EA012965B1 - Композиция для получения реассортантного рекомбинантного вируса гриппа, способ получения указанного вируса и реассортантный рекомбинантный вирус гриппа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к композициям, полезным для получения вирусов гриппа в высоких титрах, например в отсутствие хелперных вирусов, содержащих последовательности генов из изолятов вирусов гриппа высоких титров.

Description

Вирусы с отрицательной смысловой РНК относятся к семи семействам (ВйаЬбоушбае. Рагатухоутбае. Ейоушбае. Вотаушбае. Оййотухоушбае. Вииуаушбае и Атеиаушбае). которые включают широко распространенные патогены человека. такие как респираторно-синцитиальный вирус, вирус гриппа. вирус кори. вирус Эбола. а также вирусы животных. наносящие значительный ущерб птицеводству и животноводству (например. вирус болезни Ньюкастла и вирус чумы рогатого скота). Первые четыре семейства характеризуются несегментированным геномом. в то время как в последние три семейства входят вирусы. геном которых состоит из шести-восьми. трех или двух отрицательных смысловых РНК соответственно. Общим свойством вирусов с отрицательной смысловой РНК является отрицательная полярность генома. т. е. вирусная РНК (вРНК) комплементарна матричной РНК (мРНК) и таким образом сама по себе неинфекционна. Для инициации вирусной транскрипции и репликации вРНК должна транскрибироваться в положительную смысловую мРНК или кРНК соответственно комплексом вирусной полимеразы и нуклеопротеина; в случае вирусов гриппа типа А комплекс вирусной полимеразы состоит из трех полимеразных белков. а именно РВ2. РВ1 и РА. Во время вирусной репликации кРНК служит матрицей для синтеза новых молекул вРНК. Для всех вирусов с отрицательной смысловой РНК некодирующие участки на обоих 3- и 5-концах вРНК и кРНК являются определяющими для транскрипции и репликации вирусного генома. В отличие от клеточных или вирусных мРНК-транскриптов как кРНК. так и вРНК не копированы на 5-конце и не полиаденилированы на 3-конце.

Основные функции многих вирусных белков были установлены в биохимических экспериментах и при исследовании течения вирусной инфекции. Однако обратные генетические системы существенным образом увеличили наши знания о вирусах с отрицательной смысловой РНК. формирующей как фрагментированный. так и нефрагментированный геном. применительно к механизмам их патогенности и репликации. а также обусловили значительный прогресс в разработке живых аттенуированных вирусных вакцин. Обратные генетические системы. как этот термин используется в молекулярной вирусологии. означает формирование вирусов на основе генома. происходящего из клонированных кДНК (см.. например. обзор Ыеитапи е! а1.. 2002).

Для инициации репликации вирусов с отрицательной смысловой РНК вРНК или кРНК должны быть экспрессированы вместе с полимеразным комплексом и нуклеопротеином. Вирус бешенства был первым вирусом с отрицательной смысловой РНК. формирующей нефрагментированный геном. который был целиком получен на основе клонированной кДНК. Бсйе11 е! а1. (1994) получили рекомбинантный вирус бешенства совместной трансфекцией клеток конструктом кДНК. кодирующим полноразмерную кРНК. и конструктами. экспрессирующими вирусные белки Ь. Р и N. находящимися под контролем промотора РНК-полимеразы Т7. Инфицирование клеток рекомбинантным вирусом вакцины. обеспечивающим РНК-полимеразу Т7. приводило к сборке инфекционных частиц вируса бешенства. В указанной системе полимеразы Т7 первичная транскрипция полноразмерной кРНК под контролем РНК-полимеразы Т7 обеспечивала образование некэпированного кРНК-транскрипта. Однако три гуанидиновых нуклеотида. которые формируют оптимальную инициаторную последовательность РНК-полимеразы Т7. были прикреплены к 5-концу. С целью формирования аутентичного 3-конца кРНК-транскрипта. который необходим для продуктивного инфекционного цикла. была использована рибозимная последовательность вируса гепатита дельта (НЭУВх). чтобы обеспечить точное аутокаталитическое расщепление на 3-конце кРНК-транскрипта.

Со времени первоначального сообщения Бсйие11 е! а1. (1994) технологии. сходные с обратными генетическими системами. обусловили получение многочисленных вирусов с отрицательной смысловой РНК. формирующей нефрагментированный геном (Сои/е1таии. 1996; Сои/е1таии. 1998; Сои/е1таии е! а1.. 1996; Мато!! е! а1.. 1999; Мипох е! а1.. 2000; №щак 1999; №итаии е! а1.. 2002; ВоЬейк е! а1.. 1998; Воке. 1996). Модификации исходной процедуры спасения включают экспрессию РНК-полимеразы Т7 из стабильно трансфицированных клеточных линий (Вабеске е! а1.. 1996) или из экспрессирующих белки плазмид (Ьаеткои е! а1.. 1995). а также процедуры теплового шока для увеличения эффективности спасения (Рагкк е! а1.. 1999). Основываясь на системе полимеразы Т7. Впбдеи и ЕШо!! (1996) получили вирус Буньямвера (семейство Вииуаушбае) из клонированных кДНК и продемонстрировали возможность искусственного создания с помощью данной системы вирусов с отрицательной смысловой РНК. формирующей фрагментированный геном.

В 1999 г. была разработана технология плазмидных обратных генетических систем. основанная на использовании клеточной РНК-полимеразы I с целью получения вируса гриппа А с фрагментированным геномом непосредственно из клонированных кДНК (Робот е! а1.. 1999; №итаии и Ка^аока. 1999). РНКполимераза I. ядерный фермент. синтезирует рибосомальную РНК. которая подобно РНК вируса гриппа не содержит кэпа на 5-конце или полиА-структуры на 3-конце. Транскрипция с помощью РНКполимеразы I приводит к образованию конструкта. содержащего кРНК вируса гриппа. фланкированного промотором РНК-полимеразы I и последовательностями терминации. что обеспечивает синтез вРНК вируса гриппа (Робот е! а1.. 1999; №итаии и Ка^аока. 2001; Рекок/ е! а1.. 1999). Система является высокоэффективной. обеспечивает формирование более 10⁸ инфекционных вирусных частиц в расчете на 1 мл супернатанта трансфицированных плазмидой клеток через 48 ч после трансфекции.

- 1 012965

Необходимой остается разработка способа получения ортомиксовирусов высокого титра, таких как вирус гриппа А, исключительно при использовании кДНК.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к выделенной и/или очищенной молекуле нуклеиновой кислоты (полинуклеотиду), кодирующей по крайней мере один из белков вируса гриппа в высоком титре, например большем чем 10⁹/мл, например большем чем 10¹⁰/мл, или участок такого белка, а также к последовательности, комплементарной указанной. В одном случае выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белки НА, ΝΑ, РВ1, РВ2, РА, ΝΡ, М или N8 или их участки, имеющие по существу ту же самую активность, что и соответствующие полипептиды, кодируемые 8ΕΟ ΙΌ N0: 1-8.

Используемый здесь термин по существу та же самая активность означает активность, которая составляет 0,1, 1, 10, 30, 50, 90%, например, до 100% или более от активности соответствующего полноразмерного полипептида или означает определяемый уровень белка, который составляет около 80, 90% или более определяемого уровня соответствующего полноразмерного полипептида. В другом варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который, по существу, идентичен, например, по крайней мере на 80%, например на 90, 92, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из 8ΕΟ ΙΌ N0: 1-8. В еще одном варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична, например, по крайней мере на 50%, например на 60, 70, 80 или 90% или более одной из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1-8 или комплементарна ей и, в одном случае, также кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по крайней мере на 80%, например на 90, 92, 95, 97 или 99% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-8. В другом варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид с одной или более, например, 2, 5, 10, 15, 20 или более консервативными аминокислотными заменами, например консервативными заменами от 10 до 20% остатков по отношению к полипептиду, кодируемому одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-8.

Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемым остатками, имеющим сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, состоит из глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; группа аминокислот, имеющих алифатическогидроксильные боковые цепи, состоит из серина и треонина; группа аминокислот, имеющих боковые цепи, содержащие амид, состоит из аспарагина и глутамина; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, состоит из фенилаланина, тирозина и триптофана; группа аминокислот, имеющих щелочные боковые цепи, состоит из лизина, аргинина и гистидина, и группа аминокислот, имеющих боковые цепи, содержащие серу, состоит из цистеина и метионина. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются следующие: валин-лейцин-изолейцин; фенилаланин-тирозин; лизин-аргинин; аланин-валин; глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота и аспарагин-глутамин.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты или комплементарная ей последовательность гибридизуется с одной из нуклеотидных последовательностей 8Ε0 ΙΌ N0: 1-8 или комплементарной ей последовательностью в строгих, умеренно строгих или мягких условиях. Например, могут быть использованы следующие условия гибридизации: 7% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0.5 М NаΡ04, 1 мМ ΕΌΤΑ при 50°С с отмыванием 2Х88С, 0.1% 8Ό8 при 50°С (мягкие условия); 7% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0.5 NаΡ04, 1 мМ ΕΌΤΑ при 50°С с отмыванием 1Х88С, 0.1% 8Ό8 при 50°С (умеренно строгие условия, которые являются более желательными); 7% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0.5 NаΡ04, 1 мМ ΕΌΤΑ при 50°С с отмыванием 0.5Х88С, 0.1% 8Ό8 при 50°С (жесткие условия, которые являются наиболее желательными). Предпочтительными являются следующие условия: 7% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0.5 М NаΡ04, 1 мМ ΕΌΤΑ при 50°С с отмыванием 0.1Х88С, 0.1% 8Ό8 при 50°С (более строгие условия); 7% додецилсульфата натрия (8Ό8), 0.5 М NаΡ04, 1 мМ ΕΌΤΑ при 50°С с отмыванием 0.1Х88С, 0.1% 8Ό8 при 65°С (очень строгие условия). В одном случае заявленная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50%, например на 60, 70, 80 или 90% или более соответствует аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, идентичной одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-8, и который обладает по существу той же самой активностью, что и полноразмерный полипептид, кодируемый одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-8.

Заявленная молекула нуклеиновой кислоты может быть использована для экспрессии белков вируса гриппа, получения химерных генов, например, с другими вирусными генами, включая другие гены вируса гриппа, и/или для получения рекомбинантного вируса. Изобретение также относится к выделенным полипептидам, рекомбинантному вирусу и клеткам-хозяевам, которые контактируют с молекулами нуклеиновой кислоты или заявленным в соответствии с изобретением рекомбинантным вирусом.

Изобретение также относится по крайней мере к одному из следующих выделенных и/или очищенных векторов: вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью

- 2 012965 терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка ΝΡ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка ΝΑ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка N8 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор включает последовательности, кодирующие белки НА, ΝΑ, ΡΒ1, РВ2, ΡΑ, ΝΡ, М, N8 или их участки, имеющие по существу ту же самую активность, что и соответствующий полипептид, кодируемый одной из 8ЕО ΙΌ N0: 1-8, например последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 80% идентична последовательности полипептида, кодируемого одной из 8Е0 ΙΌ N0: 1-8. Факультативно, два вектора могут быть использованы вместо вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, например вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка М1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка М2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции.

Изобретение также относится к выделенным и очищенным векторам или плазмидам, которые экспрессируют или кодируют белки вируса гриппа, или экспрессируют или кодируют вРНК, как нативную, так и рекомбинантную вРНК. Предпочтительно векторы содержат кДНК вируса гриппа, например, вируса гриппа А (например, любой ген вируса гриппа А, в том числе подтипов 15 НА или 9 NΑ), вируса гриппа В или С [см. главы 45 и 46 Р1е16к У1го1оду (Р1е16к с1 а1. (ебк.), Ырртсой-Кауеи РиЫ., РЫ1а6е1рЫа, ΡΑ (1996), включенные в настоящее описание в качестве ссылок], хотя в составе заявленных векторов и способов могут быть использованы гены любых организмов. Может быть использована кДНК, находящаяся как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Например, вектор, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может кодировать белок вируса гриппа (смысловая ориентация) или вРНК (антисмысловая ориентация). Любой подходящий промотор или последовательность терминации транскрипции может использоваться для экспрессии белка или пептида, например, вирусного белка или пептида, белка или пептида невирусного патогенна или терапевтически значимого белка или пептида.

Изобретение также относится к композициям, содержащим многочисленные векторы на основе вируса гриппа, заявленные в соответствии с настоящим изобретением. В одном случае композиции включают: а) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NΡ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NΑ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка N8 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор содержит промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; и б) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, кодирующего белок РА вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ1 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ2 вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок NΡ вируса гриппа. Необязательно, векторы, указанные в б), включают один или более векторов, кодирующих белки ИР, N8, М, например, М1 и М2, НА или NΑ. Предпочтительно векторы, кодирующие вирусные белки, также содержат последовательность терминации транскрипции.

Еще в одном случае композиции включают: а) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транс

- 3 012965 крипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка ΝΡ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белков ΝΑ и ΝΒ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка N8 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка ВМ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор содержит промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; и б) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, кодирующего белок РА вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ1 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ2 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок ΝΡ вируса гриппа. Необязательно, векторы, указанные в б), включают один или более векторов, кодирующих белки ΝΡ, N8, М, НА или ΝΑ. Предпочтительно векторы, кодирующие вирусные белки, также содержат последовательность терминации транскрипции.

Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут содержать представляющие интерес ген или открытую рамку считывания, например чужеродный ген, кодирующий иммуногенный пептид или белок, используемые в качестве вакцины. Соответственно, изобретение также относится к композициям, описанным выше, в которых один из векторов замещен или же композиции дополнительно содержат вектор, включающий промотор, связанный с 5-концом последовательностей вируса гриппа, необязательно содержащих 5-кодирующие вирусные последовательности или их фрагменты, связанные с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, например, с кДНК, соединенной с 3-концом последовательностей вируса гриппа, необязательно содержащих 3кодирующие вирусные последовательности или их фрагменты, связанные с последовательностью терминации транскрипции. Предпочтительно представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, такая как кДНК, находится в антисмысловой ориентации. Введение такой композиции в клеткухозяин, пермиссивную для репликации вируса гриппа, приводит к сборке рекомбинантного вируса, содержащего вРНК, соответствующую последовательностям вектора. Промотор в таком векторе, необходимый для образования вРНК, может быть промотором РНК-полимеразы I, промотором РНКполимеразы II, промотором РНК-полимеразы III, промотором Т7 и промотором Т3, и, необязательно, вектор содержит последовательность терминации транскрипции, такую как последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы I, последовательность терминации транскрипции РНКполимеразы II, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы III или рибозим. В одном случае вектор, содержащий представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, содержит представляющую интерес кДНК. Такая кДНК как в составе вектора для получения вРНК, так и в составе вектора для получения белка, может кодировать иммуногенный эпитоп, такой как эпитоп, полезный для терапии рака или для использования в качестве вакцины, или пептид, а также полипептид, полезный для целей генной терапии. При получении вируса вектор или плазмида, содержащие представляющие интерес ген или кДНК, могут быть замещены вектором или плазмидой, содержащими ген вируса гриппа, или могут быть добавлены к векторам или плазмидам, содержащим все гены вируса гриппа.

Многочисленные векторы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть физически соединены друг с другом или же каждый вектор может присутствовать в качестве индивидуальной плазмиды или в другой форме, например в виде линейного вектора доставки нуклеиновой кислоты.

Промотор или последовательность терминации транскрипции в векторах экспрессии вРНК или белка могут быть теми же самыми или отличными от промотора и последовательности терминации транскрипции любого другого вектора. Предпочтительно, вектор или плазмида, которые экспрессируют вРНК вируса гриппа, включают промотор, подходящий для экспрессии по крайней мере в одной подходящей клетке-хозяине, например, клетке-хозяине птиц или млекопитающих, таких, как клетка собаки, кошки, лошади, коровы, овцы или клетка приматов, в том числе человека, или, предпочтительно, в более чем одной клетке-хозяине.

