CN103476425B - 用于疫苗的减毒病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种减毒病毒，其包含改良的病毒基因组，所述改良的病毒基因组含有在基因组的多个位置加工的核苷酸置换，其中所述置换向基因组引入同义的去优化密码子。本发明的减毒病毒可用于疫苗组合物，以诱导受治疗者中的保护性免疫应答。本发明还提供合成本发明的减毒病毒的方法。此外，本发明还提供用于防止受治疗者患上病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受治疗者施用预防有效剂量的包含本发明的减毒病毒的疫苗组合物。

Description

用于疫苗的减毒病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年3月30日递交的美国申请第60/909,389号和2008年3月7日递交的美国申请第61/068,666号的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
联邦资助
本发明是以来自美国国立卫生研究院的批准号A115122、来自美国国家自然科学基金会的批准号EIA0325123和来自美国国家癌症研究所的批准号T32-CA009176在美国政府支持下进行的。因此，美国政府在本发明中享有某些权利。
版权声明
本专利文档的部分公开内容含有受到版权保护的材料。当专利文档或专利公开内容出现在专利和商标局的专利文件或记录中时，版权所有人对任何人对其进行传真复制无异议，否则则保留所有版权权利。
发明领域
本发明涉及包含含有多个核苷酸置换的改良的病毒基因组的减毒病毒的生成。所述核苷酸置换造成与其他的同义密码子的密码子交换和/或密码子重排和密码子对偏倚(codon pair bias)的变化。
发明背景
DNA合成技术的快速进步保证了病毒学中采用的传统方法的变革。传统用于消除病毒基因组的不同区域的功能的方法之一是利用大量但费力的位点定向诱变，以探索病毒株系基因组中小的序列变异的影响。然而，病毒基因组尤其是RNA病毒的病毒基因组相对较短，通常低于10,000碱基长度，使得它们易于使用目前可用的技术进行全基因组合成。最近开发的基于微流体芯片的技术可执行根据规格设计的(designed to specification)新基因组的从头合成，每个基因组仅用数百美元。这允许产生完全新颖的编码序列，或将现有序列调节至传统克隆方法不可能实现的程度。
此设计自由提供极大的力量来执行DNA/RNA编码序列的大规模重新设计以：(1)研究参数诸如密码子偏倚、密码子对偏倚和RNA二级结构的变化对病毒翻译和复制效率的影响；(2)执行有效的全基因组扫描，以获得未知的调节元件和成功的病毒繁殖必需的其他信号；和(3)开发用于病毒株系的遗传工程和抗病毒疫苗的设计的新的生物技术。
由于遗传密码的简并性，除两种氨基酸外，蛋白质编码序列中的所有氨基酸可被多于一个密码子编码。此类同义密码子的使用频率是不相等的，并与细胞翻译机器共同进化，以避免过多使用通常对应于稀有或另外不利的tRNA的次优的(suboptimal)密码子(Gustafsson等人，2004)。这造成了一种称为“同义密码子偏倚”的现象，该现象在进化关系远的物种之间存在很大差异，甚至在相同物种的不同组织之间可能存在差异(Plotkin等人，2004)。
通过重组方法的密码子优化(即，使基因的同义密码子使用与宿主细胞的密码子偏倚一致)已广泛用于改善跨物种表达(参见，如Gustafsson等人，2004)。虽然通过特意引入次优的同义密码子降低表达的相反目标尚未被广泛研究，但是独立的报道表明用稀有(rare)密码子取代天然密码子可在不同生物体中降低基因表达水平。参见，如Robinson等人，1984；Hoekema等人，1987；Cafiini和Stephan，2003；Zhou等人，1999。因此，向病毒基因组中引入去优化的同义密码子可不利地影响蛋白质翻译，并从而提供用于产生减毒病毒的方法，所述减毒病毒将对制备针对病毒疾病的疫苗有 用。
病毒性疾病和疫苗
病毒始终是人类中死亡和疾病的主要原因之一。与细菌性疾病不同，病毒性疾病不易受抗生素影响并因而难以治疗。因此，疫苗接种已成为人类对病毒的主要和最有力的防御。现今，一些最古老和最严重的病毒性疾病诸如天花和脊髓灰质炎(脊髓灰质炎(po1io))已被世界范围内的免疫接种计划根除(或接近如此)。然而，许多其他古老病毒诸如鼻病毒和流感病毒控制不良，并仍造成实质的问题，虽然这些问题随年份和国家而不同。此外，新的病毒诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)和重症急性呼吸综合征(SARS)病毒，定期出现在人类群体中并通常造成致死大流行。还可能存在有意引入作为战争或恐怖主义手段的致死的人造病毒或人类改变的病毒。
疫苗的有效生产仍是一项不可预知的事业。有三大类疫苗：亚单位疫苗、灭活(死)疫苗和减毒活疫苗。对于亚单位疫苗，来自病毒的一种或几种蛋白质(如，使用重组DNA技术制备的衣壳蛋白)用作疫苗。大肠杆菌(Escherichia coli)或酵母中生产的亚单位疫苗是非常安全的，并且不会引起病毒性疾病威胁。然而，它们的功效可能是低的，因为不是所有的免疫原性病毒蛋白都存在，并且存在的那些可能不是以其天然构象存在。
灭活(死)疫苗通过培养或多或少的野生型(wt)病毒和然后将其灭活，例如用甲醛(如在Salk脊髓灰质炎疫苗中)来制备。需要进行大量的实验来找到杀死所有病毒但又不损害微粒的免疫原性的灭活处理。此外，剩余的安全问题在于培养病毒的设施可能允许强毒病毒逃逸，或灭活可能失败。
减毒活疫苗包含已经受突变使其毒性降低并可用于免疫接种的病毒。活的减毒病毒作为疫苗具有许多优点：它们通常生产简便、快速和廉价；它们通常易于施用(例如，Sabin脊髓灰质炎疫苗以方糖口服施用)；并且有时所述减毒病毒的残余生长允许“群体”免疫接种(免疫接种与初始患者密切接触的人们)。这些优点在紧急情况下当很快需要疫苗时特别重要。减毒疫苗的主要缺点是它具有一些显著的回复突变为wt毒力的频率。为此，美国已不再使用Sabin疫苗。
因此，仍有对产生实际上没有回复突变的可能性的减毒活病毒的系统性方法的需要，并因此提供快速、有效和安全的疫苗生产方法。本发明通过提供产生减毒活病毒的系统性方法合成减毒病毒工程(Synthetic Attenuated Virus Engineering，SAVE)满足了这一需要，所述减毒活病毒基本上没有回复突变的可能性，因为它们含有数百或数千个小缺陷。这一方法广泛适用于大范围内的病毒，并提供生产大范围的抗病毒疫苗的有效方法。
发明概述． 
本发明提供了一种减毒病毒，其包含改良的病毒基因组，所述病毒基因组含有在基因组的多个位置加工的核苷酸置换，其中所述置换向所述基因组引入多个同义密码子。同义密码子的这一置换改变基因组中的各种参数，包括密码子偏倚、密码子对偏倚、去优化密码子和去优化密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点、组织特异性微RNA识别序列的存在或不存在、或其任何组合。由于包括了大量的缺陷，本发明的减毒病毒提供产生针对多种多样的病毒性疾病的稳定地减毒的活疫苗的手段。
在一个实施方案中，提供包含与母体病毒的对应序列相同的编码病毒蛋白或其部分的核酸序列的减毒病毒，其中所述减毒病毒的核苷酸序列含有它所衍生自的母体序列的密码子，并且其中所述核苷酸序列与母体病毒的核苷酸序列具有低于90％的同一性。在另一实施方案中，所述核苷酸序列与母体病毒的序列具有低于80％的同一性。提供减毒的置换核苷酸序列是至少100核苷酸长度、或至少250核苷酸长度、或至少500核苷酸长度、或至少1000核苷酸长度。减毒序列的密码子对偏倚低于母体病毒的密码子对偏倚，且降低至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.2。
被减毒的病毒可以是动物病毒或植物病毒。在某些实施方案中，所述病毒是人类病毒。在另一实施方案中，所述病毒感染多个物种。特定的实施方案包括但不限于，脊髓灰质炎病毒、流感病毒、登革病毒、HIV、轮状病毒和SARS。
本发明还提供用于诱导受治疗者中的保护性免疫应答的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的减毒病毒和药学可接受的载运体(carrier)。本发明还提供改良的宿主细胞系，其特别地加工为允许在野生型宿主细胞中不能生存的减毒病毒。
此外，本发明提供合成本发明的减毒病毒的方法，所述方法包括(a)鉴别病毒基因组的至少一个非调节部分内的多个位置中的密码子，所述密码子可被同义密码子取代；(b)为每个鉴别的密码子选择待置换的同义密码子；和(c)将每个鉴别的密码子置换为同义密码子。
再者，本发明提供合成本发明的减毒病毒的方法，所述方法包括改变编码相同氨基酸的现有密码子在编码区内的顺序，以调节密码子对偏倚。
更进一步地，本发明提供合成本发明的减毒病毒的方法，所述方法合并了前两种方法。
根据本发明，减毒病毒微粒通过将病毒基因组转染入宿主细胞制备，借以产生减毒病毒微粒。本发明还提供包含适于免疫接种的减毒病毒的药物组合物。
本发明还提供用于引起受治疗者中的保护性免疫应答的方法、用于防止受治疗者患上病毒相关疾病的方法和用于在感染病毒的受治疗者中延迟病毒相关疾病的发作或减缓所述疾病的进展速率的方法，所述方法包括向受治疗者施用预防或治疗有效剂量的本发明的疫苗组合物。
本发明还提供包含改良的病毒基因组的减毒病毒，所述改良的病毒基因组合有在基因组的多个位置加工的核苷酸置换，其中所述置换向基因组引入多个同义密码子，其中所述核苷酸置换是通过包含如下步骤的过程选择的：最初通过在各自的氨基酸允许位置随机指定同义密码子生成编码序列，计算所述随机选择的编码序列的密码子对得分，并交换(a)编码相同氨基酸的密码子对或(b)根据模拟的退火优化函数置换同义密码子，并重复前一步骤直至对特定或充足次数的迭代不能观察到进一步的改进(对得分或偏倚没有变化)，直至所述解决方案收敛于优化或接近优化的值。
附图简述
图1.合成的P1衣壳设计中的密码子使用统计。与wt相比，PV-SD保持几乎相同的密码子频率，而同时使序列内的密码子位置变化最大化。在PV-AB衣壳中，非优选密码子的使用被最大化。条的长度和每个条后面的数字指示每种密码子在序列中的发生。作为参考，每种氨基酸的正常的人类同义密码子频率(“频率"表示为百分比)在第三列中给出。
图2.PVfM)、PV-AB和PV-SD衣壳编码区的序列比对。PV(M)(SEQ ID NO：1)、PV-AB(SEQ ID NO：2)和PV-SD(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列使用MuItAlin在线软件工具(Corpet，1988)比对。序列上方的数字指在衣壳序列内的位置。核苷酸1对应于PV(M)病毒基因组中的核苷酸743。在共有序列中，同一核苷酸在所有三种序列中的发生通过大写字母指示，同一核苷酸在三种序列中的两种的发生通过小写字母指示；而三种不同核苷酸在三种序列中的发生通过句点指示。
图3.密码子去优化的病毒表型。fA)本研究中使用的病毒构建体的概述。(B)在HeLa细胞单层中的一步生长动力学。(C至H)密码子去优化的病毒孵育48h(C至F)或72h(G和H)后的噬斑表型；用抗-3Dpoi抗体染色以显现被感染的细胞。(C)PV(M)，(D)PV-SD，(E)PV-AB，(F)PV-AB755-1513，(G和H)PV-AB2470-2954。清除的噬斑区的轮廓是一圈受感染的细胞(C和D)。(H)对版块G中显示的孔进行随后的结晶紫染色后，PV-AB2470-2954没有明显的噬斑。(I和J)感染48小时后，免疫染色的PV(M)产生的噬斑(I)或PV-AB2470-2954产生的感染病灶(J)的边缘的显微照片。
图4.密码子去优化导致比感染性降低。(A)从PV(M)(泳道1)、PV-AB755-1513(泳道2)和PV-AB2470-2954(泳道3)的纯化的病毒微粒分离的病毒粒子基因组RNA的琼脂糖凝胶电泳。(B)纯化的PV(M)(泳道1)、Pv-AB755-1513(泳道2)和PV-AB2470-2954(泳道3)病毒微粒的银染色的SDS-PAGE蛋白质凝胶。显示了四个衣壳蛋白中较大的三个(VP1、VP2和VP3)，证明了病毒制品的纯度和相对量。(C)使用脊髓灰质炎病毒受体碱性磷酸酶(CD155-AP)融合蛋白探针的病毒捕获ELISA的开发。使用病毒特异性抗体包被ELISA板，并施加含有未知病毒浓度的样品，然后用 CD155-AP检测。病毒浓度使用标准曲线计算，标准曲线用已知量的纯化的wt病毒(E)平行制备。(D)纯化的病毒和提取的病毒粒子RNA的量使用分光光度方法定量，并计算微粒或基因组等同物(1基因组＝1病毒粒子)的数量。此外，病毒粒子浓度通过ELISA确定。每种病毒的感染滴度通过噬斑/感染病灶测定来确定，并且比感染性计算为PFU/微粒或FFU/微粒。
图5.密码子去优化的和野生型病毒的体外翻译。在基因组翻译水平确定PV-AB表型。(A)在HeLa S10提取物中、在外源添加氨基酸和tRNA存在下的标准体外翻译揭示密码子去优化的基因组的翻译能力与PV(M)wt相比没有差异。显示的是在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离的[35S]甲硫氨酸标记的翻译产物的放射自显影图。异常条带(*)的身分是未知的。(B)未添加外源氨基酸和tRNA并存在竞争性细胞mRNA下未透析的HeLa S10提取物中的体外翻译揭示密码子去优化的PV基因组的翻译能力的缺陷。显示的是在10％SDS-PAGE凝胶上分离的脊髓灰质炎病毒2C反应性翻译产物(2CATPase、2BC和P2)的蛋白质印迹。2BC翻译产物的相对量在每个泳道下面以wt条带的百分比表示。
图6.使用双顺反子报告基因复制子的体内翻译的分析确认密码子去优化对PV翻译的有害效应。(A)双顺反子复制子的示意图。各种P1衣壳编码序列插入萤火虫荧光素酶基因(F-Luc)的上游。确定F-Luc表达相对于内部对照(R-Luc)的变化水平允许定量转运经过P1衣壳区的核糖体。(B)复制子RNA转染入HeLa细胞并在2mM盐酸胍存在下孵育7h以阻断RNA复制。经过P1区的相对翻译速率与密码子去优化的程度成反比。虽然两种可生存的病毒构建体PV-AB2470-2954和PV-AB2954-3386的衣壳编码序列允许介于60％和80％之间的wt翻译，低于20％的翻译效率与PV-AB、PV-AB2470-3386和PV-AB1513-2470基因组中观察到的致死表型有关。值代表3次独立实验的6个测定的平均。
图7.确定人类和病毒ORF的密码子对偏移。点代表针对一个ORF的长度绘图的该ORF的每密码子对的平均密码子对得分。计算了14,795个注释的人类基因的密码子对偏倚(CPB)。低表现的密码子对产生负分。标示了各种脊髓灰质炎病毒P1构建体的CPB，通过带箭头的符号表示。该 图说明大量人类基因在0.1附近聚集。显示了PV(M)-wt(标记为“WT”)(-0.02)、定制的合成脊髓灰质炎病毒衣壳PV-Max(+0.25)、PV-Min(-0.48)和PV(M)-wt：PV-Min嵌合体衣壳PV-Min755-2470(＝“PV-MinXY”)(-0.31)和PV-Min2470-3386(＝“PV-MinZ”)(-0.20)的CPB。病毒PV-SD和PV-AB是改变密码子偏倚而不是改变密码子对偏倚的结果。
图8.密码子对去优化的脊髓灰质炎病毒的特性。一步生长动力学揭示PV-Min755-2470和PV-Min2470-3385的PFU产生与PV(M)-wt相比降低2.5个数量级级别。然而，所有病毒产生相似数量的病毒微粒(未显示于此图)。结果，PFU/微粒比值被降低，这与密码子去优化的病毒PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954类似(参见图3B)(PFU是“噬斑形成单位”)。
图9.嵌合病毒基因组的装配。为了“扫描"经过靶基因组(红色)，通过重叠PCR扩增或合成小的区段并将其引入wt基因组(黑色)。
图10.用于产生甲型流感病毒的八质粒poi I-polII系统。将含有插入到人类pol I启动子和pol II启动子之间的八种病毒cDNA的八种表达质粒转染入真核细胞。因为每种质粒含有两种不同的启动子，细胞的pol I和polII二者都将转录质粒模板(推测在不同的核区隔)，这将造成病毒mRNA和vRNA的合成。合成病毒聚合酶复合体蛋白质(PB1、PB2、PA、核蛋白质)之后，病毒复制周期即启动。最终，细胞转录和翻译机器直接(polII转录)或间接(polI转录和病毒复制)衍生的所有病毒分子的装配，造成所有合成分子(vRNP和结构蛋白质HA、NA、M1、M2、NS2/NEP)的相互作用以产生感染性甲型流感病毒。(从Neumann等人，2000中复制。)(注意：存在从头合成流感病毒的其他途径)。
图11.脊髓灰质炎病毒基因组和合成病毒构建体。脊髓灰质炎病毒基因组和嵌合病毒构建体的开放读码框。上，全长PV(M)-wt基因组RNA的示意图。下，PV(M)-wt、CPB定制的合成病毒PV-Max、PV-Min和PV(M)-wt：PV-Min嵌合体病毒的开放读码框。黑色对应于PV(M)-wt序列，灰色对应于PV-Min合成序列，而阴影(Thatched)对应于PV-Max。突出显示的病毒构建体PV-Min755-2470(PV-MinXY)和PV-Min2470-3385(PV-MinZ)由于突出的减毒表型而被进一步表征。
图12.一步生长曲线显示相似动力学，产生具有降低的感染性的相似 量的微粒。(A)使用2MOI感染HeLa R19细胞的单层，给定时间点(0、2、4、7、10、24、48hr)的PFU通过噬斑测定来测量。对应的符号：(口)PV(M)-wt，(·)PV-Max，(◇)PV-Min755-1513，(x)PV-Min1513-2470，(◆)PV-MinXY，(△)PV-MinZ。(B)显示计算的每个时间点的PFU/m1向微粒/ml的转换。这是通过将PFU/ml乘以相应的病毒比感染性实现的。对应的符号和(A)中一样。
图13.通过改变CPB在体内调节翻译。fA)使用双顺反子RNA构建体定量CPB对翻译的体内效应。第一顺反子利用丙型肝炎病毒(HCV)内部核糖体进入位点(IRES)诱导Renilla荧光素酶(R-Luc)的翻译。此第一顺反子是用于归一化输入RNA的量的内部对照。PV(M)-wt IRES控制的第二顺反子诱导萤火虫荧光素酶(F-Luc)的翻译。构建体中标记“P1”的区域被各个相应病毒P1的cDNA取代。(B)将各个相应的RNA构建体在2mM盐酸胍存在下转染入HeLa R19细胞，并在6小时后测量R-Luc和F-Luc。相对于PV(M)-wt翻译(100％)将F-Luc/R-Luc值归一化。
图14.合成病毒的热灭活谱不发生变化。为了排除大规模密码子对偏倚改良改变病毒粒子的总体形态学(如技术人员可预期的，如果衣壳蛋白被错误折叠的话)，测试了PVMinXY和PV-MinZ的热稳定性。等量的微粒在50℃下孵育，并经由噬斑测定定量在给定时间段后剩余的感染性。如果合成病毒的衣壳被去稳定，我们将预期与wt PV(M)相比在50℃下增加的生存力损失。情形不是这样。两种合成病毒的热灭活动力学与wt相同。相比之下，Sabin-1病毒在编码衣壳的基因组区中携带大量突变，这相称地赋予此病毒与wt PV1(M)相比较低的热稳定性。
图15.疫苗接种后的中和抗体滴度。一组八只CD155tg小鼠(其中的七只完成了方案)各自通过以每周间隔的三次腹膜内注射接种PV-MinZ(·)和PV-MinXY(◆)的108个微粒，最后一次疫苗接种后10天测量血清转换(serum conversion)。横跨每个数据集的水平线标识每种病毒构建体的平均中和抗体滴度。抗脊髓灰质炎病毒抗体滴度经由微中和测定测量。(*)在最低测试的1：8下未检测到模拟疫苗接种的动物的病毒中和。
图16.携带密码子对去优化的NP区段的流感病毒。(A)A/PR8-NpMin病毒是可生存的，并且与A/PR8wt相比在MDCK细胞上产生更小的噬斑。(B)A/PR8-NPMin病毒显示延迟的生长动力学和低于野生型A/PR83-5倍的最终滴度。
图17.携带密码子对去优化的PB1或HA和NP区段的流感病毒。(A)A/PR8-PB1Min-RR和AdPR8-HAMin/NpMin病毒是可生存的，并且与A/PR8野生型相比在MDCK细胞上产生更小的噬斑。(B)A/PR8-PB1Min-RR和A/PR8-HAMin/NpMin病毒显示延迟的生长动力学和低于野生型A/PR8约10倍的最终滴度。
图18.BALB/c小鼠模型中A/PR8-Np Min 的减毒。(A)A/PR8-NPMin病毒与野生型A/PR8病毒相比具有降低的致病性，如通过疫苗接种后的体重下降所确定的。(B)用A/PR8-NpMin病毒疫苗接种的所有小鼠(八只中的八只)均存活，而在疫苗接种后13天，用A/PR8感染的小鼠仅有25％(八只中的两只)存活。(C)用A/PR8，NpMin病毒疫苗接种的小鼠被保护不受100×LD50的A/PR8野生型病毒的攻击。
发明详述
本发明涉及可用作防止病毒感染和疾病的疫苗的减毒病毒的生产。因此，本发明提供一种减毒病毒，其包含改良的病毒基因组，所述改良的病毒基因组含有在基因组的多个位置加工的核苷酸置换，其中所述置换向基因组引入多个同义密码子和/或引入同一氨基酸的现有密码子的顺序的变化(密码子对利用的变化)。在两种情形中，病毒基因产物的原始野生型氨基酸序列得到保留。
大多数氨基酸由多于一种密码子编码。参见表1中的遗传密码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三种氨基酸(Leu、Ser和Arg)都是由六种不同密码子编码的，而只有Trp和Met具有唯一密码子。“同义"密码子是编码同一氨基酸的密码子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG是编码Leu的同义密码子。同义密码子不是以均等的 频率使用的。一般而言，特定生物体中最频繁使用的密码子是相关的tRNA丰富的那些，并且这些密码子的使用增加蛋白质翻译的速率和/或准确度。相反，罕用密码子的tRNA被发现处于相对较低的水平，并且认为稀有密码子的使用降低翻译速率和/或准确度。因此，用同义但是以更低频率使用的密码子取代核酸中的给定密码子是将“去优化的”密码子置换入核酸。
a编码特定的氨基酸的每个密码子中的第一个核苷酸显示于最左侧列；第二个核苷酸显示于顶行；而第三个核苷酸显示于最右侧列。
此外，给定的生物体对于给定的密码子A的最近密码子邻居(codon neighbor)具有偏好，称为密码子对利用的偏倚。不改变现有密码子的密码子对偏倚的变化可影响蛋白质合成的速率和蛋白质的产生。
在本发明的各种实施方案中，所述病毒是DNA、RNA、双链或单链病毒。在进一步的实施方案中，所述病毒感染动物或植物。在优选的实施方案中，所述动物是人类。许多动物病毒公知是引起疾病的(参见下文)。某些医学上重要的病毒，诸如引起狂犬病、重症急性呼吸综合征(SARS) 和禽流感的那些，还可从其正常的非人类宿主传播至人类。
病毒还构成植物病原体的一主要群，并且正在进行研究以开发用于产生转基因植物的病毒载体。此类载体的优点包括易于转化植物、能够转化成熟植物(避免了对从单个转化细胞再生转基因植物的需要)和每个细胞中多拷贝的病毒造成的外源基因的高水平表达。然而，这些载体的主要缺点之一是尚不可能将基本的病毒复制功能与病毒的致病决定因素分开。本文公开的SAVE策略可提供加工用于植物转化的非致病病毒载体的手段。
人类中主要的病毒病原体
病毒病原体是人类和其他动物中许多疾病的病原体。人类中病毒性疾病的公知实例包括普通感冒(由人类鼻病毒HRV引起)、流感(流感病毒)、水痘(水痘-带状疱疹病毒)、麻疹(一种副黏病毒)、腮腺炎(一种副黏病毒)、脊髓灰质炎(脊髓灰质炎病毒，PV)、狂犬病(狂犬病病毒)、唇疱疹(cold sore)(单纯疱疹病毒[HSV]1型)和生殖器疱疹(HSV2型)。在引入儿童疫苗接种计划之前，这些疾病中的许多是世界范围内的常见儿童期疾病，并且在一些发展中国家中仍是健康的巨大威胁。病毒性疾病还包括更严重的疾病，诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、由SARS冠状病毒引起的重症急性呼吸综合征(SARS)、禽流感(甲型流感病毒的HSN1亚型)、Ebola(依渡拉病毒)、马尔堡出血热(马尔堡病毒)、登革热(黄病毒属(Flavivirus)血清型)、西尼罗脑炎(West Nile encephalitis)(一种黄病毒)、感染性单核细胞增多症(埃巴病毒，EBV)、肝炎(丙型肝炎病毒，HCV；乙型肝炎病毒，HBV)和黄热病(黄病毒)。某些类型的癌症也可由病毒引起。例如，虽然人类乳头瘤病毒(HPV)引起的大多数感染是良性的，但是已发现HPV与子宫颈癌相关，而卡波西肉瘤(KS)，一种AIDS患者中流行的肿瘤，由卡波西肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV)引起。
由于病毒居留于细胞内并且使用宿主细胞的机器进行繁殖，不杀死宿主细胞难以消除它们。对抗病毒性疾病的最有效方法是对有感染风险的受治疗者进行疫苗接种以提供对感染的抗性。对于一些疾病(如，水痘、麻疹、腮腺炎、黄热病)，有效的疫苗是可得的。然而，存在紧迫的需要来开发用于许多其他病毒性疾病的疫苗。本文描述的用来制备疫苗的SAVE(合成减 毒病毒工程)方法原则上适用于反向遗传系统(参见下文)可得的所有病毒。本文通过集中于应用SAVE开发用于脊髓灰质炎、普通感冒和流感的减毒病毒疫苗，例示了这一方法。
任何病毒都可通过本文公开的方法减毒。所述病毒可以是dsDNA病毒(如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、单链“正”义DNA病毒(如，细小病毒)、双链RNA病毒(如，呼肠孤病毒)、单链正义RNA病毒(如小RNA病毒、披膜病毒)、单链“反”义RNA病毒(如正黏病毒、棒状病毒)、具有DNA中间体的单链正义RNA病毒(如反转录病毒)或双链反转录病毒(如嗜肝DNA病毒)。在本发明的某些非限制性实施方案中，所述病毒是脊髓灰质炎病毒(PV)、鼻病毒、流感病毒包括禽流感(如甲型流感病毒的H5N1亚型)、重症急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、传染性支气管炎病毒、依波拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒(黄病毒属血清型)、西尼罗病病毒、埃巴病毒(EBV)、黄热病病毒、依波拉病毒(Ebola)(依波拉病毒)、水痘(水痘-带状疱疹病毒)、麻疹(一种副黏病毒)、腮腺炎(一种副黏病毒)、狂犬病(狂犬病病毒)、人类乳头瘤病毒、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV1型)或生殖器疱疹(HSV2型)。
术语“母体”病毒或“母体”蛋白质编码序列在本文用于指从其衍生新序列的病毒基因组和蛋白质编码序列，所述新序列可被或多或少地减毒。母体病毒和序列通常是“野生型”或“自然发生的"原型，或期望用于获得更加高度减毒的病毒的变体的分离物。然而，母体病毒还包括在真实或感知的期望性质的基础上在实验室中具体生成或选择的突变体。因此，为减毒候选物的母体病毒包括野生型或自然发生的病毒的突变体，所述突变体具有缺失、插入、氨基酸置换和类似突变；并且还包括具有密码子置换的突变体。在一个实施方案中，此母体序列与天然分离物有约30氨基酸或更少的差异。在另一实施方案中，所述母体序列与天然分离物有约20氨基酸或更少的差异。在又一实施方案中，所述母体序列与天然分离物有约10氨基酸或更少的差异。
减毒的PV可衍生自脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney；“PV(M)”)、脊 髓灰质炎病毒2型(Larising)、脊髓灰质炎病毒3型(Leon)、单价口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)病毒或三价OPV病毒。在某些实施方案中，所述脊髓灰质炎病毒是具有SEQ ID NO：2所述的基因组序列的PV-AB，或是PV-AB755-1513、PV-AB755-2470、PV-AB1513-3386、PV-AB2470-3386、PV-AB1513-2470、PV-AB2470-2954或PV-AB2954-3386。此命名反映PV(M)基因组，其中基因组的部分被PV-AB核苷酸置换。上标提供被置换的PV-AB核苷酸数。
在各种实施方案中，所述减毒鼻病毒是衍生自以下的人类鼻病毒fHRV)：HRV2、HRV14、人类鼻病毒10；人类鼻病毒100；人类鼻病毒11；人类鼻病毒12；人类鼻病毒13；人类鼻病毒15；人类鼻病毒16；人类鼻病毒18；人类鼻病毒19；人类鼻病毒1A；人类鼻病毒1B；人类鼻病毒2；人类鼻病毒20；人类鼻病毒21；人类鼻病毒22；人类鼻病毒23；人类鼻病毒24；人类鼻病毒25；人类鼻病毒28；人类鼻病毒29；人类鼻病毒30；人类鼻病毒31；人类鼻病毒32；人类鼻病毒33；人类鼻病毒34；人类鼻病毒36；人类鼻病毒38；人类鼻病毒39；人类鼻病毒40；人类鼻病毒41；人类鼻病毒43；人类鼻病毒44；人类鼻病毒45；人类鼻病毒46；人类鼻病毒47；人类鼻病毒49；人类鼻病毒50；人类鼻病毒51；人类鼻病毒53；人类鼻病毒54；人类鼻病毒55；人类鼻病毒56；人类鼻病毒57；人类鼻病毒58；人类鼻病毒59；人类鼻病毒60；人类鼻病毒61；人类鼻病毒62；人类鼻病毒63；人类鼻病毒64；人类鼻病毒65；人类鼻病毒66；人类鼻病毒67；人类鼻病毒68；人类鼻病毒7；人类鼻病毒71；人类鼻病毒73；人类鼻病毒74；人类鼻病毒75；人类鼻病毒76；人类鼻病毒77；人类鼻病毒78；人类鼻病毒8；人类鼻病毒80；人类鼻病毒81；人类鼻病毒82；人类鼻病毒85；人类鼻病毒88；人类鼻病毒89；人类鼻病毒9；人类鼻病毒90；人类鼻病毒94；人类鼻病毒95；人类鼻病毒96人类鼻病毒98；人类鼻病毒14；人类鼻病毒17；人类鼻病毒26；人类鼻病毒27；人类鼻病毒3；人类鼻病毒8001Finland Nov1995；人类鼻病毒35；人类鼻病毒37；+人类鼻病毒6253Finland Sep1994；人类鼻病毒9166Finland Sep1995；人类鼻病毒4；人类鼻病毒42；人类鼻病毒48；人类鼻病毒9864Finland Sep1996；人类鼻病毒5；人类鼻病毒52；人类鼻病毒6；人类鼻病毒7425Finland Dec1995；人类鼻病毒69；人类鼻病毒5928Finland May1995；人类鼻病毒70；人类鼻病毒72；人类鼻病毒79；人类鼻病毒83；人类鼻病毒84；人类鼻病毒8317Finland Aug1996；人类鼻病毒86；人类鼻病毒91；人类鼻病毒7851Finland Sep1996；人类鼻病毒92；人类鼻病毒93；人类鼻病毒97；人类鼻病毒99；Antwe甲鼻病毒98/99；人类鼻病毒263Berlin2004；人类鼻病毒3083/rhino/Hyogo/2005；人类鼻病毒NY-003；人类鼻病毒NY-028；人类鼻病毒NY-041；人类鼻病毒NY-042；人类鼻病毒NY-060；人类鼻病毒NY-063；人类鼻病毒NY-074；人类鼻病毒NY-1085；人类鼻病毒株系Hanks；未分型的人类鼻病毒OK88-8162；人类肠病毒sp-ex Amblyomma americanum；人类鼻病毒sp.或人类鼻病毒UC。
在其他实施方案中，所述减毒流感病毒衍生自甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。在进一步的实施方案中，所述甲型流感病毒属于但不限于亚型H10N7、H10N1、H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、H11N2、H11N3、H11N4、H11N6、H11N8、H11N9、H12N1、H12N2、H12N4、H12N5、H12N6、H12N8、H12N9、H13N2、H13N3、H13N6、H13N9、H14N5、H14N6、H15N2、H15N8、H15N9、H16N3、H1N1、H1N2、H1N3、H1N5、H1N6、H1N8、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H3N9、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N7、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N7、H7N8、H7N9、H8N2、H8N4、H8N5、H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9和未鉴别的亚型。
