci) e F(Cj) em seus grupos sinônimos respectivamente. Mais explicitamente, F(Ci) é a frequência com que o aminoácido Xi correspondente é codificado pelo códon Ci por todas as regiões de codificação e F(Ci) =No(Ci)/No(Xi), onde No(Ci) e No(Xi) são os números de ocorrências observados do códon Ci e do aminoácido Xi respectivamente. F(Cj) é calculado de forma correspondente. Além disso, No(Xij) é o número de ocorrências do par de aminoácidos Xij em todas as regiões de codificação. O escore de viés de par de códons S(Pij) foi calculado como logaritmo da razão de chances da frequência observada No(Pig) sobre o número esperado de ocorrências Ne(Pij).
Usando a fórmula acima, foi então determinado se os pares de códons individuais em sequências de codificação individuais são sobre ou subrepresentadas quando comparadas com os valores genômicos correspondentes Ne(Pij) que foram calculados usando todo o grupo de dados humano CCDS. Este cálculo resultou em valores de escore positivo S(Pij) para pares de códons sobrerrepresentados e valores negativos para subrepresentados nas regiões de codificação humanas (Fig. 7).
O viés de par de códons "combinado" de uma sequência de codificação individual foi calculado pela média de todos os escores de par de códons de acordo com a seguinte fórmula:
Figure img0009
O viés de par de códons de toda uma região de codificação é assim calculado pela somatório de todos os escores de par de códons individuais incluídos na região e dividindo esta soma pelo comprimento da sequência de codificação.
Mudança de viés de par de códons.
A região de codificação do capsídeo de PV(M) foi reengendrada para mudar o viés de par de códons. O maior número possível de pares de códons raramente usados (criando o vírus PV-Min) ou o maior número possível de pares de códons amplamente usados (criando o vírus PV-Max) foi introduzido, preservando o viés de códon e todas as outras características do genoma de vírus wt. Abaixo nosso método está explicado em detalhes.
Duas sequências foram elaboradas para variar o escore de par de códons da região P1 do vírus de poliomielite nas direções positiva (PV-Max; SEQ ID NO:4) e negativa (PV-Min; SEQ ID NO:5). Deixando a sequência de aminoácidos inalteradas em razão do viés de códon minimamente modificado, foi usado um algoritmo de arrefecimento simulado para embaralhar os códons, com o objetivo de otimização de escore de par de códons mínimo ou máximo para a região capsídea P1. As sequências resultantes foram processadas para eliminação dos locais de separação e redução de estruturas secundárias localizadas. Essas sequências foram então sintetizadas por um fornecedor comercial, Blue Heron Biotechnology, e tiveram sua sequência verificada. Os novos genes de capsídeo foram usados para substituir a sequência wt equivalente em um clone cDNA infeccioso do PV wt através de dois locais de restrição PfIMI. O vírus foi derivado como descrito no Exemplo 1.
Para o vírus PV-Max, a morte das células infectadas foi vista após 24 horas, um resultado semelhante ao obtido com o vírus wt. A máxima titragem virai e a cinética de crescimento de um passo do PV-Max foram também idênticas ao wt. Em contraste, nenhuma morte de célula resultou nas células transfectadas com RNA mutante PV-Min e nenhum vírus viável pode ser recuperado. As transfecções foram repetidas múltiplas vezes com o mesmo resultado. Os lisados de células transfectadas PV-Min foram submetidas a quatro passagens cegas sucessivas e ainda assim nenhum vírus foi obtido.
A região capsídea do PV-Min foi dividida em dois subfragmentos menores (PV- Min755-247o θ pv-Min2470"3386 j como havia sido feito para PV-AB (viés de códon ruim) e os subfragmentos foram clonados no fundo do wt. Como nos subclones PV-AB, os subclones de PV-Min estavam muito doentes, mas não mortos (Fig. Como se viu com os vírus PV-AB, o fenótipo dos vírus PV-Min é um resultado da infectividade específica reduzida das partículas virais e não da baixa produção de vírus de progénie. Os estudos em andamento envolvem o teste de quimeras atenuadas de par de códons em ratos CD155tg para determinar sua patogenicidade. Ainda, vírus quiméricos adicionais incluindo subclones de cDNAs de PV-Min estão sendo feitos, e sua capacidade de se replicarem está sendo determinada (ver exemplo 8 e 9 abaixo). Ainda, o efeito de distribuir quantidades intermediárias de viés de par de códons por uma sequência mais longa está sendo confirmado. Por exemplo, um vírus de poliomielite derivado é projetado para ter um viés de par de códons de cerca de -0,2 (PV-0.2; SEQ ID NO:6) e as mutações de tipo selvagem são distribuídas por toda a extensão da região capsídea P1. Isso em contraste ao PV-MinZ (PV-Min2470 3386), que tem um viés de par de códons semelhante, mas com mudanças de códon distribuídas por uma sequência mais curta.
Cumpre observar que o PV-Min e PV-0,2 são sequências nas quais existe pouca mudança no uso de códons em relação ao tipo selvagem. Na maior parte, as sequências utilizam os mesmos códons que aparece no vírus de tipo selvagem PV(M). O PV-MinZ é um tanto diferente pelo fato de que contém uma parte do PV- Min subclonado no PV(M). Como com o PV-Min e PV-0,2, a sequência de proteína codificada não é alterada, mas o uso de códons da forma determinada na região subclonada ou em toda a região capsídea P1, não é idêntico ao PV-Min (ou PV-0,2) porque somente uma parte da sequência redisposta de códons (que tem códons idênticos em toda a sua extensão, mas não dentro dos segmentos menores) foi substituída na sequência de tipo selvagem PV(M) Naturalmente, um sequência de capsídeo mudado poderia ser projetado para ter um viés de par de códons por todo o gene P1 enquanto embaralha os códons somente na região dos nucleotideos 2470 a 3386.
EXEMPLO 8
Vírus construídos por uma mudança de viés de par de códons são atenuados em ratos CD155 tg.
Injeções Intracerebrais em Ratos, Sobrevivência
Para testar a atenuação de PV-Min755"2470 e PV-Min2470"3385 em um modelo animal, esses vírus foram purificados e injetados por via intracerebral em ratos transgênicos CD 155 (PVR/receptor de vírus de poliomielite) (Ver Tabela 5). Com efeito, esses vírus mostraram um fenótipo significativamente atenuado em razão da customização do viés de par de códons usando nosso algoritmo. O PVM-wt não foi injetado em dose maior porque todos os ratos testados com virions 10e5 morreram em razão do PVM-wt. Este fenótipo atenuado é em razão da customização do viés de par de códons usando o nosso algoritmo. Isso reafirma que a customização do viés de par de códons é aplicável para um meio de criar vacinas vivas.
Figure img0010
Essas descobertas são significativas em dois aspectos. Primeiro, elas são a primeira clara evidência experimental de que o viés de par de códons é funcionalmente importante, isto é, que um fenótipo nocivo pode ser gerado pela perturbação do viés de par de códons. Segundo, elas fornecem uma dimensão adicional de mudanças de códon sinônimo que podem ser úteis para atenuar um vírus. A patogenicidade in vivo dessas quimeras atenuadas em pares de códon foram testadas em CD155tg e mostraram um fenótipo atenuado (Ver Tabela 5). Vírus quiméricos incluindo subclones de cDNAs capsídeos PV-Min foram ensaiados quanto à replicação de células infectadas e também demonstraram fenótipo atenuado.
EXEMPLO 9
Construção de vírus de poliomielite sintético com viés de par de códons alterado implicações para desenvolvimento de vacina
Cálculo de viés de par de códons, implementação de algoritmo para produzir sequências desotimizadas de par de códons.
Nós desenvolvemos um algoritmo para quantificar o viés de par de códons. Cada par de códons individual possível recebeu um "escore de par de códons" ou "CPS".
Definimos o CPS como o logaritmo natural da razão das ocorrências observadas no número esperado de ocorrências em cada par de códons por todas regiões de codificação humanas.
Figure img0011
Embora o cálculo das ocorrências observadas de um par de códons em particular seja direto (a contagem real dentro do grupo de genes), o número esperado de ocorrências de um par de códons requer um cálculo adicional. Este número esperado é calculado de forma a ser independente tanto da frequência de aminoácidos quanto do viés de códon de forma similar a Gutman e Hatfield. Isto é, a frequência esperada é calculada com base na proporção relativa do número de vezes que um aminoácido é codificado por um códon específico. Um valor de CPS positivo significa que o determinado par de códons é estatisticamente sobrerrepresentado e um CPS negativo indica que o par é estatisticamente subrepresentado no genoma humano.
Usando esses CPSs calculados, qualquer região de codificação pode ser então classificada usando pares de códons sobre ou subrepresentados pegando a média dos escores de par de códons, assim obtendo o Viés de Par de Códons (CPB) para todo o gene.
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O CPB foi calculado para todos os genes humanos anotados, usando as equações mostradas (Figura 7). Cada ponto no gráfico corresponde ao CPB de um único gene humano O pico de distribuição tem um viés de par de códons positivo de 0,07, que é o escore médio para todos os genes humanos anotados. Também existem alguns poucos genes com um viés de par de códons negativo. Foram usadas equações estabelecidas para definir e calcular o CPB para manipular esse viés.
Desenvolvimento e implementação de algoritmo baseado em computador para produzir sequências desotimizadas de par de códons.
Usando essas fórmulas, desenvolvemos a seguir um algoritmo com base em computador para manipular o CPB de qualquer região de codificação mantendo a sequência original de aminoácidos. O algoritmo tem a capacidade critica de manter o uso de códons de um gene (isto é, preservar a frequência de uso de cada códon existente), mas "embaralhar" os códons existentes de forma que o CPB possa ser aumentado ou diminuído. O algoritmo usa arrefecimento simulado, um processo matemático adequado para a otimização de comprimento total (Park, S. et al. 2004). Outros parâmetros também estão sob controle deste algoritmo; por exemplo, a energia livre do dobramento do RNA. Esta energia livre é mantida dentro de um escopo estreito, para prevenir amplas mudanças em uma estrutura secundária como consequência da redisposição de códons. O processo de otimização especificamente exclui a criação de quaisquer regiões dentro de grandes estruturas secundárias, tais como de grampo ou alça, que poderiam de outra forma surgir no RNA customizado. Usando este software, o usuário simplesmente precisa entrar com a sequência de cDNA de um determinado gene e o CPB do gene pode ser customizado como o pesquisador desejar.
Síntese "de novo" de P1 codificados por pares de códons sobrerrepresentados ou subrepresentados.
Para obter um vírus de poliomielite sintético novo com seu P1 codificado por pares de códons sobrerrepresentados ou subrepresentados, entramos com a sequência de DNA correspondente à região estrutural P1 do vírus de poliomielite tipo I Mahoney (PV(M)-wt) em nosso programa obtendo PV-Max-P1 usando pares de códons sobrerrepresentados (566 mutações) e PV-Min-P1 usando pares de códons subrepresentados. Os escores CPB dessas regiões P-l novas, customizadas e sintéticas são PV-Max = +0.25 ePV-Min = -0.48 enquanto o CPB de PV(M)-Wt é -0,02 (Figura 7).
A customização adicional incluiu a inclusão de locais de restrição que foram projetados em ambas as sequências sintéticas em determinados intervalos, para permitir a subclonagem da região P1. Esses fragmentos sintéticos P1 foram sintetizados "de novo" por Blue Herron Corp, e incorporados em uma construção de cDNA de extensão total de vírus de poliomielite (Fig. 11) (Karlin et al., 1994). Um pequeno fragmento (3 códons, 9 nucleotídeos) da sequência PV(M)-Wt foi deixado após o códon de início AUG em ambas as construções para permitir que a tradução iniciasse de forma igual para todos os vírus sintéticos; desta forma proporcionando uma medida mais precisa do efeito do CPB na fase de prolongamento da tradução. Síntese de DNA, Plasmídeos, Subclonagem de Capsídeos Sintéticos e Bactérias Grandes fragmentos de cDNA de PV alterado por par de códons, correspondente aos nucleotídeos 495 a 3636 do genoma de PV, foram sintetizados pela Blue Heron Corp, usando seu sistema proprietário GeneMaker® (http://www.blueheronbio.com/). Todos os clones/subclones subsequentes de cDNA de vírus de poliomielite foram construídos a partir do clone de cDNA PVI(M) pT7PVM usando locais de restrição únicos (van der Wert, et al., 1986). O estojo de PV-Min, PV-Max de extensão total foi liberado do vetor de Blue Heron via digestão de PfIMI e inserção no vetor pT7PVM com seu fragmento de PfIMI removido. As construções de PV-MinXY e PV-MinZ foram obtidas por digestão com Nhel e Bglll simultaneamente, depois trocando este fragmento por um vetor pT7PVM digerido de forma semelhante. O PV-MinXY e PV- MinZ foram construídos via digestão Bsml e troca do fragmento/vetor pelo pT7PVM digerido de forma semelhante. O PV-MinY foi construído pela digestão da construção PV-MinXY com o Bsml e trocando este fragmento com o fragmento Bsml por um pT7PVM digerido. A transformação e amplificação de plasmídeo foram todas conseguidas via Escherichia coli DH5a.
Criação dos vírus quiméricos contendo regiões de capsideo alteradas por CPB: viés de par de códons subrepresentado por todos os resultados de P1 em um fenótipo nulo.
