NO341506B1

NO341506B1 - Høy titer rekombinante influensavira til vaksiner og genterapi

Info

Publication number: NO341506B1
Application number: NO20056074A
Authority: NO
Inventors: Yoshihiro Kawaoka
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2017-11-27
Also published as: NZ543446A; JP5695020B2; AU2004249133B2; BRPI0410702A; CN1826407B; CN1826407A; HK1082769A1; JP5215561B2; IL238584B; MX342639B; UA92132C2; IL238584A0; US8475806B2; ES2593082T3; EP1631663A2; JP2007518395A; WO2004112831A3; EA200501890A1; BRPI0410702B1; JP2013059346A

Description

Tverreferanse til beslektede søknader

Den foreliggende søknaden krever fordel under 35 U.S.C. § 119(e) av innsendingsdatoen for U.S. søknad serienr. 60/473,798 innsendt 28. mai 2003.

Angivelse av regjeringens rettigheter

Den foreliggende oppfinnelsen ble gjennomført med en bevilgning fra regjeringen i USA (bevilgning AI-47446 fra the National Institute of Allergy and Infections Diseases Public Health Service). Regjeringen vil kunne ha visse rettigheter i oppfinnelsen.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Negativsens RNA-virus er klassifisert i syv familier (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae og Arenaviridae) som inkluderer vanlige humane patogener så som respiratorisk syncytialvirus, influensavirus, meslingvirus og Ebola-virus så vel som dyrevirus som har en viktig økonomisk innvirkning på fjærkre- og storfeindustrien (for eksempel Newcastle sykdomsvirus og kvegpestvirus). De fire første familiene er karakterisert ved ikke-segmenterte genomer, mens de tre siste har genomer som omfatter seks-til-åtte, tre eller to negativsens RNA-segmenter henholdsvis.

Fellestrekket for negativsens RNA-virus er den negative polariteten på deres RNA-genom, det vil si at det virale RNA (vRNA) er komplementært til mRNA og derfor ikke i seg selv infiserende. For å starte viral transkribering og replikasjon må vRNA bli transkribert inn pluss-sens mRNA eller cRNA henholdsvis, ved hjelp av det virale polymerasekomplekset og nukleoproteinet; for influensa A-virus, så består det virale polymerasekomplekset av tre polymeraseproteiner PB2, PB1 og PA.

Under den virale replikasjonen, tjener cRNA som en templat for syntesen av nye vRNA-molekyler. For alle negative trådede RNA-virus, så er de ikke-kodende områdene både i 5'- og 3'-termini i nevnte vRNA og cRNA, kritiske for transkripsjon og replikasjon av det virale genom. I motsetning til cellulære eller virale mRNA-transkripter, så er hverken cRNA eller vRNA avrundet i 5'-enden eller polyadenylert i 3'-enden.

Basisfunksjonene til mange virale proteiner er blitt belyst biokjemisk og/eller i sammenheng med virusinfeksjoner. Såkalte reverse genetiske systemer har imidlertid dramatisk økt vår kunnskap om negativtrådede segmenterte og ikkesegmenterte RNA-virus med hensyn til deres virale replikasjon og patogenisitet, så vel som utviklingen av levende svekkede virusvaksiner. Revers genetikk, slik dette begrepet brukes i molekylær virologi, er definert som utviklingen av virus som har et genom som er avledet fra klonede cDNA-molekyler (for en oversikt, se Neumann et al., 2002).

For å kunne starte den virale replikasjonen av negativtrådede RNA-virus, så må vRNA(er) eller cRNA(er) bli samuttrykt med polymerasekomplekset og nukleoproteinet. Rabies (hundegalskap) -virus var det første ikke-segmenterte, negativsens RNA-viruset som fullstendig ble utviklet fra klonet cDNA: Schnell et al. (1994) utviklet rekombinant rabiesvirus ved samtransfeksjon av et cDNA-konstrukt som kodet fullengde cRNA og proteinekspresjonskonstrukter for L-, P- og N-proteinene, alle under kontroll av T7 RNA-polymerasepromoteren. Infeksjon med rekombinante vacciniavirus som utviklet T7 RNA-polymerase, resulterte i utviklingen av infiserende rabiesvirus. I dette T7-polymerasesystemet var den primære transkriberingen av fullengde cRNA under kontroll av T7 RNA-polymerase og dette resulterte i et ikke-avrundet cRNA-transkript. Tre guanidinnukleotider som danner den optimale startsekvensen for T7 RNA-polymerase var imidlertid knyttet til 5'-enden. For å skape en autentisk 3'-ende i nevnte cRNA-transkript, noe som er helt vesentlig for å få en produktiv infiserende syklus, så ble hepatitt deltaribozymet (HDVRz) -sekvensen brukt for en nøyaktig autokatalytisk spalting av 3'-enden i cRNA-transkriptet.

Etter den første rapporten til Schnell et al. (1994), så har reverse genetiske systemer som har brukt tilsvarende teknikker ført til utviklingen av mange ikke-segmenterte negativtrådede RNA-virus (Conzelmann, 1996; Conzelmann, 1998; Conzelmann et al., 1996; Mariott et al., 1999; Munoz et al., 2000; Nagai, 1999; Neumann et al., 2002; Roberts et al., 1998; Rose, 1996). Senere fintilpasninger av den opprinnelige innfangingsprosedyren inkluderte ekspresjonen av T7 RNA-polymerase fra stabilt transfekterte cellelinjer (Radecke et al., 1996) eller fra proteinekspresjonsplasmider (Lawson et al., 1995) eller varmesjokkmetoder, for å øke innfangingseffekten (Parks et al., 1999). Basert på T7-polymerasesystemet, så skapte Bridgen og Elliott (1996) Bunyamweravirus (familie Bunyaviridae) fra klonede cDNA-molekyler og viste at det var mulig kunstig å utvikle et segmentert negativsens RNA-virus ved hjelp av T7-polymerasesystemet.

I 1999 ble det utviklet en plasmidbasert revers genetisk teknikk basert på den cellulære RNA-polymerase I for en fullstendig utvikling av segmenterte influensa A-virus fra klonede cDNA-molekyler (Forod et al., 1999; Neumann og Kawaoka, 1999). RNA-polymerase I, som er et nukleært enzym, syntetiserer ribosomalt RNA som på samme måte som influensavirus RNA ikke inneholder en 5' avrunding eller 3' polyA-struktur. RNA-polymerase I-transkriberingen av et konstrukt som inneholdt et influensavirus cDNA, flankert av RNA-polymerase I-promoter og terminatorsekvenser, resulterte i en influensa vRNA-syntese (Fodor et al., 1999; Neumann og Kawaoka, 1999; Neumann og Kawaoka, 2001; Pekosz et al., 1999). Systemet var svært effektivt og produserte mer enn 10<8>infiserende viruspartikler pr ml av supernatanten fra plasmidtransfekterte celler 48 timer etter transfeksjonen.

Neumann et al., J Virol. 2000, vol. 74, no. 1, sider 547-551 beskriver et plasmidbasert system til generering av infeksiøse influensaviruslignende partikler fra klonede cDNA molekyler, som produser mer enn 10<4>smittsomme partikler per ml supernatant.

Hoffmann et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2002, vol. 99, no. 17, side 11411-11416 beskriver et 8-plasmidbasert revers genetisk system til generering av rekombinant influensa B-virus vaksine som koder HA og NA glykoproteiner.

WO0060050 beskriver en metode for å fremstille ortomyksovirus fra klonet cDNA.

Neuman et al., Rev Med Virol., 2002, vol. 12, no. 1, side 13-30 beskriver influensavirus revers genetikk og dets anvendelse til for eksempel å generere levende svekkede virusvaksiner.

Det er således et behov for en fremgangsmåte som gjør det mulig å fremstill e et høyt antall ortomyksovirus så som influensa A-virus, utelukkende fra klonede cDNA-molekyler.

Sammendrag av oppfinnelsen

Det beskrives heri et isolert og/eller renset nukleinsyremolekyl (polynukleotid) som koder minst ett av proteinene med høy titer, det vil si mer enn 10<9>/ml, for eksempel mer enn 10<10>/ml av influensavirus eller en del av disse, eller komplementet til nukleinsyremolekylet. Det isolerte og/eller rensede nukleinsyremolekylet kan kode Ha, NA, PB1, PB2, PA, NP, M eller NS eller en del av disse, som i alt vesentlig har den samme aktiviteten som det tilsvarende polypeptidet som er kodet av en av de sekvensene som er angitt i SEKV.ID. NR. 1-8. Begrepet "i alt vesentlig den samme aktiviteten" inkluderer en aktivitet som har omtrent 0,1%, 1%, 10%, 30%, 50%, 90%, for eksempel opptil 100% eller mer, eller påvisbart proteinnivå som er omtrent 80%, 90% eller mer, av aktiviteten eller proteinnivået henholdsvis, til det tilsvarende fullengde polypeptidet. Det isolerte og/eller rensede nukleinsyremolekylet kan kode et polypeptid som i alt vesentlig er det samme, for eksempel har en minst 80%, for eksempel 90%, 92%, 95%, 97% eller 99% av sammenhengende aminosyresekvensidentitet til et polypeptid som er kodet av en av de sekvensene som er angitt i SEKV.ID. NR. 1-8. Det isolerte og/eller rensede nukleinsyremolekylet kan omfatte en nukleotidsekvens som i alt vesentlig er den samme, for eksempel har minst 50%, 60%, 70%, 80% eller 90% eller høyere sammenhengende nukleinsyresekvensidentitet med en av de sekvensene som er angitt i SEKV.ID. NR. 1-8, eller deres komplement, og kan også kode et polypeptid som har minst 80%, for eksempel 90%, 92%, 95%, 97% eller 99% sammenhengende aminosyresekvensidentitet til et polypeptid som er kodet av en av sekvensene som angitt i SEKV.ID. NR. 1-8. Det isolerte og/eller rensede nukleinsyremolekylet kan kode et polypeptid som har en eller flere, for eksempel 2, 5, 10, 15, 20 eller flere, konservative aminosyresubstitusjoner, det vil si konservative substitusjoner på opptil 10% eller 20% av restene i forhold til et polypeptid kodet av en av sekvensene i SEKV.ID. NR. 1-8. "Konservative aminosyresubstitusjoner" refererer seg til utbyttbare rester med tilsvarende eller lignende sidekjeder. En gruppe aminosyrer med alifatiske sidekjeder er for eksempel glysin, alanin, valin, leukin og isoleukin; og en gruppe aminosyrer med alifatiske hydroksylsidekjeder er serin og treonin; en gruppe aminosyrer med amidholdige sidekjeder er asparagin og glutamin; en gruppe aminosyrer med aromatiske sidekjeder er fenylalanin, tyrosin og tryptofan; en gruppe aminosyrer med basiske sidekjeder er lysin, arginin og histidin; og en gruppe aminosyrer med en svovelholdig sidekjede er cystein og metionin. Foretrukne konservative aminosyresubstitusjonsgrupper er: Valin-leukin-isoleukin; fenylalanin-tyrosin; lysin-arginin; alanin-valin; glutaminsyre-aspartinsyre; og asparagin-glutamin.

