JP2015091247A - ワクチンに有用な弱毒化ウイルス - Google Patents
ワクチンに有用な弱毒化ウイルス Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015091247A JP2015091247A JP2014257141A JP2014257141A JP2015091247A JP 2015091247 A JP2015091247 A JP 2015091247A JP 2014257141 A JP2014257141 A JP 2014257141A JP 2014257141 A JP2014257141 A JP 2014257141A JP 2015091247 A JP2015091247 A JP 2015091247A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- attenuated
- codon
- attenuated virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
- A61K39/13—Poliovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12361—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15061—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16061—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32061—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32661—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32661—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/32662—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32671—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32711—Rhinovirus
- C12N2770/32721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32711—Rhinovirus
- C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32711—Rhinovirus
- C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/32762—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
【課題】復帰の可能性が実質的になく、したがって、速く、効率的で、かつ安全なワクチンの製造方法を提供する弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法の必要性が依然として残っている。
【解決手段】本発明は、弱毒化生ウイルスが何百または何千もの小さい欠損を有するため、復帰の可能性が本質的にない弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法である合成弱毒化ウイルス工学(Synthetic Attenuated Virus Engineering:SAVE)を提供することによって、この必要性を満たす。この方法は、多様なウイルスに広く適用でき、多種多様の抗ウイルスワクチンを産生するための効果的な方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、弱毒化生ウイルスが何百または何千もの小さい欠損を有するため、復帰の可能性が本質的にない弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法である合成弱毒化ウイルス工学(Synthetic Attenuated Virus Engineering:SAVE)を提供することによって、この必要性を満たす。この方法は、多様なウイルスに広く適用でき、多種多様の抗ウイルスワクチンを産生するための効果的な方法を提供する。
【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2007年3月30日出願の米国出願第60/909,389号、および2008年3月7日出願の米国出願第61/068,666号に対する優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2007年3月30日出願の米国出願第60/909,389号、および2008年3月7日出願の米国出願第61/068,666号に対する優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金拠出
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号AI15122、国立科学財団からの助成金番号EIA0325123、および国立癌研究からの助成金番号T32−CA009176の下、合衆国政府の支援を受けて行われた。したがって、合衆国政府は本発明の一部の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号AI15122、国立科学財団からの助成金番号EIA0325123、および国立癌研究からの助成金番号T32−CA009176の下、合衆国政府の支援を受けて行われた。したがって、合衆国政府は本発明の一部の権利を有する。
著作権表示
本特許文献の本開示の一部分は、著作権保護の対象となる内容を含む。著作権所有者は、何人による特許文献または特許開示の複製に対しても、特許商標局の包袋または特許記録に見られる通りである限り異存はないが、それ以外はそれが何であれ全ての著作権の権利を留保する。
本特許文献の本開示の一部分は、著作権保護の対象となる内容を含む。著作権所有者は、何人による特許文献または特許開示の複製に対しても、特許商標局の包袋または特許記録に見られる通りである限り異存はないが、それ以外はそれが何であれ全ての著作権の権利を留保する。
本発明は、複数のヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスの生成に関する。ヌクレオチド置換は、コドンの他の同義コドンとの交換および/またはコドン対バイアスのコドン再編成および変化をもたらす。
DNA合成技術における急速な向上により、ウイルス学において利用される伝統的な方法の大変革が見込まれている。ウイルスゲノムの異なる領域の機能を排除するために伝統的に使用されてきた手法の1つは、ウイルス株のゲノムにおけるわずかな配列多様性の影響を調査するために、大規模であるが骨の折れる部位特異的変異誘発を利用する。ところが、ウイルスゲノム、特にRNAウイルスのものは比較的短く、しばしば10,000塩基長未満であり、現在利用可能な技術を使用する全ゲノム合成の影響を受けやすくする。近年開発されたマイクロ流体チップ技術は、1個わずか数百ドルの仕様に設計される、新ゲノムのデノボ合成を行うことができる。これは、従来のクローニング法では実質的に不可能な程度まで、全く新規のコード配列の生成または既存配列の調節を可能にする。
そのような設計の自由は、(1)ウイルス翻訳および複製効率への、コドンバイアス、コドン対バイアス、ならびにRNA二次構造等のパラメータの変化の影響を研究するために、(2)ウイルス複製の成功のために必要な未知の調節要素および他のシグナルに対して、効率的な全ゲノムスキャンを行うために、および(3)ウイルス株の遺伝子操作および抗ウイルスワクチンの設計のための新しいバイオ技術を開発するために、DNA/RNAコード配列の大規模な再設計を行うための驚異的な力を提供する。
遺伝子コードの縮退の結果として、タンパク質コード配列中の2個のアミノ酸を除く全てが、2個以上のコドンによってコード化されることができる。そのような同義コドンが使用される頻度は一定ではなく、しばしば希少あるいはそうでなければ不利なtRNAに対応する準最適コドンの過剰使用を防止するために、細胞の翻訳機構と共進化してきた(Gustafsson et al., 2004)。これは、「同義コドンバイアス」と呼ばれる現象をもたらし、これは進化的に遠い種の間、および場合によっては同種における異なる組織の間でさえ、大きく異なる(Plotkin et al., 2004)。
組み換え法によるコドン最適化(すなわち、遺伝子の同義コドンの使用を宿主細胞のコドンバイアスと一致させること)は、異種間発現を向上させるために広く使用されてきた(例えば、Gustafsson et al., 2004を参照)。準最適同義コドンの意図的導入による発現の減少という反対の目的は、広範囲に研究されてこなかったが、少数の報告は、天然コドンの希少コドンによる置換が、異なる生物中の遺伝子発現レベルを減少させることができることを示す。例えば、Robinson et al., 1984、Hoekema et al., 1987、Carlini and Stephan, 2003、Zhou et al., 1999を参照されたい。したがって、脱最適化された同義コドンのウイルスゲノムへの導入は、タンパク質翻訳に悪影響を及ぼす可能性があり、その結果、ウイルス性疾病に対するワクチンの製造に有用であり得る弱毒化ウイルスを産生するための方法を提供することができる。
ウイルス性疾病およびワクチン
ウイルスは、常にヒトの死および疾病の主な原因の1つである。細菌性疾病とは異なり、ウイルス性疾病は、抗生物質に対して感受性がなく、したがって、治療が困難である。したがって、ワクチン接種は、ヒトの主な、かつ最も強力なウイルス防御である。今日、天然痘および灰白髄炎(ポリオ)等の最も古く、かつ最も重いウイルス性疾病のいくつかは、世界的な予防接種計画によって根絶されている(またはほぼ根絶されている)。しかしながら、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルス等の多くの他の古いウイルスは、うまく抑制されておらず、なおも大きな問題を引き起こすが、これらの問題は、年ごとおよび国ごとに異なる。加えて、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)および重症急性呼吸器症候群(SARS)ウイルス等の新ウイルスが、ヒト集団において頻繁に発現し、しばしば死者を出す世界的大流行を引き起こす。また、戦争またはテロリズムの手段としての意図的導入のために、人間が製造した、または変化させた致死的なウイルスが発現する可能性もある。
ワクチンの効果的な製造は、依然として予測できない仕事である。ワクチンには、サブユニットワクチン、不活化(死菌)ワクチン、および弱毒化生ワクチンの3つの主な種類がある。サブユニットワクチンについては、ウイルスからの1つまたは複数のタンパク質(例えば、組み換えDNA技術を使用して製造されるキャプシドタンパク質)が、ワクチンとして使用される。大腸菌または酵母中で産生されるサブユニットワクチンは、非常に安全であり、ウイルス性疾病の脅威を与えない。しかしながら、それらの有効性は、免疫原性ウイルスタンパク質の全てが存在するとは限らず、存在するものも、それらの未変性構造で存在しない場合があるため、低い可能性がある。
不活化(死菌)ワクチンは、例えば、程度の差はあるが野生型(wt)のウイルスを増殖させ、次いで、ホルムアルデヒド(ソークポリオワクチンにあるような)で不活性化することによって製造される。ウイルスの全てを死滅させるが、それにもかかわらず粒子の免疫原性を損なわない不活化処理を発見するために、多くの実験が必要とされる。加えて、ウイルスを増殖させるための設備は、毒性ウイルスを漏らす可能性があるか、または不活性化が失敗する可能性があるという点で、残留物に関する安全問題が依然として残って
弱毒化生ワクチンは、ウイルスの毒性を弱め、予防接種に使用可能な状態にする変異を受けたウイルスを含む。生 弱毒化ウイルスは、ワクチンとして多くの利点を有する。それらは、製造が容易で、速く、かつ安価である場合が多く、投与が容易である場合が多く(例えば、サビンポリオワクチンは角砂糖で経口投与された)、また弱毒化ウイルスの残存増殖が、「集団」予防接種(一次患者と近く接触する人々の予防接種)を可能にする場合がある。これらの利点は、ワクチンがすぐに必要とされる緊急事態において特に重要である。弱毒化ワクチンの主な欠点は、かなりの頻度でwt毒性への復帰を有する点である。このため、サビンワクチンは、米国ではもはや使用されていない。
弱毒化生ワクチンは、ウイルスの毒性を弱め、予防接種に使用可能な状態にする変異を受けたウイルスを含む。生 弱毒化ウイルスは、ワクチンとして多くの利点を有する。それらは、製造が容易で、速く、かつ安価である場合が多く、投与が容易である場合が多く(例えば、サビンポリオワクチンは角砂糖で経口投与された)、また弱毒化ウイルスの残存増殖が、「集団」予防接種(一次患者と近く接触する人々の予防接種)を可能にする場合がある。これらの利点は、ワクチンがすぐに必要とされる緊急事態において特に重要である。弱毒化ワクチンの主な欠点は、かなりの頻度でwt毒性への復帰を有する点である。このため、サビンワクチンは、米国ではもはや使用されていない。
Alexander, H.E., G. Koch, I.M. Mountain, K. Sprunt, and O. Van Damme. 1958. Infectivity of ribonucleic acid of poliovirus on HeLa cell mono-layers Virology. 5:172-3.
したがって、復帰の可能性が実質的になく、したがって、速く、効率的で、かつ安全なワクチンの製造方法を提供する弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法の必要性が依然として残っている。本発明は、弱毒化生ウイルスが何百または何千もの小さい欠損を有するため、復帰の可能性が本質的にない弱毒化生ウイルスを生成するための、系統的方法である合成弱毒化ウイルス工学(Synthetic Attenuated Virus Engineering:SAVE)を提供することによって、この必要性を満たす。この方法は、多様なウイルスに広く適用でき、多種多様の抗ウイルスワクチンを産生するための効果的な方法を提供する。
本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスを提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドンを導入する。同義コドンのこの置換は、ゲノム中のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、RNA二次構造、CpGジヌクレオチド含有量、C+G含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、組織特異的マイクロRNA認識配列の有無、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々のパラメータを変化させる。多くの欠損が関与するため、本発明の弱毒化ウイルスは、多種多様のウイルス性疾病に対する安定弱毒化生ワクチンを産生する手段を提供する。
一実施形態では、親ウイルスの対応配列と同一である、ウイルスタンパク質またはその一部をコード化する核酸配列を含む、弱毒化ウイルスが提供され、弱毒化ウイルスのヌクレオチド配列は、それが由来する親配列のコドンを含有し、ヌクレオチド配列は、親ウイルスのヌクレオチド配列と90%未満相同である。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、親ウイルスの配列と80%未満相同である。弱毒化を提供する置換されたヌクレオチド配列は、少なくとも100ヌクレオチドの長さ、または少なくとも250ヌクレオチドの長さ、または少なくとも500ヌクレオチドの長さ、または少なくとも1000ヌクレオチドの長さである。弱毒化配列のコドン対バイアスは、親ウイルスのコドン対バイアスよりも少なく、少なくとも約0.05、または少なくとも約0.1、または少なくとも約0.2減少している。
弱毒化されるウイルスは、動物または植物ウイルスであることができる。ある実施形態では、ウイルスは、ヒトウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、複数の種を感染させる。特定の実施形態は、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、デングウイルス、HIV、ロタウイルス、およびSARSを含むがこれらに限定されない。
本発明はまた、本弱毒化ウイルスおよび薬剤として許容される担体を含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。本発明は、野生型宿主細胞において生存不能である弱毒化ウイルスに対して許容状態になるように特に操作された、改変宿主細胞株をさらに提供する。
加えて、本発明は、(a)ウイルスゲノムの少なくとも1つの非制御部分における複数の場所でコドンを同定するステップであって、コドンは、同義コドンによって置換されることができる、ステップと、(b)同定されたコドンの各々の代わりになる同義コドンを選択するステップと、(c)同定されたコドンの各々を同義コドンで置換するステップとを含む、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。
さらに、本発明は、コドン対バイアスを調節するために、同一アミノ酸をコード化する既存コドンのコード領域内の順序を変化させるステップを含む、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。
さらに、本発明は、前記の2つの方法を組み合わせる、本弱毒化ウイルスを合成するステップを提供する。
本発明にしたがって、 弱毒化ウイルス粒子は、宿主細胞にウイルスゲノムを導入し、それにより弱毒化ウイルス粒子が産生されることによって、製造される。本発明は、予防接種に好適な弱毒化ウイルスを含む、医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、予防上または治療上有効な用量の本ワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための、およびウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための、対象における防御免疫応答を誘起するための方法をさらに提供する。
本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスをさらに提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドンを導入し、ヌクレオチド置換は、それぞれのアミノ酸許容位置に同義コドンを無作為に割り当てることによって、コード配列を最初に作製するステップと、コード配列のコドン対スコアを計算するステップと、シミュレーテッドアニーリング最適化関数に従って、(a)同一アミノ酸をコード化するコドンの対、または(b)置換同義コドンのいずれかを無作為に選択および交換するステップと、特定の数または十分な数の反復にわたって、さらなる改善が認められなくなる(対スコアまたはバイアスの変化がなくなる)まで、解が最適値に、またはその近傍に収束するまで、前記のステップを繰り返すステップとを含むプロセスによって選択される。
本発明は、ウイルス感染および疾病を予防するためのワクチンとして使用され得る、弱毒化ウイルスの産生に関する。したがって、本発明は、ゲノム中の複数の場所に操作されたヌクレオチド置換を含有する改変ウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルスを提供し、置換は、ゲノムに複数の同義コドン、および/または同一アミノ酸に対する既存コドンの順序の変化(コドン対利用の変化)を導入する。両方の場合において、ウイルス遺伝子産物の元の野生型アミノ酸配列は保持される。
大部分のアミノ酸は、2個以上のコドンによってコード化される。表1の遺伝子コードを参照されたい。例えば、アラニンは、GCU、GCC、GCA、およびGCGによってコード化される。3個のアミノ酸(Leu、Ser、およびArg)が、6個の異なるコドンによってコード化される一方で、TrpおよびMetのみが、特異的なコドンを有する。「同義」コドンは、同一アミノ酸をコード化するコドンである。したがって、例えば、CUU、CUC、CUA、CUG、UUA、およびUUGは、Leuに対してコードする同義コドンである。同義コドンは、同頻度で使用されない。概して、特定の生物において最も頻繁に使用されるコドンは、同族tRNAが豊富なコドンであり、これらのコドンの使用は、タンパク質翻訳の速度および/または正確性を高める。反対に、ほとんど使用されないコドンに対するtRNAは、比較的低いレベルで見られ、希少コドンの使用は、翻訳速度および/または正確性を低下させると考えられている。したがって、同義であるがあまり頻繁に使用されないコドンによって、核酸中の所与のコドンを置換することは、核酸中に「脱最適化された」コドンを置換することである。
加えて、所与の生物は、所与のコドンAに最近接するコドンに対して特定の優先傾向があり、コドン対利用におけるバイアスと称される。既存コドンを変化させることなくコドン対バイアスを変化させることにより、タンパク質合成の速度およびタンパク質の産生に影響を及ぼすことができる。
本発明の種々の実施形態では、ウイルスは、DNA、RNA、2本鎖、または1本鎖ウイルスである。さらなる実施形態では、ウイルスは、動物または植物を感染させる。好ましい実施形態では、動物はヒトである。数多くの動物ウイルスが、疾病を引き起こすことがよく知られている(以下を参照)。狂犬病、重症急性呼吸器症候群(SARS)、および鳥インフルエンザを引き起こすような、ある医学的に重要なウイルスはまた、それらの通常の非ヒト宿主からヒトに広がる可能性がある。
ウイルスはまた、植物病原菌の主要な群を構成し、遺伝子導入植物を産生するためのウイルスベクターを開発するための研究が続いている。そのようなベクターの利点には、植物の形質転換の容易さ、単一の形質転換された細胞からの遺伝子導入植物の再生の必要性を除去する、成熟した植物を形質転換する能力、および1細胞当たりの、ウイルスの複数のコピーからの外来遺伝子の高い発現レベルが含まれる。しかしながら、これらのベクターの主な不利点のうちの1つは、ウイルスの病原性決定基から、本質的なウイルス複製機能を分離することが可能ではなかったことである。本明細書に開示されるSAVE戦略は、植物形質転換のための非病原性ウイルスベクターを操作する手段を提供することができる。
ヒトにおける主要なウイルス病原体
ウイルス病原体は、ヒトおよび他の動物における多くの疾病の原因病原体である。ヒトにおけるウイルス性疾病のよく知られている例には、風邪(ヒトライノウイルス、HRVによって引き起こされる)、インフルエンザ(インフルエンザウイルス)、水疱瘡(水痘帯状疱疹ウイルス)、麻疹(パラミクソウイルス)、流行性耳下腺炎(パラミクソウイルス)、灰白髄炎(ポリオウイルス、PV)、狂犬病(リッサウイルス)、ヘルペス(単純ヘルペスウイルス[HSV]1型)、および性器ヘルペス(HSV2型)が含まれる。小児へのワクチン接種プログラムの導入前に、これらの多くは、世界中で一般的な小児期の疾病であり、今もなお一部の発展途上国では健康への多大なる脅威である。ウイルス性疾病には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)によって引き起こされる後天性免疫不全症候群(AIDS)、SARSコロナウイルスによって引き起こされる重症急性呼吸器症候群(SARS)、鳥インフルエンザ(インフルエンザAウイルスのH5N1サブタイプ)、エボラ(エボラウイルス)、マールブルグ出血熱(マールブルグウイルス)、デング熱(フラビウイルス血清型)、ウエストナイル脳炎(フラビウイルス)、伝染性単核球症(エプスタインバーウイルス、EBV)、肝炎(C型肝炎ウイルス、HCV、B型肝炎ウイルス、HBV)、および黄熱(フラビウイルス)等のより深刻な疾病も含まれる。ある種類の癌もまた、ウイルスによって引き起こされる可能性がある。例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)によるほとんどの感染が良性であるが、HPVは、子宮頸癌と関連することがわかっており、AIDS患者において一般的な腫瘍であるカポジ肉腫(KS)は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)によって引き起こされる。
ウイルスは細胞内に存在し、再生のために宿主細胞の機構を使用するため、それらは、宿主細胞を殺滅することなく除去することが困難である。ウイルス性疾病に対処する最も効果的な方法は、感染への抵抗性をもたらすために、感染のリスクのある対象のワクチン接種であった。いくつかの疾病(例えば、水疱瘡、麻疹、流行性耳下腺炎、黄熱)に対して、効果的なワクチンが利用可能である。しかしながら、多くの他のウイルス性疾病のためのワクチンを早急に開発する必要性がある。本明細書に記載されるワクチンを製造するためのSAVE(合成弱毒化ウイルス工学)方法は、原則として、逆遺伝学系(以下を参照)が利用可能である全てのウイルスに適用できる。この方法は、灰白髄炎、風邪、およびインフルエンザのための弱毒化ウイルスワクチンを開発するために、SAVEの適用に重点を置くことによって、本明細書に例示される。
いずれのウイルスも、本明細書に開示される方法によって弱毒化することができる。ウイルスは、dsDNAウイルス(例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス)、1本鎖「プラス」センスDNAウイルス(例えば、パルボウイルス)、2本鎖RNAウイルス(例えば、レオウイルス)、1本鎖+センスRNAウイルス(例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス)、1本鎖「マイナス」センスRNAウイルス(例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス)、DNA中間体を有する1本鎖+センスRNAウイルス(例えば、レトロウイルス)、または2本鎖逆転写ウイルス(例えば、ヘパドナウイルス)であることができる。本発明のある限定されない実施形態では、ウイルスは、ポリオウイルス(PV)、ライノウイルス、鳥インフルエンザを含むインフルエンザウイルス(例えば、インフルエンザAウイルスのH5N1サブタイプ)、重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス(フラビウイルス血清型)、西ナイル熱ウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、黄熱病ウイルス、エボラ(エボラウイルス)、水疱瘡(水痘帯状疱疹ウイルス)、麻疹(パラミクソウイルス)、流行性耳下腺炎(パラミクソウイルス)、狂犬病(リッサウイルス)、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV1型)、または性器ヘルペス(HSV2型)である。
「親」ウイルスまたは「親」タンパク質コード化配列という用語は、程度の差はあるが弱毒化され得る新しい配列が由来する、ウイルスゲノムおよびタンパク質コード化配列を指すために、本明細書で使用される。親ウイルスおよび配列は、通常、「野生型」もしくは「自然発生的」な原型、またはより高度な弱毒化ウイルスを得ることが望ましい変異体の単離株である。しかしながら、親ウイルスはまた、実際の、または認識された望ましい特性に基づいて、研究室で特に作製または選択される突然変異体を含む。したがって、弱毒化の候補である親ウイルスは、欠失、挿入、アミノ酸置換等を有する、野生型または自然発生的ウイルスの突然変異体を含み、またコドン置換を有する突然変異体も含む。一実施形態では、そのような親配列は、天然単離株と約30アミノ酸以下異なる。別の実施形態では、親配列は、天然単離株と約20アミノ酸以下異なる。さらに別の実施形態では、親配列は、天然単離株と約10アミノ酸以下異なる。
弱毒化PVは、ポリオウイルス1型(Mahoney、「PV(M)」)、ポリオウイルス2型(Lansing)、ポリオウイルス3型(Leon)、1価経口ポリオワクチン(OPV)ウイルス、または3価OPVウイルスに由来し得る。ある実施形態では、ポリオウイルスは、配列番号2に記載のゲノム配列を有するPV−AB、またはPV−AB755−1513、PV−AB755−2470、PV−AB1513−3386、PV−AB2470−3386、PV−AB1513−2470、PV−AB2470−2954、もしくはPV−AB2954−3386である。名称は、PV(M)ゲノムで、ゲノムのどの一部がPV−ABのヌクレオチドで置換されるかを反映する。上付き文字は、置換されるPV−ABのヌクレオチド番号を提供する。
様々な実施形態において、弱毒化ライノウイルスは、HRV2、HRV14、ヒトライノウイルス10、ヒトライノウイルス100、ヒトライノウイルス11、ヒトライノウイルス12、ヒトライノウイルス13、ヒトライノウイルス15、ヒトライノウイルス16、ヒトライノウイルス18、ヒトライノウイルス19、ヒトライノウイルス1A、ヒトライノウイルス1B、ヒトライノウイルス2、ヒトライノウイルス20、ヒトライノウイルス21、ヒトライノウイルス22、ヒトライノウイルス23、ヒトライノウイルス24、ヒトライノウイルス25、ヒトライノウイルス28、ヒトライノウイルス29、ヒトライノウイルス30、ヒトライノウイルス31、ヒトライノウイルス32、ヒトライノウイルス33、ヒトライノウイルス34、ヒトライノウイルス36、ヒトライノウイルス38、ヒトライノウイルス39、ヒトライノウイルス40、ヒトライノウイルス41、ヒトライノウイルス43、ヒトライノウイルス44、ヒトライノウイルス45、ヒトライノウイルス46、ヒトライノウイルス47、ヒトライノウイルス49、ヒトライノウイルス50、ヒトライノウイルス51、ヒトライノウイルス53、ヒトライノウイルス54、ヒトライノウイルス55、ヒトライノウイルス56、ヒトライノウイルス57、ヒトライノウイルス58、ヒトライノウイルス59、ヒトライノウイルス60、ヒトライノウイルス61、ヒトライノウイルス62、ヒトライノウイルス63、ヒトライノウイルス64、ヒトライノウイルス65、ヒトライノウイルス66、ヒトライノウイルス67、ヒトライノウイルス68、ヒトライノウイルス7、ヒトライノウイルス71、ヒトライノウイルス73、ヒトライノウイルス74、ヒトライノウイルス75、ヒトライノウイルス76、ヒトライノウイルス77、ヒトライノウイルス78、ヒトライノウイルス8、ヒトライノウイルス80、ヒトライノウイルス81、ヒトライノウイルス82、ヒトライノウイルス85、ヒトライノウイルス88、ヒトライノウイルス89、ヒトライノウイルス9、ヒトライノウイルス90、ヒトライノウイルス94、ヒトライノウイルス95、ヒトライノウイルス96、ヒトライノウイルス98、ヒトライノウイルス14、ヒトライノウイルス17、ヒトライノウイルス26、ヒトライノウイルス27、ヒトライノウイルス3、ヒトライノウイルス8001フィンランド1995年11月、ヒトライノウイルス35、ヒトライノウイルス37、+ヒトライノウイルス6253フィンランド1994年9月、ヒトライノウイルス9166フィンランド1995年9月、ヒトライノウイルス4、ヒトライノウイルス42、ヒトライノウイルス48、ヒトライノウイルス9864フィンランド1996年9月、ヒトライノウイルス5、ヒトライノウイルス52、ヒトライノウイルス6、ヒトライノウイルス7425フィンランド1995年12月、ヒトライノウイルス69、ヒトライノウイルス5928フィンランド1995年5月、ヒトライノウイルス70、ヒトライノウイルス72、ヒトライノウイルス79、ヒトライノウイルス83、ヒトライノウイルス84、ヒトライノウイルス8317フィンランド1996年8月、ヒトライノウイルス86、ヒトライノウイルス91、ヒトライノウイルス7851フィンランド1996年9月、ヒトライノウイルス92、ヒトライノウイルス93、ヒトライノウイルス97、ヒトライノウイルス99、アントワープライノウイルス98/99、ヒトライノウイルス263ベルリン2004、ヒトライノウイルス3083/ライノ/兵庫/2005、ヒトライノウイルスNY−003、ヒトライノウイルスNY−028、ヒトライノウイルスNY−041、ヒトライノウイルスNY−042、ヒトライノウイルスNY−060、ヒトライノウイルスNY−063、ヒトライノウイルスNY−074、ヒトライノウイルスNY−1085、ヒトライノウイルス株Hanks、未区分ヒトライノウイルスOK88−8162、ヒトエンテロウイルス種exアメリカキララマダニ、ヒトライノウイルス種、またはヒトライノウイルスUCに由来するヒトライノウイルス(HRV)である。
他の実施形態において、弱毒化インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、またはインフルエンザウイルスCに由来する。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスAは、サブタイプであるH10N7、H10N1、H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、H11N2、H11N3、H11N4、H11N6、H11N8、H11N9、H12N1、H12N2、H12N4、H12N5、H12N6、H12N8、H12N9、H13N2、H13N3、H13N6、H13N9、H14N5、H14N6、H15N2、H15N8、H15N9、H16N3、H1N1、H1N2、H1N3、H1N5、H1N6、H1N8、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H3N9、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N7、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N7、H7N8、H7N9、H8N2、H8N4、H8N5、H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9、および未同定サブタイプに属するが、それらに限定されない。
さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスBは、サブタイプである、インフルエンザBウイルス(B/愛知/186/2005)、インフルエンザBウイルス(B/愛知/5/88)、インフルエンザBウイルス(B/秋田/27/2001)、インフルエンザBウイルス(B/秋田/5/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アラバマ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アラバマ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/03/1992)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/12/1996)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/16/2000)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/16/2003)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/1777/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/アラスカ/6/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アナーバー/1/1986)、インフルエンザBウイルス(B/アナーバー/1994)、インフルエンザBウイルス(B/アルゼンチン/132/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アルゼンチン/3640/1999)、インフルエンザBウイルス(B/アルゼンチン/69/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/12/2003)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/13/2003)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/135/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/14/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/14/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/140/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/146/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/148/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/15/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/16/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/162/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/163/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/164/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/2e/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/4/2002)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/48/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/5/2000)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/59/2005)、インフルエンザBウイルス(B/アリゾナ/7/2000)、インフルエンザBウイルス(B/オークランド/01/2000)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/141/1994)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/143/1994)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/153/1990)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/163/1990)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/163/90)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/34/99)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/460/03)、インフルエンザBウイルス(B/バンコク/54/99)、インフルエンザBウイルス(B/バルセロナ/215/03)、インフルエンザBウイルス(B/北京/15/84)、インフルエンザBウイルス(B/北京/184/93)、インフルエンザBウイルス(B/北京/243/97)、インフルエンザBウイルス(B/北京/43/75)、インフルエンザBウイルス(B/北京/5/76)、インフルエンザBウイルス(B/北京/76/98)、インフルエンザBウイルス(B/ベルギー/WV106/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ベルギー/WV107/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ベルギー/WV109/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ベルギー/WV114/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ベルギー/WV122/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ボン/43)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/017/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/053/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/055/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/064/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/074/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/079/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/110/01)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/952/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ブラジル/975/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ブリズベン/32/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ブカレスト/311/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ブカレスト/795/03)、インフルエンザBウイルス(B/ブエノスアイレス/161/00)、インフルエンザBウイルス(B/ブエノスアイレス/9/95)、インフルエンザBウイルス(B/ブエノスアイレス/SW16/97)、インフルエンザBウイルス(B/ブエノスアイレス/VL518/99)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/01/1995)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/02/1994)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/02/1995)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/10/2000)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/11/2001)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/14/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/6/2000)、インフルエンザBウイルス(B/カリフォルニア/7/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カナダ/16188/2000)、インフルエンザBウイルス(B/カナダ/464/2001)、インフルエンザBウイルス(B/カナダ/464/2002)、インフルエンザBウイルス(B/チャコ/366/00)、インフルエンザBウイルス(B/チャコ/R113/00)、インフルエンザBウイルス(B/チャンタブリ/218/2003)、インフルエンザBウイルス(B/済州/303/03)、インフルエンザBウイルス(B/千葉/447/98)、インフルエンザBウイルス(B/チリ/3162/2002)、インフルエンザBウイルス(B/重慶/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA1タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA10タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA100フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA101フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA102フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA103フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA104フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA105フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA106フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA107フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA108フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA109フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA11タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA110フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA112フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA113フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA114フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA115フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA116フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA12タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA13タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA14タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA15タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA16タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA17タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA18タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA19タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA2タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA20タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA21タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA22タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA23タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA24タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA25タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA26タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA27タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA28タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA29タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA3タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA30タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA31タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA32タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA33タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA34タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA37タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA38フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA39タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA40タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA41フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA42フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA43タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA44タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA45フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA46フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA47フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA5タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA50フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA51フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA52フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA53フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(
B/臨床単離株SA57フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA58フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA59フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA6タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA60フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA61フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA62フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA63フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA64フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA65フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA66フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA67フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA68フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA69フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA7タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA70フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA71フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA73フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA74フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA76フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA77フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA78フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA79フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA8タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA80フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA81フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA82フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA83フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA84フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA85タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA86タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA87タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA88タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA89タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA9タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA90タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA91タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA92タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA93 タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA94タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA95フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA96タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA97フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA98フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA99フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/CNIC/27/2001)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/04/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/11e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/13e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/15/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/16e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/17e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/2597/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/4e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/5/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コネティカット/02/1995)、インフルエンザBウイルス(B/コネティカット/07/1993)、インフルエンザBウイルス(B/コルドバ/2979/1991)、インフルエンザBウイルス(B/コルドバ/VA418/99)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/16/89)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/69/1990)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/69/90)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/10/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/45/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/47/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/9/97)、インフルエンザBウイルス(B/デラウェア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/Du/4/78)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/39/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/43/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/44/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/52/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/55/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/56/98)、インフルエンザBウイルス(B/エジプト/2040/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/1716/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/2054/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/23/04)、インフルエンザBウイルス(B/エスピリトゥサント/55/01)、インフルエンザBウイルス(B/エスピリトゥサント/79/99)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/154/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/159/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/160/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/161/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/03)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/164/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/172/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/173/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/176/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/184/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/188/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/190/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/191/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/192/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/193/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/199/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/202/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/203/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/204/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/205/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/206/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/220/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/223/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/225/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/227/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/231/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/235/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/239/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/244/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/245/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/254/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/254/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/255/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/260/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/268/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/270/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/275/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/767/2000)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/84/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/886/2001)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/WV4/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/WV5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/02/1998)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/02/2006)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/7e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/福建/36/82)、インフルエンザBウイルス(B/ジュネーブ/5079/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/11/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/21/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/33/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/41/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/52/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/55/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/56/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/8/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア12/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア3/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア48/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア49/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア53/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア6/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア65/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/1294/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/1603/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/20/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/2059/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/26/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/30/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/54/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/55/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/02/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/04/1998)、イ