Usando o promotor de polimerase de RNA T7 acima da sequência genômica de vírus de poliomielite, foi transcrito um RNA de sentido positivo. 1.5 μg de um determinado clone de cDNA de plasmídeo do caso acima foi linearizado via digestão de EcoRI e depois transcrito em RNA via polimerase de RNA T7 (Stratagene) conduzido por seu promotor acima do cDNA por 2 horas a 37°C (van der Werf et al.,1986). Este RNA foi transfectado em 1 x 106 HeLa RI 9 células usando um método DEAE-dextran modificado (van der Werf et al., 1986). Essas células foram então incubadas a temperatura ambiente (RT) por 30 minutos. O sobrenadante de transfecção foi removido e o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 2% de soro de bezerro de bovino (BCS) foi adicionado e as células foram incubadas a 37°C e observadas (até 4 dias) para verificar o início do efeito citopático (CPE).
A transfecção de RNA PV-Max produziu de efeito citopático (CPE) em 24 horas, o que é comparável à transfecção de PV(M)-Wt RNA. O vírus PV-Max gerou placas idênticas em tamanho ao tipo selvagem. Em contraste, o PV-Min RNA não produziu efeito citopático visível após 96 horas e nenhum vírus viável pôde ser isolado mesmo após quatro passagens cegas do sobrenadante das células transfectadas.
O uso subsequente do sobrenadante das células submetidas à transfecção de RNA PV-Max também produziu 95% de CPE em 12 horas, desta forma indicando que o material genômico transfectado produziu com sucesso os virions de vírus de poliomielite PV-Max. Em contraste, o RNA viral do PV-Min não resultou em CPE visível após 96 horas, e quatro passagens cegas do sobrenadante, possivelmente contendo níveis extremamente baixos de vírus, também não produziram CPE. Assim, a sequência sintética PV-Min de comprimento total, utilizando pares de códons subrepresentados, na região P1 não consegue gerar um vírus viável e então precisaria ser subclonado.
As células HeLa RI 9 foram mantidas como uma monocamada no DMEM contendo 10% de BCS. A amplificação do vírus foi obtida em monocamadas de (1.0 x 108 células) HeLa R19 usando 1 M.O.I. As células infectadas foram incubadas a 37°C em DMEM com 2% de BCS por três dias ou até que fosse observado CPE. Após três ciclos de congelamento/descongelamento, os resíduos de célula foram removidos dos lisados via centrifugação de baixa velocidade e o sobrenadante contendo vírus foi usado para mais experimentos.
As curvas de crescimento de um passo foram obtidas infectando uma monocamada de células HeLa RI 9 com 5 MOI de um vírus determinado, o material inoculante foi removido, as células lavadas 2x com PBS e depois incubadas a 37°C por 0, 2, 4, 7, 10, 24 e 48 horas. Esses pontos de tempo foram então analisados via ensaio de placa. Todos os ensaios de placa foram realizados em monocamadas de células HeLa RI 9. Essas células foram infectadas com diluição serial de um determinado ponto de tempo de curva de crescimento ou vírus purificado. Essas células foram então sobrepostas com uma goma tragacanto 0,6% em Meio Eagle Modificado contendo 2% de BCS e depois incubadas a 37°C por dois dias para PV(M)- wt e PV- Max, ou 3 dias para vírus PV-MIN (X, Y, XY, ou Z). Essas foram então desenvolvidas via tingimento de violeta cristal e a titragem PFU/ml foi calculada contando as placas visíveis.
Pequenas regiões de viés de par de códons subrepresentado resgatam a visibilidade, mas atenuam o vírus.
Usando os locais de restrição designados dentro da sequência PV-Min, subclonamos partes da região PV-Min P1 em um vírus de resto do tipo selvagem, produzindo vírus quiméricos onde as subregiões de P1 tinham viés de par de códons ruim (Figura 11) (van der Werf et al., 1986). De cada um desses subclones, o RNA foi produzido via transcrição in vitro e depois transfectadas para células HeLa RI 9, resultando em vírus com graus variáveis de atenuação (escores de viabilidade, Fig. 11). Os fragmentos P1 X e Y são, cada um, levemente atenuados; no entanto, quando somados, eles resultam em um vírus (PV-Min755"2470, PV-MinXY) que é substancialmente atenuado (Figuras 3, 4). O vírus PVMin2470"3385 (PV-MinZ) é quase tão atenuado quanto o PV-MinXY. A construção do PV-Min1513"3385 (YZ) não resultou em placas, então, aparentemente, é atenuado demais para produzir um vírus viável. Essas construções de vírus que demonstraram graus variáveis de atenuação foram adicionalmente investigados para determinar sua real cinética de crescimento.
Cinética de crescimento de um passo e mecanismo de atenuação: A infectividade específica é reduzida.
Para cada construção viável, a cinética de crescimento de um passo foi examinada. Essa cinética é geralmente semelhante à do tipo selvagem, já que procede da mesma forma básica (ou seja, uma fase de eclipse seguida de um crescimento logarítmico rápido). No entanto, para todas as construções PV-Min, a titragem final em termos de Unidades de Formação de Placas (PFU) foi tipicamente mais baixa do que a dos vírus de tipo selvagem em três ordens de magnitude (Fig. 12A).
Quando o vírus é medido em partículas virais por ml (Fig. 12B) em vez de PFU, um resultado um pouco diferente é obtido e sugere que esses vírus produzem números quase equivalentes de partículas por célula por ciclo de infecção ao vírus de tipo selvagem. Em termos de partículas virais por ml, os vírus mais atenuados são apenas 78% (PV-MinXY) ou 82% (PV-MinZ) atenuados, o que numa escala logarítmica é menor do que uma ordem de magnitude. Assim, esses vírus parecem estar atenuados em apenas duas ordens de magnitude em sua infectividade específica (o número de vírion necessário para gerar uma placa).
Para confirmar que a infectividade específica foi reduzida, medimos novamente a proporção das partículas virais por PFU usando partículas de vírus altamente purificadas. Os vírus selecionados foram amplificados em 108 células HeLa RI 9. Os lisados virais foram tratados com RNAse A para destruir os genomas virais expostos e quaisquer RNAs celulares que iriam obscurecer valores OD. Ainda, os lisados virais foram então incubados por 1 hora com 0.2% e 2mM EDTA para desnaturar as proteínas virais celulares e não viriônicas. Um capsideo de vírus de poliomielite corretamente dobrado e formado sobrevive a esse severo tratamento SDS, mas partículas alfa não (Mueller et al., 5). Virions desses lisados tratados foram então purificados via ultracentrifugação sobre um gradiente de sacarose. A concentração de partícula de vírus foi medida por densidade óptica a 260nm usando a fórmula 9.4 x 1012 partículas/ml = 1 unidade OD26o (Rueckert, 1985). Um número semelhante de partículas foi produzido para cada um dos quatro vírus (Tabela 6). Um ensaio de placa foi então realizado usando esses virions purificados. Novamente, o PV-MinXY e PV-MinZ exigiram muito mais partículas virais do que do tipo selvagem para gerar uma placa (Tabela 6).
Para vírus de tipo selvagem, a infectividade específica foi calculada em 1PFU por 137 partículas (Tabela 6), de forma coerente com a literatura (Mueller et al., 2006; Schwerdt e Fogh, 1957; Joklik e Darnell, 1961). As infectividades específicas dos vírus PV-MinXY e PV-MinZ estão na região de 1 PFU por 10.000 partículas (Tabela 6)-
Adicionalmente, a estabilidade ao calor dos vírus sintéticos foi comparada com a do PV(M)-wt para reafirmar os dados de tratamento SDS, de que essas partículas com parte de RNA novo eram igualmente estáveis. Com efeito, esses vírus sintéticos tiveram o mesmo perfil de temperatura que o PV(M)-wt quando incubados a 50°C e quantificados como um transcurso de tempo (dados não mostrados).
Pares de códons subrepresentados reduzem a eficiência de tradução, enquanto pares sobrerrepresentados intensificam a tradução.
Uma hipótese para a existência de viés de par de códons é de que a utilização de pares subrepresentados causa índices de tradução ruins ou lentos. Nossos vírus sintéticos são, em nosso conhecimento, as primeiras moléculas contendo uma alta concentração de pares de códons subrepresentados e, como tal, são as primeiras moléculas aptas para um teste da hipótese de tradução.
Para medir o efeito do viés de par de códons na tradução, usamos um indicador dicistrônico (Mueller et al., 2006) (Fig. 13). O primeiro cístron expressa Renilla luciferase (R- Luc) sob o controle do local de entrada interno do ribossomo (IRES) do Vírus da Hepatite C e é usado como controle de normalização. O segundo cístron expressa a luciferase de vaga-lume (F-Luc) sob o controle do IRES de vírus de poliomielite. No entanto, neste segundo cístron, o F-Luc é precedido pela região P1 do vírus de poliomielite e essa região P1 poderia ser codificada por qualquer das variantes de sequência sintética aqui descritas. Como o F-Luc é traduzido como uma proteína de fusão com as proteínas da região P1, a traduzibilidade da região P1 afeta diretamente a quantidade de proteína F-Luc produzida. Assim, a razão de luminescência F-Luc para a luminescência R-Luc é uma medida da traduzibilidade das várias codificações P1.
As regiões P1 de tipo selvagem, PV-Max, PV-Min, PV-MinXYe PV-MinZ foram inseridas na região rotulada "P1" (Figura 13A). O PV-MinXY, PV-MinZ, e PV-Min produzem muito menos F-Luc por unidade de R-Luc do que a região P1 de tipo selvagem, enfaticamente sugerindo que os pares de códons subrepresentados estão causando índices de tradução ruins ou lentos. 13). Em contraste, PV-Max P1 (que usa pares de códons sobrerrepresentados) produziu mais F-Luc por unidade de R- Luc, sugerindo que a tradução é na verdade melhor para o PV-Max P1 em comparação com PV(M)-Wt P1.
Construção de indicador dicistrônico e tradução in vivo.
As construções de indicador dicistrônico foram todas feitas com base em pdiLuc-PV (Mueller et al., 2006). As regiões capsídeas PV-Max e PV-Min foram amplificadas via PCR usando os oligonucleotídeos Plmax-2A-RI (+)/Plmax-2A-RI (-) ou Plmin-2A-RI (+)/Plmin-2A-RI (-), respectivamente. O fragmento de PCR foi purificado com gel e depois inserido em um vetor intermediário pCR-®-XL-TOPO® (Invitrogen). Esse vetor intermediário foi então amplificado em células quimicamente competentes One Shot® TOPIO. Após a preparação do plasmídeo via minipreparação Quiagne, os vetores intermediários contendo PV-Min foram digeridos com EcoRI e esses fragmentos foram ligados no vetor pdiLuc-PV que foi igualmente digerido com EcoRI (Mueller et al., 2006). Esses plasmídeos foram também amplificados em células quimicamente competentes One Shot® TOPIO (Invitrogen). Para construir pdiLuc- PV-MinXY e pdiLuc-PV-MinZ,, pdiLuc-PV e pdiLuc-PV-Min foram igualmente digeridos com e os fragmentos de restrição resultantes foram trocados entre os respectivos vetores. Esses foram então transformados em células quimicamente competentes One Shot® TOPIO e depois amplificados. De todos os quatro desses clones, o RNA foi transcrito via o método polimerase T7 (van der Werf et al., 1986).
Para analisar a eficiência da tradução in vivo dos capsídeos sintéticos, o RNA das construções de indicador dicistrônico foram transfectadas em 2 x 105 células HeLa RI 9 em 12 placas de poças via Lipofectamina 2000 (Invtirogen). Para quantificar a tradução do RNA somente de entrada, a transfecção foi obtida na presença de 2mM de hidrocloreto de guanidina (GuHCL). Seis horas após a transfecção as células foram lisadas via tampão de lise passivo (Promega) e depois esses lisados foram analisados por um ensaio duplo de Renilla (R-Luc) de vaga-lume (F-Luc) (Promega). Estabilidade genética de PV-MinXY e PV-MinZ.
Como o PV-MinXY e o PV-MinZ contêm, cada um, centenas de mutações (407 e 224 respectivamente), com cada mutação causando uma minúscula diminuição no viés geral de par de códons, acreditamos que seria muito difícil esses vírus reverterem à virulência de tipo selvagem. Como um teste direto dessa ideia, os vírus PV-MinXY e PV-MinZ foram passados serialmente 15 vezes, respectivamente, a um MOI de 0,5. A titragem foi monitorada para observação de reversão fenotípica, e a sequência do vírus passado foi monitorada para observação de reversões ou mutação. Após 15 passagens, não houve mudança fenotípica (isto é, mesma titragem, indução de CPE) e não houve mutações fixas na região sintética.
Estabilidade ao calor e passagem
A estabilidade dos vírus sintéticos, PV-MinXY e PV-Min Z, foi testada e comparada ao PV(M)-Wt. Isso foi obtido aquecendo-se 1x10s partículas suspensas em PBS a 50°C por 60 minutos e depois medindo a diminuição nas partículas virais intactas via ensaio de placa em 5, 15, 30 e 60 minutos (Figura 14). Para testar a estabilidade genética das partes sintéticas da região P1 dos vírus PV-MinXY e PV-MinZ, esses vírus sofreram passagem serial. Isso foi obtido infectando uma monocamada de 1x106 células HeLa RI 9 com 0,5 MOI de vírus, PV-MinXY e PV-MinZ e depois esperando pela indução de CPE. Uma vez que o CPE tenha iniciado, o que permaneceu constante por todas as passagens, os lisados foram usados para infectar novas monocamadas de células HeLa RI 9. A titragem e a sequência foram monitoradas nas passagens 5, 9 e 15 (dados não mostrados).