В одном случае один или более векторов для получения вРНК включают промотор (без ограничений указанными) РНК-полимеразы I, например промотор РНК-полимеразы I человека; промотор РНКполимеразы II, промотор РНК-полимеразы III, промотор Т7 и промотор Т3. Предпочтительные последовательности терминации транскрипции для векторов экспрессии вРНК включают (без ограничений указанными) последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы I, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы II, последовательность терминации транскрипции РНКполимеразы III или рибозим. В объеме настоящего изобретения рибозимы (без ограничений указанными) включают рибозимы 1е1гайуиета, РНКазу Р, рибозимы в форме головки молотка, рибозимы в форме булавочной головки рибозимы вируса гепатита, а также синтетические рибозимы.

Еще в одном случае по крайней мере один вектор для получения вРНК включает промотор РНКполимеразы II, соединенной с последовательностью рибозима, связанной с вирусной кодирующей последовательностью, соединенной с другой последовательностью рибозима, необязательно с последова

- 4 012965 тельностью терминации транскрипции РНК-полимеразы II. Кроме того, по крайней мере два и более предпочтительно, например, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 векторов для получения вРНК включают промотор РНКполимеразы II, первую последовательность рибозима, которая связана с 5-концом последовательности, соответствующей вирусным последовательностям, в том числе вирусным кодирующим последовательностям, которые связаны с 5-концом второй последовательности рибозима, которая связана с 5-концом последовательности терминации транскрипции. Каждый промотор РНК-полимеразы II в каждом векторе для получения вРНК может быть тем же самым промотором РНК-полимеразы II или отличным от такового любого другого вектора для получения вРНК. Сходным образом, любая последовательность рибозима в каждом векторе для получения вРНК может быть той же самой последовательностью или отличной от таковой любого другого вектора для получения вРНК. Согласно одному варианту осуществления изобретения последовательности рибозимов в одном векторе не являются одинаковыми.

Изобретение также относится к способу получения вируса гриппа. Способ включает обеспечение контактирования клетки с многочисленными векторами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением, например, одновременно или последовательно, в частности, с заявленной композицией, в количестве, эффективном для получения инфекционного вируса гриппа. Изобретение также относится к выделению вируса из клетки, которая контактировала с указанной выше композицией. Таким образом, изобретение также относится к выделенному вирусу, а также к клетке-хозяину, которая контактировала с заявленными композицией или вирусом. Кроме того, изобретение относится к способу контактирования клетки с одним или более векторами, предназначенными как для получения вРНК, так и белка, до контактирования с другими векторами, предназначенными как для получения вРНК, так и белка.

Заявленный в соответствии с изобретением способ обеспечивает простое манипулирование вирусами гриппа, например, путем введения аттенуированных мутаций в вирусный геном. Более того, поскольку вирусы гриппа индуцируют сильный гуморальный и клеточный иммунитет, изобретение позволяет использовать указанные вирусы в качестве высокоэффективных вакцинных векторов, в особенности с точки зрения доступности природных вариантов вируса, которые могут быть использованы последовательно в целях генной терапии.

Описанные здесь способы получения вирусов, которые не требуют инфицирования хелперными вирусами, полезны в исследованиях вирусного мутагенеза, для получения вакцин (например, против СПИДа, гриппа, гепатита В, гепатита С, риновирусной инфекции, филовирусной инфекции, малярии, герпеса и ящура) и конструирования векторов для целей генной терапии (например, для терапии рака, опухолей центральной нервной системы, СПИДа, мышечной дистрофии, недостаточности аденозиндезаминазы и орнитинтранскарбамилазы). Таким образом, изобретение обеспечивает получение вирусов, которые могут использоваться в медицинской практике (например, для получения вакцин или в генной терапии).

Изобретение также относится к способу иммунизации индивидуума против патогенного организма, например бактерии, вируса или паразита, а также злокачественной опухоли. Способ включает введение индивидууму такого количества по крайней мере одного выделенного вируса, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, необязательно в комбинации с адъювантом, которое эффективно для иммунизации индивидуума. Вирус содержит вРНК, в том числе кодирующую полипептид патогенного организма или специфичный для опухоли полипептид.

Изобретение также относится к способу усиления или увеличения экспрессии эндогенного белка в организме млекопитающих, у которых имеются указания на заболевание или само заболевание, характеризующееся пониженным количеством или утратой синтеза эндогенного белка. Способ включает введение млекопитающему такого количества выделенного вируса, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в таком количестве, которое эффективно для усиления или увеличения количества эндогенного белка в организме млекопитающего. Предпочтительно млекопитающим является человек.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическая диаграмма установленной обратной генетической системы. Согласно методу трансфекции ΚΝΡ (А) очищенный ΝΡ и полимеразу собирают в комплексы ΚΝΡδ при использовании ίη νίΐτο синтезированной вРНК. Клетки трансфицируют ΚΝΡδ и далее инфицируют хелперным вирусом. Согласно методу РНК-полимеразы I (В) плазмиду, содержащую промотор РНК-полимеразы I, кДНК, кодирующую вРНК, подлежащую спасению, и терминатор РНК-полимеразы I путем трансфекции вводят в клетки. Внутриклеточная транскрипция с помощью РНК-полимеразы I приводит к синтезу синтетической вРНК, которая упаковывается в потомство вирусных частиц при инфицировании клеток хелперным вирусом. При обоих методах вирусы-трансфектанты (т.е. вирусы, содержащие РНК, происходящую из клонированной кДНК) отбирают из популяции хелперных вирусов.

Фиг. 2. Схематическая диаграмма получения конструктов РНК-полимеразы I. КДНК, происходящую из вируса гриппа, амплифицировали методом РСК., расщепляли ВктЫ и клонировали в сайты ВктЫ вектора рНН21 (Е. Нойтапп, Р11. Ό. тезисы, 1и81и8, Είοόίβ-υηίνοΓδίΙν. С|С55СП. Сеттапу), который содержит промотор РНК-полимеразы I человека (Р) и терминатор РНК-полимеразы I мыши (Т). Тимидиновый нуклеотид выше терминирующей последовательности (*Т) соответствует 3-концу вРНК вируса гриппа. Последовательности вируса гриппа А показаны в блоках, закрашенных черным цветом (8ЕС Ш N0: 29-40).

- 5 012965

Фиг. 3. Предлагаемый обратно-генетический способ для получения сегментированных вирусов с отрицательной смысловой РНК. Плазмиды, содержащие промотор РНК-полимеразы I и кДНК для каждого из восьми сегментов вирусной РНК, а также терминатор РНК-полимеразы I вводят путем трансфекции в клетки вместе с плазмидами, экспрессирующими белок. Несмотря на то что инфекционные вирусы могут быть получены при использовании плазмид, экспрессирующих РА, РВ1, РВ2 и ΝΡ, экспрессия всех остальных структурных белков (показаны в овалах) увеличивает эффективность продукции вируса в зависимости от того, какой вирус получают.

Фиг. 4. Титры различных вирусов гриппа.

Детальное описание изобретения

Определения.

Используемые здесь понятия выделенный и/или очищенный относятся к заявленным в соответствии с изобретением полученным, выделенным и/или очищенным ίη νίίτο вектору, плазмиде или вирусу, которые не ассоциированы с какими-либо примесями ίη νίνο или по существу свободны от каких-либо примесей ίη νίίτο. Выделенный препарат вируса обычно получают культивированием вируса ίη νίίτο и его размножением; такой препарат по существу свободен от других инфекционных агентов.

Используемый здесь термин по существу свободный означает, что определенный инфекционный агент находится в количествах ниже уровня детекции при использовании стандартных методов определения данного агента.

Понятие рекомбинантный вирус означает, что данный вирус был сконструирован ίη νίίτο, например, при использовании технологии рекомбинантных ДНК для введения изменений в вирусный геном.

Понятие рекомбинантная нуклеиновая кислота или рекомбинантная ДНК-последовательность или фрагмент (сегмент) относится к нуклеиновой кислоте, например, ДНК, которая происходит или выделена из источника, который может последовательно химически изменять указанную ДНК ίη νίίτο таким образом, что эта последовательность будет отличаться от природной или не будет соответствовать ни одной из известных природных последовательностей, которые локализуются или будут локализованы в нативном геноме. Примером ДНК, происходящей из такого рода источника, может быть ДНКпоследовательность, представляющая собой полезный ДНК-фрагмент, который химически синтезирован в очищенной по существу форме. Примером ДНК, выделенной из такого рода источника, может быть полезная ДНК-последовательность, которая вырезана или удалена из указанного источника химическим путем, например, при использовании рестрикционных эндонуклеаз, таким образом, что она может быть в дальнейшем использована, скажем, амплифицирована в целях осуществления изобретения, с помощью методов генной инженерии.

Репликация вируса гриппа.

Вирус гриппа типа А имеет геном, состоящий из восьми одноцепочечных отрицательных смысловых вирусных РНК (вРНК), которые кодируют все десять вирусных белков. Жизненный цикл вируса гриппа начинается со связывания гемагглютинина (НА) с рецепторами, содержащими сиаловую кислоту, находящимися на поверхности клетки-хозяина, с последующим опосредованным рецепторами эндоцитозом. Низкое значение рН в эндосомах запускает конформационное изменение НА, что приводит к экспонированию Ν-концевых участков субъединицы НА2 (так называемого белка слияния). Белок слияния инициирует слияние вируса и эндосомной мембраны и в цитоплазму клетки высвобождаются матриксный белок (М) и комплексы ΡΝΡ. Последние состоят из нуклеопротеина (ΝΡ), который образует капсид для вРНК, и комплекса вирусной полимеразы, который сформирован белками РА, РВ1 и РВ2. ΡΝΡδ транспортируются в ядро, где происходят транскрипция и репликация вируса. Комплекс РНКполимеразы катализирует три различные реакции: синтез мРНК с 5-кэпом и 3-полиА-структурой, синтез полноразмерной комплементарной РНК (кРНК) и синтез геномной вРНК при использовании кДНК в качестве матрицы. Вновь синтезированные вРНК, № и белки полимеразы затем собираются в КНРк, экспортируются из ядра и транспортируются к плазматической мембране, где происходит выпочковывание вирусных частиц потомства. Белок нейраминидаза (ΝΑ) играет определяющую роль на поздней стадии инфекционного процесса, удаляя сиаловую кислоту из сиалилолигосахаридов, что приводит к высвобождению заново собранных вирионов через клеточную мембрану и предотвращает самоагрегацию вирусных частиц. Несмотря на то что сборка вируса включает взаимодействия типа белок-белок и белок-вРНК, природа таких взаимодействий остается в значительной степени неизвестной.

Хотя вирусы гриппа типов В и С структурно и функционально схожи с вирусом гриппа типа А, между ними имеются определенные различия. Например, вирус гриппа типа В не имеет белка М2, обладающего активностью ионных каналов. Вирус гриппа типа С также не имеет белка М2, обладающего активностью ионных каналов. Однако белок СМ1, скорее всего, имеет такую активность. Активность белка ионных каналов может быть определена методами, хорошо известными из уровня техники, например, описанными ΗοΙδίη^Γ е1 а1. (1994) или в заявке \¥О 01/79273.

Клеточные линии и вирусы гриппа, которые могут быть использованы в соответствии с заявленным изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы любые клетки, эффективно поддерживающие репликацию вирусов гриппа, в том числе мутантные клетки, которые экспрессируют

- 6 012965 пониженные уровни одной или более сиаловых кислот, которые являются рецепторами вируса гриппа. Полученные таким образом вирусы могут быть реассортантными вирусами.

Предпочтительно клетки являются клетками, которые сертифицированы ВОЗ или проходят сертификацию и формируют перевиваемые клеточные линии. Требования к таким линиям при прохождении сертификации включают их характеристику посредством указания, по крайней мере, на родословную, ростовые свойства, иммунологический маркер, туморогенность, условия хранения, а также подразумевают тестирование на животных, куриных эмбрионах и клеточных культурах. Такая характеристика делается для того, чтобы подтвердить, что линии свободны от определяемых побочных агентов. В некоторых странах могут требоваться кариологические исследования. Кроме того, туморогенность предпочтительно тестируется в клетках, которые находятся на том же уровне пассирования, что и клетки, используемые для получения вакцин. Вирус предпочтительно очищают способом, который продемонстрировал постоянные результаты, до того, как он будет инактивирован или аттенуирован для получения вакцины (см., например, ВОЗ, 1982).

Также предпочтительно полностью охарактеризовать клеточные линии, подлежащие использованию, с точки зрения чистоты получаемого конечного продукта. Данные, которые могут быть использованы для характеристики клеток, используемых в соответствии с настоящим изобретением, включают (а) информацию об их источнике, происхождении и числе пассажей; (б) информацию об их ростовых свойствах и морфологических признаках; (в) результаты тестирования на наличие аденовирусных агентов; (г) описание отличительных свойств, например, биохимических, иммунологических, цитогенетических, которые позволяют четко идентифицировать клетки среди других клеточных линий, и (д) результаты тестирования туморогенности. Предпочтительно число пассажей и время удвоения популяции клеточной линии, используемой в качестве хозяина, должно быть как можно более низким.

Также предпочтительно, чтобы вирус, продуцируемый в клетках, был очень хорошо очищен до того, как он будет использован в целях приготовления вакцины или генной терапии. В целом, способы очистки должны приводить к эффективному удалению клеточной ДНК, других клеточных компонентов и аденовирусных агентов из препарата вируса. Способы эффективного расщепления или денатурации ДНК также могут быть использованы. См., например, Μίζπιΐιί. 1990.

Вакцины.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением вакцины могут содержать иммуногенные белки, в том числе гликопротеины любого патогенного организма, например, иммуногенный белок одной или более бактерий, вирусов, дрожжей или грибов. Таким образом, в одном случае заявленные вирусы гриппа могут быть вакцинными векторами вирусов гриппа или других вирусов, включая (без ограничений указанными) лентивирусы, такие как СПИД; вирусы гепатита В и С; вирусы герпеса, такие как СМУ и Н8У и вирус ящура.

Полную вирусную вакцину концентрируют путем ультрафильтрации и затем очищают зональным центрифугированием или хроматографией. Вакцину инактивируют до очистки или после очистки с помощью, например, формалина или бета-пропиолактона.

Субъединичные вакцины содержат очищенные гликопротеины. Такие вакцины могут быть получены, например, при использовании вирусных суспензий, фрагментированных обработкой детергентом, очищенных поверхностных антигенов или ультрацентрифугированием. Субъединичные вакцины могут содержать главный НА белок, а также ΝΑ. Используемый детергент может быть катионным детергентом, например дексадецил триметил бромидом аммония (Ваейтеуег, 1975), анионным детергентом, таким как дезоксихолат аммония (Гасег & ^еЬ§1ег, 1976); или неионным детергентом, таким как имеющий коммерческое название ΤΡΙΤΟΝ Х100. Гемагглютинин также может быть выделен после обработки вирионов протеазой, такой как бромелин, и далее очищен любым способом, например, описанным Сгапб и 8кейе1 (1972).

Расщепленные вакцины содержат вирионы, которые были подвергнуты обработке агентами, которые растворяют липиды. Такие вакцины могут быть получены, например, при использовании водной суспензии очищенного вируса, полученного, как описано выше, инактивированного или нет, обработанной при перемешивании растворителями липидов, такими как этиловый эфир или хлороформ, ассоциированными с детергентами. Растворение липидов вирусной оболочки приводит к фрагментации вирусных частиц. Замещенная водная фаза содержит расщепленную вакцину, включающую фрагментированные вирусные частицы с удаленными природными липидными оболочками гемагглютинина и нейраминидазы, а также удаленными коровыми структурами и продуктами их деградации. Полученные в результате указанных процедур инфекционные частицы инактивируют, если это не было сделано ранее.