Det beskrives heri at det isolerte og/eller rensede nukleinsyremolekylet eller dets komplement hybridisere seg til en av sekvensene i SEKV.ID. NR. 1-8 eller deres komplement, under lav stringenthet, moderat stringenthet eller stringente betingelser. Det er for eksempel mulig å bruke de følgende betingelser: 7% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA ved 50qC med vasking i 2X SSC, 0,1% SDS ved 50qC (lav stringenthet), mer ønskelig i 7% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO41 mM EDTA ved 50qC med vasking i 1X SSC, 0,1% SDS ved 50qC (moderat stringenthet), enda mer ønskelig i 7% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA ved 50qC med vasking i 0,5X SSC, 0,1% SDS ved 50qC (stringent), fortrinnsvis i 7% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA ved 50qC med vasking i 0,1X SSC, 0,1% SDS ved 50qC (mer stringent), mer foretrukket i 7% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA ved 50qC med vasking i 0,1X SSC, 0,1¤ SDS ved 65qC (meget stringent). Nukleinsyremolekylet koder et polypeptid som i alt vesentlig er det samme, for eksempel har minst 50%, for eksempel 60%, 70%, 80% eller 90% eller høyere sammenhengende nukleinsyresekvensidentitet til en av sekvensene i SEKV.ID. NR. 1-8 og fortrinnsvis i alt vesentlig har den samme aktiviteten som et tilsvarende fullengde polypeptid som er kodet av en av sekvensene i SEKV.ID. NR.

1-8.

Nukleinsyremolekylet kan brukes for å uttrykke influensaproteiner, for å fremstille kimære gener, for eksempel med andre virale gener som inkluderer andre influensavirusgener og/eller for å fremstille rekombinant virus. Således beskrives også isolerte polypeptider, rekombinante virus og vertsceller som er kontaktet med nukleinsyremolekylene eller de rekombinante virusene beskrevet heri.

Beskrevet heri er de følgende isolerte og/eller rensede vektorene: En vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB1 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB2 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus HA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NP cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus M cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NS cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, hvor minst en av vektorene omfatter sekvenser som koder HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M, NS eller en del av disse og som i alt vesentlig har den samme aktiviteten som et tilsvarende polypeptid som er kodet av en av sekvensene i SEKV.ID. NR. 1-8, det vil si en sekvens som koder et polypeptid med minst 80% aminosyreidentitet til et polypeptid som er kodet av en av sekvensene i SEKV.ID. NR. 1-8. Eventuelt kan to vektorer brukes i stedet for vektoren som omfatter en promoter som er operativt forbundet med en influensavirus M cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, for eksempel en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus M1 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens og en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus M2 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens.

Isolerte og rensede vektorer eller plasmider som uttrykker eller koder influensavirusproteiner, eller uttrykker eller koder influensa vRNA, både nativt og rekombinant vRNA beskrives også heri. Vektorene omfatter fortrinnsvis influensa cDNA, for eksempel influensa A (for eksempel ethvert influensa A-gen som inkluderer enhver av de 15 HA- eller 9 NA-undertypene), B eller C DNA (se kapitlene 45 og 46 i Fields Virology (Fields et al. (red.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)), skjønt man kan se for seg at ett eller flere gener i enhver organisme kan anvendes i vektorene eller i fremgangsmåtene som beskrevet heri. Nevnte cDNA kan være i sens- eller antisensorientering i forhold til promoteren. En vektor kan således kode et influensavirusprotein (sens) eller vRNA (antisens).

Enhver egnet promoter eller transkripsjonstermineringssekvens kan brukes for å uttrykke et protein eller et peptid, for eksempel et viralt protein eller peptid, et protein eller peptid i en ikke-viral patogen, eller et terapeutisk protein eller peptid.

Det beskrives heri en sammensetning som omfatter en rekke influensavirusvektorer som beskrevet heri. I en utførelse omfatter sammensetningen: a) Minst to vektorer valgt fra en vektor som omfatter en promoter som er operativt forbundet med et influensavirus PA cDNA forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB1 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB2 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus HA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NP cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus M cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NS cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, hvor minst én vektor omfatter en promoter som er operativt forbundet til et nukleinsyremolekyl som beskrevet heri og forbundet med en transkriberingstermineringssekvens; og b) minst to vektorer valgt fra en vektor som koder influensavirus PA, en vektor som koder influensavirus PB1, en vektor som koder influensavirus PB2 og en vektor som koder influensavirus NP. Eventuelt kan vektorene under avsnitt b) inkludere en eller flere vektorer som koder NP, NS, M, for eksempel M1 og M2, HA eller NA. Det er foretrukket at de vektorene som koder de virale proteinene også omfatter en transkripsjonstermineringssekvens.

I en annen utførelse omfatter sammensetningen: a) Minst to vektorer valgt fra en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PA cDNA forbundet med en transkriberingstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB1 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus PB2 cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus HA cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NP cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NA og NB cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus M cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med et influensavirus NS cDNA som er forbundet med en transkripsjonstermineringssekvens, og en vektor som omfatter en promoter som operativt er forbundet med influensavirus BM2 cDNA operativt forbundet med en transkriberingssekvens, og hvor minst én vektor omfatter en promoter som operativt er forbundet med et nukleinsyremolekylsom beskrevet heri forbundet med en transkriberingstermineringssekvens; og b) minst to vektorer valgt fra en vektor som koder influensavirus PA, en vektor som koder influensavirus PB1, en vektor som koder influensavirus PB2 og en vektor som koder influensavirus NP. Eventuelt kan vektorene fra avsnitt b) inkludere en eller flere vektorer som koder NP, NS, M, HA eller NA. Det er foretrukket at de vektorer som koder de virale proteinene også omfatter en transkriberingstermineringssekvens.

En sammensetning kan også omfatte et gen eller en åpen leseramme av interesse, for eksempel et fremmed gen som koder et immunogent peptid eller protein som kan brukes som en vaksine. En annen utførelse omfatter således en sammensetning som beskrevet ovenfor, hvor en av vektorene er erstattet med, eller hvor sammensetningen ytterligere omfatter, en vektor som omfatter en promoter som er forbundet med 5' influensavirussekvenser, eventuelt inkluderer 5' influensaviruskodende sekvenser eller en del av disse, som er forbundet med en ønsket nukleinsyresekvens, for eksempel et ønsket cDNA, forbundet med 3 ' influensavirussekvenser, eventuelt inkluderer 3' influensaviruskodende sekvenser eller en del av disse, forbundet med en transkriberingstermineringssekvens. Det er foretrukket at den ønskede nukleinsyresekvensen, så som et cDNA, er i en antisensorientering. Innføringen av en slik sammensetning i en vertscelle vil muliggjøre influensavirusreplikasjon, noe som vil resultere i rekombinante virus som omfatter vRNA som tilsvarer sekvensene i vektoren. Promoteren i en slik vektor for vRNA-produksjon kan være en RNA-polymerase I-promoter, en RNA-polymerase II-promoter, en RNA-polymerase III-promoter, en T7-promoter og en T3-promoter og eventuelt kan vektoren omfatte en transkripsjonstermineringssekvens så som en RNA-polymerase I-transkripsjonsterminseringssekvens, en RNA-polymerase II-transkripsjonsterminseringssekvens, en RNA-polymerase III-transkripsjonsterminseringssekvens, eller et ribozym. I en utførelse vil den vektoren som omfatter den forønskede nukleinsyresekvensen omfatte et cDNA av interesse. Nevnte cDNA av interesse, enten det foreligger i en vektor for vRNA eller proteinproduksjon, kan kode en immunogen epitop så som en epitop som kan brukes i kreftterapi eller vaksine, eller et peptid eller et polypeptid som kan brukes i genterapi. Ved fremstilling av viruset, kan vektoren eller plasmidet som omfatter genet eller cDNA av interesse erstatte en vektor eller et plasmid for et influensaviralt gen eller kan komme i tillegg til vektorer eller plasmider for alle influensavirale gener.

En rekke av vektorene kan være fysisk forbundet, eller hver vektor kan være tilstede på et individuelt plasmid eller på annen måte, for eksempel i en lineær nukleinsyretilførselsbærer.

Promoteren eller transkripsjonsterminseringssekvensen i et vRNA eller virusproteinekspresjonsvektoren kan være den samme eller forskjellig i forhold til promoteren eller enhver annen vektor. Det er foretrukket at vektoren eller plasmidet som uttrykker influensa vRNA omfatter en promoter som er egnet for ekspresjon i minst en spesiell vertscelle, for eksempel fugle- eller pattedyrvertsceller, for eksempel celler fra hund, katt, hest, storfe eller sau, eller primatceller så som humane celler, eller fortrinnsvis, for ekspresjon i mer enn en type vertsceller.

I en utførelse omfatter en eller flere vektorer for vRNA en promoter som inkluderer, men som ikke er begrenset til, en RNA-polymerase I-promoter, for eksempel en human RNA-polymerase I-promoter, en RNA-polymerase II-promoter, en RNA-polymerase III-promoter, en T7-promoter eller en T3-promoter. Foretrukne transkripsjonstermineringssekvenser for vRNA-vektorene inkluderer, men er ikke begrenset til, en RNA-polymerase I-transkripsjonsterminseringssekvens, en RNA-polymerase II-transkripsjonsterminseringssekvens, en RNA-polymerase III-transkripsjonsterminseringssekvens, eller et ribozym. Ribozymer som inkluderer, men er ikke begrenset til, tetrahymenaribozymer, RNase P, hammerhoderibozymer, hårnålribozymer, hepatittribozym så vel som syntetiske ribozymer.

I en utførelse vil minst en vektor for vRNA omfatte en RNA-polymerase II-promoter forbundet med en ribozymsekvens som igjen er forbundet til virale kodende sekvenser som er forbundet med andre ribozymsekvenser, eventuelt forbundet med en RNA-polymerase II-transkripsjonstermineringssekvens. I en utførelse vil minst 2, og fortrinnsvis flere, for eksempel 3, 4, 5, 6, 7 eller 8 vektorer for vRNA-produksjon omfatte en RNA-polymerase II-promoter, en første ribozymsekvens, som er 5' til en sekvens som tilsvarer virale sekvenser, inklusive virale kodende sekvenser som er 5' til en ny ribozymsekvens, som igjen er 5' til en transkripsjonstermineringssekvens. Hver RNA-polymerase II-promoter i hver vRNA-vektor kan være identiske eller forskjellige i forhold til RNA-polymerase II-promoteren i enhver annen vRNA-vektor. På lignende måte kan hver ribozymsekvens i hver vRNA-vektor være identisk eller forskjellig i forhold til ribozymsekvensene i enhver annen vRNA-vektor. I en utførelse er ribozymsekvensene i en enkelt vektor forskjellige.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av influensavirus. Fremgangsmåten omfatter at en celle kontaktes en sammensetning ifølge krav 1-9 i en mengde som effektivt gir infiserende influensavirus. Oppfinnelsen inkluderer også å isolere virus fra en celle som er kontaktet sammensetningen. Det beskrives således heri også isolerte virus, så vel som en vertscelle som er kontaktet med sammensetningen eller et virus. I en annen utførelse kontaktes cellen med en eller flere vektorer, enten vRNA eller proteinproduksjonsvektorer, før andre vektorer, enten disse er vRNA eller proteinproduksjonsvektorer.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen gjør det lett å manipulere influensavirus, for eksempel ved å innføre svekkende mutasjoner i det virale genomet. Ettersom influensavirus induserer sterk humoral og cellulær immunitet, så vil oppfinnelsen også i høy grad forsterke eller forbedre disse virusene som vaksinevektorer, spesielt på bakgrunn av tilgjengeligheten av naturlige varianter av nevnte virus som kan brukes etter hverandre, noe som muliggjør en gjentakende bruk for genterapi.