Purificação de Vírus e determinação de partículas virais via absorção de OD260 Uma monocamada de células HeLa RI 9 em um prato de 15cm (1 x 108 células) foi infectada com PV(M)-Wt, PV-Max, PV-MinXY ou PV-Min Z até que se observou CPE. Após três ciclos de congelamento/descongelamento, os lisados de célula foram submetidos a duas centrifugações iniciais a 3.000 por 15 minutos e depois 10.000 x g por 15 minutos. Depois 10 μg/ml de RNAse A (Roche) foram acrescentados ao sobrenadante e incubados a RT por 1 hora; Posteriormente 0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS) e 2mM de EDTA foram acrescentados ao sobrenadante, suavemente misturados e incubados a RT por 30 minutos. Esses sobrenadantes contendo partículas de vírus foram colocados acima de uma camada de sacarose de 6ml [30% de sacarose na Solução de Sal Tamponada de Hank (HBSS)]. A sedimentação das partículas de vírus foi obtida por ultracentrifugação através do gradiente de sacarose por 3,5 horas a 28.000 rpm usando um rotor de centrifugação SW28.
Após a centrifugação, a camada de sacarose foi deixada intacta e o sobrenadante foi removido e o tubo foi lavado duas vezes com HBBS. Após a lavagem, a sacarose foi removida e o vírus "pérola" foi ressuspenso em PBS contendo 0,1% de SDS. As titragens virais foram determinadas via ensaio de placa (acima). A concentração de partículas de vírus foi determinada pela média de três medições da densidade óptica a 260nm da solução via o espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies) usando a fórmula 9,4 x 1012 particulas/ml -= 1 OD26o unidade (Mueller et al, 2006; Rueckert, 1985).
Neuroatenuação de PV-MinXY e PV-MinZ em ratos CD155tg.
O local primário de infecção do vírus de poliomielite tipo selvagem é a orofaringe e o intestino, mas esta infecção é relativamente assintomática. No entanto, quando a infecção se espalha para os neurônios motores no SNC em 1% das infecções 5 PV(M)-wt, o vírus destrói esses neurônios, causando morte ou paralisia flácida aguda conhecida como poliomielite (Landsteiner e Popper, 1909; Mueller et al., 2005). Como os neurônios motores e o SNC são os alvos críticos do vírus de poliomielite, nós queríamos saber se os vírus sintéticos seriam atenuados nesses tecidos. Assim, esses vírus foram administrados a ratos CD155tg (ratos transgênicos 10 expressando o receptor do vírus de poliomielite) via injeção intracerebral (Koike et al., 1991). O valor PLD50 foi calculado para os vírus respectivos e os vírus PV- MinXY e PV-MinZ foram atenuados em 1.000 vezes com base em partículas ou em 10 vezes com base em PFU (Tabela 6) (Reed e Muench, 1938). Como esses vírus não demonstraram neuroatenuação, eles poderiam ser usados como uma possível 15 vacina.
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Figure img0014
a) O A∑εofoi usado para determinar partículas/ml via a fórmula 9,4 x 1012partículas/ml = 1 b) Calculado pela divisão do PFU/ml de vírus purificado pelas Partículas/ml c, d) calculado após a administração do vírus via injeção intracerebral a ratos CD155tg em doses variadas A vacinação de ratos CD155tg fornece imunidade e proteção contra o desafio letal.
Grupos de ratos CD155tg (estirpe Tg21) de4a6e6a8 semanas de vida foram injetados por via intracerebral com diluições de vírus purificado de 102 partículas a 109partículas em 30ul PBS para determinar a neuropatogenia (Koike et al., 1991).
A dose letal (LD50) foi calculada pelo método Reed e Muench (Reed e Muench 1938). As titragens virais na espinha dorsal e cérebro foram quantificadas pelo ensaio de placa (dados não mostrados).
O PV-MinZ e PV-MinXY codificam exatamente as mesmas proteínas que o vírus de tipo selvagem, mas são atenuados em vários aspectos, tanto com redução de infectividade específica e neuroatenuação.
Para testar o PV-Min Z, PV-Min XY como uma vacina, três doses subletais (108 partículas) desse vírus foram administradas em 10Oul de PBS para 8 ratos CD155tg de 6 a 8 semanas de vida via injeção intraperitoneal uma vez por semana por três semanas. Um rato do grupo de vacinação não concluiu o regime de vacina em razão de doença. Ainda, um grupo de controle de ratos recebeu três vacinações simuladas com 10Oul de PBS. Aproximadamente uma semana após a vacinação final, 30ul de sangue foram extraídos da veia da cauda. Este sangue foi submetido a centrifugação de baixa velocidade e coleta de soro. A conversão do soro contra o PV(M)-Wt foi analisada via ensaio de microneutralização com 100 Unidades de Formação de Placas (PFU) de virus de desafio, realizado de acordo com as recomendações da OMS (Toyoda et al., 2007; Wahby. A.F. 2000). Duas semanas após a vacinação final e os ratos vacinados e de controle foram desafiados com uma dose letal de PV(M)-Wt por injeção intramuscular com 106de PFU em 10Oul de PBS (Toyoda et al., 2007). Todos os experimentos utilizando ratos CD155tg foram realizados em conformidade com as normas IACUC da Stony Brook University, bem como as diretrizes federais. Todos os 14 ratos vacinados sobreviveram e não mostraram sinais de paralisia; em contraste, todos os ratos que receberam vacina simulada morreram. Esses dados sugerem que, de fato, o vírus CPB usando pares de códons desotimizados consegue imunizar contra o vírus de tipo selvagem, fornecendo uma resposta umeral robusta e também permitindo completa sobrevivência após o desafio.
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a) Os ratos CDI55tg receberam três doses de vacinação (10 partículas) do vírus respectivo b) desafiados com 106PFU de PV(M)-wt via injeção intramuscular.
EXEMPLO 10 Aplicação do SAVE ao vírus influenza
O vírus influenza tem 8 segmentos genômicos separados. Os depósitos GenBank que divulgam as sequências de segmentos para o vírus Influenza A (A/Porto Rico/8/34/Monte Sinai(HINI)) inclui AF389115 (segmento 1, Polimerase PB2), AF389116 (segmento 2, Polimerase PBI), AF389117 (segmento 3, Polimerase PA), AF389118 (segmento 4, hemaglutinina HA), AF389119 (segmento 5, nucleoproteína N), AF389120 (segmento 6, neuraminidase NA), AF389121 (segmento 7, proteínas de matriz M1 e M2), e AF389122 (segmento 8, proteína não estrutural NSI).
Nos estudos inicias, o segmento genômico da estirpe A/PR/8/34 (também referido aqui como A/PR8) codificando a nucleoproteína NP, uma importante proteína estrutural, a segunda mais abundante proteína do vírion (1.000 cópias por partícula) que se liga como um monômero aos RNAs virais de extensão total para formar ribonucleoproteína helicoidal, foi escolhido para a desotimização. (Ver a Tabela 8 abaixo para matriz e sequências desotimizadas). Além disso, o NP está envolvido na mudança crucial de mRNA para o modelo e síntese de RNA de vírion (Palese e Shaw, 2007). Duas codificações sinônimas foram sintetizadas, a primeira substituindo códons frequentemente usados com códons sinônimos raros (NPCD) (isto é, viés de códon desotimizado), e o segundo, desotimizando pares de códons (NPCP'mn). Os 120 nucleotídeos terminais em ambas as extremidades do segmento não foram alterados de forma a não interferir com a replicação e encapsidação. O NP contém 338 mutações silenciosas e o NPCPmin (SEQ ID NO:23) contém 314 mutações silenciosas. Os segmentos mutantes NP foram introduzidos em vetores de sentido ambivalente como aqui descrito (abaixo) e juntamente com os outros sete plasmídeos de influenza wt, transfectados para dentro de células co-cultivadas 293TZ MDCK. Como controle, as células foram transfectadas com todos os 8 plasmídeos A/ PR8 wt. As células transfectadas com segmento NPCD e o segmento NPCPmin produziram vírus influenza viável de forma semelhante às células transfectadas com o NP de tipo selvagem. Esses novos vírus desotimizados, referidos como A/PR8- NPCD ou A/PR8-NPCPimn, respectivamente, parecem estar atenuados: A titragem (em termos de PFU) é de 3 a 10 vezes mais baixa do que a do vírus de tipo selvagem e os vírus mutantes formam placas pequenas.
Embora os vírus influenza desotimizados não sejam tão severamente atenuado quanto os vírus de poliomielite contendo um número semelhante de códons desotimizados, existe uma diferença nas estratégias de tradução dos dois vírus. O vírus de poliomielite possui um único mRNA longo traduzido em uma única poliproteína. A tradução lenta através do começo deste longo mRNA (como em nossos vírus desotimizados de capsídeo) irá reduzir a tradução de toda a mensagem, e assim afetar todas as proteínas. Em contraste, o influenza possui oito segmentos separados, e a desotimização de um terá pouco efeito, se algum, na tradução dos outros. Além disso, a expressão da proteína NP é particularmente favorecida no começo da infecção do vírus influenza (Palese e Shaw, 2007).
Caracterização do vírus influenza carregando um segmento NP desotimizado em par de códons
As características de crescimento do A/PR8-NPCPimn foram analisadas pelas monocamadas confluentes de infecção das células de Rim Canino Madin Darby (células MDCK) em pratos de 100 mm com 0,001 multiplicidades de infecção (MOI). Permitiu-se que os materiais inoculantes de vírus fossem adsorvidos a temperatura ambiente por 30 minutos em uma plataforma de balanço, depois complementado com 10 ml de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 0,2% de Soroalbumina Bovina (BSA) e 2ug/ml de Tripsina tratada com TPCK e incubada a 37C. Após 0, 3, 6, 9, 12, 24,e 48 horas, 100 μl do vírus contendo o meio foram removidos e as titragens de vírus determinadas por ensaio de placa.
As titragens virais e os fenótipos de placa foram determinados por ensaio de placa em monocamadas confluentes de células MDCK em seis placas de poços de 35mm. Diluições seriais de vírus de 10 vezes foram preparadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 0,2% de Soroalbumina Bovina (BSA) e 2μg/ml de Tripsina tratada com TPCK. As diluições de vírus foram colocadas nas células MDCK e permitidas adsorver a temperatura ambiente por 30 minutos em uma plataforma de balanço, seguidas por uma incubação de uma hora a 37C em um incubadora de cultura de células. O material inoculante foi então removido e 3 ml do Meio Eagle Mínimo contendo 0,6% de goma tragacanto (Sigma-Aldrich), 0,2% de BSA e 2ug/ml de Tripsina tratada com TPCK. Após 72 horas de incubação a 37C, as placas foram visualizadas tingindo-se os poços com violeta cristal.
O A/PR8-NPMin produziu vírus viável que produziu placas menores nas células MDCK em comparação com o A/PR8 wt (Figura 16A). Além disso, mediante infecção MCI baixa, o A/PR8- NPMin manifesta uma cinética de crescimento demorada, entre 3 e 12 horas pós infecção, onde a titragem A/PR8- NPMinfica 1,5 logaritmos atrás do A/PR8 (Figura 16B). As titragens finais foram de 3 a 5 vezes menores do que as do A/PR8 (média de três diferentes experimentos).
Caracterização dos vírus influenza A/PR8-PBIMin RR A/PR8-HAMin e A/PR8-HAMi7NPM,n carregando segmentos de PBI, HA, ou HA e desotimizados em par de códons.
Foram produzidos segmentos genômicos desotimizados em par de códons da estirpe A/PR/8/34 codificando proteína hemaglutinina HA e a subunidade de polimerase PBI HA é uma proteína estrutural virai que se projeta da superfície virai intermediando a anexação do receptor e a entrada do vírus. O PBI é um componente crucial no mecanismo de replicação de RNA. Especificamente, uma codificação sinônima de PBI (SEQ ID NO: 15) foi sintetizada pela desotimização de pares de códons entre códons 190 e 488 (nucleotideos 531-1488 do segmento PBI) retendo o uso de códons de tipo selvagem (PBIMin RR). O segmento PBIM,n RR contém 236 mutações silenciosas em comparação ao segmento PBI wt.
Uma segunda codificação sinônima de HA (SEQ ID NO:21) foi sintetizada pela desotimização de pares de códons entre códons 50-541 (nucleotídeos 180-1655 do segmento HA) retendo o uso de códons de tipo selvagem (HAMln). HAMin contém 355 mutações silenciosas em comparação ao segmento PBI wt.
Os segmentos mutantes PB lM,nRRe HAMln foram introduzidos em um vetor de sentido ambivalente como aqui descrito e juntamente com os outros sete plasmídeos de influenza wt, cotransfectados para dentro de células co-cultivadas 293T/MDCK. Além disso, o segmento HAMín juntamente com o segmento NPM,n e os demais seis plasmídeos wt foram cotransfectados. Como controle, as células foram transfectadas com todos os 8 plasmídeos A/PR8 wt. As células tranfectadas com segmentos pB|Min"RR ou (_|AMin produziram vírus viável, assim como a combinação de segmentos desotimizados em par de códons HAMin e NPMin. Os novos vírus desotimizados são referidos como A/PR8- pB1Mm-RR A7PRe. HAMm5eA/pRg HAMr7NPMm, respectivamente.