在进一步的实施方案中，所述乙型流感病毒属于但不限于亚型乙型流感病毒(B/Aichi/186/2005)、乙型流感病毒(B/Aichi/5/88)、乙型流感病毒(B/Akita/27/2001)、乙型流感病毒(B/Akita/5/2001)、乙型流感病毒fB/Alabama/1/2006)、乙型流感病毒(B/Alabama/2/2005)、乙型流感病毒(B/Alaska/03/1992)、乙型流感病毒(B/Alaska/12/1996)、乙型流感病毒 (B/Alaska/16/2000)、乙型流感病毒(B/Alaska/16/2003)、乙型流感病毒(B/A1aska/1777/2005)、乙型流感病毒(B/Alaska/2/2004)、乙型流感病毒(B/AIaska/6/2005)、乙型流感病毒(B/Ann Arbor/1/1986)、乙型流感病毒(B/Ann Arbor/1994)、乙型流感病毒(B/Argentina/132/2001)、乙型流感病毒(B/Argentina/3640/1999)、乙型流感病毒(B/Argentina/69/2001)、乙型流感病毒(B/Arizona/1/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/12/2003)、乙型流感病毒(B/Arizona/13/2003)、乙型流感病毒(B/Arizona/135/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/14/2001)、乙型流感病毒(B/Arizona/14/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/140/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/146/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/148/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/15/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/16/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/162/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/163/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/164/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/2/2000)、乙型流感病毒(B/Arizona/2/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/2e/2006)、乙型流感病毒(B/Arizona/3/2006)、乙型流感病毒(B/Arizona/4/2002)、乙型流感病毒(B/Arizona/4/2006)、乙型流感病毒fB/Arizona/48/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/5/2000)、乙型流感病毒fB/Arizona/59/2005)、乙型流感病毒(B/Arizona/7/2000)、乙型流感病毒(B/Auckland/01/2000)、乙型流感病毒(B/Bangkok141/1994)、乙型流感病毒(B/Bangkok/143/1994)、乙型流感病毒(B/Bangkok/153/1990)、乙型流感病毒(B/BangkoU163/1990)、乙型流感病毒(B/Bangkok/163/90)、乙型流感病毒(B/Bangk01(/34/99)、乙型流感病毒(B/Bangkok/460/03)、乙型流感病毒(B/Bangkok/54/99)、乙型流感病毒(B/Barcelona/215/03)、乙型流感病毒(B/Beijing/15/84)、乙型流感病毒(B/Beijing/184/93)、乙型流感病毒(B/Beijing/243/97)、乙型流感病毒(B/Beijing/43/75)、乙型流感病毒(B/Beijing/5/76)、乙型流感病毒(B/Beijing/76/98)、乙型流感病毒(B/Belgiurn/WV106/2002)、乙型流感病毒(B/Belgium/WV107/2002)、乙型流感病毒(B/Belgium/WV109/2002)、乙型流感病毒(B/Belgiurn/WV114/2002)、乙型流感病毒(B/Belgium/WV 122/2002)、乙型流感病毒(B/Bonn/43)、乙型流感病毒(B/Brazil/017/00)、乙型流感病毒(B/Brazil/053/00)、乙型流感病毒(B/BraziI/055/00)、乙型流感病毒 fB/Brazil/064/00)、乙型流感病毒(B/Brazil/074/00)、乙型流感病毒fB/BraziI/079/00)、乙型流感病毒(B/Brazil/110/01)、乙型流感病毒(B/Brazil/952/2001)、乙型流感病毒(B/Brazil/975/2000)、乙型流感病毒fB/Brisbane/32/2002)、乙型流感病毒(B/Buchares/311/1998)、乙型流感病毒(B/Bucharest/795/03)、乙型流感病毒(B/Buenos Aires/16I/00)、乙型流感病毒(B/Buenos Aires/9/95)、乙型流感病毒(B/Buenos Aires/SW 16/97)、乙型流感病毒(B/Buenos Aires/VL518/99)、乙型流感病毒(B/California/01/1995)、乙型流感病毒(B/California/02/1994)、乙型流感病毒(B/California/02/1995)、乙型流感病毒(B/California/1/2000)、乙型流感病毒(B/California/10/2000)、乙型流感病毒(B/California/11/2001)、乙型流感病毒(B/California/14/2005)、乙型流感病毒(B/California/2/2002)、乙型流感病毒(B/Califomia/2/2003)、乙型流感病毒(B/Califomia/3/2000)、乙型流感病毒(B/California/3/2004)、乙型流感病毒(B/California/6/2000)、乙型流感病毒(B/California/7/2005)、乙型流感病毒(B/Canada/16188/2000)、乙型流感病毒(B/Canada/464/2001)、乙型流感病毒(B/Canada/464/2002)、乙型流感病毒(B/Chaco/366/00)、乙型流感病毒(B/Chaco/R113/00)、乙型流感病毒(B/Chantaburi/218/2003)、乙型流感病毒(B/Cheju/303/03)、乙型流感病毒(B/Chiba/447/98)、乙型流感病毒(B/Chile/3162/2002)、乙型流感病毒(B/Chongqing/3/2000)、乙型流感病毒(B/临床分离株(isolates)SA lThailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA10 Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA100Philippilies/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA101Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA102Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA103Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA104Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA105Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA106Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA 107Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA108PhiIippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA109Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA11Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA110 Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA112Phmppines/2002)、乙型流感病毒(B/临床 分离株SA113Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA114Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA115Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA116Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA12Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA13Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA14Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA15Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA16Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA17Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA18Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA19Thajland/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA2Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/淋床分离株SA20Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA21 Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA22Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA23Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA24Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/淋床分离株SA25Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA26Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA27Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA28Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA29Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA3Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA30Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA31 Thailand/2002)、
乙型流感病毒(B/临床分离株SA32Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA33Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA34Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA37Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA38Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA39Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA40Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA41Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA42Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA43Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA44Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA45Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA46Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA47Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA5 Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA50 Philippities/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA51Philippinos/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA52Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA53Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA57Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA58Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA59Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA6Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA60Philippities/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA61Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA62Philippilies/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA63Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA64Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA65Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA66Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA67Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA68Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA69Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA7Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA70Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA71Philippities/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA73Philippilies/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA74Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA76Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA77Philippilies/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA78Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA79Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA8Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA80Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA8l Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA82Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA83Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA84Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA85Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA86Thailand/，2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA87Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA88Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA89Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA9Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA90 Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA91 Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA92Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA93Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA94Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA95Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA96Thailand/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA97Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA98Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/临床分离株SA99Philippines/2002)、乙型流感病毒(B/CNIC/27/2001)、乙型流感病毒(B/C0lorado/04/2004)、乙型流感病毒(B/C010rad0/11e/2004)、乙型流感病毒(B/Colorado/12e/2005)、乙型流感病毒(B/C010rado/13/2004)、乙型流感病毒(B/Colorado/13e/2004)、乙型流感病毒(B/Co1orado/15/2004)、乙型流感病毒(B/Co1orado/16e/2004)、乙型流感病毒(B/Colorado/17e/2004)、乙型流感病毒(B/Colorado/2/2004)、乙型流感病毒(B/Co1orado/2597/2004)、乙型流感病毒(B/Co1orado/4e/2004)、乙型流感病毒(B/Colorado/5/2004)、乙型流感病毒(B/Connecticut/02/1995)、乙型流感病毒(B/ConnecticuU07/1993)、乙型流感病毒(B/Cordoba/2979/1991)、乙型流感病毒(B/Cordoba/VA418/99)、乙型流感病毒(B/Czechoslovakia/16/89)、乙型流感病毒(B/Czechoslovakia/69/1990)、乙型流感病毒(B/CZechoslovakia/69/90)、乙型流感病毒(B，Daeku/10/97)、乙型流感病毒(B/Daeku/45/97)、乙型流感病毒(B/Daeku/47/97)、乙型流感病毒(B/Daeku/9/97)、乙型流感病毒(B/Delaware/1/2006)、乙型流感病毒(B/Du/4/78)、乙型流感病毒(B/Durban/39/98)、乙型流感病毒(B/Durban/43/98)、乙型流感病毒(B/Durban/44/98)、乙型流感病毒(B/Durban/52/98)、乙型流感病毒(B/Durban/55/98)、乙型流感病毒(B/Durban/56/98)、乙型流感病毒(B/Egypt/2040/2004)、乙型流感病毒(B/England/1716/2005)、乙型流感病毒(B/England/2054/2005)、乙型流感病毒(B/England/23/04)、乙型流感病毒(B/EspiritoSanto/55/01)、乙型流感病毒(B/EspiritoSanto/79/99)、乙型流感病毒(B/Finland/154/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/159/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/160/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/161/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/162/03)、乙型流感 病毒(B/Finland/162/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/162/91)、乙型流感病毒(B/Finland/164/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/172/91)、乙型流感病毒(B/Finland/173/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/176/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/184/91)、乙型流感病毒(B/Finland/188/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/190/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/191/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/192/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/193/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/199/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/202/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/203/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/204/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/205/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/206/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/220/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/223/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/225/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/227/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/23l/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/235/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/239/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/244/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/245/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/254/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/254/93)、乙型流感病毒(B/Finland/255/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/260/93)、乙型流感病毒(B/Finland/268/93)、乙型流感病毒(B/Finland/270/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/275/2003)、乙型流感病毒(B/Finland/767/2000)、乙型流感病毒(B/Finland/84/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/886/2001)、乙型流感病毒(B/Finland/WV4/2002)、乙型流感病毒(B/Finland/WV5/2002)、乙型流感病毒(B/Florida/02/1998)、乙型流感病毒(B/Florida/02/2006)、乙型流感病毒(B/Florida/1/2000)、乙型流感病毒(B/F1orida/1/2004)、乙型流感病毒(B/F1orida/2/2004)、乙型流感病毒(B/Florida/2/2005)、乙型流感病毒(B/F1orida/2/2006)、乙型流感病毒(B/Florida/7e/2004)、乙型流感病毒(B/Fujian/36/82)、乙型流感病毒(B/Geneva/5079/03)、乙型流感病毒(B/Genoa/1I/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/2/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/2I/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/33/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/4I/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/52/02)，乙型流感病毒(B/Genoa/55/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/56/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/7/02)、乙型流感病毒(B/Genoa/8/02)、乙型流感病毒(B/Gerloa12/02)、乙型流感病毒 (B/Genoa3/02)、乙型流感病毒(B/Genoa48/02)、乙型流感病毒(B/Genoa49/02)、乙型流感病毒(B/Genoa5/02)、乙型流感病毒(B/Genoa53/0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004)、乙型流感病毒(B/Washington/2/2000)、乙型流感病毒(B/washington/2/2004)、乙型流感病毒(B/washington/3/2000)、乙型流感病毒(B/washington/3/2003)、乙型流感病毒(B/washington/5/2005)、乙型流感病毒(B/wellington/01/1994)、乙型流感病毒(B/wisconsin/l/2004)、乙型流感病毒(B/WiScollSin/1/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/10/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/15e/2005)、乙型流感病毒(B/wisconsin/17/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/2/2004)、乙型流感病毒(B/Wisconsin/2/2006)、乙型流感病毒(B/Wisconsin/22/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/26/2006)、乙型流感病毒(B/Wisconsin/29/2006)、乙 型流感病毒(B/wiSconsin/3/2000)、乙型流感病毒(B/wisconSin/3/2004)、乙型流感病毒(B/wisconsin/3/2005)、乙型流感病毒(B/Wiscoasin/3/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/3l/2006)、乙型流感病毒(B/wisconsin/4/2006)、乙型流感病毒(B/wiSconsin/5/2006)、乙型流感病毒(B/Wisconsin/6/2006)、乙型流感病毒(B/Wisconsin/7/2002)、乙型流感病毒(B/Wuhan/2/2001)、乙型流感病毒(B/Wuhan/356/2000)、乙型流感病毒(B/WV194/2002)、乙型流感病毒(B/wyoming/15/2001)、乙型流感病毒(B/Wyoming/16/2001)、乙型流感病毒(B/wyoming/2/2003)、乙型流感病毒(B/xuanwu/l/82)、乙型流感病毒(B/xuanwu/23/82)、乙型流感病毒(B/Yamagata/l/73)、乙型流感病毒(B/Yamagata/115/2003)、乙型流感病毒(B/Yamagata/1246/2003)、乙型流感病毒(B/Yamagata/13ll/2003)、乙型流感病毒(B/Yamagata/16/1988)、乙型流感病毒(B/Yamagata/16/88)、乙型流感病毒(B/Yamagata/222/2002)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K198/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K246/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K270/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K298/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K320/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K354/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K386/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K411/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K46l/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K490/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K500/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K501/2001)、乙型流感病毒(B/YalTlagata/k508/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K513/200I)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K515/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K519/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K520/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K521/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K535/2001)、乙型流感病毒(B/Yamagata/K542/2001)、乙型流感病毒(B/Yamahashi/166/1998)、乙型流感病毒(B/Yamahashi/166/98)、乙型流感病毒(B/Yunnan/123/2001)、乙型流感病毒(株系B/Alaska/12/96)、乙型流感病毒(株系B/ANN ARBOR/1/66[COLD-ADAPTED])、乙型流感病毒(株系B/ANN ARBOR/1/66[WILD-TYPE])、乙型流感病毒(株系B/BA/78)、乙型流感病毒(株系B/BEIJING/1/87)、乙型流感病毒(株系B/ENGLAND/222/82)、乙型流感病 毒(株系B/finland/145/90)、乙型流感病毒(株系B/finland/146/90)、乙型流感病毒(株系B/finland/147/90)、乙型流感病毒(株系B/finland/148/90)、乙型流感病毒(株系B/finland/149/90)、乙型流感病毒(株系B/mlland/150/90)、乙型流感病毒(株系B/fjnland/151/90)、乙型流感病毒(株系B/finland/24/85)、乙型流感病毒(株系B/flnland/56/88)、乙型流感病毒(株系B/FUKUOKA/80/81)、乙型流感病毒(株系B/G/ 86)、乙型流感病毒(株系B/GL/54)、乙型流感病毒(株系B/HONG KONG/8/73)、乙型流感病毒(株系B/HT/84)、乙型流感病毒(株系B/ID/86)、乙型流感病毒(株系B/LENINGRAD/179/86)、乙型流感病毒(株系B/MARYLAND/59)、乙型流感病毒(株系B/MEMPHlS/6/86)、乙型流感病毒(株系B/NAGASALI/l/87)、乙型流感病毒(株系B/Osaka/491/97)、乙型流感病毒(株系B/PA/79)、乙型流感病毒(株系B/RU/69)、乙型流感病毒(株系B/SINGAPORE/64)、乙型流感病毒(株系B/Tokyo/942/96)、乙型流感病毒(株系B/VICTORIA/3/85)、乙型流感病毒(株系B/VICTORIS/87)、乙型流感病毒(B/Rochester/02/2001)和其他亚型。