ンフルエンザBウイルス(B/ジョージア/09/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/9/2005)、インフルエンザBウイルス(B/広東/05/94)、インフルエンザBウイルス(B/広東/08/93)、インフルエンザBウイルス(B/広東/5/94)、インフルエンザBウイルス(B/広東/55/89)、インフルエンザBウイルス(B/広東/8/93)、インフルエンザBウイルス(B/広州/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/広州/86/92)、インフルエンザBウイルス(B/広州/87/92)、インフルエンザBウイルス(B/京畿/592/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハノーバー/2/90)、インフルエンザBウイルス(B/哈爾浜/07/94)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/10/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/10/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/13e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/17/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/18e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1990/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1993/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/19e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/20e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/21/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/26/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/31e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/32e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/33e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/35/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/36/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/37/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/38/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/43/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/44/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/9/2001)、インフルエンザBウイルス(B/河北/19/94)、インフルエンザBウイルス(B/河北/3/94)、インフルエンザBウイルス(B/河北/4/95)、インフルエンザBウイルス(B/河南/22/97)、インフルエンザBウイルス(B/広島/23/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/02/1993)、インフルエンザBウイルス(B/香港/03/1992)、インフルエンザBウイルス(B/香港/05/1972)、インフルエンザBウイルス(B/香港/06/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/110/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1115/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/112/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/123/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1351/02)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1351/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1434/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/147/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/156/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/157/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/167/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/1989)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/89)、インフルエンザBウイルス(B/香港/28/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/293/02)、インフルエンザBウイルス(B/香港/310/2004)、インフルエンザBウイルス(B/香港/329/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2001 鶏卵適応)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/335/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/336/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/497/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/542/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/548/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/553a/2003)、インフルエンザBウイルス(B/香港/557/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/6/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/666/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/692/01)、インフルエンザBウイルス(B/香港/70/1996)、インフルエンザBウイルス(B/香港/8/1973)、インフルエンザBウイルス(B/香港/9/89)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/91)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/92)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/96)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/2/93)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/2/96)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B15/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B56/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B57/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B58/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B59/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B60/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B61/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B63/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B65/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B66/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B67/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B68/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B69/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B70/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B71/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B720/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B74/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B745/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B75/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B756/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B77/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B787/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B79/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B81/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B84/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B846/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B850/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B86/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B87/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B88/2003)、インフルエンザBウイルス(B/湖南/4/72)、インフルエンザBウイルス(B/茨城/2/85)、インフルエンザBウイルス(B/アイダホ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/33/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/36/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/47/2005)、インフルエンザBウイルス(B/仁川/297/2005)、インフルエンザBウイルス(B/インド/3/89)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7526/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7569/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7600/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7605/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/77276/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/01/1995)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/5/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/03/2002)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/95/03)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV124/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV126/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV133/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV135/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV137/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV142/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV143/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV145/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV146/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV150/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV153/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV158/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV161/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV166/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV169/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV170/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV174/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV183/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV187/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスタンブール/CTF−132/05)、インフルエンザBウイルス(B/日本/1224/2005)、インフルエンザBウイルス(B/日本/1905/2005)、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/03)、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/2003(組換え))、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/2003)、イン
フルエンザBウイルス(B/吉林/20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/05/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/06/1994)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/113/010)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/116/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/119/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/123/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/163/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/187/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/189/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/2/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/27/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/33/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/34/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/35/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/36/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/41/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/5/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/69/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/77/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/94/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/96/01)、インフルエンザBウイルス(B/門真/1076/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V1)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V10)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V11)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V2)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V3)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V4)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V5)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V6)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V7)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V8)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V9)、インフルエンザBウイルス(B/門真/136/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/409/2000)、インフルエンザBウイルス(B/門真/506/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/642/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/647/99)、インフルエンザBウイルス(B/鹿児島/15/94)、インフルエンザBウイルス(B/神奈川/73)、インフルエンザBウイルス(B/カンザス/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カンザス/22992/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケンタッキー/4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カズコフ(Khazkov)/224/91)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2036/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2037/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2038/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2039/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2040/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/7/2005)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002−V1)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002−V2)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/94)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/25/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/26/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/28/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/3/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/4/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/6/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/64/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/65/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/69/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/79/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/83/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/87/2001)、インフルエンザBウイルス(B/高知/193/1999)、インフルエンザBウイルス(B/高知/193/99)、インフルエンザBウイルス(B/ラツィオ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/リー(Lee)/40)、インフルエンザBウイルス(B/レニングラード/129/91)、インフルエンザBウイルス(B/レニングラード/148/91)、インフルエンザBウイルス(B/リスボン/02/1994)、インフルエンザBウイルス(B/リサボン/2/90)、インフルエンザBウイルス(B/ロサンゼルス/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/ルサカ/270/99)、インフルエンザBウイルス(B/ルサカ/432/99)、インフルエンザBウイルス(B/リヨン/1271/96)、インフルエンザBウイルス(B/マレーシア/83077/2001)、インフルエンザBウイルス(B/マプト/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/マプト/2/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/595/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/VL373/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/VL385/99)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/7/2003)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/5/2003)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/10/97)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/11/2006)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/2006)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/97)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/97−MA)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/13/03)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/18/95)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/19/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/20/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/21/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/28/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/01)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/89)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/4/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/5/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/7/03)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/8/99)、インフルエンザBウイルス(B/メキシコ/84/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/04/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/20/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22572/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22587/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22596/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22631/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22659/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22687/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22691/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22721/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22723/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/2e/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/e3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミコナ(micona)/1/1989)、インフルエンザBウイルス(B/三重/01/1993)、インフルエンザBウイルス(B/三重/1/93)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/6/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/66/04)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/1/1985)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/14/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミンスク/318/90)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/4e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/11/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/6/2005)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/モスクワ/16/2002)、インフルエンザBウイルス(B/モスクワ/3/03)、インフルエンザBウイルス(B/名古屋/20/99)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2032/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2033/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2034/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2035/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/351/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/670/2005)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/1/00)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/1/2000)、インフルエンザBウイ
ルス(B/南昌/12/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/15/95)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/15/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/195/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/2/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/20/96)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/26/93)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/3/95)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/4/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/480/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/5/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560a/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560b/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/6/96)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/6/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/630/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/7/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/8/95)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/107/93)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/3/96)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/34/96)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/45/91)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/48/91)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/6/89)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/2/01)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/5/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1078/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1079/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1080/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1087/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1088/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1089/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1090/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1092/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1098/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1101/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1104/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1105/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1106/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1108/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1114/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1117/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1118/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1120/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1122/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1131/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1132/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1136/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1137/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1138/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1139/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1331/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/2781/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/6357/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/800/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/801/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/1/97)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/13/94)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/2/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/31/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/32/94)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/384/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/429/98)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/580/89)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/6/96)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/6/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/9/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/10/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/11/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/14e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/17/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/18/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/19/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/20139/99)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/24/1993)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/3/90)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/39/1991)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/40/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/47/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/6/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/8/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/9/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/9/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/C10/2004)、インフルエンザBウイルス(B/NIB/48/90)、インフルエンザBウイルス(B/寧夏/45/83)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/4/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/5/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ノルウェー/1/84)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1/X−19/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1e4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/2e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/大分/15/1992)、インフルエンザBウイルス(B/オクラホマ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/オクラホマ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16291/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16296/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16299/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16305/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/5/80)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1036/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1058/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1059/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1146/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1169/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1201/2000)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/547/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/547/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/710/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/711/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/728/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/755/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/820/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/837/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/854/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997−M1)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997−M2)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V1)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V2)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V3)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V4)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V5)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V6)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V7)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V8)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/c19/93)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1072/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1329/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1510/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1846/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1847/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1862/2001)、インフルエンザBウイルス
(B/オスロ/1864/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1870/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1871/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2293/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2295/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2297/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/238/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/3761/2000)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/47/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/668/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/71/04)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/801/99)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/805/99)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/837/99)、インフルエンザBウイルス(B/パナマ/45/1990)、インフルエンザBウイルス(B/パナマ/45/90)、インフルエンザBウイルス(B/パラグアイ/636/2003)、インフルエンザBウイルス(B/パリ/329/90)、インフルエンザBウイルス(B/パリ/549/1999)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/1/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/13/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/16/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/2/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/23/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/24/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/25/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/28/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/3/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/4/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/4/2004)、インフルエンザBウイルス(B/パース/211/2001)、インフルエンザBウイルス(B/パース/25/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ペルー/1324/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ペルー/1364/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ペルジャ/4/03)、インフルエンザBウイルス(B/フィリピン/5072/2001)、インフルエンザBウイルス(B/フィリピン/93079/2001)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/250/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/255/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/270/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/285/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/162/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/173/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/2/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/3/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/4/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/452/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/453/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/465/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/51/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/511/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/514/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/517/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/6/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/7/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74199/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74204/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74206/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/8/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/9/01)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/41/97)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/45/97)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/61/97)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/200/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/209/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/315/01)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/353/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/354/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/337/01)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/357/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/374/01)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/3/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ルーマニア/217/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ルーマニア/318/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ロシア/22/1995)、インフルエンザBウイルス(B/サガ/S172/99)、インフルエンザBウイルス(B/アザラシ/オランダ/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/1/89)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/1163/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/12/88)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/12/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/13/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/16/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/17/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/19/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/21/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/232/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/28/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/31/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/37/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/38/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/40/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/41/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/6/88)、インフルエンザBウイルス(B/山東/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/山東/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/上海/1/77)、インフルエンザBウイルス(B/上海/10/80)、インフルエンザBウイルス(B/上海/24/76)、インフルエンザBウイルス(B/上海/35/84)、インフルエンザBウイルス(B/上海/361/03)、インフルエンザBウイルス(B/上海/361/2002)、インフルエンザBウイルス(B/深セン/423/99)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/51/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/N18/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/T30/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/T37/98)、インフルエンザBウイルス(B/静岡/15/2001)、インフルエンザBウイルス(B/静岡/480/2000)、インフルエンザBウイルス(B/四川/281/96)、インフルエンザBウイルス(B/四川/317/2001)、インフルエンザBウイルス(B/四川/379/99)、インフルエンザBウイルス(B/四川/38/2000)、インフルエンザBウイルス(B/四川/8/92)、インフルエンザBウイルス(B/シエナ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/04/1991)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/11/1994)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/22/1998)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/222/79)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/31/1998)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/35/1998)、インフルエンザBウイルス(B/南オーストラリア/5/1999)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/04/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/25723/99)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/5/89)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV22/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV26/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV27/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV29/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV33/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV34/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV36/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV41/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV42/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV43/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV45/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV50/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV51/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV56/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV57/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV65/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV66/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV67/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV69/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV70/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV73/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV78/2002)、インフルエンザBウイルス(B/サンクトペテルブルク/14/2006)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/308/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/315/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/318/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/345/02)、インフルエンザBウイルス(B/ストックホルム/10/90)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/18/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/28/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/32/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/58/2005)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/4291/97)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5219/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5241/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5441/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5444/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5812/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/6121/90)、インフルエンザB