As características de crescimento e os fenótipos de placa foram avaliados como descrito acima. A/PR8- PB 1 MinRR, A/PR8- HAMin, e A/PR8-HAMj7NPM,n todos produziram vírus viável. A/PR8-PBIM,nRR e A/PR8-HAM7NPMin produziram placas menores em células MDCK em comparação com o A/PR8 wt (Figura 17A). Além disso, mediante infecção de baixa MOI em células, MDCK A/PR8-HAM'ne A/PR8-HAMl7NPMin mostram cinética de crescimento muito reduzida, especialmente de 3 a 12 horas após a infecção, onde a titragem A/PR8-HAMl7NPMin fica de 1 a 2 ordens de magnitude atrás de A/PR8 (Figura 17B). As titragens finais para A/PR8-HAM,n e A/PR8-HAMi7NPMin foram 10 vezes menores do que a de A/PR8. Como A/PR8-HAMi7NPMin tem um retardo de crescimento mais severo do que A/PR8-HAMin, pode-se concluir que o efeito de desotimizar dois segmentos é aditivo.
Atenuação de A/PR8-NPMinem um modelo de rato BALB/c Grupos de 6 a 8 ratos BALB/c com 6 meses de vida receberam 12,5 μl de A/PR8 ou A/PR8-NPMin de solução de vírus em cada narina contendo diluições seriais de dez vezes entre 102e 106 PFU de vírus. Foram monitoradas a mortalidade e a morbidez (perda de peso, redução de atividade, morte). A dose letal 50, LD50, foi calculada pelo método de Reed e Muench (LD50). (Reed, L. J., e M. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27:493-497).
Oito ratos foram vacinados uma vez por inoculação intranasal com 102 PFU de vírus A/PR8-NPMin. Um grupo de controle de 6 ratos não foi vacinado com qualquer vírus (simulação). 28 dias após a vacinação inicial, os ratos foram desafiados com uma dose letal do vírus wt A/PR8 correspondente a 100 vezes o LD50.
O LD50 para o A/PR8 foi 4,6 x 101 PFU enquanto o LD50 para o A/PR8-NPM'n foi de 1 x 103 PFU. A uma dose de 102 todos os ratos infectados com A/PR8-NPMin sobreviveram. Pode-s concluir que o A/PR8-NPMin é atenuado em ratos em mais de 10 vezes em comparação com o vírus A/PR8. Assim, essa concentração foi escolhida para experimentos com vacina. A vacinação de ratos com 102 A/PR8-NPMin resultou em uma doença leve e rápida, como indicado por uma perda relativa de peso de menos de 10% (Fig. 18A). Todos os 8 ratos vacinados sobreviveram. Os ratos infectados com o A/PR8 à mesma dose tiveram perda rápida de peso com doença grave. 6 de 8 ratos infectados com A/PR8 morreram entre 10 e 13 dias após a infecção (Fig. 18B). Dois ratos sobreviveram e se recuperaram da infecção de tipo selvagem.
Mediante desafio com 100 vezes o LD50 do vírus wt, todos os vacinados com A/PR8-NPMin foram protegidos, e sobreviveram o desafio sem sintomas de doença ou perda de peso (Figura 18C). Os ratos com vacina simulada, por outro lado, demonstraram sintomas severos, e sucumbiram à infecção entre 9 e 11 dias após o desafio. Pode-se concluir que o A/PR8-NPMin induziu imunidade protetora em ratos e, assim tem potencial como vacina viva e atenuada contra influenza. Outros vírus como A/PR8-PBIMin RR e A/PR8-HAMin/NPMin, que ainda não foram testados em ratos, podem levar a melhorar ainda mais as propriedades benéficas dos vírus influenza desotimizados em par de códons como vacinas.
EXEMPLO 11
Desenvolvimento de métodos de mais alto rendimento para fazer e caracterizar quimeras virais
Construindo vírus quiméricos pela sobreposição de PCR
A "varredura" através de cada vírus mutante atenuado é realizada colocando-se fragmentos de aproximadamente 300-bp de cada vírus mutante em um contexto wt usando o PCR sobreposto. Qualquer segmento de 300 bp se sobrepõe ao segmento anterior em -200 bp, isto é, a janela de varredura tem -300 bp de comprimento, mas se move para a frente em -100 bp para cada novo vírus quimérico. Assim, para fazer a varredura através de um vírus mutante (onde somente -3000 bp da região capsídea foi alterada) é preciso cerca de 30 vírus quiméricos. A varredura é realizada em formato de prato de 96 poços que tem capacidade mais do que suficiente para analisar dois vírus simultaneamente.
O material de começo é quantidades de picograma de dois plasmídeos, um contendo a sequência do vírus wt e a outra a sequência do vírus mutante. Os plasmídeos incluem todos os elementos necessários para a sistema de genética reversa de PV (van der Werf et al., 1986) incluindo o promotor de polimerase de RNA T7, a ribozima de cabeça de martelo (Herold e Aldino, 2000) e a cauda poli(a) codificada em DNA. São usados três tipos de iniciadores PCR, os pares A, M (de Mutante) e B. Ver Figura 9. O par M amplifica o segmento de 300 bp desejado do vírus mutante; ele não amplifica o wt porque os pares de iniciadores M são projetados com base nas sequências que tenham sido significativamente alteradas no mutante. Os pares A e B amplificam os flancos desejados do genoma viral wt. E, o que é importante, cerca de 20-25 bp da sequência de sobreposição é construídos nas extremidades 5' de cada iniciador M bem como A2 e B1 respectivamente; esses 20-25 bps se sobrepõem (100% de complementaridade com a extremidade 3' do segmento A e a extremidade 5' do segmento B, respectivamente.
Para realizar o PCR sobreposto, um prato de 96 poços contém DNA plasmídeo wt e os 30 pares diferentes A e B em 30 diferentes poços. Uma placa de 96 poços diferente mas coincidente contém o DNA plasmídeo mutante e os 30 pares diferentes de iniciador M. O PCR é realizado com uma polimerase estável ao calor, com baixo índice de erro e alto processamento. Após a primeira série de PCR, cada reação é tratada com Dpnl, que destrói o plasmídeo de modelo cortando os locais GmATC metilados. Uma alíquota de cada wt e reação mutante correspondente é então misturada no tampão de reação PCR em um terceiro prato de 96 poços. Desta vez, os iniciadores nos flancos de toda a construção são usados (iniciadores A1 e B2). Como cada segmento (A, M e B) é projetado para se sobrepor a cada segmento adjacente em pelo menos 20 bp e como a reação está sendo conduzida por iniciadores que só podem amplificar um produto de comprimento total, os segmentos arrefecem e se estendem mutuamente, resultando num produto de comprimento total após dois ou três ciclos. Este é um projeto de "3 tubos (três pratos de 96 poços) que pode ser compactado para "1 tubo" (um prato de 96 poços).
Caracterização dos vírus quiméricos
No momento da incubação com polimerase de RNA T7, os genomas de DNA quiméricos lineares de comprimento total produzidos acima com todos os elementos reguladores posteriores e anteriores necessários resultam em RNA virai ativo, que produz partículas virais mediante incubação em extrato de célula HeLa S10 (Molla et al., 1991) ou mediante transfecção em células HeLa; Alternativamente, é possível transfectar as construções de DNA diretamente para células HeLa que expressam a polimerase do RNA T7 no citoplasma.
A funcionalidade de cada vírus quimérico é então ensaiada usando uma diversidade de ensaios relativamente de alto rendimento, incluindo inspeção visual das células para avaliar CPE induzido por vírus em formato de 96 poços; estimativa da produção de vírus usando um ELISA, medição quantitativa da cinética de crescimento de iguais quantidades de partículas virais inoculadas em células em séries de placas de 96 poços; e medição da infectividade específica (proporção de unidades infecciosas/ partículas [IU/P]).
A funcionalidade de cada vírus quimérico pode então ser ensaiada. Estão disponíveis diversos ensaios de relativo alto rendimento. Um primeiro ensaio deve ser a inspeção visual das células usando um microscópio para procurar CPE induzido por vírus (morte de célula) em formato de 96 poços. Isso também pode ser feito em um ensaio de 96 poços automatizado usando um corante vital, mas a inspeção visual de uma placa de 96 poços para CPE exige menos de uma hora de dedicação, o que é rápido o suficiente para a maioria das finalidades.
Em segundo lugar, de 3 a 4 dias após a transfecção, a produção de vírus pode ser ensaiada usando o método ELISA descrito no Exemplo 3. Alternativamente, a titragem de partículas é determinada usando ELISA em meio a anticorpos específicos de capsídeo. Esses ensaios permitem a identificação de construções não-viáveis (sem partículas virais), construções de fraca replicação (poucas partículas) e construções de replicação eficiente (muitas partículas) e a quantificação desses efeitos.
Em terceiro lugar, para uma determinação mais quantitativa, quantidades iguais de partículas virais como determinado acima são inoculadas em uma série de novos pratos de 96 poços para medir a cinética de crescimento. Em vários momentos (0, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 horas após a infecção), uma placa de 96 poços é removida e submetida a ciclos de congelamento-descongelamento para liberar vírus associado à célula. O número de partículas virais produzidas em cada construção a cada momento é determinado pelo ELISA como visto acima.
Em quarto lugar, a proporção IU/P pode ser medida (ver Exemplo 3) '
Varreduras de mais alta resolução
Se a letalidade dos vírus for devida a muitos pequenos defeitos espalhados pela região capsídea, como indicam os dados preliminares, então muitas ou a maioria estão doentes e somente algumas poucas não são viáveis. Se for este o caso, provavelmente não são necessárias varreduras de mais alta resolução. Ao inverso, se um ou mais dos segmentos de 300 bp causar letalidade (como é possível com o vírus desotimizado em códon no segmento entre 1513 e 2470 o qual, como descrito abaixo, pode carregar um sinal de deslocamento do quadro de leitura de tradução que contribuiu para um forte fenótipo deste segmento), a varredura de genoma é repetida em mais alta resolução, por exemplo, uma janela de 30 bp movendo-se em 10bp entre construções pelo segmento de 300 bp, e a seguir a análise fenotípica. A varredura de 30bp não envolve o PCR do vírus mutante; em vez disso, o segmento alterado de 30 bp é projetado diretamente nos iniciadores PCR do vírus wt. Isso permite as mudanças responsáveis pela letalidade a ser identificada.
Exemplo 12 Investigações em andamento sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao SAVE Escolha de quimeras
Dois a quatro exemplos de quimeras de cada um dos dois vírus parentais inviáveis (isto é, 4 a 8 vírus no total) são usados nos seguintes experimentos. São selecionadas quimeras viáveis com segmentos relativamente pequenos de DNA mutante, mas com fenótipos fortes. Por exemplo, os vírus PV-AB755"1513, PVAB2470"2954 e PV-AB2954"3386 dos vírus desotimizados em códon (ver Exemplo 1) e PV-Min755”2470 e PV-Min2470"3386 (ver Exemplo 7) são adequados. Quimeras ainda melhores para começar, com menores inserções que facilitarão a análise, também podem ser obtidas dos experimentos acima descritos (Exemplo 8).
Abundância/estabilidade de RNA
De modo concebível, a sequência de genoma alterada desestabiliza o RNA virai. Tal desestabilização pode ser um efeito direto da sequência nova, ou um efeito direto de uma pausa na tradução, ou outro defeito na tradução (ver, por exemplo, Doma e Parker, 2006). A abundância do RNA virai mutante é assim examinada. Quantidades iguais de RNA do vírus mutante quimérico e do vírus wt são misturadas e transfectadas em células HeLa, São tomadas amostras após 2, 4, 8 e 12 horas e analisadas por Northern blot ou PCR quantitativo para os dois RNAs virais diferentes, que são facilmente distinguíveis já que existem centenas de diferenças de nucleotídeo. Também é feito um controle com o RNA virai wt em comparação com o PV-SD (o vírus embaralhado por códon com um fenótipo wt). Uma proporção reduzida de RNA mutante para vírus wt indica que a quimera possui um RNA desestabilizado.
Tradução in vitro
A tradução se mostrou reduzida para o vírus desotimizado em códon e alguns de seus derivados. Ver Exemplo 5. Os experimentos de tradução in vitro são repetidos com os vírus desotimizado em par de códons (PV-Min) e suas quimeras escolhidas. Atualmente não existe uma boa teoria, muito menos qualquer evidência, sobre por que os pares de códons desotimizados deveriam levar a inviabilidade virai, desta forma, a investigação do efeito na tradução pode ajudar a elucidar o mecanismo subjacente.
As traduções in vitro foram realizadas em dois tipos de extratos no Exemplo 5. Um deles foi um extrato "turbinado" (Molla et al., 1991) em que até mesmo os vírus desotimizados em códon aparentemente deram uma boa tradução. O outro era um exgrato mais próximo das condições normais in vivo, no qual os vírus desotimizados em códon foram traduzidos de forma ineficiente. Houve quatro diferenças entre os extratos: o extrato mais "nativo" não foi dialisado; os mRNAs celulares endógenos não foram destruídos com nuclease micrococal; o extrato não foi complementado com aminoácidos exógenos; e o estrato não foi complementado com tRNA exógeno. No presente estudo, esss quatro parâmetros são alterados um de cada vez (ou em pares, se necessário) para ver qual tem o efeito mais significativo na tradução. Por exemplo, uma descoberta de que é a adição de aminoácidos e tRNA que permite a tradução do vírus desotimizado em códon confirma fortemente a hipótese de que a tradução é ineficiente apnas porque os aminoacil-tRNAs raros são limitants. Tal descoberta é importante do ponto de vista de estender a abordagem SAVE para outros tipos de vírus.