De fremgangsmåtene for fremstilling av virus som er beskrevet her, som ikke krever hjelpevirusinfeksjon, kan brukes ved undersøkelser av viral mutagenese og for produksjon av vaksiner (for eksempel for AIDS, influensa, hepatitt B, hepatitt C, rhinovirus, filovirus, malaria, herpes og munn- og klovsyke) og genterapivektorer (for eksempel for kreft, AIDS, adenosindeaminase, muskulær dystrofi, ornitintranskarbamylasesvikt og tumorer i det sentrale nervesystemet). Det er således beskrevet et virus som kan brukes i medisinsk terapi (for eksempel for en vaksine eller for genterapi).

Beskrevet heri er også en fremgangsmåte for å immunisere et individ mot en patogen, for eksempel en bakterie, virus eller parasitt eller en ondartet tumor.

Fremgangsmåten omfatter å administrere individet en mengde av minst ett isolert virus som beskrevet heri, eventuelt i kombinasjon med en adjuvans, som effektivt immuniserer individet. Viruset omfatter vRNA som igjen omfatter et polypeptid som er kodet av patogenen eller et tumorspesifikt polypeptid.

Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å forhøye eller forsterke ekspresjonen av et endogent protein i et pattedyr som har en indikasjon, eller en sykdom som er karakterisert ved nedsatt mengde eller en mangel på det endogene proteinet.

Fremgangsmåten omfatter at pattedyret administreres en mengde av et isolert virus som beskrevet heri som effektivt forsterker eller forhøyer mengden av det endogene proteinet i pattedyret. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1. Skjematisk diagram av etablerte reverse genetiske systemer. I RNP-transfeksjonsmetoden (A) blir renset NP og polymeraseproteiner samlet i RNP'er ved hjelp av in vitro syntetisert vRNA. Cellene blir transfektert med RNP'er fulgt av en hjelpevirusinfeksjon. i RNA-polymerase I-metoden (B) blir et plasmid som inneholder RNA-polymerase I-promoteren, et cDNA som koder det vRNA som skal fanges inn, og RNA-polymerase I-terminatoren, transfektert inn i celler. En intracellulær transkripsjon av RNA-polymerase I gir syntetisk vRNA som blir pakket inn i forløperviruspartikler ved infeksjon med hjelpevirus. I begge disse to fremgangsmåtene kan transfekterte virus (det vil si de som inneholder RNA som er avledet fra det klonede cDNA) velges ut fra populasjonen av hjelpevirus.

Figur 2. Skjematisk diagram for utviklingen av RNA-polymerase I-konstrukter. cDNA'er avledet fra influensavirus blir amplifisert ved hjelp av PCR, så kut tet med BsmBI og klonet inn i BsmBI-setene i pHH21-vektoren (E. Hoffmann, Ph.D. grad, Justus, Liebig-University, Giessen, Tyskland) som inneholder den humane RNA-polymerase I-promoteren (P) og muse RNA-polymerase I-terminatoren (T).

Tymidinnukleotidet oppstrøms for terminatorsekvensen (*T) representerer 3'-enden i det influensavirale RNA. Influensa A-virussekvensene er vist med fet skrift (SEKV.ID. NR. 29-40).

Figur 3. Foreslåtte reverse genetikkmetoder for utvikling av segmenterte negativsens RNA-virus. Plasmider som inneholder RNA-polymerase I-promoteren, et cDNA for hver av de åtte virale RNA-segmentene og RNA-polymerase I-terminatoren, blir transfektert inn i celler sammen med proteinekspresjonsplasmider. Skjønt infiserende virus kan utvikles med plasmider som uttrykker PA, PB1, PB2 og NP, så vil en ekspresjon av alle de gjenværende strukturelle proteinene (vist i parentes) øke effekten ved virusproduksjonen avhengig av det virus som utvikles.

Figur 4. Titreringsverdi for forskjellige influensavirus.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Begrepene "isolerte og/eller rensede" slik de brukes her, refererer seg til in vitro fremstilling, isolering og/eller rensing av en vektor, plasmid eller virus, slik at det ikke er assosiert med in vivo stoffer eller i alt vesentlig er renset fra in vitro stoffer. Et isolert viruspreparat blir generelt oppnådd ved in vitro dyrking og oppformering og er i alt vesentlig fri for andre infiserende organismer.

Med begrepet "i alt vesentlig fri" slik det brukes her, menes under påvisningsnivået for en spesiell infiserende organisme ved å bruke standard påvisningsmetoder for denne organismen.

Et "rekombinant" virus er et som er blitt manipulert in vitro, for eksempel ved å bruke rekombinante DNA-teknikker for derved å innføre forandringer i det virale genomet.

Begrepene "rekombinant nukleinsyre" eller "rekombinant DNA-sekvens eller segment" slik de brukes her, refererer seg til en nukleinsyre, for eksempel til DNA, som er blitt avledet eller isolert fra en kilde og som deretter vil kunne være endret kjemisk in vitro slik at dens sekvens ikke er naturlig forekommende, eller tilsvare naturlig forekommende sekvenser som har en annen posisjon enn de ville ha i det naturlige genomet. Et eksempel på DNA "avledet" fra en kilde vil være en DNA-sekvens som er blitt identifisert som et brukbart fragment og som så er blitt kjemisk syntetisert i i alt vesentlig ren form. Et eksempel på et slikt DNA som er "isolert" fra en kilde, vil være en brukbar DNA-sekvens som er tatt ut eller fjernet fra nevnte kilde ved hjelp av kjemiske metoder, for eksempel ved å bruke restriksjonsendonukleaser slik at den kan bli ytterligere manipulert, for eksempel amplifisert, for bruk i oppfinnelsen ved hjelp av kjente bioteknologiske fremgangsmåter.

Influensavirusreplikasjon

Influensa A-virus har et genom som består av åtte enkelttrådede negativsens virale RNA'er (vRNA'er) som totalt koder ti proteiner. Livssyklusen for influensavirus begynner med binding av hemagglutinin (HA) til sialinsyreholdige reseptorer på overflaten av vertscellen fulgt av en reseptorstyrt endocytose. Den lave pH-verdien i de sene endosomene utløser et konformelt skift i nevnte HA, noe som eksponerer N-terminus i HA2-underenheten (det såkalte fusjonspeptidet). Fusjonspeptidet starter fusjonen av den virale og endosomale membranen og matriseprotein M1) og RNP-komplekser blir frigjort inne i cytoplasmaet. RNP'er består av nukleoproteinet (NP) som enkapsiderer vRNA og det virale polymerasekomplekset som er dannet ved hjelp av PA-, PB1- og PB2-proteinene. RNP'er blir transportert inn i kjernen hvor det skjer en transkribering og replikasjon. RNA-polymerasekomplekset katalyserer tre forskjellige reaksjoner: Syntese av et mRNA med en 5'-ende og en 3' polyA-struktur av et fullengde komplementært RNA (cRNA) og et genomisk vRNA ved å bruke cDNA som en templat. Nylig syntetiserte vRNA'er, NP og polymeraseproteiner blir så samlet i RNP'er, eksportert ut fra kjernen og transportert til plasmamembranen hvor det skjer en knoppdannelse av forløperviruspartikler. Neuraminidase (NA) -proteinet spiller en avgjørende rolle sent i infeksjonen ved å fjerne sialinsyre fra sialyloligosakkarider og derved frigjøre nylig sammensatte vironer fra celleoverflaten og hindre selvaggregering av viruspartikler. Skjønt virussammensetningen innbefatter protein-til-protein- og protein-vRNA-interaksjoner, så er disse interaksjonenes natur i alt vesentlig ukjente.

Skjønt influensa B- og C-virus strukturelt og funksjonelt er lik influensa A-virus, så er det enkelte forskjeller. Således har for eksempel influensa B-virus ikke et M2-protein med ionekanalaktivitet. På lignende måte har heller ikke influensa C-virus et M2-protein med ionekanalaktivitet. Det er imidlertid sannsynlig at CM1-proteinet har denne aktiviteten. Aktiviteten for et ionekanalprotein kan måles ved hjelp av velkjente fremgangsmåter, se for eksempel Holsinger et al. (1994) og WO

01/79273.

Cellelinjer og influensavirus som kan brukes i den foreliggende oppfinnelsen

Enhver celle som understøtter effektiv replikasjon av influensavirus kan brukes i oppfinnelsen, inklusive mutante celler som uttrykker reduserte eller nedsatte nivåer av en eller flere sialinsyrer som er reseptorer for influensavirus. Virus oppnådd ved fremgangsmåtene kan gjøres til et reassortantvirus.

Det er foretrukket at cellene er WHO-sertifiserte eller sertifiserbare kontinuerlige cellelinjer. Kravene for sertifisering av slike cellelinjer inkluderer karakterisering med hensyn til minst én opprinnelse, vekstegenskaper, immunologiske markører, virusmottakelighet, tumorigenisitet og lagringsbetingelser så vel som ved testing i dyr, egg og cellekulturer. En slik karakterisering brukes for å bekrefte at cellene er frie for påvisbare ekstramidler eller stoffer. I enkelte land er det også nødvendig med karyologi. I tillegg til dette blir tumorigenisiteten fortrinnsvis testet i celler som befinner seg på samme overføringsnivå som de som brukes for vaksineproduksjon. Nevnte virus blir fortrinnsvis renset ved en fremgangsmåte som har vist seg å gi konsistente resultater, før nevnte virus blir inaktivert eller svekket for vaksineproduksjon (se for eksempel World Health Organization, 1982).

Det er foretrukket å etablere en fullstendig karakterisering av de cellelinjer som skal brukes slik at man kan inkludere passende tester med hensyn til sluttproduktets renhet. Data som kan brukes for karakterisering av en celle som skal brukes i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer (a) informasjon om dens opprinnelse, avlednings- og overføringshistorie; (b) informasjon om dens vekst og morfologiske egenskaper; (c) resultat av tester med hensyn til ekstrastoffer og midler; (d) skillende egenskaper så som biokjemiske, immunologiske eller cytogenetiske mønstere som gjør det mulig å skille cellene klart fra andre cellelinjer; og (e) resultater av tester for tumorigenisitet. Det er foretrukket at overføringsnivået eller populasjonsdoblingen for vertscellen er så lav som mulig.