在进一步的实施方案中，所述丙型流感病毒属于但不限于亚型丙型流感病毒(C/Aichi/l/81)、丙型流感病毒(C/Aichi/l/99)、丙型流感病毒(C/Ann Arbor/l/50)、丙型流感病毒(C/Aomori/74)、丙型流感病毒(C/Califomia/78)、丙型流感病毒(C/England/83)、丙型流感病毒(C/Fukuoka/2/2004)、丙型流感病毒(C/Fukuoka/3/2004)、丙型流感病毒(C/Fukushima/1/2004)、丙型流感病毒(C/Greece/79)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/246/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/247/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/248/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/249/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/250/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/25l/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/252/2000)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/252/99)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/290/99)、丙型流感病毒(C/Hiroshima/4/2004)、丙型流感病毒(C/Hyogo/1/83)、丙型流感病毒(C/Johannesburg/1/66)、丙型流感病毒(C/Johannesburg/66)、丙型流感病毒(C/KanagaWa/l/76)、丙型流感病毒(C/Kanagawa/2/2004)、丙型流感病毒(C/Kansas/1/79)、丙型流感病毒(C/Kyoto/l/79)、丙型流感病毒(C/Kyot0/41/82)、丙型流感病毒(C/Mississippi/80)、丙型流感病毒 (C/Miyagi/1/90)、丙型流感病毒(C/Miyagi/1/93)、丙型流感病毒(C/lIiyagi/l/94)、丙型流感病毒(C/Miyagi/l/97)、丙型流感病毒(C/Miyagi/l/99)、丙型流感病毒(C/Miyagi/12/2004)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/2000)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/92)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/94)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/96)、丙型流感病毒(C/Miyagi/2/98)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/2000)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/91)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/92)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/94)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/97)、丙型流感病毒(C/Miyagi/3/99)、丙型流感病毒(C/Miyagi/4/2000)、丙型流感病毒(C/Miyagi/4/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/4/96)、丙型流感病毒(C/Miyagi/4/97)、丙型流感病毒(C/Miyagi/4/98)、丙型流感病毒(C/Miyagi/42/2004)、丙型流感病毒(C/Miyagi/5/2000)、丙型流感病毒(C/Miyagi/5/91)、丙型流感病毒(C/Mjyagi/5/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/6/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/6/96)、丙型流感病毒(C/Miyagi/7/91)、丙型流感病毒(C/Miyagi/7/93)、丙型流感病毒(C/Miyagi/7/96)、丙型流感病毒(C/Miyagi/77)、丙型流感病毒(C/Miyagi/8/96)、丙型流感病毒(C/Miyagi/9/91)、丙型流感病毒(C/Miyagi/9/96)、丙型流感病毒(C/Nara/l/85)、丙型流感病毒(C/Nara/2/85)、丙型流感病毒(C/，Nara/82)、丙型流感病毒(C/NewJersey/76)、丙型流感病毒(C/Niigata/1/2004)、丙型流感病毒(C/Osaka/2/2004)、丙型流感病毒(C/猪/Beijing/115/81)、丙型流感病毒(C/Saitama/l/2000)、丙型流感病毒(C/S aitama/l/2004)、丙型流感病毒(C/Saitama/2/2000)、丙型流感病毒(C/Saitama/3/2000)、丙型流感病毒(C/Sapporo/71)、丙型流感病毒(C/Shizuoka/79)、丙型流感病毒(C/Yamagata/l/86)、丙型流感病毒(C/Yamagata/l/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/10/89)、丙型流感病毒(C/Yamagata/13/98)、丙型流感病毒(C/Yamagata/15/2004)、丙型流感病毒(C/Yamagata/2/2000)、丙型流感病毒(C/Yamagata/2/98)、丙型流感病毒(C/Yamagata/2/99)、丙型流感病毒(C/Yamagata/20/2004)、丙型流感病毒(C/Yamagata/20/96)、丙型流感病毒 (C/Yamagata/21/2004)、丙型流感病毒(C/Yamagata/26/81)、丙型流感病毒(C/Yamagata/27/2004)、丙型流感病毒(C/Yamagata/3/2000)、丙型流感病毒(C/Yamagata/3/2004)、丙型流感病毒(C/Yamagata/3/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/3/96)、丙型流感病毒(C/Yamagata/4/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/4/89)、丙型流感病毒(C/Yamagata/5/92)、丙型流感病毒(C/Yamagata/6/2000)、丙型流感病毒(C/Yamagata/6/98)、丙型流感病毒(C/Yamagata/64)、丙型流感病毒(C/Yamagata/7/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/8/2000)、丙型流感病毒(C/Yarnagata/8/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/8/96)、丙型流感病毒(C/Yamagata/9/2000)、丙型流感病毒(C/Yamagata/9/88)、丙型流感病毒(C/Yamagata/9/96)、丙型流感病毒(株系C/BERLIN/1/85)、丙型流感病毒(株系C/ENGLAND/892/83)、丙型流感病毒(株系C/GREAT LAKES/1167/54)、丙型流感病毒(株系C/JJ/50)、丙型流感病毒(株系C/猪/BEIJING/10/81)、丙型流感病毒(株系C/猪/BEIJING/439/82)、丙型流感病毒(株系C/TAYLOR/1233/47)、丙型流感病毒(株系C/YAMAGATA/10/81)、传染性鲑贫血病毒(Isavirus或Infectious salmoa anemia virus)、托高土病毒(Thogotovirus)或多里病毒(Dhori Virus)、巴特肯病毒(Batken virus)、多里病毒(株系INDIAN/1313/61)或托高土病毒、托高土病毒(分离株SiAr126)或未分类的托高土病毒、Araguari病毒(Araguari virus)、未分类的正黏病毒科(Orthomyxoviridae)或禽瘟(Fowlplague)病毒或猪流感病毒或未鉴别的流感病毒和其他亚型。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于6病毒科(delta ViI-US family)和所有相关属。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于腺病毒科(Adenoviridae ViIrUSfmmily)和所有相关属、株系、类型和分离株，例如但不限于甲、乙、丙型人类腺病毒。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae virusfamily)和所有相关属、株系、类型和分离株，例如但不限于单纯疱疹病毒。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae viluslamilv)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridaevirus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于痘病毒科(Poxviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于反转录病毒科(Retroviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。例如但不限于人类免疫缺陷病毒。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于丝状病毒科(Filovirida virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于套式病毒目病毒科(Nidovirales virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在各种实施方案中，所述减毒病毒属于杯状病毒科(Caliciviridae virus family)和所有相关属、株系、类型和分离株。
在某些实施方案中，所述同义密码子置换改变基因组中的密码子偏倚、密码子对偏倚、去优化的密码子和去优化的密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点、微RNA识别序列的存在或不存在或其任何组合。密码子置换可被加工为分布遍及基因组的多个位置或限制于基因组的一部分的多个位置。在进一步的实施方案中，所述基因组的部分是衣壳编码区。
在本发明的优选实施方案中，所述病毒保留诱导动物宿主中保护性免疫应答的能力。在其他优选实施方案中，所述病毒的毒力不回复突变至野生型。
脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和流感病毒
脊髓灰质炎病毒是小RNA病毒科成员，是一种具有7.5kb长度单链正义RNA基因组的小的无包膜病毒(Kitamura等人，1981)。进入细胞后，基因组RNA充当编码单一多蛋白的mRNA，所述多蛋白在一系列自催化切割事件后产生全套的功能性脊髓灰质炎病毒蛋白。同一基因组RNA充当合成反义RNA的模板，所述反义RNA是合成充当mRNA、复制模板或预定包壳入后代病毒粒子的基因组RNA的新的(+)链的中间物(Mueller等人，2005)。如本文所述，充分确立的PV系统用于解决优化减毒的合成病毒生产的设计策略的一般问题。PV为开发抗病毒策略提供了最重要和理解最充分的分子模型之一。特别是，存在反向遗传系统，可借以通过完全合成的方法体外合成病毒核酸然后转换成感染性病毒粒子(参见下文)。此外，存在方便的小鼠模型(CD155tg小鼠，其表达脊髓灰质炎的人类受体)来检验合成的PV设计的减毒，如先前所述(Cello等人，2002)。
鼻病毒也是小RNA病毒科的成员，并且与PV相关。人类鼻病毒(HRV)是普通感冒的常见病原体，因此它们比任何其他传染源造成更多的疾病事件(Hendley，1999)。除了普通感冒之外，HRV还参与耳和鼻窦感染、哮喘发作和其他疾病。与PV相似，HRV包含单链正义RNA病毒，其基因组编码自加工的多蛋白。所述RNA通过使用内部核糖体进入位点(Intemal Ribosome Entry Site，IRES)的内部起始机制进行翻译，以产生形成衣壳的结构蛋白，以及非结构蛋白，诸如两种病毒蛋白酶2A和3C，和RNA-依赖型聚合酶(Jang等人，1989；Pelletier等人，1988)。也和PV一样，HRV具有无包膜的二十面体衣壳，由60拷贝的四种衣壳蛋白VPl-4形成(Savolainen等人，2003)。HRV的复制周期也与脊髓灰质炎病毒相同。与PV的密切相似性，联合对人类健康的显著的、几乎到处存在的影响，使得HRV成为产生用于免疫接种的新型减毒病毒的极具吸引力的候选物。
虽然药物公司已进行了数十年的研究，但是尚未开发出针对HRV的 成功药物。这部分是由于联邦监管机构和公众对于治疗通常不严重的感染的药物的相对较低的风险承受。就是说，即使少量副作用也是不可接受的。因此，在不存在药物的情况下，有清晰的要求需要安全有效的抗鼻病毒疫苗。然而，开发抗鼻病毒疫苗是极具挑战性的，因为有超过100种HRV血清型，其中大约30种广泛流行并经常感染人类。有效的疫苗必须使免疫系统能够识别每种单一血清型以赋予真正的免疫性。本文描述的SAVE方法提供开发有效的鼻病毒疫苗的实用解决方案。基于SAVE设计过程的可预测性，设计和合成将联合构成疫苗的100或更多种SAVE减毒的鼻病毒是廉价的。
流感病毒一在1990和1999年之间，流感病毒造成美国每年大约35,000例死亡(Thompson等人，2003)。加上大约200,000例住院治疗，每年对美国经济的影响估计超过230亿美元(Cram等人，2001)。全球来讲，每年有300,000到500,000人由于流感病毒感染而死亡(Kamps等人，2006)。虽然该病毒在所有年龄组引起疾病，但是严重并发症率在儿童和65岁以上人员中最高。流感有可能突变或重组成极致命形式，如1918年流感大流行中所发生的，其中约3000万人死亡。这可能是人类历史中唯一的单个年份死亡最多的大流行。
流感病毒划分为三种类型，甲、乙和丙型。抗原性由包膜的病毒粒子表面的两种糖蛋白决定：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。两种糖蛋白连续改变其抗原性以逃避体液免疫性。改变所述糖蛋白允许病毒株系继续感染疫苗接种的个体，这是每年对高风险组进行疫苗接种的原因。此外，人类流感病毒可将HA或NA糖蛋白替换为鸟类和猪的那些，这是一种导致新的病毒(HlNl到H2N2或H3N2等)的基因区段的重分配，称为遗传漂移(Steinhauer和Skehel，2002)。全球的群体对于这些新型病毒是免疫幼稚的，它们是杀死数百万人的大流行的原因(Kilboume，2006；Russell和Webster，2005)。流感病毒的历史，以及当前高致病性禽流感病毒H5N1的威胁(Stephenson和Democratis，2006)加强了对防止流感病毒疾病的需要。
目前使用两种流感疫苗：活的减毒疫苗(冷适应株；“FluMist”)和灭活病毒。所述减毒疫苗的应用限制于健康的儿童、青少年和成人(孕妇除 外)，年龄在5-49岁。此年龄限制正好将流感的高危人群排除在外。此外，减毒的FluMist病毒有可能回复突变，回复突变对于活病毒是常见的。生产第二种、更常施用的灭活的流感病毒疫苗是复杂的。此外，此疫苗显示在防止老年人(＞65岁)群体死亡中低于期望的效力(Simonson等人，2005)。这些事实加强了对生产流感病毒疫苗的新型策略的需要。
小RNA病毒的反向遗传学
反向遗传学一般指以与经典遗传学的所谓的正向遗传学方法相反的方向进行的发现基因功能的实验方法。即，正向遗传学方法试图通过阐明表型性状的遗传学基础来确定基因的功能，而基于反向遗传学的策略则从分离的基因开始，并试图通过研究表达wt或突变的基因产生的可能表型来发现其功能。如本文在病毒系统中所用，“反向遗传学”系统指允许对由RNA构成的病毒基因组进行遗传操作的技术的可用性。简单而言，病毒基因组从病毒粒子或被感染的细胞分离，通过反转录酶转换成DNA(“cDNA”)，可能根据需要进行改良并回复突变，通常是经由RNA中间物，回到感染性病毒微粒。此过程在小RNA病毒中极其简单；事实上，开发的用于任何动物RNA病毒的第一个反向遗传学系统是用于PV的fRacaniello和Baltimore，1981)。病毒反向遗传学系统是基于裸露的病毒基因组RNA在转染入合适的哺乳动物细胞时具有感染性这一历史发现(Alexander等人，1958)。20世纪70年代反转录酶的发现和分子克隆技术的开发使得科学家能够产生和操作RNA病毒基因组的cDNA拷贝。最常见地，将基因组的完整cDNA拷贝克隆到允许体外合成基因组RNA的噬菌体T7RNA聚合酶启动子的直接下游，然后将其转染入细胞以产生病毒(van der Wert等人，1986)。替代地，同一DNA质粒可转染入在细胞质中表达T7RNA聚合酶的细胞。此系统可用于各种病毒病原体，包括PV和HRV二者。
流感病毒的分子病毒学和反向遗传学
流感病毒与小RNA病毒PV和HRV一样是RNA病毒，但是却不相关，并且与PV很不相同。与小RNA病毒相反，流感是负链病毒。此外，流感由890至234l核苷酸不等的八个单独的基因区段组成(Lamb和Krug， 2001)。部分由于负链的结构，部分由于所述八个单独的基因区段，其反向遗传学系统比PV的更加复杂。尽管如此，已开发了用于流感病毒的反向遗传学系统(Enami等人，1990；Fodor等人，1999；Garcia-Sastre和Palese，1993；Hoffman等人，2000；Luytjes等人，1989；Neumann等人，1999)。所述八个基因区段的每一个以单独的质粒表达。此反向遗传学系统极其方便用于本文描述的SAVE策略，因为最长的单个基因区段低于3kb，并因此易于合成和操作。此外，可通过简单地混合不同的质粒来组合和重组不同的基因区段。因此，将SAVE方法应用于流感病毒可能比用于PV甚至更加切实可行。
病毒反向遗传学的最近一次转变发生于本发明人通过从合成的DNA寡核苷酸装配首次化学合成感染性病毒基因组(Cello等人，2002)。这一成就清晰地表明，反向遗传学系统可得的大多数或所有病毒可单独地从其基因组序列信息合成，并保证了重新合成和改良这些病毒以符合期望标准的空前的灵活性。
病毒基因组的从头合成
使用基于计算机的算法来设计和从头合成病毒基因组。这些合成的基因组，以本文描述的减毒PV的合成为例，编码与野生型(wt)病毒完全相同的蛋白质，但是通过使用替代的同义密码子，各种参数，包括密码子偏倚、密码子对偏倚、RNA二级结构和/或二核苷酸含量被改变。呈现的数据显示这些独立于编码的变化产生高度减毒的病毒，通常是由于蛋白质翻译不良。通过靶向所有病毒的基本功能，即蛋白质翻译，开发了一种非常通用的方法来可预测地、安全地、快速地和廉价地产生减毒病毒，这对于制备疫苗是有用的。这一方法，称为“SAVE”(合成减毒病毒工程)，适用于PV之外有新的疫苗的医学需要的各种病毒。这些病毒包括但不限于鼻病毒、流感病毒、SARS和其他冠状病毒、HIV、HCV、传染性支气管炎病毒、依波拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒、西尼罗病病毒、EBV、黄热病病毒、脊髓灰质炎病毒之外的肠病毒，诸如艾柯病毒、柯萨奇病毒和肠病毒(entrovirus)71；甲型肝炎病毒，口蹄病毒诸如口蹄病病毒，黏病毒诸如流感病毒，副黏病毒诸如麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄 病毒诸如登革病毒、黄热病病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传病毒、甲病毒诸如西方脑炎病毒和东方脑炎病毒、乙型肝炎病毒和牛腹泻病毒和依波拉病毒。
本文显示PV衣壳编码区中的密码子和密码子对去优化二者均显著降低PV适合度(fitness)。本发明不限于经由同义密码子置换的病毒减毒的潜在的任何特殊分子机制。不过，实验仍在继续，以更好地理解密码子和密码子对去优化在产生减毒病毒中的潜在分子机制。特别是，本申请提供了表明密码子去优化和密码子对去优化可造成效率低下的翻译的证据。还开发了用于快速产生和筛选大量病毒构建体的高通量方法。
大规模DNA装配
近年来，寡核苷酸合成的成本骤降和质量增加使得从合成的寡核苷酸装配大区段DNA(至少多达约10 kb)成为现实。商业供应商诸如Blue HeronBiotechnology，Inc.(Bothwell，WA)(还有许多其他供应商)目前以大约1.50美元/碱基的相对较低的价格合成、装配、克隆、序列验证和交付了具有已知序列的大区段合成的DNA。因此，从商业的供应商购买合成的病毒基因组是方便和经济的选择，并且价格继续快速下降。此外，以极低成本合成和装配非常大的DNA分子的新方法不断出现(Tian等人，2004)。Church实验室以一种使用数千个寡核苷酸的平行合成(例如，在可光编程的(photo-programmable)微流体芯片上或在可从Nimblegen Systems，Inc.，Madison，WI或Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA获得的微阵列上)，然后降低错误和通过重叠PCR的装配的方法成为先驱。这些方法具有将合成大DNA的成本降至低于1美分/碱基的潜能。大规模DNA合成的效率和精度的改进以及成本的快速下降为SAVE策略的开发和应用拓展提供了推动力。
可变的编码、密码子偏倚和密码子对偏倚
可变的编码 
给定的肽可由许多核酸序列编码。例如，即使是典型的短的10聚体寡肽也可由大约410(约106)种不同的核酸编码，而PV的蛋白质可由约10442 种不同的核酸编码。自然选择最终选择这些可能的10442种核酸中的一种作为PV基因组。虽然一级氨基酸序列是给定mRNA编码的信息的最重要的水平，但是不同类型的RNA序列内还存在其他类型的信息。这些包括不同功能的RNA结构元件(如，对于PV，顺式作用复制元件或CRE(Goodfellow等人，2000；McKnight，2003)、翻译动力学信号(暂停位点、移码位点等)、加A信号、剪接信号、酶促功能(核酶)和非常可能的其它迄今未鉴别的信息和信号)。
即使考虑必须保留诸如CRE的信号的告诫，10442种可能的编码序列仍在保留编码相同蛋白质能力的同时，提供在脊髓灰质炎病毒的RNA序列中产生剧烈变化的巨大灵活性。可对密码子偏倚或密码子对偏倚进行改变，并且可以添加或去除RNA中的核酸信号和二级结构。甚至可在可变的读码框中同时编码其他或新的蛋白质(参见如，Wang等人，2006)。
密码子偏倚 
虽然大多数氨基酸可由几种不同的密码子编码，但是不是所有密码子都以相等频率使用：一些密码子是“稀有"密码子，而其他的是“常用(frequent)”密码子。如本文所用，“稀有"密码子是以显著低于特定氨基酸的最常用密码子的频率存在于mRNA中的，编码该氨基酸的至少两种同义密码子之一。因此，稀有密码子可以比最常用的密码子低约2倍的频率存在。优选地，稀有密码子以比所述氨基酸的最常用的密码子低至少3倍、更优选地至少5倍的频率存在。相反地，“常用"密码子是以显著高于特定氨基酸的最不常用密码子的频率存在于mRNA中的，编码该氨基酸的至少两种同义密码子之一。常用密码子可以比所述氨基酸的最不常用的密码子高约2倍、优选地至少3倍、更优选地至少5倍的频率存在。例如，人类基因以40％的时间使用亮氨酸密码子CTG，但以仅7％的时间使用同义的CTA(参见表2)。因此，CTG是常用密码子，而CTA是稀有密码子。大致与这些使用频率相符，基因组中有6拷贝的用于识别CTG的tRNA基因，而仅有2拷贝的用于识别CTA的tRNA基因。相似地，人类基因分别以18％和22％的时间使用丝氨酸的常用密码子TCT和TCC，但是以仅5％的时间使用稀有密码子TCG。TCT和TCC由同一tRNA经由摆动阅读，所 述tRTA在基因组中有10拷贝的基因，而TCG由仅4拷贝的tRNA阅读。公知那些非常活跃翻译的mRNA强烈偏倚仅使用最常用的密码子。这包括核糖体蛋白质和糖分解酶的基因。另一方面，相对较不丰富的蛋白质的mRNA可使用稀有密码子。
高表达的基因使用常用密码子的倾向称为“密码子偏倚”。核糖体蛋白基因可使用61种密码子中的仅20至25种最常用的，并具有高密码子偏倚(密码子偏倚接近于1)，而低表达的基因可使用所有61种密码子，并且具有很小或没有密码子偏倚(密码子偏倚接近于0)。认为常用密码子是更 大量的相关tRNA被表达的密码子，并且使用这些密码子允许翻译更快速、或更准确、或两者兼有地进行。PV衣壳蛋白的翻译非常活跃，并具有高密码子偏倚。
密码子对偏倚 
编码序列的一个突出特征是它们的密码子对偏倚。这可通过考虑氨基酸对Ala-Glu来说明，氨基酸对Ala-Glu可由8种不同的密码子对编码。如果没有各个单独的密码子的频率(如表2所示)之外的因素影响密码子对的频率，则所述8种编码的每一个的预期频率可通过将两种相关密码子的频率相乘来计算。例如，通过此计算，在所有Ala-Glu编码对中，密码子对GCA-GAA预期将以0.097的频率发生(0.23x0.42；基于表2中的频率)。为了关联每种密码子对的预期(假设)频率和人类基因组中实际观察到的频率，使用了含有总计14,795个人类基因的一致性注释的人类编码区的共有序列CDS(Consensus CDS，CCDS)数据库。这套基因最全面地代表了人类编码序列。使用这套基因，通过将密码子的发生次数除以编码相同氨基酸的所有同义密码子的数目重新计算了密码子使用频率。如所预期的，所述频率与先前公布的频率诸如表2中给出的那些密切相关。微小的频率变异可能是由于Kazusa DNA研究所的密码子使用数据库(http：//www.kazusa.orjp/codon/codon.html)提供的数据中的过采样(oversampling)效应，其中84949个人类编码序列包括于所述计算中(远多于人类基因的实际数目)。然后将由此计算的密码子频率用于计算预期的密码子对频率，首先将两个相关的密码子的频率彼此相乘(参见表3的预期频率)，然后将此结果与观察到的频率(在完整CCDS数据集中)相乘，所述观察到的频率是相关的密码子对编码的氨基酸对的发生频率。在密码子对GCA-GAA的实例中，此第二种计算产生0.098的预期频率(相比之下，使用Kazusa数据集的第一种计算为0.97)。最后，14,795个人类基因的集合中观察到的实际密码子对频率通过计数此集合中每种密码子对发生的总数目，并将其除以此集合中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数目来确定(表3；观察频率)。基于14,795个人类基因的集合的3721种(612)密码子对的完整集合的频率和观察/预期值在本文提供为增表1。
如果密码子对的观察频率/预期频率的比值大于1，则说所述密码子对是过表现的(overrepresented)。如果该比值小于1，则说其是低表现的(underrepresented)。在所述实例中，密码子对GCA-GAA过表现1.65倍，而编码对GCC-GAA低表现超过5倍。
许多其他密码子对显示非常强的偏倚；一些对是低表现的，而其他对是过表现的。例如，密码子对GCCGAA(A1aGlu)和GATCTG(AspLeu)是三至六倍低表现的(优选的对分别是GCAGAG和GACCTG)，而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGAA(AsnGlu)是约两倍过表现的。值得注意的是，密码子对偏倚对于氨基酸对的频率没有影响，对于个体密码子的频率也没有影响。例如，低表现的对GATCTG(AspLeu)恰好使用最常用的Leu密码子(CTG)。
密码子对偏倚是在原核细胞中发现的(参见Greve等人，1989)，但是此后见于所有其他检查的物种，包括人类。此效应具有非常高的统计学显著性，并且当然不只是噪音。然而，其功能重要性(如果有的话)仍是神秘的。一个提议是一些tRNA对当它们在核糖体上被带到一起时相互作用良好，而其他对相互作用不良。因为不同的密码子通常由不同的tRNA阅读，可偏倚密码子对以避免将不相容的tRNA对放在一起(Greve等人，1989)。另一种看法是许多(但不是所有)低表现的对具有中央CG二核苷酸(如编码AlaGlu的GCCGAA)，而CG二核苷酸系统性地在哺乳动物中低表现(Buchan等人，2006；Curran等人，1995；Fedorov等人，2002)。因此，密码子对偏倚的效应可以是两种类型-一种是哺乳动物基因组中CG 低表现的间接效应，而另一种与翻译的效率、速度和/或准确性有关。需强调的是，本发明不限于密码子对偏倚的潜在的任何特定分子机制。
如下文更全面讨论的，密码子对偏倚考虑编码序列中每个密码子对在所述编码序列的整个长度上的平均得分。根据本发明，密码子对偏倚通过  CPB = Σ i = 1 k CPSi k - 1 确定。
因此，可获得相似的编码序列的密码子对偏倚，例如，通过最小化子序列上的密码子对得分或适当地降低编码序列全长上的密码子对得分。
由于所有61种有义密码子和所有有义密码子对可毫无疑问地使用，因此不会预期将单个稀有密码子置换为常用密码子或将稀有密码子对置换为常用密码子对将有多大影响。因此，密码子和密码子对偏倚的许多先前研究是经由信息学而不是实验进行的。基于实验工作的一项密码子对偏倚研究是Irwin等人(1995)的研究，他们发现，与直觉相反，某些过表现的密码子对造成较慢的翻译。然而，这一结果不能被另一组重现(Cheng和Goldman，2001)，并且还与下文报道的结果冲突。因此，本发明的结果(参见下文)可能是密码子对偏倚的功能作用的第一项实验证据。
本文公开的某些实验涉及重编码病毒基因组序列诸如PV的整个衣壳区(包括l000个左右的密码子)，以单独将不良的密码子偏倚和不良的密码子对偏倚二者包括于基因组。这些实验潜在的基本原理是如果每个置换产生小的效应，那么所有置换合起来应产生大的效应。确实，结果证明去优化的密码子偏倚和去优化的密码子对偏倚单独产生不能生存的病毒。
如实施例中更详细讨论的，初步数据表明效率低下的翻译是降低具有不良的密码子偏倚或密码子对偏倚的病毒的生存力的主要机制。与精确的机制无关，数据表明向病毒基因组大规模置换同义的去优化密码子造成严重减毒的病毒。产生减毒病毒的此规程被戏称为SAVE(合成减毒病毒工程)。
根据本发明，病毒减毒可通过改变密码子对偏倚以及密码子偏倚实现。然而，预期调整密码子对偏倚是特别有利的。例如，通过密码子偏倚来减毒病毒一般需要消除共同密码子(common codon)，以便降低核苷酸序 列的复杂性。相反，密码子对偏倚降低或最小化可在保持大得多的序列多样性，并因此对核酸二级结构、退火温度和其他物理和生化性质具有更大控制的同时实现。本文公开的工作包括减毒的密码子对偏倚降低的或密码子对偏倚最小化的序列，其中密码子被改组，但是密码子使用谱未被改变。
病毒减毒可用本领域普通技术人员公知的方法确认。非限制性实例包括噬斑测定、生长测量和在受试动物中降低的致死性。本申请证实减毒病毒能够诱导宿主中的保护性免疫应答。
合成减毒病毒工程(SAVE)j
SAVE采用专门设计的计算机软件和核酸合成和装配的现代方法来重新编码和重新合成病毒的基因组。对于正寻求其有效疫苗的各种医学重要的病毒，这一策略提供产生针对其的疫苗的有效方法。
自20世纪50年代以来，有两种有效的脊髓灰质炎疫苗可用，分别为Jonas Salk开发的灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和Albert Sabin开发的包含活的减毒病毒的口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)。确实，由世界卫生组织(WHO)领导的开始于1988年的根除脊髓灰质炎的全球行动已成功在世界大多数国家根除了脊髓灰质炎。每年诊断的病例数已从数十万降至2005年的低于两千，主要发生在印度和尼日利亚。然而，广泛使用OPV的一个问题是它可回复突变成强毒形式，虽然这被认为是稀有事件，但是疫苗衍生的脊髓灰质炎的爆发已有报道(Georgescu等人，1997；Kew等人，2002；Shimizu等人，2004)。事实上，只要使用活的脊髓灰质炎病毒疫苗株系，每个携带低于7个减毒突变，就有此株系回复突变成wt的可能性，并且此回复突变造成对彻底根除脊髓灰质炎的严重威胁。因此，WHO在其脊髓灰质炎根除行动的结尾阶段可能非常需要新的脊髓灰质炎疫苗来抗击回复突变的可能，并且这为本文公开的将SAVE应用于PV的研究提供了一个基本原理。然而，选择PV主要是因为它是开发SAVE的优秀模式系统。
在重新编码过程中，病毒基因组中必要的核酸信号得以保留，但是蛋白质翻译的效率通过去优化密码子偏倚、密码子对偏倚和其他参数诸如RNA二级结构和CpG二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂 停位点或其任何组合得到系统性降低。此去优化可包括各自具有小的影响的数百或数千种变化。一般而言，去优化以病毒仍可在一些细胞系(包括专门加工以允许特定病毒的系)中生长但是所述病毒在正常动物或人类中无致病力的程度执行。此类无致病力病毒是死疫苗或活疫苗的优秀候选物，因为它们编码与完全致病力的病毒完全相同的蛋白质，并因此激发与完全致病力病毒严格相同的免疫应答。此外，SAVE过程提供细调减毒水平的前景；即，其提供设计被去优化至粗略预测程度的合成病毒的能力。获知基因组序列后，病毒微粒的设计、合成和生产可在数周的时框内完成，这对于在潜在的紧急情况下产生疫苗具有重要优点。此外，预期所述减毒病毒几乎没有回复突变成毒力的可能，因为包括了极大数量的有害核苷酸变化。此方法一般而言可应用于广泛范围的病毒，只要求了解任何特定病毒的病毒基因组序列和反向遗传学系统。
通过去优化密码子偏倚的病毒减毒
如果技术人员使用如上所述的对照细胞/测试细胞方法的IC50-比值，则CSG值低于或等于l的化合物一般而言将不被视为良好的临床候选化合物，而CSG值大于大约10的化合物将是非常有保证的并且值得进一步考虑。