Deslocamento do quadro de leitura na tradução
Outro possível defeito é que as mudanças de códon poderiam promover deslocamento do quadro de leitura na tradução; isto é, em alguns pares de códons, o ribossomo poderia se deslocar para um diferente quadro de leitura, e depois chegar a um códon de parada dentro do quadro após traduzir uma sequência de peptídeo espúria. Esse tipo de deslocamento de quadro de leitura é um evento regulador importante em alguns vírus. Os dados atuais revelam que todos os genomas de PV que carregam o segmento mutante AB do resíduo 1513 a 2470 são não-viáveis. Além disso, todos os genomas que carregam esta região mutante produzem uma nova banda de proteína durante a tradução in vitro de aproximadamente 42-44 kDa (ver Figura 5A, marcada por asterisco). Esta nova proteína poderia ser resultado de um deslocamento do quadro de leitura.
O exame da sequência no intervalo 1513-2470 revela três locais candidatos em potencial que se adequam à sequência de consenso heptamérica escorregadia para -1 deslocamento de quadro de leitura em eucariotas (X-XXY-YYZ) (Farabaugh, 1996). Esses locais são A-AAA- AAT nas posições 1885 e 1948, e T-TTA-TTT na posição 2119. Eles são seguidos por códons de parada no quatro -1 em 1929, 1986 ou 2149, respectivamente. Os dois primeiros parecem ser candidatos mais prováveis para produzir uma banda do tamanho observado.
Para determinar se está ocorrendo deslocamento do quadro de leitura, cada uma das três regiões candidatas é mudada separadamente, de forma que se torna desfavorável para o deslocamento. Ainda, cada um dos candidatos a códon de parada é separadamente mudado para um códon de sentido. Esses seis novos pontos mutantes são testados por tradução in vitro. A perda da proteína nova 42-44 kDa na mutação do local de deslocamento de quadro de leitura para uma sequência desfavorável, e um aumento no peso molecular daquela banda de proteína na eliminação do códon de parada, indicam que está ocorrendo deslocamento de quadro de leitura. Se tal deslocamento for a causa para o produto de tradução aberrante, a viabilidade do novo mutante que não tem o local de deslocamento do quadro de leitura é testado no contexto do segmento mutante 1513-2470. Claramente, tal descoberta seria significativa para futuros projetos de genoma e, se necessário, pode ser incorporado um filtro de deslocamento do quadro de leitura no algoritmo de software para evitar locais de deslocamento do quadro de leitura em potencial.
Investigações mais detalhadas de defeitos de tradução são conduzidas usando várias técnicas incluindo, mas sem limitação, perfil de polissomo, "pegada de dedo" e ensaio luciferase de proteínas de fusão.
Perfil de polissomo
Perfil de polissomo é um método tradicional de examinar a tradução. Ele não é de alto rendimento, mas é muito bem desenvolvido e entendido. Para o perfil de polissomo, são feitos extratos de célula em uma forma que impede a tradução (com cicloeximida) e ainda assim preserva o grupo de ribossomos que estão no ato de traduzir seus mRNAs respectivos (os "polissomos"). Esses polissomos são fracionados em um gradiente de sacarose, onde as mensagens associadas com um número maior de ribossomos sedimentam em direção ao fundo. Após o fracionamento do gradiente e análise do teor de RNA usando absorção de UV, é visto um perfil de polissomo onde os picos sucessivos de absorção correspondem aos mRNAs com N + 1 ribossomos; tipicamente de 10 a 15 picos distintos (representando a subunidade de ribossomo 40S e a subunidade 60S e 1, 2, 3, . . . 12, 13 ribossomos em um único mRNA) podem ser discernidos antes que os picos se misturem. As várias frações do gradiente de sacarose são então processadas em gel, secadas em uma membrana e analisadas por análise Northern para mRNAs em particular. Isso mostra se aquele mRNA está primariamente ligado a, digamos, 10 a 15 ribossomos (bem traduzidos) ou 1 a 4 ribossomos (mal traduzidos).
Nesse estudo, por exemplo, o vírus wt, o vírus PV-AB (desotimizado em códon) e seus derivados PVAB755'1513 e PV-AB2954"3386, que têm primariamente segmentos desotimizados de terminal N e terminal C, respectivamente, são comparados. A comparação entre os segmentos mutantes de terminal N e terminal C é particularmente reveladora. Se a desotimização em códon fizer com que a tradução fique lenta ou pausada, então o RNA mutante de terminal N está associado com relativamente poucos ribossomos (porque os ribossomos se movem muito lentamente através da região terminal N, impedindo outros ribossomos de serem carregados e depois se moverem rapidamente através do resto da mensagem depois de cruzar a região desotimizada). Em contraste, o RNA mutante de terminal C está associado a um número relativamente alto de ribossomos, porque muitos ribossomos conseguem se carregar, mas como eles estão impedidos perto do terminal C, eles não conseguem sair da transcrição, e o número de ribossomos associados é alto.
A análise de polissomo indica quantos ribossomos estão ativamente associados com diferentes tipos de RNA mutante e podem, por exemplo, distinguir modelos em que a tradução é lenta de modelos em que o ribossomo efetivamente cai do RNA de forma prematura. Também podem ser testados outros tipos de modelo.
Pegada de dedo
Pegada de dedo (toeprinting) é uma técnica para identificar posições em um mRNA onde os ribossomos estão lentos ou pausados. Como no perfil de polissomo, são obtidos mRNAs de tradução ativa, com seus ribossomos congelados com cicloeximida mas ainda associados; os mRNAs são frequentemente obtidos de uma reação de tradução in vitro. Um iniciador de oligonucleotídeo de DNA complementar a alguma parte relativa de 3' do mRNA é usado, e depois estendido por transcriptase reversa. A transcriptase reversa se estende até colidir com um ribossomo. Assim, uma população de moléculas de mRNA de tradução gera uma população de fragmentos de DNA que se estendem do local do iniciador até o ribossomo mais próximo. Se houver um local ou região em que os ribossomos tendam a pausar (digamos, 200 bases do iniciador), então este local ou região irá gerar um número desproporcional de fragmentos de DNA (nesse caso, fragmentos com 200 bases de comprimento). Isso aparece então como uma "pegada de dedo" (uma faixa ou área escura) em gel de alta resolução. Este é um método padrão para mapear locais de pausa de ribossomo (em até alguns poucos nucleotideos) nos mRNAs.
São analisadas quimeras com segmentos de códons desotimizados, ou pares de códons, onde em diferentes quimeras os segmentos são movidos levemente 5' ou 3'. Se os segmentos desotimizados fizerem com que os ribossomos desacelerem ou parem, a pegada de dedo se move 5' ou 3' para coincidir com a posição do segmento desotimizado. Os controles incluem RNA virai wt e vários RNAs virais embaralhados (de forma inofensiva). Os controles também incluem RNA virai mutante puro (isto é, não vinculado à tradução) para excluir os efeitos independentes de ribossomo da nova sequência na transcrição reversa.
O ensaio de pegada de dedo tem pelo menos duas vantagens. Primeiro, ele pode fornecer evidência direta de um ribossomo pausado. Segundo, ele tem resolução para alguns poucos nucleotideos, então ele pode identificar exatamente quais códons desotimizados ou pares de códons desotimizados estão causando a pausa. Isto é, pode ser que apenas alguns poucos dos códons desotimizados ou pares de códons sejam responsáveis pela maior parte do efeito, e a pegada de dedo pode revelar isso.
Ensaios de Indicador de Luciferase Duplo de proteínas de fusão
Os experimentos acima podem sugerir que certos códons ou pares de códons são particularmente nocivos à tradução. Como uma forma de alto rendimento de analisar os efeitos de códons e pares de códons em particular na tradução, são projetados pequenos peptídeos de teste e fundidos com os Terminais N de luciferase de renila. A atividade de luciferase é então medida como um ensaio da traduzibilidade do peptídeo. Isto é, se o peptídeo de terminal N é mal traduzido, pouca luciferase será traduzida.
Uma série de oito peptídeos de 25-mer são designadas com base nos experimentos acima. Cada um dos oito 25-mer é codificada de 12 formas diferentes, usando várias permutações de códons raros e/ou pares de códon raro de interesse. Usando PCR de montagem, essas 96 construções (8 25-mer x 12 codificações) são fundidas ao terminal N da luciferase de vaga-lume (F-luc) em um vetor de luciferase duplo dicistrônico descrito acima 9ver Exemplo 5 e Figura 6) Um sistema de luciferase dupla usa tanto a luciferase de vaga-lume (F-Luc) e a luciferase de renila (Renilla) (R-Luc); esses emitem luz sob condições bioquímicas diferentes, e então podem ser testados separadamente a partir de um único tubo ou poço. Um indicador dicistrônico é expresso como um único mRNA, mas a luciferase de controle (R-Luc) é traduzida de um local de entrada de ribossomo interno (IRES), enquanto a luciferase experimental (F-luc) (que tem seus peptídeos de teste fundidos ao seu terminal N) é traduzida de forma independente de seu próprio IRES. Assim, a razão de movimentação F-Luc em relação à movimentação R-Luc é uma indicação da traduzibilidade do peptídeo de teste. Ver Figura 6.
As 96 construções de indicador dicistrônico resultante são transfectadas diretamente das reações de PCR para 96 poços de células HEK293 ou HeLa. A luciferase de vaga-lume do cístron posterior serve como um controle interno de transfecção. A expressão dependente de códon ou par de códons da luciferase de renila no segundo cístron pode ser precisamente determinada como a proporção entre R-Luc e F-Luc. Este ensaio é de alto rendimento em sua natureza, e centenas ou mesmo milhares de sequências de teste podem ser ensaiadas, como necessário.
Exemplo 13
Projeto e síntese de vírus atenuados usando uma estratégia de códon alternativa
A abordagem SAVE para a reengenharia de vírus para produção de vacina depende em larga escala da substituição de códons sinônimos para reduzir a tradução de proteínas virais. Isso pode ser obtido pela modulação apropriada do viés de códon e par de códons, bem com o de outros parâmetros como a estrutura secundária de RNA e o teor de CpG. Dos quatro projetos de PV "de novo", dois (o vírus de códon embaralhado, PV-SD, e o vírus de par de códons favorecido, PV-Max), resultou em pouca mudança fenotípica sobre o vírus wt. Os outros dois projetos "de novo" (PV- AB e PV-Min) tiveram sucesso em matar o vírus usando apenas substituições sinônimas através de dois mecanismos diferentes (mudanças drásticas em viés de códon e viés de par de códons, respectivamente). As estirpes vivas mas atenuadas foram construídas subclonando as regiões a partir das estirpes de vírus inativadas no wt.
Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes de atenuação virai utilizando substituições sinônimas em larga escala facilita as previsões do fenótipo e o nível de expressão de um vírus sintético. Estudos em andamento abordam questões relacionadas ao efeito do número total de alterações ou a densidade de alterações na eficiência de tradução; o efeito da posição das regiões densas na tradução; a interação de viés de códon e par de códons; e o efeito de engendrar grandes números de estruturas secundárias de RNA de alcance curto no genoma. É provável que haja um contínuo entre o wt e as estirpes inativadas, e que qualquer nível de atenuação desejado possa ser engendrado em uma estirpe enfraquecida. No entanto, pode haver limites rígidos no nível de atenuação que podem ser atingidos para qualquer infecção ser autossustentável e dessa forma detectável. As 15442 codificações de proteínas de PV constituem um grande espaço de sequência a explorar, e várias abordagens estão sendo utilizadas para explorar esse espaço de sequência de forma mais sistemática. Essas abordagens incluem, primeiro, o desenvolvimento de uma plataforma de software para ajudar a projetar novos vírus atenuados, e, em segundo lugar, o uso deste software para projetar e depois sintetizar e caracterizar vários novos vírus que explorem mais do espaço de sequência, e respondam a perguntas específicas sobre como as codificações alternativas causam atenuação. Além disso, uma questão importante a considerar é se podem ser criados vírus perigosos acidentalmente pelo baralhamento aparentemente inofensivo de códons sinônimos.
Desenvolvimento de software para projeto computadorizado de genomas virais e análise de dados
O projeto de vírus sintéticos exige um suporte de software substancial para (1) otimizar uso de códon e pares de códon e monitorar a estrutura secundária de RNA preservando, embutindo ou removendo sinais específicos de sequência e (2) particionamento da sequência em oligonucleotídeos que garantam uma montagem de sequência precisa. O as ferramentas de software de projeto de protótipo de genoma sintético estão sendo expandidas para um ambiente completo para projeto de genoma sintético. Nesse software expandido, o editor de gene é construído conceitualmente em torno das limitações em vez das sequências. O projetista de gene trabalha em nível de características de especificação do gene desejado (por exemplo, sequência de aminoácidos, distribuição de códon/par de códons, distribuição de locais de restrição e limitações de estrutura secundária de RNA) e o editor de gene algoritmicamente projeta uma sequência de DNA percebendo essas limitações. Existem muitas limitações, muitas vezes interagindo umas com as outras, incluindo, mas sem limitação, sequência de aminoácidos, viés de códon, viés de par de códons, teor de dinucleotídeo CG, estrutura secundária de RNA, sinais de ácido nucleico cis-atuantes tais como CRE, locais de separação, locais de poliadenilação e locais de reconhecimento de enzima de restrição. O projetista de gene reconhece a existência dessas limitações e projeta genes com as características desejadas, enquanto satisfaz automaticamente a todas as limitações a um nível previamente especificado.