Инактивированные вакцины.

Заявленные инактивированные вакцины вируса гриппа получают инактивированием реплицирующегося вируса, который является объектом настоящего изобретения, при использовании известных способов, таких как (без ограничений указанными) обработка формалином или бета-пропиолактоном. Инактивированные вакцины, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, могут включать вакцины, содержащие целые вирусы (^У), или вакцины, содержащие субвирионы (8У) (расщепленные вакцины). \УУ вакцины содержат интактный, инактивированный вирус, в то время как 8У вакци

- 7 012965 ны содержат очищенный вирус, разрушенный обработкой детергентами, которые растворяют содержащую липиды вирусную оболочку, и далее подвергнутый химической инактивации.

Кроме того, вакцины, которые могут быть использованы, включают такие вакцины, которые содержат выделенные поверхностные белки НА и ΝΑ. В целом, ответы на 8У вакцины и вакцины, содержащие поверхностные антигены (т.е. на НА или ΝΑ), являются схожими. Экспериментальным образом инактивированная \УУ вакцина, содержащая антиген ΝΑ, иммунологически родственный таковому эпидемического вируса, и неродственный НА, по-видимому, менее эффективна (Одга с1 а1., 1977). Инактивированные вакцины, содержащие оба релевантных поверхностных антигена, предпочтительны.

Живые аттенуированные вирусные вакцины

Живые аттенуированные вакцины вируса гриппа также могут быть использованы для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой указанным вирусом, в соответствии с известными подходами. Аттенуация предпочтительно обеспечивается при использовании одностадийной процедуры, подразумевающей перенос аттенуированных генов из аттенуированного донорного вируса в реплицированный вирусный изолят или реассортантный вирус с помощью известных методов (см., например, Мигрйу, 1993). Поскольку устойчивость к вирусу гриппа типа А опосредуется развитием иммунного ответа на гликопротеины НА и ΝΑ, гены, кодирующие указанные поверхностные антигены, должны быть получены из реассортантных вирусов или клинических изолятов, обладающих высокой скоростью роста. Аттенуированные гены получают из аттенуированных родительских вирусов. Согласно данному подходу, гены, которые обеспечивают аттенуацию, предпочтительно, не кодируют гликопротеины НА и ΝΑ. С другой стороны, эти гены не могут быть перенесены в реассортанты, экспонирующие поверхностные антигены клинических вирусных изолятов.

Многие донорные вирусы были протестированы на их способность служить аттенуированными вирусами гриппа. В качестве примера, не ограничивающего соответствующий подход, для получения аттенуированной вирусной вакцины может быть использован адаптированный к холоду донорный вирус Α/ΑππΑγ6ογ(ΑΑ)/6/60(Η2Ν2) (см., например, Еб^агбк, 1994; Мигрйу, 1993). Кроме того, живые аттенуированные реассортантные вирусные вакцины могут быть получены путем комбинирования адаптированного к холоду донорного вируса с вирулентным реплицированным вирусом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Реассортантное потомство затем отбирают при 25°С (рестриктивная температура для репликации вирулентного вируса) в присутствии антисыворотки к Η2Ν2, которая ингибирует репликацию вируса, экспрессирующего поверхностные антигены аттенуированного адаптированного к холоду донорного вируса Α/ΑΑ//6/60(Η2Ν2).

Значительные серии реассортантов Η1Ν1 и Η3Ν2 были протестированы на людях и удовлетворяли следующим свойствам: (а) инфекционности; (б) были аттенуированы по отношению к серонегативным детям и иммунологически примированным людям; (в) иммуногенности и (г) генетической стабильности. Иммуногенность адаптированных к холоду реассортантов коррелировала с уровнем их репликации. Таким образом, приобретение шести трансферабельных генов адаптированного к холоду вируса новыми вирусами дикого типа воспроизводимым образом аттенуировало эти вирусы и позволило использовать их в вакцинах, предназначенных как для взрослых, так и для детей.

Другие аттенуирующие мутации могут быть введены в гены вируса гриппа с помощью сайтнаправленного мутагенеза для спасения инфекционных вирусов, имеющих эти мутантные гены. Аттенуирующие мутации могут быть введены в некодирующие участки генома, а также и в кодирующие участки. Такие мутации также могут быть ведены в гены, отличные от тех, что кодируют НА или ΝΑ, например в ген РВ2 полимеразы (8иЬЬагао с1 а1., 1993). Таким образом, могут быть получены новые донорные вирусы, содержащие аттенуированные мутации, введенные сайт-направленным мутагенезом, которые могут быть использованы для редукции живых аттенуированных реассортантов Η1Ν1 и Η3Ν2, являющихся кандидатными вакцинными вирусами, с помощью метода, аналогичного описанному выше для адаптированного к холоду донорного вируса А/АА//6/60. Сходным образом, другие известные и подходящие аттенуированные донорные штаммы могут быть реассортированы с заявленным в соответствии с настоящим изобретением вирусом гриппа с целью получения аттенуированных вакцин, пригодных для вакцинации млекопитающих (Епат1 с1 а1., 1990; Мийег с1 а1., 1991; 8иЬЬаго с1 а1., 1993).

Предпочтительно, чтобы такие аттенуированные вирусы сохраняли гены, полученные от вирусов, кодирующих антигенные детерминанты, практически сходные с таковыми первоначальных клинических изолятов. Это обусловлено тем, что аттенуированная вакцина предназначена для генерации по существу той же самой антигенности, которой обладает первоначальный клинический изолят вируса, и в то же время она должна утратить инфекционность до такой степени, чтобы минимальным образом индуцировать серьезные условия для развития заболевания в организме иммунизируемого млекопитающего.

Соответственно, вирус должен быть аттенуирован или инактивирован, введен в состав вакцины и применен согласно известным методам, чтобы вакцина индуцировала иммунный ответ в организме животного, например млекопитающего. Из уровня техники хорошо известны способы определения того, обладает ли аттенуированная или инактивированная вакцина той же антигенностью, что и клинический изолят или обладающий высокой ростовой активностью происходящий из него штамм. Указанные известные способы включают использование антисыворотки или антител к выделенным вирусам, экспрес

- 8 012965 сирующим антигенные детерминанты донорного вируса; химическую селекцию (например, с помощью амантадина или римантидина); выявление активности или ингибирование активности НА или ΝΑ и скрининг ДНК (напримрр, гибридизация с пробой или РСК) для подтверждения того, что донорные гены, кодирующие антигенные детерминанты (например, гены НА и ΝΑ), не обнаруживаются в аттенуированных вирусах. См., например, КоЬейьои е! а1., 1988; КФЬоигпе, 1969; АутагФ-Непгу е! а1., 1985; КоЬей8ои е! а1., 1992).

Фармацевтические композиции.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции, подходящие для инокуляции или парентерального или перорального введения, содержат аттенуированные или инактивированные вирусы гриппа и необязательно стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Композиции также могут содержать дополнительные агенты или наполнители, известные из уровня техники. См., например, Веткой е! а1., 1987; Ауегу'8 Эгид ТгеаОпепГ 1987; 08о1, 1980; Ка1хипд. 1992. Заявленные композиции, в основном, находятся в форме индивидуальных доз (единичных доз).

Соответствующие вакцины, в целом, содержат от около 0.1 до около 200 мкг, предпочтительно от 10 до 15 мкг гемагглютинина каждого из штаммов, входящих в состав композиции. Вакцина, которая представляет собой основную составляющую заявленной в соответствии с изобретением вакцинной композиции, может содержать вирусы типов А, В или С или их комбинацию, например, по крайней мере из двух или трех типов, по крайней мере из двух различных субтипов, по крайней мере из двух одинаковых типов, по крайней мере из двух одинаковых субтипов или из различных изолятов или реассортантов. Вирус гриппа человека типа А включает субтипы Η1Ν1, Η2Ν2 и Η3Ν3.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и/или эмульсии, которые могут содержать дополнительные агенты или наполнители, известные из уровня техники. Примерами неводных растворов могут служить пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, например, оливковое и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Носители или окклюзивные повязки могут использоваться для увеличения проницаемости кожи и усиления адсорбции антигена. Жидкие дозированные формы для перорального применения могут включать раствор липосом, содержащий жидкую дозированную форму. Подходящие формы для суспендирования липосом включают эмульсии, суспензии, растворы, сиропы и эликсиры, содержащие инертные добавки, широко используемые в практике, например очищенную воду. Помимо инертных добавок такие композиции могут также включать адъюванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, а также подсластители, добавки, улучшающие вкус и запах и маскирующие вкус и запах. См., например, Веткой е! а1., 1992; Ауегу 8, 1987; 08о1, 1980 и Ка!/ипд, 1992.

Для введения заявленной композиции индивидууму она может быть составлена таким образом, что содержит соли, буферы, адъюванты или другие вещества, которые желательно использовать для повышения ее эффективности. В случае вакцин могут быть использованы адъюванты, вещества, которые усиливают специфический иммунный ответ. Обычно адъювант и композицию смешивают до презентации иммунной системе, но иногда вводят отдельно, но в один и тот же участок тела иммунизируемого млекопитающего. Примеры соединений, подходящих для использования в вакцинах, описаны 08о1 (1980).

Гетерогенность вакцин может быть обеспечена смешиванием по крайней мере двух штаммов реплицированных вирусов гриппа, например 2-50 штаммов. Штаммы вируса гриппа А или В, имеющие более новую антигенную композицию, предпочтительны. В соответствии с настоящим изобретением вакцины могут содержать штамм вируса гриппа, имеющий определенные антигенные вариации, полученные с помощью известных методов.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции могут содержать или дополнительно включать по крайней мере одно химиотерапевтическое соединение, например, необходимое для генной терапии, иммуносупрессор, противовоспалительный агент или усилитель иммунитета. В случае вакцин химиотерапевтическое соединение включает (без ограничений указанными) гамма-глобулин, амантадин, гуанидин, гидроксибензимидазол, интерферон альфа, интерферон бета, интерферон гамма, фактор некроза опухолей альфа, тиосемикарбазоны, метисазоны, рифампин, рибавирин, аналог пиримидина, аналог пурина, фоскарнет, фосфоноуксусную кислоту, ацикловир, дидезоксинуклеозиды, ингибитор протеазы или ганцикловир. См., например, Ка1хипд (1992) и ссылки, приведенные в этой работе на с. 798-800 и 680-681 соответственно.

Композиции также могут содержать различные, но небольшие количества формальдегида, свободного от эндотоксина, и консервантов, которые безопасны и не обладают нежелательными побочными эффектами при введении в организм при иммунизации млекопитающего соответствующей композицией.

Фармацевтические цели.

Введение композиции (или антисыворотки) может быть как профилактическим, так и терапевтическим. При профилактическом использовании заявленные композиции, которые в данном случае представляют собой вакцины, вводят в организм до того, как будут обнаружены какие-либо симптомы инфекции. Профилактическое введение композиции служит для предотвращения или ослабления возможной последующей инфекции. Сказанное справедливо и в том случае, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии. Такое использование также предот

- 9 012965 вращает или ослабляет один или более симптомов, ассоциированных с заболеванием.

При терапевтическом использовании аттенуированные или инактивированные вирусные вакцины вводят в организм при обнаружении какие-либо симптомов инфекции. Терапевтическое введение композиции служит для ослабления имеющейся инфекции.

См., например, Веткой с1 а1., 1992; Ауегу, 1987 и ΚαΙζιιημ. 1992. Сказанное справедливо и в том случае, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии. Такое использование также ослабляет один или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, или течение заболевания.

Таким образом, заявленные в соответствии с изобретением аттенуированные или инактивированные вакцинные композиции могут применяться как до возникновения инфекции (для предотвращения или ослабления возможной инфекции), так и после ее обнаружения. Сходным образом, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии, они вводятся в организм до того, как обнаруживаются какие-либо симптомы заболевания или нарушения, а также после этого.

Композиция считается фармацевтически приемлемой, если ее введение не вызывает у реципиента никаких побочных реакций. Агент вводится в терапевтически эффективном количестве, если это количество достаточно с физиологической точки зрения. Заявленная композиция считается физиологически достаточной, если ее введение приводит к определяемому изменению физиологического состояния реципиента, например, усиливает по крайней мере один первичный или вторичный гуморальный или клеточный иммунный ответ по крайней мере на один штамм инфекционного вируса гриппа.

Защита не является абсолютной, т. е. инфекция вируса гриппа не может быть полностью предотвращена или устранена, даже если выявляется статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией или выборкой пациентов. Защита может заключаться в смягчении тяжести заболевания или снижении быстроты проявления симптомов инфицирования вирусом гриппа.

Фармацевтическое введение.

Заявленные в соответствии с изобретением композиции могут обеспечивать устойчивость к одному или более патогенам, например одному или более штаммам вируса гриппа как за счет пассивной, так и за счет активной иммунизации. При активной иммунизации инактивированные или аттенуированные живые вакцинные композиции вводят профилактически в организм хозяина (например, млекопитающего), и иммунная система хозяина отвечает на это введение защитой организма от соответствующей инфекции и/или заболевания. При пассивной иммунизации реципиенту, имеющему инфекцию вируса гриппа, вызванную по крайней мере одним штаммом, или находящемуся в группе риска, вводится готовая антисыворотка. Заявленные композиции при использовании в процедурах целей генной терапии могут вводиться как с терапевтическим целями, так и с профилактическими целями, что обеспечивается экспрессией нужного генного продукта при активной иммунизации.

В одном случае вакцина может использоваться применительно к особи женского пола млекопитающего (как во время беременности или родов, так и после них) в такие временные сроки и в таком количестве, чтобы обеспечить генерацию иммунного ответа, способного защитить как мать, так плод или новорожденного (путем пассивного проникновения антител через плаценту или их передачи с материнским молоком).

Настоящее изобретение также относится к способам предотвращения или аттенуирования нарушения или заболевания, например инфекции по крайней мере одного штамма патогенного организма. Как понимается в настоящем описании, вакцина предотвращает или ослабляет заболевание, если ее введение приводит к полному или частичному ослаблению (т.е. супрессии) симптомов или течения заболевания или же к развитию полного или частичного иммунитета к данному заболеванию. Как здесь понимается, композиция, используемая в целях генной терапии, предотвращает или ослабляет заболевание, если ее ведение приводит к полному или частичному ослаблению (т.е. супрессии) симптомов или течения заболевания или же к развитию полного или частичного иммунитета к данному заболеванию.

Инактивированный или аттенуированный вирус гриппа или полученная на его основе композиция, может быть введена любым способом, обеспечивающим достижение заданных целей, если она приготовлена в виде фармацевтической композиции, как описано ранее.

Например, введение такой композиции может осуществляться различным парентеральным путем, таким как подкожный, внутривенный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интраназальный, пероральный или чрескожный. Парентеральное введение может быть осуществлено в виде болюсной инъекции или путем последовательной перфузии. Предпочтительным способом введения заявленной фармацевтической композиции является внутримышечный или подкожный способ. См., например, Веткой е! а1., 1992; Ауегу, 1987 и ΚαΙζιπιμ, 1992.

Обычная схема предотвращения, супрессии или лечения инфекции, связанной с вирусом гриппа, включает однократное введение эффективного количества вакцинной композиции, как описано выше, или повторяющиеся введения бустерных доз в течение периода времени, составляющего от одной недели до 24 месяцев, а также любые другие режимы.