作为工程减毒病毒的手段，通过改变同义密码子使用对脊髓灰质炎病毒1型Mahoney[PV(M)]的衣壳编码区进行了重新加工。衣壳区包含病毒的约三分之一，并且其翻译非常活跃。生成了一种突变体病毒(病毒PV-AB)，其由于用稀有同义密码子取代最大可能数量的常用密码子而具有非常低的密码子偏倚。作为对照，生成了另一病毒(PV-SD)，其具有最大可能数量的同义密码子变化而保持原始的密码子偏倚。参见图1和2。因此，PV-SD是与wt具有实质上相同但位于改组位置的密码子并编码完全相同的蛋白质的病毒。在PV-SD中，未尝试通过改组规程增加或降低密码子对偏倚。参见实施例l。尽管在衣壳编码区具有934个核苷酸变化，但是PV-SD RNA产生了具有与wt不可分辨的特-l生的病毒。相反，未从携带680个沉默突变的PV-AB中回收到可生存的病毒。参见实施例2。
对于PV-AB不能生存的一个普通的解释是恰好有一个核苷酸变化不 知何故是致死的，而其他679个是无害的。例如，核苷酸变化可能由于一些灾难性但尚不理解的原因诸如阻止复制是致死的。不过这一解释是不太可能的。虽然PV在其RNA中确实含有重要的调节元件诸如CRE，但是已知没有此类元件存在于衣壳编码区内部。这得到可缺失整个衣壳编码区而不影响残留基因组在细胞中的正常复制的实证的支持，尽管当然不可能形成病毒微粒(Kaplan和Racamiello，1988)。
为了解决关于某些重新加工的病毒不能生存的问题，将病毒PV-AB的衣壳区的子区段亚克隆至野生型病毒。参见实施例l和图3。包括大的亚克隆区段(包括非重叠区段)证明是致死的，而小的亚克隆区段产生可生存(有一个例外)但不健全(sick)的病毒。“不健全”通过许多测定揭示：例如，密码子偏倚性不良的区段造成不良的滴度(图3B)和小的噬斑(图3C-H)。特别有教育性的是，一般而言，大的致死区段可被分成两个子区段，二者均存活但不健全(图3)。这些结果排除了不能生存是由于仅一个变化的假设；相反，最低而言，许多变化必须参与此表型。
位置1513至2470的区段是例外。此区段相当小，但是将其包括于PV基因组造成不能生存。目前尚不知道此片段是否可细分为仅造成不健全而不灭活病毒的子片段。可以想象，此区段确实含有高度有害的变化，可能是翻译移码位点。
因为不良的密码子偏倚天然地表明对翻译的效应，所以测试了病毒Pv-AB编码的蛋白质的翻译。参见实施例5和图5。确实，所有不健全病毒都不能很好地翻译衣壳蛋白(图5B)。病毒越不健全，翻译效率越低下，这与翻译不良是不健全的原因一致。在补充过量tRNA和氨基酸(图5A)的反应中，翻译基本被改善至M水平，与稀有密码子的识别速率有限一致。
作为去优化的密码子偏倚是否造成效率低下的翻译的第二项测试，将wt的部分和去优化的衣壳的部分融合至双顺反子报告基因构建体中萤火虫荧光素酶的N-末端。参见实施例5和图6。在这些融合构建体中，荧光素酶的翻译依赖于N-末端融合的衣壳蛋白的翻译。再次发现具有去优化的密码子的衣壳蛋白的翻译是不良的，并且在越不健全的病毒中越差，表明存在因果关系。因此，这些数据表明PV-AB病毒中数百个稀有密码子由 于翻译不良而大量造成不能生存。此外，见于体外的翻译不良和见于培养细胞中的病毒不健全也反应在对动物的感染中。即使对于最不虚弱的去优化病毒之一，PV-AB2470-2954，在小鼠中引起疾病所需的病毒微粒数增加了约l00倍。参见实施例4、表4。
Bums等人(2006)最近描述了PV的Sabin2型疫苗株系的一些相似实验并得出了相似的结论。Burns等人合成了完全不同的密码子去优化病毒f即本文描述的PV-AB病毒和他们的“abcd”病毒的核苷酸序列是非常不同的)，并得到使用相似测定的相似虚弱程度。Bums等人未测试他们的病毒构建体在宿主生物体中的减毒。然而，他们的结果证实了SAVE是可预测的这一观点，并且结果不是在很大程度上依赖于准确的核苷酸序列。
通过去优化密码子对偏倚的病毒减毒
根据本发明，可独立于密码子使用来改变密码子对偏倚。例如，在感兴趣的蛋白质编码序列中，可简单地通过其密码子的定向重排来改变密码子对偏倚。特别是，母体序列中出现的相同密码子(其在宿主生物体中可具有不同的频率)用于改变的序列中，但在不同的位置。在最简单的形式中，因为使用了与母体序列中相同的密码子，所以在所考虑的蛋白质编码区上的密码子使用保持不变(编码的氨基酸序列也保持不变)。不过，某些密码子发生于新的环境，就是说其前面和/或后面是编码与母体序列中相同的氨基酸但采用不同的核苷酸三联体的密码子。理想地，密码子的重排产生了频率低于母体序列的密码子对。实际上，重排密码子经常在一个位置上产生频率更低的密码子对，而在另一位置产生频率更高的对。通过密码子的明智重排，可相对于母体序列降低给定长度的编码序列上的密码子对使用偏倚。替代地，可重排密码予以产生使用在宿主中比在母体序列中更常用的密码子对的序列。
密码子对偏倚是通过如下评估的：依次考虑各个密码子对，根据观察到的所述密码子对在宿主的蛋白质编码序列中的频率对于各个对进行评分，然后确定所述序列的密码子对偏倚，如本文所公开。应理解，技术人员可产生具有相同密码子对偏倚的许多不同序列。同样地，根据密码子的重排方式，可将密码子对偏倚改变至更高或更低程度。编码序列的密码子 对偏倚可通过重新编码整个编码序列或通过重新编码一个或多个子序列来改变。如本文所用，“密码子对偏倚”是在编码序列长度上评估的，即使序列可能仅有一部分是突变的。因为密码子对是在宿主生物体的密码子使用环境下进行评分的，所以可向野生型病毒序列和突变的病毒序列指定密码子对偏倚值。根据本发明，病毒可通过重新编码病毒的所有或部分蛋白质编码序列以降低其密码子对偏倚来减毒。
根据本发明，密码子对偏倚是由宿主的密码子对使用确定的定量性质。因此，可确定任何给定的病毒蛋白质编码序列的绝对的密码子对偏倚值。替代地，可确定将去优化的病毒蛋白质编码序列与其所衍生自的“母体"序列关联的密码子对偏倚值的相对变化。由于病毒具有各种类型(即根据Baltimore分类的I至VII型)，且不同病毒的天然(即致病性强的)分离株产生不同的绝对密码子对偏倚值，因此是密码子对偏倚的相对变化通常与确定减毒的期望水平更相关。因此，本发明提供减毒病毒和制备减毒病毒的方法，其中所述减毒病毒包含其中一个或多个编码蛋白质的核苷酸序列具有通过突变降低的密码子对偏倚的病毒基因组。在仅编码单个蛋白质(即一个多蛋白)的病毒中，所述多蛋白的全部或部分可被突变至期望的程度以降低密码子对偏倚，并且所述突变序列的全部或部分可提供于重组病毒构建体中。对于分开编码多个蛋白质的病毒，技术人员可同时降低所有蛋白质编码序列的密码子对偏倚，或仅选择一个或少量蛋白质编码序列进行修饰。密码子对偏倚的降低是在蛋白质编码序列的长度上确定的，并且是至少约0.05、或至少约0.1、或至少约0.15、或至少约0.2、或至少约0.3、或至少约0.4。取决于病毒，基于宿主的密码子对使用的绝对密码子对偏倚可以是约-0.05或更低、或约-0.1或更低、或约-0.15或更低、或约-0.2或更低、或约-0.3或更低、或约-0.4或更低。
显然，密码子对偏倚还可叠加于其他序列变异之上。例如，编码序列可改变为编码含有一种或多种氨基酸变化的蛋白质或多肽并且还具有改变的密码子对偏倚。同样，在一些情形中，技术人员可改组密码子以在密码子偏倚降低的蛋白质编码序列中保持与母体蛋白质编码序列中完全相同的密码子使用谱。此规程突出显示了密码子对偏倚变化的力量，但不需 坚持这一点。替代地，密码子选择可造成编码序列中密码子使用的全面变化。在这方面，注意到在本文提供的某些实例中(如，PV-Min的设计)，即使在产生密码子对偏倚最小化的序列的过程中不改变密码子使用谱，当将该序列的一部分亚克隆至未突变的序列(如PV-MinXY或PV-MinZ)中时，亚克隆部分和由此产生的杂合体(hybrid)中的密码子使用谱将与原始未突变的蛋白质编码序列的谱不匹配。然而，密码子使用谱的这些变化对密码子对偏倚的影响极小。
相似地，注意到改变核苷酸序列以编码具有一个或多个氨基酸置换的蛋白质或多肽单独也高度不可能产生具有显著变化的密码子对偏倚的序列。因此，密码子对偏倚变化是可以识别的，即使在已进一步改良为编码突变的氨基酸序列的核苷酸序列中。还值得注意的是单独意味着增加密码子偏倚的突变不可能对密码子对偏倚具有多大的影响。例如，如本文所公开的，重新编码以使非优选密码子(PV-AB)的使用最大化的脊髓灰质炎病毒突变体的密码子对偏倚比野生型(PV-1(M))仅降低约0.05。同样值得注意的是此蛋白质编码序列的序列多样性被大大降低。相反，大致的序列多样性在本发明的密码子对偏倚改良的序列中得以保留。此外，没有增加稀有密码子使用可获得的密码子对偏倚的显著降低表明，不是使非优选密码子的使用最大化，如在PV-AB中，重排非优选密码子和足够数目的优选密码予以更有效地降低密码子对偏倚将是有益的。
突变的程度和强度可依赖于编码蛋白质的核酸的长度(无论全部或部分可以是突变的)和期望的密码子对偏倚降低而不同。在本发明的实施方案中，蛋白质编码序列是在至少约100核苷酸、或至少约200核苷酸、或至少约300核苷酸、或至少约500核苷酸、或至少约1000核苷酸的长度上改良的。
如上文所讨论，术语“母体”病毒或“母体"蛋白质编码序列在本文用于指从其衍生新序列的病毒基因组和蛋白质编码序列，所述新序列可以被或多或少地减毒。因此，母体病毒可以是“野生型"或“天然发生的”原型或分离株或变体或基于真实的或感知的期望性质专门生成或选择的突变体。
使用从头DNA合成，重新设计PV(M)的衣壳编码区(核苷酸755至核苷酸3385的P1区)，以引入最大可能数目的稀有使用的密码子对(病毒PV-Min)(SEQ ID NO：4)或最大可能数目的常用密码子对(病毒PV-Max)(SEO ID NO：5)，同时保留野生型病毒的密码子偏倚。参见实施例7。就是说，设计的序列使用与母体序列相同的密码子，但是它们以不同的顺序出现。PV-Max病毒基本与野生型病毒相同地展现一步生长动力学并杀死被感染的细胞。(密码子对最大化的病毒的生长动力学相对于野生型未增加，这看起来对其他病毒也是正确的。)相反，用PV-Min突变体RNA转染的细胞未被杀死，并且不能回收到可生存的病毒。将PV-Min衣壳区的片段fPV-Min755-2470、PV-Min2470-3386)亚克隆至wt背景产生非常虚弱但是未死亡的病毒。参见实施例7和图8。此结果证实了有害的密码子变化优选地广泛分布的假设，并且证实了改变密码子对去优化的序列的程度的简单性和效力，所述序列被置换入野生型母体病毒基因组以改变整体序列的密码子对偏倚和病毒产物的减毒。如在PV-AB病毒中所见，PV-Min病毒的表型是降低的病毒微粒的比感染性而不是降低的后代病毒产生的结果。
具有去优化的密码子对偏倚的病毒是减毒的。如下文例证的(参见实施例8和表5)，CD155tg小鼠幸存于以比对野生型病毒而言致死的高1000倍的量在大脑内注射减毒病毒的攻击。这些发现证实去优化密码子对偏倚使病毒致死性最小化的力量。此外，病毒的生存力可通过选择密码子对偏倚去优化的程度用感染性降低来平衡。此外，确定提供期望的减毒性质的密码子对偏倚去优化程度或程度范围后，可设计另外的序列以获得该密码子对偏倚程度。例如，SEQ ID NO：6提供具有约-0.2的密码子对偏倚的和分布于包括PV-MinXY和PV-MinZ的突变部分(即pv755-3385)的区域上的突变的脊髓灰质炎病毒序列。
用于序列设计的算法
本发明人已开发了用于基因设计的几种新算法，所述基因设计优化DNA序列的特定期望性质并同时编码给定的氨基酸序列。特别地，已开发了用于使序列中期望的RNA二级结构最大化或最小化(Cohen和Skiena，2003)以及最大地添加和/或移除指定的模式组(Skiena，2001)的算法。前一 个问题产生于设计可生存病毒中，而后一个对于因技术原因优化地插入限制位点有用。还研究了重叠基因可以设计的以可变的读码框同时编码两个或更多个基因的程度(Wang等人，2006)。此不同的功能多肽由单个核酸以不同的读码框编码的性质在病毒中是常见的，并可开发用于技术目的，诸如在抗生素抗性基因中进行编织(weaving)。
合成生物学的第一代设计工具已经建立，如Jayaraj等人(2005)和Richardson等人(2006)所述。这些主要集中于优化可生产性的设计(即，不含局部二级结构和末端重复的寡核苷酸)，而不是优化序列的生物活性。这些第一代工具可视为类似于围绕设计规则校验而建立的早期VLSI CAD工具，而不是支持更高级的设计原则。
如本文所例证的，基于计算机的算法可用于操作任何编码区的密码子对偏倚。所述算法有能力改组现有密码子并评估得到的CPB，然后重新改组序列，任选地锁定特别“珍贵的”密码子对。所述算法还采用“模拟退火，，的形式以便不陷于局部的极小范围。其他参数，诸如RNA折叠的自由能也可选择地位于所述算法的控制之下，以避免生成不期望的二级结构。所述算法可用于查找具有最小密码子对偏倚的序列，并且在此序列不提供可生存的病毒的事件中，所述算法可调整为查找具有降低但不是最小的偏倚的序列。当然，可生存的病毒序列也可仅使用计算机最小化的序列的子序列产生。
无论是否借助计算机执行，使用，例如，梯度下降或模拟退火或其他最小化例行程序(routine)。重排起始序列中存在的密码子的规程的一个实例可通过下列步骤表示：
1)获得野生型病毒基因组序列。
2)选择减毒设计要靶向的蛋白质编码序列。
3)锁定具有非编码功能的已知或推测的DNA区段。
4)为重新设计的蛋白质中剩余的氨基酸选择期望的密码子分布。
5)对未锁定的密码子位置执行随机改组，并计算密码子对得分。
6)进一步降低(或增加)密码子对得分，任选地采用模拟退火规程。
7)检查所得设计是否存在过多的二级结构和不需要的限制位点：
如果是-＞进行步骤(5)或通过用野生型序列取代有问题的区域来更正所述设计并进行步骤(8)。
8.合成对应于病毒设计的DNA序列。
9.创建病毒构建体并评估表达：
如果减毒过大，制备亚克隆构建体并进行9；
如果减毒不足，进行2。
提供了基于计算机的模拟退火例行程序的源代码(PERL脚本)。
替代地，技术人员可设计允许通过选择密码子对来去优化每对氨基酸，而不要求将所述密码子从蛋白质编码序列的其他地方换出的规程。
病毒减毒的分子机制：使用高通量方法表征减毒的PV
如上文和实施例中更详细地描述的，构建了与野生型病毒编码完全相同的蛋白质、但具有改变的密码子偏倚或改变的密码子对偏倚的两种合成的减毒脊髓灰质炎病毒。一种病毒使用去优化的密码子；另一种病毒使用去优化的密码子对。每种病毒相对于wt病毒具有数百种核苷酸变化。
本文呈现的数据表明这些病毒由于翻译不良而是减毒的。这一发现(如果正确)具有重要的意义。首先，每种病毒的降低的适合度/毒力是由于散布于基因组的数百个位置的小的缺陷。因此，基本上没有所述病毒回复突变至野生型的机会，所以所述病毒是活或死疫苗的良好起点。第二，如果降低的适合度/毒力是由于数百个翻译中的小缺陷的加成效应，此具有极小回复突变风险的降低适合度的方法应适用于许多其他病毒。
虽然强调本发明不限于任何特定的操作模式或潜在的分子机制，但是正在进行的研究仍旨在区分这些替代的假设。正在进行的研究包括使用高通量方法来扫描各种减毒病毒设计，诸如密码子和密码子对去优化的脊髓灰质炎病毒和流感病毒的基因组，和通过将每种突变体病毒的重叠的300-bp部分置于wt环境来构建嵌合体。参见实施例ll。然后测定这些嵌合病毒的功能。大多数嵌合体的适合度比野生型稍差而不显著的发现，如 本文公开的初步数据所表明的，确证了“渐进的功能丧失"假设，其中许多有害的突变分布遍及嵌合体覆盖的区域。相反，大多数嵌合体与wt相似或相同，而一个或仅少量嵌合体像母体突变体一样减毒的发现表明，序列中存在相对较少的其中突变造成减毒的位置，并且在这些位置的减毒是重要的。
如实施例12中所述，执行实验以确定密码子和密码子对去优化如何影响RNA稳定性和丰度，和指明削弱重新加工的病毒基因组的翻译的参数。对此削弱的分子基础的理解将进一步增加SAVE方法对广泛范围的病毒的适用性。另一可想象的翻译削弱潜在机制是翻译移码，其中核糖体开始翻译不同的读码框，产生假的通常截短的多肽，直至其遇到符合读码框架(in-frame)的终止密码子。携带残基1513至2470的AB突变体区段的PV基因组不仅不能生存，而且在体外翻译中产生大约42-44kDa的新的蛋白质条带(参见图5A)。此AB1513-2470片段灭活PV的能力、以及其诱导产生所述新蛋白质的能力可反映移码事件的发生，并且此可能性也正在进行研究。在SAVE设计软件中构建了避免引入移码位点的过滤器。
使用各种技术对翻译缺陷进行了更详细的研究，包括但不限于多核糖体轮廓图(polysome profiling)、趾纹法和融合蛋白的荧光素酶测定，如实施例12中所述。
脊髓灰质炎病毒的分子生物学
虽然正在进行研究以解开通过SAVE的病毒减毒的潜在机制，PV衣壳编码区的大规模密码子去优化揭示了PV本身的生物学的令人感兴趣的见解。什么决定病毒的PFU/微粒比值(比感染性)是一个长期存在的问题。一般而言，在建立生产性感染之前，感染生命周期过程中任何步骤的失败都将导致中止的感染，并且因此导致感染性微粒的死亡。在PV的情形中，已显示需要大约1oo个病毒粒子以在培养的细胞中造成一次感染性事件fJoklik和Darnell，196l；Schwerdt和Fogh，1957)。就是说，在接种的100个微粒中，只有大约一个可能成功完成受体结合(步骤1)、然后是内化和脱被(步骤2)、基因组翻译起始(步骤3)、多蛋白翻译(步骤4)、RNA复制(步骤5)和后代的包壳(步骤6)水平的所有步骤。
在本文所述的AB型病毒的感染性周期中，步骤1和2应与PV(M)感染相同，因为它们的衣壳是相同的。同样地，相同的5’非翻译区在装配翻译复合体方面应执行得同样地好(步骤3)。另一方面，病毒多蛋白翻译(步骤4)由于在衣壳区中引入大量次优的同义密码子而受到严重削弱(图5和6)。认为翻译机器重复遇到稀有密码子造成了核糖体的停止，因为根据质量作用法则，稀有氨酰-tRaNA将花费更长时间以扩散到核糖体上的A位点。由于肽延伸很大程度上是由可得的氨酰-tRNA的浓度驱动的，mRNA对许多稀有tRNA的依赖性将因此延长翻译的时间(Gustafsson等人，2004)。替代地，核糖体的过多停止可造成翻译复合体提早从RNA解离，并得到注定要降解的截短的蛋白质。两种过程都将导致更低的每mRNA分子每单位时间的蛋白质合成速率。虽然本文呈现的数据表明密码子去优化的病毒的表型是由基因组翻译的速率决定的，但是其他机械论的解释也是可能的。例如，已表明甲型肝炎病毒中遍及病毒衣壳序列的稀有同义密码子的保守位置通过引入必要的翻译暂停而对初生多肽的正确折叠具有重要功能f等人，2003)。因此，大规模改变密码子组成可令人信服地改变这些暂停位点中的一些，以造成错误折叠的衣壳蛋白增加。
这些考虑是否也适用于PV衣壳尚不清楚。如果是这样，将可预期PV-SD设计的改变的表型，其中wt密码子被保留，但是它们遍及衣壳的位置完全被改变。就是说，在关于所述蛋白质序列的适当位置将没有这些所谓的暂停位点。然而，没有观察到表型的变化，并且PV-SD以野生型水平进行翻译和复制(图3B)。
另一种可能性是测试的设计中的大规模密码子变化可能产生偶然的显性失活RNA元件，诸如稳定的二级结构或可经历与基因组的其他区域的分裂性长程相互作用的序列。
假定当对M和本文描述的突变体病毒进行比较时，病毒脱被之前的所有步骤并包括病毒脱被应是未变化的。这得到所有这些分离株的隐蔽期相似的观察结果的支持(图3B)。因此，PFU/微粒比值的显著下降很可能是去优化的基因组的降低的翻译能力的结果，即突变体病毒的缺陷是在细胞内决定的。
一般而言假定小RNA病毒的1/100至1/1000的相对较低的PFU/微粒比值(Rueckert，1985)主要是由受体结合步骤的结构变化决定的，无论是在进入细胞之前或是在进入细胞水平。几乎不具有感染性的135S微粒的形成可能是脊髓灰质炎病毒感染性效率低下背后的主要罪魁祸首(Hogle，2002)。然而，某些病毒突变体似乎回避A微粒转换而不造成更高的比感染性，这一观察结果表明其他进入后机制可能造成低PFU/微粒比值(Dove和Racaniello，1997)。
本发明的数据为病毒和细胞之间的这种进入后相互作用提供了清晰的证据，并且表明这些而不是进入前事件导致了脊髓灰质炎病毒的不同PFU/微粒比值。由于脊髓灰质炎病毒中的所有复制蛋白质位于多蛋白上的P1的下游，它们严重依赖于Pl翻译的成功完成。降低P1翻译的速率因此同样程度地降低了所有复制蛋白质的翻译。这可能依次导致降低的病毒对宿主细胞进行必要修饰的能力，所述必要修饰是建立生产性感染所需要的，诸如关闭宿主细胞翻译或阻止宿主细胞的先天应答。虽然本文所述的密码子去优化很可能在肽延伸步骤影响翻译，但是降低的翻译起始也可以是有力的减毒决定因素，如脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗株系中内部核糖体进入位点中的突变所显示的(Svitkin等人，1993；1985)。
基于这些考虑，可预知：可归因于基因组翻译或早期基因组复制缺陷的许多突变体表型实际上通过降低PFU/微粒比值证明了其自身。只要缺陷造成增加机会的中止的感染，情况就将是如此。因为在几乎所有的研究中，无所不在的噬斑测定是病毒检测方法的选择，所以表观病毒滴度的降低通常换算为病毒产生本身的降低。这可能是一个可以在单细胞水平表征病毒性质的困难为托辞固有的隐患。相反，大多数测定在大量细胞上进行。以所选测试(蛋白质合成、RNA复制、以PFU测量的病毒产生)的更低读数的面值(face value)作为每细胞基础上较低的产生的指示，而不考虑当产生病毒的细胞数量下降时细胞中的病毒产生可能是正常的。
密码子去优化的病毒的几乎相同的每细胞微粒产生表明长时间段之后产生的总蛋白质没有受到严重影响，而蛋白质产生的速率被激烈地降低。这反映于延迟的CPE出现，其可能是病毒必须经过更多的RNA复制 周期以建立相似的细胞内病毒蛋白质浓度的标志。显示密码子去优化的病毒在建立生产性感染中具有严重缺陷，因为引入的感染基因组的早期翻译速率被降低。由于此较低的翻译速率，使细胞的抗病毒应答失去能力必需的PV蛋白质(最有可能是蛋白酶2Apro和3Cpro)未以充足的量合成，从而不能足够快地通过生命周期中的此关键障碍。因此，细胞有更好的机会在病毒复制可开展和接管所述细胞之前消除感染。从而生产性感染事件的可能性被降低而中止的感染的比例增加。然而，在其中密码子去优化的病毒确实成功使细胞失去能力的情形中，此病毒将产生与野生型几乎相同量的后代。本发明的数据表明复制期中的早期翻译(从引入的RNA基因组)和晚期翻译之间可能存在根本的差异，当细胞自身的翻译在很大程度上被关闭时。虽然这可能是一个普通的现象，但是它在密码子去优化的基因组的情形中可能特别重要。宿主细胞关闭非常有可能造成自由氨酰-tRNA的过量丰富，这可克服次优的密码子使用带来的影响，因为PV基因组不再必须竞争细胞RNA作为翻译资源。这事实上可能与对本文描述的改良的体外翻译系统的观察结果类似(图5B)。使用未被核酸酶处理(并因此含有细胞的mRNA)且未补充外源氨基酸或tRNA的翻译提取物，观察到不同衣壳设计突变体翻译能力的明显不同。在这些条件下，病毒基因组必须在供应有限的环境中竞争细胞的mRNA。相反，在常规的翻译提取物中，其中内源mRNA被移除且添加了过量tRNA和氨基酸，所有PV RNA相等地翻译良好，无论密码子偏倚如何(图5A)。这两种不同的体外条件可类似于PV感染细胞中早期和晚期的体内翻译。
本研究的一个重要发现是认识到除了病毒的物理相互作用和摄取过程中的步骤之外，PFU/微粒比值还很大程度上反映病毒克服宿主细胞抗病毒应答的能力。这表明小RaNA病毒在赢得这一竞争中实际上非常效率低下，并且显示已采取进化小的基因组的途径，所述小的基因组可在细胞有效应答之前快速复制。如数据显示，在PV-AB2470-2954中使翻译速率变慢仅30％(参见图6)导致l,000倍更高速率的中止的感染，如更低的比感染性所反应的(图4D)。小RNA病毒显然不仅在错误灾难(error catastrophe)的极限下复制(Crotty等人，2001；Holland等人，1990)，而且还在通过宿主细胞抗病毒防御的消灭的极限下复制。这一效应可对小RNA病毒的致病表型 具有深远影响。负责密码子去优化的病毒的增加的中止的感染率的细胞抗病毒过程目前尚未被充分理解。已显示PV兼而诱导和抑制凋亡(Belov等人，2003；Girard等人，1999；Tolskaya等人，1995)。相似地，PV通过切割NF-κB干扰干扰素途径(Neznanov等人，2005)。有理由认为，具有降低的早期基因组翻译速率的PV仍以与wt病毒相同的方式诱导抗病毒应答(默认是诱导凋亡和干扰素)，但是然后由于低蛋白质合成而具有降低的抑制这些过程的潜能。这一假定将增加细胞中止初生感染的可能，生，并且可以解释所观察到的现象。在个体细胞水平，PV感染很可能是全有或全无的现象。病毒蛋白质和RNA合成很可能需要在非常接近最大值的范围内以确保生产性感染。
减毒的病毒疫苗组合物
本发明提供用于诱导受治疗者中的保护性免疫应答的疫苗组合物，其包含本文所述的任何减毒病毒和药学可接受的载运体。
应理解，本发明的减毒病毒，在用于引起受治疗者中的保护性免疫应答或防止受治疗者患上病毒相关疾病时，是以另外包含药学可接受的载运体的组合物的形式施用于受治疗者的。药学可接受的载运体是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于0.01-0.1M和优选地0.05M磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或0.9％盐水中的一种或多种。此类载运体还包括水性(aqueous)或非水性的溶液、悬浮液和乳液。水性载运体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。肠胃外运载体(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格溶液(1actated Ringer's)和不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂诸如基于林格氏葡萄糖的那些和类似运载体。固体组合物可包含无毒的固体载运体诸如，例如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。对于以气溶胶的施用，诸如用于肺部和/或鼻内递送，药剂(agent)或组合物优选地用无毒的表面活性剂(例如C6至C22脂肪酸的酯或部分酯或天然的甘油酯)和推进剂配制。可包括另外的载运体诸如卵磷脂以促进鼻内递 送。药学可接受的载运体还可包括少量的辅助性物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和其他添加剂诸如，例如抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂，所述辅助性物质增加活性成分的保质期和/或效力。如本领域公知的，本发明的组合物可配制为在施用于受治疗者后提供活性成分的快速的、持续的或延迟的释放。
在本发明的疫苗组合物的各种实施方案中，所述减毒病毒(i)不显著改变感染细胞中病毒蛋白质的合成和加工；(ii)每感染细胞中产生与wt病毒相似量的病毒粒子；和/或(iii)展示显著低于wt病毒的病毒粒子比感染性。在进一步的实施方案中，所述减毒病毒与对应的wt病毒诱导大致相似的宿主动物中的免疫应答。
本发明还提供特别分离或加工为使减毒病毒在野生型宿主细胞中不能生存的改良的宿主细胞系。因为所述减毒病毒不能在正常(野生型)宿主细胞中生长，所以它绝对地依赖于特异性辅助细胞系才能生长。这为产生用于疫苗生产的病毒提供了非常高的安全性水平。本发明的改良细胞系的各种实施方案允许减毒病毒的生长，其中所述细胞系的基因组已被改变，以增加编码稀有tRNA的基因的数量。
在优选的实施方案中，所述稀有密码子是CTA(编码Leu)、TCG(Ser)和CCG(Pro)。在不同的实施方案中，这些稀有密码子中的一个、两个或全部三个被置换为同义的病毒基因组中的常用密码子。例如，病毒中的所有Leu密码子可被改变为CTA；所有Ser密码子可被改变为TCG；所有Pro密码子可被改变为CCG；Leu和Ser、或Leu和Pro、或Ser和Pro密码子可被鉴定的稀有密码子取代；或单个病毒中的所有Leu、Ser和Pro密码子可被分别改变为CTA、TCG和CCG。此外，一部分即低于loo％的相关密码子可被改变为稀有密码子。因此，被置换的密码子的比例可以是密码子总数量的约20％、40％、60％、80％或100％。
在某些实施方案中，这些置换仅在病毒的衣壳区进行，其中高速率的翻译是最重要的。在其他实施方案中，所述置换遍及所述病毒进行。在进一步的实施方案中，所述细胞系过表达结合稀有密码子的tRNA。
本发明还提供合成本文所述的任何减毒病毒的方法，所述方法包括(a) 鉴别病毒基因组的至少一个非调节部分内多个位置中的密码子，所述密码子可被同义密码子取代；(b)为每个鉴别的密码子选择要置换的同义密码子；和(c)为每个鉴别的密码子置换同义密码子。
在本发明的方法的某些实施方案中，步骤(a)和(b)是由用于合成减毒病毒工程(SAVE)的基于计算机的算法指导的，所述算法允许通过在优选限值内改变去优化的密码子分布和/或去优化的密码子对分布的指定模式集来设计病毒基因组。本发明还提供其中所述模式集替代地或另外地包含去优化的密码子和去优化的密码子对的密度、RNA二级结构、CpG二核苷酸含量、C+G含量、重叠编码框、限制位点分布、移码位点或其任何组合的方法。
在其他实施方案中，步骤(c)通过从头合成含有同义密码子和/或密码子对的DNA并用所述合成的DNA置换基因组的对应区域来完成。在进一步的实施方案中，完整的基因组被所述合成的DNA置换。在又进一步的实施方案中，基因组的一部分被置换为合成的DNA。在又其他的实施方案中，所述基因组部分是衣壳编码区。
此外，本发明提供用于引起受治疗者中的保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受治疗者施用预防或治疗有效剂量的本文所述的疫苗组合物中的任一种。本发明还提供用于防止受治疗者患上病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受治疗者施用预防有效剂量的本发明的疫苗组合物中的任一种。在以上方法的实施方案中，受治疗者已暴露于致病性病毒。“暴露”于致病性病毒意指与病毒接触以使可造成感染。
本发明还提供用于延迟感染病毒的受治疗者中病毒相关疾病的发作或减慢所述疾病的进展速率的方法，所述方法包括向受治疗者施用治疗有效剂量的本发明的疫苗组合物中的任一种。
如本文所用，“施用"意指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种的递送。施用可以例如以下的方式执行：腹膜内、大脑内、静脉内、经口、透粘膜、皮下、透皮、皮内、肌内、局部、肠胃外、经由植入物、鞘内、淋巴内、损伤内(intralesionally)、心包(pericardially)或硬膜外(epidurally)。药剂或组合物还可以气溶胶施用，诸如用于肺部和/或 鼻内递送。施用可执行例如一次、多次和/或在一个或多个长时间段内执行。
引起受治疗者中的保护性免疫应答可通过例如向受治疗者施用初始剂量的疫苗，然后在合适的时间段后进行所述疫苗的一次或多次后续施用来实现。疫苗施用之间的合适时间段可由本领域技术人员容易地确定，并且通常在几周至数月等级。然而，本发明不限于任何特定的施用方法、路径或频率。
“受治疗者"意指任何动物或人工改良的动物。动物包括但不限于，人类、非人灵长类、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿类(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)和鸟类。人工改良的动物包括但不限于，具有人类免疫系统的SCID小鼠和表达人类脊髓灰质炎病毒受体CD155的CD155tg转基因小鼠。在优选的实施方案中，受治疗者是人类。乌类的优选实施方案是驯养的家禽物种，包括但不限于、鸡、火鸡、鸭和鹅。
“预防有效剂量”是当施用于易受病毒感染或易患上病毒相关病症的受治疗者时，在受治疗者中诱导保护受治疗者不被所述病毒感染或患上所述病症的免疫应答的任何疫苗量。“保护”受治疗者意指降低受治疗者感染所述病毒的可能性或减小所述病症在受治疗者中发作的可能性达至少两倍、优选地至少十倍。例如，如果受治疗者有1％的机会感染病毒，受治疗者感染所述病毒的可能性降低两倍将造成所述受治疗者具有0.5％的机会感染所述病毒。最优选地，“预防有效剂量"在受治疗者中诱导完全防止受治疗者感染所述病毒或完全阻止所述病症在受治疗者中发作的免疫应答。
如本文所用，“治疗有效剂量"是当施用于患有疫苗对其有效的病症的受治疗者时，在受治疗者中诱导造成受治疗者经历所述病症和/或其症状的降低、好转或衰退的免疫应答的任何疫苗量。在优选的实施方案中，病症和/或其症状的复发被阻止。在其他优选的实施方案中，所述受治疗者的病症和/或其症状被治愈。
本发明的免疫接种和治疗方法的任一种的某些实施方案还包括向受治疗者施用至少一种佐剂。“佐剂”应指适于增强抗原的免疫原性和激发受治疗者中的免疫应答的任何药剂。许多佐剂，包括适合与基于蛋白质的 疫苗和基于核酸的疫苗二者一起使用的颗粒(Particulate)佐剂，和将佐剂与抗原组合的方法是本领域技术人员公知的。用于基于核酸的疫苗的适合的佐剂包括但不限于，以纯化的蛋白质或核酸形式递送的Quil A、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)和白介素-12。适合用于蛋白质免疫接种的佐剂包括但不限于，明矾、弗氏不完全佐剂(FIA)、皂苷、Quil A和QS-21。
本发明还提供用本发明的减毒病毒免疫接种受治疗者的试剂盒。所述试剂盒包含减毒病毒、药学可接受的载运体、应用装置(applicator)和所述试剂盒的使用说明书材料。在进一步的实施方案中，所述减毒病毒可以是一种或多种脊髓灰质炎病毒、一种或多种鼻病毒、一种或多种流感病毒等。在期望针对特定病毒的许多不同分离株免疫接种宿主时，可优选多于一种病毒。本发明包括本领域技术人员已知的试剂盒的其他实施方案。说明书可提供对于指导减毒病毒的施用有用的任何信息。
当然，应理解和预期本领域技术人员可对本文公开的发明的原理进行变化，并且此类修饰意于包括在本发明的范围内。下列实施例进一步说明了本发明，但不应以任何方式解读为限制本发明的范围。常规方法诸如构建重组质粒、用病毒构建体转染宿主细胞、聚合酶链式反应(PCR)和免疫学技术中采用的那些的详细描述可从许多出版物获得，包括Sambrook等人(1989)和Coligan等人(1994)。本文提及的所有参考文献通过引用于本申请而以其整体并入。
遍及本申请引用的各种出版物的详细信息提供于说明书的末尾，权利要求书之前。这些出版物的公开内容通过引用于本申请而以其整体并入本文。然而，本文的参考文献引用不应解读为承认此类参考文献是本发明的现有技术。
实施例1
通过改变密码子偏倚重新加工脊髓灰质炎病毒的衣壳区
细胞、病毒、质粒和细茵