Det er foretrukket at de virus som fremstilles i cellen er høyrene før vaksine- eller genterapiformulering. Generelt vil rensemetodene resultere i en omfattende fjerning av cellulært DNA, andre cellulære komponenter og ekstramidler eller stoffer.

Fremgangsmåter som i omfattende grad nedbryter eller denaturerer DNA kan også brukes. Se for eksempel Mizrahi, 1990.

Vaksiner

En vaksine kan omfatte immunogene proteiner inklusive glykoproteiner fra enhver patogen, for eksempel et immunogent protein fra en eller flere bakterier, virus, gjær eller sopp. Det beskrives heri influensavirusersom er vaksinevektorer for influensavirus eller andre virale patogener som inkluderer, men som ikke er begrenset til, lentivirus så som HIV, hepatitt B-virus, hepatitt C-virus, herpesvirus så som CMV eller HSV eller munn- og klovsykevirus.

En fullstendig virusvaksine blir konsentrert ved ultrafiltrering og deretter renset ved sonesentrifugering eller ved kromatografi. Den blir inaktivert før eller etter rensingen, for eksempel ved å bruke formalin eller beta-propiolaceton.

En underenhetsvaksine omfatter rensede glykoproteiner. En slik vaksine kan fremstilles som følger: Det anvendes virale suspensjoner som er fragmentert ved behandling med rensemiddel, overflateantigenene blir renset, for eksempel ved ultrasentrifugering. Underenhetsvaksinene vil således i alt vesentlig inneholde HA-protein og dessuten NA. Det rensemiddelet som brukes kan være et kationisk rensemiddel, for eksempel heksadecyltrimetylammoniumbromid (Bachmeyer, 1975), et anionisk rensemiddel så som ammoniumdeoksykolat (Laver & Webster, 1976) eller et ikke-ionisk rensemiddel så som det som selges under varemerket TRITON X100. Hemagglutinin kan også isoleres etter at virionene er behandlet med en protease så som bromelin og deretter renses ved hjelp av en fremgangsmåte, for eksempel av den typen som er beskrevet av Grand og Skehel (1972).

En splittvaksine omfatter virioner som er blitt underkastet behandling med midler som løser lipider. En splittvaksine kan fremstilles som følger: En vandig suspensjon av renset virus oppnådd som beskrevet ovenfor, enten inaktivert eller ikke , blir under røring behandlet med lipidløsemidler så som etyleter eller kloroform assosiert med rensemidler. Oppløsningen av de virale kappalipidene resulterer i fragmentering av de virale partiklene. Den vandige fasen blir så innvunnet og denne vil inneholde splittvaksinen som i alt vesentlig består av hemagglutinin og neuraminidase hvor det opprinnelige lipidmiljøet er fjernet, foruten kjernen og dets nedbrytningsprodukter. De gjenværende infiserende partiklene blir så inaktivert, hvis dette ikke allerede er utført.

Inaktiverte vaksiner. Inaktiverte influensavirusvaksiner blir tilveiebrakt ved å inaktivere oppformert virus ved å bruke kjente fremgangsmåter så som, men ikke begrenset til, formalin- eller E-propiolaktonbehandling. Inaktiverte vaksinetyper kan inkludere helvirus (WV) -vaksiner eller subvirion (SV) (splitt) -vaksiner. WV-vaksinene inneholder intakte inaktiverte virus, mens SV-vaksinen inneholder renset virus som er bruddstykker med løsemidler som løser den lipidholdige virale kappen fulgt av en kjemisk inaktivering av de gjenværende virus.

I tillegg er det mulig å bruke vaksiner av den typen som inneholder isolerte HA- og NA-overflateproteiner som er betegnet som overflateantigen eller underenhetsvaksiner. Generelt vil reaksjonene på SV og overflateantigen (for eksempel renset HA eller NA) -vaksiner være lik. En eksperimentell inaktivert WV-vaksine inneholdende et NA-antigen som er immunologisk beslektet til det epidemiske virus og et ikke-beslektet HA, synes å være mindre effektive enn vanlig kjente vaksiner (Ogra et al., 1977). Det er foretrukket å bruke inaktiverte vaksiner som inneholder begge de relevante overflateantigenene.

Levende svekkede virusvaksiner. Levende svekkede influensavirusvaksiner kan også brukes for å forebygge eller behandle influensavirusinfeksjon ved å bruke kjente fremgangsmåter. Svekkingen oppnås fortrinnsvis i et enkelt trinn ved å overføre svekkede gener fra et svekket donorvirus til et replikert isolert eller reassortert virus ved hjelp av kjente fremgangsmåter (se for eksempel Murphy, 1993). Ettersom resistens mot influensa A-virus styres av utviklingen av en immunrespons overfor HA- og NA-glykoproteinene, så må genene som koder disse overflateantigenene komme fra de reassorterte virusene eller fra kliniske isolater med sterk vekst. De svekkede genene er avledet eller kommer fra det svekkede opphavet. I denne fremgangsmåten vil de genene som gir svekkingen fortrinnsvis ikke kode for HA- og NA-glykoproteinene. Ellers ville disse genene ikke kunne overføres til de reassorterte virusene som er overflateantigenene til det kliniske virusisolatet.

Mange donorvirus er blitt undersøkt for sin evne til reproduserbart å svekke influensavirus. Som et ikke-begrensende eksempel kan nevntes A/Ann Arbor(AA)/6/60 (H2N2) kuldeadaptert (ca) donorviruset som kan brukes for produksjon av svekket vaksine (se for eksempel Edwards, 1994; Murphy, 1993). Videre kan levende svekkede reassorterte virusvaksiner utvikles ved å koble cadonorviruset med et virulent replikert virus. Reassortert avkom blir så valgt ut ved 25qC (begrensende for replikasjon av virulent virus) i nærvær av et N2N2-antiserum som hemme replikasjonen av virus som bærer overflateantigenene til det svekkede A/AA/6/60 (H2N2) ca-donorviruset.

En stor serie H1N1- og H3N2-reassorterte virus er blitt undersøkt i mennesker og funnet tilfredsstillende ved å være: (a) Infiserende, (b) svekket for seronegative barn og immunologisk primede voksne personer, (c) immunogene og (d) genetisk stabile. Immunogenisiteten til de ca-reassorterte virus er parallelle med deres replikasjonsnivå. Ved således å erverve seks overførbare gener fra nevnte cadonorvirus til de nye villtypevirusene har reproduserbart svekket disse virusene slik at de kan brukes ved vaksinasjon av utsatte voksne personer og barn.

Andre svekkende mutasjoner kan innføres i influensavirusgener ved seterettet mutagenese for derved å innvinne infiserende virus som bærer disse mutante genene. Svekkende mutasjoner kan innføres i ikke-kodende områder av genomet, så vel som i kodende områder. Slike svekkende mutasjoner kan også innføres i gener som er forskjellige fra HA eller NA, for eksempel i PB2-polymerasegenet (Subbarao et al., 1993). Nye donorvirus kan således også utvikles som vil inneholde svekkende mutasjoner innført ved seterettet mutagenese, og slike nye donorvirus kan brukes for å redusere levende svekkede reassorterte H1N1- og N3N2-vaksinekandidater på en måte som er analog til det som er beskrevet ovenfor for A/AA/6/60 ca-donorviruset. På lignende måte kan andre kjente egnede svekkede donorstammer reassorteres med influensavirus for derved å oppnå eller få fremstilt svekkede vaksiner som er egnet for bruk ved vaksinasjon av pattedyr (Enami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993).

Det er foretrukket at slike svekkede virus beholder genene fra det viruset som koder de antigene determinantene som i alt vesentlig er lik de som forefattes i de kliniske isolatene. Dette fordi formålet med den svekkede vaksinen er å tilveiebringe i alt vesentlig den samme antigenisiteten som i det opprinnelige kliniske isolatet av viruset, samtidig som vaksinen mangler infeksjonsevne i en slik grad at den frembringer minimale forandringer med hensyn til å indusere en alvorlig patogen tilstand i det vaksinerte pattedyret.

Viruset kan således svekkes eller inaktiveres, formuleres og administreres ved hjelp av kjente fremgangsmåter som en vaksine for å indusere en immunrespons eller -reaksjon i et dyr, for eksempel et pattedyr. Det er kjent mange fremgangsmåter for å bestemme hvorvidt slike svekkede eller inaktiverte vaksiner har beholdt samme eller lignende antigenisitet som var tilstede i det kliniske isolatet eller høyvekststammer som er avledet fra dette. Slike kjente fremgangsmåter innbefatter bruken av antisera eller antistoffer for å eliminere virus som uttrykker antigene determinanter av donorviruset; kjemisk seleksjon (for eksempel amantadin eller rimantidin); HA- og NA-aktivitet og hemming; og DNA-screening (så som probehybridisering eller PCR) for å bekrefte at de donorgenene som koder de antigene determinantene (for eksempel HA- eller NA-gener) ikke er tilstede i de svekkede virusene. Se for eksempel Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969;

Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992.

Farmasøytiske sammensetninger

Farmasøytiske sammensetninger som beskrevet heri som er egnet for inokulering eller for parenteral eller oral administrering, omfatter svekkede eller inaktiverte influensavirus og eventuelt sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Sammensetningene kan videre omfatte hjelpemidler eller fortynningsmidler av velkjent type. Se for eksempel Berkow et al., 1987;

Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992. Sammensetningen vil generelt være tilstede i form av individuelle doser (enhetsdoser).

Vanlige vaksiner vil generelt inneholde fra omtrent 0,1 til 200 Pg, fortrinnsvis 10 til 15 Pg hemagglutinin fra hver av de stammene som inngår i sammensetningen. Den vaksinen som utgjør hovedbestanddelen i vaksinesammensetningen kan omfatte et virus av type A, B eller C eller enhver kombinasjon av disse, for eksempel minst to av de tre typene, minst to av flere forskjellige undertyper, minst to av den samme typen, minst to av den samme undertypen eller ett eller flere forskjellige isolater eller reassorterte virus. Humane influensavirus type A inkluderer H1N1-, H2N2- og H3N2-undertyper.

Preparater for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikkevandige løsninger, suspensjoner og/eller emulsjoner som kan inneholde hjelpemidler eller fortynningsmidler av kjent type. Eksempler på ikke-vandige løsemidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer så som olivenolje, foruten injiserbare organiske estere så som etyloleat. Bærere eller tette omslag eller forbindinger kan brukes for å øke hudpermeabiliteten og dermed bedre antigenabsorpsjonen. Flytende doseringsformer for oral administrering vil generelt omfatte en liposomløsning som inneholder den flytende doseringsformen. Egnede former for suspendering av liposomer inkluderer emulsjoner, suspensjoner, løsninger, siruper og safter som inneholder inerte fortynningsmidler av vanlig kjent type, så som renset vann. Foruten inerte fortynningsmidler kan slike sammensetninger også inneholde adjuvanser, fuktemidler, emulgerings- og suspenderingsmidler, søtningsstoffer, smaksstoffer eller parfymer. Se for eksempel Berkow et al., 1992; Avery's, 1987; Osol, 1980; og Katzung, 1992.