В соответствии с заявленным изобретением эффективное количество композиции представляет

- 10 012965 собой такое количество, которое достаточно для достижения желательного биологического эффекта. Следует понимать, что эффективная доза зависит от возраста пациента, пола, состояния здоровья, веса, терапии сопутствующего заболевания (если таковая имеет место быть), схемы лечения и природы того эффекта, который необходимо обеспечить. Количественные значения эффективных доз приведены ниже и не предназначены для ограничения объема изобретения; они отражают предпочтительные для использования дозы. Однако наиболее предпочтительные дозы должны подбираться индивидуально, как это всегда и происходит, специалистом в данной области знаний. См., например, Веткой с1 а1., 1992; Луегу'к, 1987 и Как/ипд, 1992.

Доза аттенуированной вирусной вакцины для млекопитающих (например, человека) или птиц (имеется в виду взрослый организм) может составлять около 10³-10⁷ бляшкообразующих единиц (РЕИ) на 1 кг веса или же может быть выражена в любых других единицах. Доза инактивированной вакцины может составлять около 0.1-200, например 50 мкг гемагглютининового белка. Однако доза должна быть безопасной и эффективной, что определяется соответствующими методами при использовании существующих вакцин в качестве стандарта.

Доза иммунореактивного НА в каждой дозе реплицированной вирусной вакцины может быть стандартизована для того, чтобы содержать подходящее количество, например, 1-50 мкг НА или же такое количество НА, которое рекомендовано Службой общественного здравоохранения США, а именно 15 мкг НА в расчете на компонент вакцины для детей старше трех лет и 7,5 мкг НА в расчете на компонент вакцины для детей менее трех лет. Количество ΝΑ также может быть стандартизовано, однако указанный гликопротеин может оказаться лабильным в процессе очистки и хранения (Кепйа1 е1 а1., 1980). Каждая 0.5-1 мл доза вакцины предпочтительно содержит примерно 1-50 млн вирусных частиц, более предпочтительно 10 млн вирусных частиц. Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.

Пример 1.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы. Клетки 293 почки эмбриона человека и клетки почки собаки Майш-ЭагЬу (МОСК) поддерживают в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ΌΜΕΜ), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и в модифицированной среде Игла (ΜΕΜ), содержащей 5% сыворотки новорожденного теленка, соответственно. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Вирусы гриппа Α/νδΝ/33(Η1Ν1) и Α/ΡΒ/8/34(Η1Ν1) размножают в 10-дневных куриных эмбрионах.

Конструирование плазмид. Для получения конструктов РНК-полимеразы I клонированную кДНК, полученную из вирусной РНК Α/νδΝ/33 и Α/ΡΒ/8/34 встраивают между промоторной и терминирующей последовательностями РНК-полимеразы I. Коротко говоря, клонированную кДНК амплифицируют с помощью РСК при использовании праймеров, содержащих сайты В§тВ1, расщепляют В§тВ1 и клонируют в сайтах В8шВ1 вектора рНН21, который содержит промотор РНК-полимеразы I человека и терминатор РНК-полимеразы I мыши, разделенные сайтами В8шВ1 (фиг. 2). Гены РВ2, РВ1, РА, НА, ΝΡ, ΝΑ, М и Νδ штамма Α/νδΝ/33 амплифицируют с помощью РСК-реакции при использовании следующих плазмид: р8С^РВ2, рС\С-РВ1 и р8С\УРЛ (все плазмиды получают от д-ра ЭеЫ №1уак из Калифорнийского университета, Лос-Анжелес), р^Н17, р^ЫР152, ρΤ3^ΝΑ15 (Сайтсе! е1 а1., 1992), рСТЗХСМ и ρ\νΝ81. соответственно. Ген РВ1 вируса Α^Κ/δ^ амплифицируют при использовании рсДНК774 (Регех е1 а1., 1998) в качестве матрицы. На фиг. 6 приведены последовательности праймеров. Для подтверждения того, что гены свободны от нежелательных мутаций, полученные с помощью РСК фрагменты секвенируют на автоматическом секвенаторе (Αρρ^ά Вю^уйеш Шс., СΑ, ϋδΑ) в соответствии с рекомендациями производителя. КДНК, кодирующую гены НА, ИР, ΝΑ и М1 штамма Α/νδΝ/33 клонируют, как описано в литературе (Нийй1е8коп е1 а1., 1982) и субклонируют в эукариотическом векторе экспрессии ρСΑССδ/ΜСδ (под контролем промотора бета-актина цыпленка) (Νί\νη е1 а1., 1991) с получением ρΕνδΝ-ΗΑ, ρСΑССδ-VδN-NΡ0-14, ρСΑ66δ-VNΑ15 и ρСΑ66δ-VδN-Μ1-2/1, соответственно.

Гены М2 и Νδ2 из штамма Α/νδΝ/33 амплифицируют с помощью РСК и клонируют в векторе ρСΑССδ/ΜСδ с получением рЕР24с и ρСΑ-Nδ2. На конечном этапе используют рсДНК774(РВ1), рсДНК762(РВ2) и рсДНК787(РА) для экспрессии белков РВ2, РВ1 и РА под контролем промотора цитомегаловируса (Регех ек а1., 1998).

Получение инфекционных частиц вируса гриппа. Клетки 293 (1х10⁶) трансфицируют максимально 17 плазмидами в различных количествах при использовании транс ГТ ЬТ-1 (Раиуега, Майкоп, νί^οηδίη) согласно рекомендациям производителя. Коротко говоря, ДНК и реагент для трансфекции смешивают (2 мкл транс ЕТ ЬТ-1 на 1 мкг ДНК), инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляют к клеткам. Через шесть часов смесь ДНК и агента для трансфекции заменяют на среду Орй-МЕМ (С1Ьсо/ВКЕ, Са1кйег8Ьигд, Магу1апй), содержащую 0.3% бычьего сывороточного альбумина и 0.01% эмбриональной телячьей сыворотки. В различное время после трансфекции вирусы собирают и титруют на клетках МОСК. Поскольку для осуществления указанной процедуры не требуются хелперные вирусы, полученные вирусы-трансфектанты анализируют без очистки методом бляшек.

Определение процентного содержания трансфицированных плазмидами клеток, продуцирующих вирусы. Через 24 ч после трансфекции клетки 293 диспергируют с помощью 0.02% Ε^ΤΑ до отдельных клеток. Затем клеточную суспензию разводят в 10 раз и переносят на слившийся монослой клеток МОСК

- 11 012965 в 24-луночные планшеты. Далее вирусы определяют в исследовании гемагглютинации.

Иммунологическое окрашивание. Через 9 ч после инфицирования вирусом гриппа клетки дважды отмывают фосфатно-буферным раствором (ΡΒ8) и фиксируют параформальдегидом (в ΡΒ8) в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки обрабатывают 0.1%-ным Тритоном Х-100 и исследуют, как описано Ыеитапп е! а1. (1997).

Результаты.

Получение инфекционных вирусов при экспрессии плазмидами вирусных РНК-фрагментов, трех субъединиц полимеразы и белка ΝΡ. Несмотря на то что трансфекция клеток смесью ΡΝΡδ. экстрагированных из очищенных вирионов. приводит к формированию инфекционных частиц вируса гриппа. описанная стратегия недостаточно эффективна. когда используются восемь различных ΡΝΡδ. полученных ίη νίΐτο. Для получения инфекционных вирусов гриппа полностью на основе кДНК восемь вирусных Κ.ΝΡ8 генерируют ίη νίίτο. Таким образом получают плазмиды. содержащие кДНК для полноразмерных вирусных РНК штамма Α/Ψ8Ν/33. фланкированную промотором РНК-полимеразы I человека и терминатором РНК-полимеразы I мыши. В принципе. трансфекция указанными 8 плазмидами эукариотических клеток должна приводить к синтезу всех восьми вРНК вируса гриппа. Белки РВ2. РВ1. РА и ΝΡ. полученные совместной трансфекцией плазмид. экспрессирующих белок. затем должны собираться вместе с вРНК в функционально активные νΚΝΡδ. которые затем должны реплицироваться и транскрибироваться. формируя инфекционные частицы вируса гриппа (фиг. 3). Клетки 293 в количестве 1х10⁶ трансфицируют плазмидами. экспрессирующими белок (1 мкг рсДНК762(РВ2). 1 мкг рсДНК774(РВ1). 0.1 мкг рсДНК787(РА) и 1 мкг ρΟΑ66§-Ψ§Ν-ΝΡΟ/14) и 1 мкг каждой из следующих плазмид для РНКполимеразы I (ρΡο1Ι-νδΝ-ΡΒ2. ρΡο1Ι-νδΝ-ΡΒ1. ρΡο 11-Α8Χ-ΡΑ. ρΡο11-Α8Χ-ΗΑ. ρΡο11-А8Х-ХР. ρΡο 11-\ν8Ν-ΝΑ. ρΡο1Ι-\ν8Ν-Μ и ρΡο1Ι-νδΝ-Νδ). Решение использовать пониженное количество рсДНК787(РА) основано на предварительных наблюдениях (Мепа е! а1.. 1996) и данных по оптимальным условиям получения вирусоподобных частиц (ΑΈΡδ) (данные не приведены). Через 24 ч после трансфекции клеток 293 7х10³ ΡΡϋ вируса на 1 мл было обнаружено в супернатанте (эксперимент 1. табл. 1). Это подтверждает. в первую очередь. что методы обратной генетики способны обеспечить получение вируса гриппа типа А полностью из плазмид.

Таблица 1 Набор плазмид. используемых для получения вируса гриппа из клонированной кДНК*

I
Плазмиды для РНК полимеразы I:**	1	2	3
	РВ1	+	+	-
	РК8-РВ1	-	-	+
	РВ2	+	+	4-
	РА	+	+	+
	НА	4-	+	4-
	ΝΡ	+	+	4-
	ΝΑ		4-	4-
	М		+	4-
	N8	4-	4-	4-
Плазмиды для экспрессии белка:
	РВ1	4-	4-	+
	РВ2	4-	4-	+
	РА	4-	4-
	ΝΡ	4-	+	+
	НА	-	+	-
	ΝΑ	-	+	-
	М1	-	4-	-
	М2	-	4-	-
	N82	-	+	-
Титр вируса (рги/мл)	7х103 '	7x103	1x103

Эксперимент
4	5	6	7	8
-	-	-	-	-
4-	+	+	4-	4-
4-	4-	+	+	4-
+	4-	4-	Д	+
4-	4-	+	4-	4-
4-	+	+	4-	4-
4-	+	4-	д	Д
+	+	4-	+	+
4-	4-	4-	4-	4-
4-	+		4-	д
4-	4-	4-	-	+
4-	4-	4-	-	д
4-	4-	4-	д	-
+	4-	Д	4-	4-
4-	+	Д	4-	4-
4-	4-	Д	+	4-
+	+	Д	4-	+
+	+	4-	+	+
3x104	0	0	0	0

* Клетки 293 трансфицировали указанными плазмидами. Через 24 ч (эксперименты 1и 2) и 48 ч (эксперименты 3-8) определяли титры вируса в супернатантах на клетках МОСК.

** Если не указано иное. плазмиды конструировали на основе кДНК. соответствующей РНК штамма Α/Ψ8Ν/33.

- 12 012965

Эффективность образования вируса гриппа при совместной экспрессии всех вирусных структурных белков.

Несмотря на то что экспрессии вирусных ΝΡ и белков полимеразы достаточно для определяемого плазмидой продуцирования вирусов гриппа, возможно улучшение эффективности данного процесса. В предварительных исследованиях было показано, что экспрессия всех структурных белков вируса гриппа (РВ2, РВ1, РА, НА, ΝΡ, ΝΑ, М1, М2 и N8) приводит к образованию УЪРк, содержащих искусственную вРНК, кодирующую маркерный ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (Мепа е! а1., 1996). Таким образом, доступность целой кДНК, кодирующей структурные белки, вместо той, которая требуется для репликации и транскрипции вРНК, может повысить эффективность продуцирования вирусов. С этой целью клетки 293 трансфицировали оптимальными количествами плазмид экспрессии вирусного белка (оценка с помощью образования УЪР; неопубликованные данные): 1 мкг рсДНК762(РВ2) и рсДНК774(РВ1); 0.1 мкг рсДНК787(РА); 1 мкг ρΕ\8Ν-ΗΑ, ρΟΑ668-^8Ν-ΝΡΘ/14 и ρΟΑ668-^ΝΑ 15; 2 мкг рСА668\8№М1-2/1; 0.3 мкг ρСΑ-N8Α и 0.03 мкг рЕР24с (для М2) вместе с 1 мкг каждой плазмиды для РНКполимеразы I (эксперимент 2, табл. 2). Вторую партию клеток трансфицировали тем же самым набором плазмид для РНК-полимеразы I, за исключением гена РВ1, для которого рРоП-РК/8/34-РВ1 была замещена для попытки получить реассортантный вирус, вместе с плазмидами, экспрессирующими ΡΑ, РВ1, РВ2 и N0 (эксперимент 3, табл. 1) или плазмидами, экспрессирующими все структурные белки (эксперимент 4, табл. 1). Выход вируса \8Ν не был существенно другим через 24 ч (эксперименты 1 и 2, табл. 1) и 36 ч (данные не приведены) после трансфекции. Однако более чем 10-кратное увеличение выхода вируса при использовании РК/8/34-РВ1 было обнаружено, когда все структурные белки вируса гриппа были экспрессированы (эксперименты 3 и 4, табл. 1). Негативные контроли, в которых не было одной из плазмид экспрессии белков ΡΑ, РВ1, РВ2 или №, не продуцировали вирус (эксперименты 5-8, табл. 1). Таким образом, в зависимости от продуцируемого вируса, экспрессия всех структурных белков вируса гриппа типа А повышало эффективность метода обратной генетики.

Далее определяли кинетику продукции вируса после трансфекции клеток при использовании набора плазмид, содержащих ген Α/ΡΒ/8/34-ΡВ1, применяемых для получения вируса. В двух из трех экспериментах вирус впервые определялся через 24 ч после трансфекции. Титр, измеренный в данный момент времени, составил более 103 РЕИ/мл и затем он увеличился до более 106 РЕИ/мл через 48 ч после трансфекции (табл. 2). Для установления процента трансфицированных плазмидой клеток, продуцирующих вирусы, клетки 293Т обрабатывали ΕΌΤΑ (0.02%) через 24 ч после трансфекции для их диспергирования и проводили исследования методом лимитирующих разведений. В этом эксперименте на указанный момент времени не было обнаружено вирусов в культуральном супернатанте. Полученные результаты свидетельствуют, что одна из 103.3 клеток продуцирует инфекционные вирусные частицы.

Таблица 2 Кинетика продукции вируса после трансфекции плазмидами клеток 293Т*

Часы после трансфекции плазмидой	Титры вируса в культуральном супернатанте (РГЕГ/мл)
Эксперимент
1	2	2
6	0	ΝΟ	N0
12	0	ΝΟ	0
18	0	ΝΟ	0
24	0	2х103	6х103
30	ΝΟ	5х104	9x10’
36	6x102	>1х105	7x10*
42	ΝΏ	>1х106	5x10”
48	8х104	>1х106	1х107

* Клетки 293Т были трансфицированы 8 плазмидами для РНК-полимеразы I, кодирующими вирусные гены из штамма Α/\8Ν/33, за исключением гена РВ1, происходящего из ΑΦ^^ΑΗ, и 9 плазмидами, экспрессирующими белки, как раскрыто в описании. В различные временные точки вирус титровали в клетках МОСК (ΝΟ - данные отсутствуют).

Выделение вируса гриппа, содержащего эпитоп ΡΕΑΟ в составе белка ΝΑ.