HeLa R19细胞单层在37℃下保持于补充10％小牛血清(bovine calf serum，BCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle mediam，DMEM)中。所有PV感染性cDNA构建体是基于PVl(M)cDNA克隆pT7PVM(Cao等人，1993；van der Werf等人，1986)。双顺反子报告质粒使用pHRPF-Luc构建(Zhao和Wimmer，2001)。大肠杆菌DH5a用于质粒转化和繁殖。病毒通过以5PFU/细胞感染HeLa R19细胞单层扩增。感染的细胞在370C下于DMEM(2％BCS)中孵育直至完整的细胞病变效应(CPE)是明显的，或在感染后孵育至少4天。三轮冻融之后，将溶胞产物通过低速离心澄清除去细胞碎片，并将含有病毒的上清液用于进一步的传代或分析。
合成衣壳取代物和双顺反子报告基因复制子的克隆
跨越基因组的核苷酸495和3636之间的两个PV基因组cDNA片段，称为SD和AB，使用技术(Blue Heron Biotechnology)合成。pPV-SD和pPV-AB是通过如下产生的：通过PmdI消化从供应商的克隆载体释放取代盒(replacement cassette)并插入其中已移除对应的PnMI片段的pT7PVM载体。pPV-AB755-1513和pPV-AB2470-3386是通过将来自pPV-AB的BsmI片段或NheI-EcoRI片段分别插入同等消化的pT7PVM载体而获得的。在pPV-AB1513-3386和pPV-AB755-2470中，pT7PVM的BsmI片段或NheI-EcoRI片段分别取代pPV-AB载体的对应片段。用pT7PVM的NheI-EcoRI片段取代pPV-AB1513-3386的NheI-EcoRI片段得到pPV-AB2470-3386。最后，pPV-AB2470-3386和pT7PVM的SnaBI-EcoRI片段的互相取代分别产生pPV-AB2954-3386和pPV-AB2470-2954。
双顺反子报告基因构建体的克隆是通过位点定向诱变首先在pHRPF-Luc中引入沉默突变来实现的，使用寡核苷酸Fluc-mutRI(+)/Fluc-mutRI(-)以突变萤火虫荧光素酶开放读码框中的EcoRI位点并产生pdiLuc-mRI。pT7PVM、pPV-AB1513-2470和pPV-AB2470-2954的衣壳区使用寡核苷酸RI-2A-P1wt(+)/P1wt-2A-RI(-)进行PCR扩增。pPV-AB2470-3386和pPV-AB2954-3386或pPV-AB的衣壳序列分别用 RI-2A-Plwt(+)/P1AB-2A-RI(-)或RI-2A-P1AB(+)/P1AB-2A-RI(-)进行扩增。PCR产物用EcoRI消化并插入pdiLuc-mRI中现在唯一的EcoRI位点以分另得到pdiLuc-PV、pdiLuc-AB1513-2470、pdiLuc-AB2470-2954、pdiLuc-AB2470-3386、pdiLuc-AB2954-3386和pdiLuc-AB。
寡核苷酸
使用下列寡核苷酸：
Fluc-mutRI(+)，5′-GCACTGATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGG-3′(SEQ ID NO：6)；Fluc-mutRI(-)，5，-CCAGTAGATCCAGAGGAGTTCATTATCAGTGC-3′(SEQ ID NO：7)；RI-2A-P1wt(+)，5，-CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCTCAGGTTTCATCACAGAAAGTGGG-3′(SEQ ID NO：8)；RI-2A-P1AB(+)，5，-CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCGCAAGTATCGTCGCAAAAAGTAGG-3(SEQ ID NO：9)；P1wt-2A-RI(-)，5，-TTCGAATTCTCCATATGTGGTCAGATCCTTGGTGG-AGAGG-3′(SEQID NO：10)；和PlAB-2A-RI(-)，5，-TTCGAATTCTCCATACGTCGTTAAATCTTTCGTCGATAACG-3′(SEQID NO：11)。
体外转录和RNA转染
由T7启动子驱动，2μgEcoRI线性化的质粒DNA在37。C下由T7RNA聚合酶(Stratagene)转录l h。根据DEAE-葡聚糖方法(Van der Werf等人，1986)的改良，使用lμg病毒或双顺反子转录物RNA转染35-mm直径板上的106个HeLa R19细胞。在室温下孵育30-min之后，移除上清液，然后将细胞在37℃下于2ml含有2％BCS的DMEM中孵育直至出现CPE，或将细胞在转染后冷冻4天用于进一步的传代。病毒滴度使用半固体覆盖的于极限Eagle培养基中的0.6％黄蓍胶(Sigma-Aldrich)通过标准的噬斑测定在HeLa R19细胞上确定。
密码子去优化的脊髓灰质炎病毒的设计和合成
产生了脊髓灰质炎病毒P1衣壳区的两种不同的同义编码(encoding)，各受不同的设计准则支配。设计限于衣壳，因为已结论性地显示完整的衣壳编码序列可从PV基因组中缺失或用外源序列取代而不影响所得子基因组复制子的复制(Johansen和Mollrow，2000；Kaplan和Racaniello，1988)。因此可以非常确定没有未鉴别的重要调节性RNA元件位于衣壳区，衣壳区可能被RNA序列的调节无意中影响。
第一个设计(PV-SD)试图使RNA碱基变化数最大而同时保留野生型P1区的准确密码子使用分布(图1)。为了实现这一点，通过查找位置和密码子之间最大权重的双向匹配(Gabow，1973)对各氨基酸进行同义密码子位置交换，其中每个位置-密码子对的权重是原始密码子和要取代它的同义候选密码子之间的碱基变化数。为了避免来自匹配算法的任何位置偏倚，在创建输入图之前，随机改变同义密码子位置的顺序，并且随后恢复所述位置。使用Rothberg最大双向匹配程序(Rothberg，1985)计算匹配。总计11个有用的限制酶位点，各有6个核苷酸，在病毒基因组序列中被锁定，以不参与密码子位置交换。密码子改组技术可能产生另外的限制位点，所述限制位点应优选地在所得的重新构建的全长基因组中保持唯一。为此，通过置换密码子进一步加工所述序列以消除不期望的位点。这造成了轻微地改变密码子频率分布的另外九种同义密码子变化。然而，没有密码子相对野生型序列的频率改变超过l。总的来说，与wtP1序列相比，2,643个核苷酸中的934个在PV-SD衣壳设计中发生了改变，但保持了衣壳编码结构域的相同的蛋白质序列(参见图l和2)。由于密码子使用没有改变，因此PVM-SD衣壳编码序列中的GC含量与wt的GC含量保持相同，为49％。
第二种设计(PV-AB)试图相对wt Pl区彻底地改变密码子使用分布。这一设计受表明密码子偏倚可影响组织特异性表达的近期工作(Plotkin等人，2004)的影响。期望的密码子使用分布衍生自先前描述的一组脑特异性基因中观察到的最不宜的密码子(Hsiao等人，2001；Plotkin等人，2004)。合成衣壳编码区，使在这组基因中观察到的各种特定氨基酸的最稀有的同义密码子的使用最大化(图1)。因为对于除了一个(Leu)之外的所有氨基酸而言，脑中最稀有的密码子普遍对应于所有人类基因中最稀有的密码子，实际 上，预期这一设计也将区分其他人类组织中的表达。总而言之，PV-AB衣壳在680个核苷酸位置中不同于wt衣壳(参见图2)。PVM-AB衣壳区中的GC含量与M中的49％相比，被降低至43％。
实施例2
密码子去优化对脊髓嵌质炎病毒的生长和感染性的影响
通过感染病灶测定来确定病毒滴度
感染的执行与标准的噬斑测定相同。孵育48或72h后，移除黄蓍胶覆盖，孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次，并用冷甲醇/丙酮固定30min。孔在含有10％BCS的PBS中封闭，然后与1：20稀释的抗-3D小鼠单克隆抗体125.2.3(Paul等人，1998)在37℃孵育1h。清洗之后，细胞与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)孵育，并使用Vector VIP底物试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)显现感染的细胞。计数染色的病灶，其等同于用wt病毒获得的噬斑，并且和噬斑测定规程中一样计算滴度。
密码子去优化的脊髓灰质炎病毒显示严重的生长表型
在两个初始衣壳ORF取代设计(图3A)中，仅PV-SD产生可生存的病毒。相反，用PV-AB RNA进行的四次独立转染未回收到可生存的病毒，即使在传代三轮之后(图3E)。显示引入PV-AB基因组的密码子偏倚太严格。因此，PV-AB衣壳编码序列的更小的部分被亚克隆至PV(M)背景以降低非优选密码子的有害效应。在这些亚克隆中，PV-AB2954-3386在RNA转染40h后产生CPE，而PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954分别需要转染后的一次或两次另外的传代(与野生型病毒的24h相比)。令人感兴趣的是，这些嵌合病毒代表具有原始AB序列的最小部分的三个亚克隆，这一观察结果表明非优选密码子数量和病毒适合度之间的直接关联。
所有可生存病毒变体的一步生长动力学通过感染性HeLa单层在感染复数(multiplicity of infection，MOI)为2下确定，用在RNA转染后最多两次传代之后获得的病毒细胞溶胞产物(图3B)。所述MOI的选择是由于PV-AB2470-2954的低滴度和消除浓缩和纯化接种体要求进一步传代的需要。 在所用的条件下，所有病毒至感染后24h产生完整的或接近完整的CPE。
尽管在其衣壳区有934个单点突变，PV-SD以wt能力复制(图3B)并产生与M相似大小的噬斑(图3D)。虽然PV-AB2954-3386以接近野生型的动力学生长(图3B)，PV-AB755-1513产生微小的噬斑和感染性低大约22倍的病毒(分别见图2、3B和F)。虽然能在高MOI感染中引起CPE(尽管延迟许多)(20至24h后80％至90％CPE)，但是PV-AB2470-2054在标准的噬斑测定的条件下根本没有产生噬斑(图3H)。因此这一病毒使用病灶形成测定来定量，其中在噬斑测定条件下孵育72h的感染细胞的病灶在它们被针对病毒聚合酶3D的抗体免疫组织化学染色之后计数(图3G)。感染48h后，Pv-AB2470-2954感染的病灶通常包括仅数十至数百个细胞(图3J)，病灶直径0.2至0.5mm，与wt的3-mm噬斑相比(图3C和D)。然而，在另外24h后，病灶的直径显著增加(2至3mm；图3G)。当HeLa细胞是用PV-AB755-1513和PM-AB2470-2954以MOI为1进行感染时，CPE分别在12和18h之间以及3和4天之间出现，与wt的8h相比(数据未显示)。
为了定量蛋白质编码序列中特定的密码子偏倚的累积效应，计算了相对密码子去优化指数(RCDI)，其是针对人类基因组中总的密码子分布的比较性量度。RCDI为1/密码子表明基因遵循正常的人类密码子频率，而与正常人类密码子偏倚的任何偏差造成RCDl高于1。RCDI使用以下公式得到：
RCDI＝[∑(CiFa/CiFh)·Nci]/N(i=1至64)。
CiFa是测试序列中各密码子f占相同氨基酸的所有同义密码子的观察的相对频率(0至1)；CiFh是人类基因组中观察到的各密码子i占该氨基酸的所有同义密码子的正常相对频率(0.06至1)；Nci是所述密码子i在序列中的发生次数；且N是序列中的密码子(氨基酸)总数。
因此，序列中高数量的稀有密码子造成更高的指数。使用此公式，各种衣壳编码序列的RCDI值计算为PV(M)和PV-SD的是1.14，这非常接近于正常的人类分布。AB构建体的RCDI值是PV-AB755-1513的1.73、PV-AB2470-2954的1.45和母体PV-AB的6.5l。为了比较，可能是了解最清楚的密码子优化的蛋白质“人源化”绿色荧光蛋白(GFP)的RCDI是1.31， 与原始Aequora victoria gfp基因的RCDI为1.68相比(Zolotukhin等人，
1996)。根据这些计算，RCDI＜2的衣壳编码序列与可生存的病毒表型相关，而RCDI＞2(PV-AB＝6.51、PV-AB1513-3386＝4.04、PV-AB755-2470＝3.61)造成致死表型。
实施例3
密码子去优化对脊髓灰质炎病毒的比感染性的效应
病毒微粒的分子定量：直接OD260吸光度法
HeLa细胞的15厘米盘状物(dishes)(4×107个细胞)用PV(M)、PV-AB755-1513或PV-AB2470-2954以0.5的MOI感染，直至发生完整的CPE(过夜对比4天)。细胞相关的病毒通过三个连续的冷冻/融化周期释放。细胞溶胞产物通过在2,000×g下离心10min，然后进行第二次10-main离心(14,000×g下10min)来澄清。上清液在室温、10μg/ml RNA酶A(Roche)存在下孵育1h，以消化任何额外的病毒或细胞RNA。添加0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和2mM EDTA之后，将含有病毒的上清液覆盖于6-mi蔗糖垫(于汉克斯平衡盐溶液[HBSS]中的30％蔗糖；Invitrogen，Carisbad，CA)上。病毒微粒通过使用SW28吊桶式转头(swinging bucket rotor)在28,000rom下超速离心4h来沉积。弃去上清液，离心管用HBSS润洗两次并保持蔗糖垫完整。除去最后一次洗液和蔗糖垫之后，将病毒沉淀重悬于含有0.2％SDS和5mM EDTA的PBS中。病毒感染滴度通过噬斑测定/感染病灶测定(参见上文)来确定。病毒微粒浓度用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies，Inc.，wilmington，DE)在260am光密度(OD260)下确定，并使用公式1 OD260单位＝9.4×1012微粒/ml(Raeckert，1985)计算。此外，病毒粒子RNA通过三轮苯酚提取和一轮氟仿提取来提取。RNA用乙醇沉淀，并重悬于超纯水。RNA纯度通过TAE缓冲的琼脂糖凝胶分析确认，浓度使用分光光度方法确定。对应的病毒制品的基因组等同物的总数量经由确定的RNA浓度和所述RNA的分子量计算。因此，可计算每感染单位的病毒粒子的相对量，假定一个RNA酶保护的病毒基因组等同物对应于一个病毒微粒。
病毒微粒的分子定量：ELISA方法
Nunc Maxisorb96孔板在37℃下用100μl PBS中的10μg兔抗-PV(M)抗体(Murdin和wimmeF，1989)包被2h并在4℃下包被另外14h，然后所述板用350μl PBS短暂地清洗三次，并用350μl于PBS中的10％小牛血清在37℃下封闭l h。用PBS短暂地清洗三次之后，孔与于DMEM加2％BCS中的100μl含有病毒的细胞溶胞产物或对照在室温下孵育4h。孔用350μl PBS清洗三次，每次5min。孔然后在室温下与于100μlDMEM-10％BCS中的2μg CD155-碱性磷酸酶(AP)融合蛋白(He等人，2000)孵育4h。用PBS清洗五次，最后一次清洗之后，添加100μ110mM Tris，pH7.5，并且将板在65℃下孵育l h。比色碱性磷酸酶测定通过添加100μl9mg/ml磷酸对硝基苯酯(于2M二乙醇胺、1mM MgC12，pH9.8)来完成。确定碱性磷酸酶活性，并计算病毒微粒浓度，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)板阅读仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，在405-nm波长下，根据使用两倍系列稀释的已知浓度的纯化PV(M)病毒贮液平行制备的标准曲线。
PFU/微粒比值在密码子去优化的病毒中被降低
PV-AB2470-2954在细胞培养物中极差的生长表型和它不能形成噬斑表明细胞至细胞传播中的缺陷，这可与个体病毒微粒的更低的比感染性一致。
为了测试这一假设，纯化PV(M)、PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954病毒，并且使用分光光度方法确定病毒微粒的量。纯化的病毒制品通过测量OD260直接定量，并根据公式1OD260单位＝9.4×1012微粒/ml计算微粒浓度(图4D)(Ruecken，1985)。另外，从这些病毒粒子中提取基因组RNA(图4A)并在OD260下定量(数据未显示)。然后经由基因组RNA的2.53×106g/mol的分子大小确定病毒粒子的数量(1病毒粒子＝1基因组)。特别地，从4×107HeLa细胞制备病毒，所述细胞以0.5MOI的病毒感染直至出现完整的CPE，如上所述。微粒确定的两种方法产生相似的结果(图4D)。实际上，发现PV(M)和PV-AB755-1513产生大致相等量的病毒粒子，而PV-AB2470-2954与PV(M)相比产生介1/3(通过直接UV方法(图4D)至1/8(通过基因组RNA方法[数据未显示])的病毒粒子数量。相反，wt病毒样 品对应于分别比PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954高大约30倍和3，000倍的感染单位(图4D)。此外，纯化的病毒粒子的衣壳蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)解析(resolve)，并通：过银染色显现(图4B)。这些数据还支持以下结论：在每细胞基础上，PV-AB2470-2954和PV-AB755-1513产生相似的或仅轻微地降低的每细胞后代量(图4B，泳道3)，而它们的PFU/微粒比值被降低。病毒的PFU/微粒比值可依赖于确定噬斑(用于噬斑测定的细胞类型和具体的噬斑测定技术)或微粒计数(分光光度术或电子显微术)的方法而显著不同。PV1(M)的1/115的PFU/微粒比值是使用本文所述的方法确定的，其可与1/272(Joklik和Darnell，1961)(在HeLa细胞上进行)和1/87(Schwerdt和Fogh，1957)(在原代猴肾细胞中)的先前确定值很好地比较。
病毒粒子特异性ELISA的开发
为了确认观察到的密码子去优化的脊髓灰质炎病毒的降低的PFU/微粒比值，开发了新的病毒粒子特异性ELISA(图4C和E)作为确定样品中完整病毒微粒的物理量而不是感染滴度的方法，感染滴度是生物变量。测定是基于先前的观察结果，即，融合于热稳定的胎盘碱性磷酸酶的PV受体CD155的胞外域(CD155-AP)非常紧密和特异性地结合完整的160S微粒(He等人，2000)。考虑到PV130S微粒(A微粒)丧失了它们的有效结合CD155的能力(Hogle，2002)，预期没有其他衣壳中间物或衣壳亚基将与CD155-AP相互作用，从而确保了完整微粒的特异性。支持这一观念，用表达P1衣壳前体的牛痘病毒株系感染的细胞(Ansardi等人，1993)的溶胞产物造成没有可计量的信号(数据未显示)。
ELISA方法允许定量粗样品诸如感染后的细胞溶胞产物中的病毒微粒，其应使在样品操作和纯化过程中的其他机制(热/化学灭活、氧化、降解等)造成的PFU/微粒比值的可能改变最小化。在目前条件下，此测定的灵敏度是大约107个病毒微粒，因为其中没有包括信号扩增步骤。这依次造成异常低的背景。使用此ELISA，样品中的PV微粒浓度可通过在用已知浓度的纯化PV(M)制备的标准曲线上反算来确定(图4E)。通过ELISA确定微粒与通过直接UV方法获得的结果很好地相符(图4D)。
结果的含义 
本研究已通过从头基因合成产生减毒病毒证实了PV衣壳编码序列的大规模密码子去优化的效用。初始目标是探索此技术作为产生活的减毒病毒疫苗工具的可能。发现密码子去优化的病毒具有非常低的比感染性(图4)。此低比感染性(即单个病毒微粒在细胞中成功启动感染性周期的机会)造成宿主内传播更慢的病毒感染。这依次允许宿主生物体有更多时间装配免疫应答和清除感染，这是减毒病毒疫苗中非常期望的特征。另一方面，密码子去优化的病毒与野生型病毒相比每细胞产生相似量的后代，而感染性低2至3个数量级(图4)。这允许以和wt病毒本身的产生一样有效和经济的方式产生抗原性与wt不可区分的病毒微粒。然而，由于低比感染性，此病毒制品的实际操作和加工要安全得多。因为对在高安全条件(containment condition)下生产大量的致病性病毒和来自生产设施的偶然或恶意的病毒逃逸的相关风险的关注不断增加，所以本文描述的病毒作为生产灭活的病毒疫苗的更安全的替代方法可证明是非常有用的。因为它们在蛋白质水平是与wt病毒l00％相同的，所以保证了在接受灭活的病毒的宿主中相同的免疫应答。
实施例4
密码子去优化对脊髓灰质炎病毒神经致病性的效应
小鼠神经致病性测试
对各组的介于6和8周龄之间的四到五只CD155tg小鼠(株系Tg21)(Koike等人，1991)大脑内注射于30μl PBS中的介于102和106PFU/病灶形成单位(focus-forming units，FFU)之间的病毒稀释液。百分之五十致死剂量(LD50)值通过Reed和Muench(1938)的方法计算。死亡或瘫痪时间脊髓组织中的病毒滴度通过噬斑或感染病灶测定来确定。
在微粒基础上密码子去优化的脊髓灰质炎病毒在CD155tg小鼠中被神经减毒(neuroattenuated)
为了测试本研究中构建的病毒的致病性潜能，CD155转基因小鼠fKoike等人，1991)以介于102和105PFU/FFU之间的剂量大脑内注射PVfM)、PV-SD、PV-AB755-1513和PV-AB247-2954。初始结果令人困惑，因为 非常违反直觉地，PV-AB755-1513并且尤其是PV-AB2470-2954最初被发现与wt病毒具有一样的神经致病性，或甚至具有比M病毒略高的神经致病性。
参见表4。
aLD50表示为大脑内接种后造成50％致死性的感染单位数，如通过噬斑或感染病灶测定来确定的。
bLD50表示为大脑内接种后造成50％致死性的病毒微粒数，如通过OD260测量来确定的。
c死亡或瘫痪时从感染小鼠的脊髓中回收的病毒；以PFU或FFU/g组织表示，如通过噬斑或感染病灶测定所确定的。
d死亡或瘫痪时从感染小鼠的脊髓中回收的病毒；以微粒/g组织表示，通过将第三列中的值乘以各种病毒特征性的微粒/PFU比值衍生而来(图4D)。
此外，用PV-AB755-1513和Pv-AB2470-2954感染后瘫痪发作的次数与wt病毒的相当(数据未显示)。相似地令人费解的是观察到在死亡或瘫痪时，用Pv-AB755-1513和Pv-AB2470-2954感染的小鼠的脊髓中的病毒载量(如通过噬斑测定所确定的)分别比用wt病毒感染的小鼠中的那些低30倍和300倍(表4)。因此，表观地以仅wt病毒的0.3％复制的PV-AB2470-2954将具有与wt相同的神经致病潜能看起来是不可能的。然而，在已经确定PV-AB755-1513和Pv-AB2470-2954中改变的PFU/微粒关系(参见实施例3)之后，接种物的量现在可与接种的实际的微粒数关联起来。执行此校正后，确定在微粒基础上，PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954与wt相比分别是20倍和100倍神经减毒的。参见表4。此外，在微粒基础上，瘫痪小鼠脊髓中的病毒载量在所有三种病毒中是非常相似的(表4)。
还得出结论，不可能用同义密码子重新设计出特异性区别针对中枢神经系统的表达的PV衣壳基因。这可能是因为其他人(P10tkin等人，2004)描述的密码子偏倚的组织特异性差异太小，以致不能产生组织限制性病毒表型。在比Plotkin等人所使用的更大的一组脑特异性基因中，未检测到可 感知的组织特异性密码子偏倚(数据未显示)。然而，此结论不应有损于本发明方法产生的脊髓灰质炎病毒确实在小鼠中被神经减毒高达l00倍的系数的事实。就是说，在中枢神经系统中造成与wt病毒相同的损害需要100倍更多的密码子或密码子对去优化的病毒微粒。
实施例5
密码子去优化对脊髓灰质炎病毒的基因组翻译的效应
体外和体内翻译
本研究中使用了两种不同的HeLa细胞S10细胞质提取物。标准提取物通过Molla等人(1991)的方法制备。[35S]甲硫氨酸标记的翻译产物通过凝胶放射自显影分析。第二种提取物如先前所述(Kaplan和Racaniell0，1988)制备，除了不透析，并且不用微球菌核酸酶移除内源细胞mRNA。与改良的提取物的反应不补充外源氨基酸或tRNA。翻译产物通过用抗-2C单克隆抗体91.23的蛋白质印迹(Pfister和Wiminer，1999)分析。2BC条带的相对强度通过使用NIH-Image1.62软件的扫描凝胶图像的像素计数确定。在所有情形中，翻译反应编程为用200ng各种体外转录的病毒基因组RNA。
对于体内翻译分析，用如上文所述的体外转录的双顺反子复制子RNA转染HeLa细胞。为了评估与RNA复制分开的翻译，转染在2mM盐酸胍存在下执行。在被动裂解缓冲液(Promega，Madison，W1)中7h之后，细胞被裂解，然后进行双重萤火虫(F-Luc)和Renilla(R-Luc)荧光素酶测定(Promega)。第二顺反子(P1-Fluc-P2-P3多蛋白)的翻译效率通过除以在丙型肝炎病毒(HCV)内部核糖体进入位点(IRES)控制下表达的第一顺反子的Renilla荧光素酶活性来归一化。
密码子去优化的病毒在基因组翻译水平是缺陷的
因为合成病毒和wt PV(M)在其蛋白质组成上是不可区分的，并且没有已知的基于RNA的调节元件在改良的RNA基因组中被改变，所以这些设计允许研究降低的基因组翻译/复制对减毒的效应，而不影响所述病毒的细胞和组织向性或免疫学性质。PV-AB基因组是根据以下假设设计的：向衣壳编码序列中引入许多次优的密码子应导致基因组翻译降低。因为Pl区 位于多蛋白的N-末端，所以所有下游非结构蛋白质的合成由通过Pl区的翻译速率决定。为了测试事实上翻译是否受到影响，执行了体外翻译(图5)。
出乎意料地，对于测试的任何基因组，标准的基于HeLa细胞的细胞质S10提取物(Molla等人，1991)中的初始翻译未显示翻译能力的差异(图5A)。然而，由于此翻译系统为最大化翻译进行了优化，因此它包括过量氨基酸和tRNA的外源添加，这可令人信服地补偿遗传加工的密码子偏倚。因此，用改良的HeLa细胞提取物重复了体外翻译，所述改良的HeLa细胞提取物未进行透析，并且其中未通过微球菌核酸酶处理移除细胞mRNA(图5B)。此提取物中的翻译在不添加外源tRNA或氨基酸下执行。因此，产生了更密切类似于感染细胞中的环境，在感染细胞中，PV基因组的翻译仅依靠细胞供应并与细胞mRNA竞争资源。由于未透析的提取物中细胞mRNA的高背景翻译和低[35S]Met掺入速率，通过用抗-2C抗体的蛋白质印迹(Pfister和Wimmer，1999)检测一组病毒特异性翻译产物。这些改良的条件造成改良的基因组的翻译效率显著降低，这与去优化的序列的程度有关。虽然PV-SD的翻译与wt的相当，但是三种无感染性的基因组PV-AB、PV-AB1513-3386和PV-AB755-2470的翻译被降低大约90％(图5B)。
Bums等人(2006)最近报告了与本文所述的那些相关的实验。这些作者改变密码子使用的程度远低于本研究中的程度，并且他们的突变体病毒没有表达致死表型。令人感兴趣地，Bums等人确定翻译在他们的突变体病毒的改变的表型中不起主要作用，这一结论与本文呈现的数据有差异。很可能是Bums等人(2006)使用的体外翻译测定(其采用补充有未感染的HeLa细胞提取物和过量的氨基酸的核酸酶处理的兔网织红细胞溶胞产物)解释了他们未能检测到翻译的任何显著降低的原因。Cf.图5A。
考虑到体外翻译系统最终的人工本质，还研究了各种衣壳设计对细胞中翻译的效应。为此，基于先前报告的双顺反子复制子(Zhao和Wimmer，2001)构建了双顺反子脊髓灰质炎病毒报告基因复制子(图6A)。各种Pl盒插入萤火虫荧光素酶(F-Luc)基因的紧上游并符合读码框架。因此，脊髓灰质炎病毒IRES驱动类似于病毒基因组中的病毒多蛋白的单个病毒多蛋白 的表达，除了衣壳和2Apro蛋白酶之间的萤火虫荧光素酶蛋白质之外。Renilla荧光素酶(R-Luc)基因在HCV IRES控制下的表达提供内部对照。所有实验在2mM盐酸胍存在下执行，其完全阻断基因组复制(Wimmer等人，1993)。使用这种类型的构建体允许通过计算F-Luc/R-Luc比值来准确确定第二顺反子的相对表达。由于F-Luc表达依赖于核糖体成功转运通过上游Pl区，因此它提供插入的Pl序列对多蛋白翻译速率的效应的量度。使用此方法，确实发现改良的衣壳编码区(其与病毒背景(如PV-AB、PV-AB1513-2470和PV-AB2470-3386)中的致死表型相关)使翻译速率降低大约80％至90％(图6B)。两种可生存病毒构建体PV-AB2470-2954和PV-AB2954-3386的衣壳分别被允许以wt水平的68％和83％翻译。在介于3和12h的时间段内，第一顺反子的体内翻译速率在所有构建体中保持恒定，表明RNA稳定性不受密码子变化的影响(数据未显示)。最后，这些实验的结果表明脊髓灰质炎病毒极其依赖于非常有效的翻译，因为经过Pl区的翻译效率的30％的相对较小的下降(如见于PV-AB2470-2954)造成严重的病毒复制表型。
实施例6
密码子去优化的脊髓灰质炎病毒的遗传稳定性
由于对表型有贡献的大基因组区段上的许多突变的分布效应，密码子去优化的病毒应具有遗传稳定的表型。为了研究密码子去优化的病毒的此遗传稳定性，并测试这些病毒是遗传稳定的假设，将病毒在合适的宿主细胞中传代。疫苗设计的目前的“凌迟处死”(Death by1000cuts)理论的优点是降低的回复突变至野生型的风险。通常的疫苗株系与wt病毒仅有少量点突变差异，并且这些中仅有一小部分可实际上对减毒有贡献。病毒进化快速起作用以将此少量的起作用的突变进行回复突变。确实，此回复突变给世界卫生组织(WHO)从全球根除脊髓灰质炎病毒的计划带来了严重威胁。只要使用活疫苗株系，就有非常真实的此株系将回复突变至wt的机会。此回复突变作为新的脊髓灰质炎爆发的来源已被观察(Georgescu等人，1997；Kew等人，2002；Shimizu等人，2004)。
由于本发明的合成设计具有数百至数千个点突变，其几乎没有回复突变至wt株系的风险。然而，自然选择是强大的，并且传代后，所述合成病毒不可避免地进化。正继续进行研究以确定此进化的终点，但是很可能的结果是它们陷于局部的最优，而与原始设计相差不远。
为了验证这一理论，将代表性的重新加工的病毒在宿主细胞中传代多达50次。在10、20和50次传代后，对进化的病毒的基因组测序。更具体地，选择来自各类型的去优化的病毒的至少一个示例性嵌合体。此起始嵌合体非常虚弱，但并不死亡。例如，对于PV，所述嵌合体可以是PV-AB2470-2954和PV-Min755-2470。从每种起始病毒中选择10个噬斑。这10个噬斑衍生的病毒群体的各个群体批量传代总计50次。在第10、20和50次传代后，再次选择10个噬斑纯化的病毒，并且其基因组与所述10个母体病毒的基因组一起测序。传代后，通过检查噬斑大小并确定噬斑形成单位/m1作为一步生长动力学，比较了40个(每个母体病毒30+10个)选择的病毒与其母体的适合度。测试选择传代的分离株在合适的宿主生物体中的致病性。例如，测试脊髓灰质炎病毒在CD155tg小鼠中的致病性。
根据基因组的测序，所有10个病毒系具有某些共同的突变的发现将表明这些变化对病毒适合度是特别重要的。这些变化可与通过趾纹法鉴别为主要的暂停位点的位点(参见实施例9)进行比较；两种类型的测定的结合可鉴别对病毒适合度最有害的突变体密码子。相反，不同系具有全然不同的突变的发现将支持突变体密码子变化中的许多变化在其对适合度的效应上非常相似的观点。迄今为止，在HeLa细胞中传代10次后，PV-AB755-1513和PV-AB2470-2954未经历任何可察觉的适合度增加。病毒感染滴度保持和传代实验开始时一样低(107PFU/ml和106FFU/m1)，并且噬斑表型没有改变(数据未显示)。对这些传代的病毒的序列分析正在进行，以确定传代过程中是否发生遗传变化以及发生什么类型的遗传变化。
Bums等人(2006)报告在HeLa细胞中进行25次连续传代的过程中，他们的改变的密码子组成很大程度上是保守的。他们发现，虽然随着传代次数的增加，未改良的Sabin2病毒和密码子取代的病毒二者在HeLa细胞中复制的适合度均增加，但是所述改良的病毒的相对适合度保持低于未改 良的病毒的相对适合度。因此，所有迹象表明，通过SAVE重新设计的病毒在遗传上是非常稳定的。本发明的密码子和密码子对去优化的病毒的初步数据表明，分布于大量密码子的较低严重度的密码子变化改善了个体病毒表型的遗传稳定性，并因而改善了它们用于疫苗的潜能。
实施例7
通过去优化密码子对重新加工脊髓灰质炎病毒的衣壳区
密码子对偏倚的计算。
可能的3721种含有非“终止"的密码子对(如GTT-GCT)中的每个个体密码子对携带对于给定的基因“训练组”特异的指定的“密码子对得分”或“CPS”。给定密码子对的CPS定义为观察的发生次数与预期在此组基因中发生的次数(在此实施例中为人类基因组)的log比值。确定特定密码子对的实际发生次数(或换言之，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)只是计数密码子对在特定组的编码序列中发生的实际次数。然而，确定预期的次数需要另外的计算。与Gutman和Hatfield相似地，预期的次数计算为独立于氨基酸频率和密码子偏倚。就是说，预期的频率是基于氨基酸由具体密码子编码的次数的相对比例计算的。正的CPS值意味着给定的密码子对是统计学过表现的，而负的CPS表明所述对在人类基因组中是统计学低表现的。
为了在人类环境中执行这些计算，使用了一致性注释人类编码区的最新的共有序列CDS(CCDS)数据库，含有总计14,795个基因。此数据集提供密码子和密码子对和由此的基因组水平的氨基酸和氨基酸对频率。
使用Federov等人(2002)的范例以进一步增强Gutman和Hatfield(1989)的方法。这允许独立于密码予频率和编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机缔合(association)来计算给定密码子对的预期频率。
S ( P ij ) = 1 n ( N o ( P ij ) N E ( P ij ) ) = 1 n ( N o ( P ij ) F ( C i ) F ( C j ) N o ( X ij ) )
在所述计算中，Pij以频率No(Pij)在其同义组中发生的密码子对。Ci 和Cj是分别以频率F(Ci)和F(Cj)在其同义组中发生的包含Pij的两个密码子。更明确地，F(Ci)是对应的氨基酸Xi遍及所有编码区由密码子Ci编码的频率，并且F(Ci)＝No(Ci)/No(Xi)，其中No(Ci)和No(Xi)分别是观察的密码子Ci和氨基酸Xi的发生次数。相应计算F(Cj)。此外，No(Xij)是氨基酸对Xij遍及所有编码区的发生次数。Pij的密码子对偏倚得分S(Pij)计算为观察的频率No(Pij)与Ne(Pij)的预期发生次数的对数优势(log-odds)比值。
使用上述公式，然后确定了个体编码序列中的个体密码子对在与对应的基因组Ne(Pij)值相比时是过表现的还是低表现的，基因组Ne(Pij)值是通过使用完整的人类CCDS数据集计算的。此计算得到正的S(Pij)得分值代表人类编码区中过表现的密码子对，而负值代表低表现的密码子对(图7)。
个体编码序列的““组合”密码子对偏倚通过根据下列公式将所有密码子对得分平均来计算：
S ( P ij ) = Σ i = 1 k S ( Pij ) l k - 1 .