ウイルス(B/台湾/0002/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0114/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0202/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0409/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0409/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0562/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0569/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0576/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0600/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0610/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0615/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0616/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0654/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0684/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0699/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0702/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0722/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0730/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0735/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0833/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0874/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0879/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0880/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0927/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0932/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0993/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1013/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1013/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/102/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/110/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1103/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/114/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/11515/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/117/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1197/1994)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/121/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/12192/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1243/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1265/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1293/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/14/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1484/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1502/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1503/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1534/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1536/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1561/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1574/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1584/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/16/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1618/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/165/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/166/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/188/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1949/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1950/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/202/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2026/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2027/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/217/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/21706/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2195/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2551/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2805/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2805/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/3143/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/31511/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/31511/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/34/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/3532/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/39/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/41010/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/41010/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4119/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4184/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4184/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/43/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4602/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/473/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/52/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/52/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/54/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/61/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/635/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/637/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/68/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/68/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/69/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/70/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/74/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/75/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/77/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/81/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/872/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/97271/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/98/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/H96/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M214/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M227/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M24/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M244/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M251/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M53/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M71/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1013/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1115/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1207/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1316/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1549/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1582/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N16/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1619/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1848/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1902/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N200/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2050/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N230/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N232/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2333/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2335/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N253/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2620/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2986/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N3688/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N371/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N376/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N384/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N3849/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N404/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N473/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N511/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N559/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N612/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N701/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N767/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N798/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N860/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N872/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N913/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S117/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S141/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S76/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S82/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾(Taiwn)/103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/テヘラン/80/02)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B10/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1166/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1181/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1182/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1188/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1190/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1193/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B17/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B18/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B19/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B21/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B24/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B3/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B30/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B7/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B8/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B9/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/06/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/91)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/10/2005)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/11/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/12/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/14/1991)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/14/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/16/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/18/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/22/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/23/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/37/1988)、インフルエンザBウ
イルス(B/テキサス/37/88)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/4/90)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/57/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/6/2000)、インフルエンザBウイルス(B/徳島/101/93)、インフルエンザBウイルス(B/東京/6/98)、インフルエンザBウイルス(B/トレント/3/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/15/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/17/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/19/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/25/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/27/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/28/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/34/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/37/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/8/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ14/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ18/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ23/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ24/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/6/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/イギリス/34304/99)、インフルエンザBウイルス(B/イギリス/34520/99)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/19/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/19/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/28/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/33/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/65/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/74/04)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/75/04)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/NG/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウスアイア/15732/99)、インフルエンザBウイルス(B/ソ連/100/83)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/20139/99)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/20975/99)、インフルエンザBウイルス(B/バーモント/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/02/1987)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/103/89)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/19/89)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/2/87)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/504/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ウィーン/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/11/2003)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/9/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウェリントン/01/1994)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/10/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/15e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/17/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/22/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/26/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/29/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/31/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/5/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/6/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/武漢/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/武漢/356/2000)、インフルエンザBウイルス(B/WV194/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/15/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/16/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/許晶/1/82)、インフルエンザBウイルス(B/許晶/23/82)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1/73)、インフルエンザBウイルス(B/山形/115/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1246/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1311/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/16/1988)、インフルエンザBウイルス(B/山形/16/88)、インフルエンザBウイルス(B/山形/222/2002)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K198/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K246/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K270/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K298/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K320/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K354/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K386/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K411/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K461/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K490/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K500/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K501/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K508/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K513/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K515/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K519/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K520/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K521/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K535/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K542/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山梨/166/1998)、インフルエンザBウイルス(B/山梨/166/98)、インフルエンザBウイルス(B/雲南/123/2001)、インフルエンザBウイルス(B株/アラスカ/12/96)、インフルエンザBウイルス(B株/アナーバー/1/66[低温適応型])、インフルエンザBウイルス(B株/アナーバー/1/66[野生型])、インフルエンザBウイルス(B株/BA/78)、インフルエンザBウイルス(B株/北京/1/87)、インフルエンザBウイルス(B株/イングランド/222/82)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/145/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/146/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/147/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/148/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/149/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/150/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/151/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/24/85)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/56/88)、インフルエンザBウイルス(B株/福岡/80/81)、インフルエンザBウイルス(B株/GA/86)、インフルエンザBウイルス(B株/GL/54)、インフルエンザBウイルス(B株/香港/8/73)、インフルエンザBウイルス(B株/HT/84)、インフルエンザBウイルス(B株/ID/86)、インフルエンザBウイルス(B株/レニングラード/179/86)、インフルエンザBウイルス(B株/メリーランド/59)、インフルエンザBウイルス(B株/メンフィス/6/86)、インフルエンザBウイルス(B株/長崎/1/87)、インフルエンザBウイルス(B株/大阪/491/97)、インフルエンザBウイルス(B株/PA/79)、インフルエンザBウイルス(B株/RU/69)、インフルエンザBウイルス(B株/シンガポール/64)、インフルエンザBウイルス(B株/東京/942/96)、インフルエンザBウイルス(B株/ビクトリア/3/85)、インフルエンザBウイルス(B株/ビクトリア/87)、インフルエンザBウイルス(B/ロチェスター/02/2001)、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスCは、サブタイプである、インフルエンザCウイルス(C/愛知/1/81)、インフルエンザCウイルス(C/愛知/1/99)、インフルエンザCウイルス(C/アナーバー/1/50)、インフルエンザCウイルス(C/青森/74)、インフルエンザCウイルス(C/カリフォルニア/78)、インフルエンザCウイルス(C/イングランド/83)、インフルエンザCウイルス(C/福岡/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/福岡/3/2004)、インフルエンザCウイルス(C/福島/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/ギリシャ/79)、インフルエンザCウイルス(C/広島/246/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/247/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/248/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/249/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/250/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/251/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/252/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/252/99)、インフルエンザCウイルス(C/広島/290/99)、インフルエンザCウイルス(C/広島/4
/2004)、インフルエンザCウイルス(C/兵庫/1/83)、インフルエンザCウイルス(C/ヨハネスブルク/1/66)、インフルエンザCウイルス(C/ヨハネスブルク/66)、インフルエンザCウイルス(C/神奈川/1/76)、インフルエンザCウイルス(C/神奈川/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/カンザス/1/79)、インフルエンザCウイルス(C/京都/1/79)、インフルエンザCウイルス(C/京都/41/82)、インフルエンザCウイルス(C/ミシシッピ/80)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/90)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/99)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/12/2004)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/92)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/98)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/92)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/99)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/98)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/42/2004)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/6/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/6/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/77)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/8/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/9/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/9/96)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/1/85)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/2/85)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/82)、インフルエンザCウイルス(C/ニュージャージー/76)、インフルエンザCウイルス(C/新潟/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/大阪/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/ブタ/北京/115/81)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/1/2000)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/札幌/71)、インフルエンザCウイルス(C/静岡/79)、インフルエンザCウイルス(C/山形/1/86)、インフルエンザCウイルス(C/山形/1/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/10/89)、インフルエンザCウイルス(C/山形/13/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/15/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/99)、インフルエンザCウイルス(C/山形/20/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/20/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/21/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/26/81)、インフルエンザCウイルス(C/山形/27/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/4/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/4/89)、インフルエンザCウイルス(C/山形/5/92)、インフルエンザCウイルス(C/山形/6/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/6/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/64)、インフルエンザCウイルス(C/山形/7/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/96)、インフルエンザCウイルス(C株/ベルリン/1/85)、インフルエンザCウイルス(C株/イングランド/892/83)、インフルエンザCウイルス(C株/五大湖/1167/54)、インフルエンザCウイルス(C株/JJ/50)、インフルエンザCウイルス(C株/ブタ/北京/10/81)、インフルエンザCウイルス(C株/ブタ/北京/439/82)、インフルエンザCウイルス(C株/テイラー/1233/47)、インフルエンザCウイルス(C株/山形/10/81)、イサウイルスもしくは伝染性サケ貧血ウイルス、ソゴトウイルスもしくはドーリウイルス、バトケンウイルス、ドーリウイルス(インド株/1313/61)もしくはソゴトウイルス、ソゴトウイルス(単離株SiAr126)もしくは未分類ソゴトウイルス、アラグアリウイルス、未分類オルトミクソウイルス科または家禽ペストウイルスもしくはブタインフルエンザウイルス、または未同定インフルエンザウイルス、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。
B/臨床単離株SA57フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA58フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA59フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA6タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA60フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA61フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA62フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA63フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA64フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA65フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA66フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA67フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA68フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA69フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA7タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA70フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA71フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA73フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA74フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA76フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA77フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA78フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA79フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA8タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA80フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA81フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA82フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA83フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA84フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA85タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA86タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA87タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA88タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA89タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA9タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA90タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA91タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA92タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA93 タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA94タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA95フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA96タイ/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA97フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA98フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/臨床単離株SA99フィリピン/2002)、インフルエンザBウイルス(B/CNIC/27/2001)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/04/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/11e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/13e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/15/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/16e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/17e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/2597/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/4e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コロラド/5/2004)、インフルエンザBウイルス(B/コネティカット/02/1995)、インフルエンザBウイルス(B/コネティカット/07/1993)、インフルエンザBウイルス(B/コルドバ/2979/1991)、インフルエンザBウイルス(B/コルドバ/VA418/99)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/16/89)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/69/1990)、インフルエンザBウイルス(B/チェコスロバキア/69/90)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/10/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/45/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/47/97)、インフルエンザBウイルス(B/大邱/9/97)、インフルエンザBウイルス(B/デラウェア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/Du/4/78)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/39/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/43/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/44/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/52/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/55/98)、インフルエンザBウイルス(B/ダーバン/56/98)、インフルエンザBウイルス(B/エジプト/2040/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/1716/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/2054/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イングランド/23/04)、インフルエンザBウイルス(B/エスピリトゥサント/55/01)、インフルエンザBウイルス(B/エスピリトゥサント/79/99)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/154/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/159/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/160/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/161/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/03)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/162/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/164/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/172/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/173/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/176/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/184/91)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/188/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/190/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/191/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/192/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/193/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/199/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/202/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/203/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/204/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/205/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/206/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/220/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/223/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/225/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/227/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/231/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/235/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/239/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/244/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/245/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/254/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/254/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/255/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/260/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/268/93)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/270/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/275/2003)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/767/2000)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/84/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/886/2001)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/WV4/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フィンランド/WV5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/02/1998)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/02/2006)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/フロリダ/7e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/福建/36/82)、インフルエンザBウイルス(B/ジュネーブ/5079/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/11/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/21/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/33/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/41/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/52/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/55/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/56/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア/8/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア12/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア3/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア48/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア49/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア53/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア6/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノア65/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/1294/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/1603/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/20/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/2059/03)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/26/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/30/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/54/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジェノバ/55/02)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/02/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/04/1998)、イ
ンフルエンザBウイルス(B/ジョージア/09/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ジョージア/9/2005)、インフルエンザBウイルス(B/広東/05/94)、インフルエンザBウイルス(B/広東/08/93)、インフルエンザBウイルス(B/広東/5/94)、インフルエンザBウイルス(B/広東/55/89)、インフルエンザBウイルス(B/広東/8/93)、インフルエンザBウイルス(B/広州/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/広州/86/92)、インフルエンザBウイルス(B/広州/87/92)、インフルエンザBウイルス(B/京畿/592/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハノーバー/2/90)、インフルエンザBウイルス(B/哈爾浜/07/94)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/10/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/10/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/11e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/13e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/17/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/18e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1990/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/1993/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/19e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/20e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/21/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/26/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/31e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/32e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/33e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/35/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/36/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/37/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/38/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/43/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/44/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ハワイ/9/2001)、インフルエンザBウイルス(B/河北/19/94)、インフルエンザBウイルス(B/河北/3/94)、インフルエンザBウイルス(B/河北/4/95)、インフルエンザBウイルス(B/河南/22/97)、インフルエンザBウイルス(B/広島/23/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/02/1993)、インフルエンザBウイルス(B/香港/03/1992)、インフルエンザBウイルス(B/香港/05/1972)、インフルエンザBウイルス(B/香港/06/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/110/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1115/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/112/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/123/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1351/02)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1351/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/1434/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/147/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/156/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/157/99)、インフルエンザBウイルス(B/香港/167/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/1989)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/22/89)、インフルエンザBウイルス(B/香港/28/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/293/02)、インフルエンザBウイルス(B/香港/310/2004)、インフルエンザBウイルス(B/香港/329/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2001 鶏卵適応)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/330/2002)、インフルエンザBウイルス(B/香港/335/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/336/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/497/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/542/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/548/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/553a/2003)、インフルエンザBウイルス(B/香港/557/2000)、インフルエンザBウイルス(B/香港/6/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/666/2001)、インフルエンザBウイルス(B/香港/692/01)、インフルエンザBウイルス(B/香港/70/1996)、インフルエンザBウイルス(B/香港/8/1973)、インフルエンザBウイルス(B/香港/9/89)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/91)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/92)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/1/96)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/2/93)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/2/96)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B15/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B56/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B57/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B58/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B59/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B60/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B61/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B63/1997)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B65/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B66/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B67/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B68/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B69/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B70/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B71/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B720/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B74/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B745/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B75/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B756/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B77/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B787/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B79/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B81/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B84/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B846/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B850/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B86/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B87/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヒューストン/B88/2003)、インフルエンザBウイルス(B/湖南/4/72)、インフルエンザBウイルス(B/茨城/2/85)、インフルエンザBウイルス(B/アイダホ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/13e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/33/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/36/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イリノイ/47/2005)、インフルエンザBウイルス(B/仁川/297/2005)、インフルエンザBウイルス(B/インド/3/89)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7526/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7569/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7600/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/7605/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インド/77276/2001)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/01/1995)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/インディアナ/5/2006)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/03/2002)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/アイオワ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/95/03)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV124/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV126/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV133/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV135/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV137/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV142/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV143/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV145/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV146/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV150/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV153/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV158/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV161/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV166/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV169/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV170/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV174/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV183/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスラエル/WV187/2002)、インフルエンザBウイルス(B/イスタンブール/CTF−132/05)、インフルエンザBウイルス(B/日本/1224/2005)、インフルエンザBウイルス(B/日本/1905/2005)、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/03)、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/2003(組換え))、インフルエンザBウイルス(B/江蘇/10/2003)、イン