Os algoritmos de síntese anteriormente desenvolvidos para embutir/remover padrões, estruturas secundárias, quadros de codificação sobrepostos e observar distribuições de códon/par de códons são implementados como parte do editor, mas mais importantes são os algoritmos para perceber combinações heterogêneas de tais preferências. Com tais combinações levam a problemas não tratáveis por computador (NP-completos), a otimização heurística necessariamente desempenha um papel importante no editor. São usadas técnicas de arrefecimento simulado para executar esses projetos; isso é particularmente apropriado já que o arrefecimento simulado obteve seu primeiro uso prático nas primeiras ferramentas de projeto VLSI. O ambiente completo de programação de projeto de gene é independente de plataforma, rodando em Linux, Windows e MacOS. O sistema é projetado para trabalhar com genomas em escala de bactéria ou fungo (fermento) e é validado através da síntese e avaliação dos novos projetos virais atenuados descritos abaixo. Projetos de vírus com viés de códon extremo em um ou poucos aminoácidos
Para uma vacina viva, um vírus deve estar o mais debilitado possível, sem estar inativado, pois nesse caso não há como cultivar e fabricar o vírus. Uma forma de obter um vírus debilitado em grau ideal é engendrar a substituição de códons raros por apenas um ou poucos aminoácidos e criar a linha de célula correspondente que sobreexpresse os tRNAs raros que se ligam a esses códons raros. O vírus consegue então crescer de forma eficiente na linha de célula permissiva, mas é inviável em linhas normais de célula hospedeira. O vírus é cultivado e fabricado usando a linha de célula permissiva, o que é não apenas muito conveniente, mas também mais seguro do que os métodos atualmente utilizados para produzir vacinas vivas atenuadas.
Com a ordenação do genoma humano, as informações sobre número de cópia de vários genes de tRNA que lêem códons raros estão disponíveis. Com base na literatura (por exemplo, Lavner e Kotlar, 2005), os melhores códons raros para as finalidades atuais são CTA (Leu), um códon bastante raro que tem apenas duas cópias do gene tRNA cognato; TCG (Ser), um códon raro com quatro cópias do gene tRNA cognato; e CCG (Pro), um códon raro com quatro cópias do gene tRNA cognato (Lavner e Kotlar, 2005). O número médio de cópias de um gene tRNA de um tipo particular é 9, enquanto a faixa é de 2 a 33 cópias (Lavner e Kotlar, 2005). Assim, o códon CTA não é apenas um códon raro, mas é também o códon com menos genes tRNA cognatos. Esses códons não são lidos por nenhum outro tRNA; por exemplo, eles não são lidos via emparelhamento de base de oscilação.
Espera-se que a mudança de todos os códons na codificação de genoma de vírus para Leu (180 códons), Ser (153) e Pro (119) para os códons sinônimos raros CTA, TCG ou CCG respectivamente crie vírus gravemente debilitados ou mesmo não viáveis. Então podem ser criadas células auxiliares que sobreexpressam os tRNAs raros correspondentes. O vírus correspondente é absolutamente dependente do cultivo somente nesse sistema de cultura artificial, fornecendo o melhor em segurança para a geração de vírus para produção de vacina.
Quatro vírus de alta prioridade são projetados e sintetizados: todos os códons Leu trocados para CTA; todos os códons Ser trocados para TCG; todos os códons Pro trocados para CCG; e todos os códons Leu, Ser e Pro trocados para CTA, TCG e CCG respectivamente em um único vírus. Em uma configuração, essas substituições são feitas somente na região capsídea do vírus, onde um alto índice de tradução é muito importante. Em outra configuração, as substituições são feitas por todo o vírus.
Vírus de viés de dinucleotídeo CG Com poucas exceções, os genomas de vírus subrepresentam o dinucleotídeo CpG, mas não GpC (Karlin et al., 1994). Este fenômeno é independente do teor geral de G+C no genoma. O CpG é normalmente metilado no genoma humano, de forma que um DNA de fita única contendo dinucleotídeos CpG não metilados, como frequentemente presentes em bactérias e vírus de DNA, são reconhecidos como uma assinatura patógeno pelo receptor Toll-like 9. Isso leva à ativação do sistema imunológico inato. Embora um sistema semelhante não tenha demonstrado funcionar para vírus RNA, a inspeção do genoma de PV sugere que o PV selecionou contra códons sinônimos contendo CpG numa extensão ainda maior do que a subrepresentação dos dinucleotídeos CpG em humanos. Isso é particularmente impressionante para códons de arginina. Dos seis códons sinônimos Arg, os quatro CG contendo códons (CGA, CGC CGG, CCU) juntos representam apenas 24 de todos os 96 códons Arg, enquanto os dois remanescentes (AGA, AGG) totalizam 72. Isso em contraste com o uso de códons médio humano, que 65 CG contendo códons e 31 códons AGA/AGO. Na verdade, dois dos códons subrepresentados no PV são frequentemente usados em células humanas (CGC, CGG). Existem dois outros indícios de que o CG pode ser um dinucleotídeo em desvantagem no PV. Primeiro, no vírus desotimizado em par de códons, muitos dos pares de códon raros introduzidos contém CG como o dinucleotídeo central do hexâmero de par de códons Segundo, quando Burns et al (2006) passou seus vírus desotimizado em par de códons e ordenou os genomas, foi observado que esses vírus evoluíram para remover alguns dinucleotideos CG.
Assim, em um vírus reelaborado de alta prioridade, a maioria ou todos os códons Arg são mudados para CGC ou CGG (dois códons humanos frequentes). Isso não afeta negativamente a tradução e permite uma avaliação do efeito do viés de dinucleotídeo CpG no crescimento do vírus. Um teor de C+G aumentado do vírus resultante requer um monitoramento cuidadoso da estrutura secundária; isto é, não são permitidas mudanças nos códons Arg para criar estruturas secundárias pronunciadas.
Modulando viés de códon e viés de par de códons simultaneamente.
O viés de códon e o viés de par de códons poderiam, de forma concebível, interagir um com o outro em nível de tradução. O entendimento dessa interação pode permitir a regulagem previsível da traduzibilidade de qualquer proteína determinada, possivelmente em um alcance extremo.
Se representarmos o viés de códon e viés de par de códons do vírus da poliomielite de tipo selvagem e o viés de códon e viés de par de códons de pior tipo possível como -1, então os quatro vírus de alta prioridade são os vírus (- 0,3, -0,3), (-0,3, -0,6), (-0,6, -0,3), e (-0,6, -0,6) Esses vírus revelam como o viés de códon interage de forma ruim ou moderadamente com vírus de par de códons moderadamente ruim ou muito ruim. Esses vírus são comparados ao tipo selvagem e também aos projetos extremos PV-AB (-1, 0) e PV-Min (0, -1).
Modulando a estrutura secundária de RNA
Os projetos sintéticos acima protegem contra estruturas secundárias excessivas. Dois projetos adicionais sistematicamente evitam as estruturas secundárias. Esses vírus são engendrados para ter viés de códon e par de códons wt com (1) provavelmente mínima estrutura secundária, e (2) muitas estruturas secundárias pequenas o suficiente para atrasar a tradução.
Projetos virais adicionais
Os projetos virais adicionais incluem projetos viés de códon e viés de par de códons de genoma total; projetos de viés de par de códons não-CG; projetos de códon raro de densidade reduzida; e vírus com cerca de 150 códons raros, espalhados pela região capsídea ou agrupados no terminal N na extremidade do capsídeo, ou agrupados no terminal C na extremidade do capsídeo.
EXEMPLO 14 Testando o potencial para criar vírus de maior virulência acidentalmente
É teoricamente possível que a reelaboração dos genomas virais com o objetivo de atenuar esses vírus possa acidentalmente criar um vírus mais virulento do que o vírus wt. Como as sequências de proteína não são alteradas no procedimento SAVE, esse resultado é improvável. No entanto, é desejável demonstrar de forma experimental que a abordagem SAVE é benigna.
Das possíveis 10442 sequências que poderiam codificar as proteínas PV, alguma versão razoavelmente adequada do PV surgiu em algum ponto do passado, e evoluiu a um ótimo local (em oposição a um ótimo global). A criação de uma nova versão de PV com a mesma capacidade de codificação de proteína mas um grupo muito diferente de códons coloca este vírus em um local diferente no panorama de aptidão global, que poderia, de forma concebível, estar próximo de um ótimo local diferente de PV wt. Também de forma concebível, esse novo ótimo local poderia ser melhor do que o ótimo local de tipo selvagem. Assim, é apenas um pouco possível que o baralhamento de códons sinônimos possa criar um vírus mais adequado.
Para investigar essa possibilidade, 13 genomas de PV são reelaborados e sintetizados; um vírus com o melhor viés de códon possível; um vírus com o melhor viés de par de códons possível (isto é, PV-Max); um vírus com o melhor viés de códon e par de códons possível; e 10 vírus adicionais com viés de códon e par de códons wt, mas códons sinônimos embaralhados. Outros parâmetros, tais como estrutura secundária, teor de C+G e teor de dinucleotídeo CG são mantidos o mais próximo possível dos níveis wt.
Esses 13 vírus podem estar em uma localização diferente do panorama de aptidão global um do outro e do tipo selvagem. Mas nenhum deles está em um ótimo local pois não foram submetidos à seleção. Os 13 vírus e o wt são passados, e são tomadas amostras de vírus na 1a, 10a, 20a e 50a passagem. Sua adequação e comparada um com o outro e com o wt avaliando tamanho de placa, unidades de formação de placa/ml em curvas de crescimento de um passo e números de partículas formadas por célula. Ver Exemplo 1. Cinco exemplos após cada um dos 13 vírus são ordenados após a 10a, 20a e 50a passagem. Isolados de passagem selecionados são testados quanto à patogenicidade em ratos CD155tg, e os LDso são determinados. Esses ensaios revelam se quaisquer dos vírus são mais aptos do que o wt, e fornecem uma medida quantitativa do risco de produção acidental de vírus especialmente virulentos. Os 10 vírus com níveis wt de viés de códon e par de códons também fornecem informações sobre a variabilidade do panorama de aptidão em nível de codificação.
Diante da possibilidade se que pudesse surgir um vírus mais apto, e que um vírus mais apto pudesse ser mais perigoso, esses experimentos são conduzidos em um laboratório BSL3. Após a 10a passagem, os fenótipos e sequências são avaliados e 5 a suscetibilidade do surgimento de vírus para a neutralização de anticorpos específicos de PV é verificada. O experimento é interrompido e se reconsidera se qualquer evidência é obtida de evolução em direção a um vírus significativamente mais apto, ou de evolução sistemática em direção a novas sequências de proteína que fujam à neutralização dos anticorpos. Os fenótipos e sequências são avaliados 10 de forma semelhante após a passagem 20 antes de proceder à passagem 50. Como os vírus sintéticos são criados para codificar exatamente as mesmas proteínas que o vírus wt, o escopo para um aumento de virulência parece bastante limitado, mesmo se for observada uma evolução em direção a uma aptidão (levemente) aumentada.
Exemplo 15
Extensão da abordagem SAVE para outros sistemas de vírus que não o vírus de poliomielite Não obstante a necessidade em potencial para uma nova vacina contra a poliomielite para combater o potencial de reversão nos estágios finais do esforço global de erradicação, o PV foi selecionado nos presentes estudos primariamente 20 como sistema de modelo para desenvolver o SAVE. O SAVE, no entanto, foi desenvolvido com a expectativa de que sua abordagem possa ser estendida para outros vírus para os quais sejam necessárias vacinas. A extensão da estratégia do SAVE é aqui exemplificada pela aplicação ao Rinovírus, o agente causador do resfriado, e ao vírus influenza.
Adaptação do SAVE ao Rinovírus humano - um vírus estreitamente relacionado ao vírus de poliomielite.
Os dois modelos de rinovírus, HRV2 HRV2 e, foram selecionados para testar a abordagem SAVE por diversos motivos: (1) O HRV2 e o HRV representam dois membros dos dois diferentes subgrupos genéticos, A e B; (Ledford et al., 2004); (2) esses dois modelos de vírus usam receptores diferentes, o receptor LDL e o ICAM-I, respectivamente (Greve et al., 1989; Hofer et al., 1994); ambos os vírus, bem como seus clones cDNA infecciosos foram usados de forma extensa e a maioria dos materiais e métodos mais aplicáveis foram estabelecidos (Altmeyer et al., 1991; Gerber et al., 2001); e (4) muito do conhecimento molecular disponível dos rinovírus advém de estudos desses dois sorotipos.
As estratégias mais promissoras desenvolvidas através dos experimentos PV são aplicadas aos genomas de HRV2 e HRV14. Por exemplo, códons, pares de códons, estruturas secundárias ou combinações dos anteriores são desotimizadas. Dois a três genomas com graus variáveis de atenuação são sintetizados para cada genótipo. Toma-se cuidado de não alterar o CRE, uma crítica estrutura secundária de RNA de cerca de 60 nucleotídeos (Gerber et al., 2001; Goodfellow et al., 2000; McKnight, 2003). Este elemento é vital para a replicação dos picornavirus e, desta forma, a estrutura em si deve ser mantida ao se reelaborarem genomas. A localização do CRE dentro do genoma varia para diferentes picornavirus , mas é conhecida para a maioria das família (Gerber et al., 2001; Goodfellow et al., 2000; McKnight, 2003), e pode ser deduzida por modelagem de homologia para outras, na falta de evidência experimental. No caso do HRV2 o CRE se localiza na sequência de RNA correspondente à proteína não estrutural 2Apro e o CRE do HRV14 se localiza na região de proteína capsídea VPI (Gerber et al., 2001; McKnight, 2003).