Når en sammensetning brukes for administrering til et individ, kan den videre omfatte salter, buffere, adjuvanser eller andre stoffer som er ønskelige for å bedre sammensetningens effekt. For vaksiner er det mulig å bruke adjuvanser eller andre stoffer som bedrer den spesifikke immunresponsen eller reaksjonen. Vanligvis vil adjuvansen og sammensetningen blandes før den eksponeres for immunsystemet, eller kan brukes separat, men på samme sted hvor organismen blir immunisert.

Eksempler på egnede stoffer og materialer som er egnet for bruk i vaksinesammensetninger er gitt i Osol (1980).

Heterogenisiteten i en vaksine kan tilveiebringes ved å blande replikerte influensavirus for minst to influensavirusstammer så som 2-50 stammer eller ethvert antall innenfor dette variasjonsområdet. Det er foretrukket å bruke influensa A- og B-virusstammer som har en moderne antigen sammensetning. Det beskrives heri at det akn tilveiebringes vaksiner for variasjoner innenfor en enkelt stamme av et influensavirus ved å bruke velkjent teknikk.

En farmasøytisk sammensetning kan videre eller i tillegg omfatte minst én kjemoterapeutisk forbindelse, for eksempel for genterapi, immunoundertrykkende midler, antiinflammatoriske midler eller immunforsterkende midler, og for vaksiner, kjemoterapeutika som inkluderer, men som ikke er begrenset til, gammaglobulin, amantadin, guanidin, hydroksybenzimidazol, interferon-D, interferon-E, interferon-J, tumornekrosefaktor-alfa, tiosemikarbazoner, metiazon, rifampin, ribavirin, en pyrimidinanalog, en purinanalog, foskarnet, fosfonoeddiksyre, asyklovir, dideoksynukleosider, en proteasehemmer eller ganciklovir. Se for eksempel Katsung (1992) og de referanser som der er gitt på sidene 798-800 og 680-81 henholdsvis.

Sammensetningen kan også inneholde variable, men små mengder av endotoksinfritt formaldehyd og konserveringsmidler som er funnet å være risikofr ie og som ikke bidrar til uønskede effekter i den organismen som administreres sammensetningen.

Farmasøytiske formål

Administreringen av sammensetningen (eller de antisera som den utløser) kan være enten for et "profylaktisk" eller "terapeutisk" formål. Når de anvendes profylaktisk, vil sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, som er vaksiner, bli gitt før det er manifestert eventuelle symptomer på en patogen infeksjon. Den profylaktiske administreringen av sammensetningen tjener til å forebygge eller å svekke en eventuell etterfølgende infeksjon. Når den tilveiebringes eller anvendes profylaktisk, så vil genterapisammensetningene bli gitt før det er tegn til en sykdom. Den profylaktiske administreringen av sammensetningen tjener til å forebygge eller å svekke en eller flere av de symptomer som er assosiert med sykdommen.

Når sammensetningene brukes terapeutisk, vil den gi en svekket eller inaktivert viral vaksine ved påvisning av et symptom på en virkelig infeksjon. Den terapeutiske administreringen av en eller flere forbindelser tjener til å svekke enhver virkelig infeksjon. Se for eksempel Berkow et al., 1992; Avery, 1987; og Katzung, 1992. Når sammensetningene brukes terapeutisk, vil en genterapisammensetning bli gitt ved påvisning av et symptom eller en indikasjon på en sykdom. Den terapeutiske administreringen av en eller flere forbindelser tjener til å svekke et symptom eller en indikasjon på nevnte sykdom.

En svekket eller inaktivert vaksinesammensetning kan således være tilveiebrakt eller administrert enten før infeksjonen begynner (for derved å forebygge eller svekke en forventet infeksjon), eller etter at den virkelige infeksjonen har startet. På lignende måte vil sammensetningen for genterapi bli gitt før det er manifestert eventuelle symptomer på en lidelse eller sykdom, eller etter at en eller flere symptomer er blitt påvist.

En sammensetning er angitt å være "farmakologisk akseptabel" hvis dens administrering kan tolereres av den mottakende pasienten. Et slikt middel er angitt å være administrert i en "terapeutisk effektiv mengde", hvis den mengden som administreres er fysiologisk signifikant. En sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fysiologisk signifikant hvis dens nærvær resulterer i en påvisbar forandring i fysiologien hos en mottakende pasient, det vil si bedrer minst én primær eller sekundær humoral eller cellulær immunrespons mot minst én stamme av et infiserende influensavirus.

"Beskyttelsen" som gis trenger ikke å være absolutt, det vil si at influensainfeksjonen ikke nødvendigvis blir totalt hindret eller utryddet, hvis det er en statistisk signifikant forbedring sammenlignet med en kontrollpopulasjon eller et annet sett av pasienter. Beskyttelsen kan være begrenset til å lindre graden eller utviklingshastigheten når det gjelder symptomene på influensavirusinfeksjonen.

Farmasøytisk administrering

En sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan gi resistens mot en eller flere patogener, for eksempel en eller flere influensavirusstammer, enten ved passiv immunisering eller aktiv immunisering. Ved aktiv immunisering blir en inaktivert eller svekket levende vaksinesammensetning administrert profylaktisk til en vert (for eksempel et pattedyr) og vertens immunrespons på administreringen vil gi en beskyttelse mot infeksjon og/eller sykdom. For passiv immunisering vil de utløste antisera kunne innvinnes og administreres en mottaker hvor det er mistanke om at vedkommende har en infeksjon forårsaket av minst én influensavirusstamme. En genterapisammensetning som beskrevet heri kan gi profylaktiske eller terapeutiske nivåer av det forønskede genproduktet ved aktiv immunisering.

I en utførelse blir vaksinen gitt et hunnpattedyr (ved eller før svangerskap eller fødsel) under betingelser med hensyn til tid og mengde som er tilstrekkelig til å frembringe en immunrespons som tjener til å beskytte både hunnen og fosteret eller den nyfødte (via passiv inkorporering av antistoffene over placenta eller i morsmelken).

Beskrevet heri er således fremgangsmåter for å hindre eller forebygge eller svekke en lidelse eller sykdom, for eksempel en infeksjon som er forårsaket av minst én stamme av en patogen. Slik det brukes her, er det angitt at en vaksine hindre eller svekker en sykdom hvis dens administrering resulterer enten i delvis eller total svekkelse (for eksempel undertrykkelse) av et symptom eller tilstand av sykdommen, eller i total eller delvis immunitet for individet mot sykdommen. Slik det brukes her, er det angitt at en genterapisammensetning hindrer eller svekker en sykdom hvis dens administrering resulterer enten i total eller delvis svekkelse (for eksempel undertrykkelse) av et symptom, eller en tilstand av sykdommen, eller i total eller delvis immunitet for individet mot sykdommen.

Minst ett inaktivert eller svekket influensavirus, eller en sammensetning som inneholder dette, kan administreres på enhver måte som gjør at man oppnådd de forønskede formål, for eksempel ved å bruke en farmasøytisk sammensetning som beskrevet ovenfor.

For eksempel kan en administrering av en slik sammensetning utføres på forskjellige parenterale måter så som subkutant, intravenøst, intradermalt, intramuskulært, intraperitonealt, intranasalt, oralt eller ved en transdermal måte.

Parenteral administrering kan være ved hjelp av en bolusinjeksjon eller ved en gradvis perfusjon over tid. En foretrukket måte for å bruke en farmasøytisk sammensetning, er at den anvendes intramuskulært eller subkutant. Se for eksempel Berkow et al., 1992; Avery, 1987; og Katzung, 1992.

Et typisk regime for å hindre, undertrykke eller behandle en influensavirusrelatert patologi omfatter å administrere en effektiv mengde av en vaksinesammensetning som beskrevet her, administrert som en enkelt behandling, eller gjentatt som forsterkende eller forbedrende doser over et tidsrom som varierer fra en uke til omtrent 24 måneder, eller ethvert variasjonsområde innenfor disse verdiene.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er en "effektiv mengde" av en sammensetning en som er tilstrekkelig til å oppnå den forønskede biologiske effekten. Det er underforstått at den effektive dosen vil være avhengig av pasientens alder, kjønn, helse og vekt, type av samtidig behandling hvis slik forekommer, behandlingsfrekvens og den type effekt som er ønskelig. De variasjonsområder med hensyn til effektive doser som er gitt i det etterfølgende, er bare gitt som foretrukne doseringsområder. De mest foretrukne dosene vil kunne tilpasses den individuelle pasienten, noe som er underforstått og som lett kan bestemmes av den behandlende legen. Se for eksempel Berkow et al., 1992; Avery's, 1987; og Katsung, 1992.

En dose av en svekket virusvaksine for et pattedyr (for eksempel et menneske) eller en voksen fugl, kan være fra 10<3>-10<7>plakkdannende enheter (PFU)/kg, eller ethvert variasjonsområde innenfor disse verdiene. Dosen av den inaktiverte vaksinen kan variere fra omtrent 0,1 til 200, for eksempel 50 Pg hemagglutininprotein. Dosen bør imidlertid være risikofri og effektiv slik dette kan bestemmes ved vanlig kjente fremgangsmåter ved å bruke eksisterende vaksiner som et utgangspunkt.

Dosen av immunoreaktivt HS i hver dose av den replikerte virusvaksinen kan standardiseres slik at den inneholder en egnet mengde, for eksempel 1-50 Pg eller enhver verdi innenfor dette variasjonsområdet, eller en mengde som anbefalt av the U.S. Public Health Service (PHS) som vanligvis er 15 Pg pr komponent for eldre barn, fra 3 år og oppover, eller 7,5 Pg pr komponent for yngre barn, det vil si 3 år eller yngre. Mengden av NA kan også standardiseres, men dette glykoproteinet kan imidlertid være labilt under prosessrensing og lagring (Kendal et al., 1980). Hver 0,5 ml dose av vaksine inneholder fortrinnsvis tilnærmingsvis 1-50 milliarder viruspartikler, fortrinnsvis 10 milliarder partikler.

Oppfinnelsen vil nå bli ytterligere beskrevet ved hjelp av de følgende eksemplene.

Eksempel 1

Materialer og metoder

Celler og virus. 293T humane embryoniske nyreceller og Madin-Darby hundenyreceller (MDCK) ble holdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med henholdsvis 10% kalvefosterserum og i modifisert Eagles medium (MEM) som inneholdt 5% serum fra nyfødte kalver. Alle cellene ble holdt på 37qC i 5% CO2. Influensavirus A/WSN/33 (H1N1) og A/PR/8/34 (H1N1) ble oppformert i 10 dager gamle egg.