Для подтверждения того факта, что новая система обратной генетики обеспечивает встраивание мутаций в геном вируса гриппа типа А, был получен вирус, содержащий эпитоп ΡΕΑΟ в составе белка ΝΑ (Са81гисс1 е! а1., 1992). Клетки 293Т трансфицировали плазмидой для РНК-полимеразы I (рРоП-\8№ ΝΑ/ΡΕ79), содержащей кДНК, кодирующую как белок ΝΑ, так и эпитоп ΡΕΑΟ, находящийся в основании головки белка, а также плазмидами для РНК-полимеразы I и плазмидами, экспрессирующими белок. Для подтверждения того факта, что выделенный вирус (РК.8-\8№ЕЬ79) действительно экспрессирует белок ΝΑ-ΡΕΑΟ, проводили иммунологическое окрашивание клеток, инфицированных РК.8-\8№ЕЬ79

- 13 012965 или Α/Ψ8Ν/33 дикого типа.

Моноклональное антитело к эпитопу ЕЬАО выявляло клетки, инфицированные ΡΚ.8-Ά8Ν-ΕΈ79, но не инфицированные вирусом дикого типа. Получение вируса ΡΚ.8-Ά8Ν-ΕΈ79 было в такой же степени эффективным, что и получение вируса дикого типа, не являющегося в данном случае мишенью (сведения не приведены). Указанные результаты свидетельствуют, что новая система обратной генетики обеспечивает получение введение мутаций в геном вируса гриппа типа А.

Получение инфекционного вируса гриппа, содержащего мутации в гене РА.

Для получения вирусов, содержащих мутации в гене РА, были введены две молчащие мутации, создающие новые сайты распознавания рестрикционными эндонуклеазами (Взр1201 в положении 846 и РуцП в положении 1284 мРНК). Ранее было невозможно модифицировать указанный ген методом обратной генетики, поскольку не было действенной системы отбора. Были получены вирусы-трансфектанты РА-Т846С и РА-А1284. Эти вирусы были клонированы двумя последовательными лимитирующими разведениями. Для подтверждения того факта, что полученные вирусы действительно являются трансфектантами с мутациями в гене РА, методом обратной РСК-транскрипции была получена кДНК гена РА. Вирусы РА-Т846С и РА-А1284 содержали ожидаемые мутации в гене РА, что было показано наличием в их геноме новых введенных сайтов рестрикции. Осуществление РСК. тех же самых вирусных образцов с теми же самыми праймерами, но без стадии обратной транскрипции, не приводило к получению какихлибо продуктов (данные не приведены), свидетельствуя о том, что кДНК РА действительно происходит из вРНК, а не из плазмиды, используемой для получения вирусов. Эти результаты показывают, каким образом вирусы с мутантными генами могут быть получены и выделены без использования хелперных вирусов.

Обсуждение результатов.

Описанная здесь система обратной генетики, таким образом, обеспечивает эффективное получение вирусов гриппа типа А полностью из клонированной кДНК. Впбдеп и ΕΙΙίοΙ (1996) также использовали метод обратной генетики для получения вируса Буньявьера (семейство Випуаутбае), но он содержал только три фрагмента отрицательной смысловой РНК и эффективность его продукции была ниже, а именно 10² РРИ/10⁷ клеток. Несмотря на то что выход вируса варьировал от эксперимента к эксперименту, постоянно определялось более 10³ РРИ/106 клеток вирусов гриппа, содержащих восемь фрагментов генома. Существуют различные объяснения высокой эффективности описанной здесь системы обратной генетики. Вместо получения К№з ίη νίίτο (Ьиу^ез е! а1., 1989), К№з были получены ίη νίνο посредством внутриклеточного синтеза вРНК при использовании РНК-полимеразы I и посредством направляемого плазмидой экспрессии белков вирусной полимеразы и №. Также использование клеток 293Т, которые легко трансфицируются плазмидами (Οοΐο е! а1., 1997), позволило убедиться в том, что для продукции вируса необходима большая популяция клеток, получающих все плазмиды. Кроме того, большое количество транскриптов, продуцируемых РНК-полимеразой I, которая является одним из наиболее обильно экспрессируемых белков в растущих клетках, также способствовало превышающему все ожидания повышению эффективности используемой системы. Все это привело, в свою очередь, к изобилию транскриптов вРНК и синтезу адекватного количества вирусного белка, необходимого для инкапсулирования вРНК, формированию К№з в ядре и экспорту указанных комплексов к клеточной мембране, где новые вирусы собирались и высвобождались из клеток.

Ранее созданные системы обратной генетики (Епат1 е! а1., 1990; №итапп е! а1., 1994; Ьцу4]е8 е! а1., 1989; Р1е8е11ка е! а1., 1996) требуют инфицирования хелперным вирусом и, соответственно, таких способов селекции, которые позволяют выделить небольшое число трансфектантов из огромного количества хелперных вирусов. Такие стратегии использовались для получения вирусов гриппа, содержащих один из следующих происходящих из кДНК генов: РВ2 (8иЬЬагао е! а1., 1993), НА (Епат1 е! а1., 1991; Нопто!о е! а1., 1994), № (Ь1 е! а1., 1995), ΝΑ (Епат1 е! а1., 1990), М (Сазйаса е! а1., 1995; Уазиба е! а1., 1994) и N8 (Епат1 е! а1., 1991). Большинство способов селекции, за исключением тех, которые применимы к генам НА и ΝΑ, основаны на температуре роста, природе хозяина, чувствительности к лекарственным препаратам и, таким образом, лимитируют использование системы обратной генетики для функционального анализа генных продуктов. Даже в случае генов НА и ΝΑ, для которых созданы системы селекции, основанные на антителах, трудно выделить вирус с явными ростовыми дефектами. В противоположность этому, описанная здесь система обратной генетики не требует хелперного вируса и позволяет получать вирусы-трансфектанты с мутациями в любом фрагменте гена или с тяжелыми дефектами роста. Владение технологией введения любой нужной мутации в геном вируса гриппа типа А позволяет исследователям осуществлять многочисленные долговременные исследования, такие, как установление природы регуляторных последовательностей в нетранслируемых участках вирусного генома, структурнофункциональных взаимодействий между вирусными белками и взаимозависимости между молекулярной основой рестрикции по организму-хозяину и патогенкостью вируса.

Несмотря на доступность инактивированных вакцин вируса гриппа, их эффективность является субоптимальной, что частично обусловлено их ограниченной способностью вызывать локальный 1дА и цитотоксический Т-клеточный иммунный ответ. Текущие клинические испытания живых вакцин вируса гриппа на основе адаптированных к холоду штаммов позволяют предположить, что такие вакцины опти

- 14 012965 мальным образом аттенуированы и не вызывают симптомов гриппа, но в достаточной степени индуцируют протективный иммунитет (см. обзор в Кейе1& Р1ебга, 1998). Однако предварительные результаты свидетельствуют, что указанные живые вакцины вируса гриппа не значительно более эффективны, чем наилучшие инактивированные вакцины генам (см. обзор в Кейе1& Р1ебга, 1998), и оставляют пространство для дальнейшего улучшения. Одна из возможностей заключается в модификации вакцины на основе адаптированных к холоду штаммов при использовании описанной выше системы обратной генетики. Альтернативно, можно начать с применения системы обратной генетики для получения эффективного штамма вируса гриппа типа А со множественными аттенуированными мутациями в генах, кодирующих внутренние белки. Наиболее значимое применение описанной здесь системы обратной генетики может привести к быстрой продукции аттенуированных живых вирусных вакцин при ожидаемых пандемиях, обусловленных новыми НА- и ΝΑ-субтипами вируса гриппа.

Новая система обратной генетики будет способствовать применению вирусов гриппа в качестве вакцинных векторов. Вирусы могут быть сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать чужеродные белки или иммуногенные эпитопы помимо белков вируса гриппа. Возможно, например, получение вирусов с чужеродными белками, которые кодируются девятым сегментом вРНК (Епат1 е1 а1., 1991), и применение их в качестве вакцин. Вирусы гриппа не только вызывают сильный клеточноопосредованный и гуморальный иммунитет, но и поставляют широкий спектр поверхностных вирионных белков НА и ΝΑ (например, 15 НА и 9 ΝΑ субтипов и их эпидемических вариантов), обеспечивая возможность повторной иммунизации той же самой популяции индивидуумов.

УЪРк вирусов гриппа, содержащие искусственную вРНК, кодирующую маркерный ген, были получены экспрессией вирусных структурных белков и вРНК с помощью полимеразной системы вирус осповакцины-Т7 (Мепа е1 а1., 1996). Используя систему обратной генетики, в настоящее время можно получить УЬРк, содержащие вРНК, кодирующую белки, необходимые для транскрипции и репликации вРНК (т.е. ΡΑ, ΡΒ1, РВ2 и ΝΡ), а также вРНК, кодирующую представляющие интерес белки. Такие УЪРк могут быть полезными векторами доставки генов. Важно, что отсутствие в них генов, кодирующих вирусные структурные белки, позволяет утверждать, что инфекционные вирусы не будут образовываться после осуществления νΕΡ-генной терапии. Поскольку геном вируса гриппа не интегрируется в хромосому хозяина, νΕΡ-система подходит для генной терапии в случаях, требующих только кратковременной трансдукции клеток (например, для лечения рака). В противоположность аденовирусным векторам (Коуе§б1 е1 а1., 1997) νΕΡδ вируса гриппа могут содержать варианты как НА, так и ΝΑ, что обеспечивает возможность повторного лечения популяции индивидуумов.

Семейство Оййотухоутбае включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также недавно классифицируемые в составе этого семейства тоготовирусы. Стратегия получения инфекционных вирусов гриппа типа А полностью из клонированной кДНК, описанная здесь, может быть применена к любым ортомиксовирусам и, возможно, к другим вирусам с отрицательной смысловой РНК (например, Випуаушбае, Лгепаутбае). Возможность манипулирования вирусным геномом без технических ограничений имеет большое значение для изучения жизненного цикла вирусов и его регуляции, функционирования вирусных белков и молекулярных механизмов вирусного патогенеза.

Пример 2.

Для применения системы обратной генетики по отношению к вирусу гриппа Α/ΡικτΙο К1со/8/34 вРНК экстрагировали из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных Α/Ρие^ίο К1со/8/34 (Η1Ν1), вариантом Маб1коп с более высокой скоростью роста (ΡΚ8ΗΟ), при использовании набора РНКазы О1адеп в соответствии с рекомендациями производителя. КДНК синтезировали с помощью КТазы ΜΜΕν (ΡΐΌίικβη) и праймера ИШ12. Затем кДНК амплифицировали в течение ночи с помощью ΡСЯ-реакции при использовании следующих реагентов.

Наборы праймеров

РВ1: Ва РВ1-1 и РВ1-1735К (прямой фрагмент) и РВ1-903 и Ва-РВ1-2341К (наращивающий фрагмент)

Ва ΡΒΙ-1: САСАСАСОСТСТССбООАССС-АААбСАООСА (8 Ер Ю N0:9)

- 15 012965

173РВ1-1735К: ОООТТТОТАТТТОТОТОТСАСС (БЕр ГО N0:10)

233РВ1-903: ССАСОАСАСТСАААТТТСТТТСАС (ЗЕф Ю N0:11)

Ва-РВ1-2341К.: САСАСАСОТСТССТАТТАОТАОАААСААООСАТТТ (БЕр ГО

N0:12)

РВ2: Ва РВ2-1 и В2 1260К. (прямой фрагмент) и 0ν’3Ν РВ2 .чед-2 и Ва-РВ2-2341К.

(наращивающий фрагмент)

Ва РВ2-1: САСАСАООТСТССССЮАССОАААОСАООСТ (8Еф ГО N0:13)

В2 126013: САСАСАСОТСТССАТСАТАСААТССТСТТО (8Е0 ГО N0:14)

XV 8Ν РВ2 8βς-2: СТССТСТО АТС.ОТОС.С АТ АС (БЕр ТО N0:15)

Ва-РВ2-2341К: САС АС АССТСТССТАТТАОТАОАААСААСЮТСОТТТ (БЕр ТО

N0:16)

РА: Вш-РА-1: САСАСАСОТСТССООСАОССАААССАООТАС (8Е0 ГО N0:17)

Вт-РА-2233К: САСАСАСОТСТССТАТТАОТАОАААСААО6ТАСТТ (8Εζ>

ГО N0:18)

НА: Вт-ΗΑ-Ι: САСАСАССТСТССОООАССААААОСАОСОО (8Еф ГО N0:19)

Вга-ББ-890К: САСАСАСОТСТССТАТТАОТАОАААСААОООТОТТТТ (БЕр

ГО N0:20)

ΝΡ: Вш-ΝΡ-Ι: САСАСАСОТСТССССОАССААААОСАООСТА (БЕр ГО N0:21)

Вт-ΝΡ-1565К: САСАСАСОТСТССТАТТАОТАОАААСААОООТАТТТТТ (ЗЕр ГО N0:22)

ΝΑ: Вт-ΝΑ-Ι: САСАСАООТСТССОООАССАААА&САССАОТ (ЗЕГ) ГО N0:23)

Ва-НЛ-14131<: САСАСАООТСТООТАТТАОТАОАААСААОСАОТТТТТ (8Е<2 ГО N0:24)

М: Вт-М-1: САСАСАСОТСТССОООАОСААААОСАООТАС (БЕр ГО N0:25)

Вш-М-1027К: САСАСАСОТСТССТАТТАОТАОАААСААООТАОТТТТТ (ЗЕр ГО N0:26)

N8: Вш-Νδ-Ι: САСАСАСОТСТССССОАССААААССАСОТО (ЗЕр ГО N0:27)

Вт-КЗ-890'К: САСАССТСТССТАТТАОТАОАААСААОООТОТТТТ (ЗЕр

ГО N0:28)

ДНК-полимераза: нативная ДНК-полимераза р£и (81га1адепе).

РСЯ-продукты разделяют гель-электрофорезом и экстрагируют из агарозного геля с помощью на

- 16 012965 бора фирмы Οί;·ι§οη. Экстрагированные гены лигируют в слепой вектор ρΤ7Β1ι.ιο Щоуадеп) при использовании набора для лигирования фирмы Τ;·ι1<;·ιγ;·ι уег. II. Через 5 ч лигированные гены переносят путем трансформации в клетки бактерий ΙΜ109 (гены РВ2, М и N8) или ΌΗ5 альфа (гены ΡΑ, РВ1 и №). Шесть колоний для каждого гена культивируют в среде ТВ в течение 8 ч. Плазмиды экстрагируют из бактериальных культур и секвенируют по четыре колонии на ген.

Гены ΡΑ, №, М и N8 вырезают из вектора рТ7В1ие с помощью фермента В§тВ1 (№\ν Επβίαηά Βίο1аЬк). Ген РВ1 вырезают с помощью Вка I (№\ν Εηβίαηά Вю1аЬк). Вырезанные гены лигируют в течение ночи в вектор рРоИВ, содержащий промотор РНК-полимеразы I человека и терминатор РНК-полимеразы I мыши, расщепленный с помощью ВктВБ Передний фрагмент гена РВ2 из вектора рТ7В1ие вырезают с помощью Вкг СI (№\ν Εηβίηηά Вю1аЬк) и Ват Ы (Воске), а задний фрагмент - с помощью Вкг СI (№\ν Εηβίηηά Вю1аЬк) и 8ре I (Воске). Вырезанные фрагменты смешивают и расщепляют Вка I. Через 6 ч расщепленные гены очищают при использовании набора для РСВ-очистки фирмы О1адеп и лигируют в течение ночи между сайтами ΒктΒI вектора рРоИВ.

Лигированные гены РВ1-, РА-, №-, М- и Ж-рРоИВ используют для трансформации клеток ΙΜ109 (гены М и N8) или ΌΗ5 альфа (гены ΡΑ, РВ1 и №) в течение ночи. Колонии трансформированных бактерий культивируют в среде ЬВ в течение ночи. Лигированные гены РВ2-рРо1БВ используют для трансформации клеток ΙΜ109 в течение ночи.