O sistema de genética reversa para derivar rinovírus de equivalentes de genoma de DNA é essencialmente o mesmo descrito acima para o PV, exceto que as transfecções são feitas em células HeLa-HI a 34°C em meio de cultura de tampão Hepes contendo 3mM Mg++ para estabilizar o capsídeo virai. Os vírus sintéticos resultantes são ensaiados em cultura de tecido para determinar a proporção PFU/IU. Ver Exemplo 3. O tamanho de placa e a cinética em curvas de crescimento de um passo também são ensaiadas da forma descrita. Ver Exemplo 2. Como o processo SAVE pode ser aplicado de forma relativamente barata a todos os 100 ou mais ou menos 100 rinovírus relevantes, é factível produzir uma vacina segura e eficaz para o resfriado usando esta abordagem.
Adaptação do SAVE ao vírus influenza A - um vírus não relacionado ao vírus de poliomielite
Os critérios mais promissores de projeto do SAVE identificados a partir da experimentação com o PV são usados para sintetizar versões desotimizadas em códon do vírus influenza. O vírus influenza é um vírus "segmentado", consistindo de oito segmentos separados de RNA; cada um desses pode ser modificado por códon. O consagrado sistema de genética reversa de plasmídeo de sentido ambivalente é usado para gerar as variantes da estirpe A/PR/8/34 do vírus influenza. O sistema de oito plasmídeos é uma variação do que foi descrito anteriormente (Hoffmann et al., 2000) e foi gentilmente fornecido pelos Drs. P. Palese e A. Garcia-Sastre. Rapidamente, os oito segmentos de genoma de influenza, cada um contido em um plasmídeo separados, são ladeados por um promotor Pol I na extremidade 3' e um terminador Pol I na extremidade 5' da fita antissentido. Esse estojo, por sua vez, é ladeado por um promotor de citomegalovírus (um promotor Pol II) na extremidade 5' e um sinal de poliadenilação na extremidade 3' na fita da frente (Hoffmann et al, 2000). No momento da co-transfecção em células co-cultivadas 293 T e MDCK, cada estojo de expressão de sentido ambivalente produz dois tipos de moléculas de RNA. As unidades de transcrição Pol II na fita da frente produz todos os mRNAs de influenza necessários para síntese de proteínas virais. A unidade de transcrição Pol I na fita reversa produz segmentos de RNA de genoma (-) necessários para a montagem de complexos de ribonucleoproteína e encapsidação. Assim, são formadas partículas infecciosas de influenza A/PR/8/34 (Figura 10). Essa estirpe em particular do sorotipo é relativamente benigna para humanos. Ela foi adaptado para cultivo nas células de cultura de tecido e é particularmente útil para estudar a patogênese, já que é patogênica em ratos BALB/c.
Ao sintetizar segmentos que são alternativamente divididos (NS e M), cuida-se para não destruir locais de divisão e os quadros de leitura alternativos. Em todos os casos, o terminal 120 nt em qualquer das extremidades de cada segmento é excluído, já que se sabe que essas sequências contêm sinais para replicação de RNA e montagem de vírus. Pelo menos duas versões de cada fragmento são sintetizadas (desotimização moderada e máxima). São gerados vírus em que somente um segmento é modificado, o efeito é avaliado e mais segmentos modificados são introduzidos como necessário. Isso é fácil nesse sistema, já que cada segmento está em um plasmídeo separado.
A titragem da infectividade do vírus é verificada por ensaio de placa nas células MDCK na presença de 1 ug/ml de (TPCK)-tripsina. Alternativamente, dependendo do número de diferentes construções de vírus, o ELISA de 96 poços é usado para determinar a titragem de vários vírus como unidades infecciosas de células em células MDCK, essencialmente da forma acima descrita para o PV. Ver Exemplo 3. A única diferença é que agora um anticorpo específico de HA é usado para tingir as células infectadas. Além disso, a concentração relativa de virions é determinada via ensaio de hemaglutinação (HA) usando glóbulos vermelhos (RBC) de galinha (Charles River Laboratories), usando protocolos padrão (Kendal et al., 1982). Rapidamente, as suspensões de vírus são diluídas em 2 vezes de forma serial em I PBS em pratos 96 poços de fundo em V. O PBS sozinho é usado como controle de ensaio. Uma quantidade padronizada de RBCs é acrescentada a cada poço, e os pratos são brevemente agitados e incubados a temperatura ambiente por 30 minutos. As titragens de HA são lidas como a diluição recíproca do vírus no último poço com hemaglutinação completa. Enquanto a titragem de HA é um corolário direto da quantidade de partículas presentes, a titragem de PFU é uma medida funcional da infectividade. Determinando ambas as medidas, uma proporção relativa de PFU/unidade de HA é calculada de forma semelhante à proporção PFU/partícula descrita nos experimentos de PV. Ver Exemplo 3. Isso trata da questão sobre se os vírus influenza desotimizados em códon e par de códons também exibem uma relação PFU/partícula menor, como se observou para o PV.
Teste de Virulência
A dose letal 50 (LD5o) do vírus NPR/8/34 parental é determinada primeiro para ratos e os vírus influenza sintéticos são escolhidos para a infecção de ratos BALB/c por infecção intranasal. Os métodos para determinar os valores LD50 são bem conhecidos por pessoas de conhecimento normal do ofício (ver Reed e Muench, 1938, e Exemplo 4). Os vírus candidatos ideais mostram uma baixa infectividade (baixa titragem de PFU) com alta concentração de virions (alta titragem de HA). Ratos anestesiados recebem 25 μl de solução de vírus em PBS em cada narina contendo diluições seriais de dez vezes entre 102e 107 PFU de vírus. A mortalidade e a morbidez (perda de peso, atividade reduzida) são monitoradas duas vezes por dia até três semanas. O LD50 é calculado pelo método de Reed e Muench. Para o vírus wt A/PR/8/34 o LD5o esperado é de cerca de 10 PFU (Talon et al., 2000), mas pode variar dependendo das condições particulares de laboratório sob as quais a titragem do vírus é verificada.
Adaptação do SAVE à Dengue, HIV, Rotavirus e SARS
Vários vírus foram selecionados para teste adicional da abordagem SAVE. A Tabela 8 identifica as regiões de codificação de Dengue, HIV, Rotavirus (dois segmentos) e SARS, e fornece sequências de nucleotideos para vírus matriz e sequências de genoma virai exemplares com viés de par de códons desotimizado. Como descrito acima, o viés de par de códons é determinado para uma sequência de codificação, muito embora apenas uma parte (subsequência) possa conter as mutações desotimizadas.
Figure img0016
Figure img0017
* - O CPB pode ser reduzido desotimizando-se um segmento interno menor do que a sequência de codificação completa No entanto, o CPB é calculado para o CDS completo.
EXEMPLO 16
Avaliação de candidatos a vacina de vírus de poliomielite e vírus influenza em ratos É testada a capacidade dos vírus desotimizados de vacinar os ratos contra a poliomielite ou influenza.
Experimentos de imunização de vírus de poliomielite, titragens de anticorpos e experimentos de desafio wt
A hipótese de trabalho é a de que um bom candidato a vacina combina uma baixa titragem de infectividade com uma alta titragem de virions. Isso garante que uma alta quantidade de partículas de vírus (isto é, antígeno) possa ser injetada mantendo um baixo perfil de risco. Assim, grupos de cinco CD155tg serão injetados de forma intraperitoneal com 103, 104, 105, e 106 PFU de PV(Mahoney) (isto é, de tipo selvagem), estirpe de vacina Sabin PVI, pvAB247 -2954, PV-Min755"2470, ou outros vírus de poliomielite atenuados promissores desenvolvidos durante este estudo. Para o tipo selvagem, 1 PFU é cerca de 100 partículas virais, enquanto para os vírus atenuados, 1 PFU é mais ou menos de 5.000 a 100.000 partículas. Assim, injeção com número igual de PFUs significa de que de 50 a 1000 vezes mais partículas de vírus atenuado estão sendo injetadas. Para vírus wt injetado de forma intraperitoneal, o LD50 é de cerca de 106 PFU ou cerca de 108 partículas. Assim também, algumas mortes se esperam com as mais altas doses, mas não com as doses mais baixas.
Reforços da mesma dose são dados uma semana após e quatro semanas após a inoculação inicial. Uma semana após o segundo reforço, as titragens de anticorpos de neutralização de PV são determinadas por ensaio de redução de placa. Para este fim, 100 PFU de vírus PV(M) wt são incubadas com diluições seriais em duas vezes de soros de ratos imunizados. O número residual de PFU é determinado por ensaios de placas. A titragem de anticorpos de neutralização é expressa como o recíproco da diluição mais baixa de soro nas quais não foram observadas placas.
Quatro semanas após o último reforço, ratos imunizados e controles não imunizados são desafiados com uma dose letal de vírus wt PV(M) - 106 PFU de forma intraperitoneal; isso equivale a 100 vezes LD50 e a sobrevivência é monitorada.
Experimentos de imunização de vírus influenza, titragens de anticorpos e experimentos de desafio wt
Para experimentos de vacinação, grupos de 5 ratos BALB/c são injetados com vírus wt e influenza atenuados de forma intraperitoneal a uma dose de 0,001, 0,01, 0,1 e 1,0 LD50. As vacinações de reforço são dadas nos mesmos intervalos acima descritos para o PV. As titragens de anticorpos de influenza uma semana após o segundo reforço são determinadas por um ensaio de inibição de hemaglutinação (Hl) seguindo os protocolos padrão (Kendal et al., 1982). Rapidamente, os soros de ratos imunizados e de controle tratados com a enzima destruidora de receptor (RDA; Sigma, St Louis, MO) são diluídos serialmente em duas vezes e misturados com 5 unidades-HA do vírus A/PR/8/34 em 96 poços de fundo em V. Os RBCs são então acrescentados e os pratos são processados como acima para o ensaio HA padrão. As titragens de anticorpos são expressas como a diluição recíproca que resulta na completa inibição da hemaglutinação.
Três semanas após a última vacinação de reforço, os ratos são desafiados de forma intranasal com 100 ou 1000 LD50 de vírus parental A/PR/8/34 (aproximadamente 105 e 106 PFU) e a sobrevivência é monitorada.
Tratamento do animal
Os ratos transgênicos expressando o receptor de vírus de poliomielite humano CD155 (CD155tg) foram obtidos do Dr. Nomoto, Universidade de Tóquio. A colônia de ratos CD155tg é mantida pela instalação de animais da Universidade Estadual de Nova York (SUNY). Os ratos BALB/c foram obtidos de Taconic (Germantown, NY). Os ratos anestesiados foram inoculados usando agulhas hipodérmicas de bitola 25 com 30 μl de suspensão virai por via intravenosa, intraperitoneal ou intracerebral ou por via intranasal. São usados ratos de ambos os sexos com idades entre 6 e 24 semanas. Os ratos são o sistema de modelo mais econômico para pesquisa de vírus de poliomielite e vírus influenza. Além disso, no caso de PV, a linha de ratos de CD155tg é o único modelo animal exceto por primatas não humanos. Os ratos também fornecem o modelo animal mais seguro, já que não ocorre o espalhamento de vírus entre animais para vírus de poliomielite e vírus influenza.
Todos os ratos são mantidos em uma instalação de animais de ponta na SUNY sob os auspícios do Departamento de Pesquisa Animal em Laboratório (DLAR) e sua equipe veterinária. Todos os animais são verificados duas vezes por mês pela equipe veterinária. Os animais infectados com vírus são verificados duas vezes por dia pelos investigadores e diariamente pela equipe veterinária. Todos os experimentos de infecção são realizados em salas especialmente designadas com isolamento máximo na dependência de animais. Após a conclusão de um experimento, os ratos sobreviventes sofrem eutanásia e os cadáveres são esterilizados por autoclave. Nenhum rato sai da sala de vírus vivo.
No presente estudo, os ratos não são submetidos a qualquer procedimento cirúrgico além de inoculação intravenosa, intracerebral, intraperitoneal, intramuscular ou intranasal, injeção de anestésico e coletas de amostras de sangue. Para experimentos de vacinação, as amostras de sangue são tomadas antes e após a vacinação para detecção de anticorpos específicos de virus. Para esse firn, 50-100 μl são coletados dos ratos no dia anterior à injeção e uma semana após a segunda vacinação de reforço. Um máximo de duas amostras de sangue em animais individuais são coletadas com intervalo de pelo menos quatro semanas. Os animais são anestesiados e um bisturi afiado é usado para cortar 2mm de cauda. O sangue é coletado com um tubo capilar. A amostragem subsequente é obtida removendo-se a crosta da cauda. Se a cauda estiver cicatrizada, um novo corte de 2mm é repetido.
Todos os experimentos em animais são realizados seguindo os seguintes protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do SUNY (IACUC). A eutanásia é realizada por pessoal treinado em uma câmara de gás de CO2 de acordo com a recomendação da Associação Médica Veterinária Americana. Os experimentos de infecção são realizados de acordo com as mais recentes recomendações para ABSL 2/poliomielite emitidas pelos Centros para Controle e Prevenção de Doenças (CDC).