完整编码区的密码子对偏倚由此通过将包含此区域的所有个体密码子对得分相加，并将此和除以编码序列长度来计算。
密码子对偏倚的改变。
重新加工PV(M)的衣壳编码区以改变密码子对偏倚。引入最大可能数目的稀少使用的密码子对(生成病毒PV-Min)或最大可能数目的常用密码子对(生成病毒PV-Max)，同时保留wt病毒基因组的密码子偏倚和所有其他特征。下文详细解释了我们的方法。
设计两种序列，来以正方向(PV-Max；SEQ ID NO：4)和负方向(PV-Min；SEQ ID NO：5)改变脊髓灰质炎病毒Pl区密码子对得分。通过保持氨基酸序列不变和密码子偏倚最小地改良，使用模拟退火算法来改组密码子，优化目标是最小或最大的Pl衣壳区密码子对得分。加工所得序列以消除剪接位点和降低局部二级结构。然后由商业供应商Blue Heron Biotechnology合成这些序列并进行序列验证。经由两个PflMI限制位点使用新的衣壳基因取代wt PV的感染性cDNA克隆中的相等wt序列。病毒如实施例l中 所述进行衍生。
对于PV-Max病毒，感染细胞的死亡见于24h后，此结果与wt病毒获得的类似。PV-Max的最大病毒滴度和一步生长动力学也与wt相同。相反，在用PV-Min突变体RNA转染的细胞中没有细胞死亡产生，并且没有回收到可生存的病毒。转染重复多次得到了相同的结果。PV-Min转染细胞的溶胞产物经受四次连续的盲传，但仍然没有获得病毒。
PV-Min的衣壳区被分为两个更小的子片段(PV-MinTM和PV-Min247-3386)，像对PV-AB的操作一样(不良的密码子偏倚)，并将所述子片段克隆至wt背景。和PV-AB亚克隆一样，PV-Min的亚克隆非常不健全，但是没有死亡(图8)。和对PV-AB病毒的观察一样，PV-Min病毒的表型是降低的病毒微粒的比感染性的结果，而不是降低后代病毒的产生。正在进行的研究包括在CD155tg小鼠中测试密码子对减毒的嵌合体以确定它们的致病性。同样地，正在制备包含PV-Min cDNA的亚克隆的另外的嵌合病毒，并确定它们复制的能力(参见下面的实施例8和9)。同样地，确认了在较长序列上分布中间量的密码子对偏倚的效应。例如，设计具有约-0.2的密码子对偏倚(PV-0.2；SEQ ID NO：6)的脊髓灰质炎病毒衍生物，并且从野生型的突变分布在Pl衣壳区的全长。这与PV-MinZ(PV-Min2470-3386)相反，其具有相似的密码子对偏倚，但是密码子变化分布在较短的序列。
值得指出的是，PV-Min和PV-0.2是其中密码子使用相对于野生型几乎没有变化的序列。对于大部分来说，序列采用野生型PV(M)病毒中发生的相同密码子。PV-MinZ稍微有些不同，因为它含有亚克隆至PV(M)的PV-Min的部分。与PV-Min和PV-0.2一样，所编码的蛋白质序列没有改变，但是如在亚克隆区中或完整的Pl衣壳区上所确定的，其密码子使用与PV-Min(或PV-0.2)不相同，因为仅有密码子重排的序列(其在其全长上具有相同密码子，但在较小的区段内则不是)的一部分被置换到PV(M)野生型序列。当然，突变的衣壳序列可设计为在完整的P l基因具有密码子对偏倚，而仅在核苷酸2470-3386的区域中改组密码子。
实施例8
通过改变密码子对偏倚构建的病毒在CD155tg小鼠中是减毒的
小鼠大脑内注射，存活率
为了测试PV-Min755-2470和PV-Min2470-3385在动物模型中的减毒，这些病毒被纯化并大脑内注射入CD155(PVR/脊髓灰质炎病毒受体)转基因小鼠(参见表5)。确实这些病毒由于使用我们的算法定制了密码子对偏倚而显示显著减毒的表型。PVM-wt未注射更高剂量，因为以10e5个病毒粒子攻击的所有小鼠由于PVM-wt而死亡。此减毒的表型是由于使用我们的算法定制的密码子对偏倚。这再次确认了定制密码子对偏倚适用于作为产生活疫苗的手段。
这些发现具有两个方面的重要意义。首先，它们是第一项清晰的实验证据，表明密码子对偏倚是功能重要的，即可通过扰乱密码子对偏倚产生有害的表型。第二，它们提供了可用来减毒病毒的同义密码子变化的另外的维度。这些密码子对减毒的嵌合体的体内致病性已在CD155tg中进行了测试，并显示减毒的表型(参见表5)。包含PV-Min衣壳cDNA亚克隆的另外的嵌合病毒已进行了在感染的细胞中的复制的测定，并且也已显示减毒的表型。
实施例9
构建具有改变的密码子对偏倚的合成脊髓灰质炎病毒：对疫苗开发的暗示
计算密码子对偏倚，执行算法以产生密码子对去优化的序列。
我们开发了定量密码子对偏倚的算法。每个可能的个体密码子对被给定一个“密码子对得分”或“CPS，。我们将CPS定义为每个密码子对在所有人类编码区中观察到的发生次数与预期发生次数的比值的自然对数。
CPS = 1 n ( F ( Ab ) o F ( A ) × F ( B ) F ( X ) × F ( Y ) × F ( XY ) )
虽然特定密码子对的观察发生的计算是直接的(在基因集合内的实际计数)，但是密码子对的预期发生次数需要另外的计算。我们将此预期次数计算为独立于氨基酸频率和密码子偏倚二者，这与Gutman和Hatfleld相似。就是说，预期的频率是基于氨基酸由具体密码子编码的次数的相对比例计算的。正的CPS值意味着给定的密码子对是统计学过表现的，而负的CPS表明所述对在人类基因组中是统计学低表现的。
使用这些计算的CPS，然后任何编码区可通过获得密码子对得分的平均值，进而给出完整基因的密码子对偏倚(CPB)而被检定为使用过表现或低表现的密码子对。
CPS = Σ i = 1 k CPSi k - 1
已使用所示等式计算所有注释的人类基因的CPB并制图(图7)。图中的每个点对应于单个人类基因的CPB。分布的峰值具有0.07的正的密码子对偏倚，这是所有注释的人类基因的平均得分。另外还有非常少的基因具有负的密码子对偏倚。然后使用确立的定义和计算CPB的等式来操作此偏倚。
开发和执行基于计算机的算法以产生密码子对去优化的序列。
使用这些公式，我们接下来开发了基于计算机的算法以操作任何编码区的CPB而保持原始氨基酸序列。所述算法具有关键的能力来保持基因的密码子使用(即保留每个现有密码子的使用频率)，但“改组”现有密码子以增加或减少CPB。所述算法使用模拟退火，一种适于全长优化的数学过程(Park，S.等人，2004)。其他参数也处于此算法的控制之下；例如，RNA折叠的自由能。此自由能被保持在窄范围内以防止密码子重排造成的二级结构的大变化。优化过程特异性地排除生成具有大的二级结构诸如发夹或茎环的任何区域，否则其可能产生于定制的RNA中。使用此计算机软件， 用户只需输入给定基因的cDNA序列，即可定制实验者认为适合的所述基因的CPB。
由过表现或低表现的密码子对编码的Pl的从头合成。 
为了获得其P1由过表现或低表现密码子对编码的新的合成脊髓灰质炎病毒，我们向我们的程序输入了对应于脊髓灰质炎病毒I型Mahoney(Pv(M)-wt)的Pl结构区的DNA序列，产生使用过表现密码子对(566个突变)的PV-Max-P l和使用低表现密码子对(631个突变)的PV-Min-P1。这些定制的、新的合成P-1区域的CPB得分为PV-Max＝十0.25和PV-Min＝-0.48，而PV(M)-wt的CPB是-0.02(图7)。，
另外的定制包括将设计的限制位点以给定的间隔包括于两种合成序列，以允许亚克隆Pl区。这些合成的Pl片段通过Blue Herron Corp.从头合成，并掺入脊髓灰质炎病毒的全长cDNA构建体(图11)(Karlin等人，1994)。在两种构建体中，均在AUG起始密码子后保留PV(M)-wt序列的小片段(3个密码子，9个核苷酸)，以允许所有合成病毒相等地启动翻译；从而提供CPB对翻译延伸期的效应的更准确测量。
DNA合成、质粒、合成衣壳的亚克隆和细茵。
大的密码子对改变的PV cDNA片段，对应于PV基因组的核苷酸495至3636，通过Blue Heron Cor0.合成，使用他们的专有系统(htto：//WWW.blueheronbio.com/)。所有后续的脊髓灰质炎病毒cDNA克隆/亚克隆是使用唯一限制位点从PVl(M)cDNA克隆pT7PVM构建的(van derWen等人，1986)。全长PV-Min、PV-Max盒经由PflMI消化从Blue Heron的运载载体释放，并插入移除了其PflMI片段的pT7PVM载体。PV-MinXY和PV-MinZ构建体通过同时用NheI和BglII消化，然后将此片段与相似地消化的pT7PVM载体交换获得。PV-MinXY和PV-MinZ经由BsmI消化并将所述片段/载体与相似地消化的pT7PVM交换而构建。PV-MinY是通过用BsmI消化PV-MinXY构建体并将此片段与消化的pT7PVM的BsmI片段交换而构建的。质粒转化和扩增均经由大肠杆菌DH5α实现。
含有CPB改变的衣壳区的嵌合病毒的创建：遍及Pl的低表现密码子 对偏倚造成无效表型。
使用位于脊髓灰质炎病毒基因组序列上游的T7RNA聚合酶启动子，转录正义RNA。1.5μg来自上文的给定质粒cDNA克隆经由EcoRI消化线性化，然后由位于所述cDNA上游的T7RNA聚合酶(Stratagene)的启动子驱动，经由T7RNA聚合酶在370C下2小时转录成RNA(van der Werf等人，1986)。使用改良的DEAE-葡聚糖方法(van der Werf等人，1986)将此RNA转染入l x106个HeLa R19细胞。然后将这些细胞在室温(RT)下孵育30分钟。移除转染上清液，并添加含有2％小牛血清(BCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，细胞在370C下孵育，并观察(多达4天)细胞病变效应(CPE)的发作。
PV-Max RNA转染在24小时内产生90％细胞病变效应(CPE)，这与PV(M)-wt RNA的转染相当。Pv-Max病毒产生大小与野生型相同的噬斑。相反，PV-Min RNA在96小时后未产生可见的细胞病变效应，并且即使在将转染细胞的上清液进行四次盲传后仍未分离到可生存的病毒。
随后使用经受PV-Max RNA转染的细胞的上清液也在12小时内产生95％CPE，因此表明转染的基因组材料成功产生PV-Max脊髓灰质炎病毒病毒粒子。相反，PV-Min病毒RNA在96小时后未产生可见的CPE，并且将可能含有极低水平的病毒的上清液进行四次盲传也未产生CPE。因此，在Pl区利用低表现密码子对的全长PV-Min合成序列不能产生可生存的病毒，所以它需要进行亚克隆。
HeLa R19细胞在含有10％BCS的DMEM中保持为单层。病毒扩增使用1M.O.I在(1.0 ×108个细胞)HeLa R19单层上实现。感染的细胞在37℃C下于含2％BCS的DMEM中孵育三天，或至观察到CPE。三个冷冻/融化周期后经由低速离心从溶胞产物中移除细胞碎片，并且将含有病毒的上清液用于进一步的实验。
一步生长曲线通过以下实现：用5M.O.I的给定病毒感染HeLa R19细胞的单层，移除接种物，细胞用PBS清洗2x，然后在37℃C下孵育0、2、4、7、10、24和48小时。然后经由噬斑测定分析这些时间点。所有噬斑测定在HeLa R19细胞的单层上执行。将这些细胞用给定生长曲线时间点 的系列稀释液或纯化的病毒感染。然后将这些细胞用于含有2％BCS的改良Eagle培养基中的0.6％黄蓍胶(tragenthum gum)覆盖，然后在37℃下孵育2天(对于Pv(M)-wt和PV-Max病毒)或3天(对于PV-Min(X、Y、XY或z)病毒)。然后这些经由结晶紫染色显像，并通过计数可见的噬斑计算PFU/ml滴度。
小区域的低表现密码子对偏倚拯救生存力，但却减毒病毒。
使用在PV-Min序列内设计的限制位点，我们将PV-Min P1区的部分亚克隆至另外的野生型病毒，产生了其中仅P1的子区域具有不良的密码子对偏倚的嵌合病毒(图11)(van der werr等人，1986)。从这些亚克隆中的每一个，经由体外转录产生RNA，并且随后将所述RNA转染入HeLa R19细胞，产生具有不同减毒程度的病毒(生存力得分，图11)。P1片段X和Y各自是轻微地减毒的；然而加在一起时，它们产生显著减毒的病毒fPV-Min755-2470、PV-MinXY)(图3、4)。病毒PVMin2470-3385(PV-MinZ)的减毒与PV-MinXY的大约相同。构建体PV-Min1513-3385(YZ)没有产生噬斑，所以很显然是过度减毒以致不能产生可生存的病毒。进一步研究了这些病毒构建体(其显示不同的减毒程度)以确定它们实际的生长动力学。
一步生长动力学和减毒机制：比感染性被降低。
研究了每个可生存的构建体的一步生长动力学。这些动力学一般而言与野生型的相似，因为它们以相同的基本方式发生(即隐蔽期后是快速的对数生长)。然而，对于所有PV-Min构建体，根据噬斑形成单位(PFU)的最终滴度通常比野生型病毒的低一至三个数量级(图12A)。
当病毒以病毒微粒/ml(图12B)而不是PFU测量时，获得了略有不同的结果，表明这些病毒与野生型病毒产生近似相等的每感染周期每细胞的微粒数量。根据病毒微粒/ml，减毒最多的病毒为仅78％(PV-MinXY)或82％(Pv-MinZ)减毒的，其在对数水平低于一个数量级。因此，这些病毒以其比感染性而言显示是约两个数量级减毒的(产生一个噬斑需要的病毒粒子数)。
为了确认比感染性的降低，我们使用高度纯化的病毒微粒重新测量了 病毒微粒/PFU比值。所选的病毒在108个HeLa R19细胞上扩增。病毒溶胞产物用RNA酶A处理以破坏将使0D值变暗的暴露的病毒基因组和任何细胞RNA。病毒溶胞产物然后还与0.2％SDS和2mM EDTA孵育1h以使细胞蛋白质和非病毒粒子的病毒蛋白质变性。正确折叠和形成的脊髓灰质炎病毒衣壳幸免于此苛刻的SDS处理，were as alph微粒则没有(Mueller等人，2005)。这些处理的溶胞产物的病毒粒子然后经由超速离心在蔗糖梯度上纯化。病毒微粒浓度通过260nm的光密度测量，使用公式9.4x1012微粒/mi＝1OD260单位(Rueckert，1985)。四种病毒的每一种都产生相似数量的微粒(表6)。然后使用这些纯化的病毒粒子执行噬斑测定。同样地，PV-MinXY和PV-MinZ需要比野生型多得多的病毒微粒来产生噬斑(表6)。
对于野生型病毒，比感染性计算为l PFU/137微粒(表6)，这与文献是一致的(Mueller等人，2006；Schwerdt和Fogh，1957；Joklik和Damell，1961)。病毒PV-MinXY和PV-MinZ的比感染性在1PFU/10，000微粒附近(表6)。
另外，比较了合成病毒的热稳定性与PV(M)-wt的热稳定性，以重新确认SDS处理数据，这些具有新的RNA部分的微粒是同等稳定的。确实，当在500℃孵育并随着时间过程定量时，这些合成病毒与PV(M)-wt具有相同的温度谱(数据未显示)。
低表现密码子对降低翻译效率，而过表现对增强翻译。
关于密码子对偏倚存在的一个假设是利用低表现的对造成不良的或慢的翻译速率。据我们所知，我们的合成病毒是含有高浓度低表现密码子对的第一种分子，并且因此是适于测试所述翻译假设的第一种分子。
为了测量密码子对偏倚对翻译的效应，我们使用了双页反子报告基因(Mueller等人，2006)(图13)。第一顺反子表达处于丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)控制下的Renilla荧光素酶(R-Luc)，并用作归一化对照。第二顺反子表达处于脊髓灰质炎病毒IRES控制下的萤火虫荧光素酶(F-Luc)。然而，在此第二顺反子中，F-Luc的前面是脊髓灰质炎病毒的P1区，并且此Pl区可由本文描述的任何合成序列变体编码。因为F-Luc被 翻译为与P1区蛋白质的融合蛋白，所以P1区的可翻译性直接影响产生的F-Luc蛋白质的量。因此F-Luc发光与R-Luc发光的比值是各种P1编码的可翻译性的量度。
野生型、PV-Max、PV-Min、PV-MinXY和PV-MinZ的P1区被插入标记“P1”的区域(图13A)。PV-MinXY、PV-MinZ和PV-Min比野生型P1区产生少得多的F-Luc/单位R-Luc，强烈表明低表现密码子对造成不良或缓慢的翻译速率(图13)。相反，PV-Max P1(其使用过表现密码子对)产生更多F-Luc/单位R-Luc，表明与PV(M)-wt P1相比，PV-Max Pl的翻译实际上更好。
双顺反子报告基因构建和体内翻译。
k/页反子报告基因构建体均是基于pdiLuc-PV(Mueller等人，2006)构建的。PV-Max和PV-Min衣壳区经由分别使用寡核苷酸P1max-2A-RI(+)/P1max-2A-RI(-)或P l min-2A-RI(+)/P1min-2A-RI(-)的PCR扩增。PCR片段经凝胶纯化，然后插入中间载体pCR--XL-TOPO(Invitrogen)。此中间载体然后在One ShotTOPl0化学感受态细胞中扩增。经由Quiagne miniprep制备质粒后，将含有PV-Min的中间载体用EcoRI消化，并将这些片段连接于同样用EcoRI消化的pdiLuc-PV载体(Mueller等人，2006)。这些质粒也在One ShotTOPl0化学感受态细胞(Invitrogen)中扩增。为了构建pdiLuc-PV-MinXY和pdiLuc-PV-MinZ，将pdiLuc-PV和pdiLuc-PV-Min同样用NheI消化，并在相应的载体之间交换所得的限制片段。然后将这些转化入One ShotTOP10化学感受态细胞并且随后扩增。从所有这四个克隆，经由T7聚合酶方法转录RNA(van der Werf等人，1986)。
为了分析合成衣壳的体内翻译效率，经由Lipofectamine2000(Invtirogen)将双顺反子报告基因构建体的RNA转染入在12孔皿上的2x105个HeLa R19细胞。为了定量仅输入RNA的翻译，转染在2mM盐酸胍(GuHCL)存在下实现。转染六个小时后，细胞经由被动裂解缓冲液(Promega)裂解，然后通过双重萤火虫(F-Luc)Renilla(R-Luc)荧光素酶测定(Promega)来分析这些溶胞产物。
PV-MinXY和PV-MinZ的通传稳定性。
因为PV-MinXY和PV-MinZ各自含有数百个突变(分别为407和224个)，且每个突变造成总密码子对偏倚的微乎其微的下降，我们认为这些病毒应非常难以回复突变至野生型毒力。作为此想法的直接测试，将病毒PV-MinXY和PV-MinZ以0.5的MOI分别连续传代15次。监测滴度的表型回复突变，并且监测传代病毒的序列的回复突变或突变。15次传代后，病毒没有表型变化(即诱导CPE的滴度相同)，并且合成区域中没有固定的突变。
热稳定性和传代。
测试了合成病毒PV-MinXY和PV-Min z的稳定性并与PV(M)-wt进行比较。这是通过将悬浮于PBS中的1×108个微粒加热至50℃保持60分钟，然后在5、15、30和60分钟经由噬斑测定测量完整病毒微粒的减少而实现的(图14)。为了测试病毒PV-MirLXY和PV-MinZ的P1区的合成部分的遗传稳定性，将这些病毒连续传代。这是通过用0.5MOI的病毒PV-MinXY和PV-MinZ感染1x106个HeLa R19细胞的单层，然后等待CPE的诱导而实现的。启动CPE(其在传代中始终保持恒定)后，溶胞产物用于感染新的HeLa R19细胞单层。监测第5、9和15次传代的滴度和序列(数据未显示)。
病毒纯化和经由OD260吸光度的病毒微粒确定。
15cm皿上的HeLa R19细胞的单层(1x108个细胞)用PV(M)-wt、PV-Max、PV-MinXY或PV-Min Z感染，直至观察到CPE。三个冷冻/融化周期后，细胞溶胞产物经受3,000x g、15分钟和然后l0000xg、15分钟的两次初始离心。然后向上清液添加10μg/ml的RNA酶A(Roche)并在RT下孵育1小时；随后向上清液添加0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和2mMEDTA，轻轻混合并在RT下孵育30分钟。将这些含有病毒微粒的上清液置于6ml蔗糖垫[于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中的30％蔗糖]上。病毒微粒的沉降通过经由蔗糖梯度的超速离心实现，所述超速离心是使用SW28吊桶式转头在28,000rpm下3.5小时。
离心后，保持蔗糖垫不动并移除上清液，管用HBBS清洗两次。清洗后，移除蔗糖，并将病毒“珍珠”重悬于含有0.1％SDS的PBS中。病毒滴度经由噬斑测定来确定(上文)。病毒微粒浓度通过经由NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)的260nm下的溶液光密度的三次测量的平均确定，使用公式9.4×1012微粒/ml＝1OD260单位(Mueller等人，2006；Rueckert，1985)。
CD155tg小鼠中PV-MinXY和PV-MinZ的神经减毒。
野生型脊髓灰质炎病毒感染的最初位点是口咽和肠，但此感染是相对无症状的。然而，在1％的PV(M)-wt感染中，当感染传播至CNS中的运动神经元时，病毒破坏这些神经元，造成死亡或称为脊髓灰质炎的急性弛缓性瘫痪(acute flaccid paralysis)(Landsteiner和Popper，1909；Mueller等人，2005)。因为运动神经元和CNS是脊髓灰质炎病毒的关键靶标，我们希望了解所述合成病毒在这些组织中是否是减毒的。因此经由大脑内注射将这些病毒施用于CD155tg小鼠(表达脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠)(Koike等人，1991)。计算各个病毒的PLD50值，并且PV-MinXY和PV-MinZ病毒是1,000倍(基于微粒)或10倍(基于PFU)减毒的(表6)(Reed和Muench，1938)。因为这些病毒确实显示神经减毒，所以它们可用作可能的疫苗。
a)使用A260经由公式9.4×1012微粒/ml＝1OD260单位确定微粒/ml
b)通过将纯化病毒的PFU/ml除以微粒/ml计算
c、d)在以不同剂量经由大脑内注射向CD155tg小鼠施用病毒后计算
疫苗接种CD155tg小鼠提供免疫性和针对致死攻击的保护。
用于30ul PBS中的l02个微粒至109个微粒的纯化病毒稀释液大脑内注射各组4-6、6-8周龄的CD515tg小鼠(Tg21品系)以确定神经致病性(Koike等人，1991)。
致死剂量(LD50)通过Reed和Muench方法(Reed和Muench，1938)计算。脊髓和脑中的病毒滴度通过噬斑测定来定量(数据未显示)。
PV-MinZ和PV-MinXY与野生型病毒编码完全相同的蛋白质，但是在若干个方面是减毒的，兼有降低的比感染性和神经减毒。
为了测试PV-Min z、PV-MinXY用作疫苗，将此病毒的三个亚致死剂量(108个微粒)于100ul PBS中经由腹膜内注射施用于8、6-8周龄CD155tg小鼠，每周一次，共三周。疫苗分组的一只小鼠由于疾病而未完成疫苗方案。同时一组对照小鼠接受以100ul PBS的三次模拟疫苗接种。最后一次疫苗接种后大约一周，从尾静脉中抽取30ul血液。此血液经受低速离心并收集血清。针对PV(M)-wt的血清转换以攻击病毒的100个噬斑形成单位fPFU)经由微中和测定分析，根据WHO的建议执行(Toyoda等人，2007；Wahby，A.F.，2000)。最后一次疫苗接种后两周，疫苗接种的小鼠和对照小鼠通过肌内注射于100ul PBS中的106PFU，接受致死剂量的PV(M)-wt的攻击(Toyoda等人，2007)。使用CD155tg小鼠的所有实验的执行遵守Stony Brook University的IACUC规定以及联邦准则。所有14只疫苗接种的小鼠存活，并且未显示瘫痪或parasia迹象；相反，所有模拟疫苗接种的小鼠死亡(表7)。这些数据表明使用去优化的密码子对的CPB病毒确实能够针对野生型病毒免疫，提供有力的体液(humeral)应答并且还允许攻击后的完全存活。
a)CD155tg小鼠接受相应病毒的三个疫苗接种剂量(108个微粒)
b)用106PFU的PV(M)-wt经由肌内注射进行攻击
买施例10
SAVE应用于流感病毒
流感病毒具有8个分开的基因组区段。公开甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinal(H1N1))的区段序列的GcnBank保藏物(deposit)包括AF389115(区段l，聚合酶PB2)、AF389116(区段2，聚合酶PBl)、AF389117(区段3，聚合酶PA)、AF389118(区段4，血凝素HA)、AF389119(区段5，核蛋白NP)、AF389120(区段6，神经氨酸酶NA)、AF389121(区段7，基质蛋白质Ml和M2)和AF389122(区段8，非结构蛋白质NSl)。
在初始研究中，选择株系A/PR/8/34(在本文也称作A/PR8)的编码核蛋白NP的基因组区段用于去优化，核蛋白NP是病毒粒子的主要的结构蛋白质和第二丰富的蛋白质(1,000拷贝/微粒)，其作为单体结合于全长病毒RNA以形成卷曲的核糖核蛋白。(有关母体和去优化的序列，参见下文的表8)。此外，NP参与从mRNA到模板的关键转变和病毒粒子RNA合成(Palese和Shaw，2007)。合成了两种同义的编码，第一种用稀有同义密码子取代常用的密码子(NPCD)(即去优化的密码子偏倚)和第二种，去优化的密码子对(NPCPmin)。不改变区段任一端的末端120个核苷酸以不干扰复制和包壳。NPCD含有338个沉默突变，而NPCPmin(SEQ ID NO：23)含有314个沉默突变。将突变的NP区段如所述地(下文)引入双义载体，并与其他七种wt流感质粒一起共转染入293T/MDCK共培养细胞。作为对照，细胞用所有8种wt A/PR8质粒转染。用NPCD区段和NpCPmin区段转染的细胞与用野生型NP转染的细胞相似地产生可生存的流感病毒。这些新的去优化的病毒分别称为A/PR8-NPCD或A/PR8-NPCPmin，显示是减毒的：滴度(根据 PFU)比野生型病毒低3倍至10倍，两种突变体病毒均产生小的噬斑。
虽然去优化的流感病毒不像含有相似数量的去优化密码子的脊髓灰质炎病毒一样严格减毒，两种病毒的翻译策略有所不同。脊髓灰质炎病毒具有单个长的mRNA，翻译成单一多蛋白。通过此长mRNA开始的缓慢翻译(如我们的衣壳去优化的病毒中)将降低完整信息的翻译，并因而影响所有蛋白质。相反，流感具有8个分开的区段，因此去优化一个对其他的翻译影响很小，如果有影响的话。此外，NP蛋白质的表达在流感病毒感染的早期是特别受支持的(Palese和Shaw，2007)。
携带密码子对去优化的NP区段的流感病毒的表征
A/PR8-NpCPmin的生长特性通过以0.001的感染复数(MOI)感染于100mm皿中的Madin Darby犬肾细胞(MDCK细胞)的融合单层来分析。允许病毒接种物在室温下于摇动平台上吸附30分钟，然后补充含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)和2ug/ml TPCK处理的胰蛋白酶的10ml Duibecco改良Eagle培养基(DMEM)并在370C下孵育。0、3、6、9、12、24和48小时后，取出100μl含有病毒的培养基并通过噬斑测定确定病毒滴度。
病毒滴度和噬斑表型通过于35mm六孔板中的MDCK细胞的融合单层上的噬斑测定来确定。病毒的10倍系列稀释液在含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)和2pg/ml TPCK处理的胰蛋白酶的Duibecco改良Eagle培养基(DMEM)中制备。病毒稀释液被铺板于MDCK细胞上，并被允许在室温下在摇动平台上吸附30分钟，然后在37℃下于细胞培养孵育器中孵育l小时。然后移除接种物，含有0.6％黄蓍胶(Sigma-Aldrich)0.2％BSA和2ug/mi TPCK处理的胰蛋白酶的3m1极限Eagle培养基。在37℃下孵育72小时后，通过用结晶紫染色所述孔来显现噬斑。
A/PR8-NPMin产生可生存的病毒，所述病毒与A/PR8wt相比在MDCK细胞上产生更小的噬斑(图16A)。此外，通过低MOI感染，A/PR8-NPMin显示了延迟的生长动力学，介于感染后3-12小时之间，其中A/PR8-NpMin滴度落后于A/PR81.510g(图16B)。最终的滴度比A/PR8的低3-5倍。(三次.不同实验的平均值)。
携带密码子对去优化的PBl、HA或HA和NP区段的流感病毒A/PR8-PBlMin-RR，A/PR8-HAmin和A/PR8-HAMin/NPMin的表征。
产生了编码血凝素蛋白质HA和聚合酶亚基PBl的株系A/PR/8/34的密码子对去优化的基因组区段。HA是从病毒表面突出的介导受体连接和病毒进入的病毒结构蛋白质。PBl是病毒RNA复制机器的关键组件。特别地，通过去优化密码子190-488(PBl区段的核苷酸531-1488)之间的密码子对同时保留野生型密码子使用，合成了PBl的同义编码(SEQ ID NO：15)(PB1Min-RR)。区段PB1Min-RR与wt PB l区段相比含有236个沉默突变。
通过去优化密码子50-541(HA区段的核苷酸180-1655)之间的密码子对同时保留野生型密码子使用，合成了HA的第二个同义编码(SEQ ID NO：21)(HAMin)。HAMin与wtPBl区段相比含有355个沉默突变。
将突变的PB1Min-RR和HAMin区段如上所述地引入双义载体，并与其他七种wt流感质粒一起共转染入293T/MDCK共培养细胞。此外HAMin区段与NpMin区段和剩余的六种wt质粒一起共转染。作为对照，细胞用所有8种wtA/PR8质粒转染。用PB1Min-RR或HAMin区段转染的细胞产生可生存的病毒，密码子对去优化的区段HAMin和NpMin的组合也一样。新的去优化的病毒分别被称为A/PR8-PB1Min-RR、AlPR8-HAMin和A/PR8-HAMin/NPMin。