Плазмиды экстрагируют из бактериальных культур и правильность вставки генов подтверждают расщеплением ферментами. Колонии бактерий, трансформированные РВ2-рРо1БВ, культивируют в ЬВ в течение 8 ч. Затем плазмиды экстрагируют и правильность вставки генов подтверждают расщеплением ферментами. Все рРоП-конструкты секвенируют для того, чтобы убедиться в том, что они не содержат нежелательных мутаций.

рРоПВ-конструкты для РВ8НС переносят путем трансфекции в эмбриональные клетки почки человека 293Т с помощью рРоП-конструктов Α/\V8N/33(\V8N)-ΗΑ и NΑ, Α/ΗοηдΚοηд/483/97(ΗΚ)-ΗΑаν^^ и NΑ или Α/Κаνакак^/01(Κаνакак^)-ΗΑ и NΑ и четырех конструктов, экспрессирующих белки, для белков полимеразы и № Α/\V8N/33. Супернатанты из трансфицированных клеток 293Т последовательно разводят (до 10^-7) и инфицируют ими аллантоисную полость 9-дневных куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость инфицированных эмбрионов затем собирают и титруют вирус в исследовании НА (табл. 3).

Таблица 3

Вирус, содержащий гены РК.8 вместе со следующими генами НА и ΝΑ	Титр НА (ΗΑϋ/мл) вируса в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, инокулированных супернатантами клеток 293Т, разведенными в следующих значениях:
без разведения	1(Б	ю·*	1СБ	1(Г	кг	1(Г	10·’
Χν3Ν-ΗΑΝΛ	< 1	< !	200	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
ΗΚ-ΗΑβυϊτΝΑ	юо	< 1	<1	<1	<1	<1	<1	< 1
Кахуазай-НА ΝΑ	< 1	< 1	< 1	<1	< 1	< 1	< 1	<1

Позитивные по НА образцы (вирус с \V8N-ΗΑ NΑ при разведении 10^-2 и вирус с ΗΚ-ΗΑηνίΓ NΑ при отсутствии разведения) разводят последовательно от 10^-2 до 10^-8 и 100 мкл каждого разведения инфицируют куриные эмбрионы. Аллантоисную жидкость инфицированных куриных эмбрионов собирают и титруют вирус в исследовании НА (табл. 4). 50%-ная доза инфицированных эмбрионов (ΕΖθ5₀) для Α/Риейо В1со/8/34 (Н1М), полученная из плазмиды, составляет 10^10.33/мл, а титр вируса равен 1:3200.

Получают рекомбинантный вирус, содержащий гены НА и NΑ Α/ΗοηдΚοηд/213/2003 (Н5Ш) и остальные гены вируса гриппа типа А из штамма РВ8НС. Для данного вируса составляет 10^10.67/мл, а титр вируса равен 1:1600.

Таблица 4

Вирус, содержащий гены РВ.8 вместе со следующими генами ΗΑηΝΑ	Титр НА (НАи/мл) вируса в каждом разведении
10’2	10^	ю-4	10^	10’6	1(Г	10‘8
Ψ8Ν-ΗΑΝΑ	160	40	40	320	40	640	<1
НК-НАаИгИА	400	800	400	400	400	800	<1

- 17 012965

Последовательности генов РК8:

£А

АОССААА6СА ОСТАСТСАТС СААААТССАА ОАТТТТСТОС САСААТССТТ

СААТССОАТС АТТСТССАСС ТТ6С6САААА ААСААТОААА САСТАТСССС

АСОАССТОАА ААТССАААСА А АСАААТТТС сассаататс САСТСАСТТ6 '

6ААСТАТССТ ТСАТСТАТТС асаттттсас ттсатсаатс АССААОСССА .

СТСААТААТС СТАСААСТТС СТСАТССААА ТССАСТТТГС ААОСАСАСАТ

ТТСАААТААТ СОАСОСААСА САТС6САСАА ТССССТССАС АСТАСТАААС

АОТАТТГССЛ. АСА СТА САСС ОССТСАСААА ССАААСТТТС ТАССАСАТТТ

СТАТСАТТЛС ААСОАСААТА САТТСЛТССЛ А А1ТССАСТА АСААССАОАС

ААСТТСАСАТ АТАСТАТСТС СААААОСССА АТААААТТАА АТСТСАСААА

АСАСАСАТСС АСАТТТТСТС СТТСАСТОСС СААСАААТСС ССАСААА6СС

АСАСТАСАСТ СТССАТСААС АААССАСССС ТА6САТСААА АССАСАСТАТ '

ТСАССАТААС АСААСАААТС ОССА ССАСАС СССТСТ66СА ТТССТТТССТ

СаОТСССАСА САСС АСА АСА САСААТТСАА СААА6СТТТ0 АААТСАСАСЮ

ААСААТСССС ААОСТТСССС АССАААОТСТ СССССССААС ТТСТССАССС

ТТСААААТТТ ТАСАСССТАТ СТССАТОСАТ ТССААССОАА ССОСТАСАТТ

САОСОСААСС ТОТСТСАААТ ОТССАААСАА СТАААТОСТА СААТТСААСС

ТТТТТТСААА АСААСАССАС СЛССЛСГГАС АСТТСССААТ СССССТСССТ

СТТСТСАССС ОТССАААТТС СТСС’ТОАТСС АТОССТТААА

АТГААОСАТТ I

САССАСССАА СТСАТСААСб АСгАСОСААТА ССОСТАТАТС АТОСААТСАА

АТССАТСАСА АСАТТСТТТО САТООААССА АСССААТОТТ СТТАААССАС

АССААААССС ААТАААТССА ААТТАТСТТС ТСТСАТССАЛ ССААСТАСТС

ССЛСААСТСС ЛСОАСАТТОЛ ОААТОАСОАО ААААТГССАА АСАСТААААА '

ТАТСААСААА АСААОТСАСС ТАААСТОССС АСТТОСТСАС ААСАТСССАС

САСААААССТ АСАСТТТ6АС САСТОТАААО АТОТАООТСА ТТТСААОСАА

ТАТС АТАСТС АТСААССАСА АТТСАОСТСС СТТОСААСТТ ССАТТСАОАА

ТСАОТТТААС АА60С АТССС ААСТСАСАСА ТТСААОСТСЮ ЛТАСАССТСС

АТСАСАТТСС АСААОАТСте ОСТССААТТСт ААСАСАТТ6С ААОСАТСАСА

АСС ΑΑΊΤΑΤΤ ТСАСАТСАСА ССТОТСТСАС ТССАОАСССА САСААТАСАТ

ААТОЛАССОА СТСТАСАТСА АТАСТСССТТ ССТТААТССА ТСТТОТССАС

СААТОСАТСА ТТТССААТГА АТТССААТСА ТААОСААСТС ТАСдААСТААСг

САСтССтААССС САААСАССАА СТТСТАТООТ ТТСАТСАТАА ААООААСАТС

ССАСТГААСС ААТО АСАССО АССТССТААА СТТТСТСАСС АТССАСТТТТ

СТСТСАСТСА СССААСАСТТ сААССАСАТА ААТСЮСАСАА стастототт ’

СТТСАСАТАС ОАСАТАТОСТ ТАТААСААСТ 6ССАТАС6СС АООТТТСААС

ОСССАТСТТС ТТСТАТСТСА СААС АААТСЮ ААССТСАААА АТТААААТОА ’

ААТСЮСОААТ ССАСАТСАСС СОТТСССТСС ТССАОТСАСТ ТСААСАААТТ (?,АОЛОТАТСА ТТСААССТСА СТССТСТОТС АААСАСАААО АСАТСАССАА

- 18 012965

АОАОТТСТТТ ОАОААСАААТ САОАААСАТО ОСССАТТООА ОАОТСССССА

ААООАОТСОА ООАААОТТСС АТТС6ОААСЮ ТСТОСАООАС ТТТАТТАОСА

ААОТССЗОТАТ ТСААСАОСГТ ОТАТОСАТСТ СС АСААСТАО ААСОАТТТТС

АОСТОААТСА АОААААСТОС ТТСТТАТСОТ ТС АОССТСТТ АОООАСААСС

ТООААССТОО ОАССТТТОАТ СТТООООООС ТАТАТОААОС ААТТОАООАС

ТСССТОАТТА АТ0АТСССТ6 (КгТТТГОСТТ ААТОСТТСТТ

ООТТСААСТС

СТТССТТАСА САТОСАТТОА ОТТАОТТОТО ОСАСТОСТАС ТАТТТОСТАТ

ССАТАСТОТС С ААААААСТА ССТТОТТТСТ АСТ (5ΕφΙϋΝΟ:1) '

РВ1

АОСОАААОСА 6 ОС АААССАТ ГГОААТООАТ ОТСААТССОА ССТТАСТПТ СТТААААСТО ССАОСАСАА А АТОСТАТААО САСААСТГТС

ССТТАТАСТО САОАСССТСС ТТАСАОССАТ 6СОАСАСЮАА

САООАТАСАС

САТООАТАСТ ОТСААСАОСЛ САСАТСАОТА СТСАОАА АЛО ООААОАТООА

СААСАААСАС СОАААСТОСА ОСАССОСААС ТСААСССОАТ ТОАТООСССА

СТОССАОААО АСААТОААСС ААОТООТТАТ ОСССАААСАО АТТОТОТАТТ

ООАООСОАТО ОСТТТССТТО АООААТСССА ТССТООТАТТ

ТТТОААААСТ

СОТОТАТТСА ААСОАТООАО ОТТОТТСАОС АААСАСОАОТ АОАСААОСТО

АСАСААООСС ОАСАОАССТА ТОАСТСОАСТ СТАААТАОАА

ЛССЛЛССТСС .

ТОСААСАОСА ТТООССААСА СААТАОААОТ ОТТСАОАТСА ААТООССТСА

СООССЛ АТОЛ ОТСТОГЗААОО СТСАТАОЛСТ ТССТТААООА ТОТААТООАО

ТС ААТСААСА ААОААОАААТ ООООАТСАСА АСТСАТПТС АОАОАААОАО

АССЮСтТОАСгА ОАСААТАТОА СТААОААААТ САТААСАСАО АОААСААТОО ’

ОТАААААОАА ОСАОАОАТТО ААСААААООА ОТТАТСТААТ, ТАОАОСАТТО

АСССТОААСА СААТОАССАА АСЛТССТОАО АСАОООААОС ТААААСООАО

ЛОСАЛТТОСЛ ЛССССАОООА ТОСАААТААО ООООТТТОТА ТАСтттотте

- 19 012965

АОАСАСТООС ΑΑΘΟΑΘΤΑΤΑ ТОТОЛ6ЛЛЛС ТТОААСААТС АОСгОТТОССА

ОТТООАОССА АТОАОААОАА АОСАААОТТО ОСАААТОТТС ТААООААОАТ

ОАТОАССААТ ТСТСАООАСА ССОААСТТТС ТТТСАСС АТС АСТООАОАТА

АСАССАААТС 6ААСОААААТ САОААТССТС ΟΟΑΤΟΤΤΠΤ 06ССАТ0АТС

АСАТАТАТОА ССАОАААТСА ОСССОХАТОО ТТСАОАААТО ТТСТААОТАТ .

ТОСТССААТА АТОТТСТСАА АСААААТОСС ОАОАСТОООА АААОООТАТА '

ТОТТТСАОАО СААОАОТАТО АААСТТАОАА СТСАААТАСС ТОСАОАААТа

СТАОСААССА ТСОАГГТОАА АТАТТТСААТ <3АТТСААСАА

ΟΑΑΑΟΑΑΘΑΤ

ТОААААААТС ССАССССТСТ ТААТАОАООО ОАСТОСАТСА ТТОАОСССТО

ОААТСАТОАТ ОбЮСАТОТТС ААТАТОТТАА ОСАСТОТАТТ аоссотстсс

АТССТОААТС ТТООАСАААА О АОАТАСАСС ААОАСТАСТТ АСТООТОООА

ТООТСТТСАА ТССТСТОАСО АТТТТОСТСТ О АТТОТОААТ ССАСССААТС

АТОААОООАТ ТСААОССОСА ОТСОАСАООТ ТТТАТСОААС СТОТААОСТА

СТТООААТСА АТАТОАОСАА ОАААААОТСТ ТАСАТАААСА ОААСАООТАС

АТТТОААГТС АСААОТТТТГ ТСТАТСОТТА ТССЮТТТОТТ ОССААТТТСА

ОСАТООАОСТ ТСССАОТТТТ ООООТОТСТС ООАТСААССА

ОТСАССООАС

АТОЛ СТАТТС- 6АОТТАСТОТ САТСАААААС ААТАТОАТАА АСААТОАТСТ

ТООТССАССА АСАОСТСААА ТООСССТТСА ОТТОТГСАТС АААСАТТАСА

ООТАСАСОТА ССОАТОССАТ АТАСОТОАСА САСАААТАСА ААСССОААОА

ТСАТТТОААА ТАААОАААСТ ОТСЮОАССАА АСССОТТССА ААОСТОСАСТ

ССТООТСТСС ОАСООАООСС САААТТТАТА СААСАТТАОА ААТСТССАСА

ТТССТОААОТ СТОССТАААА ТОООААТТОА ТООАТОАСОА ТТАССАОООО

ССгТТТАТОСА АСССАСТОАА СССАТГТОТС АОССАТАААО АААТТОААТС ·

ААТОААС ААТ ОСАОТОАТОА ТОССАОСАСА ТООТССАОСС ааааасатоо

АОТАТОАТОС ТОТтеСААСА АСАСАСТССТ ООАТССССАА

ААСАААТСОА

- 20 012965

ТССАТСТТОА АТАСААОТСА ААОАООАОТА СТТОАСОАТО ААСАААТОТА

ССАААСОТОС ТОСААТТТАТ ТТОАААААТТ СТТССССАОС ЛСТТСАТАСА

ОААОАССАОТ СОООАТАТСС АОТАТбОТОО АООСТАТООТ ТТССАОАОСС

СОААТТСАТО САС60АТТСА1ТГССААТСТ ООААОСАТАА ЛСАААСААСА

ОТТСАСТОАО АТСАТОААОА ТСТОТТССАС САТТОААОАО СТСАОАСООС

АААААТАОТО ААТТТАОСТТ стссттсато ААААААТОСС ТТОТТТСТАС т

(8ВЦ Ю N0:2)