EXEMPLO 17 Algoritmo de viés de par de códons - viés de par de códons e matriz de escore
Na maioria dos organismos, existe um viés de códon distinto, que descreve as preferências de aminoácidos sendo codificados por códons em particular mais do que em outros. Acredita-se que o viés de códon esteja vinculado aos índices de tradução de proteína. Além disso, cada espécie tem preferências específicas sobre se um determinado par de códons aparece como vizinhos em sequências de genes, algo que é chamado de viés de par de códons.
[0425] Para quantificar a viés de par de códons, definimos uma distância de par de códons como a razão logarítmica do observado sobre o número esperado de ocorrências (frequência) de pares de códons nos genes de um organismo. Embora o cálculo da frequência observada de pares de códons em um grupo de genes seja direto, a frequência esperada de um par de códons é calculada como em Gutman e Hatfield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3699-3703, 1989, e é independente de aminoácido e viés de códon . Para isso, a frequência esperada é calculada com base na proporção relativa do número de vezes que um aminoácido é codificado por um códon específico. Em resumo:
Figure img0018
onde o par de códons AB codifica o par de aminoácidos SY e F denota a frequência (número de ocorrências).
Neste esquema podemos definir uma matriz de distância de par de códons de 64 x 64 com todos os custos e pares como definido acima. Qualquer m-resíduo de proteína pode ser classificado usando pares de códons sobre ou subrepresentados pela média dos escores de par de códons que compõem sua codificação.
Otimização de uma codificação de gene com base em viés de par de códons
Para examinar os efeitos do viés de par de códons na tradução de proteínas específicas, decidimos mudar os pares de códons mantendo a mesma distribuição de códon. Então definimos o seguinte problema: Considerando uma sequência de aminoácidos e um grupo de frequências de códon (distribuição de códon), mudar a codificação de DNA da sequência de tal forma que o escore de par de códons seja 15 otimizado (normalmente minimizado ou maximizado).
Nosso problema, como definido acima, pode ser associado com o Problema do Vendedor Viajante (TSP). O problema do vendedor viajante é o mais notório problema NP-completo. Essa é uma função de sua utilidade geral, e porque é fácil de explicar ao público em geral. Imagine um vendedor viajante que tem que visitar 20 um determinado grupo de cidades de carro. Qual é a menor rota que vai possibilitar a ele fazer as visitas e voltar para casa, assim minimizando seu trajeto total?
Heurística TSP
Quase qualquer aspecto de TSP vai ser NP-completo, então a forma certa de proceder é com heurística. Essas soluções em geral são bem sucedidas, tipicamente chegando a apenas uns poucos pontos percentuais da solução ótima, o que é perto o suficiente para a maioria das aplicações e em particular para nossa codificação otimizada.
Árvores geradoras mínimas - Uma heurística simples e popular, em especial quando os locais representam pontos no plano com base na árvore geradora mínima dos pontos. Fazendo uma primeira busca a fundo nesta árvore, caminhamos sobre cada borda da árvore exatamente duas vezes, uma vez indo para baixo quando descobrimos o novo vértice e uma vez indo para cima quando voltamos. Podemos então definir uma rota dos vértices de acordo com a ordem em que são descobertos e o uso do caminho mais curto entre cada par vizinho dos vértices nesta ordem para conectá-los. Este caminho deve ser uma borda simples se o gráfico está completo e obedece a desigualdade do triângulo, com pontos no plano. O trajeto resultante é sempre, no máximo, o dobro do caminho do mínimo trajeto TSP. Na prática, é normalmente melhor, tipicamente de 15% a 20% sobre o ótimo. Além disso, o tempo do algoritmo está vinculado ao da computação da árvore de geração mínima, somente O(n lg n) no caso de pontos no plano.
Métodos de inserção incremental - Uma classe diferente de heurística insere novos pontos em um trajeto parcial um de cada vez (iniciando em um único vértice) até que o trajeto está concluído. A versão desta heurística que parece funcionar melhor é a do mais distante ponto de inserção: de todos os pontos remanescentes, insira o ponto v no trajeto parcial T de forma que
Figure img0019
O mínimo garante que insiramos o vértice na posição que acrescenta a menor quantidade de distância ao trajeto, enquanto o máximo garante que pegaremos o pior vértice primeiro. Isso parece funcionar bem porque primeiro "esboça" um trajeto parcial antes de preencher os detalhes. Tipicamente, tais trajetos são apenas de 5% a 10% mais longos do que o ótimo.
Trajetos k-ótimos - Substancialmente mais poderosos são os Kernighan-Lin, ou classe k-opt de heurística. Começando de um trajeto arbitrário, o método aplica refinamentos locais no trajeto na esperança de melhorá-lo. Em particular, subgrupos das bordas k>2 são excluídos do trajeto e as subcorrentes remanescentes k reconectadas de modo diferente para ver se o trajeto resultante é uma melhoria.. Um trajeto é k-ótimo quando nenhum subgrupo de bordas k pode ser excluído e reconectado de forma a reduzir o custo do trajeto. Experimentos extensos sugerem que os roteiros 3ótimos ficam normalmente apenas a alguns pontos percentuais de distância dos roteiro ótimos. Para k>3, o tempo de computação aumenta consideravelmente mais depressa do que a qualidade da solução. Dar duas opções a um roteiro é um meio rápido e eficaz de melhorar qualquer outra heurística. O arrefecimento simulado fornece um mecanismo alternativo para utilizar edge flips para melhorar os roteiros heurísticos.
Algoritmo para revolver o problema da codificação ótima.
Nosso problema, como definido, é associado com o problema de encontrar um caminho (não um roteiro) para o vendedor viajante, numa métrica de 64 países. Nessa formulação, cada um dos 64 códons possíveis é análogo a um país, e a multiplicidade de códons é modelada como o número de cidades no país.. A medida de viés de par de códons é refletida na matriz de distância de pais.
O problema biológico real do projeto de genes codificando proteínas especificas usando um determinado grupo de multiplicidades de códon de forma a otimizar a sequência gene/DNA sob uma medida de viés de par de códons é um pouco diferente. O que falta em nosso modelo de TSP de país é a necessidade de codificar sequências de proteína específicas. O código triplo de DNA particiona os 64 códons em 21 classes de equivalência (codificando para cada um dos 20 possíveis aminoácidos e um símbolo de parada). Qualquer sequência de proteína/aminoácido pode ser especificada escolhendo-se um representante arbitrário da classe de equivalência de códon associada para codificá-la.
Em razão das restrições especiais e da natureza de nosso problema, bem como de sua adaptabilidade à aplicação de critérios adicionais na otimização, selecionamos a heurística de arrefecimento simulado para otimizar as sequências. A técnica é resumida abaixo.
Heurística de arrefecimento simulado O arrefecimento simulado é um procedimento de busca heurística que permite transições ocasionais que levam a soluções mais caras (e portanto inferiores). Isso pode não parecer uma boa opção, mas serve para ajudar a impedir a nossa busca de ficar presa a ótimos locais.
A inspiração para o arrefecimento simulado vem do processo físico de resfriar materiais derretidos de volta para o estado sólido. Em teoria termodinâmica, o estado de energia de um sistema é descrito pelo estado de energia de cada uma das partículas que o constituem. O estado de energia de cada partícula se move aleatoriamente, com tais transições regidas pela temperatura do sistema. Em particular, a probabilidade P(ei, ej( T) de transição da energia ei para ej à temperatura T é dada por:
Figure img0020
Onde kB é uma constante, chamada constante de Boltzmann. O que esta fórmula significa? Considere o valor do exponente sob diferentes condições. A probabilidade de movimento de um estado de energia alta para um estado de energia baixa é muito alta. No entanto, também existe uma probabilidade diferente de zero de aceitar uma transição para um estado de alta energia, com pequenos saltos de energia sendo muito mais provável do que grandes. Quando mais alta a temperatura, maior a probabilidade de que ocorram tais saltos de temperatura.
Que relevância isso tem para a otimização combinatória? Um sistema de energia, à medida que resfria, busca ir para um estado de energia máxima. Para qualquer grupo discreto de partículas, a minimização da energia total é um problema de otimização combinatória. Embora as transições aleatórias tenham sido geradas de acordo com a distribuição de probabilidade acima, podemos simular a física para resolver os problemas de otimização combinatória.
Como com a busca local, a representação do problema inclui uma representação do espaço de solução e uma função de custo C(s) apropriada e facilmente aplicável em computador, medindo a qualidade de uma solução dada. O novo componente é o roteiro de resfriamento, cujos parâmetros regem a possibilidade que teremos de aceitar uma transição ruim como função de tempo.
No começo da pesquisa, estamos ansiosos para usar o aleatório para explorar de forma ampla o espaço de pesquisa, de forma que a possibilidade de aceitar uma transição negativa deve ser alta. À medida que a busca avança, buscamos limitar as transições para melhorias e otimizações locais. O roteiro de resfriamento pode ser regulado pelos seguintes parâmetros: Temperatura inicial do sistema - Tipicamente t1 =1 Função de decremento de temperatura - Tipicamente tk= a.tk-1 onde 0.8 < a < 0.99.
Isto implica uma queda exponencial na temperatura, em oposição a uma queda linear.
Número de iterações entre mudanças de temperatura - Tipicamente, 100 a 1000 iterações podem ser permitidas antes de baixar a temperatura.
Critério de aceitação - Um critério típico é aceitar qualquer transição de si para Si+1 quando C(si +1) < C(si) para aceitar uma transição negativa sempre que
Figure img0021
onde r é um número aleatório 0 < r< 1. A constante c normaliza esta função de custo, de forma que quase todas as transições são aceitas na temperatura inicial.
Critério de parada - Tipicamente, quando o valor da solução atual não tiver mudado ou melhorado mais ou menos dentro da última iteração, a busca é encerrada e a solução atual é relatada.
Em mãos hábeis, a heurística específica do melhor problema para o TSP pode ter melhor desempenho do que o arrefecimento simulado, mas o arrefecimento 15 simulado funciona de forma fácil e admirável.

Claims (25)

1. Método de produção de um genoma viral atenuado, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obtenção da sequência de nucleotídeos de uma proteína-mãe que codifica a sequência de um vírus-mãe b. rearranjo de códons sinônimos da sequência de codificação de proteína do vírus parental para obter uma sequência de codificação de proteína modificada, em que o referido rearranjo fornece um viés de par de códons reduzido em relação a um hospedeiro mamífero sobre a sequência de codificação de proteína modificada, em comparação com a região de codificação do parente vírus, sem alterar o uso de códons do vírus original, em que a tendência do par de códons é calculada pela seguinte fórmula:
Figure img0022
e que, o viés de par de códons (CPB) de uma sequência de codificação de proteína é a média aritmética do escore de par de códons (CPS) dos pares de códons individuais (i) contidos na referida sequência de codificação de proteína de códons k de comprimento; e em que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma polarização do par de códons pelo menos 0,05 menor do que a polarização do par de códons da sequência de codificação da proteína parental c. substituir a sequência de codificação da proteína modificada com os códons reorganizados na sequência de nucleotídeos do vírus parental para criar um genoma viral atenuado ; e d. sintetizar o genoma viral atenuado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rearranjo dos códons sinônimos compreende a etapa de selecionar e trocar aleatoriamente pares de códons que codificam o mesmo aminoácido e determinar se a polarização do par de códons é reduzida pela troca.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa é repetida até que a polarização do par de códons seja reduzida em uma quantidade desejada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa é repetida até que a polarização do par de códons converge em ou perto de um valor ideal.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são implementadas em um computador.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é alcançada por síntese de novo da sequência de codificação de proteína modificada.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que todo o genoma é substituído pelo DNA sintetizado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que uma porção do genoma viral é substituída pelo DNA sintetizado.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um isolado natural.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um mutante de um isolado natural.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma polarização de par de códons pelo menos 0,1 menos do que a polarização de par de códons da sequência de codificação da proteína parental.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma polarização de par de códons pelo menos 0,2 menos do que a polarização de par de códons da sequência de codificação da proteína parental.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma polarização do par de códons pelo menos 0,3 menos do que a polarização do par de códons da sequência de codificação da proteína parental.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma polarização de par de códons pelo menos 0,4 menos do que a polarização de par de códons da sequência de codificação da proteína parental.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma tendência de par de códons de -0,05 ou menos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma tendência de par de códons de -0,1 ou menos.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma tendência de par de códons de -0,3 ou menos.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada tem uma tendência de par de códons de -0,4 ou menos.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada é modificada ao longo de um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada é modificada ao longo de um comprimento de pelo menos 500 nucleotídeos.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação da proteína modificada é modificada ao longo de um comprimento de pelo menos 1000 nucleotídeos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus original é um poliovírus, rinovírus, vírus da influenza, coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da bronquite infecciosa, ebolavírus, Vírus de Marburg, vírus da dengue, vírus da doença do Nilo Ocidental, vírus Epstein-Barr (EBV), vírus da febre amarela, Poxvírus, vírus do Herpes, Papilomavírus ou Adenovírus.
23. Método de produção de um vírus atenuado, caracterizado pelo fato de que compreende a produção de um genoma viral atenuado de acordo com o método da reivindicação 1; e inserir o genoma viral atenuado em uma célula hospedeira, em que um Vírus atenuado é produzido.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus parental é um vírus de DNA, RNA, de fita dupla ou de fita simples.
25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma viral atenuado é uma sequência de nucleotídeos de DNA ou RNA.
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