生长特性和噬斑表型如上所述进行评估。
A/PR8-PB1Min-ILR、A/PR8-HAMin和A/PR8-HAMin/MPMin全部产生可生存的病毒。与)dPR8wt相比，A/PR8-PB1Min-RR和A/PR8-HAMin/NPMin在MDCK细胞上产生较小的噬斑(图17A)。此外，在MDCK细胞上低MOI感染之后，A/PR8-HAMin和A/PRS-HAMin/NpMin显示大幅度降低的生长动力学，尤其是转染后3-12hr，其中A/PR8-HAMin/NPmin滴度比A/PR8落后1至2个数量级(图17B)。儿PR8-HAMin和儿PR8-HAMin/NPMin二者的最终滴度比A/PR8的低10倍。由于A/pR8-HAMin/NPMin的生长阻碍比A/PR8-HAMin更加严重，因此可得出结论，去优化两个区段的效应是加成性的。
A/PR8-NPMin在BALB/c小鼠模型中的减毒
向各组的6-8只麻醉的6周龄BALB/c小鼠给与12.5μlA/PR8或A/PR8-NpMin病毒溶液至每个鼻孔中，所述病毒溶液含有介于102和106PFU病毒之间的10倍系列稀释液。监测死亡率和发病率(体重下降、活动减少、死亡)。致死剂量50(LD50)通过Reed和Muench的方法(Reed，L J.和M.Muench.1938.Am.J.Hyg.27：493-497)计算。
八只小鼠通过用102PFU的A/PR8-NPMin病毒鼻内接种进行一次疫苗接种。6只小鼠的对照组未进行任何病毒的疫苗接种(模拟)。此初始疫苗接种28天后，用对应于100倍LD50的致死剂量的wt病毒A/PR8攻击小鼠。
A/PR8的LD50是4.6×101PFU，而A/PR8-NPMin的LD50是1×103PFU。在102剂量下，所有A/PR8-NPMin感染的小鼠存活。可得出结论，与wt AdPR8病毒相比，A/PR8-NPMin在小鼠中的减毒超过10倍。因此选择此浓度用于疫苗接种实验。用102A/PR8-NPMin疫苗接种小鼠造成轻度和短暂的疾病，如低于10％的相对体重下降所表明的(图18A)。8只疫苗接种的小鼠中的全部8只均存活。在相同剂量下以A/PR8感染的小鼠经历快速的体重下降和严重的疾病。用A/PR8感染的8只小鼠中的6只在感染后10和13天之间死亡(图18B)。两只小鼠存活，并从野生型感染中恢复。
用100倍LD50的wt病毒进行攻击后，所有A/PRg-NpMin疫苗接种的得到保护，并从攻击中存活而没有疾病症状或体重下降(图18C)。另一方面，模拟疫苗接种的小鼠显示严重的症状，并且在攻击后9和11天之间屈服于感染。可得出结论，A/PR8-NPMin诱导小鼠中的保护性免疫性，并因此具有作为活的减毒流感疫苗的潜能。其他病毒诸如A/PR8-PB1Min-RR和A/PR8-HAMin/NPMin目前正在小鼠中测试，可导致进一步改善密码子对去优化的流感病毒作为疫苗的有益性质。
实施例ll
开发用于制备和表征病毒嵌合体的更高通量的方法
通过重叠PCR构建嵌合病毒 
通过使用重叠PCR将每种突变体病毒的大约300-bp片段置于wt环境，执行对每种减毒的突变体病毒的“扫描"。任何给定的300-bp区段与前面的区段重叠～200bp，即对于每种新的嵌合病毒，扫描窗是～300bp长度，但向前移动～100bp。因此，扫描一种突变体病毒(其中仅衣壳区的～3000bp被改变)需要约30种嵌合病毒。扫描在具有绰绰有余的能力同时分析两种病毒的96-孔皿型号(format)中执行。
起始材料是皮克量的两种质粒，一种含有M病毒的序列，而另一种含有突变体病毒的序列。质粒包括PV反向遗传学系统的所有必需元件(van der Werf等人，1986)，包括T7RNA聚合酶启动子、锤头状核酶(Herold和Aldino，2000)和DNA编码的聚腺苷酸尾。使用了三对PCR引物，A、M(用于突变体)和B对。参见图9。M对扩增突变体病毒的期望的300bp区段；它不扩增wt，因为M引物对是基于突变体中已被显著改变的序列设计的。A和B对扩增期望的wt病毒基因组侧翼。重要的是，将约20-25bp的重叠序列分别构建于M引物以及A2和B1的每一个的5’端；这些20-25bp分别与A区段的3’端和B区段的5’端重叠(100％互补性)。
为了执行重叠PCR，一个96-孔皿含有wt质粒DNA和在30个不同的孔中的30种不同的A和B对。一个分开但匹配的96-孔板含有突变体质粒DNA和30种不同的M引物对。PCR用高度前进的、低错误率、热稳定的聚合酶执行。第一轮PCR后，每个反应用DpnI处理，DpnI通过在甲基化的GmATC位点切割而破坏模板质粒。然后将每个wt和匹配突变体反应的小份在PCR反应缓冲液中在第三个96-孔皿中混合。这次使用侧翼于完整构建体的引物(即A1和B2引物)。因为每个区段(A、M和B)设计为与每个相邻区段重叠至少20bp，并且因为反应是由仅能扩增全长产物的引物驱动的，所以所述区段退火并互相延伸，在两个或三个循环后产生全长产物。这是可压缩至“1-管"(一个96-孔皿)的“3-管"(三个96-孔皿)设计。
嵌合病毒的表征
与T7RNA聚合酶孵育后，上面产生的具有所有需要的上游和下游调节元件的全长线性嵌合DNA基因组产生有活力的病毒RNA，其在于HeLa S10细胞提取物中孵育后(Molla等人，1991)或在转染入HeLa细胞后产生病毒微粒。替代地，可将DNA构建体直接转染入在细胞质中表达T7RNA聚合酶的HeLa细胞。
然后使用各种相对高通量的测定来测定每种嵌合病毒的功能性，包括视觉检查细胞以评估96-孔型号中病毒诱导的CPE；使用ELISA判断病毒产生；在一系列96孔板中定量测量接种于细胞的等量病毒微粒的生长动力学；和测量比感染性(感染单位/微粒[IU/P]比值)。
然后可测定各种嵌合病毒的功能性。有许多相对高通量的测定可用。第一种测定可以是使用显微镜视觉检查细胞以查看96\孔型号中病毒诱导的CPE(细胞死亡)。这还可以使用活体染料的自动化96--孔测定运行，但是视觉检查96-孔板的CPE要求低于一个小时的操作时间(hands-on time)，这对于大多数目的是足够的。
第二，转染后3至4天，可使用实施例3中描述的ELISA方法测定病毒产生。替代地，微粒滴度用衣壳特异性抗体使用三明治ELISA确定。这些测定允许鉴别不能生存的构建体(没有病毒微粒)、复制不良的构建体(很少微粒)和有效复制的构建体(许多微粒)并定量这些效应。
第三，对于更精确定量的确定，将如上文确定的等量病毒微粒接种于一系列新的96孔板以测量生长动力学。在不同的时间(感染后0、2、4、6、8、12、24、48、72h)，取出一个964b板并经受数个冻融周期以释放细胞相关的病毒。在每个时间由每个构建体产生的病毒微粒数通过如上文的ELISA确定。
第四，可测量IU/P比值(参见实施例3)。
更高分辨率的扫描
如果所述病毒的致死性是由于散布于衣壳区的许多小缺陷，如初始数据所表明的，则许多或大多数的嵌合体是不健全的，并且只有少量是不能生存的。如果是这种情形，则更高分辨率的扫描很可能是不必要的。相反，如果所述300bp区段的一个或多个确实造成致死性(如在介于1513和2470之间的区段中密码子去优化的病毒的可能情况，其，如下文所述，可 携带导致此区段的强烈表型的翻译移码信号)，则以更高分辨率重复基因组扫描，例如300-bp区段构建体上移动10bp的30bp窗，然后进行表型分析。30-bp扫描不包括突变体病毒的PCR；而是将改变的30-bp区段直接设计入wt病毒的PCR引物。这允许查明造成致死性的变化。
实施例12
SAVE潜在的分子机制的正在进行的研究
嵌合体的选择 
两种母体不能生存的病毒各自的两至四种示例性嵌合体(即总计4至8种病毒)用于下列实验。选择具有相对较小的突变体DNA区段但具有强烈表型的可生存的嵌合体。例如，来自去优化密码子病毒的病毒PV-AB75s-1513、PVAB2470-2954和PV-AB2954-3386(参见实施例1)，以及PV-Min755-2470和PV-Min2470-3386(参见实施例7)是合适的。也可从上文所述的实验中获得具有使得分析更易进行的更小插入的甚至更好的起始嵌合体(实施例8)。
RNA丰度/稳定性
令人信服地，改变的基因组序列使病毒RNA去稳定。此去稳定可以是新序列的直接效应或翻译暂停或翻译中的其他缺陷的间接效应(参见，如Doma和Parker，2006)。因此检查了突变体病毒RNA的丰度。将来自嵌合突变体病毒和wt病毒的等量RNA混合并转染入HeLa细胞。2、4、8和12h后采集样品，并通过RNA印迹或定量PCR分析样品的两种不同病毒RNA，它们因为存在数百种核苷酸差异而是容易区分的。还进行了wt病毒RNA与PV-SD(具有wt表型的密码子改组病毒)相比的对照。降低的突变体与wt病毒RNA比值表明嵌合体具有去稳定的RNA。
体外翻译
显示密码子去优化的病毒和其衍生物中的一些的翻译被降低。参见实施例5。用密码子对去优化的病毒(PV-Min)和其选定嵌合体重复体外翻译实验。关于去优化的密码子对为什么应导致病毒不能生存，目前还没有很 好的理论，更不用说有任何证据，因此研究对翻译的效应可帮助阐明潜在的机制。
在实施例5的两种类型的提取物中执行体外翻译。一种是“加大了马力的"提取物(Molla等人，1991)，其中即使是密码子去优化的病毒也明显产生良好的翻译。另一种是更密切接近正常的体内条件的提取物，其中密码子去优化的病毒翻译效率低下。所述提取物之间有四处不同：更“天然"的提取物未透析；内源细胞mRNA未用微球菌核酸酶破坏；所述提取物未补充外源氨基酸；并且所述提取物未补充外源tRNA。在本研究中，一次改变这四种参数中的一种(或必要时成对地改变)，以观察哪种参数对翻译的效应最显著。例如，添加氨基酸和tRNA允许翻译密码子去优化的病毒的发现强烈支持这样的假设，即翻译的效率低下仅仅是因为稀有氨酰-tRNA被限制。从将SAVE方法扩展到其他种类的病毒的观点看，此发现是重要的。
翻译移码
另一种可能的缺陷是密码子变化可促进翻译移码；就是说，在一些密码子对处，核糖体可转变成不同的读码框，然后在翻译假的肽序列之后到达符合读码框架的终止密码子。这种类型的移码是一些病毒中重要的调节事件。本发明的数据揭示，携带残基1513至2470的AB突变体区段的所有PV基因组是不能生存的。此外，携带此突变体区的所有基因组在体外翻译过程中产生大约42-44kDa的新蛋白质条带(参见图5A，通过星号标识)。此新蛋白质可能是移码的结果。
检查1513-2470间隔中的序列揭示了符合真核生物中-1移码的易打滑的(slippery)七聚体共有序列(X-XXY-YYZ)(Farabaugh，1996)的三个可能的候选位点。这些位点是位置1885和1948处的A-AAA-AAT和位置2119处的T-TTA-TTT。它们后面有分别在1929、1986或2149处的符合-1读码框的终止密码子。前两个看起来更有可能是产生具有所观察的大小的条带的候选物。
为了确定是否发生了移码，将三个候选区域的每一个分开突变，以使其不利于移码。此外，将候选终止密码子的每一个分开突变成有义密码子。 通过体外翻译测试了这六种新的点突变体。将移码位点突变成不利序列后新的42-44kDa蛋白质的缺失，和消除终止密码子后该蛋白质条带的分子量的增加，表明发生了移码。如果移码是异常翻译产物的导致因素，在1513-2470突变体区段环境中测试了缺乏移码位点的新突变体的生存力。此发现无疑将对未来的基因组设计具有重要意义，并且如果必要，可在软件算法中包括移码过滤器以避免可能的移码位点。
使用各种技术对翻译缺陷进行了更详细的研究，包括但不限于多核糖体轮廓图、趾纹法和融合蛋白的荧光素酶测定。
多核糖体轮廓图
多核糖体轮廓图是检查翻译的传统方法。它不是高通量的，但是其开发和理解非常充分。对于多核糖体轮廓图，细胞提取物以使翻译停止(用环己酰亚胺)但尚保留处于翻译其相应mRNA行动中的核糖体组(“多核糖体”)的方式制备。将这些多核糖体在蔗糖梯度上分级，借此与更多数量的核糖体缔合的信息(message)向底部沉降。梯度分级并使用UV吸收分析RNA含量后，即可观察到多核糖体轮廓图，其中接连的吸收峰对应于和N+1个核糖体在一起的mRNA；通常在所述峰模糊在一起之前可分辨10至15个不同的峰(代表40S核糖体亚基、60S亚基和在单个mRNA上的1、2、3、...12、13个核糖体)。然后在凝胶上运行蔗糖梯度的各种级分、将其印到膜上并通过特定mRNA的Northem分析对其进行分析。然后这显示特定mRNA主要是与所述10至15个核糖体连结(翻译良好)还是与1至4个核糖体连结(翻译不良)。
在此研究中，比较了例如wt病毒、PV-AB(密码子去优化的)病毒和其衍生物PV-AB755-1513和PV-Aa2954-3386(分别主要具有N-末端或C-末端去优化的区段)。N-末端和C-末端突变体区段之间的比较特别具有启迪作用。如果密码子去优化造成翻译减缓或停止，则N-末端突变体RNA与相对较少的核糖体缔合(因为核糖体非常缓慢地移动经过N-末端区(防止其他核糖体加载)，然后在穿越去优化的区域之后再飞快地经过信息的剩余部分)。相反，C-末端突变体RNA与相对较大数量的核糖体缔合，因为许多核糖体能够加载，但是因为它们被阻止在C-末端附近，所以它们不能从转录物 脱离，从而造成缔合的核糖体数量高。
多核糖体分析表明有多少核糖体活跃地与不同种类的突变体RNA缔合，并可例如区分其中翻译缓慢的模型和核糖体实际上提早从RNA上脱落的模型。也可测试其他种类的模型。
趾纹法
趾纹法是用于鉴别核糖体在mRNA上被减缓或暂停的位置的技术。如在多核糖体轮廓图中，获得活跃翻译的mRNA，其核糖体用环己酰亚胺冻结但仍保持缔合；通常从体外翻译反应中获得所述mRNA。使用与mRNA上一些相对的3’部分互补的DNA寡核苷酸引物，然后通过反转录酶延伸。反转录酶延伸，直至它碰到核糖体。因此，一群翻译的mRNA分子产生一群从引物位点延伸至最近的核糖体的DNA片段。如果有核糖体将要暂停的位点或区域(即，距引物200个碱基)，那么此位点或区域将产生数量不成比例的DNA片段(在此情形中，200个碱基长度的片段)。那么这在高分辨率凝胶上显示为“趾纹”(条带或暗区域)。这是用于定位(mapping)mRNA上的核糖体暂停位点(于几个核苷酸内)的标准方法。
分析了具有去优化的密码子或密码子对区段的嵌合体，其中不同嵌合体中所述区段轻微地向5，或3’移动。如果去优化的区段造成核糖体减缓或停止，趾纹向5，或3，移动以匹配去优化的区段的位置。对照包括wt病毒RNA和若干个(无害地)改组的病毒RNA。对照还包括单纯突变体病毒RNA(即不参与翻译)，以排除新序列对反转录的独立于核糖体的效应。
趾纹测定具有至少两个优点。第一，它可提供暂停的核糖体的直接证据。第二，它的分辨率达几个核苷酸，所以它可准确鉴别哪个去优化的密码子或去优化的密码子对造成所述暂停。就是说，可以是仅有几个去优化的密码子或密码子对造成所述效应的大部分，而趾纹法可揭示这一点。
融合蛋白的双重荧光素酶报告基因测定
以上实验可表明某些密码子或密码子对是对翻译特别有害的。作为分析特定密码子和密码子对对翻译的效应的高通量方法，设计了小的测试肽并将其融合于海肾荧光素酶的N-末端。然后测量荧光素酶活性作为肽可翻 译性的测定。就是说，如果所述N-末端肽翻译不良，那么就产生很少荧光素酶。
基于上文的实验设计了一系列八种25-聚体肽。八种25-聚体的每一种以12种不同的方式编码，使用感兴趣的稀有密码子和/或稀有密码子对的不同排列。使用装配PCR，将这96种构建体(8种25-聚体x12种编码)融合于上文所述的双顺反子、双重荧光素酶载体中的萤火虫荧光素酶(F-luc)的N-末端(参见实施例5和图6)。双重荧光素酶系统使用萤火虫荧光素酶(F-Luc)和海肾(Renilla)荧光素酶(R-Luc)二者；它们在不同生物化学条件下发光，所以可从单个管或孔中分开测定。双顺反子报告基因表达为单个mRNA，但是对照荧光素酶(R-Luc)从一个内部核糖体进入位点(IRES)翻译，而实验荧光素酶(F-luc)(其N-末端融合有测试肽)独立地从它自身的IRES翻译。因此，F-Luc活性与R-Luc活性的比值是测试肽可翻译性的指示。参见图6。
将所得的96种双顺反子报告基因构建体直接从PCR反应转染至96孔的HEK293或HeLa细胞。上游顺反子的萤火虫荧光素酶充当内部转染对照。第二顺反子中海肾荧光素酶的密码子或密码子对依赖性表达可准确地确定为R-Luc和F-Luc之间的比值。这一测定本质上是高通量的，并且必要时可测定数百或甚至数千种测试序列。
实施例13
使用新的替代密码子策略的减毒病毒的设计和合成
再加工病毒以用于疫苗生产的SAVE方法依赖于大规模同义密码子置换来降低病毒蛋白质的翻译。这可通过适当地调节密码子和密码子对偏倚、以及其他参数诸如RNA二级结构和CpG含量来实现。在四种从头PV设计中，两种(改组的密码子病毒PV-SD和有利的密码子对病毒PV-Max)几乎没有产生相对于wt病毒的表型变化。其他两种从头设计(PV-AB和PV-Min)成功地杀死病毒，而仅利用通过两种不同机制的同义置换(分别是密码子偏倚和密码子对偏倚的显著变化)。通过将灭活的病毒株系区域亚克隆至wt来构建活着但是减毒的株系。
采用大规模同义置换的病毒减毒潜在机制的更好理解推动了合成病毒的表型和表达水平的预测。正在进行的研究解决了与变化总数量或变化密度对翻译效率的效应；致密区域的位置对翻译的效应；密码子和密码子对偏倚的相互作用；和将大量短程RNA二级结构加工入基因组的效应相关的问题。很可能wt和灭活的株系之间存在连续体，并且可向减弱的株系中加工任何期望的减毒水平。然而，对于任何感染可实现自我维持并因此可检测的减毒水平存在硬性的限制。PV蛋白质的15442种编码构成了探索的巨大序列空间，并且正利用各种方法来更系统地探索此序列空间。这些方法包括，第一，开发软件平台以帮助设计新的减毒病毒，和第二，使用此软件设计、然后合成和表征探索更多序列空间的大量新病毒，并回答关于替代编码如何造成减毒的特异性问题。另外，要考虑的一个重要问题是通过表观无害的同义密码子改组是否可偶然地产生危险的病毒。
用于病毒基因组的基于计算机的设计和数据分析的软件的开发
设计合成病毒需要实质的软件支持以(1)优化密码子和密码子对使用，并在保留、嵌入或移除序列特异性信号的同时监测RNA二级结构，和(2)将序列分割成寡核苷酸以确保准确的序列装配。原型的合成基因组设计软件工具正被扩展到合成基因组设计的全环境中。在此扩展的软件中，围绕限制因素(constraints)而不是序列概念地构建了基因编辑器。基因设计者在指定期望基因的特性(如氨基酸序列、密码子/密码子对分布、限制位点的分布和RNA二级结构限制因素)的水平工作，而基因编辑器根据算法设计实现这些限制因素的DNA序列。有许多限制因素，它们通常彼此相互作用，包括但不限于氨基酸序列、密码子偏倚、密码子对偏倚、CG二核苷酸含量、RNA二级结构、顺式作用核酸信号诸如CRE、剪接位点、多聚腺苷化作用位点和限制酶识别位点。基因设计者识别这些限制因素的存在，并设计具有期望特征的基因而同时自动满足所有限制因素于预先指定的水平。
先前开发的用于嵌入/移除模式、二级结构、重叠编码框和遵守密码子/密码子对分布的合成算法作为编辑器的一部分来执行，但更重要的是用于实现此类偏好的异质组合的算法。因为此类组合导致计算上难以处理的 (NP-完全)问题，所以启发式优化必要地在编辑器中起重要作用。采用了模拟退火技术来实现此类设计；这是特别适当的，因为模拟退火在早期VLSI设计工具中实现了它的第一个实际用途。
全特征化的基因设计编程环境是平台独立的，在Linux、Windows和MacOS中运行。所述系统设计为在细菌或真菌(酵母)级别上操作基因组，并通过下文描述的新的减毒病毒设计的合成和评估得到验证。
在一个或少量氨基酸中具有极端密码子偏倚的病毒设计
对于活疫苗，病毒应尽可能地虚弱，但未达到灭活，那样就没有方法培养和生产病毒了。一种获得最优虚弱程度的方法是稀有密码子的置换加工为仅针对一个或少量氨基酸，并产生过表达与那些稀有密码子结合的稀有tRNA的对应细胞系。所述病毒然后即能够在所述专门的、容许的细胞系中有效地生长，但在正常的宿主细胞系中不能生存。使用容许细胞系培养和生产病毒，这不仅非常方便，而且比目前所用的用于生产活的减毒疫苗的方法更加安全。
随着人类基因组的测序，有关读取稀有密码子的各种tRNA基因的拷贝数的信息是可得的。根据文献(如Lavner和Kotlar，2005)，用于本发明目的的最佳稀有密码子是CTA(Leu)，一种仅有两个拷贝的相关tRNA基因的非常稀有的密码子；TCG(Ser)，一种有四个拷贝的相关tRNA基因的稀有密码子；和CCG(Pro)，一种有四个拷贝的相关tRNA基因的稀有密码子(Lavner和Kotlar，2005)。特定类型的tRNA基因拷贝数的中值是9，而范围是2至33拷贝(Lavner和Kotlar，2005)。因此，CTA密码子不仅是稀有密码子，而且还是具有最少相关tRNA基因的一个密码子。这些密码子不被任何其他tRNA阅读；例如，它们不经由摆动碱基配对阅读。
将遍及病毒基因组的编码Leu(180个密码子)、Ser(153)和Pro(119)的所有密码子分别改变为稀有的同义密码子CTA、TCG或CCG，预期产生严重虚弱或甚至不能生存的病毒。然后可产生过表达对应的稀有tRNA的辅助细胞。对应的病毒绝对地依赖于仅在此人工培养系统的生长，提供产生用于疫苗生产的病毒的安全的最大极限。
设计并合成了四种高优先级的病毒：在单个病毒中，所有Leu密码子转变为CTA；所有Ser密码子转变为TCG；所有Pro密码子转变为CCG；和所有Leu、Ser和Pro密码子分别转变为CTA、TCG和CCG。在一实施方案中，这些置换仅在病毒的衣壳区中进行，其中高速率的翻译是最重要的。在另一实施方案中，所述置换是遍及所述病毒进行的。
CG二核苷酸偏倚病毒
除了少数例外，病毒基因组低表现二核苷酸CpG，但不低表现GpC(Karlin等人，1994)。这一现象与基因组整体的G+C含量无关。CpG在人类基因组中通常被甲基化，所以含有未甲基化的CpG二核苷酸的单链DNA(如细菌和DNA病毒中通常存在的)被Toll-样受体9识别为病原体特征。这导致先天免疫系统的激活。虽然相似的系统尚未显示对RNA病毒起作用，但是对PV基因组的检查表明PV不选择(selected against)含有CpG的同义密码子的程度甚至大于CpG二核苷酸在人类中的显著低表现。对于精氨酸密码子，这尤为惊人。在六种同义的Arg密码子中，含有CG的四种密码子(CGA、CGC、CGG、CCU)加在一起仅占所有96个Arg密码子中的24个，而剩余两种(AGA、AGG)占72个。这与平均的人类密码子使用相反，其预测65个含有CG的密码子和31个AGA/AGO密码子。事实上，在PV中低表现的密码子中有两种是在人类细胞中常用的(CGC、CGG)。有CG可能是PV中不利的二核苷酸的两条其他线索。第一，在密码子对去优化的病毒中，引入的稀有密码子对中的许多含有CG作为密码子对六聚体的中央二核苷酸。第二，当Bums等人(2006)将他们的密码子偏倚去优化的病毒传代并测序基因组时，观察到这些病毒进化为除去一些CG二核苷酸。
因此，在一高优先级的重新设计的病毒中，大多数或全部Arg密码子被改变为CGC或CGG(两种常用人类密码子)。这并不消极地影响翻译，而允许评估CpG二核苷酸偏倚对病毒生长的效应。所得病毒的增加的C+G含量要求小心地监测二级结构；就是说，不允许Arg密码子的变化产生显著的二级结构。
同时调节密码子偏倚和密码子对偏倚。
密码子偏倚和密码子对偏倚可令人信服地在翻译水平彼此相互作用。理解此相互作用使得可预测性地调节任何给定蛋白质的可翻译性(可能是在极端范围上)成为可能。
如果我们将野生型脊髓灰质炎密码子偏倚和密码子对偏倚表示为0，而最差的可能密码子偏倚和密码子对偏倚表示为-1，则四种高优先级病毒是(-0.3，-0.3)、(-0.3，-0.6)、(-0.6，-0,3)和(-0.6、-0.6)病毒。这些病毒揭示中度不良或非常不良的密码子偏倚如何与中度不良或非常不良的密码子对病毒相互作用。将这些病毒与野生型还有极端的PV-AB(-1，0)和PV-Min(0，-1)设计进行了比较。
调节RNA二级结构
以上合成设计避免了过多的二级结构。两种另外的设计系统地避免了二级结构。这些病毒被加工为具有(1)可证明地最少的二级结构和(2)足以减缓翻译的许多小二级结构的wt密码子和密码子对偏倚。
另外的病毒设计
另外的病毒设计包括全基因组密码子偏倚和密码子对偏倚设计；非CG密码子对偏倚设计；降低密度的稀有密码子设计；和具有约150个稀有密码子的病毒(散步遍及衣壳区，或聚集于衣壳的N-末端，或聚集于衣壳的C-末端)。
实施例14
测试偶然地生成具有增加毒力的病毒的可能。
以使病毒减毒为目标的病毒基因组的重新设计可偶然地制造出比wt病毒致病性更强的病毒在理论上是可能的。因为SAVE规程中的蛋白质序列未被改变，所以这一结果是不可能的。尽管如此，仍期望通过实验证实SAVE方法是有利的。
在可能编码PV蛋白质的10442种可能序列中，一些具有合理适合度的PV版本很可能在过去的一些时间点产生，并进化至局部最优(与全局最优 相对)。生成具有相同蛋白质编码能力但非常不同的密码子组的新版本的PV将此新病毒置于全局适合度地形(1andscape)中的不同位置，这可令人信服地接近于不同于wt PV的局部最优。令人信服地，此新的局部最优可比野生型局部最优更好。因此，改组同义密码子可产生更具适合度的病毒是不太可能的。
为了研究此可能性，重新设计并合成了13种PV基因组：一种具有最佳可能的密码子偏倚的病毒；一种具有最佳可能的密码子对偏倚的病毒(即PV-Max)；一种具有最佳可能的密码子和密码子对偏倚的病毒；和10种具有wt密码子和密码子对偏倚但改组的同义密码子的另外的病毒。其他参数，诸如二级结构、C+G含量和CG二核苷酸含量，被维持在尽可能地接近于wt水平。
这13种病毒可各自与彼此和与野生型处于全局适合度地形的非常不同的位置。但是它们没有一个是处于局部最优，这是因为它们未经受选择。将这13种病毒和wt传代，并在第l、10、20和50次传代时采集样品病毒。通过评估噬斑大小、一步生长曲线中的噬斑形成单位/ml和每细胞形成的微粒数，将它们的适合度彼此进行比较和与wt进行比较。参见实施例1。在第10、20和50次传代后测序这13种病毒中每一种的五个实例。在CD155tg小鼠中测试所选传代分离株的致病性，并确定LD50。这些测定揭示是否有任何病毒比wt更具适合度，并提供偶然产生特别致病的病毒的风险的定量量度。具有wt水平的密码子和密码子对偏倚的10种病毒还提供有关适合度地形在编码水平的可变性的信息。
鉴于可能出现更具适合度的病毒的可能性，而更具适合度的病毒可能是更危险的病毒，这些实验在BSL3实验室中进行。在第10次传代后，评估表型和序列，并验证出现的病毒对PV特异性抗体的中和的易感性。如果获得朝向显著更具适合度的病毒的进化或朝向逃避抗体中和的新蛋白质序列的系统进化的任何证据，则停止实验并重新考虑。在进行至第50次传代之前，在第20次传代后相似地评估表型和序列。因为合成病毒产生为与wt病毒编码完全相同的蛋白质，增加毒力的范围看来是非常有限的，即使观察到朝向(轻微地)增加适合度的进化。
实施例15
将SAVE方法扩展到不同于脊髓灰质炎病毒的病毒系统
尽管在根除脊髓灰质炎的全球行动的结束阶段潜在需要新的脊髓灰质炎疫苗来对抗可能的回复突变，但是本研究中选择PV主要是作为用于开发SAVE的模式系统。然而，开发SAVE是期望可将此方法扩展到需要疫苗的其他病毒。SAVE策略的这一扩展在本文通过对鼻病毒(普通感冒的病原体)和对流感病毒的应用进行例证。
使SAVE适应于人类鼻病毒-一种与脊髓灰质炎病毒密切相关的病毒
两种模式鼻病毒HRV2和HRV14被选择用来测试SAVE方法，这是基于若干个原因：(1)HRV2和HRV14代表两个不同的遗传亚组A和B的两个成员(Ledf0rd等人，2004)；(2)这两种模式病毒使用不同的受体，分别为LDL-受体和ICAM-1(Greve等人，1989；Hofer等人，1994)；两种病毒以及它们的感染性cDNA克隆已广泛使用，并且大多数适用的材料和方法也已确立(Altmeyer等人，199l；Gerber等人，2001)；和(4)可得的鼻病毒的分子知识中的许多都是源于对这两种血清型的研究。
将通过PV实验开发的最有保证的SAVE策略应用于HRV2和HRV14的基因组。例如，密码子、密码子对、二级结构或其组合被去优化。对于每种基因型，合成具有不同减毒程度的两至三种基因组。小心不要改变CRE，一种约60核苷酸的关键RNA二级结构(Gerber等人，2001；Goodfe11ow等人，2000；McKnight，2003)。此元件对小RNA病毒的复制至关重要，因此在重新设计基因组时必须保持该结构本身。CRE在基因组中的位置对不同小RNA病毒而言是不同的，但对大多数科来说是已知的(Gerber等人，200l；Goodfellow等人，2000；McKnight，2003)，并且对于缺乏实验证据的其他病毒，其可通过同源建模推断。在HRV2的情形中，CRE位于对应于非结构蛋白质2Apro的RNA序列；而HRV14的CRE位于VPl衣壳蛋白区(Gerber等人，2001；McKnight，2003)。
从DNA基因组等同物衍生鼻病毒的反向遗传学系统与上文所述的用于PV的大致相同，除了转染是在HeLa-H1细胞中在34℃下于含有3mM Mg++以稳定病毒衣壳的Hcpcs-缓冲培养基中进行。在组织培养物中测定所得的合成病毒以确定PFU/IU比值。参见实施例3。噬斑大小和一步生长曲线中的动力学也如所述地进行。参见实施例2。因为SAVE过程可相对较廉价地应用于所有100种左右的相关鼻病毒，所以使用此方法产生普通感冒的安全和有效的疫苗是可行的。
使SAVE适应于甲型流感病毒-一种与脊髓灰质炎病毒无关的病毒