フルエンザBウイルス(B/吉林/20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/05/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/06/1994)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/113/010)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/116/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/119/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/123/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/163/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/187/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/189/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/2/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/27/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/33/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/34/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/35/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/36/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/41/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/5/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/69/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/77/01)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/94/99)、インフルエンザBウイルス(B/ヨハネスブルク/96/01)、インフルエンザBウイルス(B/門真/1076/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V1)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V10)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V11)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V2)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V3)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V4)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V5)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V6)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V7)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V8)、インフルエンザBウイルス(B/門真/122/99−V9)、インフルエンザBウイルス(B/門真/136/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/409/2000)、インフルエンザBウイルス(B/門真/506/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/642/99)、インフルエンザBウイルス(B/門真/647/99)、インフルエンザBウイルス(B/鹿児島/15/94)、インフルエンザBウイルス(B/神奈川/73)、インフルエンザBウイルス(B/カンザス/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カンザス/22992/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケンタッキー/4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/カズコフ(Khazkov)/224/91)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2036/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2037/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2038/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2039/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/2040/2006)、インフルエンザBウイルス(B/キスム/7/2005)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002−V1)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2002−V2)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/1/94)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/25/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/26/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/28/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/3/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/4/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/6/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/64/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/65/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/69/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/79/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/83/2001)、インフルエンザBウイルス(B/神戸/87/2001)、インフルエンザBウイルス(B/高知/193/1999)、インフルエンザBウイルス(B/高知/193/99)、インフルエンザBウイルス(B/ラツィオ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/リー(Lee)/40)、インフルエンザBウイルス(B/レニングラード/129/91)、インフルエンザBウイルス(B/レニングラード/148/91)、インフルエンザBウイルス(B/リスボン/02/1994)、インフルエンザBウイルス(B/リサボン/2/90)、インフルエンザBウイルス(B/ロサンゼルス/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/ルサカ/270/99)、インフルエンザBウイルス(B/ルサカ/432/99)、インフルエンザBウイルス(B/リヨン/1271/96)、インフルエンザBウイルス(B/マレーシア/83077/2001)、インフルエンザBウイルス(B/マプト/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/マプト/2/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/595/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/VL373/99)、インフルエンザBウイルス(B/マルデルプラタ/VL385/99)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/メリーランド/7/2003)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/マサチューセッツ/5/2003)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/10/97)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/11/2006)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/2006)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/97)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/12/97−MA)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/13/03)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/18/95)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/19/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/20/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/21/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/28/96)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/01)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/89)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/3/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/4/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/5/93)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/7/03)、インフルエンザBウイルス(B/メンフィス/8/99)、インフルエンザBウイルス(B/メキシコ/84/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/04/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/20/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22572/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22587/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22596/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22631/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22659/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22687/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22691/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22721/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/22723/99)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/2e/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミシガン/e3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミコナ(micona)/1/1989)、インフルエンザBウイルス(B/三重/01/1993)、インフルエンザBウイルス(B/三重/1/93)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/6/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/66/04)、インフルエンザBウイルス(B/ミラノ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/1/1985)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/14/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミネソタ/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミンスク/318/90)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミシシッピ/4e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/11/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ミズーリ/6/2005)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1/2003)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/モンタナ/1e/2004)、インフルエンザBウイルス(B/モスクワ/16/2002)、インフルエンザBウイルス(B/モスクワ/3/03)、インフルエンザBウイルス(B/名古屋/20/99)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2032/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2033/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2034/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/2035/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/351/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ナイロビ/670/2005)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/1/00)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/1/2000)、インフルエンザBウイ
ルス(B/南昌/12/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/15/95)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/15/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/195/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/2/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/20/96)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/26/93)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/3/95)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/4/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/480/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/5/97)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560a/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/560b/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/6/96)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/6/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/630/94)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/7/98)、インフルエンザBウイルス(B/南昌/8/95)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/107/93)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/3/96)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/34/96)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/45/91)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/48/91)、インフルエンザBウイルス(B/ナッシュビル/6/89)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/2/01)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ネブラスカ/5/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1078/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1079/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1080/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1087/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1088/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1089/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1090/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1092/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1098/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1101/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1104/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1105/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1106/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1108/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1114/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1117/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1118/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1120/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1122/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1131/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1132/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1136/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1137/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1138/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1139/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネパール/1331/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/2781/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/6357/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/800/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/801/90)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/1/97)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/13/94)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/2/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/31/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/32/94)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/384/95)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/429/98)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/580/89)、インフルエンザBウイルス(B/オランダ/6/96)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ネバダ/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/4/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニュージャージー/6/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューメキシコ/9/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/10/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/11/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/12e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/14e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/17/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/18/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/19/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/20139/99)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/24/1993)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/2e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/3/90)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/39/1991)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/40/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/47/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/6/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/8/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/9/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/9/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ニューヨーク/C10/2004)、インフルエンザBウイルス(B/NIB/48/90)、インフルエンザBウイルス(B/寧夏/45/83)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/4/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ノースカロライナ/5/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ノルウェー/1/84)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1/X−19/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/1e4/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/2/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オハイオ/2e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/大分/15/1992)、インフルエンザBウイルス(B/オクラホマ/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/オクラホマ/2/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16291/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16296/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16299/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オマーン/16305/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/オレゴン/5/80)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1036/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1058/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1059/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1146/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1169/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/1201/2000)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/547/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/547/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/710/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/711/97)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/728/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/755/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/820/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/837/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/854/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997−M1)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/1997−M2)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V1)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V2)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V3)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V4)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V5)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V6)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V7)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/983/97−V8)、インフルエンザBウイルス(B/大阪/c19/93)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1072/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1329/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1510/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1846/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1847/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1862/2001)、インフルエンザBウイルス
(B/オスロ/1864/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1870/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/1871/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2293/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2295/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/2297/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/238/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/3761/2000)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/47/2001)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/668/2002)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/71/04)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/801/99)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/805/99)、インフルエンザBウイルス(B/オスロ/837/99)、インフルエンザBウイルス(B/パナマ/45/1990)、インフルエンザBウイルス(B/パナマ/45/90)、インフルエンザBウイルス(B/パラグアイ/636/2003)、インフルエンザBウイルス(B/パリ/329/90)、インフルエンザBウイルス(B/パリ/549/1999)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/1/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/13/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/16/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/2/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/23/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/24/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/25/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/28/02)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/3/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/4/04)、インフルエンザBウイルス(B/パルマ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ペンシルベニア/4/2004)、インフルエンザBウイルス(B/パース/211/2001)、インフルエンザBウイルス(B/パース/25/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ペルー/1324/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ペルー/1364/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ペルジャ/4/03)、インフルエンザBウイルス(B/フィリピン/5072/2001)、インフルエンザBウイルス(B/フィリピン/93079/2001)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/250/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/255/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/270/99)、インフルエンザBウイルス(B/釜山/285/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/1/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/162/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/173/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/2/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/3/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/4/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/452/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/453/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/465/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/51/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/511/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/514/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/517/98)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/6/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/7/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74199/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74204/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/74206/99)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/8/01)、インフルエンザBウイルス(B/ケベック/9/01)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/41/97)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/45/97)、インフルエンザBウイルス(B/ラバト/61/97)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/200/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/209/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/315/01)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/353/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオデジャネイロ/354/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/337/01)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/357/02)、インフルエンザBウイルス(B/リオドスール/374/01)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/3/03)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ローマ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ルーマニア/217/1999)、インフルエンザBウイルス(B/ルーマニア/318/1998)、インフルエンザBウイルス(B/ロシア/22/1995)、インフルエンザBウイルス(B/サガ/S172/99)、インフルエンザBウイルス(B/アザラシ/オランダ/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/1/89)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/1163/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/12/88)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/12/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/13/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/16/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/17/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/19/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/21/95)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/232/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/28/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/31/97)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/37/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/38/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/40/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/41/91)、インフルエンザBウイルス(B/ソウル/6/88)、インフルエンザBウイルス(B/山東/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/山東/7/97)、インフルエンザBウイルス(B/上海/1/77)、インフルエンザBウイルス(B/上海/10/80)、インフルエンザBウイルス(B/上海/24/76)、インフルエンザBウイルス(B/上海/35/84)、インフルエンザBウイルス(B/上海/361/03)、インフルエンザBウイルス(B/上海/361/2002)、インフルエンザBウイルス(B/深セン/423/99)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/51/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/N18/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/T30/98)、インフルエンザBウイルス(B/滋賀/T37/98)、インフルエンザBウイルス(B/静岡/15/2001)、インフルエンザBウイルス(B/静岡/480/2000)、インフルエンザBウイルス(B/四川/281/96)、インフルエンザBウイルス(B/四川/317/2001)、インフルエンザBウイルス(B/四川/379/99)、インフルエンザBウイルス(B/四川/38/2000)、インフルエンザBウイルス(B/四川/8/92)、インフルエンザBウイルス(B/シエナ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/04/1991)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/11/1994)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/22/1998)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/222/79)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/31/1998)、インフルエンザBウイルス(B/シンガポール/35/1998)、インフルエンザBウイルス(B/南オーストラリア/5/1999)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/04/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/25723/99)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスカロライナ/4/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/サウスダコタ/5/89)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV22/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV26/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV27/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV29/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV33/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV34/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV36/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV41/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV42/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV43/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV45/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV50/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV51/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV56/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV57/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV65/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV66/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV67/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV69/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV70/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV73/2002)、インフルエンザBウイルス(B/スペイン/WV78/2002)、インフルエンザBウイルス(B/サンクトペテルブルク/14/2006)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/308/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/315/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/318/02)、インフルエンザBウイルス(B/サンタカタリーナ/345/02)、インフルエンザBウイルス(B/ストックホルム/10/90)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/18/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/28/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/32/2005)、インフルエンザBウイルス(B/鈴鹿/58/2005)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/4291/97)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5219/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5241/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5441/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5444/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/5812/90)、インフルエンザBウイルス(B/スイス/6121/90)、インフルエンザB
ウイルス(B/台湾/0002/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0114/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0202/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0409/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0409/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0562/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0569/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0576/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0600/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0610/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0615/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0616/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0654/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0684/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0699/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0702/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0722/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0730/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0735/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0833/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0874/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0879/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0880/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0927/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0932/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/0993/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1013/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1013/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/102/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/110/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1103/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/114/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/11515/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/117/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1197/1994)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/121/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/12192/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1243/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1265/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1293/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/13/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/14/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1484/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1502/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1503/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1534/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1536/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1561/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1574/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1584/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/16/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1618/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/165/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/166/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/188/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1949/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/1950/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/202/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2026/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2027/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/217/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/21706/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2195/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2551/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2805/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/2805/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/3143/97)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/31511/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/31511/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/34/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/3532/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/39/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/41010/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/41010/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4119/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4184/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4184/2000)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/43/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/4602/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/473/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/52/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/52/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/54/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/61/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/635/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/637/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/68/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/68/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/69/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/70/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/74/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/75/2004)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/77/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/81/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/872/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/97271/2001)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/98/2005)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/H96/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M214/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M227/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M24/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M244/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M251/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M53/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/M71/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1013/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1115/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1207/99)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1316/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1549/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1582/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N16/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1619/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1848/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N1902/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N200/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2050/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N230/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N232/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2333/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2335/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N253/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2620/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N2986/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N3688/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N371/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N376/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N384/03)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N3849/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N404/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N473/00)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N511/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N559/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N612/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N701/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N767/01)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N798/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N860/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N872/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/N913/04)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S117/05)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S141/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S76/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾/S82/02)、インフルエンザBウイルス(B/台湾(Taiwn)/103/2005)、インフルエンザBウイルス(B/テヘラン/80/02)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B10/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1166/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1181/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1182/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1188/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1190/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B1193/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B17/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B18/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B19/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B20/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B21/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B24/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B3/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B30/2003)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B7/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B8/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テンプル/B9/1999)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/06/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/1/91)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/10/2005)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/11/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/12/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/14/1991)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/14/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/16/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/18/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/22/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/23/2000)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2001)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/37/1988)、インフルエンザBウ