Konstruksjon av plasmider. For å utvikle RNA-polymerase I-konstrukter, ble klonet cDNA avledet fra A/WSN/33 eller A/PR/8/34 viralt RNA innført mellom promoter -og terminatorsekvensene i RNA-polymerase I. Kort beskrevet ble klonede cDNA'er amplifisert ved hjelp av PCR med primere som inneholdt BsmBI-seter kuttet med BsmBI og klonet inn i BsmBI-setene i pHH21-vektoren som inneholder den humane RNA-polymerase I-promoteren og muse RNA-polymerase I-terminatoren, skilt av BsmBI-seter (figur 2). PB2-, PB1-, PA-, HA-, NP-, NA-, M- og NS-genene i A/WSN/33-stammen ble så PCR-amplifisert ved å bruke en av de følgende plasmidene: pSCWPB2, pGW-PB1 og pSCWPA (alle ble oppnådd fra Dr. Deby Nayak ved University of California, Los Angeles) og pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Castrucci et al., 1992), pGT3WM og pWNS1 henholdsvis. PB1-genet i influensa A/PR/8/34-virus ble amplifisert ved å bruke pcDNA774 (PB1) (Perez et al., 1998) som en templat. Se figur 6 for sekvensene i primerne. For å sikre at genene var fri for uønskede mutasjoner, ble PCR-avledede fragmenter sekvensert ved hjelp av et autosekvenseringsapparat (Applied Biosystems Inc., CA, USA) ved å anvende den protokollen som var anbefalt av fabrikanten. De cDNA-molekylene som kodet HA-, NP-, NA- og M1-genene i A/WSN/33-virus ble konet som beskrevet (Huddleston et al., 1982) og deretter subklonet inn i den eukaryote ekspresjonsvektoren pCAGGS/MCS (kontrollert av kylling E-aktinpromoteren) (Niwa et al., 1991), noe som resulterte i pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 og pCAGGS-WSN-M1-2/1 henholdsvis. M2- og NS2-genene fra A/PR/8/34-viruset ble amplifisert ved hjelp av PCR og klonet inn i pCAGGS/MCS, noe som ga pEP24c og pCA-NS2. Endelig ble pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) og pcDNA787(PA) brukt for å uttrykke PB2-, PB1- og PA-proteinene under kontroll av cytomegaloviruspromoteren (Perez et al., 1998).

Utvikling av infiserende influensapartikler. 293T-celler (1 x 10<6>) ble transfektert med et maksimum på 17 plasmider i forskjellige mengder ved hjelp av Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) ved å følge fabrikantens instruksjoner. Kort beskrevet ble DNA og transfeksjonsreagensen blandet (2 Pl Trans IT-LT-1 pr Pg DNA), hvoretter blandingen ble innkubert ved romtemperatur i 45 minutter og så tilsatt cellene. Seks timer senere ble DNA-transfeksjonsreagensblandingen erstattet med Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) som inneholdt 0,3% storfeserumalbumin og 0,01% kalvefosterserum. Ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjonen ble virus hentet inn fra supernatanten og titrert på MDCK-celler.

Ettersom hjelpevirus ikke var nødvendig i denne fremgangsmåten, blir innvunne transfekterte virus analysert uten plakkrensing.

Bestemmelse av prosent av plasmidtransfekterte celler som produserer virus.

Tjuefire timer etter transfektering ble 293T-celler dispergert med 0,02% EDTA til enkeltceller. Cellesuspensjonen ble så fortynnet 10 ganger og overført til konfluente monolag av MDCK-celler i 24 brønners plater. Virus ble så påvist vedhjelp av hemagglutineringsprøven.

Immunofargingsprøve. Ni timer etter infeksjon med influensavirus, ble cellene vasket to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS) og fiksert med 3,7% paraformaldehyd (i PBS) i 20 minutter ved romtemperatur. De ble deretter behandlet med 0,1% Triton X-100 og bearbeidet som beskrevet av Neumann et al. (1997).

Resultater

Utvikling av infiserte virus ved plasmiddrevet ekspresjon av virale RNA-segmenter, tre polymeraseunderenheter og NP-protein. Skjønt transfeksjon av celler med en blanding av RNP'er ekstrahert fra rensede virioner resulterer i infiserende influensapartikler, så vil denne strategien sannsynligvis ikke være effektiv når det anvendes åtte forskjellige in vitro utviklede RNP'er. For å produsere infiserende influensavirus utelukkende fra cDNA'er, ble åtte virale RNP'er utviklet in vivo. Det ble således fremstilt plasmider som inneholder cDNA-molekyler for fullengde viral RNA'er fra A/WSN/33-viruset, flankert av den humane RNA-polymerase I-promoteren og muse RNA-polymerase I-terminatoren. I prinsippet så bør en transfeksjon av disse åtte plasmidene i eukaryote celler resultere i en syntese av alle åtte influensa vRNA'er. PB2-, PB1-, PA- og NP-proteinene utviklet ved samtransfeksjon av proteinekspresjonsplasmider skulle så kunne sette sammen nevnte vRNA'er til funksjonelle vRNP'er som så kan replikeres og transkriberes og så danne infiserende influensavirus (figur 3). 1 x 106 293T-celler ble transfektert med proteinekspresjonsplasmider (1 Pg av pcDNA762(PB2), 1 Pg av pcDNA774(PB1), 0,1 Pg av pcDNA787(PA) og 1 Pg av pCAGGS-WSN-NP0/14), 0,1 Pg av hver av de følgende RNA-polymerase I-plasmidene (pPo1I-WSN-PB2, pPo1I-WSN-PB1, pPo1I-WSN-PA, pPo1I-WSN-HA, pPo1I-WSN-NP, pPo1I-WSN-NA, pPo1I-WSN-M og pPo1I-WSN-NS). Beslutningen om å bruke en redusert mengde av pcDNA787(PA) var basert på tidligere observasjoner (Mena et al., 1996) og data når det gjelder optimale betingelser for å utvikle viruslignende partikler (VLP'er) (data ikke vist). Tjuefire timer etter transfeksjonen av nevnte 293T-celler, ble det i supernatanten funnet 7 x 10<3>pfu av virus (eksperiment 1, tabell 1), noe som for første gang viser at reverse genetikkmetoder har evne til å kunne produsere influensa A-virus utelukkende fra plasmider.

Tabell 1. Plasmidsett som ble brukt for å produsere influensavirus fra klonet cDNA*

* 293T-celler ble transfektert med de angitte plasmidene. Tjuefire (eksperimentene 1 og 2) eller førtiåtte timer (eksperimentene 3-8) senere ble virustitreringen i supernatanten bestemt i MDCK-celler.

<†>Hvis intet annet er angitt, ble plasmidene konstruert med cDNA-molekyler som representerer nevnte RNA'er fra A/WSN/33-viruset.

Effektiviteten ved influensavirusproduksjon med samekspresjon av alle de virale strukturelle proteinene. Skjønt ekspresjonen av de virale NP- og polymeraseproteinene er tilstrekkelig for den plasmiddrevne utviklingen av influensavirus, så er det mulig at effektiviteten kan bedres. I tidligere undersøkelser resulterte ekspresjonen av alle de influensavirusstrukturelle proteinene (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2 og NS2) i VLP'er som inneholdt et kunstig vRNA som koder et reporterkloramfenikolacetyltransferasegen (Mena et al., 1996).

Tilgjengeligheten av hele komplementet for de strukturelle proteinene i stedet for bare det som er nødvendig for viral RNA-replikasjon og -transkripsjon, kunne således bedre effektiviteten ved virusproduksjonen. For å oppnå dette ble 293T-celler transfektert med optimale mengder av virale proteinekspresjonsplasmider (slik dette kunne bedømmes ved VLP-produksjon; upubliserte data): 1 Pg av pcDNA762(PB2) og pcDNA774(PB1); 0,1 Pg av pcDNA787(PA); 1 Pg av pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0/14 og pCAGGS-WNA15; 2 Pg av pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0,3 Pg av pCA-NS2; og 0,03 Pg av pEP24c (for M2) sammen med 1 Pg av hvert RNA-polymerase I-plasmid (eksperiment 2, tabell 1). Et nytt sett av celler ble transfektert med det samme settet av RNA-polymerase I-plasmider med unntak av PB1-genet, hvor pPo1I-PR/8/34-PB1 ble brukt i stedet i et forsøk på å utvikle et reassortert virus sammen med plasmider som bare uttrykte PA, PB1, PB2 og NP (eksperiment 3, tabell 1), eller de som uttrykker alle de influensastrukturelle proteinene (eksperiment 4, tabell 1). Utbyttene av WSN-virus var ikke særlig forskjellig etter 24 timer (eksperimentene 1 og 2, tabell 1) eller etter 36 timer (data ikke vist) etter transfeksjonen. Man fant imidlertid en 10 gangers økning av utbyttet av virus med PR/8/34-PB1 når alle de influensavirale strukturelle proteinene var tilveiebrakt (eksperimentene 3 og 4, tabell 1). Negative kontroller som manglet ett av plasmidene for ekspresjonen av PA-, PB1-, PB2- eller NP-proteinene, ga ikke noe virus (eksperimentene 5-8, tabell 1). Avhengig av det virus som ble utviklet, så viste det seg at ekspresjonen av alle influensa A-virusstrukturelle proteiner i betydelig grad bedret effektiviteten ved den reverse genetikkmetoden.

Deretter ble kinetikken for virusproduksjon etter transfeksjon av celler bestemt ved å bruke det settet av plasmider som ble brukt for å utvikle et virus med A/PR/8/34-PB1-genet. I to av tre eksperimenter ble viruset først påvist 24 timer etter transfeksjon. Den titreringsverdien som ble målt på dette tidspunktet var >103 pfu/ml og hadde økt til >106 pfu/ml 48 timer etter transfeksjon (tabell 2). For å undersøke prosenten av plasmidtransfekterte celler som produserte virus , ble 293T celler behandlet med EDTA (0,02%) 24 timer etter transfeksjon for å dispergere cellene, hvoretter det ble utført begrensende fortynningsundersøkelser. I dette eksperimentet ble det ikke funnet noe fritt virus i dyrkningssupernatanten på dette tidspunktet. Resultatene indikerer at 1 av 103,3 celler utviklet infiserende viruspartikler.

Tabell 2. Kinetikk ved virusproduksjon etter plasmidtransfeksjon i 293T-celler*

* 293T-celler ble transfektert med åtte RNA-polymerase I-plasmider som koder A/WSN/33-virusgener med unntak av PB1-genet som var avledet fra A/PR/8/34-virus, og de ni proteinekspresjonsplasmidene som er beskrevet i teksten. På forskjellige tidspunkter ble det titrerte virus i kultursupernatanten i MDCK-celler. ND = ikke utført.