РВ2

АОСОАААССА ООТСААТТАТ АТТСААТАТО ОАААОААТАА ААСААСТАСО

АААТСТААТО ТСОСАОТСТС ОСАСССОСОА ОЛТА СТС АСА ААААССАССО

ТСОАССАТАТ ОС,СС.А ТЛ АТС ААСгААСгТАСА САТСАООААО

АСАСОАОААО

ААСССАОСАС ТТАССАТСАА АТС О АТС АТС ОСААТОАААТ АТССААТТАС

АОСАОАСААО АООАТААСОС АААТОАТТСС ТОАОАОАААТ ОАОСААООАС

АААСТТТАТС ОАОТААААТО ААТОАТОССО ОАТСАОАССО АОТОАТООТА

ТСАССТСТОО СТСТСАС АТС ОТООААТАОО ААТССАССАА ТААСАААТАС

А6ТТСАТТАТ ССАААААТСТ АСААААСТТА ТГТТОАААОА ОТСОАААООС

ТАААССАТОО ААССТТТООС ССТОТССАТТ ТТАОАААССА

АОТСААААТА

ССТСССАСтАС ТТСАСАТААА ТССТССТСАТ ССАСАТСТСА

СТОССААССА

СЮС АСАООАТ ОТААТСАТСО ААОТТСТТТТ СССТААСОАА

ОТССОАОССА

ООАТАСТААС АТСОСААТСО СААСТААСОА ТААССАААОА ОААСАААСАА

О ААСТССА6О АТТССЛАЛАТ ТТСТССТТТС ЛТССТТСС АТ

АСАТОТТОСА

ОАОАОААСТО (ЗТССОСАААА СОАОАТТССТ СССАСТСЮСТ

ООТООААСАА

ОСАОТОТОТА САТТОААОТО ТТОСАТТТОА СТСААССЛЛС АТОСТСЮСАА

САСАТСТАТА СТССАеОАОО ОЙААОТСАОО ААТОАТОАТО

ТТОАТСАААО

- 21 012965

СТТОАТТАТТ (ЭСТССТАСЮА АСАТАОТСАС ААСАОСТОСА СТАТСАОСАО

АТССАСТАСС АТСТТТАТТС САОАТСТОСС АСАОСАСАСА оаттстОтоса

АТГАССАТ60 ТАСАСАТССТ ТАСЮСАСААС ССААС АОААО АСгСААСЗСССтТ (ЭСАТАТАТОС ААОССТОСАА ТОССАСТОАС ААТТАССТСА ТССТТСА6ТТ

ТТСОТООАТТ САСАТТТААС АСААСААССС САТСАТСАСТ СААСАСАСА6

ОААСАСЮТОС ттасссссаа тсттсаааса ттоаасатаа (ЗАОТССАТСА

СЮС1АТАТОАА САСТТСАСАА ТОСТТСССАО ААОАОСААСА СССАТАСТСА

ОААААССААС САООАОАТТС АТТСАССТОА ТАОТОАОТОС ОАСАОАСОАА

С АСТСОАТГСг ССОААОС ЛАТ ААТГОТОССС АТССТАТТТТ

САСААОАОСА

ТГСТАТОАТА АААССАСТСА САООТОАТСТ ОААТТТСОГС ААТА66ОСОА

АТС ААСОАТТ СААТССТАТО САТС ААСТТТ ТА АОАСАТТТ ТСАОААССАТ аССАААОТОС ТПТТСАААА ТТОСООАСТТ СААССТАТСС АСААТСТСАТ

СССААТОАТТ СССАТАТТСС ССОАСАТСАС ТССААССАТС САСАТСТСАА

ТСАОАСОАОТ СтАСААТСАСС АА А АТООСтТО ТАОАТОАОТА

СГССАОСАС6

ОАОА6ОСТАС ТООТОАССАТ ТОАСССТТТТ ТТСАСААТСС ОООАССААСС

АОСЛААТОТА СТАСТ6ТСТС СССАССАСЮТ СА0Т6АААСА

САОСОААСА6

АСАААСТСАС ААТААСТТАС ТСАТСОТСАА ТСАТСТСОСА ОАТТААТООТ

ССТСААТСАС Т0ТТ60ТСАА ТАССТАТСАА ТССАТСАТСА САААСТ6ОСА

ААСТСТГААА АТТСАОТСОТ СССЛОААССС ТАСААТССТА ТАСААТАААА

ТОСААТТТС А АССАТТТСАС ТСТТТАСТАС СТААССССАТ ТАОАОСССАА

ТАСАСТС6ОТ ТТСТААСААС ТСТСТТССАА САААТСАОСС

АТОТ6СТТ6С

САСАТТТОАТ АССОСАСАОА ТААТАА ДАСТ ТСТТСССТТС ССАОССОСТС

САССАААОСА ААОТАСААТС САСТТСТССТ САТТТАСТОТ СААТСТСАОС

ССАТСАССАА ТСАСААТАСТ ТОТААОСССС ААТТСТССТЙ ГАТТСААСТА

ТААСААСССС АССААСАОАС ТСАСАСТТСТ СССАААСОАТ ОСТОССАСТТ

- 22 012965

ТААС'ТОААОА СССАОАТОАА ОССАСАОСТО ОАОТСЮАОТС СОСТОТТСТО

АОйООАТТСС ТСАТТСТСтСгС, САААОААОАС ААОАОАТАТО

ООССА6САСТ

АА6САТСААТ (ЗААСТОАОСА АССТТ6СОАА АСОАСАОААО ОСТААТСТОС

ТААТТОООСЛ АСОАОАСОТО ОТОТТООТАА ТОАААССОАА

АСОСЮАСТСТ

АССАТАСТГА СТОАСАОССА ОАСАОСОАСС ААААОААТТС СОАТОСССАТ

СААТТАОТОТ ССЛАТАаТГТ АААААССАСС ТТОТТТСТАС Т (8Е0 Ш N0:3) '

ΝΡ

АОСААААОСА ОООТАОАТАА ТСАСТСАСТО АОТСАСАТСА АААТС АТООС ОТСТСААООС АСС АААСО АТ СТТАСОААСА ОАТООАОАСТ

ОАТООАОААС ОССАСгААТСС САСТОАААТС АСЛССЛТССО ТСОСАААААТ

ΟΛΤΤΟΟΤΟΘΛ АТТООЛСОАТ ТСТАС АТССА ААТОТССАСС (ЗААСТСАААС

ТС АОТОАТТА ТОАСЮОАСОС ТТСАТССААА АСАОСТТААС ААТАОАОАОЛ

АТСОТОСТСТ СТССТТТТОА СОАААООАОА ААТАААТАСС ТТОЛЛОААСЛ

ТСССАСТ6С0 СООАААОАТС СТААОААААС ТООАООАССТ АТАТАСА6ОА

ОАОТАААСОО АААОТООАТО А6А0ААСТСА ТССТТГЛТСА САААОААОАА

АТААООСОАА ТСТООСОССА АОСТААТААТ ООТОАСОАТО СААСООСТОО

ТСТСАСТСАС АТОАТСАТСТ СССАТТССАА ТТТОААТОАТ (ЗСААСТТАТС

АОАОСгАСААО А6СТСТТ0ТТ СОСАССООАА ТСЮАТСССАО САТОТОСТСТ

СТОАТССААО ОТТСААСТСТ СССТА6САСКЗ ТСТООАОССО САООТОСТОС

АОТСАААООА ОТТСОААСАА ТООТОАТООА АТТООТСАОА АТОАТСАААС

ОТОООАТСАА ТОАТСООААС ТТСТООАООО ОТОАОААТОО А СО А. ДА. ДАС А

АОААТТОСТТ АТОАААОААТ СТОСААСАТТ СТСАААОСЮА ААТТТСАААС

ТОСТОСАСАА АААОСААТОА ТОСАТСААОТ ОА(ЗАОА(ЗА<ЗС

С60ААСССЛС

ООААТОСТОА ОТТСОАА6АТ СТСАСТТТТС ТА6САС00ТС ТОСАСТСАТА

ТТОАОАОООТ СОЭТТОСТСА СААСгТССТОС СТОССТОССТ отототАТоо

- 23 012965

АССТОССОТА ОССАОТ0СОТ АССАСТТТОА ААССОАСОСА ТАСТСТСТАО

ТСООА АТАОА СССТТГСАОА СТОСТТСААА АСАОССААОТ СТАСАОССТА

АТСАСгАССАА АТОАОААТСС АОСАСАСААО А0ТСААСТС6 ТОТООАТООС

АТОССАГГСТ ОССССАТТГО ААОАТСТААО АОТАТТЛАОС

ТТСАТСАААО

СОАСОААООТ ОСТСССААОА СООЛАОСТТГ ССАСТАОАОС АОТТСАААТГ

ОСТТССААТО ААААТАТССА 0АСТАТ6САА ТСААОТАСАС ТТОААСТОАО

ААОСАООТАС ТОСОССАТАА ООАССАОААО ТООАООАААС АССААТСААС

АСАСССС АТС ТСССЮОССАА АТС АСС АТАС ААССТАСОТТ СТСАОТАСАС

АОАААТСТСС СГГТТОАСАО ААСААССАТТ ЛТОССЛОСЛТ ТСААТСС0АА

ТА С АСАСаСС АСААСАТСте ЛСЛТСгЛСгОАС ссааатсата АОСАТСАТСЮ

АААСТССААС АССАСАА6АТ ОТОТСТТТСС АООО0СО0ОО А0ТСТТС0АО

СТСТС0ОАС0 ААААООСА0С ОАОСССОАТС СТСССТТССТ ТТОАСАТОАО

ТААТ0АА0ОА ТСТТАТТТСТ ТСОСА0АС АА Т6САОА00А0

ТАСОАСААТТ

АААОАААААТ АСССТТОТТТ СТАСТ (ЗЕф ГО N0:4)

М

АОСААААОСА О0ТАОАТАТТ ОАААОАТОА0 ТСТТСТААСС ОАООТС0ААА

СОТАСОТАСТ СТСТАТСАТС СССТСА0ОСС СССТСАААОС СОАОАТСССА

САОАОАСГТО ААОАТОТСТТ Т6СА6СОААО ААСАСССАТС ТТОАОСТТСТ

САТО6ААТО0 СТАААОАСАА САССААТССТ ОТСАССТСТО АСТААООООА

ΊΤΤΤΑΟΟΑΤΤ ТОТОТТСАСО СТСАСССТОС ССАОТОАССС

А6ОАСТ6САС

СОТАОАСОСТ ТТОТССЛААА ТОСССТТААТ ОООААСОСОО АТССАААТАА

САТСОАСААА ОСАОТТАААС ТОТАТАО0АА ЙСТСААОА00

ОАОАТААСАТ

ТССАТСОО6С СААА6АААТС ТСАСТСАСТТ АТТСТОСТОО тасАсттосс

АбттстАтаа осстсатата с аасаооатс ооссстател ССАСТОААОТ

О6САТТТООС СТОСТАТСТО СААССТОТ0А АСАОАТТССТ САСТСССАСС

- 24 012965

АТСССГСТСА ТА6ССАААТО СТО АСААСАА ССААТССАСТ ААТСАСАСАТ (ЗАОААСАОЛА ТССТТТТАСС САССАСТАСА ОСТААСОСТА

ТССАССАААТ

СЮСТОСАТСО лоте аосаас саосасаосс сатссасстт

ССТАСТСАСС

СТАСЛСАААТ СС1ССААССС АТСАСААССА ТТ66САСТСА ТССТАССТСС

АОТбСТССТС ТСАААААТСА ТСТТСТТСАА ААТТТОСАОС ССТАТСАСАА

АССААТОСОО ОТОСАОАТОС ААСООТТСАА 0Т6АТССТСТ САСТАТТОСС

ССАААТАТСА ТТСССАТСТТ 6САСТТОАС А ТТСТССАТТС ТТСАТСОТСТ

ТТПТТСААА ТССАТТТАСС СТСССТТТАА АТАССОАСТС АААССАСССС

СТТСТАСОСА АОСАСТСССА ААСТСТАТОА ОССААСААТА ТССАААСОАА '

САСС АС АСТС СТСТСОАТОС ТС1АССАТООТ С АТТТТСТСА

ОСАТАОАССТ

ССАОТААААА АСТАССГТОТ ТТСТАСТ (8ЕС> Щ N0:5)

N8

АССАААА6СА СССТСАСААА ААСАТААТОС АТСС АААСАС ТОТСТСААСС

ТТТСАС6ТА6 АТТОСТТТСТ ТТСОСАТСТС СССАААС6А6 ТТССАСАССА ,

АСААСТАССС ОАТСССССАТ ТССТТСАТСС ССТТСССС6А ОЛТСАСАЛЛТ

СССТААСАСС ААССССС ЛОТ АСТСТС6СТС ТССАСАТСАА САСАОССАСА

ССТССТОСАА АОСАОАТАОТ ССАССССАТТ СТО АЛ АСА АО ААТСССАТСА

6ОСАСТТААА АТОАССАТСС ССТСТСТАСС ТОССТССССТ ТАССТААСТС

АСАТСАСТСТ ТСАССАААТО ТСААСССАСТ ОСТССЛ ТОСТ САТАСССААС

САСАААСТСС САСССССТСТ ТТСТАТСАОА АТССАССАСС

ССАТСАТССА

ТАЛСААСАТС АТАСТОАААС ССААСТТСАС ΤΟΤΟΑΤΤΊΤΓ САСССОСТСС

АСАСТСТААТ АТГССТААСС ССТТТСАССО ААСАСССАОС ААТТСГГССС

САААТТТСАС САТТСССТТС ТСТТССАССА САТАСТССТС АООАТСТСАА ~

АААТССАСТТ ООАОТССТСЛ ТСССАСОАСТ ТСААТОСААТ

САТААСАСАС

ТТСОАСТСТС ТСАААСТСТА САСАСАТГСС СТТССАСААС САСТААТСАС

- 25 012965

ААТОООАОАС СТССАСТСАС ТССААААСАО АААССАОААА ТаОСОССААС

ААТТАОСТСА ОААСТТТОАА ОААлТААСАТ СОТТСАТТОА ЛСтААСТОЛбА

САСАААСТОА АОАТААСАОА ОААТАОТТТТ ОА6САААТАА САТТТАТОСА

АОССТТАСАТ СТАТТОСТТС ААОТООАОСА АОАОАТААОА АСТТТСТСОТ

ТТСАОСТТАТ ТТАОТАСТАА ААААСАСССТ ТСТТТСТАСТ (КЕО ГО N0:6)

НА

А6САААА0СА06С0ААААТАААААСААССААААТСАА0ССАААССТ АСТаСТССТОТТЛтетОСАСТТОСАОСТОСАОАТ

СгСАОАСАСААТАТОТАТАООСТАССАТОСОААСААТТСААССаАСАС ТОТТаАСАСАОТАСТСОАОААОААТОТСАСАОТ

ОАСАСАСТСТОТТААССТОСТСОААОАСАОССАСААССЮААААСТАТ ОТАОАТТААААООААТАОССССАСТАСААТТОО ооааатотаасатсосссоатоостсттосоааасссаоаатоссас ССАСТОСТТССАСТОАОАТСАТОСТССТАСАТТ

ОТАаАААСАССАААСТСТОАОААТООААТАТСТТАТССАООАОАТТТ САТСОАСТАТОАОаЛССТОАОСаАОСААТТОАО СТСАОТОТСАТСАТТСОАААОАТТСОАААТАТТТСССАААОАААОСТ САТООСССААССАСААСАСАААССЮАОТААСОО САаСАТаСТСССАТОАОасОААААООАеТТТТТАСАСАААТТтеСТА ТООСТОАСООАОААООАОСОСТСАТАСССАААО СТОАААААТТСТТАТОТОААСААААААОООАААСААОТССТТОТАСТ ОТСааОТАТТСАТСАСССОССТААСАОТААООА асаасаоаатстстатсаоаатоаааатосттатотстстотаотоа СТТСАААТТАТААСАСОАСАТТТАСССССОААА таосаоаааоасссаааотааоасатсааостоооаооатоааста ТТАСТбОАССТТССТААААССССОАОАСАСААТА АТАТТТОАОСгСАААТООАААТСТААТАОСАССААТСгТАТОСПТССС АСТОАОТАОАСОСТТТбОСТСССОСАТСАТСАС

СТСАААСОСАТСААТОСАТОАСгТОТААСАСОААОТСТСАААСАСССС ТОООАОСТАТАААСАОСАОТСТСССТТАССАОА АТАТАСАСССАОТСАСААТАООАОАОТССССААААТАСОТСАаОАОТ аССАААТГСАСОАТООТТАСАОСАСТААООААС АТТССОТССАТТСААТССАОАООТСТАТТТООАОССА'ГТОССООТТТТ АТТОААООСЮОАТООАСТООААТОАТАОАТОО АТООТАТООТТАТСАТСАТСАОААТСААСАОООАТСАООСТАТОСАО ССЮАТСААААААССАСАСААААТОССАТТААСХЭ бОАТТАСАААСААООТОААСАСТОТТАТСвАОААААТСААСАТТСАА ттсасасстотсоотаааоалттсаасааатта οααααααοοατοοαααατττααατααααααθττοατοαίγοοατττοτ ооасатттооасататаатосаоааттоттаот ТСТАСТСЮААААТОАААООАСТСТООАТТТССАТОАСТСАААТОТОА АОААТСТОТАТОАОАААСгТАААААОССААТТАА АОААТААТОССАААОАААТСООАААТСОАТСТТТТОАОТТСТАССАС ААОТОТОАСААТОААТССАТаОАААОТОТААОА