イルス(B/テキサス/37/88)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/4/90)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/5/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/57/2002)、インフルエンザBウイルス(B/テキサス/6/2000)、インフルエンザBウイルス(B/徳島/101/93)、インフルエンザBウイルス(B/東京/6/98)、インフルエンザBウイルス(B/トレント/3/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/1/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/1/03)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/15/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/17/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/19/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/2/03)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/25/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/27/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/28/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/34/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/37/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ/8/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ14/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ18/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ23/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ24/02)、インフルエンザBウイルス(B/トリエステ7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/6/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ウランウデ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/イギリス/34304/99)、インフルエンザBウイルス(B/イギリス/34520/99)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/19/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/19/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/2/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/28/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/33/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/4/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/5/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/65/05)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/7/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/74/04)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/75/04)、インフルエンザBウイルス(B/ウルグアイ/NG/02)、インフルエンザBウイルス(B/ウスアイア/15732/99)、インフルエンザBウイルス(B/ソ連/100/83)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/20139/99)、インフルエンザBウイルス(B/ユタ/20975/99)、インフルエンザBウイルス(B/バーモント/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/02/1987)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/103/89)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/19/89)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/2/87)、インフルエンザBウイルス(B/ビクトリア/504/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ウィーン/1/99)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/1/2005)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/11/2003)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/バージニア/9/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/2/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/3/2003)、インフルエンザBウイルス(B/ワシントン/5/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウェリントン/01/1994)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/1/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/1/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/10/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/15e/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/17/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/2/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/2/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/22/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/26/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/29/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2000)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2004)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2005)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/3/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/31/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/4/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/5/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/6/2006)、インフルエンザBウイルス(B/ウィスコンシン/7/2002)、インフルエンザBウイルス(B/武漢/2/2001)、インフルエンザBウイルス(B/武漢/356/2000)、インフルエンザBウイルス(B/WV194/2002)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/15/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/16/2001)、インフルエンザBウイルス(B/ワイオミング/2/2003)、インフルエンザBウイルス(B/許晶/1/82)、インフルエンザBウイルス(B/許晶/23/82)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1/73)、インフルエンザBウイルス(B/山形/115/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1246/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/1311/2003)、インフルエンザBウイルス(B/山形/16/1988)、インフルエンザBウイルス(B/山形/16/88)、インフルエンザBウイルス(B/山形/222/2002)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K198/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K246/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K270/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K298/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K320/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K354/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K386/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K411/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K461/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K490/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K500/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K501/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K508/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K513/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K515/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K519/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K520/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K521/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K535/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山形/K542/2001)、インフルエンザBウイルス(B/山梨/166/1998)、インフルエンザBウイルス(B/山梨/166/98)、インフルエンザBウイルス(B/雲南/123/2001)、インフルエンザBウイルス(B株/アラスカ/12/96)、インフルエンザBウイルス(B株/アナーバー/1/66[低温適応型])、インフルエンザBウイルス(B株/アナーバー/1/66[野生型])、インフルエンザBウイルス(B株/BA/78)、インフルエンザBウイルス(B株/北京/1/87)、インフルエンザBウイルス(B株/イングランド/222/82)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/145/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/146/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/147/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/148/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/149/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/150/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/151/90)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/24/85)、インフルエンザBウイルス(B株/フィンランド/56/88)、インフルエンザBウイルス(B株/福岡/80/81)、インフルエンザBウイルス(B株/GA/86)、インフルエンザBウイルス(B株/GL/54)、インフルエンザBウイルス(B株/香港/8/73)、インフルエンザBウイルス(B株/HT/84)、インフルエンザBウイルス(B株/ID/86)、インフルエンザBウイルス(B株/レニングラード/179/86)、インフルエンザBウイルス(B株/メリーランド/59)、インフルエンザBウイルス(B株/メンフィス/6/86)、インフルエンザBウイルス(B株/長崎/1/87)、インフルエンザBウイルス(B株/大阪/491/97)、インフルエンザBウイルス(B株/PA/79)、インフルエンザBウイルス(B株/RU/69)、インフルエンザBウイルス(B株/シンガポール/64)、インフルエンザBウイルス(B株/東京/942/96)、インフルエンザBウイルス(B株/ビクトリア/3/85)、インフルエンザBウイルス(B株/ビクトリア/87)、インフルエンザBウイルス(B/ロチェスター/02/2001)、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスCは、サブタイプである、インフルエンザCウイルス(C/愛知/1/81)、インフルエンザCウイルス(C/愛知/1/99)、インフルエンザCウイルス(C/アナーバー/1/50)、インフルエンザCウイルス(C/青森/74)、インフルエンザCウイルス(C/カリフォルニア/78)、インフルエンザCウイルス(C/イングランド/83)、インフルエンザCウイルス(C/福岡/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/福岡/3/2004)、インフルエンザCウイルス(C/福島/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/ギリシャ/79)、インフルエンザCウイルス(C/広島/246/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/247/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/248/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/249/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/250/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/251/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/252/2000)、インフルエンザCウイルス(C/広島/252/99)、インフルエンザCウイルス(C/広島/290/99)、インフルエンザCウイルス(C/広島/4
/2004)、インフルエンザCウイルス(C/兵庫/1/83)、インフルエンザCウイルス(C/ヨハネスブルク/1/66)、インフルエンザCウイルス(C/ヨハネスブルク/66)、インフルエンザCウイルス(C/神奈川/1/76)、インフルエンザCウイルス(C/神奈川/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/カンザス/1/79)、インフルエンザCウイルス(C/京都/1/79)、インフルエンザCウイルス(C/京都/41/82)、インフルエンザCウイルス(C/ミシシッピ/80)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/90)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/1/99)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/12/2004)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/92)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/2/98)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/92)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/94)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/3/99)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/97)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/4/98)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/42/2004)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/2000)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/5/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/6/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/6/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/93)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/7/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/77)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/8/96)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/9/91)、インフルエンザCウイルス(C/宮城/9/96)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/1/85)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/2/85)、インフルエンザCウイルス(C/奈良/82)、インフルエンザCウイルス(C/ニュージャージー/76)、インフルエンザCウイルス(C/新潟/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/大阪/2/2004)、インフルエンザCウイルス(C/ブタ/北京/115/81)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/1/2000)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/1/2004)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/埼玉/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/札幌/71)、インフルエンザCウイルス(C/静岡/79)、インフルエンザCウイルス(C/山形/1/86)、インフルエンザCウイルス(C/山形/1/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/10/89)、インフルエンザCウイルス(C/山形/13/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/15/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/2/99)、インフルエンザCウイルス(C/山形/20/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/20/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/21/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/26/81)、インフルエンザCウイルス(C/山形/27/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/2004)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/3/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/4/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/4/89)、インフルエンザCウイルス(C/山形/5/92)、インフルエンザCウイルス(C/山形/6/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/6/98)、インフルエンザCウイルス(C/山形/64)、インフルエンザCウイルス(C/山形/7/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/8/96)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/2000)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/88)、インフルエンザCウイルス(C/山形/9/96)、インフルエンザCウイルス(C株/ベルリン/1/85)、インフルエンザCウイルス(C株/イングランド/892/83)、インフルエンザCウイルス(C株/五大湖/1167/54)、インフルエンザCウイルス(C株/JJ/50)、インフルエンザCウイルス(C株/ブタ/北京/10/81)、インフルエンザCウイルス(C株/ブタ/北京/439/82)、インフルエンザCウイルス(C株/テイラー/1233/47)、インフルエンザCウイルス(C株/山形/10/81)、イサウイルスもしくは伝染性サケ貧血ウイルス、ソゴトウイルスもしくはドーリウイルス、バトケンウイルス、ドーリウイルス(インド株/1313/61)もしくはソゴトウイルス、ソゴトウイルス(単離株SiAr126)もしくは未分類ソゴトウイルス、アラグアリウイルス、未分類オルトミクソウイルス科または家禽ペストウイルスもしくはブタインフルエンザウイルス、または未同定インフルエンザウイルス、および他のサブタイプに属するが、それらに限定されない。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、デルタウイルスファミリおよび全ての近縁属に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、ヒトアデノウイルスA、B、Cであるがこれに限定されない、アデノウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルスであるがこれに限定されない、ヘルペスウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、レオウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、パピローマウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ポックスウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルスであるがこれに限定されない,レトロウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、フィロウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、パラミクソウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、オルソミクソウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ピコルナウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ブニヤウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ニドウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、カルシウイルスファミリ、ならびに全ての近縁属、株、型、および単離株に属する。
ある実施形態では、同義コドン置換は、ゲノム中のコドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、RNA二次構造、CpGジヌクレオチド含有量、C+G含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、マイクロRNA認識配列の有無、またはそれらの任意の組み合わせを変化させる。コドン置換は、ゲノム全体にわたって分布した複数の場所で、またはゲノムの一部に制限された複数の場所で操作され得る。さらなる実施形態では、ゲノムの一部は、キャプシドコード領域である。
本発明の好ましい実施形態では、ウイルスは、動物宿主における防御免疫応答を誘発する能力を保持する。他の好ましい実施形態では、ウイルスの毒性は、野生型に戻らない。
ポリオウイルス、ライノウイルス、およびインフルエンザウイルス
ピコルナウイルスファミリの一員であるポリオウイルスは、7.5kbの長さの1本鎖(+)センスRNAゲノムを有する、小型の非エンベロープウイルスである(Kitamura et al., 1981)。細胞侵入時、ゲノムRNAは、一連の自己触媒的切断事象の後に、機能ポリオウイルスタンパク質の完全な相補体を生じさせる単一ポリタンパク質をコード化する、mRNAとして機能する。同一のゲノムRNAは、子孫ビリオンへのキャプシド形成の対象とされている、mRNA、複製テンプレート、またはゲノムRNAのいずれかとして機能する新しい(+)鎖の合成のための中間体である、(−)センスRNAの合成のためのテンプレートとして機能する(Mueller et al., 2005)。本明細書に記載されるように、弱毒化合成ウイルスの産生のための設計戦略を最適化する上での一般的な問題に対処するために、十分に確立したPV系を使用した。PVは、抗ウイルス戦略を構築するための、最も重要かつ最もよく理解された分子モデルのうちの1つを提供する。特に、逆遺伝学系が存在し、それによりウイルス核酸は、完全な合成方法によって生体外で合成し、次いで、感染性ビリオンに変換することができる(以下を参照)。さらに、前述の通り、合成PV設計の弱毒化を試験するための便利なマウスモデルが利用可能である(ポリオに対するヒト受容体を発現する、CD155tgマウス)(Cello et al., 2002)。
ライノウイルスも、ピコルナウイルスファミリの一員であり、PVに関連する。ヒトライノウイルス(HRV)は、風邪の通常の原因病原体であり、したがって、それらは、いずれの他の感染病原体よりも多くの疾病の発現に関与する(Hendley, 1999)。風邪に加えて、HRVはまた、耳および副鼻腔感染、喘息、および他の疾病に関与する。PVと同様に、HRVは、1本鎖プラスセンスRNAウイルスを含み、そのゲノムは、自己プロセシングポリタンパク質をコード化する。RNAは、キャプシドを形成する構造タンパク質に加えて、2つのウイルスプロテアーゼ、2Aおよび3C、ならびにRNA依存性ポリメラーゼ等の非構造タンパク質を産生するために、内部リボソーム進入部位(IRES)を使用して、内部開始機構によって翻訳される(Jang et al., 1989、Pelletier et al., 1988)。やはりPVと同様に、HRVは、4個のキャプシドタンパク質VP1−4の60個のコピーによって形成される、非エンベロープ20面体キャプシドを有する(Savolainen et al., 2003)。HRVの複製サイクルもまた、ポリオウイルスのものと同一である。PVとの酷似は、ヒトの健康への有意な、ほとんど普遍的な影響と組み合わせて、HRVを、予防接種に有用な新規の弱毒化ウイルスを生成するための、非常に魅力的な候補にする。
製薬会社による何十年もの研究にもかかわらず、HRVに対する好ましい薬剤は開発されていない。これは、1つには、ほとんど深刻ではない疾病を治療する薬剤に対する、連邦規制機関および大衆の比較的低いリスク許容度が原因である。すなわち、軽度の副作用でさえ受け入れられない。したがって、薬剤がないので、安全かつ効果的な抗ライノウイルスワクチンへの明確な要望がある。しかしながら、抗ライノウイルスワクチンの開発は、HRVの血清型が100以上あり、そのうちの約30は、広範囲にわたって広がり、日常的にヒトを感染させるため、非常に困難である。効果的なワクチンは、確実な免疫をもたらすために、免疫系が全ての血清型を認識することを可能にしなければならない。本明細書に記載されるSAVE方法は、効果的なライノウイルスワクチンの開発への現実的な解決策を提供する。SAVE設計プロセスの予測可能性に基づくと、組み合わせてワクチンを構成する、100以上のSAVE弱毒化ライノウイルスの設計および合成は安価である。
インフルエンザウイルス−1990年から1999年の間、インフルエンザウイルスは、米国において毎年約35,000人の死者を出した(Thompson et al., 2003)。約200,000件の入院と合わせて、米国経済への影響は、年間230億ドルを超えると推測されている(Cram et al., 2001)。世界的には、300,000から500,000人の間の人が、インフルエンザウイルス感染によって毎年死亡している(Kamps et al., 2006)。ウイルスは、全年齢層の間で疾病を引き起こすが、重い合併症の速度は、小児および65歳以上の人で最も高い。インフルエンザは、約3000万人が死亡した1918年のインフルエンザの大流行の間に起こったように、極度の致死性に変異する、または組み換わる可能性がある。これは、ヒトの歴史において、恐らくたった1つの最も致命的な1年の流行であった。
インフルエンザウイルスは、A、B、およびCの3つの型に分類される。抗原性は、エンベロープビリオンの表面における2個の糖タンパク質、血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)によって決定される。両方の糖タンパク質は、体液性免疫を逃れるために、それらの抗原性を連続的に変化させる。糖タンパク質の変化は、ウイルス株がワクチン接種者を感染させ続けることを可能にし、それが、高リスク群の毎年のワクチン接種の理由である。加えて、ヒトインフルエンザウイルスは、HAまたはNA糖タンパク質を鳥類またはブタのもので置換することができ、遺伝的シフトとして知られる遺伝子断片の再集合は、新ウイルスをもたらす(H1N1からH2N2またはH3N2等)(Steinhauer and Skehel, 2002)。世界人口が免疫学的に感受性であるこれらの新規ウイルスは、何百万人もの人が死亡する流行の原因である(Kilbourne, 2006、Russell and Webster, 2005)。極めて病原性の高い鳥インフルエンザウイルス、H5N1の近年の脅威と合わせて、インフルエンザウイルスの歴史(Stephenson and Democratis, 2006)は、インフルエンザ疾病の予防の必要性を強調する。
現在、生弱毒化ワクチン(低温に適応、「FluMist」)および不活化ウイルスの、2つのインフルエンザワクチンが使用されている。弱毒化ワクチンの適用は、5〜49歳の健康な小児、若年者、および成人(妊婦を除く)に制限されている。この年齢制限は、まさにインフルエンザのリスクが最も高い人を除外する。さらに、弱毒化FluMistウイルスは、生ウイルスには一般的な復帰の可能性がある。2番目により一般的に投与される不活化インフルエンザウイルスワクチンの産生は、複雑である。さらに、このワクチンは、高齢者(65歳より高齢)人口の死亡の予防において、期待したよりも効果的でないように思われる(Simonson et al., 2005)。これらの事実は、インフルエンザウイルスワクチンを生成するための新規戦略の必要性を強調する。
ピコルナウイルスの逆遺伝学
逆遺伝学は、概して、古典的遺伝学のいわゆる順遺伝学的方法と反対方向に進む、遺伝子の機能を発見するための実験的方法を指す。すなわち、順遺伝学的方法が、表現型形質の遺伝的基礎を解明することによって、遺伝子の機能を決定しようとするのに対して、逆遺伝学に基づく戦略は、単離された遺伝子で始まり、wtまたは変異遺伝子の発現によって生成される、考えられる表現型を研究することによって、その機能を発見しようとする。ウイルス系との関連で本明細書に使用される「逆遺伝学」系は、RNAで作られるウイルスゲノムの遺伝子操作を可能にする技術の利用可能性を指す。簡潔に、ウイルスゲノムは、ビリオンまたは感染細胞から単離され、酵素逆転写によってDNA(cDNA)に変換され、必要に応じて改変される場合もあり、通常RNA中間体を介して、感染性ウイルス粒子に復帰する。ピコルナウイルスにおけるこのプロセスは非常に単純であり、実際に、全ての中で、動物RNAウイルスのために開発された最初の逆遺伝学系は、PVのためのものであった(Racaniello and Baltimore, 1981)。ウイルス逆遺伝学系は、裸のウイルスゲノムRNAが、好適な哺乳類細胞に導入される際に感染性であるという歴史的な所見に基づいている(Alexander et al., 1958)。1970年代の逆転写酵素の発見および分子クローニング技術の開発は、科学者がRNAウイルスゲノムのcDNAコピーを生成および操作することを可能にした。最も一般的に、ゲノムの全cDNAコピーは、次にウイルスの生成のために細胞に導入されるゲノムRNAの生体外合成を可能にする、ファージT7 RNAポリメラーゼプロモータのすぐ下流でクローン化される(van der Wert, et al., 1986)。あるいは、同一のDNAプラスミドは、細胞質においてT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞に導入され得る。この系は、PVおよびHRVの両方を含む種々のウイルス病原体に使用することができる。
インフルエンザウイルスの分子ウイルス学および逆遺伝学
ピコルナウイルス、PV、およびHRVと同様に、インフルエンザウイルスはRNAウイルスであるが、その他の点ではPVとは無関係であり全く異なる。ピコルナウイルスと対照的に、インフルエンザはマイナス鎖ウイルスである。さらに、インフルエンザは、890〜2341ヌクレオチドに及ぶ8個の別々の遺伝子断片から成る(Lamb and Krug, 2001)。1つにはマイナス鎖組織によって、また1つには8個の別々の遺伝子断片によって、逆遺伝学系はPVに対してよりも複雑である。それにもかかわらず、逆遺伝学系は、インフルエンザウイルスのために開発されてきた(Enami et al., 1990、Fodor et al., 1999、Garcia−Sastre and Palese, 1993、Hoffman et al., 2000、Luytjes et al., 1989、Neumann et al., 1999)。8個の遺伝子断片の各々は、別々のプラスミドから発現される。この逆遺伝学系は、最長の個々の遺伝子断片が3kb未満であり、したがって合成および操作が容易であるため、本明細書に記載されるSAVE戦略での使用に非常に便利である。さらに、異なる遺伝子断片は、単純に異なるプラスミドを混合することによって組み合わせ、および組み換えることができる。したがって、SAVE方法の適用は、PVに対してよりもインフルエンザウイルスに対して、さらに実行可能である可能性がある。
ウイルス逆遺伝学における近年のパラダイムシフトは、合成DNAオリゴヌクレオチドからの集合による感染性ウイルスゲノムの本発明者らの最初の化学合成で起こった(Cello et al., 2002)。この達成は、逆遺伝学系が利用可能であるほとんどまたは全てのウイルスが、それらのゲノム配列情報のみから合成することができることを明確にし、所望の要件を満たすためのこれらのウイルスの再合成および改変において、これまでにない柔軟性を保証する。
ウイルスゲノムのデノボ合成
ウイルスゲノムをデノボ設計および合成するために、コンピュータによるアルゴリズムが使用される。本明細書に記載される弱毒化PVの合成で例示される、これらの合成されたゲノムは、野生型(wt)ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、代替同義コドンを使用することによって、コドンバイアス、コドン対バイアス、RNA二次構造、および/またはジヌクレオチド含有量を含む種々のパラメータは変化させられる。示されたデータは、しばしばタンパク質の不十分な翻訳によって、これらのコーディング非依存的変化が高度な弱毒化ウイルスを産生することを示す。全てのウイルスの基本的機能、すなわちタンパク質翻訳を標的にすることによって、ワクチン製造に有用な弱毒化ウイルスを予想通りに、安全に、迅速に、かつ安価に産生するための、非常に一般的な方法が開発された。「SAVE」(合成弱毒化ウイルス工学)と呼ばれるこの方法は、新ワクチンの医学的必要性があるPV以外の多種多様のウイルスに適用できる。これらのウイルスは、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、SARSおよび他のコロナウイルス、HIV、HCV、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、EBV、黄熱病ウイルス;エコーウイルス、コクサッキーウイルス、およびエンテロウイルス71等の、ポリオウイルス以外のエンテロウイルス;A型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス等のアフトウイルス、インフルエンザウイルス等のミクソウイルス、麻疹ウイルス等のパラミクソウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス;デングウイルス、黄熱病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性ウイルス等のフラビウイルス;西部および東部ウマ脳炎ウイルス等のアルファウイルス、B型肝炎ウイルス、およびウシ下痢症ウイルス、ならびにエボラウイルスを含むがこれらに限定されない。
PVキャプシドコード領域におけるコドンおよびコドンペア脱最適化の両方が、PV適応度を劇的に減少させることを本明細書に示す。本発明は、同義コドンの置換によるウイルス弱毒化の基礎となるいずれの特定の分子機構にも限定されない。それにもかかわらず、弱毒化ウイルスの産生におけるコドンおよびコドン対脱最適化の基礎的な分子機構をよりよく理解するために、実験は進行中である。特に、コドン脱最適化およびコドン対脱最適化が、非効率的な翻訳をもたらす可能性があることを示唆する証拠が、本願に提供される。迅速な生成および数多くのウイルス構築物のスクリーニングのためのハイスループット方法もまた、開発されている。
大規模DNA集合
近年、オリゴヌクレオチド合成のコストの急落および質の増加は、合成オリゴヌクレオチドからDNAの大断片(少なくとも最大で約10kb)を集合させることを実用的にしてきた。Blue Heron Biotechnology, Inc.(Bothwell, WA)等の(および多くの他の)商業ベンダーは、現在、1塩基当たり約$1.50という比較的低い価格で、既知の配列の合成DNAの大断片を合成、集合、クローニング、配列検証、および配達する。したがって、商業サプライヤーからの合成されたウイルスゲノムの購入は、便利かつコスト効率のよい選択肢であり、価格は急激に下がり続けている。さらに、極めて低いコストで非常に大きなDNA分子を合成し、集合させる新しい方法が現れている(Tian et al., 2004)。Church labは、何千ものオリゴヌクレオチドの平行合成(例えば、Nimblegen Systems, Inc., Madison, WIまたはAgilent Technologies, Inc., Santa Clara, CAから入手可能な、光プログラム可能マイクロフルイディクスチップ上、またはマイクロアレイ上で)、続いて、重複PCRによるエラー低減および集合を使用する方法を先駆けて開発してきた。これらの方法は、合成巨大DNAのコストを1塩基当たり1セント未満まで削減する可能性がある。大規模DNA合成の効率および正確性の向上、ならびコストの急激な低下は、SAVE戦略の構築および幅広い適用のための推進力を提供する。
代替的コード化、コドンバイアス、およびコドン対バイアス
代替的コード化
所与のペプチドは、数多くの核酸配列によってコード化することができる。例えば、典型的な10merオリゴペプチドでさえ、約410(約106)個の異なる核酸によってコード化することができ、PVのタンパク質は、約10442個の異なる核酸によってコード化することができる。自然選択は、これらの考えられる10442個の核酸のうちの1つを、PVゲノムとして最終的に選択している。一次アミノ酸配列が、所与のmRNAによってコード化される最も重要なレベルの情報である一方で、異なる種類のRNA配列において、追加の種類の情報がある。これらには、異なる機能のRNA構造要素(例えば、PVに対しては、シス作用性複製要素、またはCRE(Goodfellow et al., 2000、McKnight, 2003)、翻訳動的シグナル(中止部位、フレームシフト部位等)、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、酵素機能(リボザイム)、および恐らく、他のまだ同定されていない情報およびシグナル)が含まれる。
CRE等のシグナルを保存しなければならないという注意があるにしても、10442個の考えられるコード化配列は、同一タンパク質をコード化する能力を保存しながら、ポリオのRNA配列において劇的な変化をもたらす驚異的な柔軟性を提供する。コドンバイアスもしくはコドン対バイアスにおける変化が可能であり、RNAにおける核酸シグナルおよび二次構造は、追加または除去することができる。追加または新規タンパク質は、代替フレームにおいて同時にコード化することさえ可能である(例えば、Wang et al., 2006を参照)。
コドンバイアス
ほとんどのアミノ酸が、いくつかの異なるコドンによってコード化することができる一方で、全てのコドンが同頻度で使用されるとは限らず、「希少」コドンであるコドンもあれば、「高頻度」コドンであるコドンもある。ここで使用される「希少」コドンは、そのアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンよりも大幅に低い頻度でmRNAに存在する特定のアミノ酸をコード化する、少なくとも2個の同義コドンのうちの1つである。したがって、希少コドンは、最も頻繁に使用されるコドンよりも2倍低い頻度で存在し得る。好ましくは、希少コドンは、アミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンよりも少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍低い頻度で存在する。反対に、「高頻度」コドンは、そのアミノ酸に対して最低頻度で使用されるコドンよりも大幅に高い頻度でmRNAに存在する特定のアミノ酸をコード化する、少なくとも2個の同義コドンのうちの1つである。高頻度コドンは、アミノ酸に対して最低頻度で使用されるコドンよりも約2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍高い頻度で存在し得る。例えば、ヒト遺伝子は、40%の確率でロイシンコドンCTGを使用するが、たった7%の確率で同義CTAを使用する(表2を参照)。したがって、CTGが高頻度コドンである一方で、CTAは希少コドンである。これらの使用頻度におおむね一致して、CTGを認識するtRNAの遺伝子に対して、ゲノム中のコピーが6個ある一方で、CTAを認識するtRNAの遺伝子のコピーは2個のみである。同様に、ヒト遺伝子は、セリンに対して高頻度コドンTCTおよびTCCを、それぞれ18%および22%の確率で使用するが、希少コドンTCGはたった5%の確率で使用する。TCTおよびTCCは、ゲノム中のその遺伝子の10個のコピーを有する、同一tRNAによるゆらぎを介して読み取られるが、TCGは、たった4個のコピーによって読み取られる。非常に活発に翻訳されるmRNAが、最高頻度コドンのみを使用するために強くバイアスされることはよく知られている。これは、リボソームタンパク質および糖分解酵素の遺伝子を含む。一方で、比較的豊富ではないタンパク質のmRNAは、希少コドンを使用し得る。
高度に発現された遺伝子が高頻度コドンを使用する傾向は、「コドンバイアス」と呼ばれる。リボソームタンパク質の遺伝子は、61個のコドンのうちの20〜25個の最高頻度コドンを使用し、高いコドンバイアス(1に近いコドンバイアス)を有する可能性があるが、わずかに発現された遺伝子は、61個のコドン全てを使用し、コドンバイアスをほとんどまたは全く有しない可能性がある(0に近いコドンバイアス)。頻繁に使用されるコドンは、より多くの同族tRNAが発現されるコドンであり、これらのコドンの使用は、翻訳がより迅速に、もしくはより正確に、またはその両方で進むことを可能にすることが考えられる。PVキャプシドタンパク質は、非常に活発に翻訳され、高いコドンバイアスを有する。
コドン対バイアス
コード配列の目立った特徴は、それらのコドン対バイアスである。これは、8個の異なるコドン対によってコード化することができるアミノ酸対Ala−Gluを考察することによって説明され得る。個々のコドンの頻度(表2に示される通り)以外の要因が、コドン対の頻度に関与しない場合、8個のコード化の各々の予測頻度は、2個の関連コドンの頻度を乗じることによって計算することができる。例えば、この計算によって、コドン対GCA−GAAは、全てのAla−Gluコード化対の中から、0.097の頻度で発生すると予測される(0.23x0.42、表2の頻度に基づく)。各コドン対の予測(仮想)頻度をヒトゲノム中で実際に観察される頻度と関連付けるために、合計で14,795個のヒト遺伝子を含有する、常に注釈付きのヒトコード領域のConsensus CDS(CCDS)データベースを使用した。この遺伝子セットは、ヒトコード配列の最も包括的な表現である。この遺伝子セットを使用して、コドンの発生回数を同一アミノ酸に対してコード化する全ての同義コドンの数で割ることによって、コドン使用の頻度を再計算した。予測通り、頻度は、表2に示される頻度等のすでに公開された頻度と密接に相関した。わずかな頻度変化は、84949個のヒトコード配列が計算に含まれる(実際のヒト遺伝子数よりもはるかに多い)、Kazusa DNA Research Institute(http://www.kazusa.or.jp/codon/ codon.html)のコドン使用データベースによって提供されるデータにおける、過剰サンプリング効果による可能性がある。次いで、このように計算したコドン頻度を使用し、最初に2個の関連コドンの頻度を互いに乗じ(表3の予測頻度を参照)、次いでこの結果に、当該コドン対によってコード化されるアミノ酸対が発生する実測頻度(全CCDSデータセットにおける)を乗じることによって、予測コドンペア頻度を計算した。コドン対GCA−GAAの例において、この第2の計算は、0.098の予測頻度をもたらす(Kazusaデータベースを使用した第1の計算の0.97と比較して)。最後に、セット内の各コドン対の発生の総数を数え、それを同一アミノ酸対に対してコード化するセット内の全ての同義コード化対の数で割ることによって、14,795個のヒト遺伝子セットで認められるような実際のコドン対頻度を決定した(表3、実測頻度)。14,795個のヒト遺伝子セットに基づく、3721(612)個のコドン対の完全セットの頻度および実測/予測値は、捕捉表1として本明細書で提供される。
コドン対の実測頻度/予測頻度の比率が1よりも大きい場合、コドン対は、過剰に存在すると言える。比率が1よりも小さい場合、過少に存在すると言える。例において、コドン対GCA−GAAが1.65倍過剰に存在する一方で、コード化対GCC−GAAは、5倍以上過少に存在する。
多くの他のコドン対は非常に強いバイアスを示し、過少に存在する対もあれば、過剰に存在する対もある。例えば、コドン対GCCGAA(AlaGlu)およびGATCTG(AspLeu)は、3〜6倍過少に存在するが(好ましい対は、それぞれGCAGAGおよびGACCTGである)、コドン対GCCAAG(AlaLys)およびAATGAA(AsnGlu)は、約2倍過剰に存在する。コドン対バイアスが、アミノ酸の対の頻度とも、個々のコドンの頻度とも無関係であることは、注目すべきである。例えば、過少に存在する対GATCTG(AspLeu)は、最高頻度Leuコドン(CTG)を使用する。
コドン対バイアスは原核細胞中で発見されたが(Greve et al., 1989を参照)、その後ヒトを含む全ての他の検査した種に見られた。効果は、非常に高い統計的有意性を有し、確実に単なるノイズではない。しかしながら、その機能的有意性があるとすれば、それは未解決である。一提案は、tRNAには、リボソーム上で集められる時によく相互作用する対もあれば、一方で、十分に相互作用しない対もあることである。異なるコドンは、通常異なるtRNAによって読み取られるため、コドン対は、不適合tRNAの対をまとめることを防ぐために、バイアスされ得る(Greve et al., 1989)。別の考えは、多くの(しかし全てではない)過少に存在する対が、中央CGジヌクレオチド(例えば、GCCGAA、AlaGluをコード化する)を有し、CGジヌクレオチドは、哺乳動物において系統的に過少に存在することである(Buchan et al., 2006、Curran et al., 1995、Fedorov et al., 2002)。したがって、コドン対バイアスの効果は2種類であり得、1つは、哺乳類ゲノム中のCGの過少存在の間接的効果であり、もう1つは、翻訳の効率、速度、および/または正確性と関係がある。本発明が、コドン対バイアスの基礎となるいかなる特定の分子機構にも限定されないことが強調される。
以下に詳述するように、コドン対バイアスは、コード配列の全長にわたって平均化される、コード配列中の各コドン対のスコアを考慮に入れる。本発明に従って、コドン対バイアスは、以下の式によって決定される。
したがって、コード配列に対する同様のコドン対バイアスは、例えば、部分列にわたって最小化されたコドン対、またはコード配列の全長にわたってやや減少したコドン対スコアによって得ることができる。
61個のセンスコドンの全ておよびセンスコドン対の全てを確実に使用することができるため、高頻度コドンの代わりに単一希少コドンを使用する、または高頻度コドン対の代わりに希少コドン対を使用することが、多くの効果を有するとは予測されない。したがって、コドンおよびコドン対バイアスの多くの以前の研究は、実験ではなく情報科学を介して行われてきた。実験研究に基づいたコドン対バイアスの一研究は、Irwin et al.(1995)の研究であり、Irwinは、ある過剰に存在するコドン対が、直感に反して、より遅い翻訳を引き起こしたことを発見した。しかしながら、この結果は、2番目のグループによって再現することができなかった(Cheng and Goldman, 2001)、 また、以下に報告する結果と矛盾する。したがって、本結果(以下を参照)は、コドン対バイアスの機能的役割の最初の実験的証拠であり得る。
本明細書に開示されるある実験は、約1000個のコドンを含む、PVの全キャプシド領域等の再コードし、ゲノム中の少ないコドンバイアスおよび少ないコドン対バイアスの両方を別々に組み込むことに関連する。これらの実験の基礎となる理論的根拠は、各置換が小さい効果を生み出すならば、全ての置換が合わせて大きな効果を生み出すはずであるということである。実際に、脱最適化されたコドンバイアスおよび脱最適化されたコドン対バイアスの両方が、生存しないウイルスを別々に作製するということがわかっている。実施例においてより詳細に考察されるように、予備データは、非効率的な翻訳が、少ないコドンバイアスまたはコドン対バイアスでウイルスの生存性を減少させるための主要な機構であることを示唆する。正確な機構に関係なく、データは、ウイルスゲノムへの脱最適化された同義コドンの大規模置換が、極度の弱毒化ウイルスをもたらすことを示唆する。弱毒化ウイルスを産生するためのこの方法は、SAVE(合成弱毒化ウイルス工学)と呼ばれている。
本発明に従って、コドン対バイアスならびにコドンバイアスの変化によって、ウイルス弱毒化を達成することができる。しかしながら、コドン対バイアスの調整は、特に有利であることが期待される。例えば、コドンバイアスによるウイルスの弱毒化は、概して共通コドンの除去を必要とし、したがって、ヌクレオチド配列の複雑性は低減する。対照的に、コドン対バイアス低減または最小化は、はるかに大きな配列多様性、およびその結果としてより大きな核酸二次構造の制御、アニーリング温度、ならびに他の物理的および生化学的特性を維持しながら達成することができる。本明細書に開示される研究は、コドンがシャッフルされるが、コドン使用プロファイルは変化しない、弱毒化コドン対バイアスが低減または最小化された配列を含む。
当業者似よく知られている方法で、ウイルス弱毒化を確認することができる。限定されない例には、プラークアッセイ、増殖測定、および試験動物における死亡率の減少が含まれる。本願は、弱毒化ウイルスが宿主における防御免疫応答を誘発することが可能であることを立証する。
合成弱毒化ウイルス工学(SAVE)
SAVEは、特別に設計されたコンピュータソフトウェア、およびウイルスのゲノムを再コードおよび再合成するための、核酸合成および集合の現代的方法を採用する。この戦略は、有効なワクチンが求められる種々の医学的に重要なウイルスに対するワクチンを産生する、効率的な方法を提供する。
2つの効果的なポリオワクチン、Jonas Salkによって開発された不活化ポリオワクチン(IPV)、およびAlbert Sabinによって開発された生弱毒化ウイルスを含む経口ポリオワクチン(OPV)は、1950年代からそれぞれ入手可能である。実際に、灰白髄炎の根絶への世界的な取り組みが1988年に始まり、World Health Organization(WHO)が主導し、世界中のほとんどの国からのポリオの根絶に成功した。年間の診断症例数は、2005年には数十万から2000件未満に減少し、インドおよびナイジェリアで主に発生している。しかしながら、OPVの幅広い利用に関する問題は、それが病原型に戻る可能性があることであり、まれな事象と考えられるが、ワクチン由来のポリオの発生が報告されている(Georgescu et al., 1997、Kew et al., 2002、Shimizu et al., 2004)。実際に、生ポリオウイルスワクチン株を使用する限り、各々は7個未満の弱毒突然変異を保因し、この株がwtに戻る可能性があり、そのような復帰は、ポリオの完全な根絶に深刻な脅威を与える。したがって、WHOは、ポリオ根絶におけるその取り組みの終盤において、復帰の可能性を防ぐ新しいポリオワクチンが十分に必要であり得、これは、PVへのSAVEの適用に関する本明細書に開示される研究の一理論的根拠を提供する。しかしながら、主にPVはSAVEを開発するための優れたモデル系であるという理由から、PVを選択した。
再コード中、ウイルスゲノム中の必須核酸シグナルは保存されるが、タンパク質翻訳の効率は、コドンバイアス、コドン対バイアス、ならびにRNA二次構造、およびCpGジヌクレオチド含有量、C+G含有量、翻訳フレームシフト部位、翻訳中止部位、またはそれらの任意の組み合わせ等の他のパラメータを脱最適化することによって、系統的に減少する。この脱最適化は、何百または何千もの変化を伴う可能性があり、各々は小さい効果を有する。概して、脱最適化は、ウイルスが一部の細胞株(特定のウイルスに対して許容性を有するように特に操作された株を含む)でなおも増殖することができるが、ウイルスが正常動物またはヒトにおいて非病原性である時点まで実施される。そのような非病原性ウイルスは、完全毒性ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化し、したがって、完全毒性ウイルスと全く同一の免疫応答を誘発するため、死菌または生ワクチンのいずれにも優れた候補である。加えて、SAVEプロセスは、弱毒化レベルの微調整に対する可能性を提供する。すなわち、それは、ほぼ予測可能な程度まで脱最適化された合成ウイルスを設計する能力を提供する。ウイルス粒子の設計、合成、および産生は、一度ゲノム配列が既知になると、数週間の期間で達成可能であり、潜在的な緊急事態におけるワクチンの産生の重要な利点を有する。さらに、弱毒化ウイルスは、非常の数多くの有害なヌクレオチド変化が伴うため、毒性に戻る可能性は実質的にないと予測される。この方法は、概して多様なウイルスに適用でき、いずれの特定のウイルスに対するウイルスゲノム配列および逆遺伝学系の知識のみを必要とする。
コドンバイアスの脱最適化によるウイルス弱毒化
上記の対照細胞/試験細胞のIC50比の方法を使用する場合、1以下のCSG値を有する化合物は、概して、よい臨床候補化合物とはみなされないが、約10よりも大きなCSG値を有する化合物は、非常に有望であり、さらに考察する価値がある。
弱毒化ウイルスを操作する手段として、同義コドン使用を変化させることによって、ポリオウイルス1型Mahoney[PV(M)]のキャプシドコード領域を再操作した。キャプシド領域は、ウイルス約3分の1を成し、非常に活発に翻訳される。可能な限り多い数の頻繁に使用されるコドンを希少同義コドンで置換することによって、非常に低いコドンバイアスを有する、1つの変異ウイルス(ウイルスPV−AB)を作製した。対照として、元のコドンバイアスを維持しながら可能な限り多い数の同義コドン変化を有する、別のウイルス(PV−SD)を作製した。図1および2を参照されたい。したがって、PV−SDは、wtと本質的に同一のコドンを有するウイルスであるが、それれらはシャッフルされた位置にあって、その一方全く同一のタンパク質をコード化する。PV−SDにおいて、シャッフル方法によってコドン対バイアスを増加または減少させようとする試みはなかった。実施例1を参照されたい。キャプシドコード領域における934個のヌクレオチドの変化にもかかわらず、PV−SD RNAは、wtと区別できない特性を有するウイルスを産生した。対照的に、680個のサイレント変異を保因するPV−ABからは、生存ウイルスは回収されなかった。実施例2を参照されたい。
PV−ABの生存不能に関しては、ヌクレオチド変化のうちの1つのみが、何らかの形で致死的であり、他の679個は無害であるということによりわずかに説明される。例えば、ヌクレオチド変化は、複製の阻害等のある破壊的だが認められていない理由で致死的であり得る。しかしんながら、この説明は疑わしい。PVは、CRE等、そのRNAにおける重要な調節要素を含有しないが、そのような要素は、キャプシドコード領域内に存在しないことが知られている。これは、もちろん、ウイルス粒子を形成することはできないが、全キャプシドコード領域が、細胞中の残存ゲノムの正常な複製に影響を与えることなく削除することができるという証明によって裏付けられる(Kaplan and Racamiello, 1988)。
ある再操作されたウイルスの生存不能に関する問題に対処するために、ウイルスPV−ABのキャプシド領域のサブ断片を野生型ウイルスにサブクローン化した。実施例1および図3を参照されたい。大きなサブクローン化された断片(非重複断片を含む)の組み込みは、致死性であることが認められ、その一方小さいサブクローン化された断片は、生存する(1つの例外を除いて)が健康でないウイルスを産生した。「健康でないこと」は、多くのアッセイから明白であり、例えば、少ないコドンバイアスの断片は、少ない力価(図3B)および小さいプラーク(図3C〜H)をもたらす。概して、大きな致死性断片が2個のサブ断片に分割され、それらの両方は生存するが健康でないことは、特に有益である。これらの結果は、生存不能が1つの変化のみによるものであるという仮説を除外し、代わりに、少なくとも、多くの変化が表現型に寄与しているはずである。
位置1513〜2470に特別な断片がある。この断片は極めて小さいが、PVゲノム中のその包含は、生存不能を引き起こす。このフラグメントが、単に疾病を引き起こすだけで、ウイルスを不活性化しないサブフラグメントに細分することができるかどうかは、現在知られていない。この断片は、非常に有害な変化、場合によっては翻訳フレームシフト部位を含有しないことが考えられる。
少ないコドンバイアスは、編訳への効果を自然と示すため、ウイルスPV−ABによってコード化されるタンパク質の翻訳を試験した。実施例5および図5を参照されたい。実際に、全ての健康ではないウイルスは、キャプシドタンパク質をあまり翻訳しなかった(図5B)。翻訳は、健康ではないことの原因となっている不十分な翻訳と一致して、より健康ではないウイルスにおいてあまり効率的ではなかった。翻訳は、制限している希少コドンの認識速度と一致して、過剰tRNAおよびアミノ酸が添加された反応において、本質的にwtレベルまで改善された(図5A)。
脱最適化されたコドンバイアスが非効率的な翻訳を引き起こしていたかどうかの第2の試験として、wtおよび脱最適化キャプシドの一部を、ジシストロニックレポータ構築物におけるホタルルシフェラーゼのN末端に融合させた。実施例5および図6を参照されたい。これらの融合構築物において、ルシフェラーゼの翻訳は、N末端で融合したキャプシドタンパク質によって決まる。この場合もやはり、脱最適化されたコドンでのキャプシドタンパク質の翻訳は不十分であり、より健康ではないウイルスにおいて悪化したことがわかり、因果関係を示唆する。したがって、データは、PV−ABウイルス中の何百もの希少コドンが、主に不十分な翻訳によって生存不能を引き起こすことを示唆する。さらに、生体外に見られる不十分な翻訳および培養細胞に見られるウイルス疾病もまた、動物の感染に反映される。最も衰弱していない脱最適化ウイルスのうちの1つ、PV−AB2470−2954に対してでさえ、マウスにおける疾病を引き起こすために必要とされるウイルス粒子の数は、約100倍増加した。実施例4、表4を参照されたい。
Burns et al.(2006)は、PVのサビン2型ワクチン株を用いたいくつかの同様の実験を最近記載し、同様の結論に達した。Burns et al.は、完全に異なるコドン脱最適化ウイルスを合成し(すなわち、本明細書に記載されるPV−ABウイルスのヌクレオチド配列と、それらの「abcd」ウイルスは非常に異なる)、それにもかかわらず、同様のアッセイを使用して、同様の程度の衰弱を得た。Burns et al.は、弱毒化に対する宿主生物におけるそれらのウイルス構築物を試験しなかった。しかしながら、それらの結果は、SAVEが予測可能であり、結果が、正確なヌクレオチド配列にあまり左右されないという考えを立証する。
コドン対バイアスの脱最適化によるウイルス弱毒化
本発明に従って、コドン対バイアスは、コドン使用とは無関係に変化させることができる。例えば、当該のタンパク質コード化配列において、コドン対バイアスは、単にそのコドンの指示された再編成によって変化させることができる。特に、宿主生物において異なる頻度である可能性がある、親配列に生じるのと同一コドンは、変化した配列で使用されるが、異なる位置である。最も単純な形において、親配列におけるのと同一コドンが使用されるため、考察されているタンパク質コード領域でのコドン使用は変化しないままである(コード化したアミノ酸配列と同様)。それにもかかわらず、あるコドンは、新しい状況で生じ、すなわち、親配列にあるものと同一のアミノ酸をコード化するコドンが先行する、および/または後に続くが、異なるヌクレオチドトリプレットを採用する。理想的には、コドンの再編成は、親配列にあるコドン対よりも頻繁ではないコドン対をもたらす。実際には、コドンの再編成は、しばしば、1つの位置においてあまり高頻度でないコドン対、および第2の位置においてより頻繁な対をもたらす。コドンの慎重な再編成によって、コード配列の所与の長さにわたるコドン対使用バイアスは、親配列に比して減少させることができる。あるいは、親配列においてよりも、宿主においてより頻繁なコドン対を使用する配列を産生するために、コドンを再編成し得る。
本明細書に開示されるように、各コドン対を順に考察し、コドン対が宿主のタンパク質コード配列中に認められる頻度に従って各対をスコアリングし、次いで、配列に対するコドン対バイアスを決定することによって、コドン対バイアスは評価される。同一コドン対バイアスを有する多くの異なる配列を作製することができることは、十分に理解される。また、コドン対バイアスは、コドンが再編成される方法に応じて、異なる程度で変化させることができる。コード配列のコドン対バイアスは、全コード配列を再コード化することによって、または1つ以上の部分列を再コード化することによって変化させることができる。ここで使用される「コドン対バイアス」は、配列の一部のみが変異する可能性があるが、コード配列の長さにわたって評価される。コドン対は宿主生物のコドン使用に照らしてスコアリングされるため、コドン対バイアス値は、野生型ウイルス配列および変異ウイルス配列に割り当てることができる。本発明に従って、ウイルスは、ウイルスのタンパク質コード化配列の全部または一部を再コード化することによって弱毒化し、そのコドン対バイアスを減少させることができる。
本発明に従って、コドン対バイアスは、宿主のコドン対使用から決定される定量的特性である。したがって、絶対コドン対バイアス値は、いずれの所与のウイルスタンパク質コード配列に対しても決定され得る。あるいは、脱最適化されたウイルスタンパク質コード配列を、それが由来する「親」配列に関連付ける、コドン対バイアス値の相対的変化を決定することができる。ウイルスは種々の種類で現れ(すなわち、Baltimore分類によるI〜VII型)、異なるウイルスの自然(すなわち、毒性)単離株は、絶対コドン対バイアスの異なる値を得るため、通常、弱毒化の所望のレベルの決定に対してより関連深いのは、コドン対バイアスにおける相対変化である。したがって、本発明は、弱毒化ウイルスおよび弱毒化ウイルスを製造する方法を提供し、弱毒化ウイルスは、1つ以上のタンパク質コード化ヌクレオチド配列が、変異によって減少したコドン対バイアスを有する、ウイルスゲノムを含む。単一タンパク質(すなわち、ポリタンパク質)のみをコード化するウイルスにおいて、ポリタンパク質の全部または一部は、コドン対バイアスを減少させるために、所望の程度まで変異することができ、変異配列の全部または一部は、組み換えウイルス構築物において提供することができる。複数のタンパク質を別々にコード化するウイルスに対して、タンパク質コード化配列の全てのコドン対バイアスを同時に減少させるか、またはタンパク質コード化配列の1つのみもしくは数個を改変のために選択することができる。コドン対バイアスの減少は、タンパク質コード化配列の長さにわたって決定され、少なくとも約0.05、または少なくとも約0.1、または少なくとも約0.15、または少なくとも約0.2、または少なくとも約0.3、または少なくとも約0.4である。ウイルスに依存して、絶対コドン対バイアスは、宿のコドン対使用に基づいて、約−0.05以下、または約-0.1以下、または約−0.15以下、または約−0.2以下、または約−0.3以下、または約−0.4以下であることができる。
コドン対バイアスを他の配列多様性に重ね合わせることができることは明らかである。例えば、コード配列は、1つ以上のアミノ酸変化を有するタンパク質またはポリペプチドをコード化するため、および改変コドン対バイアスを有するために変化させることができる。また、場合によっては、コドンバイアスが減少したタンパク質コード化配列において、親タンパク質コード化配列にあるものと全く同一のコドン使用プロファイルを維持するために、コドンをシャッフルすることができる。この方法は、コドン対バイアス変化の力を強調するがそれのみを用いる必要はない。あるいは、コドン選択は、コード配列におけるコドン使用の全体の変化をもたらすことができる。この関連で、本明細書に提供されるある実施例において(例えば、PV−Minの設計)、コドン対バイアスが最小化された配列を生成するプロセスにおいて、コドン使用プロファイルが変化しないとしても、その配列の一部が未変異配列にサブクローン化された場合(例えば、PV−MinXYまたはPV−MinZ)、サブクローン化した部分にわたる、かつ産生されるハイブリッドにおけるコドン使用プロファイルは、元の未変異タンパク質コード配列のプロファイルと一致しないことに留意されたい。しかしながら、コドン使用プロファイルのこれらの変化は、わずかなコドン対バイアスの効果しか有さない。
同様に、1つまたは 多くのアミノ酸置換でタンパク質またはポリペプチドをコード化するために、単独でヌクレオチド配列を変化させることも、それ自体、コドン対バイアスの有意な変化を有する配列を産生する可能性が非常に低いことに留意されたい。したがって、コドン対バイアス改変は、変異アミノ酸配列をコード化するためにさらに改変されたヌクレオチド配列中でさえ、認識することができる。それ自体でコドンバイアスを増加させるように意図される変異は、コドン対バイアスに対して小さい効果しか有しない可能性があることも注目すべきである。例えば、本明細書に開示されるように、非優先コドン(PV−AB)の使用を最大化するために再コード化される、ポリオウイルス変異体に対するコドン対バイアスは、約0.05のみ野生型(PV−1(M))から減少する。また、そのようなタンパク質コード化配列は、大きく減少した配列多様性を有することも注目すべきである。それとは反対に、かなりの配列多様性が、本発明のコドン対バイアスが改変された配列中で維持される。さらに、希少コドンの使用を増加させることなく得られるコドン対バイアスの大幅な減少は、PV−ABにあるような非優先コドンの使用の最大化の代わりに、コドン対バイアスをより効果的に減少させるために、十分な数の好ましいコドンで非優先コドンを再編成することが有益であることを示唆する。
全部または一部が変異可能かどうかにかかわらず、タンパク質コード化核酸の長さ、およびコドン対バイアスの所望の減少に応じて、変異の程度および強度は変化させることができる。本発明の一実施形態では、タンパク質コード化配列は、少なくとも約100ヌクレオチド、または少なくとも約200ヌクレオチド、または少なくとも約300ヌクレオチド、または少なくとも約500ヌクレオチド、または少なくとも約1000ヌクレオチドの長さにわたって改変される。
上記のように、「親」ウイルスまたは「親」タンパク質コード化配列という用語は、程度の差はあるが弱毒化され得る配列が由来する、ウイルスゲノムおよびタンパク質コード化配列を指すために本明細書に使用される。したがって、親ウイルスは、「野生型」もしくは「自然発生的」な原型、または単離株もしくは変異体、または実際の、もしくは認識された望ましい特性に基づいて、特に作製または選択される突然変異体であることができる。
デノボDNA合成を使用して、PV(M)のキャプシドコード領域(ヌクレオチド755〜ヌクレオチド3385のP1領域)を再設計し、野生型ウイルスのコドンバイアスを保存しながら、可能な限り多い数のほとんど使用されないコドン対(ウイルスPV−Min)(配列番号4)、または可能な限り多い数の頻繁に使用されるコドン対(ウイルスPV−Max)(配列番号5)を導入した。実施例7を参照されたい。すなわち、設計された配列は、親配列と同一のコドンを使用するが、それらは異なる順で現れる。PV−Maxウイルスは、野生型ウイルスと本質的に同一の一段増殖速度および感染細胞の殺滅を示した(増殖速度が、野生型と比較して、コドン対が最大化されたウイルスに対して増加していないことは、他のウイルスにも当てはまると思われる)。反対に、PV−Min変異体RNAが導入された細胞は殺滅されず、生存ウイルスを回収することができなかった。PV−Minのキャプシド領域のフラグメント(PV−Min755−2470、PV−Min2470−3386)のwt背景へのサブクローニングは、非常に衰弱しているが死滅していないウイルスを産生した。実施例7および図8を参照されたい。この結果は、有害なコドン変化が好ましくは広く分布するという仮説を立証し、全配列およびウイルス産物の弱毒化に対するコドン対バイアスを変化させるために、野生型親ウイルスゲノムへと置換されるコドン対脱最適化配列の程度を変化させることの単純性および有効性を証明する。PV−ABウイルスでわかるように、PV−Minウイルスの表現型は、子孫ウイルスの低い産生の結果よりも、ウイルス粒子の特異的感染の減少の結果である。
脱最適化されたコドン対バイアスを有するウイルスは、 弱毒化される。以下に例示されるように(実施例8および表5を参照)、CD155tgマウスは、野生型ウイルスに対して致死的な量よりも約1000倍高い量の弱毒化ウイルスの脳内接種による抗原投与で生存した。これらの所見は、ウイルスの致死性を最小化するための、コドン対バイアスの脱最適化の力を証明する。さらに、ウイルスの生存性は、コドン対バイアス脱最適化の程度を選択することによって、感染性の減少とのバランスを取ることができる。さらに、一度、所望の弱毒化特性を提供するコドン対バイアス脱最適化の程度または程度の範囲が決定されると、コドン対バイアスのその程度に達するために、追加の配列を設計することができる。例えば、配列番号6は、約−0.2のコドン対バイアス、およびPV−MinXYおよびPV−MinZの変異部分を包含する領域にわたって分布する変異(すなわち、PV755−3385)を有するポリオウイルス配列を提供する。
配列設計のためのアルゴリズム
本発明者らは、同時に所与のアミノ酸配列に対してコードしながら、特定の所望の特性に対してDNA配列を最適化する遺伝子設計のための、いくつかの新規アルゴリズムを開発した。特に、配列中の所望のRNA二次構造を最大化または最小化するためのアルゴリズム(Cohen and Skiena, 2003)、ならびに特定のパターンのセットを最大限に追加および/または除去するためのアルゴリズム(Skiena, 2001)が、開発された。前者の課題は、生存ウイルスの設計において生じ、後者は、技術的な理由から制限部位を最適に挿入するために有用である。代替リーディングフレームにおいて2個以上の遺伝子を同時にコード化する、重複遺伝子を設計することができる程度もまた、研究されてきた(Wang et al., 2006)。単一核酸の異なるリーディングフレームにおいてコード化されている、異なる機能性ポリペプチドのこの特性は、ウイルスによく見られ、抗生物質抵抗性遺伝子におけるウィービング等の技術的な目的で活用することができる。
合成生物学のための第1世代の設計ツールは、Jayaraj et al.(2005)およびRichardson et al.(2006)によって記載されるように構築されてきた。これらは、生物学的活性のための配列を最適化する代わりに、製造可能性のための設計を最適化することに主に重点を置いている(すなわち、局所的二次構造および末端反復のないオリゴヌクレオチド)。これらの第1世代のツールは、高次設計原理を裏付ける代わりに、設計規則検査を中心に構築された初期のVLSI CADツールの類似とみることもできる。
本明細書に例示されるように、いかなるコード領域のコドン対バイアスをも操作するために、コンピュータによるアルゴリズムを使用することができる。アルゴリズムは、既存コドンをシャッフルし、得られるCPBを評価し、次いで配列を再シャッフルし、任意に特に「有用」なコドン対を固定する能力を有する。アルゴリズムはまた、極小値から抜け出せなくならないように、多くの「シミュレーテッドアニーリング」を採用する。RNAの折り畳みの自由エネルギー等の他のパラメータは、望ましくない二次構造の生成を防止するために、任意にアルゴリズムの制御下置くことができる。アルゴリズムは、最小コドン対バイアスを有する配列を見つけるために使用することができ、そのような配列が生存ウイルスをもたらさない場合、アルゴリズムは、減少したが最小化されていないバイアスを有する配列を見つけるために、調整することができる。もちろん、生存ウイルス配列もまた、コンピュータで最小化された配列の部分列のみを使用して産生し得る。
コンピュータを用いて実行されるかどうかにかかわらず、例えば、勾配降下、もしくはシミュレーテッドアニーリング、または他の最小化ルーチンを使用する。開始配列中に存在するコドンを再編成する方法の実施例は、以下のステップによって表すことができる。
1)野生型ウイルスゲノム配列を得る。
2)弱毒化設計のための標的にタンパク質コード配列を選択する。
3)非コード機能を有する既知の、または推測されたDNA断片を固定する。
4)再設計されたタンパク質中の残存アミノ酸に対する、所望のコドン分布を選択する。
5)固定されていないコドン位置のランダムシャッフルを行い、コドンペアスコアを計算する。
6)任意にシミュレーテッドアニーリング方法を採用し、コドンペアスコアをさらに減少(または増加)させる。
7)過剰な二次構造および不要な制限部位に対して得られる設計を検査し、
はいの場合→ステップ(5)に進むか、または問題のある領域を野生型配列で置換することによって、設計を修正し、ステップ(8)に進む。
8.ウイルス設計に対応するDNA配列を合成する。
9.ウイルス構築物を作製し、発現を評価する。
弱毒化され過ぎている場合、サブクローン構築物を調製し、9に進む。
弱毒化が不十分である場合、2に進む。
1)野生型ウイルスゲノム配列を得る。
2)弱毒化設計のための標的にタンパク質コード配列を選択する。
3)非コード機能を有する既知の、または推測されたDNA断片を固定する。
4)再設計されたタンパク質中の残存アミノ酸に対する、所望のコドン分布を選択する。
5)固定されていないコドン位置のランダムシャッフルを行い、コドンペアスコアを計算する。
6)任意にシミュレーテッドアニーリング方法を採用し、コドンペアスコアをさらに減少(または増加)させる。
7)過剰な二次構造および不要な制限部位に対して得られる設計を検査し、
はいの場合→ステップ(5)に進むか、または問題のある領域を野生型配列で置換することによって、設計を修正し、ステップ(8)に進む。
8.ウイルス設計に対応するDNA配列を合成する。
9.ウイルス構築物を作製し、発現を評価する。
弱毒化され過ぎている場合、サブクローン構築物を調製し、9に進む。
弱毒化が不十分である場合、2に進む。
コンピュータによるシミュレーテッドアニーリングルーチンのソースコード(PERLスクリプト)が提供される。
あるいは、コドンがタンパク質コード化配列中の他の場所から交換されるという要件なしで、コドン対を選択することによって、アミノ酸の各対が脱最適化されることを可能にする方法を考案することができる。
ウイルス弱毒化の分子機構:ハイスループット方法を使用した弱毒化PVの特性化
上記のように、かつ実施例においてより詳細に記載されるように、野生型ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、改変コドンバイアスまたは改変コドン対バイアスを有する、2個の合成弱毒化ポリオウイルスを構築した。一方のウイルスは、脱最適化されたコドンを使用し、もう一方のウイルスは、脱最適化されたコドン対を使用する。各ウイルスは、wtウイルスに対して数百のヌクレオチド変化を有する。
本明細書に示されるデータは、これらのウイルスが不十分な翻訳によって弱毒化されることを示唆する。この所見は、正しければ、重要な因果関係を有する。最初に、各ウイルスの適応度/毒性の減少は、ゲノムにわたって広がる何百もの位置における小欠損が原因である。したがって、ウイルスが野生型に戻る可能性は本質的にないため、ウイルスは生または死菌ワクチンのいずれに対しても良好な開始点である。第2に、適応度/毒性の減少が、翻訳における何百もの小欠損の相加的効果が原因である場合、復帰のリスクを最小限に抑えて適応度を減少させるこの方法は、多くの他のウイルスに適用できるはずである。