使用从PV实验鉴别的最有保证的SAVE设计标准合成流感病毒的密码子去优化的版本。流感病毒是由八个分开的RNA区段组成的“区段化"病毒，这些中的每一个可被密码子改良。使用确立的双义质粒反向遗传学系统产生流感病毒株系A/PR/8/34的变体。此八质粒系统是先前描述的系统fHoffmann等人，2000)的变异，并由P.Palese博士和A.Garcia-Sastre博士慷慨提供。简要而言，各自包含于分开的质粒的流感的八个基因组区段在反义链的3’端侧翼于Poi I启动子，并且在5’端侧翼于Pol I终止子。此盒依次在正义链的5’端侧翼于巨细胞病毒启动子(PolII启动子)，并且在3’端侧翼于加A信号(Hoffmann等人，2000)。在共转染入共培养的293T和MDCK细胞后，每个双义表达盒产生两种类型的RNA分子。正义链上的PolII转录单位产生病毒蛋白质的蛋白质合成必需的所有流感mRNA。反义链上的Poi I转录单位产生核糖核蛋白复合体装配和包壳必需的反义基因组RNA区段。从而形成感染性流感A/PR/8/34微粒(图10)。Hl N1血清型的此特定株系对人类是相对良性的。已使其适应于在组织培养细胞中生长，并且它对于研究发病机理是特别有用的，因为它在BALB/c小鼠中是致病的。
当合成可变剪接的区段(NS和M)时，小心不要破坏剪接位点和可变读码框。在所有情形中，每个区段任一端的末端120nt被排除，因为已知这些序列含有RNA复制和病毒装配的信号。合成每个片段的至少两个版本(中等和最大去优化的)。产生其中仅一个区段被改良的病毒，评估效应，并根据需要引入更多的改良的区段。这在此系统中是容易的，因为每个区段在分开的质粒上。
通过MDCK细胞上的噬斑测定在1ug/ml(TPCK)-胰蛋白酶存在下滴 定病毒感染，睦。替代地，根据不同病毒构建体的数量，使用96-孔ELISA将各种病毒的滴度确定为MDCK细胞上的细胞感染单位，基本如上文所述用于PV的。参见实施例3。唯一的差异是现在使用HA特异性抗体来染色感染的细胞。此外，病毒粒子的相对浓度经由使用鸡红细胞(KBC)的血凝(HA)测定(Charles River Laboratories)使用标准方案(Kendal等人，1982)确定。简要而言，将病毒悬浮液在V-型底96孔板中于PBS中2倍系列稀释。PBS单独用作测定对照。向各孔中添加标准量的RBC，短暂地摇动板，并在室温下孵育30分钟。HA滴度读取为具有完全血凝的最后一个孔的倒数病毒稀释度。HA-滴度是存在的微粒量的直接结果，而PFU-滴度是感染性的功能量度。通过确定两种量度，与PV实验中描述的PFU/微粒比值相似地计算相对的PFU/HA-单位比值。参见实施例3。这解决了密码子和密码子对去优化的流感病毒是否也和观察的PV一样展示更低的PFU/微粒的问题。
毒力测试
首先确定小鼠的母体NPR/8/34病毒的致死剂量50(LD50)，然后选择合成的流感病毒通过鼻内感染来感染BALB/c小鼠。用于确定LD50值的方法是本领域普通技术人员公知的(参见Reed和Muench，1938和实施例4)。理想的候选病毒展示低感染性(低PFU滴度)和高病毒粒子浓度(高HA-滴度)。向麻醉小鼠的每个鼻孔中施用于PBS中的25μl病毒溶液，所述溶液含有介于102至107PFU病毒的10倍系列稀释物。监测死亡率和发病率(体重下降、活动减少)，每天两次，多达三周。LD5o通过Reed和Muench(1938)的方法计算。对于A/PR/8/34wt病毒，预期的LD50在103PFU左右(Talon等人，2000)，但是可因滴定病毒所在的具体实验室条件而有所不同。
使SAVE适应于登革、HIV、轮状病毒和SARS
选择了几种病毒来进一步测试SAVE方法。表8鉴别了登革、HIV、轮状病毒(两个区段)和SARS的每一种的编码区，并提供了母体病毒的核苷酸序列和具有去优化的密码子对偏倚的示例性病毒基因组序列。如上所述，确定了编码序列的密码子对偏倚，即使仅一个部分(子序列)可含有去优化的突变。
*-CPB可通过去优化小于完整编码序列的内部区段被降低.尽管如此，计算完整CDs的CPB。
实施例16
脊髓灰质炎病毒和流感病毒疫苗候选物在小鼠中的评估
测试了去优化的病毒针对脊髓灰质炎或流感疫苗接种小鼠的能力。
脊髓灰质炎病毒免疫接种、抗体滴度和wt攻击实验
现在起作用的假设是好的疫苗候选物兼有低感染滴度和高病毒粒子滴度。这确保可注射大量病毒微粒(即抗原)而同时具有低风险谱。因此，对各组的五只CD155tg小鼠腹膜内注射103、104、105和106PFU的PV(Mahoney)(即野生型)、PV1Sabin疫苗株系、PVAB2470-2954、PV-Min75S-2470或本研究过程中开发的其他保证减毒的脊髓灰质炎病毒。对于野生型，1PFU是约100个病毒微粒，而对于所述减毒病毒，1PFU是大约5,000至100,000个微粒。因此，注射等量PFU意指注射50至1000倍更多的减毒病毒。对于腹膜内注射的wt病毒，LD50是约106PFU或约108个微粒。因此，预期最高剂量而不是较低剂量具有一些杀伤作用。
相同剂量的加强针在初始接种后一周和四周进行。第二次加强后一周，通过噬斑减小测定来确定PV-中和抗体滴度。为此，将100PFU的wtPV(M)病毒与免疫接种小鼠的血清的2倍系列稀释液孵育。通过噬斑测定确定残留的PFU数。中和抗体滴度表示为未观察到噬斑的最低血清稀释度的倒数。
最后一次加强四周后，免疫接种小鼠和未免疫接种的对照用致死剂量的PV(M)wt病毒攻击(106PFU腹膜内；这等于100倍的LD50攻击，并监测存活率。
流感免疫接种、抗体滴度和wt攻击实验
对于疫苗接种实验，对各组的5只BALB/c小鼠以0.001、0.01、0.1和1.0LDso的剂量腹膜内注射减毒的流感病毒。加强疫苗接种以如上文所述的用于PV的相同间隔进行。流感抗体滴度在第二次加强后一周根据标准方案通过抑制血凝(HI)测定来确定(Kendal等人，1982)。简要而言，用受体破坏酶(receptor destroying enzyme,RDE；Sigma，St Louis，MO)处理的免疫接种和对照小鼠血清进行2倍系列稀释，并与5HA-单位A/PR/8/34病毒在V-型底96孔中混合。然后添加RBC，并且板的处理如上文的标准HA-测定。抗体滴度表示为造成血凝的完全抑制的倒数稀释度。
最后一次加强疫苗接种后三周，以100或1000LD50的A/PR/8/34母体病毒(大约105和10b PFU)鼻内(infra-nasally)攻击小鼠，并监测存活率。
动物操作
表达人类脊髓灰质炎病毒受体CD155的转基因小鼠(CD155tg)获自东京大学的Nomoto博士。CD155tg小鼠群体在State University ofNew York(SUNY)动物设施中喂养。BALB/c小鼠获自Taconic(Germantown，NY)。使用25号(gauge)皮下注射针头以30μ1病毒悬浮液通过静脉内、腹膜内或大脑内路径或50ul通过鼻内路径接种麻醉的小鼠。使用6-24周龄的两种性别的小鼠。小鼠是用于脊髓灰质炎病毒和流感病毒研究的最经济的模型系统。此外，在PV的情形中，CD155tg小鼠系是除非人灵长类外的唯一动物模型。小鼠还提供最安全的动物模型，因为对于脊髓灰质炎病毒和流感病毒二者来说，动物之间不发生病毒传播。
所有小鼠居住在SUNY的由实验室动物研究系(Department of Laboratory Animal Research，DLAR)和其兽医员工主办的最先进的动物设施中。所有动物由兽医员工每周检查两次。病毒感染的动物由研究人员每天检查两次，并由兽医员工每天检查一次。所有感染实验在所述动物设施内专门设计的隔离度最高的房间进行。在有实验结论后，存活的小鼠被安乐死，而尸体经高压灭菌进行灭菌。没有小鼠活着离开病毒室。
在本研究中，小鼠未经受除静脉内、大脑内、腹膜内、肌内或鼻内接种、注射麻醉剂和采集血样之外的任何手术程序。对于疫苗接种实验，在疫苗接种之前和之后采集血样以检测病毒特异性抗体。为此，在注射前一天和第二次加强疫苗接种后一周从小鼠采集50-100μl。个体动物的最多两个血样至少间隔四周采集。将动物麻醉，并使用锋利的解剖刀切下2mm的尾部。用毛细管采集血液。后续的样品采集通过除去尾部的疤获得。如果尾巴愈合，则重复新的2-mm尾部剪断。
所有动物实验均按照SUNY机构动物照料和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案执行。麻醉由经过培训的人员在C02气室中根据美国兽医协会(American Veterinary Medical Association)的建议执行。感染实验根据疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)颁布的最新ABSL2/脊髓灰质炎建议执行。
实施例17
密码子对偏倚算法-密码子对偏倚和得分矩阵
在大多数生物体中，存在不同的密码子偏倚，其描述特定密码子比其他密码子更频繁地编码氨基酸的偏好。广泛相信密码子偏倚与蛋白质翻译速率有关。此外，每个物种对于给定的密码子对是否在基因序列中显示为邻居具有特异性的偏好，这被称为密码子对偏倚。
为了定量密码子对偏倚，我们将密码子对距离定义为生物体的基因中密码子对的观察发生次数与预期发生次数(频率)的log比值。虽然计算一组基因中密码子对的观察频率是直接的，但是密码子对的预期频率是按Gutman和Hatfield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3699-3703，1989计算的，并且独立于氨基酸和密码子偏倚。为了实现这一点，基于氨基酸由特定密码子编码的次数的相对比例计算预期频率。简言之：
密码子对得分 = log ( F ( AB ) F ( A ) × F ( B ) F ( X ) × F ( Y ) × ( XY ) )
其中密码子对AB编码氨基酸对XY，而F指频率(发生次数)。
在此纲要中，我们可定义64×64密码子对距离矩阵，而所有对的值(cost)如上文所定义。可通过平均包含其编码的密码子对得分将任何m-残基蛋白质(m-residue protein)检定为使用过表现或低表现密码子对。
基于密码子对偏倚优化基因编码
为了检查密码子对偏倚对特定蛋白质的翻译的影响，我们决定改变密码子对而保持相同密码子分布。所以我们阐释了下列问题：给定氨基酸序列和一组密码子频率(密码子分布)，改变序列的DNA编码以优化(通常是最小化或最大化)密码子对得分。
我们的问题，如上文所阐释的，可与旅游推销员问题(TravelingSalesman Problem，TSP)有关。旅游推销员问题是最出名的NP-完全问题。这是其总有效性的函数，并且因为其易于向公众详细解释。设想旅游推销员必须驾车访问给定的城市组。将使他做到这一点并回家，从而使他的总驾驶最小化的最短路径是什么？
TSP探索
几乎TSP的任何flavor都将是NP-完全的，所以正确的前进方式是探索性的。这些通常是非常成功的，一般在最优解决方案的几个百分比内，这对于大多数应用和特别地我们的优化的编码是足够的。
最小生成树(Minimum spanning trees)一一种简单并流行的探索，特别是当位点代表平面中的点时，是基于点的最小生成树。通过对此树进行深度优先(depth-first)搜索，我们刚好沿树的每一边走两次，一次向下(当我们发现新的顶点时)，而一次向上(当我们返回时)。然后我们可根据发现顶点的顺l页序制定顶点的旅行(tour)，并使用每个相邻顶点对之间的最短路径以此顺序连接它们。如果图是完整的，此路径必须是单个边并遵守三角不等式，像平面中的点那样。得到的旅行永远是最小TSP旅行的长度的最多两倍。实际上，这通常是更好的，一般超过最优值15％至20％。此外，算法的时间受计算最小生成树的时间的约束，在平面中的点的情形中仅有O(nlgn)。
渐进的插入方法-一种不同的探索类别，向局部旅行插入新的点，一次一个(从单个顶点开始)，直至旅行完成。此探索的看起来作用最佳的版本是最远的点插入：在所有的剩余点中，插入点V于局部的旅行T，以佳
max v ∈ V min i = 1 | T | ( d ( v , v i ) + d ( v , v i + 1 ) ) .
最小值确保我们在向旅行添加最小距离量的位置上插入顶点，而最大值确保我们首先挑选最差的此类顶点。这看起来很好地起作用，因为它在填充细节之前首先“大体描述出”局部旅行。典型地，此类旅行仅比最优旅行长5％至10％。
k，最优(k-optimal)旅行-显著更强大的是Kernighan-Lin或k-opt类别的探索。从任意旅行开始，所述方法对旅行应用局部改善以希望改进它。特别地，从旅行中删除k≥2边的子集，并以不同的方式重新连接k残留子链，以查看所得旅行是否改进。当没有k边的子集可以被删除并重新连 接以降低旅行成本时，旅行即是k-最优的。广泛的实验表明3最优(3optimal)旅行通常在最优旅行成本的几个百分比内。对于k＞3，计算时间的增加比解决方案质量的增加快出相当多。2优化(two-opting)旅行是改进任何其他探索的快速且有效的方式。模拟退火提供使用边翻转(edge flips)改进探索旅行的替代机制。
用于解决最优编码问题的算法
如所阐释的，我们的问题与在64-国家矩阵(metric)下找到旅游推销员路径(而不是旅行)的问题有关。在此表示法中，64种可能的密码子的每一种类似于一个国家，而密码子多样性建模为这个国家的城市数。密码子对偏倚量度反映为国家距离矩阵。
在密码子对偏倚量度下使用给定组的密码子多样性设计编码特定蛋白质的基因以优化基因/DNA序列的实际生物学问题略有不同。在我们的国家TSP模型中缺少的是编码特定蛋白质序列的需要。DNA三联体密码将64种密码子分成21种等同类别(编码20种可能的氨基酸中的每一种和终止符号)。可通过挑选编码它的相关密码子等同类别的任意代表指定任何给定的蛋白质/氨基酸序列。
由于我们的问题的特殊限制和本质，以及其在优化中应用另外的标准的适应性，我们选择模拟退火探索来优化序列。该技术概括于下文。
模拟退火探索 
模拟退火是允许导致更昂贵(并因此更差)的解决方案的偶然转变的探索式搜索过程。这听起来可能不像胜利，但是它起到了帮助防止我们的搜索陷于局部最优的作用。
模拟退火的灵感来自将熔化的材料冷却至固体状态的物理过程。在热动力学理论中，系统的能态是通过构成它的各个微粒的能态来描述的。每个微粒的能态大约随机地跳跃，此类跃迁受系统温度的支配。特别地，在温度T下从能量ei跃迁至ej的概率P(ei，ej，T)由下式给出：
P ( c i , c j , T ) = e ( e i - e j ) / ( kBT ) 其中kB是常数，称为玻尔兹曼常数(Boltzmann’sconstant)。此公式的含义是什么？考虑不同条件下的指数值。从高能态移动至较低能态的概率是非常高的。然而，也存在接受向高能态跃迁的非零概率，且小的能量跳跃比大的更有可能。温度越高，此类能量跳跃发生的可能性越大。
这对于组合优化有什么相关性呢？当物理系统冷却时，它试图前进至最低的能态。对于微粒的任何离散集合，使总能量最小是组合优化问题。通过根据以上概率分布的随机跃迁，我们可模拟解决任意组合优化问题的物理学。
对于局部搜索，问题表示包括解决方案空间的表示和测量给定解决方案的质量的适当的且易于计算的成本函数C(s)二者。新的组成是冷却方案，其参数支配有多大的可能性我们接受差的跃迁作为时间的函数。
在搜索的开始，我们渴望使用随机性广泛地探索搜索空间，所以接受负跃迁的概率应该是高的。随着搜索的进行，我们试图将跃迁限制于局部改进和优化。冷却方案可受下列参数调节：
初始系统温度一典型地t1＝1。
温度递减函数一典型地tk＝α·tk-1，其中0.8≤α≤0.99。这暗示温度的指数衰减(与线性衰减相对)。
温度变化之间的迭代次数-典型地，在降低温度之前可允许100至1，000次迭代。
接受标准-典型的标准是当C(Sif+1)＜C(si)时接受从si向si+1的任何跃迁，并在以下任何时候接受负跃迁
e - ( C i s i ) - C ( s i - 1 ) ct i ≥ 1 .
其中r是随机的数字0≤r＜1。常数c归一化此成本函数，以使几乎所有跃迁在起始温度下都是被接受的。
停止标准-典型地，当目前的解决方案的值在大约最后一次迭代内未改变或改进时，终止搜索并报告当前的解决方案。
在专家手中，用于TSP的最佳问题特异性探索的效果可比模拟退火略好，但是模拟退火解决方案工作容易，效果好。
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Claims (83)

1.一种减毒病毒，其包含病毒基因组，所述病毒基因组含有改良的蛋白质编码核苷酸序列，所述改良的蛋白质编码核苷酸序列具有低于它所衍生自的母体蛋白质编码核苷酸序列的密码子对偏倚的密码子对偏倚，并且具有以重排的顺序存在的来自母体的现有同义密码子。
2.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有比所述母体蛋白质编码序列的密码子对偏倚低至少约0.05的密码子对偏倚。
3.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有比所述母体蛋白质编码序列的密码子对偏倚低至少约0.1的密码子对偏倚。
4.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有比所述母体蛋白质编码序列的密码子对偏倚低至少约0.2的密码子对偏倚。
5.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有约-0.05或更低的密码子对偏倚。
6.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有约-0.1或更低的密码子对偏倚。
7.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有约-0.3或更低的密码子对偏倚。
8.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有约-0.4或更低的密码子对偏倚。
9.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列与母体病毒的蛋白质编码序列具有低于90％的同一性。
10.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列与母体病毒的蛋白质编码序列具有低于80％的同一性。
11.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列和所述母体蛋白质编码序列编码同一蛋白质。
12.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列编码与天然分离物具有约10氨基酸或更少差异的蛋白质。
13.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列编码与天然分离物具有约20氨基酸或更少差异的蛋白质。
14.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列在至少约100核苷酸的长度上被改良。
15.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列在至少约500核苷酸的长度上被改良。
16.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列在至少约1000核苷酸的长度上被改良。
17.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒感染动物或植物。
18.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒感染人类。
19.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒诱导动物宿主中的保护性免疫应答。
20.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列的回复突变于宿主中生长时被充分抑制。
21.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒是DNA、RNA、双链或单链病毒。
22.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述蛋白质编码序列编码多蛋白。
23.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述核苷酸序列编码衣壳蛋白。
24.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒是脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、流感病毒、重症急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、传染性支气管炎病毒、依波拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒、西尼罗病病毒、埃巴病毒(EBV)或黄热病毒。
25.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述病毒是痘病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒或腺病毒。
26.如权利要求24所述的减毒病毒，其中所述减毒的脊髓灰质炎病毒衍生自脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney)、脊髓灰质炎病毒2型(Lansing)、脊髓灰质炎病毒3型(Leon)、单价口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)病毒或三价OPV病毒。
27.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述同义密码子重排分布遍及所述改良的蛋白质编码序列。
28.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述同义密码子重排限制于所述改良的蛋白质编码序列的一部分。
29.如权利要求27所述的减毒病毒，其中所述部分编码衣壳的一种或多种蛋白质。
30.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是小RNA病毒。
31.如权利要求30所述的减毒病毒，其中所述小RNA病毒是脊髓灰质炎病毒。
32.如权利要求31所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4或其部分。
33.如权利要求31所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:6。
34.如权利要求30所述的减毒病毒，其中所述小RNA病毒是鼻病毒。
35.如权利要求34所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32或其部分。
36.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是正黏病毒。
37.如权利要求36所述的减毒病毒，其中所述正黏病毒是流感病毒。
38.如权利要求37所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和其部分中的一种或多种。
39.如权利要求37所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:23。
40.如权利要求37所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21。
41.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是黄病毒。
42.如权利要求41所述的减毒病毒，其中所述黄病毒是登革病毒。
43.如权利要求42所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:34。
44.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是反转录病毒。
45.如权利要求44所述的减毒病毒，其中所述反转录病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)。
46.如权利要求45所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:36。
47.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是呼肠孤病毒。
48.如权利要求47所述的减毒病毒，其中所述呼肠孤病毒是轮状病毒。
49.如权利要求48所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40。
50.如权利要求1至29的任一项所述的减毒病毒，其中所述病毒是冠状病毒。
51.如权利要求50所述的减毒病毒，其中所述冠状病毒是重症急性呼吸综合征(SARS)病毒。
52.如权利要求51所述的减毒病毒，其中所述病毒基因组的核苷酸序列包含SEQ ID NO:42。
53.一种制备减毒病毒基因组的方法，所述方法包括：
a)获得母体病毒蛋白质编码区的核苷酸序列；
b)重排所述核苷酸序列的密码子以获得如下的突变的核苷酸序列
i)与所述母体病毒的编码区编码相同氨基酸序列，和
ii)与所述母体病毒的编码区相比具有降低的密码子对偏倚；和
c)将所述突变的核苷酸序列的全部或部分置换入所述母体病毒的核苷酸序列。
54.如权利要求53所述的方法，其中重排密码子包括随机地选择并交换编码相同氨基酸的密码子对和确定密码子对偏倚是否被所述交换降低的步骤。
55.如权利要求54所述的方法，其中重复所述步骤至密码子对偏倚被降低期望的量。
56.如权利要求54所述的方法，其中重复所述步骤至密码子对偏倚收敛于或接近优化值。
57.如权利要求53至56的任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在计算机上执行。
58.如权利要求53所述的方法，其中步骤(c)通过从头合成所述突变的核苷酸序列实现。
59.如权利要求58所述的方法，其中用合成的DNA置换所述完整基因组。
60.如权利要求58所述的方法，其中用合成的DNA置换所述病毒基因组的一部分。
61.如权利要求53所述的方法，其中所述母体病毒是天然分离物。
62.如权利要求53所述的方法，其中所述母体病毒是天然分离物的突变体。
63.一种制备减毒病毒的方法，所述方法包括将通过如权利要求53所述的方法制备的减毒病毒基因组插入宿主细胞，借以生产减毒病毒。
64.一种用于诱导受治疗者中的保护性免疫应答的疫苗组合物，其包含如权利要求1至52的任一项所述的减毒病毒和药学可接受的载运体。
65.如权利要求64所述的疫苗组合物，其中所述减毒病毒(i)不显著改变病毒蛋白质在受感染细胞中的合成和加工；(ii)在每个受感染细胞中产生与野生型病毒相似量的病毒粒子；和/或(iii)展示显著低于野生型病毒的病毒粒子比感染性。
66.如权利要求64所述的疫苗组合物，其中所述减毒病毒在宿主动物中诱导与对应的野生型病毒大致相似的免疫应答。
67.如权利要求64所述的疫苗组合物在制备用于引起受治疗者中的保护性免疫应答的药物中的用途。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述受治疗者已暴露于致病性病毒。
69.如权利要求64所述的疫苗组合物在制备用于防止受治疗者患上病毒相关疾病的药物中的用途。
70.如权利要求69所述的用途，其中所述受治疗者已暴露于致病性病毒。
71.如权利要求64所述的疫苗组合物在制备用于在感染病毒的受治疗者中延迟病毒相关疾病的发作或减缓病毒相关疾病的进展速率的药物中的用途。
72.如权利要求67至71的任一项所述的用途，其中所述药物还包括至少一种佐剂。
73.如权利要求67至71的任一项所述的用途，其中所述受治疗者是哺乳动物或鸟。
74.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是人类。
75.如权利要求73所述的用途，其中所述鸟是驯养的家禽物种。
76.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是驯养的牲畜物种。
77.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是牛。
78.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是猪。
79.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是绵羊。
80.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是马。
81.如权利要求73所述的用途，其中所述哺乳动物是外来的动物园动物。
82.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有比所述母体蛋白质编码序列的密码子对偏倚低至少约0.3的密码子对偏倚。
83.如权利要求1所述的减毒病毒，其中所述改良的蛋白质编码序列具有比所述母体蛋白质编码序列的密码子对偏倚低至少约0.4的密码子对偏倚。
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