Innvinning av influensavirus inneholdende FLAG-epitopen i NA-proteinet. For å verifisere hvorvidt det reverse genetikksystemet gjør det mulig å innføre mutasjoner i genomet til influensa A-virus, ble det utviklet et virus som inneholdt en FLAG-epitop (Castrucci et al., 1992) i NA-proteinet. 293T-celler ble transfektert med et RNA-polymerase I-plasmid (pPo1I-WSN-NA/FL79) som inneholdt et cDNA som koder både NA-proteinet og en FLAG-epitop ved bunnen av proteintoppen sammen med den nødvendige RNA-polymerase I og proteinekspresjonsplasmider. For å bekrefte at det innvunne viruset (PR8-WSN-FL79) i virkeligheten uttrykte NA-FLAG-proteinet, ble det utført immunofargingsprøver med celler som var infisert med PR8-WSN-FL79 eller A/WSN/33 villtypevirus. Et monoklonalt antistoff til FLAG-epitopen ble påvist i celler som var infisert med PR8-WSN-FL79, men ikke i de som var infisert med villtypevirus. Innvinning av PR8-WSN-FL79-viruset var like effektivt som for det utaggede villtypeviruset (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at det nye reverse genetikksystemet gjør det mulig å innføre mutasjoner i influensa A-virusgenomet.

Utvikling av infiserende influensavirus inneholdende mutasjoner i PA-genet. For å fremstille virus med mutasjoner i PA-genet, ble det innført to såkalte tause mutasjoner, noe som skapte nye gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser (Bsp120I i posisjon 846 og PvuII i posisjon 1284 i nevnte mRNA). Tidligere var det ikke mulig å modifisere dette genet ved revers genetikk på grunn av en mangel på et pålitelig seleksjonssystem. Det ble innvunnet transfekterte virus, PA-T846C og PA-A1284. De innvunne transfekterte virusene ble biologisk klonet ved to påfølgende begrensende fortynninger. For å verifisere at de innvunne virusene virkelig var transfektanter med mutasjoner i PA-genet, så ble cDNA for PA-genet oppnådd ved revers transkriptase-PCR. PA-T846C- og PA-A1284C-virusene hadde de forventede mutasjonene i PA-genet, noe som kunne påvises ved et nærvær av de nye innførte restriksjonssetene. PCR av de samme virale prøvene og primerne uten det reverse transkripsjonstrinnet ga ingen produkter i det hele tatt (data ikke vist), noe som indikerer at PA cDNA virkelig kom fra vRNA i stedet for fra det plasmidet som ble brukt for å utvikle virusene. Disse resultatene viser hvorledes virus med muterte gener kan fremstilles og innvinnes uten bruk av hjelpevirus.

Diskusjon

De reverse genetikksystemene som er beskrevet her, gjør det mulig effektivt å produsere influensa A-virus utelukkende fra klonede cDNA-molekyler. Bridgen og Elliott (1996) brukte også revers genetikk for å utvikle et bunyamweravirus (Bunyaviridae-familien), men det inneholder bare tre segmenter av negativsens RNA og effektiviteten ved dets produksjon av svært lav, 10<2>pfu/10<7>celler. Skjønt utbyttet av viruset var forskjellig fra eksperiment til eksperiment, så ble det konsistent observert mer enn 10<3>pfu/106 celler for influensavirus som inneholdt åtte segmenter. Det er flere forklaringer på den høye effektiviteten i de reverse genetikksystemene som er beskrevet her. I stedet for å produsere RNP'er in vitro (Luytjes et al., 1989), så ble RNP'er utviklet in vivo ved en intracellulær syntese av vRNA'er ved å bruke RNA-polymerase I og via plasmiddrevet ekspresjon av de virale polymeraseproteinene og NP. Også ved å bruke 293T-celler som lett lar seg transfektere med plasmider (Goto et al., 1997), så kunne man sikre at en stor populasjon av cellene mottok alle de plasmider som var nødvendige for virusproduksjon. I tillegg er det sannsynlig at det store antallet transkripter som ble produsert ved hjelp av RNA-polymerase I, som er blant de mest vanlig uttrykte enzymene i voksne celler, bidro til systemets totale effektivitet. Disse egenskapene førte til et tilsvarende stort antall vRNA-transkripter og tilfredsstillende mengder av viralt protein for innkapsling av vRNA, dannelse av RNP'er i kjernen og eksport av disse kompleksene til cellemembranen hvor nye virus ble satt sammen og frigjort.

Tidligere etablerte reverse genetikksystemer (Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Luytjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996) krever hjelpevirusinfeksjon og derfor seleksjonsmetoder som gjør det mulig å innvinne et lite antall transfektanter fra et enormt antall hjelpevirus. Slike strategier er blitt brukt for å utvikle influensavirus som har en av de følgende cDNA-avledede genene: PB2 (Subgarao et al., 1993), HA (Enami et al., 1991; Horimoto et al., 1994), NP (Li et al., 1995), NA (Enami et al., 1990), M (Castrucci et al., 1995; Yasuda et al., 1994) og NS (Enami et al., 1991). De fleste seleksjonsmetodene, bortsett fra de som lar seg anvende på HA- og NA-genene, er avhengige av veksttemperatur, begrensninger med hensyn til verter eller medikamentfølsomhet, noe som derved begrenser anvendelsen av revers genetikk for funksjonell analyse av genprodukter. Selv med HA- og NA-gener for hvilke det er tilgjengelig pålitelige antistoffdrevne seleksjonssystemer, er det vanskelig å produsere virus med fremtredende vekstdefekter. I motsetning til dette, så krever de reverse genetikksystemene som er beskrevet her ikke hjelpevirus og gjør det mulig å utvikle transfektanter med mutasjoner i ethvert gensegment eller med flere alvorlige vekstdefekter. Med en teknologi som gjør det mulig å innføre enhver levedyktig mutasjon i influensa A-virusgenomet, gjør det mulig for forskere å undersøke en rekke tidligere uløste problemer så som type av regulerende sekvenser i de ikke-translaterte områdene av det virale genomet, strukturfunksjonsformål med hensyn til virale proteiner og den molekylære basen for vertsvariasjonsbegrensning og viral patogenisitet.

Skjønt inaktiverte influensavaksiner er tilgjengelige, så er deres effekt bare suboptimal, noe som delvis skyldes deres begrensede evne til å utløse lokale IgA og cytotoksiske T-celleresponser. Kliniske forsøk med kuldetilpassede levende influensavaksiner som nå utføres, antyder at slike vaksiner kan optimalt svekkes slik at de ikke vil forårsake influensasymptomer, men ikke desto mindre induserer beskyttende immunitet (for en oversikt, se Keitel & Piedra, 1998). Preliminære resultater indikerer imidlertid at disse levende virusvaksinene ikke vil være signifikant mer effektive enn de beste inaktiverte vaksinene (for en oversikt, se Keitel & Piedra, 1998), slik at det stadig er muligheter for ytterligere forbedringer. En mulighet vil være å modifisere en kuldetilpasset vaksine med de reverse genetikksystemene som er beskrevet ovenfor. Alternativt er det mulig å starte helt på nytt ved å bruke revers genetikk for å få fremstilt en "master" influensa A-stamme med multiple svekkende mutasjoner i de genene som koder interne proteiner. En av de mer spennende og interessante anvendelsene av det reverse genetikksystemet som er beskrevet her, angår en rask utvikling av svekkede levende virusvaksiner i forbindelse med en mulig forventet pandemi som involverer nye HA- eller NA-undertyper av influensavirus.

Dette nye reverse genetikksystemet vil sannsynligvis gjøre det lettere og bedre å bruke influensavirus som vaksinevektorer. Disse virusene kan manipuleres slik at de uttrykker fremmede proteiner eller immunogene epitoper i tillegg til influensavirusproteinene. Man kan for eksempel utvikle virus med fremmede proteiner som et niende segment (Enami et al., 1991) og bruke dem som levende vaksiner. Ikke bare vil influensavirus stimulere sterke cellemedierte og humorale immunresponser, men de tilveiebringer også et stort utvalg av virionoverflate HA-og NA-proteiner (for eksempel 15 HA- og 9 NA-undertyper og deres epidemiske varianter), noe som gjør det mulig med gjentatte immuniseringer av den samme målbefolkningen.

Influensa VLP'er med kunstig vRNA som koder et reportergen er blitt fremstilt ved å uttrykke viralstrukturelle proteiner og vRNA med vaccinia-T7-polymerasesystemet (Mena et al., 1996). Ved å bruke revers genetikk, kan man nå utvikle VLP'er som inneholder vRNA'er som koder de proteiner som er nødvendige for vRNA-transkribering og replikasjon (for eksempel PA, PB1, PB2 og NP), så vel som vRNA-kodende proteiner av interesse. Slike VLP'er vil kunne brukes i gentilføringsbærervæsker. Viktig er det også at deres mangel på gener som koder virale strukturelle proteiner vil sikre at infiserende virus ikke vil bli produsert etter en VLP-genterapi. Ettersom influensavirusgenomet ikke blir integrert i vertskromosomer, så vil VLP-systemet være egnet for genterapi i situasjoner som krever bare korttids overføring av celler (for eksempel for kreftbehandling). I motsetning til adenovirusvektorer (Kovesdi et al., 1997), så vil influensa VLP'er inneholde både HA- og NA-variantene, noe som gjør det mulig med gjentatte behandlinger av målbefolkninger.

Familien Orthomyxoviridae omfatter influensa A-, B- og C-virus så vel som det nylig klassifiserte Thogotoviruset. Den strategi for utvikle infiserende influensa A-virus utelukkende fra klonede cDNA-molekyler som er beskrevet her, vil kunne anvendes på ethvert ortomyxovirus og muligens også andre segmentert negativsens RNA-virus (for eksempel Bunyaviridae og Arenaviridae). Evnen til å manipulere det virale genomet uten tekniske begrensninger, har store implikasjoner for undersøkelsen av de virale livssyklusene og deres regulering, de virale proteiners funksjon og den molekylære mekanismen bak viral patogenisitet.

Eksempel 2

For å utvikle et revers genetikksystem for influensa A/Puerto Rico/8/34, ble viralt RNA ekstrahert fra den allantoine væsken hos A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), Madison høyvekstvariant (PR8HG) ved å bruke RNeasy minisettet (Qiagen) ved å følge fabrikantens protokoll. cDNA ble syntetisert ved å bruke MMLV-RTase (Promega) og Uni12-primer. cDNA-molekylene ble amplifisert over natten ved PCR og ved å bruke de følgende primersettene:

PB1: Ba PB1-1 og PB1-1735R (frontfragment) og PB1-903 og Ba-PB1-2341R (endefragment)

Ba-PB1-1 CACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA (SEKV.ID. NR. 9)

173PB1-1735R GGGTTTGTATTTGTGTGTCACC (SEKV.ID. NR. 10)

233PB1-903 CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC (SEKV.ID. NR. 11) Ba-PB1-2341R CACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATTT (SEKV.ID. NR. 12)

PB2: Ba PB2-1 og B21260 R (frontfragment) opg WSN PB2 sekv-2 og Ba-PB2-2341R (bakfragment)

Ba-PB2-1 CACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC (SEKV.ID. NR. 13)

B2 1260R CACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG (SEKV.ID. NR.