本発明は、いずれの特定の操作方法または基本的な分子機構にも限定されないということが強調されているが、進行中の研究は、これらの対立仮説を区別することを目的としている。進行中の研究は、コドンおよびコドン対脱最適化されたポリオウイルス、ならびにインフルエンザウイルス等の種々の弱毒化ウイルス設計のゲノムを通してスキャンするための、および各変異ウイルスの重複300−bp部分をwt背景に置くことによって、キメラを構築するためのハイスループット方法の使用を含む。実施例11を参照されたい。これらのキメラウイルスの機能が次いで分析される。本明細書に開示される予備データによって示唆されるように、ほとんどのキメラが、野生型よりも大幅にではなくわずかに適応していないという所見は、多くの有害な変異が、キメラが覆う領域全体にわたって分布するという「機能の漸進的低下」仮説を裏付ける。反対に、1個またはほんの数個のキメラが親突然変異体と同様に弱毒化される一方で、キメラのほとんどがwtと同様または同一であるという所見は、変異が弱毒化を引き起こす配列中の位置は比較的少なく、それらの位置における弱毒化は有意であることを示唆する。
実施例12に記載されるように、コドンおよびコドンペア脱最適化が、RNA安定性および存在度にどのように影響を及ぼすかを決定するために、および再操作されたウイルスゲノムの翻訳を損なうパラメータを特定するために実験が行われる。この障害の分子基礎の理解は、幅広いウイルスへのSAVE方法の適用性をさらに高める。翻訳障害の基礎となる別の考えられる機構は翻訳フレームシフトであり、そこではリボソームが、異なるリーディングフレームを翻訳し始め、インフレーム終止コドンに遭遇するまで、偽性の典型的に切断されたポリペプチドを生成する。残基1513〜2470からのAB変異体断片を有するPVゲノムは、生存不可能なだけでなく、約42〜44kDaの生体外翻訳中に新規タンパク質バンドを産生する(図5Aを参照)。PVを不活性化するこのAB1513−2470フラグメントの能力、および新規タンパク質の産生を誘発するその能力は、フレームシフト事象の発生を反映し得、この可能性もまた研究されている。フレームシフト部位の導入を防ぐためのフィルタが、SAVE設計ソフトウェアに組み込まれている。
実施例12に記載されるように、ポリソームプロファイリング、先端プリント化、および融合タンパク質のルシフェラーゼアッセイを含むがこれらに限定されない、種々の技術を使用して、翻訳欠損のより詳細にわたる研究が行われる。
ポリオウイルスの分子生物学
SAVEによって、ウイルス弱毒化の基礎となる機構を解明するための研究が進行中であるが、PVキャプシドコード領域の大規模コドン脱最適化は、PV自体の生態に関する興味深い見解を明らかにした。何がウイルスのPFU/粒子の比(特異的感染)を決定するのかは、長年の疑問であった。概して、増殖感染の確立前の感染ライフサイクル中のいずれのステップにおける失敗も、不稔感染をもたらし、したがって、感染粒子の消滅をもたらす。PVの場合、培養細胞における1つの感染事象を引き起こすために、約100個のビリオンが必要とされることが示されている(Joklik and Darnell, 1961、Schwerdt and Fogh, 1957)。すなわち、接種された100個の粒子のうち、約1個のみが、受容体結合(ステップ1)、続いて、内在化および脱殻(ステップ2)、ゲノム翻訳の開始(ステップ3)、ポリタンパク質翻訳(ステップ4)、RNA複製(ステップ5)、ならびに子孫のキャプシド形成(ステップ6)のレベルで、全てのステップを成功裏に完了する可能性がある。
本明細書に記載されるAB型ウイルスの感染サイクルにおいて、ステップ1および2は、それらのキャプシドが同一であるため、PV(M)感染と同一であるはずである。同様に、同一の5’非翻訳領域は、翻訳複合体の集合において同様に十分に機能するはずである(ステップ3)。一方で、ウイルスポリタンパク質翻訳(ステップ4)は、キャプシド領域における多数の準最適同義コドンの導入によって大幅に弱められる(図5および6)。翻訳機構による希少コドンの遭遇の反復は、質量作用の法則によって、希少アミノアシルtRNAが、リボソーム上の部位Aに拡散するのにより長くかかるため、リボソームの失速を引き起こすと考えられる。ペプチド伸長が、大体において利用可能なアミノアシルtRNAの濃度によって促進されるため、mRNAの多くの希少tRNAへの依存は、必然的に翻訳時間を長くする(Gustafsson et al., 2004)。あるいは、リボソームの過剰失速は、RNAからの翻訳複合体の早期解離を引き起こし、分解の対象とされている、切断されたタンパク質をもたらす可能性がある。両方のプロセスは、単位時間当たりの、1mRNA分子当たりのタンパク質合成速度の低下をもたらす。本明細書に示されるデータは、コドン脱最適化ウイルスの表現型がゲノム翻訳の速度によって決定されることを示唆しているが、他の機構的説明も考えられる。例えば、A型肝炎ウイルス中のウイルスキャプシド配列全体にわたる希少同義コドンの保存位置は、必要な翻訳中止を導入することによる新生ポリペプチドの適切な折り畳みに対して、機能的に重要であることが示唆されている(Sanchez et al., 2003)。したがって、コドン組成の大規模改変は、これらの中止部位の一部を変化させる可能性があり、ミスフォールドしたキャプシドタンパク質の増加をもたらし得る。
これらの考察がPVキャプシドにも適用するかどうかは明らかではない。そうであるなら、wtコドンは保存されたが、キャプシド全体にわたるそれらの位置は、完全に変化している、変化した表現型がPV−SD設計で予測されたであろう。すなわち、中止部位と言われているうちの1つも、タンパク質配列に対して適切な位置にないであろう。しかしながら、表現型において何の変化も認められず、PV−SDは、野生型レベルにおいて翻訳および複製した(図3B)。
別の可能性は、試験された設計における大規模コドン変化が、安定した二次構造等の偶発的な優性阻害RNA要素、またはゲノムの他の領域との破壊的な長距離相互作用を受け得る配列を作製し得ることである。
ウイルス脱殻前、およびウイルス脱殻を含む全てのステップは、本明細書に記載されるwtおよび変異ウイルスが比較される際に変化していないはずであると考えられる。これは、全てのこれらの単離株の暗黒期が同様であるという観察結果によって裏付けられる(図3B)。したがって、PFU/粒子の比の劇的な減少は、脱最適化されたゲノムの翻訳能の減少の結果である可能性が高く、すなわち、変異ウイルスの障害は、細胞内で決定される。
概して、1/100〜1/1,000のピコルナウイルスの比較的低いPFU/粒子の比(Rueckert, 1985)は、細胞侵入レベル前あるいは細胞侵入レベルでの受容体結合ステップにおける構造変化によって主に決定されると考えられる。ほとんど感染性ではない135S粒子の形成は、ポリオウイルス感染性の非効率性の主な原因であり得る(Hogle, 2002)。しかしながら、あるウイルス突然変異体は、より高い特異的感染性をもたらすことなく、粒子変換を回避するように思われ、観察結果は、他の侵入後機構が低いPFU/粒子の比に関与している可能性があることを示唆する(Dove and Racaniello, 1997)。
本データは、ウイルスと細胞との間のそのような侵入後の相互作用の明確な証拠を示し、侵入前事象ではなく、これらが、ポリオウイルスの明確なPFU/粒子の比に寄与することを示唆する。ポリオウイルス中の全ての複製タンパク質が、ポリタンパク質上のP1の下流に位置するため、それらは、決定的に、P1翻訳がうまく完了することに依存する。したがって、P1翻訳の速度の低下は、全ての複製タンパク質の翻訳を同一の程度まで低下させる。次に、これは、宿主細胞翻訳の停止または宿主細胞の生得的反応等の、増殖感染の確立に必要とされる、宿主細胞への必要な改変を行う、ウイルスの能力の低下をもたらす可能性が高い。本明細書に記載されるようなコドン脱最適化が、ペプチド伸長ステップにおいて翻訳をもたらす可能性が高い一方で、翻訳の開始の減少はまた、ポリオウイルスのサビンワクチン株中の内部リボソーム侵入部位における変異に対して示されてきたように、強力な弱毒化の決定要因である可能性もある(Svitkin et al., 1993、1985)。
これらの考察に基づいて、ゲノム翻訳の欠損または早期ゲノム複製に起因する多くの突然変異表現型は、実際にはPFU/粒子の比を低下させることによって現れることが予測される。これは、欠損が不稔感染の可能性の増加をもたらす限りみられる。ほとんど全ての研究において、遍在プラークアッセイは、最適なウイルス検出方法であるため、明らかなウイルス力価の減少は、しばしば、ウイルス産生それ自体の減少と同等とみなされる。これは、単細胞レベルでウイルス特性を特性化する困難さによって正当化することができる、内在する危険であり得る。代わりに、ほとんどのアッセイは、数多くの細胞に対して行われる。選択された試験のより低い計測値(PFUで測定されるタンパク質合成、RNA複製、ウイルス産生)は、ウイルスを産生する細胞数が減少する一方で、細胞中のウイルス産生は正常であり得るということを考慮せず、1細胞当たりのより低い産生の指標として、そのままの値で取られる。
コドン脱最適化ウイルスによる1細胞当たりの粒子のほぼ同一の産生は、タンパク質産生の速度が大幅に低下した一方で、長期間の後に産生されるタンパク質の合計が大幅には影響されていないことを示す。これは、CPEの遅延出現にも反映され、同様の細胞内ウイルスのタンパク質濃度を増加させるために、ウイルスがさらなるRNA複製サイクルを経験しなければならないという表示であり得る。入ってくる感染ゲノムの初期翻訳速度が低下するため、コドン脱最適化ウイルスが、増殖感染の確立において大きな障害を有するように思われる。この翻訳速度の低下の結果として、細胞の抗ウイルス応答を不可能にする上で必須のPVタンパク質(プロテイナーゼ2Aproおよび3Cproである可能性がもっとも高い)は、十分速くライフサイクル中のこの重大な障害を克服するのに十分な量で、合成されない。したがって、ウイルス複製が展開し細胞を支配し得る前に、細胞が感染を除去する可能性が高い。したがって、増殖感染事象の可能性は減少し、不稔感染の速度は増加する。しかしながら、コドン脱最適化ウイルスが細胞を無能にすることに成功する場合、このウイルスは、野生型とほぼ同一の量の子孫を産生する。本データは、細胞自体の翻訳が大きく停止した場合、複製段階中の初期翻訳(新しいRNAゲノムから)と後期翻訳との間に、基本的な差があることを示唆する。これは一般的な現象であり得るが、コドン脱最適化ゲノムの場合には特に重要であり得る。宿主細胞の停止は、遊離アミノアシルtRNAの過剰存在をもたらす可能性が非常に高く、PVゲノムがもはや翻訳リソースをめぐって細胞RNAと競合する必要がないため、準最適コドン使用の与えられた効果を克服し得る。これは、実際に、本明細書に記載される改変された生体外翻訳系での観察結果(図5B)と類似する可能性がある。ヌクレアーゼ処理されず(したがって、細胞mRNAを含有)、外因性アミノ酸またはtRNAが添加されなかった翻訳抽出物を使用すると、異なるキャプシド設計の突然変異体翻訳能において明らかな差が認められた。これらの条件下で、ウイルスゲノムは、供給が限られている環境下において細胞mRNAと競合しなければならない。対照的に、内因性mRNAが除去され、過剰tRNAおよびアミノ酸が添加された、伝統的な翻訳抽出物において、すべてのPV RNAが、コドンバイアスに関係なく同様に十分に翻訳した(図5A)。これらの2つの異なる生体外条件は、PV感染細胞における初期および後期段階中の生体内翻訳に類似している可能性がある。
本研究の1つの重要な所見は、物理的相互作用およびウイルスの取り込みの間のステップに加えて、PFU/粒子の比もまた、宿主細胞の抗ウイルス応答を克服するウイルスの能力を大きく反映するという認識である。これは、ピコルナウイルスが、実際には、この競争に勝ち残るには非常に非効率的であり、細胞が効果的に応答することができる前に、迅速に複製することができる小ゲノムを進化させる選択を取ったようであることを示唆する。データが示すように、PV−AB2470−2954において翻訳速度をほんの30%低下させることによって(図6を参照)、より低い特異的感染性に反映されるように、不稔感染の速度は1,000倍高まる(図4D)。ピコルナウイルスは、明らかに、エラーカタストロフィの始めだけでなく(Crotty et al., 2001、Holland et al., 1990)、宿主細胞の抗ウイルス防御による除去の始めにも複製する。この効果は、ピコルナウイルスの病原性表現型に重大な影響を及ぼし得る。コドン脱最適化ウイルスによる中断された感染の速度増加に関与する細胞抗ウイルスプロセスは、現在のところ完全には解明されていない。PVは、アポトーシスの誘発および阻害の両方を行うことが示されている(Belov et al., 2003、Girard et al., 1999、Tolskaya et al., 1995)。同様に、PVは、NF−κBを切断することによって、インターフェロン経路を妨害する(Neznanov et al., 2005)。初期ゲノム翻訳の速度が減少したPVは、wtウイルスと同一の方法で抗ウイルス応答をなおも誘発するが(初期設定によるアポトーシスおよびインターフェロンの誘発)、次いで、低いタンパク質合成によって、これらのプロセスを阻害する可能性は低下することが考えられる。このシナリオは、細胞が新生感染を中断する可能性を増加させ得、観察された現象を説明し得る。個々の細胞レベルにおいて、PV感染は、全か無かの現象である可能性がある。ウイルスタンパク質およびRNA合成は、恐らく、増殖感染を確実にするために、最大範囲に近い範囲内である必要がある。
弱毒化ウイルスワクチン組成物
本発明は、本明細書に記載される弱毒化ウイルス、および任意の薬剤として許容される担体を含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。
本発明の弱毒化ウイルスは、対象における防御免疫応答を誘起するため、または対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するために使用される場合、薬剤として許容される担体を付加的に含む組成物の形で、対象に投与されることは理解されるべきである。薬剤として許容される担体は、当業者にはよく知られており、0.01〜0.1M、好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水(PBS)、または0.9%の生理食塩水のうちの1つ以上を含むがこれらに限定されない。そのような担体には、水溶液または非水溶液、 懸濁液、および乳液も含まれる。水性担体には、水、アルコール溶液/水溶液、乳液または懸濁液、生理食塩水、および緩衝媒体が含まれる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、ならびに固定油が含まれる。静脈内媒体には、リンガーデキストロースに基づくような液体および栄養補充液、電解質補充液等が含まれる。固体組成物は、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウム、および炭酸マグネシウム等の非毒性固体担体を含み得る。肺および/または鼻腔内送達用等のエアロゾルでの投与のために、薬剤または組成物は、例えば、C6〜C22脂肪酸のエステルもしくは部分エステルまたは天然グリセリド等の非毒性界面活性剤、および噴射剤で好ましくは処方される。鼻腔内送達を促進するために、レシチン等の追加担体を含めることができる。薬剤として許容される担体は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、ならびに例えば、抗菌剤、抗酸化剤、およびキレート剤等の他の添加剤等の、有効成分の有効期限および/または有効性を高める少量の補助物質をさらに含んでもよい。本組成物は、当技術分野でよく知られている通り、対象への投与後の有効成分の即時放出、持続放出、または遅延放出を提供するように処方することができる。
本ワクチン組成物の種々の実施形態では、弱毒化ウイルスは、(i)感染細胞におけるウイルスタンパク質の合成およびプロセシングを多く変化させず、(ii)wtウイルスと類似した感染細胞当たりの量のビリオンを産生し、および/または(iii)wtウイルスよりもかなり低いビリオン特異的感染性を呈する。さらなる実施形態では、弱毒化ウイルスは、宿主動物において、対応するwtウイルスと実質的に類似した免疫応答を誘発する。
本発明はまた、野生型宿主細胞において生存不能の弱毒化ウイルスを許容するように特に単離または操作される、改変宿主細胞株を提供する。弱毒化ウイルスは、正常(野生型)宿主細胞において増殖することができないため、増殖のための特異的なヘルパー細胞株に完全に依存している。これは、ワクチン産生のためのウイルス生成に対して、非常に高いレベルの安全性を提供する。本改変細胞株の種々の実施形態は、弱毒化ウイルスの増殖を可能にし、該細胞株のゲノムは、希少tRNAをコード化する遺伝子数を増加させるために変化している。
好ましい実施形態では、希少コドンは、CTA(coding for Leu)、TCG(Ser)、およびCCG(Pro)である。異なる実施形態では、これらの希少コドンのうちの1つ、2つ、または3つ全てが、ウイルスゲノム中の同義高頻度コドンの代わりとなる。例えば、ウイルス中の全てのLeuコドンは、CTAに変化してもよく、全てのSerコドンは、TCGに変化してもよく、全てのProコドンは、CCGに変化してもよく、LeuおよびSer、またはLeuおよびPro、またはSerおよびProコドンは、同定された希少コドンによって置換されてもよく、あるいは全てのLeu、Ser、およびProコドンは、単一のウイルス中でそれぞれCTA、TCG、およびCCGに変化してもよい。さらに、関連コドンの一部分、すなわち、100%未満は、希少コドンに変化してもよい。したがって、置換されるコドンの割合は、コドンの合計数の約20%、40%、60%、80%、または100%であってもよい。
ある実施形態では、これらの置換は、ウイルスのキャプシド領域内のみで行われ、翻訳の高速度が最も重要である。他の実施形態では、置換は、ウイルス全体にわたって行われる。さらなる実施形態では、細胞株は、希少コドンに結合するtRNAを過剰発現する。
本発明は、本明細書に記載される弱毒化ウイルスのいずれかを合成する方法をさらに提供し、該方法は、(a)ウイルスゲノムの少なくとも1つの非制御部分における複数の場所でコドンを同定するステップであって、コドンは、同義コドンによって置換されることができる、ステップと、(b)同定されたコドンの各々の代わりになる同義コドンを選択するステップと、(c)同定されたコドンの各々を同義コドンで置換するステップとを含む。
本方法のある実施形態では、ステップ(a)および(b)は、好ましい限度内で、脱最適化されたコドン分布および/または脱最適化されたコドンペア分布の特定のパターンセットを変化させることによって、ウイルスゲノムの設計を可能にする、合成弱毒化ウイルス工学(SAVE)のためのコンピュータによるアルゴリズムによって誘導される。本発明はまた、パターンセットが、脱最適化されたコドンおよび脱最適化されたコドン対の密度、RNA二次構造、CpGジヌクレオチド含有量、C+G含有量、重複コーディングフレーム、制限部位分布、フレームシフト部位、またはそれらの任意の組み合わせを代替的または付加的に含む、方法を提供する。
他の実施形態では、ステップ(c)は、同義コドンおよび/またはコドン対を含有するDNAのデノボ合成、ならびに合成されたDNAでのゲノムの対応する領域の置換によって達成される。さらなる実施形態では、全ゲノムは、合成されたDNAで置換される。さらなる実施形態では、ゲノムの一部は、合成されたDNAで置換される。さらに他の実施形態では、ゲノムの該一部は、キャプシドコード領域である。
加えて、本発明は、対象に、予防上または治療上有効な用量の本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、対象における防御免疫応答を誘起するための方法を提供する。本発明はまた、対象に、予防上有効な用量の本ワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、対象がウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための方法を提供する。上記の方法の実施形態では、対象は、病原性ウイルスに曝されている。病原性ウイルスに「曝されている」というのは、感染が生じ得るウイルスとの接触を意味する。
本発明は、対象に、治療上有効な用量の本ワクチン組成物のいずれかを投与するステップを含む、ウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための方法をさらに提供する。
ここで使用される「投与」は、種々の方法のいずれかを使用した送達、および当業者に既知の送達システムを意味する。投与は、例えば、腹腔内、脳内、静脈内、経口、経粘膜、皮下、経皮、皮内、筋肉内、局所、非経口、埋め込み、髄腔内、リンパ内、病巣内、心膜内、または硬膜外で行うことができる。薬剤または組成物はまた、肺および/または鼻腔内送達用等のエアロゾルで投与されてもよい。投与は、例えば、1回、複数回、および/または1回以上の長期間にわたって行われてもよい。
対象における防御免疫応答を誘起するステップは、例えば、対象に一次用量のワクチンを投与し、適切な期間の後、1回以上のワクチンの後続投与を続けることによって達成することができる。ワクチン投与間の適切な期間は、当業者によって容易に決定され得、通常、約数週間から数ヶ月である。しかしながら、本発明は、いかなる特定の投与方法、投与経路、または投与頻度にも限定されない。
「対象」は、いずれの動物または人為的に改変された動物を意味する。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ラット、およびモルモット等の齧歯動物、ならびに鳥類を含むがこれらに限定されない。人為的に改変された動物は、ヒト免疫系を有するSCIDマウス、およびヒトポリオウイルス受容体CD155を発現する、CD155tg遺伝子導入マウスを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。鳥類の好ましい例は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、およびガチョウを含むがこれらに限定されない、家畜化された家禽種である。
「予防上有効な用量」は、ウイルス感染しやすい、またはウイルス関連の疾患に罹患しやすい対象に投与されると、対象がウイルスに感染するか、または疾患に罹患するのを防ぐ免疫応答を、対象において誘発するワクチンの任意の量である。対象を「防ぐ」という意味は、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも10倍、対象がウイルスに感染する可能性を減少させること、あるいは、対象における疾病の発症の可能性を低下させることを意味する。例えば、対象がウイルスに感染する可能性を1%有する場合、対象がウイルスに感染する可能性の2倍の減少は、対象がウイルスに感染する可能性を0.5%有するという結果になる。最も好ましくは、「予防上有効な用量」は、対象がウイルスに感染するのを完全に予防するか、または対象における疾患の発症を完全に予防する免疫応答を、対象において誘発する。
ここで使用される「治療上有効な用量」は、ワクチンが有効な疾患に罹患した対象に投与されると、対象に疾患および/またはその症状の軽減、緩和、または退縮を経験させる免疫応答を、対象において誘発する。好ましい実施形態では、疾患および/またはその症状の再発が予防される。他の好ましい実施形態では、対象は、疾患および/またはその症状が治癒する。
本予防接種および治療方法のいずれかのある実施形態は、対象に、少なくとも1つのアジュバントを投与するステップをさらに含む。「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高め、対象における免疫応答を促進するのに好適ないかなる薬剤も意味するものとする。タンパク質ベースおよび核酸ベース両方のワクチンでの使用に好適な、微粒子アジュバントを含む多数のアジュバント、ならびにアジュバントを抗原と組み合わせる方法は、当業者にはよく知られている。核酸ベースのワクチンに好適なアジュバントは、Quil A、イミキモド、レシキモド、および精製タンパク質または核酸の形で送達されるインターロイキン−12を含むがこれらに限定されない。タンパク質免疫での使用に好適なアジュバントは、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント(FIA)、サポニン、Quil A、およびQS−21を含むがこれらに限定されない。
本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルスによる対象の予防接種のためのキットを提供する。キットは、弱毒化ウイルス、薬剤として許容される担体、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。さらなる実施形態では、弱毒化ウイルスは、1つ以上のポリオウイルス、1つ以上のライノウイルス、1つ以上のインフルエンザウイルス等であり得る。特定のウイルスの多くの異なる単離株に対して宿主に予防接種をすることが望ましい場合、2つ以上のウイルスが好ましい場合がある。本発明は、当業者に既知のキットの他の実施形態を含む。使用説明書は、弱毒化ウイルスの投与を指示する上で有用な、いかなる情報も提供することができる。
もちろん、本明細書に開示される発明の原理における変更が、当業者によって行われることができることは理解および予測されるものであり、そのような変更が、本発明の範囲内に含まれることを目的とする。以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を何ら制限するものと解釈されるべきではない。組み換えプラスミドの構築、ウイルス構築物での宿主細胞の導入、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、および免疫学的方法に採用されるような従来の方法の詳細な説明は、Sambrook et al.(1989)およびColigan et al.(1994)を含む多数の出版物から得ることができる。本明細書で言及される全ての参照は、参照することによって全体として本願に組み込まれる。
本願全体にわたって引用される種々の出版物の全詳細は、請求項の直前の本明細書の最後に示される。これらの出版物の開示は、参照することによって全体として本願に組み込まれる。しかしながら、本明細書での参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であるという確認として解釈されるべきではない。
実施例1
コドンバイアスを変化させることによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作
コドンバイアスを変化させることによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作
細胞、ウイルス、プラスミド、およびバクテリア
HeLa R19細胞単層を10%の仔ウシ血清(BCS)が添加されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中に、37℃で維持した。全てのPV感染性cDNA構築物は、PV1(M)cDNAクローンpT7PVMに基づく(Cao et al., 1993、van der Werf et al., 1986)。ジシストロニックレポータプラスミドをpHRPF−Lucを使用して構築した(Zhao and Wimmer, 2001)。プラスミド形質転換および増殖のために、大腸菌DH5αを使用した。ウイルスを1細胞当たり5PFUのHeLa R19細胞単層の感染によって増幅した。完全な細胞変性効果(CPE)が見えるようになるまで、または感染後少なくとも4日間、感染細胞をDMEM(2% BCS)中で、37℃でインキュベートした。3回の冷凍および解凍後、溶解物を低速度の遠心分離によって細胞残屑から清澄し、ウイルスをが乳する上清をさらなる継代または分析に使用した。
合成キャプシド置換およびジシストロニックレポーターレプリコンのクローニング
GeneMaker(登録商標)技術(Blue Heron Biotechnology)を使用して、SDおよびABと呼ばれる、ヌクレオチド495から3636の間のゲノムに及ぶ、2個のPVゲノムcDNAフラグメントを合成した。PflMI消化、および対応するPflMIフラグメントが除去されたpT7PVMベクターへのPflMI挿入によって、ベンダーのクローニングベクターから置換カセットを放出することによって、pPV−SDおよびpPV−ABを生成した。pPV−ABから同等に消化されたpT7PVMベクターに、BsmIフラグメントまたはNheI−EcoRIフラグメントをそれぞれ挿入することによって、pPV−AB755−1513およびpPV−AB2470−3386を得た。pPV−AB1513−3386およびpPV−AB755−2470において、pT7PVMのBsmIフラグメントまたはNheI−EcoRIフラグメントはそれぞれ、pPV−ABベクターの各々のフラグメントを置換する。pPV−AB1513−3386のNheI−EcoRIフラグメントのpT7PVMのフラグメントでの置換は、pPV−AB2470−3386をもたらす。最終的に、pPV−AB2470−3386およびpT7PVMのSnaBI−EcoRIフラグメントの互いとの置換は、pPV−AB2954−3386およびpPV−AB2470−2954をそれぞれ産生する。
最初に、オリゴヌクレオチドFluc−mutRI(+)/Fluc−mutRI(−)を使用した部位特異的変異誘発によって、pHRPF−Lucにサイレント変異を導入し、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレームにおけるEcoRI部位を変異させ、pdiLuc−mRIを生成することによって、ジシストロニックレポータ構築物のクローニングを行った。オリゴヌクレオチドRI−2A−P1wt(+)/P1wt−2A−RI(−)を使用して、pT7PVM、pPV−AB1513−2470、およびpPV−AB2470−2954のキャプシド領域をPCR増幅した。RI−2A−P1wt(+)/P1AB−2A−RI(−)、またはRI−2A−P1AB(+)/P1AB−2A−RI(−)をそれぞれ用いて、pPV−AB2470−3386およびpPV−AB2954−3386、またはpPV−ABのキャプシド配列を増幅した。PCR産物をEcoRIで消化し、pdiLuc−mRIにおける新しい特異的EcoRI部位に挿入し、pdiLuc−PV、pdiLuc−AB1513−2470、pdiLuc−AB2470−2954、pdiLuc−AB2470−3386、pdiLuc−AB2954−3386、およびpdiLuc−ABをそれぞれ得た。
オリゴヌクレオチド
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
Fluc−mutRI(+)、5′−GCACTGATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGG−3′(配列番号6)、Fluc−mutRI(−)、5′−CCAGTAGATCCAGAGGAGTTCATTATCAGTGC−3′(配列番号7)、RI−2A−P1wt(+)、5′−CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCTCAGGTTTCATCACAGAAAGTGGG−3′(配列番号8)、RI−2A−P1AB(+)、5′−CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCGCAAGTATCGTCGCAAAAAGTAGG−3(配列番号9)、P1wt−2A−RI(−)、5′−TTCGAATTCTCCATATGTGGTCAGATCCTTGGTGG−AGAGG−3′(配列番号10)、およびP1AB−2A−RI(−)、5′−TTCGAATTCTCCATACGTCGTTAAATCTTTCGTCGATAACG−3′(配列番号11)。
Fluc−mutRI(+)、5′−GCACTGATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGG−3′(配列番号6)、Fluc−mutRI(−)、5′−CCAGTAGATCCAGAGGAGTTCATTATCAGTGC−3′(配列番号7)、RI−2A−P1wt(+)、5′−CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCTCAGGTTTCATCACAGAAAGTGGG−3′(配列番号8)、RI−2A−P1AB(+)、5′−CAAGAATTCCTGACCACATACGGTGCGCAAGTATCGTCGCAAAAAGTAGG−3(配列番号9)、P1wt−2A−RI(−)、5′−TTCGAATTCTCCATATGTGGTCAGATCCTTGGTGG−AGAGG−3′(配列番号10)、およびP1AB−2A−RI(−)、5′−TTCGAATTCTCCATACGTCGTTAAATCTTTCGTCGATAACG−3′(配列番号11)。
生体外転写およびRNA導入
T7プロモータによって促進され、2 μgのEcoRI線状化プラスミドDNAをT7 RNAポリメラーゼ(Stratagene)によって、37℃で1時間転写した。DEAEデキストラン方法の改良形に従って、1マイクログラムのウイルスまたはジシストロニック転写RNAを使用し、35mm直径のプレート上に106個のHeLa R19細胞を導入した(van der Werf et al., 1986)。室温での30分間のインキュベーション後、上清を除去し、CPEが現れるまで、細胞を2% BCSを含有する2mlのDMEM中で、37℃でインキュベートするか、またはさらなる継代のために、細胞を導入後4日間冷凍した。最小イーグル培地中の0.6%のトラガカントゴム(Sigma−Aldrich)の半固形重層を使用して、HeLa R19細胞の標準的なプラークアッセイによって、ウイルス力価を決定した。
コドン脱最適化ポリオウイルスの設計および合成
ポリオウイルスP1キャプシド領域の2個の異なる同義コード化を生成し、各々を異なる設計要件によって制御した。全キャプシドコード配列は、得られるサブゲノムレプリコンの複製に影響を与えることなく、PVゲノムから削除するか、または外因性配列で置換することができるということが決定的に示されているため、設計をキャプシドに限定した(Johansen and Morrow, 2000、Kaplan and Racaniello, 1988)。したがって、未同定の決定的な調節RNA要素が、キャプシド領域に位置していないのは間違いなく、それらは不注意にRNA配列の調節の影響を受ける可能性がある。
第1の設計(PV−SD)は、野生型P1領域の正確なコドン使用分布を保存しながら、RNA塩基の変化数を最大化しようとした(図1)。これを達成するために、各位置−コドン対の重量は、元のコドンとそれを置換する同義候補コドンとの間の塩基の変化数である、位置とコドンとの間の最大加重2部マッチングを見つけることによって、各アミノ酸に対して同義コドン位置を交換した(Gabow, 1973)。マッチングアルゴリズムからのいかなる位置バイアスも防止するために、入力グラフを作成する前に、無作為に同義コドン位置の順序を変え、その後に位置を元に戻した。マッチングを算出するために、Rothbergの最大2部マッチングプログラム(Rothberg, 1985)を使用した。各6個のヌクレオチドの、合計11個の有用な制限酵素部位を、ウイルスゲノム配列中に固定し、コドン位置交換に関与しないようにした。コドンシャッフル技術は、得られる再構築された完全長ゲノム中で好ましくは特異的なままであるべきである、追加の制限部位を作製する可能性がある。したがって、望ましくない部位を除去するために、コドンを置換することによって、配列をさらに処理した。これは、コドン頻度分布をわずかに変化させた、さらに9個の同義コドン変化をもたらした。しかしながら、その頻度が、野生型配列に対して1を上回って変化したコドンはなかった。キャプシドコーディングドメインの同一のタンパク質配列を維持しながら、wtP1配列と比較してPV−SDキャプシド設計において変化したヌクレオチドは、2,643個のうち合計で934個であった(図1および2を参照)。コドン使用は変化しなかったため、PVM−SDキャプシドコード配列中のGC含有量は、49%でwtと同一のままであった。
第2の設計PV−ABは、wtP1領域にわたるコドン使用分布を大幅に変化させようとした。この設計は、コドンバイアスが組織特異的発現に影響を与える可能性があることを示唆する、近年の研究の影響を受けた(Plotkin et al., 2004)。所望のコドン使用分布は、前述の脳特異的遺伝子のセットにおいて認められた最も好ましくないコドンから得た(Hsiao et al., 2001、Plotkin et al., 2004)。この遺伝子セットにおいて認められるような、各特定のアミノ酸に対する最も希少な同義コドンの使用を最大化し、キャプシドコード領域を合成した(図1)。1個(Leu)を除く全てのアミノ酸に対して、脳内の最も希少なコドンが、一般に全てのヒト遺伝子の間の最も希少なコドンに対応するため、実際に、この設計は、他のヒト組織における発現も区別すると予測される。結局は、PV−ABキャプシドは、680個のヌクレオチド位置においてwtキャプシドとは異なる(図2を参照)。PVM−ABキャプシド領域におけるGC含有量は、wtにおける49%と比較して43%に減少した。
実施例2
ポリオウイルスの増殖および感染へのコドン脱最適化の効果
ポリオウイルスの増殖および感染へのコドン脱最適化の効果
感染病巣アッセイによるウイルス力価の決定
標準的なプラークアッセイに対して感染を行った。インキュベーションの48または72時間後、トラガカントゴム重層を除去し、ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、冷メタノール/アセトンで30分間固定した。ウェルを10% BCSを含有するPBS中にブロックし、続いて、1:20の希釈の抗3Dマウスモノクローナル抗体125.2.3で、37℃で1時間インキュベートした(Paul et al., 1998)。洗浄後、細胞を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)でインキュベートし、ベクターVIP基質キット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を使用し、感染細胞を視覚化した。wtウイルスで得たプラークと同等である染色された病巣数を数え、プラークアッセイ手順にあるように力価を計算した。
コドン脱最適化ポリオウイルスは、大きい増殖表現型を示す
2つの初期キャプシドORF置換設計(図3A)のうち、PV−SDのみが生存ウイルスを産生した。対照的に、PV−AB RNAでの4回の独立した導入からは、3回の継代後でさえ生存ウイルスは回収されなかった(図3E)。PV−ABゲノムに導入されたコドンバイアスは、あまりに大きかったと思われる。したがって、PV−ABキャプシドコード配列のより小さい部分をPV(M)背景にサブクローン化し、非優先コドンの有害な作用を減少させた。これらのサブクローンのうち、PV−AB2954−3386は、RNA導入の40時間後にCPEを産生したが、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954は、導入後に1代または2代の追加の継代をそれぞれ必要とした(野生型ウイルスの24時間と比較して)。興味深いことに、これらのキメラウイルスは、元のAB配列の最小部分での3個のサブクローンを表し、観察結果は、非優先コドン数とウイルス適応度との間の直接相関を示唆する。
RNA導入に続いて最大で2代継代後に得られたウイルス細胞溶解物で、感染多重度(MOI)2で、HeLa単分子層を感染させることによって、全ての生存ウイルス変異体の一段増殖速度を決定した(図3B)。PV−AB2470−2954の低力価の理由から、また接種材料を濃縮および精製するために必要とされる、さらなる継代の必要性を排除するために、MOIを選択した。使用された条件下で、全てのウイルスは、感染後24時間までに完全な、またはほぼ完全なCPEを産生した。
そのキャプシド領域における934個の単一点突然変異にもかかわらず、PV−SDは、wtの最大能力で複製し(図3B)、wtと同様のサイズのプラークを産生した(図3D)。PV−AB2954−3386がほぼ野生型の速度で増殖した一方で(図3B)、PV−AB755−1513は、微小プラークおよび約22倍感染性が低いウイルスを産生した(それぞれ、図2、3B、およびF)。非常に遅延してはいるが、高MOI感染においてCPEをもたらすことができるが(20〜24時間後に80〜90%のCPE)、PV−AB2470−2954は、標準的なプラークアッセイの条件下で、全くプラークを産生しなかった(図3H)。したがって、フォーカス形成アッセイを使用してこのウイルスを定量化し、プラークアッセイ条件下での72時間のインキュベーション後の感染細胞の病巣の数を、ウイルスポリメラーゼ3Dに対する抗体で免疫組織化学的に染色した後に数えた。感染の48時間後、PV−AB2470−2954感染病巣は通常、wtの3mmのプラーク(図3CおよびD)と比較して、0.2〜0.5mmの直径の病巣を有する、ほんの数十から数百個の細胞(図3J)を含んだ。しかしながら、さらに24時間後、病巣の直径は大幅に増加した(2〜3mm、図3G)。HeLa細胞が、MOI1でPV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954に感染した場合、CPEは、wtの8時間と比較して、12から18時間の間、および3から4日の間にそれぞれ現れた(データは図示せず)。
タンパク質コード配列中の特定のコドンバイアスの蓄積効果を定量化するために、ヒトゲノム中の全体的コドン分布に対する比較測定である、相対コドン脱最適化指数(RCDI)を計算した。1/コドンのRCDIは、遺伝子が正常なヒトコドン頻度に従うことを示し、一方、正常なヒトコドンバイアスからのいずれの偏差も、1より高いRCDIをもたらす。RCDIを以下の式を使用して得た。
したがって、配列中の高い希少コドン数は、より高い指数をもたらす。この式を使用して、種々のキャプシドコード配列のRCDI値は、PV(M)およびPV−SDに対して、1.14であると計算され、これは、正常なヒト分布に非常に近い。AB構築物のRCDI値は、PV−AB755−1513に対して1.73、PV−AB2470−2954に対して1.45、および親PV−ABに対して6.51である。比較のために、恐らくもっとも知られているコドン最適化タンパク質である、「ヒト化」緑色蛍光タンパク質(GFP)に対するRCDIは、元のオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子に対する1.68のRCDIと比較して、1.31であった(Zolotukhin et al., 1996)。これらの計算に従うと、2未満のRCDIを有するキャプシドコード配列が、生存ウイルス表現型と関連する一方で、2より高いRCDI(PV−AB=6.51、PV−AB1513−3386=4.04、PV−AB755−2470=3.61)は、致死表現型をもたらす。
実施例3
ポリオウイルスの特異的感染へのコドン脱最適化の効果
ポリオウイルスの特異的感染へのコドン脱最適化の効果
ウイルス粒子の分子定量化:直接OD260吸光方法
HeLa細胞(4 × 107個の細胞)の15cmのディッシュを、完全なCPEが発生するまで(一晩対4日間)、PV−AB755−1513またはPV−AB2470−2954にMOI0.5で感染させた。3回の連続的冷凍/解凍サイクルによって、細胞関連ウイルスを放出した。細胞溶解物を2,000×gでの10分間の遠心分離、続いて、14,000×gでの2回目の10分間の遠心分離によって取り除いた。上清を、10μg/mlのRNase A(Roche)の存在下で、室温で1時間インキュベートし、いかなる過剰なウイルスまたは細胞RNAも消化した。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および2mMのEDTAの添加後、ウイルス含有上清を6mlのスクロースクッション(ハンクス平衡塩溶液[HBSS]中30%のスクロース、Invitrogen, Carlsbad, CA)上に重層した。ウイルス粒子を、SW28スイングバケットロータを使用して、28,000rpmで4時間の超遠心分離によって堆積させた。上清を除去し、スクロースクッションをそのままの状態にしながら、遠心分離管をHBSSで2回すすいだ。最後の洗浄液およびスクロースクッションの除去後、ウイルスペレットを0.2% SDSおよび5mMのEDTAを含有するPBSに再懸濁した。ウイルス感染力価を、プラークアッセイ/感染病巣アッセイ(上記を参照)によって決定した。ウイルス粒子濃度を、260nm(OD260)の光学濃度のNanoDrop分光光度計(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE)を用いて決定し、式:1OD260単位=9.4×1012粒子/ml(Rueckert, 1985)を使用して計算した(Rueckert, 1985)。加えて、ビリオンRNAを、3回のフェノール抽出および1回のクロロホルム抽出によって抽出した。RNAをエタノール沈殿させ、超純水に再懸濁した。RNA純度をTAE緩衝アガロースゲル分析によって確認し、濃度を分光光度的に決定した。対応するウイルス調合物のゲノム等価物の合計数を、決定されたRNA濃度およびRNAの分子量によって計算した。したがって、1個のRNase保護ウイルスゲノム等価物が、1個のウイルス粒子に対応すると仮定すると、感染単位当たりのビリオンの相対量を計算することができる。
ウイルス粒子の分子定量化:ELISA方法
Nunc Maxisorb96ウェルプレートを、37℃で2時間、さらに4℃で145時間、100μlのPBS中の10μgのウサギ抗PV(M)抗体(Murdin and Wimmer, 1989)で被覆し、次いで、プレートを、350μlのPBSで3回簡単に洗浄し、PBS中の350μlの10%仔ウシ血清で、37℃で1時間ブロックした。PBSでの3回の簡単な洗浄に続いて、ウェルを、2% BCS含有DMEM中の100μlのウイルス含有細胞溶解物または対照で、室温で4時間インキュベートした。ウェルを350μlのPBSで3回、各5分間洗浄した。次いで、ウェルを、100μlのDMEM−10% BCS中の2μgのCD155−アルカリホスファターゼ(AP)融合タンパク質(He et al., 2000)で、室温で4時間インキュベートした。PBSでの5回の洗浄の最後の後、100μlの10mMトリス、pH7.5を添加し、プレートを65℃で1時間インキュベートした。100μlの9mg/mlパラニトロフェニルリン酸(2Mのジエタノールアミン、1mM MgCl2中、pH9.8)によって、比色アルカリホスファターゼ決定を行った。アルカリホスファターゼ活性を決定し、精製PV(M)ウイルスストックの既知の濃度の2倍連続希釈を使用して、同時に作製した標準曲線上で、405nmの波長で、酵素免疫測定法(ELISA)プレートリーダ(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で、ウイルス粒子濃度を計算した。
PFU/粒子の比は、コドン脱最適化ウイルスにおいて減少する
細胞培養中のPV−AB2470−2954の極めて不十分な増殖表現型、およびそれがプラークを形成できないことは、個々のウイルス粒子のより低い特異的感染性と一致し得る、細胞間伝播の欠損を示唆する。
この仮説を試験するために、PV(M)、PV−AB755−1513、およびPV−AB2470−2954ウイルスを精製し、ウイルス粒子の量を分光光度的に決定した。OD260を測定することによって、精製ウイルス調合物を直接定量化し、式:1OD260単位=9.4×1012粒子/mlに従って、粒子濃度を計算した(図4D)(Rueckert, 1985)。さらに、ゲノムRNAをそれらのビリオンから抽出し(図4A)、OD260で定量化した(データは図示せず)。次いで、ゲノムRNAに対して2.53×106g/molの分子サイズによって、ビリオン数(1ビリオン=1ゲノム)を決定した。具体的に、上記に記載されるように、完全なCPEが現れるまで、0.5MOIのウイルスに感染した4×107個のHeLa細胞からウイルスを調製した。両方の粒子決定の方法は、同様の結果をもたらした(図4D)。実際に、PV(M)およびPV−AB755−1513が、ほぼ同量のビリオンを産生した一方で、PV−AB2470−2954は、PV(M)(ゲノムRNA方法による[データは図示せず])と比較して、1/3(直接UV方法による(図4D))から1/8の間のビリオン数を産生したことがわかった。対照的に、wtウイルスサンプルは、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954よりも、約30倍および約3,000倍それぞれ多い感染単位に対応した(図4D)。加えて、精製ビリオンのキャプシドタンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分解し、銀染色によって視覚化した(図4B)。これらのデータはまた、1細胞当たりで、PV−AB2470−2954およびPV−AB755−1513が、1細胞当たり同様またはほんのわずかに減少した量の子孫を産生する一方で(図4B、レーン3)、それらのPFU/粒子の比は減少するという結論を裏付ける。ウイルスに対するPFU/粒子の比は、プラーク(プラークアッセイおよび特定のプラークアッセイ技術のための細胞の種類)、または粒子数(分光光度法もしくは電子顕微鏡法)のいずれかを決定するための方法に応じて、大幅に変化し得る。本明細書に記載される方法を使用して、PV1(M)に対して1/115のPFU/粒子の比が決定され、それは、1/272(Joklik and Darnell, 1961)(HeLa細胞で行った)および1/87(Schwerdt and Fogh, 1957)(初代サル腎細胞において)の以前の決定とよく一致する。
ビリオン特異的ELISAの開発
コドン脱最適化ポリオウイルスで認められた、PFU/粒子の比の減少を確認するために、生物学的変数である感染力価よりもむしろ、サンプル中の無傷のウイルス粒子の物理的な量を測定するための方法として、新規ビリオン特異的ELISAを開発した(図4CおよびE)。アッセイは、耐熱性胎盤アルカリホスファターゼ(CD155−AP)に融合したPV受容体CD155の細胞外ドメインが、無傷の160S粒子に非常にしっかりと、かつ特異的に結合するという以前の観察結果に基づいている(He et al.,. 2000)。PV 130S粒子(A粒子)が、CD155を効率的に結合するそれらの能力を失うことを考慮すると(Hogle, 2002)、他のキャプシド中間体またはキャプシドサブユニットでCD155−APと相互作用するものはないと予測され、したがって、無傷の粒子に対する特異性を確実にする。この考えの裏付けとして、P1キャプシド前駆体を発現するワクシニアウイルス株(Ansardi et al., 1993)に感染した細胞からの溶解物は、いかなる定量化可能なシグナルももたらさなかった(データは図示せず)。
ELISA方法は、感染後の細胞溶解物等の粗サンプル中のウイルス粒子の定量化を可能にし、サンプルの取り扱いおよび精製(熱/化学的不活性化、酸化、分解等)の間の他の機構によるPFU/粒子の比の考えられる変化を最小化するはずである。本条件下では、シグナル増幅ステップを伴わないため、このアッセイの感度は約107個のウイルス粒子である。これは、非常に低い背景をもたらした。このELISAを用いて、既知の濃度の精製PV(M)で作製された標準曲線上での逆算によって、サンプル中のPV粒子濃度を決定することができた(図4E)。ELISAによる粒子測定は、直接UV方法によって得られた結果とよく合致した(図4D)。
結果の意味
本研究は、弱毒化ウイルスの生成のためのデノボでの遺伝子合成による、PVキャプシドコード配列の大規模コドン脱最適化の有用性を示した。初期目標は、生弱毒化ウイルスワクチンを生成するためのツールとしての本技術の可能性を調査することであった。コドン脱最適化ウイルスは、非常に低い特異的感染性を有することがわかった(図4)。低い特異的感染性(単一ウイルス粒子が、細胞中の感染サイクルの開始に成功する可能性)は、宿主においてよりゆっくりと広がるウイルス感染をもたらす。これは、宿主生物が免疫応答を開始し、感染を除去するのにさらなる時間をかけることを可能にし、それは、弱毒化ウイルスワクチンにおいて最も望ましい特徴である。一方で、コドン脱最適化ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、1細胞当たり同様の量の子孫を生成した一方、感染性は2〜3桁少なかった(図4)。これは、wtと抗原的に区別できないウイルス粒子を、wtウイルス自体の産生と同じくらい効果的かつコスト効率よく産生することを可能にする。しかしながら、低い特異的感染性によって、そのようなウイルス調合物の実際の取り扱いおよびプロセシングは、はるかに安全である。高度な封じ込め条件下での十分な量の毒性ウイルスの産生、および偶然あるいは悪意による製造施設からのウイルス漏出の関連リスクに関する懸念が増加しているため、本明細書に記載されるウイルスは、不活化ウイルスワクチンの産生において、より安全な代替手段として非常に有用であることを証明し得る。それらは、タンパク質レベルにおいてwtウイルスと100%同一であるため、不活化ウイルスを受容した宿主における同一の免疫応答が保証される。
実施例4
ポリオウイルスの神経病原性へのコドン脱最適化の効果
ポリオウイルスの神経病原性へのコドン脱最適化の効果
マウス神経病原性試験
6から8週齢の間の4〜5匹のCD155tgマウス(系統Tg21)(Koike et al., 1991)の群に、30μlのPBS中の102から106PFU/フォーカス形成単位(FFU)の間のウイルス希釈液を脳内注射した。Reed and Muench(1938)の方法によって、半数致死量(LD50)の値を計算した。プラークまたは感染病巣アッセイによって、死亡時または麻痺時の脊髄組織におけるウイルス力価を決定した。
コドン脱最適化ポリオウイルスは、CD155tgマウスにおいて粒子単位で神経弱毒化される
本研究において構築されるウイルスの病原可能性を試験するために、CD155遺伝子導入マウス(Koike et al., 1991)に、102から105PFU/FFUの間の用量で、PV(M)、PV−SD、PV−AB755−1513、およびPV−AB2470−2954を脳内注射した。非常に直観に反して、PV−AB755−1513および特にPV−AB2470−2954は、wtウイルスと同じくらいの神経病原性を有するか、またはwtウイルスよりもわずかに高い神経病原性さえ有することがわかったため、初期結果は困惑させるものであった。表4を参照されたい。
加えて、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954の感染後の麻痺の発症時は、wtウイルスの発症時と同程度であった(データは図示せず)。同様に困惑させたのは、死亡時または麻痺時に、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954に感染したマウスの脊髄における、プラークアッセイによって決定されるウイルス負荷が、wtウイルスに感染したマウスのウイルス負荷よりも、30倍および300倍それぞれ低かったという観察結果である(表4)。したがって、明らかにwtウイルスのほんの0.3%で複製するPV−AB2470−2954が、wtと同一の神経病原可能性を有する可能性は低いように思われる。しかしながら、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954における変化したPFU/粒子関係を構築した後に(実施例3を参照)、接種材料の量は、接種された実際の粒子数と関連付けることができるようになる。この修正を行った後に、粒子単位で、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954は、wtと比較して20倍および100倍それぞれ神経弱毒化されることが確定された。表4を参照されたい。さらに、粒子単位で、麻痺したマウスの脊髄におけるウイルス負荷は、3個すべてのウイルスで非常に類似していた(表4)。
中枢神経系における発現を特に区別し得る、同義コドンでのPVキャプシド遺伝子の再設計が可能ではなかったこともまた、結論づけられた。これは、他によって記載されるコドンバイアスの組織特異的差異(Plotkin et al., 2004)が、組織限定的ウイルス表現型をもたらすにはあまりに小さすぎることが原因である可能性がある。脳特異的遺伝子のPlotkin et al.が使用したものよりも大きなセットにおいて、感知できるほどの組織特異的コドンバイアスは、全く検出されなかった(データは図示せず)。しかしながら、この結論は、本発明の方法によって産生されるポリオウイルスが、実際に、マウスにおいて最大で100倍神経弱毒化されるという事実から反れるものではない。すなわち、中枢神経系においてwtウイルスと同一の損傷をもたらすために、100倍以上のコドンまたはコドンペア脱最適化ウイルス粒子が必要とされる。
実施例5
ポリオウイルスのゲノム翻訳へのコドン脱最適化の効果
ポリオウイルスのゲノム翻訳へのコドン脱最適化の効果
生体外および生体内翻訳
本研究において、2個の異なるHeLa細胞S10の細胞質抽出物を使用した。標準抽出物をMolla et al.(1991)の方法によって調製した。[35S]メチオニン標識翻訳生成物を、ゲルオートラジオグラフィによって分析した。第2の抽出物を、それを透析せず、内因性細胞mRNAを小球菌ヌクレアーゼで除去しなかったことを除いて、すでに記載ている方法で調製した(Kaplan and Racaniello, 1988)。改変された抽出物との反応に、外因性アミノ酸またはtRNAを添加しなかった。抗2Cモノクローナル抗体91.23(Pfister and Wimmer, 1999)を用いて、ウエスタンブロット法によって、翻訳生成物を分析した。NIH−Image 1.62ソフトウェアを使用して、スキャンされたゲル画像の画素数によって、2BCバンドの相対強度を決定した。全ての場合において、翻訳反応を、200ngの種々の生体外転写されたウイルスゲノムRNAでプログラムした。
生体内翻訳の分析のために、HeLa細胞に、上記の生体外転写されたジシストロニックレプリコンを導入した。RNA複製から分離された翻訳を評価するために、2mMの塩酸グアニジンの存在下で導入を行った。細胞を受動的溶解緩衝液(Promega, Madison, WI)に7時間溶解させ、続いて、デュアルホタル(F−Luc)およびウミシイタケ(R−Luc)ルシフェラーゼアッセイ(Promega)を行った。C型肝炎ウイルス(HCV)内部リボソーム進入部位(IRES)の制御下で発現した、第1のシストロンのウミシイタケルシフェラーゼ活性による分裂によって、第2のシストロン(P1−Fluc−P2−P3ポリタンパク質)の翻訳効率を正規化した。
コドン脱最適化ウイルスは、ゲノム翻訳レベルにおいて不完全である
合成ウイルスおよびwtPV(M)は、それらのタンパク質構成において区別ができず、何の既知のRNA調節要素も、改変されたRNAゲノムにおいて変化しなかったため、これらの設計は、細胞および組織指向性またはウイルスの免疫学的特性に影響を及ぼすことのない、弱毒化へのゲノム翻訳/複製の減少の効果の研究を可能にした。キャプシドコード配列への多くの準最適コドンの導入が、ゲノム翻訳の減少をもたらすはずであるという仮説の下に、PV−ABゲノムを設計した。P1領域は、ポリタンパク質のN末端にあるため、全ての下流にある非構造タンパク質の合成は、P1領域にわたる翻訳の速度によって決定される。実際に翻訳が影響を受けているかどうかを試験するために、生体外翻訳を行った(図5)。
意外なことに、標準HeLa細胞の細胞質S10抽出物(Molla et al., 1991)における初期翻訳は、試験されたゲノムのいずれに対しても翻訳能の差を示さなかった(図5A)。しかしながら、この翻訳系は、最大翻訳のための最適化されるため、それは、過剰アミノ酸およびtRNAの外部からの添加を含んでおり、それが遺伝子操作されたコドンバイアスを補い得ることも考えられる。したがって、透析せず、細胞mRNAを小球菌ヌクレアーゼ処理によって除去しなかった、改変されたHeLa細胞抽出物で、生体外翻訳を繰り返した(図5B)。この抽出物における翻訳を、外因性tRNAまたはアミノ酸を添加することなく行った。このように、感染細胞における環境により酷似している環境を作製したが、ここでは、PVゲノムの翻訳は、細胞mRNAとリソースを競合しながら、細胞供給のみに依存する。細胞mRNAからの高い背景翻訳および非透析抽出物における低い[35S]取り込み速度の理由から、ウイルス特異的翻訳生成物のセットを、抗2C抗体(Pfister and Wimmer, 1999)を用いて、ウエスタンブロット法によって検出した。これらの変更された条件は、脱最適化された配列の程度と相関した、改変されたゲノムの翻訳効率の劇的な減少をもたらした。PV−SDの翻訳が、wtの翻訳と同程度であった一方で、3個の非感染ゲノム、PV−AB、PV−AB1513−3386、およびPV−AB755−2470の翻訳は、約90%減少した(図5B)。
Burns et al.(2006)は、本明細書に記載される実験に関連した実験を近年報告した。これらの著者らは、本研究におけるよりも、はるかに限られた程度にコドン使用を改変し、それらの変異ウイルスのどれも、致死表現型を発現しなかった。興味深いことに、Burns et al.は、翻訳がそれらの変異ウイルスの表現型の変化において主要な役割を果たさなかったと断定し、結論は、本明細書に示されるデータと異なっている。非感染HeLa細胞抽出物および過剰アミノ酸を添加した、ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球溶血液を採用した、Burns et al.(2006)が使用した生体外翻訳アッセイは、翻訳のいかなる有意な減少も検出できなかったことを説明していると思われる。図5Aを参照されたい。
生体外翻訳系の最終的な人工的性質を考慮して、細胞における翻訳への種々のキャプシド設計の効果もまた研究した。この目的で、すでに報告されたジシストロニックレプリコン(Zhao and Wimmer, 2001)に基づいて、ジシストロニックポリオウイルスレポーターレプリコンを構築した(図6A)。種々のP1カセットを、ホタルルシフェラーゼ(F−Luc)遺伝子のすぐ下流およびインフレームに挿入した。したがって、ポリオウイルスIRESは、キャプシドと2Aproプロテイナーゼとの間のホタルルシフェラーゼタンパク質を除いて、ウイルスゲノムにおけるものと同様の単一ウイルスポリタンパク質の発現を促進する。HCV IRESの制御下のウミシイタケルシフェラーゼ(R−Luc)遺伝子の発現は、内部対照を提供する。ゲノム複製を完璧にブロックする、2 mMの塩酸グアニジンの存在下で、全ての実験を行った(Wimmer et al., 1993)。この種類の構築物の使用は、F−Luc/R−Lucの比を計算することによって、第2のシストロンの相対的発現の正確な決定を可能にした。F−Luc発現は、上流P1領域を通したリボソーム輸送の成功に依存するため、それは、ポリタンパク質翻訳速度への挿入されたP1配列の効果の指標を提供する。この方法を使用して、ウイルス背景における致死表現型(例えば、PV−AB、PV−AB1513−2470、およびPV−AB2470−3386)と関連した、改変されたキャプシドコード領域が、翻訳速度を約80〜90%減少させたことが実際にわかった(図6B)。2個の生存ウイルス構築物、PV−AB2470−2954およびPV−AB2954−3386からのキャプシドは、wtレベルの68%および83%での翻訳をそれぞれ可能にした。第1のシストロンの生体内翻訳速度は、3から12時間の間の期間にわたって、全ての構築物において一定のままであり、RNA安定性がコドン変化の影響を受けていないことを示唆する(データは図示せず)。結論として、これらの実験の結果は、PV−AB2470−2954に見られるように、30%のP1領域にわたる比較的小さい翻訳効率の低下が、大きいウイルス複製表現型をもたらしたことから、ポリオウイルスが、非常に効率的な翻訳に依存することを示唆する。
実施例6
コドン脱最適化ポリオウイルスの遺伝的安定性
コドン脱最適化ポリオウイルスの遺伝的安定性
表現型に寄与する大きなゲノム断片にわたって分布した多くの変異の効果の理由から、コドン脱最適化ウイルスは、遺伝的に安定した表現型を有するはずである。コドン脱最適化ウイルスの遺伝的安定性を研究するために、かつこれらのウイルスが遺伝的に安定しているという前提を試験するために、ウイルスは適切な宿主細胞において継代される。ワクチン設計の現在の「千の傷による死(death by 1000 cuts)」理論の利点は、野生型への復帰のリスクの低下である。典型的なワクチン株は、wtウイルスとはほんの数個の点突然変異によって異なり、これらの小サブセットのみが、実際に弱毒化に寄与し得る。ウイルス進化は、そのような少数の活性変異を戻す働きをする。実際に、そのような復帰は、世界からポリオウイルスを根絶するというWorld Health Organization(WHO)のプロジェクトに深刻な脅威を与える。生ワクチン株が使用される限り、この株がwtに戻る可能性は非常に高い。そのような復帰は、新ポリオの発生源としてすでに認められている(Georgescu et al., 1997、Kew et al., 2002、Shimizu et al., 2004)。
本合成設計における何百から何千もの点突然変異によって、wt株への復帰のリスクはほとんどない。しかしながら、自然選択は強力であり、継代によって、合成ウイルスは必然的に進化する。この進化の終点を決定するための研究が進行中であるが、起こりそうな結果は、それらが、元の設計からそれほど遠くない局所的最適に捕らわれてしまうことである。
この理論を実証するために、代表的な再操作されたウイルスは、宿主細胞において最大で50代継代される。進化したウイルスのゲノムは、10、20、および50代継代後に配列される。より具体的に、脱最適化されたウイルスの各種類から少なくとも1つのキメラの例が選択される。開始キメラは、非常に衰弱しているが死滅していない。例えば、PVに対して、キメラは、PV−AB2470−2954およびPV−Min755−2470であり得る。各開始ウイルスから、10個のプラークが選択される。10個のプラークに由来するウイルス集団の各々は、合計で50代大量継代される。10代、20代、および50代継代後、10個のプラークの精製ウイルスが再び選択され、それらのゲノムは、10個の親ウイルスのゲノムと合わせて配列される。継代後、プラークサイズを検査し、一段増殖速度として、プラーク形成単位/mlを決定することによって、40(1親ウイルス当たり30+10)個の選択されたウイルスの適応度は、それらの親の適応度と比較される。選択継代単離株は、適切な宿主細胞においてそれらの病原性に関して試験される。たとえば、ポリオウイルスの病原性は、CD155tgマウスにおいて試験される。
ゲノムの配列決定の際、10個全てのウイルス株が共通のある変異を有するという所見は、これらの変化が、ウイルス適応度に対して特に重要であることを示唆し得る。これらの変化は、主要な中止部位として、先端プリント化によって同定される部位と比較されてもよく(実施例9を参照)、両方の種類のアッセイの組み合わせは、ウイルス適応度に最も有害な変異コドンを同定し得る。反対に、異なる株が全ての異なる変異を有するという所見は、変異コドン変化の多くが、適応度へのそれらの効果において非常に類似していることを示唆し得る。これまで、HeLa細胞における10代継代後、PV−AB755−1513およびPV−AB2470−2954は、適応度のいかなる感知できる増加も経験していない。ウイルス感染力価は、継代実験の開始と同様に低いままであり(107PFU/mlおよび106FFU/ml)、プラーク表現型は変化しなかった(データは図示せず)。継代中に遺伝子変化が発生するのか、およびどの種類の遺伝子変化が発生するのかを決定するために、これらの継代されたウイルスの配列分析が現在進行中である。
Burns et al.(2006)は、彼らの変化したコドン組成物が、HeLa細胞において25連続継代中、大部分保存されたことを報告した。彼らは、改変されていないサビン2ウイルスおよびコドン置換ウイルスの両方のHeLa細胞における、複製への適応度が、より高い継代数で増加した一方で、改変ウイルスの相対的適応度は、改変されていないウイルスの適応度よりも低いままであったことを発見した。したがって、あらゆる点から考えると、SAVEによって再設計されるウイルスは、遺伝的に非常に安定している。本発明のコドンおよびコドンペア脱最適化ウイルスに関する予備データは、多数のコドンにわたって分布するそれほど大きくないコドン変化は、個々のウイルス 表現型の遺伝的安定性を高め、したがって、それらのワクチンでの使用の可能性を高めることを示唆する。
実施例7
コドン対を脱最適化することによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作
コドン対を脱最適化することによるポリオウイルスのキャプシド領域の再操作
コドン対バイアスの計算
考えられる3721個の非「ストップ」含有コドン対(例えば、GTT−GCT)のそれぞれのコドン対は、遺伝子の所与の「トレーニングセット」に特異的な、割り当てられた「コドン対スコア」または「CPS」を有する。所与のコドン対のCPSは、この遺伝子セットにおいて(この実施例においては、ヒトゲノム)予測された数に対する、実測発生数の対数比として定義される。特定のコドン対の実際の発生数(または言い換えれば、特定のアミノ酸対が特定のコドン対によってコード化される可能性)の決定は、単にコード配列の特定のセットにおけるコドン対の実際の発生数を数えるということである。しかしながら、予測数の決定は、さらなる計算を必要とする。予測数は、Gutman and Hatfieldと同様に、アミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方とは無関係になるように計算される。すなわち、予測頻度は、アミノ酸が特異的コドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。正のCPS値は、所与のコドン対が統計的に過剰に存在することを示し、負のCPSは、対がヒトゲノムにおいて統計的に過少に存在することを示す。
ヒトに関してこれらの計算を行うために、合計で14,795個の遺伝子を含有する、常に注釈付きのヒトコード領域の最新のConsensus CDS(CCDS)データベースを使用した。このデータセットは、コドンおよびコドン対、したがって、ゲノムスケールでのアミノ酸およびアミノ酸対頻度を提供する。
Gutman and Hatfield(1989)の方法をさらに強化するために、Federov et al.(2002)のパラダイムを使用した。これは、コドン頻度と無関係の所与のコドン対の予測頻度、および特定のアミノ酸対をコード化する隣接コドンの非ランダム関連性の計算を可能にする。
上記の式を使用して、次いで、個々のコード配列中の個々のコドン対が、全ヒトCCDSデータセットを使用して計算した対応するゲノム
と比較して、過剰または過少に存在しているかどうかを決定した。この計算は、ヒトコード領域における過剰に存在するコドン対に対して正の
を、過少に存在するコドン対に対して負の値をもたらした(図7)。
以下の式に従って、全てのコドン対スコアを平均化することによって、個々のコード配列の「総合」コドン対バイアスを計算した。
したがって、全コード領域のコドン対バイアスは、領域を含む個々のコドン対スコアの全てを合計し、この合計をコード配列の長さで割ることによって計算される。
コドン対バイアスの変化
PV(M)のキャプシドコード領域を再操作し、コドン対バイアスを変化させた。コドンバイアスおよびwtウイルスゲノムの全ての他の特徴を保存しながら、可能な限り多い数のほとんど使用されないコドン対(ウイルスPV−Minを作製)、または可能な限り多い数の広く使用されるコドン対(ウイルスPV−Maxを作製)を導入した。我々の方法を以下により詳細に説明する。
2つの配列を設計し、正(PV−Max、配列番号4)および負(PV−Min、配列番号5)の方向に、ポリオウイルスP1領域コドン対スコアを変化させた。アミノ酸配列を変化させないまま残し、コドンバイアスを最小限に改変させることによって、P1キャプシド領域に対する最少または最大コドン対スコアの最適化を目的に、コドンをシャッフルするために、シミュレーテッドアニーリングアルゴリズムを使用た。スプライス部位の除去および局所的二次構造の減少のために、得られる配列を処理した。次いで、商業ベンダー、Blue Heron Biotechnologyによってこれらの配列を合成し、配列検証した。新キャプシド遺伝子を使用し、2つのPflMI制限部位を介して、wtPVの感染性cDNAクローンにおいて同等のwt配列を置換した。実施例1に記載されるように、ウイルスを得た。
PV−Maxウイルスに対して、24時間後に感染細胞の死が見られ、wtウイルスで得られた結果と同様の結果であった。PV−Maxの最大ウイルス力価および一段増殖速度も、wtと同一であった。対照的に、PV−Min変異体RNAを導入した細胞をもたらした細胞死はなく、生存ウイルスは全く回収できなかった。導入を複数回繰り返したが、結果は同じであった。PV−Minを導入した細胞の溶解物を4代連続盲目継代させたが、それでもなおウイルスは全く得られなかった。
PV−Minのキャプシド領域を、PV−AB(少ないコドンバイアス)に対して行ったように、2つのより小さいサブフラグメント(PV−Min755−2470およびPV−Min2470−3386)に分割し、サブフラグメントをwt背景にクローン化した。PV−ABサブクローンと同様に、PV−Minのサブクローンは非常に健康ではなかったが、死滅していなかった(図8)。PV−ABウイルスで認められたように、PV−Minウイルスの表現型は、子孫ウイルスの産生の低下よりもむしろ、ウイルス粒子の特異的感染の減少の結果である。進行中の研究は、CD155tgマウスにおけるコドン対弱毒化キメラを、それらの病原性を決定するために試験するステップを伴う。また、PV−Min cDNAのサブクローンを含むさらなるキメラウイルスも製造されており、それらの複製する能力が測定されている(以下の実施例8および9を参照)。また、より長い配列にわたって中程度の量のコドン対バイアスを分布させる効果が確認されている。例えば、ポリオウイルス誘導体は、約−0.2のコドン対バイアス(PV−0.2、配列番号6)を有するように設計され、野生型からの変異は、P1キャプシド領域の全長にわたって分布している。これは、同様のコドン対バイアスを有するが、より短い配列にわたって分布するコドン変化を有する、PV−MinZ(PV−Min2470−3386)と対照的である。
V−MinおよびPV−0.2が、野生型に対してコドン使用の変化がほとんどない配列であるということは、指摘しておく価値がある。大部分、配列は、野生型PV(M)ウイルスに現れるコドンと同一のコドンを採用する。PV−MinZは、それがPV(M)にサブクローン化されたPV−Minの一部を含有するという点で、幾分異なる。PV−MinおよびPV−0.2と同様に、コード化されたタンパク質配列は変化しないが、サブクローン化された領域あるいは全P1キャプシド領域のいずれかにおいて決定されたコドン使用は、コドン再編成配列の一部のみ(より小さい断片においてではなく、その全長にわたって同一コドンを有する)が、PV(M)野生型配列に置換されているため、PV−Min(or PV−0.2)と同一ではない。もちろん、変異キャプシド配列は、ヌクレオチド2470−3386からの領域においてのみコドンをシャッフルする一方で、全P1遺伝子にわたってコドン対バイアスを有するように設計され得る。
実施例8
コドン対バイアスの変化によって構築されるウイルスは、CD155tgマウスにおいて弱毒化される
コドン対バイアスの変化によって構築されるウイルスは、CD155tgマウスにおいて弱毒化される
マウス脳内接種、生存
動物モデルにおいてPV−Min755−2470およびPV−Min2470−3385の弱毒化を試験するために、これらのウイルスを精製し、CD155(PVR/ポリオウイルス受容体)遺伝子導入マウスに脳内接種した(表5を参照)。実際に、これらのウイルスは、我々のアルゴリズムを使用したコドン対バイアスのカスタマイズによって、大幅に弱毒化した表現型を示した。PVM−wtが原因で、10e5ビリオンで抗原投与された全てのマウスが死亡したため、PVM−wtはより高い用量で接種しなかった。この 弱毒化表現型は、我々のアルゴリズムを使用したコドン対バイアスのカスタマイズが原因である。これは、コドン対バイアスのカスタマイズが、生ワクチンを作製するための手段に適用できることを再確認する。
これらの所見は、2つの点で重要である。第1に、それらは、コドン対バイアスが機能的に重要である、すなわち、有害な表現型は、コドン対バイアスを分布させることによって生成することができるという最初の明確な実験的証拠である。第2に、それらは、ウイルスを弱毒化するために使用することができる、同義コドン変化のさらなる側面をもたらす。これらのコドンペア弱毒化キメラの生体内病原性は、CD155tgにおいて試験されており、弱毒化表現型を示している(表5を参照)。PV−MinキャプシドcDNAのサブクローンを含むさらなるキメラウイルスが、感染細胞における複製に関して分析されており、同様に弱毒化表現型を示している。
実施例9
改変コドン対バイアスを有する合成ポリオウイルスの構築:ワクチン開発に対する意味
改変コドン対バイアスを有する合成ポリオウイルスの構築:ワクチン開発に対する意味
コドン対脱最適化配列を産生するためのコドン対バイアスの計算、アルゴリズムの実行
我々は、コドン対バイアスを定量化するためのアルゴリズムを開発した。可能な全ての個々のコドン対に、「コドン対スコア」または「CPS」を与えた。我々は、CPSを、全てのヒトコード領域にわたる各コドン対の予測発生数に対する、実測発生数の自然対数比と定義する。
特定のコドン対の測定された発生の計算は単純(遺伝子セットにおける実際の数)であるが、コドン対の予測発生数は、さらなる計算を必要とする。我々は、Gutman and Hatfieldと同様に、この予測数がアミノ酸頻度およびコドンバイアスの両方と無関係になるように計算する。すなわち、予測頻度は、アミノ酸が特異的コドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。正のCPS値は、所与のコドン対が統計的に過剰に存在することを示し、負のCPSは、対がヒトゲノムにおいて統計的に過少に存在することを示す。
これらの計算されたCPSを使用すると、次いで、いかなるコード領域も、コドン対スコアの平均を取ることによって、過剰に存在する、または過少に存在するコドン対を使用するとみなすことができ、したがって、全遺伝子に対するコドン対バイアス(CPB)を得ることができる。
示され図示される(図7)方程式を使用して、CPBを全ての注釈付きヒト遺伝子に対して計算した。グラフ中の各点は、単一ヒト遺伝子のCPBに対応する。分布のピークは、0.07の正のコドン対バイアスを有し、全ての注釈付きヒト遺伝子に対する平均スコアである。また、負のコドン対バイアスを有する遺伝子は非常に少ない。次いで、このバイアスを操作するために、CPBを定義および計算するために確立された方程式を使用した。
コドン対脱最適化された配列を産生するためのコンピュータによるアルゴリズムの開発および実行
これらの式を使用して、我々は、次に、元のアミノ酸配列を維持しながら、いかなるコード領域のCPBも操作するための、コンピュータによるアルゴリズムを開発した。アルゴリズムは、遺伝子のコドン使用を維持する(すなわち、各既存コドンの使用頻度を保存する)が、CPBが増加または減少することができるように既存コドンを「シャッフル」する重要な能力を有する。アルゴリズムは、完全長最適化に好適な数学的プロセスである、シミュレーテッドアニーリングを使用する(Park, S. et al., 2004)。例えば、RNAの折り畳みの自由エネルギー等の他のパラメータもまた、このアルゴリズムの制御下にある。この自由エネルギーは、コドン再編成の結果としての二次構造の大きな変化を予防するために、狭い範囲内で維持される。最適化プロセスは、特に、ヘアピンまたはステムループ等の、そうでなければカスタマイズされたRNAにおいて生じ得る、大きな二次構造を有するいかなる領域の生成も除外する。このコンピュータソフトウェアを使用して、ユーザは、単に所与の遺伝子のcDNA配列を入力するだけでよく、遺伝子のCPBは、実験者が適切だと考えるようにカスタマイズすることができる。
過剰に存在する、あるいは過少に存在するコドン対によってコード化されるP1のデノボ合成
そのP1が過剰に存在する、あるいは過少に存在するコドン対によってコード化された、新規合成ポリオウイルスを得るために、我々は、ポリオウイルスI型Mahoney(PV(M)−wt)のP1構造領域に対応するDNA配列を、我々のプログラムに入力し、過剰に存在するコドン対(566変異)を使用してPV−Max−P1を、過少に存在するコドン対(631変異)を使用してPV−Min−P1を得た。これらのカスタマイズされた新規合成P−1領域のCPBスコアが、PV−Max=+0.25およびPV−Min=−0.48である一方で、7PV(M)−wtのCPBは、−0.02である(図7)。
さらなるカスタマイズは、P1領域のサブクローン化を可能にするために、所与の間隔で両方の合成配列に設計した制限部位の含有を含んだ。これらの合成P1フラグメントをBlue Herron Corp.によってデノボ合成し、ポリオウイルスの完全長cDNA構築物に組み込んだ(図11)(Karlin et al., 1994)。PV(M)−wt配列の小フラグメント(3個のコドン、9個のヌクレオチド)を、両方の構築物におけるAUG開始コドンの後に残し、翻訳が全ての合成ウイルスに対して同等に開始することを可能にし、したがって、翻訳の伸長段階へのCPBの効果のより正確な測定を提供した。
DNA合成、プラスミド、合成キャプシドおよびバクテリアのサブクローン化
PVゲノムのヌクレオチド495〜3636に対応する、大きなコドンペア変化PV cDNAフラグメントを、Blue Heron Corp.によって、彼らが所有するGeneMaker(登録商標)システムを使用して合成した(http://www.blueheronbio.com/)。全てのその結果生じたポリオウイルス cDNAクローン/サブクローンを、特異的制限部位を使用して、PV1(M)cDNAクローン pT7PVMから構築した(van der Wert, et al., 1986)。PflMI消化およびそのPflMIフラグメントが除去されたpT7PVMベクターへの挿入によって、Blue Heronの担体ベクターから完全長PV−Min、PV−Maxカセットを放出した。NheIおよびBglIIでの同時の消化、次いで、このフラグメントを同様に消化されたpT7PVMベクターと交換することによって、PV−MinXYおよびPV−MinZ構築物を得た。BsmI消化および同様に消化したpT7PVMとのフラグメント/ベクターの交換によって、PV−MinXYおよびPV−MinZを構築した。PV−MinXY構築物をBsmIで消化し、このフラグメントを消化したpT7PVMに対するBsmIフラグメントと交換することによって、PV−MinYを構築した。プラスミド形質転換および増幅は全て、大腸菌DH5αを介して達成した。
CPB変化キャプシド領域を含有するキメラウイルスの生成:P1全体にわたって過少に存在するコドン対バイアスは、ヌル表現型をもたらす
ポリオウイルスゲノム配列の上流にあるT7 RNAポリメラーゼプロモータを使用して、プラスセンスRNAを転写した。上記からの1.5μgの所与のプラスミドcDNAクローンを、EcoRI消化を介して線状化し、次いで、cDNAの上流にあるそのプロモータによって促進される、T7 RNAポリメラーゼ(Stratagene)を介して、2時間37℃でRNAに転写した(van der Werf et al., 1986)。改変されたDEAE−デキストラン方法(van der Werf et al., 1986)を使用して、このRNAをを1x106個のHeLa R19細胞に導入した。次いで、これらの細胞を室温(room−temperature;RT)で30分間インキュベートした。導入の上清を除去し、2%仔ウシ血清(BCS)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)を添加し、細胞を37℃でインキュベートし、細胞変性効果(CPE)の発症に関して観察した(最大で4日間)。
PV−Max RNA導入は、24時間で90%の細胞変性効果(CPE)を産生し、それはPV(M)−wtRNAの導入と同程度である。PV−Maxウイルスは、野生型と同一のサイズのプラークを生成した。対照的に、PV−Min RNAは、96時間後に目に見える細胞変性効果を全く産生せず、導入された細胞からの上清の4代盲目継代の後でさえ、生存ウイルスを単離することはできなかった。
PV−Max RNA導入を受ける、細胞からの上清の後続の使用もまた、12時間で95%のCPEを産生し、したがって、導入されたゲノム材料が、PV−Maxポリオウイルスビリオンの産生に成功したことを示唆する。対照的に、PV−MinウイルスRNAは、96時間後に目に見えるCPEを何ももたらさず、非常に低いレベルのウイルスを含有すると考えられる、上清の4代盲目継代もまた、CPEを産生しなかった。したがって、P1領域における、過少に存在するコドン対を利用する完全長PV−Min合成配列は、生存ウイルスを生成することができず、したがって、サブクローン化される必要があり得る。
HeLa R19細胞を、10% BCSを含有するDMEM中に単分子層として維持した。1MOIを使用して、(1.0x108個の細胞)HeLa R19単分子層上で、ウイルス増幅を達成した。3日間、またはCPEが認められるまで、感染細胞を2% BCSを含有するDMEM中で、37℃でインキュベートした。3回の冷凍/解凍サイクルの後に、低速度遠心分離によって、細胞残屑を溶解物から除去し、ウイルスを含有する上清をさらなる実験に使用した。
HeLa R19細胞の単分子層を5MOIの所与のウイルスに感染させることによって、一段増殖曲線を得、接種材料を除去し、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、0、2、4、7、10、24、および48時間、37℃でインキュベートした。次いで、これらの時点を、プラークアッセイによって分析した。HeLa R19細胞の単分子層に対して、全てのプラークアッセイを行った。これらの細胞を、精製ウイルスの所与の増殖曲線の時点の連続希釈で感染させた。ついで、これらの細胞を2% BCSを含有する変法イーグル培地中の0.6%のトラガカントゴムで重層し、次いで、PV(M)−wtおよびPV−Maxに対していずれも2日間、ならびにPV−Min(X、Y、XY、またはZ)ウイルスに対して3日間、37℃でインキュベートした。次いで、これらをクリスタルバイオレット染色によって現像し、目に見えるプラークを数えることによって、PFU/ml力価を計算した。
過少に存在するコドン対バイアスの小領域は、生存性を助けるが、ウイルスを弱毒化する
PV−Min配列において設計された制限部位を使用して、我々は、PV−Min P1領域の一部を、それ以外は野生型のウイルスにサブクローン化し、P1のサブ領域のみが、少ないコドン対バイアスを有したキメラウイルスを産生した(図11)(van der Werf et al., 1986)。これらのサブクローンの各々から、生体外転写によってRNAを産生し、次いで、HeLa R19細胞に導入し、異なる程度の弱毒化を有するウイルスを得た(生存性スコア、図11)。P1フラグメントXおよびYは、それぞれわずかに弱毒化されているが、しかしながら、合わせられると、それらは、相当に弱毒化されたウイルス(PV−Min755−2470、PV−MinXY)をもたらす(図3、4)。ウイルスPVMin2470−3385(PV−MinZ)は、PV−MinXYとほぼ同程度の弱毒化される。構築物PV−Min1513−3385(YZ)は、プラークをもたらさず、したがって、明らかに、生存ウイルスをもたらすにはあまりに弱毒化されすぎている。異なる程度の弱毒化を示した、これらのウイルス構築物を、それらの実際の増殖速度を決定するためにさらに研究した。
弱毒化の一段増殖速度および機構:特異的感染は減少する
各生存構築物に対して、一段増殖速度を分析した。これらの速度は、概して、それらが同一の基本的な方法で進む(すなわち、エクリプス期、続いて急速な対数増殖)という点で、野生型の速度と同様である。しかしながら、全てのPV−Min構築物に対して、プラーク形成単位(PFU)での最終力価は、典型的に、野生型ウイルスの最終力価よりも1〜3桁低かった(図12A)。
ウイルスが、PFUの代わりに1ml当たりのウイルス粒子で測定される場合(図12B)、わずかに異なる結果が得られ、これらのウイルスが、1感染サイクル当たりの1細胞当たり、野生型ウイルスとほぼ同等の粒子数を産生することを示唆する。1ml当たりのウイルス粒子を単位として、ほとんどの弱毒化ウイルスは、ほんの78%(PV−MinXY)または82%(PV−MinZ)弱毒化され、それは対数スケールで1桁未満である。したがって、これらのウイルスは、それらの特異的感染において、約2桁弱毒化されると思われる(プラークを精製するために必要とされるビリオン数)。
特異的感染が減少したことを確認するために、我々は、高度に精製されたウイルス粒子を使用して、PFU当たりのウイルス粒子の比を再測定した。選択されたウイルスを108個のHeLa R19細胞で増幅した。ウイルス溶解物をRNAse Aで処理し、OD値を曖昧にし得る、露出したウイルスゲノムおよびいかなる細胞RNAも破壊した。また、次いで、ウイルス溶解物を0.2% SDSおよび2mMのEDTAで1時間インキュベートし、細胞および非ビリオンウイルスタンパク質を変性させた。適切に折り畳まれ形成されたポリオウイルスキャプシドは、この荒いSDS処理に生き残るが、アルファ粒子は生き残らない(Mueller et al., 2005)。次いで、これらの処理された溶解物からのビリオンをスクロース勾配での超遠心分離によって精製した。式:9.4x1012粒子/ml=1OD260単位を使用して、260nmの光学濃度によって、ウイルス粒子濃度を測定した(Rueckert, 1985)。4個のウイルスの各々に対して、同様の数の粒子を産生した(表6)。次いで、これらの精製ビリオンを使用して、プラークアッセイを行った。この場合もやはり、PV−MinXYおよびPV−MinZは、プラークを生成するために、野生型よりもはるかに多くのウイルス粒子を必要とした(表6)。
野生型ウイルスに対して、特異的感染は137個の粒子当たり1PFUであると計算され(表6)、文献(Mueller et al., 2006、Schwerdt and Fogh, 1957、Joklik and Darnell, 1961)と一致する。ウイルスPV−MinXYおよびPV−MinZの特異的感染性は、10,000個の粒子当たり1PFUに近い(表6)。
さらに、合成ウイルスの熱安定性を、PV(M)−wtの熱安定性と比較し、新規RNAの一部を有するこれらの粒子が、同等に安定していたというSDS処理データを再確認した。実際に、これらの合成ウイルスは、50℃でインキュベートし、経時変化として定量化した場合、PV(M)−wtと同一の温度プロファイルを有した(データは図示せず)。
過少に存在するコドン対は、翻訳効率を低下させるが、過剰に存在する対は、翻訳を高める
コドン対バイアス存在に対する一仮説は、過少に存在する対の利用が、不十分な、または遅い翻訳速度をもたらすことである。我々の合成ウイルスは、我々の知る限り、高い濃度の過少に存在するコドン対を含有する最初の分子であり、したがって、翻訳仮説の試験に好適な最初の分子である。
翻訳へのコドン対バイアスの効果を測定するために、我々は、ジシストロニックレポータを使用した(Mueller et al., 2006)(図13)。第1のシストロンは、C型肝炎ウイルス内部リボソーム進入部位(IRES)の制御下で、ウミシイタケルシフェラーゼ(R−Luc)を発現し、正規化対照として使用される。第2のシストロンは、ポリオウイルスIRESの制御下で、ホタルルシフェラーゼ(F−Luc)を発現する。しかしながら、この第2のシストロンにおいて、ポリオウイルスのP1領域がF−Lucに先行し、このP1領域は、本明細書に記載される合成配列変異体のいずれによってもコード化され得る。F−Lucは、P1領域のタンパク質との融合タンパク質として翻訳されるため、P1領域の翻訳可能性は、産生されるF−Lucタンパク質の量に直接影響を与える。したがって、R−Luc発光に対するF−Luc発光の比は、種々のP1コード化の翻訳可能性の指標である。
野生型のP1領域PV−Max、PV−Min、PV−MinXY、およびPV−MinZを「P1」と標識される領域に挿入した(図13A)。PV−MinXY、PV−MinZ、およびPV−Minは、野生型P1領域が生成するよりもはるかに少ないR−Luc単位当たりのF−Lucを生成し、過少に存在するコドン対が、不十分な、または遅い翻訳速度をもたしていることを強く示唆する(図13)。対照的に、PV−Max P1(過剰に存在するコドン対を使用)は、R−Luc単位当たりのF−Lucをより多く産生し、翻訳が、実際に、PV(M)−wtP1と比較して、PV−Max P1に対してよりよいことを示唆する。
ジシストロニックレポータ構築および生体内翻訳
ジシストロニックレポータ構築物を、pdiLuc−PVに基づいて全て構築した(Mueller et al., 2006)。オリゴヌクレオチド P1max−2A−RI(+)/P1max−2A−RI(−)またはP1min−2A−RI(+)/P1min−2A−RI(−)をそれぞれ利用して、PCRによって、PV−MaxおよびPV−Minキャプシド領域を増幅した。PCRフラグメントをゲル精製し、次いで、中間ベクター、pCR−(登録商標)−XL−TOPO(登録商標)(Invitrogen)に挿入した。次いで、この中間ベクターをOne Shot(登録商標)TOP10化学的コンピテント細胞中で増幅した。Quiagneミニプレップによるプラスミドの調製後、PV−Minを含有する中間ベクターをEcoRIで消化し、これらのフラグメントを、EcoRIで同様に消化したpdiLuc−PVベクターに結紮した(Mueller et al., 2006)。これらのプラスミドも、One Shot(登録商標)TOP10化学的コンピテント細胞(Invitrogen)中で増幅した。pdiLuc−PV−MinXYおよびpdiLuc−PV−MinZを構築するために、pdiLuc−PVおよびpdiLuc−PV−MinをNheIで同様に消化し、得られる制限フラグメントをそれぞれのベクター間で交換した。次いで、これらをOne Shot(登録商標)TOP10化学的コンピテント細胞に形質転換し、次いで、増幅した。これらのクローンの4個全てから、T7ポリメラーゼ方法(van der Werf et al., 1986)によってRNAを転写した。
合成キャプシドの生体内翻訳効率を分析するために、リポフェクタミン2000(Invtirogen)を介して、12ウェルディッシュ上の2x105個のHeLa R19細胞に、ジシストロニックレポータ構築物のRNAを導入した。投入RNAのみの翻訳を定量化するために、2mMの塩酸グアニジン(GuHCL)の存在下で導入を行った。導入の6時間後、受動的溶解緩衝液(Promega)によって溶解させ、次いで、これらの溶解物を、デュアルホタル(F−Luc)ウミシイタケ(R−Luc)ルシフェラーゼアッセイ(Promega)によって分析した。
PV−MinXYおよびPV−MinZの遺伝的安定性
PV−MinXYおよびPV−MinZはそれぞれ、何百もの変異(それぞれ407および224)を含有し、各変異は、全コドン対バイアスの極めてわずかな減少を引き起こすため、我々は、これらのウイルスが、野生型毒性に戻るのは非常に困難であるはずだと信じている。この考えの直接試験として、ウイルスPV−MinXYおよびPV−MinZをそれぞれ、0.5のMOIで15代連続継代した。表現型復帰に対して力価を監視し、復帰または変異に対して継代されたウイルスの配列を監視した。15代継代後、ウイルスにおける表現型の変化はなく(すなわち、同一の力価、CPEの誘発)、合成領域において固定変異はなかった。
熱安定性および継代
合成ウイルス、PV−MinXYおよびPV−MinZの安定性を試験し、PV(M)−wtと比較した。PBS中に懸濁された1x108個の粒子を60分間50℃まで加熱し、次いで、プラークアッセイによって無傷のウイルス粒子の減少を5、15、30、および60分で測定することによって、これを達成した(図14)。ウイルスPV−MinXYおよびPV−MinZのP1領域の合成部分の遺伝的安定性を試験するために、これらのウイルスを連続継代した。1x106個のHeLa R19細胞の単分子層を0.5 MOIのウイルスPV−MinXYおよびPV−MinZに感染させ、次いで、CPEの誘発を待つことによって、これを達成した。継代全体にわたって一定のままであったCPEが開始されると、HeLa R19細胞の新単分子層を感染させるために、溶解物を使用した。力価および配列を5、9、および15代継代で監視した(データは図示せず)。
ウイルス精製およびOD260吸光によるウイルス粒子の決定
CPEが認められるまで、15cmディッシュ上のHeLa R19細胞の単分子層(1x108個の細胞)を、PV(M)−wt、PV−Max、PV−MinXY、またはPV−MinZに感染させた。3回の冷凍/解凍サイクルの後に、細胞溶解物を、最初に15分間3,000xg、次いで15分間10,000xgでの2回の遠心分離にかけた。次いで、10μg/mlのRNAse A(Roche)を上清に添加し、RTで1時間インキュベートし、続いて、0.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および2mM EDTAを上清に添加し、軽く混合し、RTで30分間インキュベートした。ウイルス粒子を含有するこれらの上清を6mlのスクロースクッション[ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中30%のスクロース]上に置いた。SW28スイングバケットロータを使用して、28,000rpmで3.5時間、スクロース勾配での超遠心分離によって、ウイルス粒子の沈降を達成した。
遠心分離後、スクロースクッションをそのままの状態にしながら、上清を除去し、管をHBBSで2回洗浄した。洗浄後、スクロースを除去し、「球状(pearl)」ウイルスを0.1% SDSを含有するPBSに再懸濁した。ウイルス力価を、プラークアッセイ(上記)によって決定した。式:9.4x1012粒子/ml=1OD260単位(Mueller et al., 2006、Rueckert, 1985)を使用して、NanoDrop分光光度計(NanoDrop技術)によって、260nmの溶液での光学濃度の3回の測定の平均によって、ウイルス粒子濃度を決定した。
CD155tgマウスにおけるPV−MinXYおよびPV−MinZの神経弱毒化
野生型ポリオウイルスの感染の原発部位は、中咽頭および腸であるが、この感染は比較的無症状である。しかしながら、感染が、1%のPV(M)−wt感染でCNSの運動ニューロンに広がると、ウイルスはこれらのニューロンを破壊し、死または灰白髄炎として知られる急性弛緩性麻痺を引き起こす(Landsteiner and Popper, 1909、Mueller et al., 2005)。運動ニューロンおよびCNSは、ポリオウイルスの重要な標的であるため、我々は、合成ウイルスがこれらの組織において弱毒化されたかどうかを知りたいと思った。したがって、これらのウイルスを脳内接種によって、CD155tgマウス(ポリオウイルス受容体を発現する遺伝子導入マウス)に投与した(Koike et al., 1991)。それぞれのウイルスに対して、PLD50値を計算し、PV−MinXYおよびPV−MinZウイルスを、粒子に基づいて1,000倍、あるいはPFUに基づいて10倍弱毒化した(表6)(Reed and Muench, 1938)。これらのウイルスは、神経弱毒化を実際に示したため、それらは可能なワクチンとして使用し得る。
CD155tgマウスのワクチン接種は、致死的攻撃に対する免疫および防御を提供する
4〜6匹の6〜8週齢のCD155tgマウス(Tg21系統)の群に、30ulのPBS中の102個の粒子から109個の粒子の精製ウイルス希釈を脳内接種し、神経病原性を決定した(Koike, et al., 1991)。
Reed and Muench方法(Reed and Muench, 1938)によって、致死量(LD50)を計算した。プラークアッセイによって、脊髄および脳におけるウイルス力価を定量化した(データは図示せず)。
PV−MinZおよびPV−MinXYは、野生型ウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するが、特異的感染および神経弱毒化の減少、両方におけるいくつかの点で弱毒化される。
ワクチンとしてのPV−MinZ、PV−MinXYを試験するために、このウイルスの3つの致死未満量(108個の粒子)を100ulのPBS中で、週に1回を3週間の腹腔内注射によって、8匹の6〜8週齢のCD155tgマウスに投与した。ワクチン集団からの1匹のマウスは、病気によりワクチン投与計画を完了しなかった。また、対照マウス群は、100ulのPBSで3つの偽のワクチン接種を受けた。最終ワクチン接種の約1週間後、尾静脈から30ulの血液を抽出した。この血液を低速度遠心分離にかけ、血清を採取した。WHOの推薦に従って実行した、攻撃ウイルスの100プラーク形成単位(PFU)でのマイクロ中和アッセイによって、PV(M)−wtに対する血清変換を分析した(Toyoda et al., 2007、Wahby, A.F., 2000)。最終ワクチン接種の2週間後、予防接種を受けたマウスおよび対照マウスに、100ulのPBS中で、106PFUでの筋肉内注射によって、致死量のPV(M)−wtを抗原投与した(Toyoda et al., 2007)。CD155tgマウスを利用した全ての実験を、Stony Brook UniversityのIACUC規則および連邦のガイドラインに従って行った。全ての14匹の予防接種を受けたマウスは生存し、麻痺または不全麻痺の兆候は示さなかったが、対照的に、全ての偽の予防接種を受けたマウスは死亡した(表7)。これらのデータは、実際に、脱最適化されたコドン対を使用するCPBウイルスが、野生型ウイルスに対して免疫性を与えることが可能であり、強い体液性応答を提供し、また抗原投与後の完全な生存も可能にすることを示唆する。
実施例10
インフルエンザウイルスへのSAVEの適用
インフルエンザウイルスへのSAVEの適用
インフルエンザウイルスは、8個の異なるゲノム断片を有する。インフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1))に対する断片配列を開示するGenBankの寄託は、AF389115(断片1、ポリメラーゼPB2)、AF389116(断片2、ポリメラーゼPB1)、AF389117(断片3、ポリメラーゼPA)、AF389118(断片4、血球凝集素HA)、AF389119(断片5、核タンパク質NP)、AF389120(断片6、ノイラミニダーゼNA)、AF389121(断片7、マトリクスタンパク質M1およびM2)、ならびにAF389122(断片8、非構造タンパク質NS1)を含む。
初期研究において、主要な構造タンパク質である核タンパク質NP、およびコイル状のリボ核タンパク質を形成するために、単量体を完全長ウイルスRNAに結合させる、ビリオン(1粒子当たり1,000コピー)の2番目に豊富なタンパク質をコード化する、株A/PR/8/34(本明細書ではA/PR8とも呼ばれる)のゲノム断片を脱最適化のために選択した(親配列および脱最適化された配列に関して、以下の表8を参照)。さらに、NPは、mRNAからテンプレートおよびビリオンRNA合成への重要な交換に関与する(Palese and Shaw, 2007)。2つの同義コード化を、最初に頻繁に使用されるコドンを希少同義コドン(NPCD)に置換し(すなわち、脱最適化されたコドンバイアス)、次に、コドン対(NPCPmin)を脱最適化し、合成した。断片の両末端にある末端の120個のヌクレオチドは、複製およびキャプシド形成を妨げないように変化させなかった。NPCDは、338個のサイレント変異を含有し、NPCPmin(配列番号23)は、314個のサイレント変異を含有する。変異NP断片を(以下に)記載されるようにアンビセンスベクターに導入し、他の7個のwtインフルエンザプラスミドと合わせて、293T/MDCK共培養細胞に同時導入した。対照として、細胞に8個全てのwtA/PR8プラスミドを導入した。NPCD断片およびNPCPmin断片を導入された細胞は、野生型NPを導入された細胞と同様に、生存インフルエンザウイルスを産生した。A/PR8−NPCDまたはA/PR8−NPCPminと呼ばれる、これらの新脱最適化ウイルスはそれぞれ、弱毒化されているように思われる。力価(PFUを単位として)は、野生型ウイルスよりも3〜10倍低く、変異ウイルスは両方、小プラークを形成する。
脱最適化されたインフルエンザウイルスは、同様の数の脱最適化されたコドンを含有するポリオウイルスほど大幅に弱毒化されてはいないが、2個のウイルスの翻訳戦略には違いがある。ポリオウイルスは、単一ポリタンパク質に翻訳される、単一の長いmRNAを有する。この長いmRNA(我々のキャプシド脱最適化ウイルスにあるような)の開始点を通る遅い翻訳は、全メッセージの翻訳を低下させ、したがって、全てのタンパク質に影響を及ぼす。対照的に、インフルエンザは、8個の別々の断片を有し、1個の脱最適化は、他の翻訳に対して、たとえあったとしてもほんの少しの影響しかない。さらに、NPタンパク質の発現は、特に、インフルエンザウイルス感染の初期段階に有利である(Palese and Shaw, 2007)。
コドン対脱最適化されたNP断片を有するインフルエンザウイルスの特性化
0.001の感染多重度(MOI)で、100mmディッシュにおけるメイディンダービーイヌ腎臓細胞(MDCK細胞)の融合性単層を感染させることによって、A/PR8−NPCPminの増殖特性を分析した。ウイルス接種材料をロッキングプラットホーム上得、室温で30分間吸着させ、次いで、0.2%のウシ血清アルブミン(BSA)および2ug/mlのTPCK処理トリプシンを含有する、10mlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)を添加し、37℃でインキュベートした。0、3、6、9、12、24、および48時間後、100μlのウイルス含有培地を除去し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。
35mmの6ウェルプレートにおけるMDCK細胞の融合性単層のプラークアッセイによって、ウイルス力価およびプラーク表現型を決定した。0.2%のウシ血清アルブミン(BSA)および2μg/mlのTPCK処理トリプシンを含有する、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において、ウイルスの10倍連続希釈を調製した。ウイルス希釈をMDCK細胞上にプレートアウトし、ロッキングプラットホーム上で、室温で30分間吸着させ、続いて、細胞培養インキュベータで、37℃で1時間インキュベートした。次いで、接種材料を除去し、0.6%のトラガカントゴム(Sigma−Aldrich)、0.2% BSA、および2ug/mlのTPCK処理トリプシンを含有する、3mlの最小イーグル培地を添加した。37℃での72時間のインキュベーション後、ウェルをクリスタルバイオレットで染色することによって、プラークを視覚化した。
A/PR8−NPMinは、A/PR8wtと比較して、MDCK細胞上により小さいプラークを産生した、生存ウイルスを産生した(図16A)。さらに、低MOI感染によって、A/PR8−NPMinは、感染の3時間後から12時間後の間の遅延した増殖速度を示し、A/PR8−NPMin力価は、A/PR8から1.5対数遅れを取っている(図16B)。最終力価は、A/PR8の最終力価よりも、3〜5倍低かった(3つの異なる実験の平均)。
コドン対脱最適化PB1、HA、またはHAおよびNP断片を有する、インフルエンザウイルスA/PR8−PB1Min−RR、A/PR8−HAMin、およびA/PR8−HAMin/NPMinの特性化
血球凝集素タンパク質HAおよびポリメラーゼサブユニットPB1をコード化する、株A/PR/8/34のコドン対脱最適化ゲノム断片を産生した。HAは、受容体結合およびウイルス侵入を仲介するウイルス表面から突き出ている、ウイルス構造タンパク質である。PB1は、ウイルスRNA複製機構の重要成分である。具体的に、野生型コドン使用(PB1Min−RR)を保持しながら、コドン190〜488(PB1断片のヌクレオチド531〜1488)の間のコドン対を脱最適化することによって、PB1(配列番号15)の同義コード化を合成した。断片PB1Min−RRは、wtPB1断片と比較して、236個のサイレント変異を含有する。
野生型コドン使用(HAMin)を保持しながら、コドン50〜541(HA断片のヌクレオチド180〜1655)の間のコドン対を脱最適化することによって、HA(配列番号21)の第2の同義コード化を合成した。HAMinは、wtPB1断片と比較して、355個のサイレント変異を含有する。
変異体PB1Min−RRおよびHAMin断片を上記のアンビセンスベクターに導入し、他の7個のwtインフルエンザプラスミドと合わせて、293T/MDCK共培養細胞に同時導入した。加えて、NPMin断片および残りの6個のwtプラスミドと合わせて、HAMin断片を同時導入した。対照として、細胞に8個全てのwtA/PR8プラスミドを導入した。PB1Min−RRまたはHAMin断片のいずれかを導入された細胞は、コドン対脱最適化断片HAMinおよびNPMinの組み合わせと同様に、生存ウイルスを産生した。これらの新脱最適化ウイルスは、A/PR8−PB1Min-RR、A/PR8−HAMin、およびA/PR8−HAMin/NPMinとそれぞれ呼ばれる。
増殖特性およびプラーク表現型を上記のように評価した。
A/PR8−PB1Min−RR、A/PR8−HAMin、およびA/PR8−HAMin/NPMinは全て、生存ウイルスを産生した。A/PR8−PB1Min−RRおよびA/PR8−HAMin/NPMinは、A/PR8wtと比較して、MDCK細胞上により小さいプラークを産生した(図17A)。さらに、MDCK細胞上の低MOI感染の際、A/PR8−HAMinおよびA/PR8−HAMin/NPMinは、特に感染後3〜12時間から、はるかに低下した増殖速度を示し、A/PR8−HAMin/NPMin力価は、A/PR8から1〜2桁遅れている(図17B)。A/PR8−HAMinおよびA/PR8−HAMin/NPMinの両方の最終力価は、A/PR8の最終力価よりも10倍低かった。A/PR8−HAMin/NPMinが、A/PR8−HAMinよりもはるかに大幅に増殖が遅延しているため、2個の断片の脱最適化の効果は、付加的であるということが結論づけられる。
BALB/cマウスモデルにおけるA/PR8−NPMinの弱毒化
6〜8匹の6週齢の麻酔したBALB/cマウスの群の各鼻孔に、102から106PFUの間のウイルスの10倍連続希釈を含有する、12.5μlのA/PR8またはA/PR8−NPMinウイルス溶液を投与した。死亡率および罹患率(体重減少、活性低下、死亡)を監視した。Reed and Muenchの方法(Reed, L. J., and M. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27:493−497)によって、致死量50、LD50を計算した。
8匹のマウスに、鼻腔内接種によって、102PFUのA/PR8−NPMinウイルスを1回予防接種した。6匹のマウスの対照群は、いずれのウイルスも接種しなかった(偽)。この初回ワクチン接種の28日後、LD50の100倍に相当する致死量のwtウイルスA/PR8を、マウスに抗原投与した。
A/PR8−NPMinに対するLD50が1x103PFUであった一方で、A/PR8に対するLD50は、4.6x101PFUであった。102の用量では、全てのA/PR8−NPMinに感染したマウスが生存した。wtA/PR8ウイルスと比較して、A/PR8−NPMinが、マウスにおいて10倍を上回って弱毒化しているということが結論づけられる。したがって、この濃度をワクチン接種実験に選択した。マウスへの102A/PR8−NPMinのワクチン接種は、10%未満の相対的体重減少によって示されるように、軽度および短期の病気を引き起こした(図18A)。予防接種を受けた8匹のマウスのうち8匹全てが生存した。同量のA/PR8に感染したマウスは、重度の疾病を伴う急激な体重減少を経験した。A/PR8に感染した8匹のマウスのうち6匹は、感染の10日後から13日後の間に死亡した(図18B)。2匹のマウスは生存し、野生型感染から回復した。
LD50の100倍のwtウイルスの抗原投与によって、全てのA/PR8−NPMinの接種を受けたマウスは防御され、病徴または体重減少なく抗原投与に生き残った(図18C)。一方で、偽の予防接種を受けたマウスは、重度の症状を示し、抗原投与の9日後から11日後の間に感染して死亡した。A/PR8−NPMinは、マウスにおいて防御免疫を誘発し、したがって、生弱毒化インフルエンザワクチンとしての可能性を有するということが結論づけられる。A/PR8−PB1Min−RRおよびA/PR8−HAMin/NPMin等の他のウイルスも、まだマウスにおいて試験しなければならないが、ワクチンとしてのコドンペア脱最適化インフルエンザウイルスの有益な特性のさらなる改善をもたらす可能性がある。
実施例11
ウイルスキメラを製造および特性化するためのさらなるハイスループットを有する方法の開発
ウイルスキメラを製造および特性化するためのさらなるハイスループットを有する方法の開発
重複PCRによるキメラウイルスの構築
各弱毒化変異ウイルスを通した「スキャン」は、重複PCRを使用して、各変異ウイルスからの約300bpのフラグメントをwt背景に入れることによって行われる。いずれの所与の300bp断片も、前断片と約200bp重複し、すなわち、スキャン窓は、約300bpの長さであるが、各新キメラウイルスに対して約100bp前進する。したがって、1個の変異ウイルス(約3000bpのキャプシド領域のみが変化されている)を通してスキャンするために、約30個のキメラウイルスが必要である。2個のウイルスを同時に分析するのに十分すぎる容量を有する、96ウェルディッシュフォーマットでスキャンを行った。
出発物質は、ピコグラム量の2個のプラスミドであり、一方は、wtウイルスの配列を含有し、もう一方は、変異ウイルスの配列を含有する。プラスミドは、T7 RNAポリメラーゼプロモータ、ハンマーヘッド型リボザイム(Herold and Aldino, 2000)、およびDNAによってコード化されたポリ(A)テールを含む、PV逆遺伝学系(van der Werf et al., 1986)の全ての必要な要素を含む。PCRプライマの3つの対、A、M(変異体)、およびB対が使用される。図9を参照されたい。M対は、変異ウイルスの所望の300bp断片を増幅するが、Mプライマ対は、変異体において有意に変化されている配列に基づいて設計されているため、wtを増幅しない。AおよびB対は、wtウイルスゲノムの所望のフランクを増幅する。重要なことには、重複配列の約20〜25bpが、A2およびB1のそれぞれと同様に、各Mプライマの5’末端に構築される。これらの20〜25bpは、A断片の3’末端およびB断片の5’末端のそれぞれと重複する(100%の相補性)。
重複PCRを実行するために、1個のウェルディッシュは、wtプラスミドDNA、および30個の異なるウェルにおいて30個の異なるAおよびB対を含有する。別個であるが一致している96ウェルプレートは、変異体プラスミドDNA、および30個の異なるMプライマ対を含有する。PCRは、高度進行性、低エラー率の耐熱性ポリメラーゼで実行される。1回目のPCRの後に、各反応物はDpnIで処理され、メチル化GmATC部位を切断することによって、テンプレートプラスミドを破壊する。次いで、各wtおよび一致している変異反応物からのアリコートを、第3の96ウェルディッシュにおけるPCR反応緩衝液中で混合される。この時、前構築物に隣接するプライマが使用される(すなわち、A1およびB2プライマ)。各断片(A、M、およびB)は、各隣接断片と少なくとも20bp重複するように設計されるため、かつ反応は、完全長産物を増幅することしかできないプライマによって促進されているため、断片はアニールし相互に伸長し、2または3サイクル後に完全長産物をもたらす。これは、「1チューブ」(1個の96ウェルディッシュ)設計に凝縮され得る「3チューブ」(3個の96ウェルディッシュ)設計である。
キメラウイルスの特性化
T7 RNAポリメラーゼでのインキュベーション後、全ての必要とされる上流および下流調節要素で、上記で産生された完全長線状キメラDNAゲノムは、活性ウイルスRNAをもたらし、それは、HeLa S10細胞抽出物(Molla et al., 1991)におけるインキュベーションまたはHeLa細胞への導入によって、ウイルス粒子を産生する。あるいは、細胞質においてT7 RNAポリメラーゼを発現するHeLa細胞に、DNA構築物を直接導入することが可能である。
次いで、96ウェルフォーマットにおいてウイルスにより誘発されたCPEを評価するための細胞の目視検査、ELISAを使用したウイルス産生の評価、一連の96ウェルプレートにおける細胞に接種された等量のウイルス粒子の増殖速度の定量的測定、および特異的感染の測定(感染単位/粒子[IU/P]の比)を含む、種々の比較的ハイスループットなアッセイを使用して、各キメラウイルスの機能性が分析される。
次いで、各キメラウイルスの機能性を分析することができる。多数の比較的ハイスループットなアッセイが利用可能である。第1のアッセイは、96ウェルフォーマットにおけるウイルスにより誘発されたCPE(細胞死)を調べるために顕微鏡を使用して、細胞を視覚的に検査するためであってもよい。これは、生体染色色素を使用して、自動化96ウェルアッセイで行うこともできるが、CPEのための96ウェルプレートの目視検査は、実践的な時間で1時間未満しか必要とせず、ほとんどの目的で十分速い。
第2に、導入の3〜4日後、ウイルス産生は、実施例3に記載されるELISA方法を使用して分析されてもよい。あるいは、キャプシド特異的抗体を用いたサンドウィッチELISAを使用して、粒子力価が決定される。これらのアッセイは、非生存構築物(ウイルス粒子なし)、不十分に複製する構築物(ほんのわずかな粒子)、および十分に複製する構築物(多くの粒子)の同定、ならびにこれらの効果の定量化を可能にする。
第3に、より定量的な決定のために、上記で決定された等量のウイルス粒子は、増殖速度を測定するために、一連の新鮮な96ウェルプレートに植菌される。種々の時間(感染後0、2、4、6、8、12、24、48、72時間)において、1個の96ウェルプレートは除去され、冷凍/解凍サイクルにかけられ、細胞関連ウイルスを遊離させる。上記のELISAによって、各時間において各構築物から産生されたウイルス粒子数が決定される。
第4に、IU/Pの比を測定することができる(実施例3を参照)。
より高分解能のスキャン
ウイルスの致死性が、予備データが示すように、キャプシド領域にわたって広がる多くの小欠損によるならば、キメラの多くまたはほとんどは健康ではなく、ほんの数個は生存できない。この場合には、より高分解能のスキャンは恐らく必要ない。反対に、300bp断片のうちの1つ以上が、実際に致死性をもたらす場合(以下に記載されるように、この断片の強い表現型に寄与する、翻訳フレームシフトシグナルを伝達し得る、1513から2470の間の断片におけるコドン脱最適化ウイルスに考えられるように)、ゲノムスキャンは、より高分解能、例えば、300bp断片にわたって構築物間で30bpウィンドウ移動10bpで繰り返され、表現型分析が後に続く。30bpスキャンは、変異ウイルスのPCRを含まず、代わりに、変化した30bp断片は、wtウイルスに対するPCRプライマに直接設計される。これは、致死性に関与する変化が特定されることを可能にする。
実施例12
SAVEの基礎となる分子機構に対する進行中の研究
SAVEの基礎となる分子機構に対する進行中の研究
キメラの選択
2個の親生存不能ウイルスの各々からの2〜4個のキメラの例(すなわち、合計で4〜8個のウイルス)が、次の実験に使用される。変異体DNAの比較的小さい断片を有するが、強い表現型を有する生存キメラが選択される。例えば、脱最適化されたコドンウイルスからのウイルスPV−AB755−1513、PVAB2470−2954、およびPV−AB2954−3386(実施例1を参照)、ならびにPV−Min755−2470およびPV−Min2470−3386(実施例7を参照)が好適である。分析をより容易にするより小さい挿入部分を有する、さらに良好な開始キメラもまた、上記の実験から得ることができる(実施例8)。
RNA存在度/安定度
考えられる限りでは、変化したゲノム配列は、ウイルスRNAを不安定化する。そのような不安定化は、新規配列の直接的影響、または翻訳の中止もしくは翻訳の他の欠損の間接的影響であり得る(例えば、Doma and Parker, 2006を参照)。したがって、変異ウイルスRNAの存在度が検査される。キメラ変異ウイルスおよびwtウイルスからの等量のRNAが混合され、HeLa細胞に導入される。2、4、8、および12時間後にサンプルは採取され、2個の異なるウイルスRNAに対して、ノーザンブロット法または定量PCRによって分析されるが、それらは、何百ものヌクレオチドの差異があるため容易に識別できる。PV−SD(wt表現型を有する、コドンがシャッフルされたウイルス)と比較した、wtウイルスRNAでの対照実験も行なう。wtウイルス RNAに対する変異体の比の減少は、キメラが不安定化したRNAを有することを示す。
生体外翻訳
コドン脱最適化ウイルスおよびその誘導体の一部に対して、翻訳が減少することが示された。実施例5を参照されたい。生体外翻訳実験は、コドン対脱最適化ウイルス(PV−Min)およびその選択されたキメラで繰り返される。脱最適化されたコドン対がなぜウイルス生存不能を引き起こすのかということに関して、現在優れた理論はなく、ましてやいかなる証拠もなく、したがって、翻訳への効果を調査することは、基礎となる機構を明らかにするのに役立ち得る。
実施例5において2種類の抽出物に生体外翻訳をおこなった。一方は、「高性能」抽出物(Molla et al., 1991)であり、コドン脱最適化ウイルスさえも、明らかに良好な翻訳をもたらした。もう一方は、正常な生体内条件により近い抽出物であり、脱最適化されたコドンウイルスは、非効率的に翻訳された。抽出物間で4つの差異があり、より「天然」の抽出物は透析されず、内因性細胞mRNAは、小球菌ヌクレアーゼで破壊されず、抽出物は、外因性アミノ酸を添加されず、抽出物は、外因性 tRNAを添加されなかった。本研究において、どれが翻訳に対して最も有意な効果をもたらすかを調べるために、これらの4つのパラメータは、1つずつ(または必要に応じて対で)変化される。例えば、コドン脱最適化ウイルスの翻訳を可能にするものが、アミノ酸およびtRNAの添加であるという所見は、希少アミノアシルtRNAが制限的であるため、翻訳が非効率的であるという仮説を強く裏付ける。そのような所見は、他の種類ウイルスにもSAVE方法を行うという観点から重要である。
翻訳フレームシフト
別の考えられる欠損は、コドン変化が翻訳フレームシフトを促進し得ること、すなわち、いくつかのコドン対において、リボソームが異なるリーディングフレームに変移し、次いで、偽ペプチド配列を翻訳した後にインフレーム終止コドンに達し得ることである。この種類のフレームシフトは、いつくかのウイルスにおいて重要な制御事象である。本データは、残基1513〜2470のAB変異体断片を有する全てのPVゲノムが、生存できないことを示す。さらに、この変異体領域を有する全てのゲノムは、約42〜44kDaの生体外翻訳中に新規タンパク質バンドを産生する(図5Aを参照。アスタリスクが付けられている)。この新規タンパク質は、フレームシフトの結果であり得る。
1513〜2470の間隔における配列の検査は、真核生物における−1フレームシフトに対するスリッパリィ七量体共通配列に適合する、3つの潜在的な候補部位を示す(X−XXY−YYZ)(Farabaugh, 1996)。これらの部位は、位置1885および1948におけるA−AAA−AAT、位置2119におけるT−TTA−TTTである。それらには、1929、1986、または2149のそれぞれにおける−1フレームの終止コドンが続く。前者の2つは、測定されたサイズのバンドを産生するためのよりふさわしい候補であるように思われる。
フレームシフトが起こっているかどうかを決定するために、3つの候補領域の各々は、フレームシフトに好ましくなくなるように別々に変異される。さらに、候補終止コドンの各々は、センスコドンに別々に変異される。これらの6個の新しい点突然変異体は、生体外翻訳によって試験される。好ましくない配列へのフレームシフト部位の変異による新規42〜44kDaタンパク質の損失、および終止コドン除去によるそのタンパク質バンドの分子量の増加は、フレームシフトが起こっていることを示す。フレームシフトが、異常翻訳産物の原因であるなら、フレームシフト部位を欠く新変異体の生存性が、1513〜2470の変異体断片との関連で試験される。明らかに、そのような 所見は、将来のゲノム設計に重要であり、必要な場合は、フレームシフトフィルタが、考えられるフレームシフト部位を防ぐために、ソフトウェアアルゴリズムに組み込むことができる。
翻訳欠損に関するより詳細にわたる研究は、ポリソームプロファイリング、先端プリント化、および融合タンパク質のルシフェラーゼアッセイを含むがこれらに限定されない、種々の技術を使用して行われる。
ポリソームプロファイリング
ポリソームプロファイリングは、翻訳を検査する伝統的な方法である。ハイスループットではないが、非常によく開発され理解されている。ポリソームプロファイリングに対して、細胞抽出物は、翻訳を停止し(シクロヘキシミドで)、それにもかかわらずそれらのそれぞれのmRNAを翻訳しているリボソームのセット(「ポリソーム」)を保存する方法で作製される。これらのポリソームは、スクロース勾配で分別され、それにより多数のリボソームと関連するメッセージは、底部に向かって沈殿する。勾配の分別およびUV吸収を使用したRNA含有量の分析後に、吸収の後続ピークがN+1リボソームを有するmRNAに対応する、ポリソームプロファイルが見られ、典型的に10〜15個の明らかなピーク(単一mRNA上の40Sリボソームサブユニット、60サブユニット、および1、2、3、…12、13個のリボソームを表す)が、合わせて不鮮明になる前に識別することができる。次いで、スクロース勾配からの種々の分画は、ゲル上で行われ、膜にブロットされ、特定のmRNAのためのノーザン分析によって分析される。次いで、これは、その特定のmRNAが、例えば、10〜15個のリボソーム(十分に翻訳された)、または1〜4個のリボソーム(不十分に翻訳された)に主に関与するかどうかを示す。
この研究において、例えば、wtウイルス、PV−AB(コドン脱最適化)ウイルス、ならびに主としてN末端またはC末端が脱最適化された断片をそれぞれ有する、その誘導体PV−AB755−1513およびPV−AB2954−3386が比較される。N末端とC末端変異体断片との比較は、特に多くを明らかにする。コドン脱最適化が、翻訳を遅くするか、または中止させるなら、N末端変異体RNAは、比較的少ないリボソームと関連する(リボソームが、N末端領域にわたって非常にゆっくりと移動し、他のリボソームが加重することを予防し、次いで、脱最適化された領域を横切った後にメッセージの残りを通して迅速に動くため)。対照的に、C末端変異体RNAは、多くのリボソームが荷重することができるため、比較的多数のリボソームと関連するが、それらがC末端近傍で妨害されるため、それらは転写を終えることができず、関連リボソームの数は高い。
ポリソーム 分析は、いくつのリボソームが、異なる種類の変異体RNAと積極的に関連するかを示し、例えば、翻訳が遅いモデルを、リボソームが実際にRNAから早期に離れるモデルと区別することができる。他の種類のモデルも試験することができる。
先端プリント化
先端プリント化は、リボソームが遅いか、または中止されるmRNA上の位置を同定するための技術である。ポリソームプロファイリングにあるように、活発に翻訳中のmRNAが得られ、それらのリボソームはで冷凍されているが、それでもなお関連しており、mRNAは、しばしば生体外翻訳反応から得られる。mRNAのある比較的に3’部分を補完するDNAオリゴヌクレオチドプライマが使用され、次いで逆転写酵素によって伸長される。逆転写酵素は、それがリボソームと衝突するまで伸長する。したがって、翻訳mRNA分子集団は、プライマの部位から最近傍のリボソームに伸長するDNAフラグメント集団を生成する。リボソームが中止する傾向を有する部位または領域がある場合、(例えば、プライマからの200個の塩基)、この部位または領域は、不均衡な数のDNAフラグメントをもたらす(この場合、フラグメントは、200塩基長)次いで、これは、高分解能ゲル上の「先端プリント」(バンドまたは暗い領域)として見える。これは、mRNA上のリボソーム中止部位(数個のヌクレオチド以内まで)をマッピングするための標準的方法である。
異なるキメラにおいて、断片がわずかに5’または3’変移される、脱最適化されたコドンまたはコドン対の断片を有するキメラが分析される。脱最適化された断片が、リボソームを遅くするか、または中止させる場合、先端プリントは、脱最適化された断片の位置と一致するように、5’または3’変移する。対照は、wtウイルスRNAおよびいくつかの(無害に)シャッフルされたウイルスRNAを含む。対照はまた、逆転写への新規配列のリボソーム非依存的効果を除外するために、純粋な変異ウイルスRNA(すなわち、翻訳に関与していない)も含む。
先端プリントアッセイは、少なくとも2つの利点を有する。第1に、それは、中止されたリボソームの直接的証拠を提供することができる。第2に、それは、数個のヌクレオチドの分解を有するため、どの脱最適化されたコドンまたは脱最適化されたコドン対が中止を引き起こしているのかを正確に同定することができる。すなわち、脱最適化されたコドンまたはコドン対のうちの数個のみが、効果の大部分に関与している可能性があり、先端プリント化はそれを明らかにすることができる。
融合タンパク質のデュアルルシフェラーゼレポータアッセイ
上記の実験は、あるコドンまたはコドン対が翻訳に対して特に有害であることを示唆し得る。翻訳への特定のコドンおよびコドン対の効果を分析するためのハイスループットな方法として、小さい試験ペプチドを設計し、ウミシイタケルシフェラーゼのN末端に融合される。次いで、ルシフェラーゼ活性は、ペプチドの翻訳可能性のアッセイとして測定される。すなわち、N末端ペプチドが不十分に翻訳される場合、ルシフェラーゼはほとんど産生されない。
一連の8個の25merペプチドは、上記の実験に基づいて設計される。8個の25merの各々は、該希少コドンおよび/または希少コドン対の種々の置換を使用して、12の異なる方法でコード化される。集合PCRを使用して、これらの96構築物(8 25merx12のコード化)は、上記のジシストロン性デュアルルシフェラーゼベクターにおける、ホタルルシフェラーゼ(F−luc)のN末端に融合される(実施例5および図6を参照)。デュアルルシフェラーゼ系は、ホタルルシフェラーゼ(F−Luc)およびウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(R−Luc)の両方を使用し、これらは、異なる生化学的条件下で光を発するため、1つの管またはウェルから別々に分析することができる。ジシストロニックレポータは、単一mRNAとして発現されるが、対照ルシフェラーゼ(R−Luc)が、1つの内部リボソーム進入部位(IRES)から翻訳される一方で、実験用ルシフェラーゼ(F−luc)(そのN末端に融合される試験ペプチドを有する)は、それ自体のIRESから独立して翻訳される。したがって、R−Luc活性に対するF−Luc活性の比は、試験ペプチドの翻訳可能性を暗示する。図6を参照されたい。
得られる96個のジシストロニックレポータ構築物は、PCR反応からHEK293またはHeLa細胞の96個のウェルに直接導入される。上流シストロンのホタルルシフェラーゼは、内部導入制御として機能する。第2のシストロンにおけるウミシイタケルシフェラーゼのコドンまたはコドン対依存性発現は、R−LucとF−Lucとの間の比として正確に決定することができる。このアッセイは、本来ハイスループットであり、何百、または何千もの試験配列を必要に応じて分析することができる。
実施例13
新規代替コドン戦略を使用した、弱毒化ウイルスの設計および合成
新規代替コドン戦略を使用した、弱毒化ウイルスの設計および合成
ワクチン産生のためのウイルスの再操作のためのSAVE方法は、ウイルスタンパク質の翻訳を減少する大規模同義コドン置換に依存する。これは、コドンおよびコドン対バイアス、ならびにRNA二次構造およびCpG含有量等の他のパラメータを適切に調節することによって、達成することができる。4個のデノボのPV設計のうち、2個(シャッフルされたコドンウイルス、PV−SD、および好適コドン対ウイルス、PV−Max)は、wtウイルス対して表現型変化はほとんどもたらさなかった。他の2個のデノボ設計(PV−ABおよびPV−Min)は、2個の異なる機構を通して同義置換のみを採用するウイルスを殺滅することに成功した(コドンバイアスおよびコドン対バイアスのそれぞれにおける大幅な変化)。生きているが弱毒化した株は、不活化ウイルス株からの領域をwtにサブクローン化することによって構築した。
大規模な同義置換を採用したウイルス弱毒化の基礎となる機構のよりよい理解は、合成ウイルスの表現型および発現レベルの予想を容易にする。進行中の研究は、翻訳効率への変化合計数および変化密度の効果、翻訳への高密度領域の位置の効果、コドンおよびコドン対バイアスの相互作用、ならびにゲノムへの数多くの短い範囲のRNA二次構造の再操作の効果に関する問題に対処する。wtと活性化された株との間には連続性があり、いかなる所望の弱毒化レベルも、弱毒化された株に操作することができる可能性が高い。しかしながら、いかなる感染も自立的であり、したがって検出可能であるように達成することができる弱毒化レベルには厳しい制限があり得る。PVタンパク質のこの15442のコード化は、調査すべき巨大な配列スペースを構成し、種々の方法が、この配列スペースをより系統的に調査するために利用されている。これらの方法は、第1に、新規弱毒化ウイルスの設計に役立つソフトウェアプラットフォームを開発するステップと、第2に、より多くの配列スペースを調査し、代替的コード化がどのように弱毒化を引き起こすかに関する特定の質問に答える、多数の新ウイルスを設計し、次いで、合成および特性化するために、このソフトウェアを使用するステップとを含む。さらに、考慮すべき重要な課題は、危険なウイルスが、同義コドンの外見上無害なシャッフルによって偶然に作製される可能性があるかどうかである。
ウイルスゲノムのコンピュータによる設計およびデータ分析のためのソフトウェアの開発
合成ウイルスの設計は、(1)配列特異的シグナルを保存、組み込み、または除去しながら、コドンおよびコドンペア使用を最適化し、RNA二次構造を監視するための、および(2)正確な配列集合を確実にするために、配列をオリゴヌクレオチドに分割するための、多くのなソフトウェアサポートを必要とする。原型合成ゲノム設計ソフトウェアツールは、合成ゲノム設計のための完全な環境に拡張されている。この拡張されたソフトウェアにおいて、遺伝子エディタが、配列の代わりに制約を中心に概念的に構築される。遺伝子の設計者は、所望の遺伝子の特性を特定するレベルで機能し(例えば、アミノ酸配列、コドン/コドンペア分布、制限部位の分布、およびRNA二次構造制約)、遺伝子エディタは、これらの制約を実現するDNA配列をアルゴリズムで設計する。アミノ酸配列、コドンバイアス、コドン対バイアス、CGジヌクレオチド含有量、RNA二次構造、CRE、スプライス部位、ポリアデニル化部位、および制限酵素認識部位等のシス作用性核酸シグナルを含むがこれらに限定されない、しばしば互いと相互作用する多くの制約がある。遺伝子の設計者は、これらの制約の存在を認識し、予め指定したレベルまで全ての制約を自動的に満たしながら、所望の特徴を有する遺伝子を設計する。
パターン、二次構造、重複コーディングフレーム、およびコドン/コドンペア分布への接着を組み込む/除去するためにすでに開発されている合成アルゴリズムは、エディタの一部として実現されるが、より重要なことは、そのような選好の異種の組み合わせを実現するためのアルゴリズムである。そのような組み合わせは、コンピュータ的に扱いにくい(NP完全)問題をもたらすため、発見的最適化が、エディタにおいて必然的に重要な役割を果たす。シミュレーテッドアニーリング技術は、そのような設計を実現するために採用され、これは、シミュレーテッドアニーリングが、初期の設計ツールにおけるその最初の実際的使用を達成したために特に適している。
フル機能の遺伝子設計プログラミング環境は、プラットフォーム非依存であり、Linux、Windows、およびMacOSにおいて作動している。システムは、バクテリアまたは菌(酵母)の規模でゲノムと連動するように設計され、以下に記載される新規弱毒化ウイルス設計の合成および評価によって認証される。
1個または数個のアミノ酸における極端なコドンバイアスでのウイルス設計
生ワクチンに対して、ウイルスは、不活性化されていない場合、可能な限り衰弱していなければならず、その場合、ウイルスを培養および製造する方法はない。最適な衰弱を得るための一方法は、1個または数個のみのアミノ酸に対して希少コドンの置換を操作し、それらの希少コドンと結合する希少tRNAを過剰発現する、対応する細胞株を作製することである。次いで、ウイルスは、特別な許容細胞株において効率的に増殖することができるが、正常な宿主細胞株においては生存不能である。ウイルスは、許容細胞株を使用して培養および製造されるが、それは非常に便利であるだけでなく、生弱毒化ワクチンを産生するために現在使用されている方法よりも安全である。
ヒトゲノムの配列化によって、希少コドンを読み取る種々のtRNA遺伝子のコピー数に関する情報が、入手可能である。文献(例えば、Lavner and Kotlar, 2005)に基づくと、本目的に最適な希少コドンは、同族tRNA遺伝子の2個のコピーを有する非常に希少なコドン、CTA(Leu)、同族tRNA遺伝子の4個のコピーを有する希少コドン、TCG(Ser)、および同族tRNA遺伝子の4個のコピーを有する希少コドン、CCG(Pro)である(Lavner and Kotlar, 2005)。特定の種類のtRNA 遺伝子のコピー数の中央値は9個であるが、範囲は2〜33個のコピーである(Lavner and Kotlar, 2005)。したがって、CTAコドンは、希少コドンであるだけでなく、最も少ない同族tRNA遺伝子を有する1個のコドンでもある。これらのコドンは、いずれの他のtRNAによって読み取られず、例えば、ゆらぎ塩基対形成によって読み取られない。
Leu(180コドン)、Ser(153)、およびPro(119)に対するウイルスゲノムコーディング全体を通して、コドンの全てを希少同義コドン CTA、TCG、またはCCGのそれぞれに変化させることは、重度に衰弱したウイルス、または非生存ウイルスでさえ作製すると予想される。次いで、対応する希少tRNAを過剰発現するヘルパー細胞を作製することができる。対応するウイルスは、この人工培養系のみにおける増殖に完全に依存しており、ワクチン産生のためのウイルスの生成の最大の安全性を提供する。
4個の優先度の高いウイルスが設計および合成される。単一ウイルスにおいて、全てのLeuコドンはCTAに転換し、全てのSerコドンはTCGに転換し、全てのProコドンはCCGに転換し、全てのLeu、Ser、およびProコドンは、CTA、TCG、およびCCGのそれぞれに転換される。一実施形態では、これらの置換は、ウイルスのキャプシド領域においてのみ行われ、そこでは、翻訳の高い速度が最も重要である。別の実施形態では、置換はウイルス全体にわたって行われる。
CGジヌクレオチドバイアスウイルス
まれに例外はあるが、ウイルスゲノムは、GpCではなくジヌクレオチドCpGを過少に示す(Karlin et al., 1994)。この現象は、ゲノムの全G+C含有量と無関係である。CpGは、しばしばバクテリアおよびDNAウイルスに存在するような、非メチル化CpGジヌクレオチドを含有する1本鎖DNAが、Toll様受容体9によって病原体の特徴として認識されるように、ヒトゲノム中でメチル化される場合が多い。これは、自然免疫系の活性化をもたらす。同様の系がRNAウイルスに対して作用することは示されてはいないが、PVゲノムの検査は、PVが、ヒトにおけるCpGジヌクレオチドの有意な過少存在よりも大きい程度まで、CpGを含有する同義コドンに対して選択したことを示唆する。これは、特にアルギニンコドンに対して顕著である。6個の同義Argコドンのうち、4個のCG含有コドン(CGA、CGC、CGG、CCU)は合わせて、96個全てのArgコドンのうち24個のみを占める一方で、残りの2個(AGA、AGG)は、72個を占める。これは、65個のCG含有コドンおよび31個のAGA/AGOコドンを予測し得る、平均ヒトコドン使用と対照的である。実際に、PVにおいて過少に存在するコドンのうちの2個は、ヒト細胞(CGC、CGG)において頻繁に使用される。CGが、PVにおいて不利なジヌクレオチドであり得るという他の暗示が2つある。第1に、コドン対脱最適化ウイルスにおいて、導入された希少コドン対の多くは、コドン対六量体の中心ジヌクレオチドとして、CGを含有する。第2に、Burns et al.(2006)が彼らのコドンバイアス脱最適化ウイルスを継代し、ゲノムを配列した時に、これらのウイルスが、一部のCGジヌクレオチドを除去するために進化したことが認められた。
したがって、1個の優先度の高い再設計されたウイルスにおいて、ほとんどまたは全てのArgコドンは、CGCまたはCGG(2個の頻繁なヒトコドン)に変化される。これは、翻訳に悪影響を及ぼさず、ウイルス増殖へのCpGジヌクレオチドバイアスの効果の評価を可能にする。得られるウイルスの増加したC+G含有量は、二次構造の注意深い監視を必要とし、すなわち、Argコドンの変化は、顕著な二次構造を作製することができない。
コドンバイアスおよびコドン対バイアスの同時調節
コドンバイアスおよびコドン対バイアスは、翻訳レベルにおいて互いと相互作用し得ると考えられる。この相互作用の理解は、場合によっては最大範囲にわたって、いかなる所与のタンパク質の翻訳可能性の調節も予測可能に可能にし得る。
野生型ポリオコドンバイアスおよびコドン対バイアスを0、および予想される最低のコドンバイアスおよびコドン対バイアスを−1として表すならば、4個の優先度の高いウイルスは、(−0.3,−0.3)、(−0.3,−0.6)、(−0.6,−0.3)、および(−0.6,−0.6)ウイルスである。これらのウイルスは、中程度に不十分な、または非常に少ないコドンバイアスが、中程度に不十分な、または非常に少ないコドン対ウイルスとどのように相互作用するかを明らかにする。これらのウイルスは、野生型、および極端なPV−AB(−1,0)およびPV−Min(0,−1)設計とも比較される。
RNA二次構造の調節
上記の合成設計は、過剰な二次構造を防ぐ。2つの追加の設計は、二次構造を系統的に防ぐ。これらのウイルスは、(1)恐らく最小の二次構造、および(2)翻訳を遅くするのに十分な、多くの小さい二次構造を含む、wtコドンおよびコドン対バイアスを有するように操作される。
追加のウイルス設計
追加のウイルス設計は、完全ゲノムコドンバイアスおよびコドン対バイアス設計、非CGコドン対バイアス設計、濃度低下希少コドン設計、およびキャプシド領域にわたって広がるか、あるいはキャプシドのN末端の端部において分類されるか、またはキャプシドのC末端の端部において分類される、約150個の希少コドンを有するウイルスを含む。
実施例14
増加した毒性のウイルスを偶然に作製する可能性の試験
増加した毒性のウイルスを偶然に作製する可能性の試験
ウイルスゲノムのこれらのウイルスの弱毒化を目的とした再設計が、wtウイルスよりも毒性のウイルスを偶然に作製し得ることは、理論的には可能性がある。タンパク質配列は、SAVE方法において変化されないため、この結果は起こりそうもない。それでもやはり、SAVE方法が害のないものであることを実験的に証明することが望ましい。
PVタンパク質をコード化する可能性がある、考えられる10442の配列のうち、ある適度に適合した形のPVが、過去のある時点で発生し、局所的最適に進化した可能性がある(大域的最適とは対照的)。同一タンパク質コーディング能力だが、非常に異なるコドンセットを有する新しい形のPVの生成は、この新ウイルスを大域的適応度地形上の異なる位置に配置し、それは、wtPVよりも異なる局所的最適に近い可能性がある。考えられる限りでは、この新局所的最適は、野生型の局所的最適よりも良好であり得る。したがって、同義コドンのシャッフルがより適合したウイルスを作製する可能性はほとんどない。
この可能性を調査するために、13個のPVゲノム、最良のコドンバイアスを有する1個のウイルス、最良のコドン対バイアス(すなわち、PV−Max)を有する1個のウイルス、最良のコドンおよびコドン対バイアスを有する1個のウイルス、およびwtコドンおよびコドン対バイアスであるが、シャッフルされた同義コドンを有する、10個のさらなるウイルスを再設計および合成した。二次構造、C+G含有量、およびCGジヌクレオチド含有量等の他のパラメータは、wtレベルに可能な限り近く保持される。
これらの13個のウイルスはそれぞれ、互いおよび野生型とは、大域的適応度地形の非常に異なる位置にある場合がある。しかしながら、それらは選択の対象になっていないため、それらのうち1つも局所的最適にはない。13個のウイルスおよびwtが、継代され、サンプルウイルスが、1代、10代、20代、および50代継代において採取される。それらの適応度は、プラークサイズ、一段増殖曲線におけるプラーク形成単位/ml、および1細胞当たり形成される粒子数を評価することによって、互いおよびwtと比較される。実施例1を参照されたい。13個のウイルスの各々の5個の例は、10代、20代、および50代継代後に配列される。CD155tgマウスにおける病原性に対して、選択された継代の単離株が試験され、LD50が決定される。これらのアッセイは、ウイルスのいずれかが、wtよりも適合しているかどうかを明らかにし、特に毒性のウイルスの偶発的産生のリスクの定量的測定を提供する。コドンおよびコドン対バイアスのwtレベルを有する10個のウイルスはまた、コード化レベルでの適応度地形の多様性に関する情報を提供する。
より適合したウイルスが生じ得、より適合したウイルスが、より危険なウイルスであり得る可能性を考慮して、これらの実験がBSL3研究室において行われる。10代継代後に、表現型および配列が評価され、PV特異的抗体による中和への新たなウイルスの感受性が検証される。有意に適合したウイルスへの進化、または抗体中和を回避する新しいタンパク質配列への系統的進化のいかなる証拠が得られた場合も、実験は中止および再検討される。表現型および配列は、50代継代に進む前の20代継代後に同様に評価される。wtウイルスと全く同一のタンパク質をコード化するために、合成ウイルスが作製されるため、適応度の(わずかな)増加への進化が認められたとしても、毒性増加の余地は非常に限られているように思われる。
実施例15
ポリオウイルス以外のウイルス系へのSAVE方法の拡張
ポリオウイルス以外のウイルス系へのSAVE方法の拡張
ポリオ根絶における国際努力の最終段階での復帰の可能性に対抗するための、新しいポリオワクチンの潜在的な必要性にもかかわらず、PVは、主にSAVEの開発のためのモデル系として、本研究において選択された。しかしながら、SAVEは、この方法が、ワクチンが必要とされる他のウイルスに拡張することができることを見込んで開発されてきた。SAVE戦略のこの拡張は、本明細書では、ライノウイルス、風邪の原因病原体、およびインフルエンザウイルスへの適用によって例示される。
ヒトライノウイルス−ポリオウイルスと密接な関係があるウイルスへのSAVEの適応
いくつかの理由によって、SAVE方法を試験するために、2個のモデルライノウイルス、HRV2およびHRV14を選択した。それらの理由は、(1)HRV2およびHRV14は、2個の異なる遺伝子サブグループ、AおよびBの2つのメンバーを表す(Ledford et al., 2004)こと、(2)これらの2個のモデルウイルスは、異なる受容体、LDL受容体およびICAM−1をそれぞれ使用する(Greve et al., 1989、Hofer et al., 1994)こと、(3)両方のウイルスならびにそれらの感染性DNAクローンは、広く使用されており、最も適用できる材料および方法が確立されていること(Altmeyer et al., 1991、Gerber et al., 2001)、および(4)ライノウイルスの利用可能な分子知識の大部分が、これらの2個の血清型の研究から生じていることである。
PV実験を通して開発された、最も期待できるSAVE 戦略が、HRV2およびHRV14のゲノムに適用される。例えば、コドン、コドン対、二次構造、またはそれらの組み合わせは脱最適化される。弱毒化の程度が異なる2〜3個のゲノムは、各遺伝子型に対して合成される。約60個のヌクレオチドの重要な RNA二次構造であるCREを変化させないように、注意が払われる(Gerber et al., 2001、Goodfellow et al., 2000、McKnight, 2003)。この要素は、ピコルナウイルスの複製に不可欠であり、したがって、ゲノムの再設計時に、構造自体が維持されなければならない。ゲノムにおけるCREの一は、異なるピコルナウイルスに対して異なるが、ほとんどの科に関して既知であり(Gerber et al., 2001、Goodfellow et al., 2000、McKnight, 2003)、実験的証拠が欠けている他のためのホモロジーモデリングによって推定することができる。HRV2の場合は、CREは、非構造タンパク質2Aproに対応するRNA配列に位置し、HRV14のCREは、VP1キャプシドタンパク質領域に位置する(Gerber et al., 2001、McKnight, 2003)。
DNAゲノム等価物からライノウイルスを得るための逆遺伝学系は、ウイルスキャプシドを安定化するために、3mMのMg++を含有するヘペス緩衝培養培地において、34℃で、導入がHeLa−H1細胞に行われることを除いて、PVに関して上記に記載されるものと基本的に同一である。PFU/IUの比を決定するために、得られる合成ウイルスは組織培養で分析される。実施例3を参照されたい。一段増殖曲線におけるプラークサイズおよび速度もまた、記載の通りに分析される。実施例2を参照されたい。SAVEプロセスは、全ての100個ほどの関連ライノウイルスに比較的安価に適用することができるため、この方法を使用して風邪のための安全かつ効果的なワクチンを産生することは、実現可能である。
インフルエンザAウイルス−ポリオウイルスと無関係のウイルスへのSAVEの適応
PV実験から同定される、最も期待できるSAVE設計基準が、コドン脱最適化型のインフルエンザウイルスを合成するために使用される。インフルエンザウイルスは、RNAの8個の別々の断片から成る「セグメント化」ウイルスであり、これらの各々は、コドン改変することができる。インフルエンザウイルス株A/PR/8/34の変異体を生成するために、十分に確立したアンビセンスプラスミド逆遺伝学系が使用される。この8プラスミド系は、すでに記載されているものの変異形であり(Hoffmann et al., 2000)、Drs. P. Palese and A. Garcia−Sastreによって好意的に提供された。簡潔に、別々のプラスミドにそれぞれ含有される、インフルエンザの8個のゲノム断片は、アンチセンス鎖上の3’末端におけるPol Iプロモータ、および5’末端におけるPol Iターミネータによって隣接される。次に、このカセットは、順方向鎖上の5’末端におけるサイトメガロウイルスプロモータ(Pol IIプロモータ)、および3’末端におけるポリアデニル化シグナルによって隣接される(Hoffmann et al., 2000)。共培養された293TおよびMDCK細胞への同時導入の際、各アンビセンス発現カセットは、2種類のRNA分子を産生する。順方向鎖上のPol II転写単位は、ウイルスタンパク質のタンパク質合成に必要な全てのインフルエンザmRNAを産生する。逆方向鎖上のPol I転写単位は、リボ核タンパク質複合体の集合およびキャプシド形成に必要な、(−)センスゲノムRNA断片を産生する。したがって、感染インフルエンザA/PR/8/34粒子が形成される(図10)。H1 N1血清型のこの特定の株は、ヒトに対して比較的無害である。それは、組織培養細胞における増殖に適応されており、特に、BALB/cマウスにおいて病原性であるため、病因の研究に有用である。