14)

WSN PBS sekv-2 CTCCTCTGATGGTGGCATAC (SEKV.ID. NR. 15) Ba-PB2-2341R CACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT (SEKV.ID. NR. 16)

PA:

Bm-PA-1 CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC (SEKV.ID. NR. 17)

Bm-PA-2233R CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTACTT (SEKV.ID. NR. 18)

HA:

Bm-HA-1: CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG (SEKV.ID. NR. 19)

Bm-NS-890R: CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT (SEKV.ID. NR. 20)

NP:

Bm-NP-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA (SEKV.ID. NR. 21)

Bm-NP-1565R CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT (SEKV.ID. NR. 22)

NA:

Ba-NA-1: CACACAGGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGAGT (SEKV.ID. NR. 23)

Ba-NA-1413R:

CACACAGGTCTGGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT (SEKV.ID. NR. 24)

M:

Bm-M-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEKV.ID. NR. 25)

Bm-M-1027R CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT (SEKV.ID. NR. 26)

NS:

Bm-NS-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTG (SEKV.ID. NR. 27)

Bm-NS-890R CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT (SEKV.ID. NR. 28)

DNA-polymerase: pfu nativ DNA-polymerase (Stratagene).

PCR-produktene blir skilt ved hjelp av gelelektroforese og ekstrahert fra agarosegelen ved å bruke et gelekstraksjonssett (Qiagen). De ekstraherte genene blir ligert inn i pT7Blue bluntvektoren (Novagen) ved å bruke et Takara ligeringssett versjon II (Takara). Etter 5 timer ble de ligerte genene transformert inn i JM109 (PB2-, M- og NS-genene) eller DH5alfa (PA, PB1 og NP). Seks kolonier for hvert gen ble dyrket i TB i 8 timer. Plasmidene ble ekstrahert fra bakteriekulturen og fire kloner pr gen ble sekvensert.

PA-, NP-, M- og NS-genene i pT7Blue ble kuttet ut ved hjelp av BsmBI-enzymet (New England Biolabs). PB1-genet ble kuttet ved hjelp av BsaI (New England Biolabs). De utkuttede genene ble ligert over natten med en pPoIIR-vektor som inneholder den humane RNA-polymerase I-promoteren og den muse RNA-polymerase I-terminatoren som var blitt kuttet med BsmBI. Frontfragmentet av PB2-genet i pT7Blue ble kuttet ved hjelp av BsrGI (New England Biolabs) og BamHI (Roche), mens det bakre fragmentet ble kuttet med BsrGI (New England Biolabs) og SpeI (Roche). De utkuttede fragmentene ble blandet og oppløst ved hjelp av BsaI. Etter 6 timer ble de oppløste genene renset ved å bruke et PCR-rensesett (Qiagen) og ligert over natten mellom BsmBI-setene i pPoIIR-vektoren.

De ligerte PB1-, PA-, NP-, M- og NS-pPoIIR-genene ble brukt for å transformere JM109 (M- og NS-genene) og DH5alfa (PB1-, PA- og NP-genene) over natten. Koloniene av de transformerte bakteriene ble dyrket i LB over natten. Det ligerte PB2-pPoIIR ble brukt for å transformere JM109 over natten.

Plasmidene ble ekstrahert fra bakteriekulturene og geninnsettingene ble bekreftet ved enzymoppløsning. De bakteriekoloniene som var transformert med PB2-PoIIR ble dyrket i LB i 8 timer. Plasmidene ble så ekstrahert og geninnsettingen ble bekreftet ved enzymoppløsning. Alle pPoII-konstruktene ble sekvensert for å sikre at de ikke inneholdt uønskede mutasjoner.

pPoIIR-konstruktene for PR8HG ble transfektert inn i 293T humane embryoniske nyreceller med A/WSN/33(WSN)-NA og NA, N/Hong Kong/483/97(HK)-HAavir og NA eller A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA og NA PoII-konstrukter og fire proteinekspresjonskonstrukter for polymeraseproteinene og NP fra A/WSN/33. Supernatantene fra de transfekterte 293T-cellene ble seriefortynnet (ufortynnet til 10<-7>) og infisert inn i de allantoine hulrommene hos 9 dager gamle kyllingegg med embryoer. Allantoinvæskene fra de infiserte eggene ble høstet og deres virustiterverdi ble testet ved HA-prøve (tabell 3).

Tabell 3

HA-positive prøver (prøver med WSN-HA NA med 10<-2>og virus med HK-HAavir NA ved ufortynnet) ble seriefortynnet fra 10<-2>til 10<-8>og 100 Pl av hver fortynning ble brukt til å infisere kyllingegg med embryoer. Allantoinvæskene fra de infiserte eggene ble innhøstet, og deres virustiterverdier ble testet ved en HA-prøve (tabell 4). 50% egginfeksjonsdosen (EID50) for A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) fremstilt fra plasmider var 10<10,33>/ml og HA-titerverdien var 1:3200.

Det ble fremstilt et rekombinant virus med HA- og NA-genene fra A/Hong Kong/213/2003 (H5N1) og resten med type A-influensavirusgener fra PR8HR. Titerverdien for det rekombinante viruset var 10<10,67>EID50/ml og HA-titerverdien var 1:1600.

Tabell 4

Virus med PR8-gener HA-titerverdi (HAU/ml) for hver fortynning

Sekvenser for PR8-gener:

PA

Eksempel 3

Influensavirus A/Hong Kong/213/2003 (H5N1, HK213) replikerer seg systemisk i kyllinger og forårsaker en letal infeksjon. Videre er dette viruset også letalt for kyllingembryoer. Skjønt dets overflateproteiner er sterkt beslektet med de for tiden sirkulerende patogene fugleinfluensavirusene, kan således HK213 ikke brukes som en vaksinestamme, ettersom forsøk på å dyrke den i embryonerte kyllingegg har resultert i produksjon av allantoinvæske av dårlig kvalitet. Videre er bruken av dette sterkt virulente viruset i produksjonen av vaksiner risikofylt for de som arbeider med vaksinen. For å teste muligheten for å bruke A/PR/8/34 som en mastervaksinestamme, så ble spaltingssetet for hemagglutinin (HA) -genet i HK213 (som inneholder multiple basiske aminosyrer) mutert fra en virulent til en avirulent fenotype (fra RERRRKKR (SEKV.ID. NR. 9) til -TETR). Et virus som inneholdt det muterte HA-genet ga en ikke-letal og lokalisert infeksjon i kyllinger. Videre var det muterte viruset ikke letalt for kyllingembryoer. Vekst av det muterte viruset i embryonerte egg ga således en allantoinvæske av høy kvalitet og i denne svekkede formen er nevnte virus risikofritt for de som arbeider med vaksinen.

Et rekombinant virus som inneholder neuraminidase (NA) og muterte HA-gener fra HK213 og alle de gjenværende gener fra høytiter A/PR/8/34 (H1N1, HG-PR8) -virus (eksempel 2) som vokser 10 ganger bedre enn de andre A/PR/8/34 PR8-stammene i egg (10<10>EID50/ml; HA-titer: 1:8000) ble utviklet i embryonerte kyllingegg. Dette rekombinante viruset som uttrykker overflateproteiner som er beslektet med de for tiden sirkulerende patogene fugleinfluensavirustypene, vokste til høy titerverdi i embryonerte kyllingegg (figur 4). Ved å erstatte HA- og NA-genene i HG-PR8 med de som forefinnes i en for tiden sirkulerende stamme av influensavirus, resulterte således i en vaksinestamme som risikofritt kan fremstilles og som viser bruken av PR8-HG som en mastervaksinestamme.

Referanser

Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3. utgave, ADIS Press, Ltd., Williams og Wilkins, Baltimore, MD (1987).

Aymard-Henry et al., Virology: A Practical Approach, Oxford IRL Press, Oxford, 119-150 (1985).

Bachmeyer, Intervirology, 5: 260 (1975).

Berkow et al., red., The Merck Manual, 16. utgave, Merck & Co., Rahway, NJ (1992).

Bridgen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 15400 (1996).

Castrucci et al., J. Virol., 66: 4647 (1992).

Castrucci et al., J. Virol., 69: 2725 (1995).

Conzelmann et al., J. Gen. Virol., 77: 381 (1996).

Conzelmann et al., Trends Microbiol., 4: 386 (1996).

Conzelmann et al., Annu. Rev. Genet., 32: 123 (1998).

Cozelmann et al., J. Virol., 68: 713 (1994).

Edwards, J. Infect. Dis., 169: 68 (1994).

Enami et al., J. Virol., 65: 2711 (1991).

Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 3802 (1990).

Enami et al., Virology, 185: 291 (1991).

Fodor et al., J. Virol., 73: 9679 (1999).

Goto et al., Virology, 238: 265 (1997).

Grand og Skehel, Nature, New Biology, 238: 145 (1972).

Hatta et al., Science, 293: 1840 (2001).

Horimoto et al., J. Virol., 68: 3120 (1994).

Huddleston et al., Nucl. Acids Res., 10: 1029 (1982).

Keitel et al., i Textbook of Influenza, red. Nickolson, K.G., Webster, R.G., og Hay, A. (Blackwell, Oxford), sidene 373-390 (1998).

Kendal et al., Infect. Immunity, 29: 966 (1980).

Kilbourne, Bull. M2 World Health Org., 41: 653 (1969).

Kovesdi et al., J. Curr. Opin. Biotechnol., 8: 583 (1997).

Laver & Webster, Virology, 69: 511 (1976).

Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 4477 (1995).

Li et al., Virus Res., 37: 153 (1995).

Luytjes et al., Cell, 59: 1107 (1989).

Marriott et al., Adv. Virus Res., 53: 321 (1999).

Mena et al., J. Virol., 70: 5016 (1996).

Mizrahi, (red.), Viral Vaccines, Wiley-Liss, New York, 39-67 (1990).

Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract., 2: 174 (1993).

Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5177 (1991).

Munoz et al., Antiviral Res., 46: 91 (2000).

Nagai et al., Microbiol. Immunol., 43: 613 (1999).

Nagai, Rev. Med. Virol., 9: 83 (1999).

Neumann et al., Adv. Virus Res., 53: 265 (1999).

Neumann et al., J. Gen. Virol., 83: 2635 (2002).

Neumann et al., J. Virol., 71: 9690 (1997).

Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96: 9345 (1999).

Neumann et al., Virology, 202: 477 (1994).

Neumann et al., Virology, 287: 243 (2001).

Niwa et al., Gene, 108: 193 (1991).

Ogra et al., J. Infect. Dis., 134: 499 (1977).

Osol (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980).

Parks et al., J. Virol., 73: 3560 (1999).

Pekosz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96: 8804 (1999).

Perez et al., Virology, 249: 52 (1998).

Pleschka et al., J. Virol., 70: 4188 (1996).

Radecke et al., EMBO J., 14: 5773 (1995).

Roberts et al., Virology, 247: 1 (1998).

Robertson et al., Biologicals, 20: 213 (1992).

Robertson et al., Giornale di Igiene e Medicina Preventive, 29: 4 (1988).

Rose, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 14998 (1996).

Schnell et al., EMBO J., 13: 4195 (1994).

Subbaro et al., J. Virol., 67: 7223 (1993).

World Health Organization TSR nr. 673 (1982).