代替としてスプライスされる断片(NSおよびM)を合成する場合、スプライス部位および代替的リーディングフレームを破壊しないように注意が払われる。全ての場合において、これらの配列が、RNA複製およびウイルス集合のシグナルを含有することが既知であるために、各断片の両端部における末端120ntは除外される。各フラグメントの少なくとも2個の形が合成される(中程度および最大脱最適化)。1つの断片のみが改変されるウイルスが生成され、効果が評価され、必要に応じて、より多くの改変された断片が導入される。これは、各断片が別々のプラスミド上にあるため、この系においては容易である。
ウイルス感染性は、1ug/ml(TPCK)トリプシンの存在下での、MDCK細胞へのプラークアッセイによって力価決定される。あるいは、異なるウイルス構築物の数に応じて、基本的に、PVに関して上記に記載されるMDCK細胞上の細胞感染単位として、種々のウイルスの力価を決定するために、96ウェルELISAが使用される。実施例3を参照されたい。唯一の違いは、ここでは、感染細胞を染色するために、HA特異的抗体が使用されるという点である。加えて、ビリオンの相対濃度は、標準的なプロトコル(Kendal et al., 1982)を使用した、ニワトリ赤血球細胞(RBC)(Charles River Laboratories)を使用した、赤血球凝集(HA)アッセイによって決定される。簡潔に、ウイルス懸濁液は、V底96ウェルプレートにおけるPBS中で2倍に連続希釈される。PBSのみが、アッセイ対照として使用される。標準化された量のRBCが各ウェルに添加され、プレートは簡単に撹拌され、室温で30分間インキュベートされる。HA力価は、完全な赤血球凝集を有する最後のウェルにおける、ウイルスの逆希釈として読み取られる。HA力価が、存在する粒子量の直接的な結果であるが、PFU力価は、感染性の機能的測定値である。両方の測定値を決定することによって、相対的なPFU/HA単位の比は、PV実験において記載されるPFU/粒子の比と同様に計算される。実施例3を参照されたい。これは、コドンおよびコドン対脱最適化インフルエンザウイルスもまた、PVに対して認められたように、より低いPFU/粒子を示すかどうかという課題に対処する。
毒性試験
致死量50(LD50)の親NPR/8/34ウイルスは、最初にマウスに対して決定され、合成インフルエンザウイルスが、鼻内感染によるBALB/cマウスの感染に対して選択される。LD50値を決定するための方法は、当業者にはよく知られている(Reed and Muench, 1938、および実施例4を参照)。理想的な候補ウイルスは、高いビリオン濃度(高いHA−力価)を有する、低い感染性(低いPFU力価)を示す。麻酔されたマウスに、102から107PFUの間のウイルスの10倍連続希釈を含有する、PBS中の25μlのウイルス溶液が各鼻孔に投与される。死亡率および罹患率(体重減少、活性低下)は、1日2回、最大で3週間監視される。LD50は、Reed and Muench(1938)の方法によって計算される。A/PR/8/34wtウイルスに対して、予測LD50は、約103PFU(Talon et al., 2000)であるが、ウイルスが力価決定される特定の実験室条件に応じて異なり得る。
デング熱、HIV、ロタウイルス、およびSARSへのSAVEの適応
SAVE方法をさらに試験するために、いくつかのウイルスを選択した。表8は、デング熱、HIV、ロタウイルス(2個の断片)、およびSARSの各々のコード領域を示し、親ウイルス、および脱最適化されたコドン対バイアスを有する例示的なウイルスゲノム配列に対する、ヌクレオチド配列を提供する。上記のように、コドン対バイアスは、一部のみ(部分列)が脱最適化変異を含有する場合があるが、コード配列に対して決定される。
実施例16
マウスにおけるポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスワクチン候補の評価
マウスにおけるポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスワクチン候補の評価
脱最適化されたウイルスが、マウスにポリオまたはインフルエンザの予防接種をする能力を試験する。
ポリオウイルス免疫、抗体力価、およびwt抗原投与実験
作業仮説は、良好なワクチン候補は、低い感染性力価を高いビリオン力価と併せ持つということである。これは、低いリスクプロファイルを有しながら、大量のウイルス粒子(すなわち、抗原)を注射することができることを確実にする。したがって、5匹のCD155tgマウスの群は、103、104、105、および106PFUのPV(Mahoney)(すなわち、野生型)、PV1サビンワクチン株、PVAB2470−2954、PV−Min755−2470、または本研究中に開発された、他の期待できる弱毒化ポリオウイルスを腹腔内に注射される。野生型に対して、1PFUは約100個のウイルス粒子であるが、弱毒化ウイルスに対しては、1PFUは約5,000〜100,000個の粒子である。したがって、同数のPFUでの注射は、弱毒化ウイルスの50〜1000倍多い粒子が注射されていることを意味する。腹腔内に注射されたwtウイルスに対して、LD50は、約106PFUまたは約108粒子である。したがって、低用量ではなく、最大用量である程度の死亡が予測される。
同一用量の追加接種が、最初の接種の1週間後および4週間後に行われる。2回目の追加免疫の1週間後、プラーク減少アッセイによって、PV中和抗体力価が決定される。この目的で、100PFUのwtPV(M)ウイルスが、免疫化マウスからの血清の2倍連続希釈でインキュベートされる。プラークアッセイによって、PFUの残余数が決定される。中和抗体力価は、プラークが認められない最低血清希釈の逆数として表される。
最後の追加免疫の4週間後、免疫化マウスおよび非免疫化対照は、致死量のPV(M)wtウイルス(106PFU、腹腔内。これは、LD50の100倍に等しい)を抗原投与され、生存が監視される。
インフルエンザ免疫、抗体力価、およびwt抗原投与実験
ワクチン接種実験のために、5匹のBALB/cマウスの群は、0.001、0.01、0.1、および1.0LD50の用量で、wtおよび弱毒化インフルエンザウイルスを腹腔内に注射される。追加のワクチン接種は、PVに関して上記に記載されるものと同一の間隔で行われる。赤血球凝集(HI)阻害アッセイ、続いて標準的なプロトコルによって、2回目の追加免疫の1週間後のインフルエンザ抗体力価が決定される(Kendal et al., 1982)。簡潔に、受容体破壊酵素(RDE; Sigma, St Louis, MO)で処理された、免疫化マウスおよび対照マウスからの血清は、2倍連続希釈され、V底96ウェルにおける5HA単位のA/PR/8/34ウイルスと混合される。次いで、RBCが添加され、プレートは、標準的なHAアッセイに関する上記の通り処理される。抗体力価は、赤血球凝集の完全阻害をもたらす逆希釈として表される。
最後の追加のワクチン接種の3週間後、マウスは、100または1000LD50のA/PR/8/34親ウイルス(約105および106PFU)を鼻腔内に抗原投与され、生存が監視される。
動物の取り扱い
ヒトポリオウイルス受容体CD155(CD155tg)を発現する遺伝子導入マウスは、Dr. Nomoto、The Tokyo Universityから得た。CD155tgマウスコロニーは、State University of New York(SUNY)の動物施設によって維持される。BALB/cマウスは、Taconic(Germantown, NY)から得られる。麻酔マウスは、静脈内、腹腔内、もしくは脳内経路によって30μlのウイルス懸濁液、または鼻腔内経路によって50u1を、25ゲージの皮下注射針を使用して接種される。6〜24週齢の両方の性別のマウスが使用される。マウスは、ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルス研究の最も経済的なモデル系である。加えて、PVの場合、CD155tgマウス株は、非ヒト霊長類を除くと唯一の動物モデルである。マウスはまた、ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスの両方に対して、動物間でのウイルス拡大が起こらないため、最も安全な動物モデルを提供する。
全てのマウスは、Department of Laboratory Research(DLAR)およびその獣医スタッフの指揮下で、SUNYの最先端の動物施設に収容される。全ての動物は、獣医スタッフによって週2回検査される。ウイルスに感染した動物は、治験責任医師によって1日2回、および獣医スタッフによって毎日検査される。全ての感染実験は、動物施設内の特別に指定された最大隔離室において行われる。実験が終了した後に、生存しているマウスは安楽死され、死体は、オートクレーブによって殺菌される。ウイルス室に生きたまま残っているマウスは1匹もいない。
本研究において、マウスは、静脈内、脳内、腹腔内、筋肉内、または鼻腔内接種、麻酔注射、および血液サンプルの採集以外に、いかなる外科的処置も受けない。ワクチン接種実験のために、ウイルス特異的抗体の検出のために、ワクチン接種の前後に血液サンプルが採集される。この目的を達成するために、注射の1日前、および2回目の追加のワクチン接種の1週間後に、50〜100μlがマウスか採取される。個々の動物への最大で2回の血液サンプルは、少なくとも4週間間隔で採取される。動物は麻酔され、尾を2mm切断するために、鋭い外科用メスが使用される。毛細管で血液が採取される。後続のサンプリングは、尾のかさぶたを除去することによって得られる。尾が治癒した場合、新しく尾を2mm切り落とすことが繰り返される。
全ての動物実験は、SUNY Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認されているプロトコルに従って行われる。安楽死は、American Veterinary Medical Associationの推奨に従って、CO2ガス室において訓練されたスタッフによって実行される。感染実験は、Centers for Disease Control and Prevention(CDC)によって発行されたABSL 2/ポリオに関する最新の推奨の下で行われる。
実施例17
コドン対バイアスアルゴリズム−コドン対バイアスおよびスコアマトリクス
コドン対バイアスアルゴリズム−コドン対バイアスおよびスコアマトリクス
ほとんどの生物において、明確なコドンバイアスが存在し、それは、他よりも頻繁に、特定のコドンによってコード化されているアミノ酸の選好を表す。コドンバイアスは、タンパク質翻訳速度と関係があると広く考えられている。加えて、各種は、コドン対バイアスと呼ばれる、所与のコドンペアが遺伝子配列中の隣接として現れるかどうかに関する特定の選好を有する。
コドン対バイアスを定量化するために、我々は、コドン対距離を、生物の遺伝子におけるコドン対の発生予測数(頻度)に対する実測数の対数比として定義する。遺伝子セットにおけるコドン対の実測頻度の計算は直接的であるが、コドン対の予測頻度は、Gutman and Hatfield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3699−3703, 1989にあるように計算され、アミノ酸およびコドンバイアスとは無関係である。それを達成するために、予測頻度は、アミノ酸が特異的なコドンによってコード化される回数の相対的割合に基づいて計算される。要するに、
であり、式中、コドン対ABは、アミノ酸対XYをコード化し、Fは頻度(発生数)を示す。
このスキームにおいて、我々は、上記に定義されるような全ての対コストを有する、64×64コドンペア距離マトリクスを定義することができる。いかなる m残基タンパク質も、そのコード化を含むコドン対スコアの平均によって、過剰または過少に存在するコドン対を使用して、評価することができる。
コドン対バイアスに基づく遺伝子コード化の最適化
特異的なタンパク質の翻訳へのコドン対バイアスの効果を検査するために、我々は、同一コドン分布を維持しながら、コドン対を変化させることを決定した。したがって、我々は、以下の問題を定義する。アミノ酸配列およびコドン頻度(コドン分布)セットを所与として、コドン対スコアが最適化(通常、最小化または最大化)されるように、配列のDNAコード化を変化させる。
上記に定義されるような我々の問題は、巡回セールスマン問題(TSP)と関連づけることができる。巡回セールスマン問題は、最もよく知られたNP完全問題である。これは、その一般的な実用性の機能であり、広く一般に説明することが容易であるためである。車で所与の都市セットの各々を訪問しなければならない巡回セールスマンを想像されたい。彼がそうして帰宅することを可能にする、したがって、彼の全運転を最小化する最短ルートは何か。
TSPヒューリスティック
TSPのほとんど全ての特色は、NP完全になるため、進めるための正しい方法はヒューリスティックによる。これらは、非常にうまくいくことが多く、典型的に、数パーセントの最適解に近づき、それは、ほとんどの用途に対して、特に我々の最適化されたコード化に対して十分に近い。
最小全域木−特に部位が平面中の点を表す場合の、単純かつ一般的なヒューリスティックは、点の最小全域木に基づいている。この木の深さ優先探索を行うことによって、新しい頂点を発見した時に下に行くのに1回、および引き返す時に上に行くのに1回の、ちょうど2回、木の各エッジを歩く。次いで、頂点が発見された順序に従って頂点の巡回路を定義し、それらを接続するために、この順序での頂点の各隣接対間の最短経路を使用することができる。この経路は、平面内の点と同様に、グラフが完全であり、三角不等式に従う場合、単一エッジでなければならない。得られる巡回路は、常に、最大でも最小TSP巡回路の長さの2倍である。実際には、それより良好である場合が多く、典型的には最適よりも15%〜20%超である。さらに、アルゴリズムの時間は、最小全域木を算出する時間によって制限され、平面内の点の場合は
のみである。
逐次添加法−異なる種類のヒューリスティックは、巡回路が完全になるまで1つずつ部分的巡回路に新しい点を挿入する(単一頂点から開始)。最良に機能すると考えられるこのヒューリスティックの形は、最も離れた点挿入であり、全ての残りの点のうち、部分的巡回路Tに点vを挿入し、
になるようにする。最小値は、巡回路への最短距離を追加する位置への頂点の挿入を確実にし、最大値は、最初に最悪のそのような頂点を選択することを確実にする。詳細に記入する前に、最初に部分的巡回路を「大まかに描く」ため、これは、良好に機能するように思われる。典型的に、そのような巡回路は、最適よりもほんの5%〜10%長い。
k最適巡回路−かなりより強力なのは、Kernighan−Linまたはk−optの種類のヒューリスティックである。方法は、任意の巡回路から始まり、それを改善することを求めて、巡回路に局所的微調整を適用する。特に、
のエッジのサブセットは、巡回路から削除され、サブチェーンを残しているkは、得られる巡回路が改善されているかどうかを見るために、異なる方法で繋ぎ直される。巡回路は、巡回路のコストを下げるために、kのサブセットが削除および繋ぎ直しすることができない場合に、k最適である。広範な実験は、3回の最適巡回路が、通常、最適巡回路コストの数パーセント内であることを示唆する。k>3に対して、算出時間は、解品質よりも大幅に速く増加する。巡回路の2選択は、いずれの他のヒューリスティックも改善するための迅速かつ効果的な方法である。シミュレーテッドアニーリングは、ヒューリスティックな巡回路を改善するために、エッジフリップを採用するための代替的機構を提供する。
最適コード化問題を解決するためのアルゴリズム
定義される我々の問題は、64の国の測量基準の下で巡回セールスマン経路(巡回路ではない)を見つけることに関する問題と関連する。この定式化において、64個の考えられるコドンの各々は、国に類似しており、コドン多様性は、国の都市の数として形作られる。コドン対バイアス測定は、国の距離マトリクスとして反映される。
コドン対バイアス測定下で遺伝子/DNA配列を最適化するために、コドン多様性の所与のセットを使用して、特異的なタンパク質をコード化する遺伝子の設計に関する実際の生物学的問題は、わずかに異なる。国TSPモデルにおける我々のモデルに欠けているものは、特異的なタンパク質配列をコード化する必要性である。DNAトリプレットコードは、21個の等価クラスに64個のコドンを分割する(20個の考えられるアミノ酸の各々および停止記号のコーディング)。いずれの所与のタンパク質/アミノ酸配列も、それをコード化するための関連コドンの等価クラスの任意の代表を選択することによって、特定することができる。
特別な制限および我々の問題の本質、ならびに最適化におけるさらなる基準の適用へのその適応性の理由から、我々は、配列を最適化するために、シミュレーテッドアニーリングヒューリスティックを選択した。技術は、以下に要約される。
シミュレーテッドアニーリングヒューリスティック
シミュレーテッドアニーリングは、より高価な(したがって劣る)解をもたらす、偶発的移行を可能にするヒューリスティック探索法である。これは、利点のように思われない可能性があるが、それは、我々の探索が局所的最適から抜け出せなくなることを防ぐ働きをする。
シミュレーテッドアニーリングのひらめきは、溶融物質を個体の状態に冷却する物理的プロセスから来ている。熱力学的理論において、系のエネルギー状態は、それを構成する粒子の各々のエネルギー状態によって示される。各粒子のエネルギー状態は、不規則にジャンプし回り、そのような移行は、系の温度によって影響される。特に、
は、
によって得られ、式中、ボルツマン定数と呼ばれるkBは定数である。この式は何を意味するのか。異なる条件下で指数値を考慮されたい。高エネルギー状態からより低いエネルギー状態への移動の確率は、非常に高い。しかしながら、高エネルギー状態への移行が許容され、小エネルギーが大エネルギーよりもジャンプする可能性がはるかに高い、非ゼロ確率もある。温度が高いほど、そのようなエネルギージャンプが生じる可能性も高い。
これは、組み合わせ最適化に対してどのような関連性を有するのか。物理系は、それが冷却すると、最小エネルギー状態になろうとする。いかなる別々の粒子セットに対しても、全エネルギーの最小化は、組み合わせ最適化の問題である。上記の確率分布に従って生成される不規則な移行を通して、我々は、任意の組み合わせ最適化の問題を解決するための物理学をシミュレートすることができる。
局所的探索と同様に、問題表示は、解空間の表示、および所与の解の質を測定する、適切かつ容易に計算可能なコスト関数の両方を含む。新しい構成要素は、冷却計画であり、そのパラメータは、我々が時間の関数として悪い移行を許容する可能性の程度を制御する。
探索の開始時に、我々は、良好ではない移行を許容する確率が高くなるように、乱雑度を使用して探索空間を広く調査することに意欲的である。探索が進むにつれて、我々は、局所的な改善および最適化に移行を制限しようと努める。冷却計画は、以下のパラメータによって調整される。
初期の系温度−典型的には、
である。
温度減少関数−典型的には、
であり、式中、
である。これは、線形減少とは異なり、温度の指数関数的減衰を暗示する。
温度変化間の反復数−典型的には、100〜1,000回の反復が、温度が低下する前に可能であり得る。
許容基準−典型的な基準は、
である時に、
のいかなる移行も許容すること、および
である場合はいつでも良好ではない移行を許容することであり、式中、
の乱数である。
停止基準−典型的に、現在の解の値が、最後の反復ほどのうちに変化または改善されていない場合、探索は終了し、現在の値が報告される。
専門家の手に委ねると、TSPに対する最適な問題特異的ヒューリスティックは、シミュレーテッドアニーリングよりわずかに機能が優れているが、シミュレーテッドアニーリング解は、容易かつ見事に機能する。
[参考文献]
Claims (81)
- 弱毒化ウイルスであって、それが由来する親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少ないコドン対バイアスを有する改変タンパク質コード化配列を含むウイルスゲノムを含む、弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約0.05少ないコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約0.1少ないコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、前記親タンパク質コード化配列のコドン対バイアスよりも少なくとも約0.2少ないコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、約−0.05以下のコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、約−0.1以下のコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、約−0.3以下のコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、約−0.4以下のコドン対バイアスを有する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、前記親ウイルスのタンパク質コード化配列と90%未満同一である、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、前記親ウイルスのタンパク質コード化配列と80%未満同一である、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列および前記親タンパク質コード化配列は、同一タンパク質をコード化する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、天然単離株と約10アミノ酸以下だけ異なるタンパク質をコード化する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、天然単離株と約20アミノ酸以下だけ異なるタンパク質をコード化する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約100ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約500ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列は、少なくとも約1000ヌクレオチドの長さにわたり改変される、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスは、動物または植物を感染させる、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記動物はヒトである、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスは、動物宿主における防御免疫応答を誘発する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記改変タンパク質コード化配列の復帰は、宿主中で生育された場合実質的に阻害される、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスは、DNA、RNA、2本鎖、または1本鎖ウイルスである、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記タンパク質コード化配列は、ポリタンパク質をコード化する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ヌクレオチド配列は、キャプシドタンパク質をコード化する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスは、ポリオウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、伝染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、または黄熱病ウイルスである、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、またはアデノウイルスである、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記弱毒化ポリオウイルスは、ポリオウイルス1型(Mahoney)、ポリオウイルス2型(Lansing)、ポリオウイルス3型(Leon)、1価経口ポリオワクチン(OPV)ウイルス、または3価OPVウイルスに由来する、請求項24に記載の弱毒化ウイルス。
- ヌクレオチド置換が、前記改変タンパク質コード化配列全体に分布する、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ヌクレオチド置換は、前記改変タンパク質コード化配列の一部分に限定される、請求項1に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記部分は、前記キャプシドの1つ以上のタンパク質をコード化する、請求項27に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはピコルナウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ピコルナウイルスはポリオウイルスである、請求項30に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号4またはその一部分を含む、請求項31に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号6を含む、請求項31に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ピコルナウイルスはライノウイルスである、請求項30に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号30、または配列番号32、またはそれらの一部分を含む、請求項34に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはオルソミクソウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記オルソミクソウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項36に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号14、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号28、およびそれらの一部分のうちの1つ以上を含む、請求項37に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号23を含む、請求項37に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号15および配列番号21を含む、請求項37に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはフラビウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記フラビウイルスはデングウイルスである、請求項41に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号34を含む、請求項42に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはレトロウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項44に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号36を含む、請求項45に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはレオウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記レオウイルスはロタウイルスである、請求項47に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号38および/または配列番号40を含む、請求項48に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスはコロナウイルスである、請求項1から29のうちのいずれか1項に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群(SARS)ウイルスである、請求項50に記載の弱毒化ウイルス。
- 前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチド配列は、配列番号42を含む、請求項51に記載の弱毒化ウイルス。
- 弱毒化ウイルスゲノムの作製方法であって、
a)親ウイルスのタンパク質コード化領域のヌクレオチド配列を取得するステップと、
b)前記ヌクレオチド配列のコドンを再編成して、
i)前記親ウイルスの前記コード領域と同一のアミノ酸配列をコード化し、
ii)前記親ウイルスの前記コード領域と比較して減少したコドン対バイアスを有する、変異ヌクレオチド配列を取得するステップと、
c)前記変異ヌクレオチド配列のすべてまたは一部を、前記親ウイルスの前記ヌクレオチド配列に置換するステップと、を含む、方法。 - 前記コドンを再編成するステップは、同一アミノ酸をコード化するコドン対を無作為に選択および交換し、コドン対バイアスが前記交換により減少したかどうかを判定するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記ステップは、前記コドン対バイアスが所望の量減少するまで繰り返される、請求項54に記載の方法。
- 前記ステップは、前記コドン対バイアスが最適値に、またはその近傍に収束するまで繰り返される、請求項54に記載の方法。
- ステップ(a)および(b)はコンピュータ上で実行される、請求項53から56のうちのいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)は、前記変異ヌクレオチド配列の新規合成により達成される、請求項53に記載の方法。
- ゲノム全体が前記合成されたDNAと置換される、請求項58に記載の方法。
- 前記ウイルスゲノムの一部分が、前記合成されたDNAと置換される、請求項58に記載の方法。
- 前記親ウイルスは天然単離株である、請求項49に記載の方法。
- 前記親ウイルスは天然単離株の変異体である、請求項49に記載の方法。
- 請求項53に記載の方法により作製される弱毒化ウイルスゲノムを宿主生物に挿入するステップを含み、それにより弱毒化ウイルスが産生される、弱毒化ウイルスの作製方法。
- 請求項1から52のうちのいずれかの弱毒化ウイルスと、薬剤として許容される担体とを含む、対象における防御免疫応答を誘発するためのワクチン組成物。
- 前記弱毒化ウイルスは、(i)感染細胞におけるウイルスタンパク質の合成およびプロセシングを実質的に変化させず、(ii)感染細胞当たり野生型ウイルスと類似した量のビリオンを産生し、および/または(iii)前記野生型ウイルスよりもかなり低いビリオン特異的感染性を呈する、請求項64に記載のワクチン組成物。
- 前記弱毒化ウイルスは、宿主動物において、前記対応する野生型ウイルスと実質的に類似した免疫応答を誘発する、請求項64に記載のワクチン組成物。
- 対象における防御免疫応答を誘起するための方法であって、前記対象に、予防上または治療上有効な用量の請求項64に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記対象は、病原性ウイルスに曝されている、請求項67に記載の方法。
- ウイルス関連の疾病に罹患するのを予防するための方法であって、前記対象に、予防上有効な用量の請求項64に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記対象は、病原性ウイルスに曝されている、請求項69に記載の方法。
- ウイルスに感染した対象におけるウイルス関連の疾病の発症を遅延させるか、またはその進行速度を遅らせるための方法であって、前記対象に、治療上有効な用量の請求項64に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記対象に、少なくとも1つのアジュバントを投与するステップをさらに含む、請求項67から71のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記対象は、哺乳動物または鳥類である、請求項67から71のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物はヒトである、請求項73に記載の方法。
- 前記鳥類は、家畜化された家禽種である、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物は、家畜化された家畜種である、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物はウシである、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物はブタである、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物はヒツジである、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物はウマである、請求項73に記載の方法。
- 前記哺乳動物は、外来性の動物園の動物である、請求項73に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US90938907P | 2007-03-30 | 2007-03-30 | |
US60/909,389 | 2007-03-30 | ||
US6866608P | 2008-03-07 | 2008-03-07 | |
US61/068,666 | 2008-03-07 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501289A Division JP5733976B2 (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-31 | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015091247A true JP2015091247A (ja) | 2015-05-14 |
Family
ID=39808891
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501289A Active JP5733976B2 (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-31 | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
JP2014257141A Pending JP2015091247A (ja) | 2007-03-30 | 2014-12-19 | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501289A Active JP5733976B2 (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-31 | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9476032B2 (ja) |
EP (3) | EP3431099B1 (ja) |
JP (2) | JP5733976B2 (ja) |
KR (1) | KR101621100B1 (ja) |
CN (1) | CN103476425B (ja) |
AU (1) | AU2008232491B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0809600B1 (ja) |
CA (1) | CA2682089C (ja) |
DK (1) | DK2139515T4 (ja) |
HR (1) | HRP20181319T4 (ja) |
MX (2) | MX349825B (ja) |
PL (1) | PL2139515T5 (ja) |
WO (1) | WO2008121992A2 (ja) |
Families Citing this family (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0809600B1 (pt) * | 2007-03-30 | 2023-01-24 | The Research Foundation Of State University Of New York | Vírus atenuado útil para vacinas |
WO2010039649A2 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Flavivirus-based system for production of hepatitis c virus (hcv) |
EP2391713A1 (en) | 2009-01-30 | 2011-12-07 | The Board Of Regents For Oklahoma State University | Immunogenic compositions, vaccines and diagnostics based on canine distemper viruses circulating in north american dogs |
EP2403527A4 (en) * | 2009-03-06 | 2012-11-14 | Sinai School Medicine | LIVELY WEAKED INFLUENZA VIRUS VACCINES WITH MICRORNA REACTION ELEMENTS |
WO2011044561A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | The Research Foundation Of State University Of New York | Attenuated influenza viruses and vaccines |
EP2490268A1 (en) * | 2011-02-03 | 2012-08-22 | Imec | Method for fabricating photovoltaic cells |
EP2751260A2 (en) * | 2011-09-02 | 2014-07-09 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Live attenuated influenza virus |
CN104204196A (zh) * | 2011-12-16 | 2014-12-10 | 纽约州州立大学研究基金会 | 新型减毒脊髓灰质炎病毒:PV-1单-cre-X |
US20140363469A1 (en) * | 2012-01-19 | 2014-12-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Viral attenuation and vaccine production |
EP4190895A1 (en) * | 2013-02-08 | 2023-06-07 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Attenuation of human respiratory syncytial virus by genome scale codon-pair deoptimization |
CN105189756B (zh) * | 2013-03-14 | 2021-06-11 | 爱默蕾大学 | 具有沉默突变的重组rsv、其相关疫苗和方法 |
DK2969005T3 (da) * | 2013-03-15 | 2020-01-20 | The Resaerch Foundation For The State Univ Of New York | Attenuerede influenzavira og -vacciner |
CN104056276B (zh) * | 2013-03-20 | 2017-05-10 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法 |
CN104419687B (zh) * | 2013-09-03 | 2017-03-15 | 中国农业大学 | 重组PRRS病毒HV‑nsp29及其应用 |
US10400220B2 (en) | 2014-09-05 | 2019-09-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Attenuated virus having multiple hosts |
US10731227B2 (en) | 2014-12-12 | 2020-08-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions, kits, and methods to detect HIV virus |
WO2017099801A1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions, kits, and methods to detect hiv virus |
EP3050962A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-03 | Institut Pasteur | RNA virus attenuation by alteration of mutational robustness and sequence space |
EP3303571A4 (en) * | 2015-06-04 | 2018-10-17 | The University of Hong Kong | Live-attenuated virus and methods of production and use |
EP3355899A4 (en) * | 2015-09-30 | 2019-04-03 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | In place of EVOLUTIONARY PRESERVED RNA STRUCTURE MUTATED APPROVED VIRUS |
US11235050B2 (en) | 2015-10-29 | 2022-02-01 | Emory University | Chimeric RSV, immunogenic compositions, and methods of use |
CN105821009B (zh) * | 2016-04-05 | 2019-07-26 | 中国人民解放军第三〇二医院 | 靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用 |
EP3472319B1 (en) | 2016-06-15 | 2024-03-27 | President and Fellows of Harvard College | Methods for rule-based genome design |
EP3488239A1 (en) * | 2016-07-22 | 2019-05-29 | Verily Life Sciences LLC | Quantitative massively parallel proteomics |
US11149255B2 (en) * | 2016-09-06 | 2021-10-19 | Bioventures, Llc | Compositions and methods for generating reversion free attenuated and/or replication incompetent vaccine vectors |
CN106650307B (zh) * | 2016-09-21 | 2019-04-05 | 武汉伯远生物科技有限公司 | 一种基于密码子对使用频度的基因密码子优化方法 |
WO2018057950A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Vaccine candidates for human respiratory syncytial virus (rsv) having attenuated phenotypes |
CN106520832B (zh) * | 2016-11-17 | 2020-02-18 | 新乡医学院 | 双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用 |
EA201991319A1 (ru) * | 2016-11-30 | 2019-11-29 | Вакцины аттенуированного свиного гриппа и способы их изготовления и применения | |
AR111770A1 (es) | 2017-05-05 | 2019-08-21 | Elanco Us Inc | Vacuna para enfermedad respiratoria bovina |
JP2020530765A (ja) * | 2017-07-17 | 2020-10-29 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | リサウイルス抗原構築物 |
CN111511397A (zh) * | 2017-12-22 | 2020-08-07 | 科达金尼克斯有限公司 | 具有密码子对去优化区域的重组病毒及其用于治疗癌症的用途 |
CN108586608A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-28 | 四川农业大学 | 一种dhav-1 2c蛋白多克隆抗体、重组融合蛋白及其制备方法 |
CN109504662B (zh) * | 2018-11-09 | 2022-06-10 | 浙江天元生物药业有限公司 | 一种柯萨奇病毒减毒株及其应用 |
CA3121430A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Heterologous prime boost vaccine compositions and methods |
EP4096712A4 (en) * | 2020-01-28 | 2024-05-08 | Codagenix Inc. | DE-OPTIMIZED SARS-COV-2 AND METHODS OF USE |
CN111321125B (zh) * | 2020-02-03 | 2022-07-19 | 广州医科大学 | 重组流感病毒及其在疫苗中的应用 |
CN111269895B (zh) * | 2020-02-03 | 2022-09-27 | 广州医科大学 | 甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用 |
WO2021191342A1 (de) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | Reinmueller Johannes | Virustatisches mittel |
CN111481663B (zh) * | 2020-04-09 | 2022-12-09 | 广州医科大学 | 一种流感病毒活疫苗及其制备方法 |
US20230143228A1 (en) * | 2020-04-21 | 2023-05-11 | Emory University | Coronavirus vaccines, compositions, and methods related thereto |
PE20230833A1 (es) * | 2020-05-27 | 2023-05-19 | Us Agriculture | Cepas vivas atenuadas de la fiebre aftosa modificadas por desoptimizacion y usos de estas |
EP4179074A1 (en) * | 2020-07-07 | 2023-05-17 | Codagenix Inc. | Method of producing modified virus genomes and producing modified viruses |
EP4181956A1 (en) * | 2020-07-16 | 2023-05-24 | Griffith University | Live-attenuated virus vaccine |
US20240018609A1 (en) * | 2020-08-19 | 2024-01-18 | City Of Hope | Lamp detection of sars-cov-2 in saliva for the rapid diagnosis of covid-19 |
CN112662633A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-16 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | II型草鱼呼肠孤病毒冷适应株GCRV-GD108ca及其应用 |
CA3223318A1 (en) * | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Muhammad Munir | Virus attenuation |
US20230274791A1 (en) * | 2021-11-29 | 2023-08-31 | The Chinese University Of Hong Kong | Codon de-optimization or optimization using genetic architecture |
WO2024036331A2 (en) * | 2022-08-12 | 2024-02-15 | Fred Hutchinson Cancer Center | Barcoded influenza viruses and mutational scanning libraries including the same |
CN117153270B (zh) * | 2023-10-30 | 2024-02-02 | 吉林华瑞基因科技有限公司 | 一种基因二代测序数据处理方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006511221A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-06 | バイカル インコーポレイテッド | ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン |
WO2006042156A2 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS represneted by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION | Modulation of replicative fitness by using less frequently used synonymous codons |
JP2010523086A (ja) * | 2007-03-30 | 2010-07-15 | ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステート・ユニヴァーシティー・オブ・ニュー・ヨーク | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6829494A (en) | 1993-08-02 | 1995-02-28 | Chiron Corporation | Recombinant constructs using replacement sequences in hypervariable regions |
US6537776B1 (en) | 1999-06-14 | 2003-03-25 | Diversa Corporation | Synthetic ligation reassembly in directed evolution |
US6352842B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-03-05 | Diversa Corporation | Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution |
US6238884B1 (en) | 1995-12-07 | 2001-05-29 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
US20040023327A1 (en) | 1995-12-07 | 2004-02-05 | Short Jay M. | End selection in directed evolution |
US6171820B1 (en) | 1995-12-07 | 2001-01-09 | Diversa Corporation | Saturation mutagenesis in directed evolution |
US6562594B1 (en) | 1999-09-29 | 2003-05-13 | Diversa Corporation | Saturation mutagenesis in directed evolution |
US6764835B2 (en) | 1995-12-07 | 2004-07-20 | Diversa Corporation | Saturation mutageneis in directed evolution |
EP2112220A3 (en) | 1996-07-15 | 2010-01-06 | The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
GB9705669D0 (en) † | 1997-03-19 | 1997-05-07 | British Tech Group | Attenuated polioviruses |
US6410023B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-06-25 | United States Of America | Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene |
EP0966538A1 (en) * | 1997-08-07 | 1999-12-29 | Altwell Biotech. Inc. | Replication-competent recombinant sabin type 1 strain of poliovirus |
EP1690868A1 (en) | 1997-10-31 | 2006-08-16 | Maxygen, Inc. | Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling |
GB9817082D0 (en) † | 1998-08-06 | 1998-10-07 | Btg Int Ltd | Attenuated poliovirus vaccine |
AU1199000A (en) | 1998-09-29 | 2000-04-17 | Maxygen, Inc. | Shuffling of codon altered genes |
CA2361927A1 (en) | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
AU4039400A (en) | 1999-03-26 | 2000-10-16 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
CA2291367A1 (en) * | 1999-12-06 | 2001-06-06 | Isabelle Henry | Genetic constructions having a reduced or an increased number of epigenetic control regions and methods of use thereof |
US20020076415A1 (en) | 1999-12-14 | 2002-06-20 | Jing-Hsiung Ou | Hepatitis C virus gene products |
AUPQ776100A0 (en) | 2000-05-26 | 2000-06-15 | Australian National University, The | Synthetic molecules and uses therefor |
GB0017990D0 (en) | 2000-07-21 | 2000-09-13 | Glaxo Group Ltd | Papilloma virus sequences |
WO2002008435A1 (en) | 2000-07-21 | 2002-01-31 | Glaxo Group Limited | Codon-optimized papilloma virus sequences |
IL155154A0 (en) | 2000-09-30 | 2003-10-31 | Diversa Corp | Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating |
ATE403152T1 (de) | 2000-10-17 | 2008-08-15 | Besst Test Aps | Test zum direkten nachweisen einer biologischen zelle in einer körperflüssigkeitsprobe |
US20030041354A1 (en) | 2000-10-17 | 2003-02-27 | Novozymes A/S | Transgenic plants |
AU2002326303A1 (en) * | 2001-05-25 | 2002-12-03 | Tao Biosciences, Llc | Methods for attenuation of virulence in bacteria |
CA2517394A1 (en) | 2003-02-28 | 2005-02-17 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services | Recombinant human metapneumovirus and its use |
WO2005024012A1 (en) | 2003-09-11 | 2005-03-17 | Novozymes A/S | Increased expression of a modified polypeptide |
EP1735451B1 (en) | 2004-04-07 | 2009-10-28 | Novozymes A/S | Mutated prokaryotic cells with high secretion-levels |
EP2644696B1 (en) | 2004-05-24 | 2015-07-15 | MedImmune, LLC | Method of increasing replication of a reassortant influenza virus in eggs. |
JP2008504839A (ja) | 2004-07-02 | 2008-02-21 | ヘンリー, エル. ニーマン, | コピーチョイス組換え及びその使用法 |
EP1781785B1 (en) | 2004-07-20 | 2010-11-10 | Novozymes, Inc. | Methods of producing mutant polynucleotides |
EP1773995B1 (en) | 2004-08-03 | 2009-10-07 | The Regents Of The University Of California | Site specific system for generating diversity protein sequences |
US8168771B2 (en) | 2005-01-31 | 2012-05-01 | The Johns Hopkins University | Use of consensus sequence as vaccine antigen to enhance recognition of virulent viral variants |
AU2006304268B2 (en) | 2005-10-14 | 2011-09-29 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Rabies virus vector systems and compositions and methods thereof |
CN106148288A (zh) | 2006-08-25 | 2016-11-23 | 美国国有健康与人类服务部(马里兰州) | 重组修饰的安卡拉痘苗病毒及其应用、质粒载体及其应用 |
US8216844B2 (en) | 2006-08-29 | 2012-07-10 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for improved protein production |
WO2008049782A1 (en) | 2006-10-24 | 2008-05-02 | Basf Se | Method of increasing gene expression using modified codon usage |
PL2082045T3 (pl) | 2006-10-24 | 2015-07-31 | Basf Se | Sposób zmniejszania ekspresji genów poprzez modyfikację częstości występowania kodonów |
US8298541B2 (en) | 2007-03-29 | 2012-10-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Live attenuated virus vaccines for La Crosse virus and other Bunyaviridae |
WO2009049351A1 (en) | 2007-10-15 | 2009-04-23 | The University Of Queensland | Construct system and uses therefor |
EP3355899A4 (en) | 2015-09-30 | 2019-04-03 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | In place of EVOLUTIONARY PRESERVED RNA STRUCTURE MUTATED APPROVED VIRUS |
JP7250520B2 (ja) | 2016-04-13 | 2023-04-03 | ヤンセン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | 組換えアルテリウイルスレプリコン系およびその使用 |
US11821111B2 (en) | 2019-11-15 | 2023-11-21 | Fred Hutchinson Cancer Center | Barcoded influenza viruses and deep mutational scanning libraries including the same |
-
2008
- 2008-03-31 BR BRPI0809600-7A patent/BRPI0809600B1/pt active IP Right Grant
- 2008-03-31 HR HRP20181319TT patent/HRP20181319T4/hr unknown
- 2008-03-31 KR KR1020097022782A patent/KR101621100B1/ko active IP Right Grant
- 2008-03-31 MX MX2014010788A patent/MX349825B/es unknown
- 2008-03-31 PL PL08799746.6T patent/PL2139515T5/pl unknown
- 2008-03-31 US US12/594,173 patent/US9476032B2/en active Active
- 2008-03-31 WO PCT/US2008/058952 patent/WO2008121992A2/en active Search and Examination
- 2008-03-31 CN CN200880018001.1A patent/CN103476425B/zh active Active
- 2008-03-31 DK DK08799746.6T patent/DK2139515T4/da active
- 2008-03-31 JP JP2010501289A patent/JP5733976B2/ja active Active
- 2008-03-31 EP EP18177156.9A patent/EP3431099B1/en active Active
- 2008-03-31 EP EP23219605.5A patent/EP4368202A2/en active Pending
- 2008-03-31 MX MX2009010549A patent/MX2009010549A/es active IP Right Grant
- 2008-03-31 EP EP08799746.6A patent/EP2139515B2/en active Active
- 2008-03-31 CA CA2682089A patent/CA2682089C/en active Active
- 2008-03-31 AU AU2008232491A patent/AU2008232491B2/en active Active
-
2014
- 2014-12-19 JP JP2014257141A patent/JP2015091247A/ja active Pending
-
2016
- 2016-09-07 US US15/258,584 patent/US10023845B2/en active Active
-
2018
- 2018-07-16 US US16/036,348 patent/US11162080B2/en active Active
-
2021
- 2021-10-28 US US17/513,032 patent/US20220298492A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006511221A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-06 | バイカル インコーポレイテッド | ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン |
WO2006042156A2 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS represneted by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION | Modulation of replicative fitness by using less frequently used synonymous codons |
JP2010523086A (ja) * | 2007-03-30 | 2010-07-15 | ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステート・ユニヴァーシティー・オブ・ニュー・ヨーク | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 80, no. 19, JPN6013017460, 2006, pages 9687 - 9696, ISSN: 0003223687 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5733976B2 (ja) | ワクチンに有用な弱毒化ウイルス | |
Vialat et al. | Mapping of the mutations present in the genome of the Rift Valley fever virus attenuated MP12 strain and their putative role in attenuation | |
NO341506B1 (no) | Høy titer rekombinante influensavira til vaksiner og genterapi | |
US20210228705A1 (en) | Recombinant virus with codon-pair deoptimized region and uses thereof for the treatment of cancer | |
Pondé | Physicochemical effect of the N501Y, E484K/Q, K417N/T, L452R and T478K mutations on the SARS-CoV-2 spike protein RBD and its influence on agent fitness and on attributes developed by emerging variants of concern | |
Choi et al. | Development of a dual-protective live attenuated vaccine against H5N1 and H9N2 avian influenza viruses by modifying the NS1 gene | |
JP2023532735A (ja) | 組み換えエンテロウイルスおよびその使用 | |
Meng et al. | RNA polymerase I-driven reverse genetics system for enterovirus 71 and its implications for vaccine production | |
BR112017004452B1 (pt) | Vírus atenuado, arbovírus atenuado, seus usos, composição de vacina, método de produção de um genoma de vírus atenuado, método de produção de um arbovírus atenuado e genoma de arbovírus atenuado | |
Feng et al. | Attenuation of the influenza virus by microRNA response element in vivo and protective efficacy against 2009 pandemic H1N1 virus in mice | |
Chen et al. | Construction and characterization of an improved DNA-launched infectious clone of duck hepatitis a virus type 1 | |
US20240228981A1 (en) | Attenuated viruses useful for vaccines | |
WIMMER et al. | Patent 2682089 Summary | |
Groenke | Molecular mechanism of virus attenuation by codon pair deoptimization | |
CN107151659B (zh) | 一种流感病毒株及其应用 | |
Girish | IMPACT OF EVOLUTION ON INFLUENZA A VIRUS FITNESS AND ANTIGENICITY DURING THE 2021-2022 AND 2022-2023 FLU SEASONS | |
Kendall | The role of RNA structure in Chikungunya virus early replication events | |
Arabov | The effects of CpG and UpA dinucleotides on the attenuation of poliovirus by codon pair deoptimization | |
Bow | Investigation of the role of the RNA-dependant RNA polymerase in the transcription and replication of the 1918 pandemic Influenza A virus | |
Balaraman | Hammerhead ribozyme mediated suppression of Chikungunya virus replication in Vero cells | |
BR102013011247A2 (pt) | Processo para a construção de rnas infecciosos a partir de cdnas de clones do vírus da dengue tipo 3, processo para a construção de rnas infecciosos a partir de cdnas de clones quiméricos do vírus da dengue tipo 3 e do vírus rocio e referidos cdnas |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160104 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160808 |