- 26 012965

ААТОбвАСТТАТСАТТАТСССАААТАТТСАСААОАОТСАААОТТаАА

САСЮСААААОСгТАОАТСЮАСТОАААТГООААТС

ААТООССАТСТАТСАСАТТСТООСОАТСТАСТСААСТОТСОССАСгТТС

АСТСОТОСтТСОТСТСССТОООООСААТСА

ОТТТСТООАТОТОТТСТААТООАТСПТОСАСгТОСАОААТАТОСАТСТ

ОАОАТТАОААТТТСАСАОАТАТОАООАААААС

АСССТТСТТТСТАСТ (8Ер ТП N0:7)

ΝΑ

АОСААААОСАаООСТТГААААТОААТССАААТСАОААААТААТААС САТГООАТСААТСТОТСТООТАОТСООАСТААТТ АОССТААТАТТОСАААТАОСЮААТАТААТСТСААТАТОСгАТТАОССА ТТСААТТСАААСТООААОТСААААССАТАСТСО ААТАТОСААССААААСАТСАТТАССТАТАААААТАОСАССТОООТАА АООАСАСААСТТСАОТСгАТАТТААСССгОСААТТ САТСТСТТТОТСССАТССОТООаТОСОСТАТАТАСАаСАААОАСААТ АОСАТААОААТТООТТССАААССАОАССгТТТТТ ОТСАТААОАОАОСССПТАТТТСАТОТТСТСАСТТбСААТССАОСАСС ТТТТТТСТОАСССААСОТасСГГАСТОААтеА СААОСАТТСААОТОСОАСТСгТТААООАСАОААОСССТГАТАССОССТ ТААТОАОСТОСССТОТСООТОАЛОСТССОТССС СОТАСААТТСААОАТТТОААТСОСТТОСТТООТСАОСААОтеСАтеТС АТОАТООСАТСТЗССТОССТААСААТСООААТТ ТСАОСТССАОАТААТООАОСАОТООСТОТАТТААААТАСААСОбСАТ ААТААстеАААССАТАААААОТТОСАСтОААОАА ААТАТТСАООАСАСААОАСТСТОААТОТОССТОТОТАААТОаТТСАТ ОТПТАСТАТААТвАСТОАТООСССбАОТОАТО ОбСТОСССТССТАСААААТТТТСААОАТСОААААОСааААаОТТАСТ АААТСААТАОАОТТОААТССАССТААТТСТСАС ТАТОАООААТОТГССТСТТАСССтеАТАССОССАААеТОАТОТСТОТ ОТОСАОАОАСААТТООСАТООТТСОААСССССС АТСООТОТСТТТССАТСААААССТООАТТАТСАААТАОСАТАСАТСТ ОСАОТОбООТТТТСОетОАСААСССОСОТСССО ААОАТаОААСАСОСАОСТОТСОТССАОТОТАТОТТОАТООАОСАААС аОАаТАААСЮСАТТТТСАТАТАООТАТОаТААТ ООТСТТТОСАТАООААООАССААААОТСАСАОТТССАОАСАТаСОТТ ТОАОАТОАТТТОСОАТССТААТООАТСОАСАСА САСтеАТАОТААОТТСТСТОТОАООСААОАТОТТОТООСААТОАСТС АТТСЮТСАОООТАТАбСОСААОТТТСОТТСААС АТССТОАОСТОАСАОСКЗСТАОАСТОТАТСАООССОтаСТТСТОООТТ ОААТТААТСАООООАСОАССТАААОААААААСА '

АТСТООАСТАСТОСОАОСАаСАТТТСТТТТТОТОССбтеААТАаТОАТ АСТОТАОАТТООТСТТООССАОАСООТОСТОА ОТТОССАТТСАОСАТТОАСААОТАСТСТОТТСААААААСТССТТОТТТ СТАСТ (8ЕЦ ГО N0:8)

Пример 3.

Вирус гриппа Α/ΗοηдКοηд/213/2003(Η5N1, НК213) систематически реплицируется в организме цыплят, вызывая летальную инфекцию. Более того, этот вирус вызывает гибель и куриных эмбрионов. Таким образом, хотя поверхностные белки указанного вируса близкородственны циркулирующим в настоящее время патогенным штаммам вируса гриппа птиц, НК213 не может быть использован в качестве вакцинного штамма, поскольку попытки его выращивания в куриных эмбрионах заканчиваются получением аллантоисной жидкости, практически не содержащей вирус. Также использование высоковирулентного вируса с целью получения вакцины небезопасно для персонала. Для тестирования возможности использования Α/ΡΚ/8/34 в качестве эффективного вакцинного вирусного штамма сайт расщепления гена НА НК 213 (содержащий многочисленные основные аминокислоты) подвергали мутированию от вирулентного до авирулентного фенотипа [от КЕККККК (8Е0 Ю Ν0: 9) к ТЕТК]. Вирус, содержащий мутированный ген НА, не вызывал летальной, локализованной инфекции в организме цыплят. Кроме того, мутированный вирус не вызывал гибель куриных эмбрионов. Таким образом, выращивание мутированного вируса в куриных эмбрионах приводит к получению аллантоисной жидкости, содержащей большое количество вируса, и в такой аттенуированной форме он безопасен для применения в вакцинах.

В куриных эмбрионах получали рекомбинантный вирус, содержащий ген ΝΑ и мутированный ген НА из штамма НК213 и остальные гены из штамма высокого титра Α/ΡΚ/8/34 (Η1Ν1, Η6-ΡΚ8) (пример 2), который растет в куриных эмбрионах в 10 раз с большей скоростью, чем другие штаммы Α/ΡΚ/8/34 ΡΚ8 (10¹⁰ ЕГО₅₀/мл; титр НА равен 1:8 000). Этот рекомбинантный вирус, экспрессирующий поверхностные белки, которые близкородственны циркулирующим в настоящее время патогенным штаммам вируса гриппа птиц, в куриных эмбрионах размножается в высоких титрах (фиг. 4). Таким образом, замена генов НА и ΝΑ ΗΟ-ΡΚ8 на гены циркулирующих в настоящее время патогенных штаммов вируса гриппа приводит к получению вакцинного штамма, который безопасен и позволяет использовать ΗΟ-ΡΚ8 в ка

- 27 012965 честве эффективного вакцинного штамма.

Источники информации.

Ауегу'з Эгид Тгеа!теп!: Рппар1ез апб Ргасйсе о£ Сйшса1 Рйагтасо1оду апб Тйегареийсз, 3гб ебйюп, ΑΌΙ8 Ргезз, Ь!б., Аййатз апб Айктз, Ва1йтоге, ΜΌ (1987).

Аутагб-Непгу е! а1., У1го1оду: А Ргасйса1 Арргоасй, ОхГогб 1КЪ Ргезз, ОхГогб, 119-150(1985).

Васйтеуег, 1п!еМго1оду, 5:260 (1975).

Вегкоте е! а1., ебз. ТНе Мегск Мапиа1. 16111 ебйюп, Мегск & Со., Кайгау, N1 (1992).

Впбдеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8а. И.8.А, 93:15400 (1996).

Сазйиса е! а1., 1. Уйо1., 66:4647 (1992).

Сазйиса е! а1., 1. Уио1., 69:2725 (1995).

Сопхе1тапп е! а1., 1. Сеп. У1го1., 77:381 (1996).

Сопхе1тапп е! а1., Тгепбз М1сгоЫо1., 4:386 (1996).

Сопхе1тапп, Аппи. Кеу. Сепе!., 32:123 (1998).

Сохе1тапп е! а1., 1. Упо1., 68:713 (1994).

Ебтеагбз, 1. 1пГес!. Όίδ., 169: 68 (1994).

Епат1 е! а1., 1. Упо1., 65:2711 (1991).

Епат1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8а. И.8.А., 87:3802 (1990).

Епат1 е! а1., У1го1оду, 185:291 (1991).

Робог е! а1., 1. Упо1., 73:9679 (1999).

Со!о е! а1., Упо1оду. 238:265 (1997).

Сгапб апб 8кейе1, №1иге. №\ν Вю1оду. 238:145 (1972).

На!!а е! а1., 8аепсе. 293:1840 (2001).

Нопто!о е! а1., 1. Уйо1., 68:3120 (1994).

Нибб1ез!оп е! а1., №с1. Аабз Кез., 10:1029 (1982).

Кейе1 е! а1., ш Тех!Ьоок оГ [пПиепха, ебз. №ско1зоп, К.С., АеЬз!ег, К.С., апб Нау, А. (В1аскгее11, ОхГогб), рр. 373-390 (1998).

Кепба1 е! а1., 1пГес!. 1ттипйу, 29:966 (1980).

КйЬоите, Ви11. М2 Аог1б Неа1!й Огд., 41: 653 (1969).

Кохезб! е! а1., 1. Сигг. Орт. В1о!есйпо1., 8:583 (1997).

Йауег & АеЬз!ег, Упо1оду, 69:511 (1976).

Ьатезоп е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8а. И.8.А., 92:4477 (1995).

Ы е! а1., Уйиз Кез., 37:153 (1995).

Ьиу!_)ез е! а1., Се11, 59:1107 (1989).

Мато!! е! а1., Αбν. Уйиз Кез., 53:321 (1999).

Мепа е! а1., 1. Упо1., 70:5016 (1996).

М17гаЫ, (еб.), Упа1 Уасстез. Айеу-Ызз, №\ν Уогк, 39-67 (1990).

Мигрйу, 1пГес!. И1з. Сйп. Ргас!., 2: 174 (1993).

Миз!ег е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8а. И8А. 88: 5177 (1991).

Мипох е! а1., Апйупа1 Кез., 46:91 (2000).

№д;й е! а1., М1сгоЫо1. 1ттипо1. 43:613 (1999).

№дак Кеу. Меб. Упо1., 9:83 (1999).

№итапп е! а1., Αбν. Уйиз Кез., 53:265 (1999).

№итапп е! а1., 1. Сеп. Упо1., 83:2635 (2002).

№итапп е! а1., 1. Упо1., 71:9690 (1997).

№итапп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8а. И.8.А. 96:9345 (1999).

№итапп е! а1., Уйо1оду, 202:477 (1994).

№итапп е! а1., Уйо1оду, 287:243 (2001).

\т;| е! а1., Сепе. 108:193 (1991).

Одга е! а1., 1. 1пГес!. П1з., 134: 499 (1977).

Озо1 (еб.), Кеттд!оп'з Рйагтасеийса1 8аепсез, Маск РиЬйзЫпд Со., Еаз!оп, РА 1324-1341 (1980).

Рагкз е! а1., 1. Уйо1., 73:3560 (1999).

Рекоз/ е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8а. И.8.А, 96:8804 (1999).

Регех е! а1., Уйо1оду, 249:52 (1998).

Р1езсйка е! а1., 1. Уйо1., 70:4188 (1996).

Кабеске е! а1., ЕМВО 1., 14:5773 (1995).

КоЬейз е! а1., Уйо1оду, 247:1 (1998).

КоЬейзоп е! а1., Вю1одюа1з, 20:213 (1992).

КоЬейзоп е! а1., Сюта1е б1 1д1епе е Мебкша Р1^еп!йа, 29:4 (1988).

Козе, Ргос. №!1. Асаб. 8а. И.8.А, 93:14998 (1996).

8сйпе11 е! а1., ЕМВО 1., 13:4195 (1994).

8иЬЬагао е! а1., 1. Уйо1. 67:7223 (1993).

Аог1б Неа1!й Огдашхайоп Т8К №. 673 (1982).

- 28 012965

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящее описание исключительно в качестве ссылок. В то время как в настоящем описании раскрыты наиболее предпочтительные варианты осуществления заявленного изобретения и многие детали приведены в целях иллюстрации изобретения, специалисту в данной области очевидно, что возможны дополнительные варианты осуществления изобретения, а многие приведенные здесь детали могут существенно варьировать, не выходя за рамки основных принципов изобретения.

Список последовательностей <110> Каваока, Йошихиро <120> Вирусы гриппа высокого титра для приготовления генной терапии вакцин и

<130>	800.038И01
<150>	из 60/473,798	ч
<151>	2003-05-28
<160>	40
<170>	ГавЕЗЕО £ог Игпйоиз Уегзгоп 4.0
<210>	1
<211>	2233
<212>	ДНК
<213>	Вирус гриппа
<400>	1

адсдааадса аППд'Ьсдадс аасаааПППд ППсаНсааПд аадсасадаП адПаПППдса ааддадааба дааааддсса даадаааПдд ассадасПаП садНссдада аадсПНдссд дПддаПддаП. дПаааПдсПа дддссПсссП даддасссаа асаПСсПППд ааПНаПсННс ааааППссаа аасабддоас ПаПдаПадПд ааддсаПдсд дсПссааППд Пдсададсса ПсППдПдсад дадддааддс ааПдасассд даассасаНа дссаПаддсс абНаааабда дададпа£да дадаасаааП аб-Ьдддаадд ссасаасПад адддасаасс сааааПддаа аасааПдааа сасПсасНПд дНсааПааНс сдадддаада ддсбдадааа ааЪПддадПа абсПдадааа адасПасас± аоаадаааПд дасааППдаа сссдссдаас сддсбасаПН ££ΐ£1: Пдааа дПссаааПНс ададддааНа асссааНдПН дсаадПасНд ПаПдаадааа адасПППдас аППдаддПсд ППсаадсИдд аадсабдада аа£дааддда ЪЬбссааЪЪа сППдПаПддП сПП^дЪдадс дПасПдПдПН дсссаПдППс ддадабдадд дПссПсПдПс дсссаПНдда ИППаППадса адсГдааСса дассПППдаП даППППдПдс дадПаПдддд даадПабдсП дПадаасППд даПодсасаа ссааадНЪПс асааддадад асасасаПсс сПсдаПдаад дссадсадад даааддНПНд СНсПссадсс дадддсаадс асаасассас сПдсПдаПдд ссдсПаНаПд дНПааассас дсадаасПдс аоаадбсадс дасПдНааад сППдсаадПП а£ададс£сд аддаа'Ь'ЬаП'Ь дПдПасаПса аППссааПда ППсаПсаПаа аПддадППЪП сПНдадаПад ППдПаПдПда сдНПдссПсс ааададааад дадПссссса аадПсддПаП адаааасСдс сППддддддс дасаакдскЬ аддассПдаа ПсаПдЪаЪЪс дПдаПссааа ПддссПддас ПассадаППП аадННсасаП асаППТПсПс ааадсадддс дссбсПддда аааПсасадд ППдааааППП ПдПсбсаааП дассасППад аПдссНПааа аНдсааПсаа асдааааддд аддасаПНда. ПааадПдддс аПдПаддПда ддаПНсадаа аПдадаППдд ЬсасаПсада аПасПдссПП ПаадсаадПд ааддаадаНс сПсбсасПда дадаНаНдсН даасааабдд ЪссадгсасЬ асаПдассаа ааддадПдда ПсаасадсПН ППсППаГсдП ПаПаПдаадс саа£ссда£д ааПсдаааса адаППППсас ЪдсасЪП'ЬПд адНадПааас дПаПдаНПас аНасНаПсПд дППсасПддд ПаддаПсааа П-ЬссПППсдП аасааНдсдс ПададссЬаП дПссааадаа асППссдааП аППаадсаПП аПдсаПдада ааПаааПсса дааПдаддад асПЪддПдад ПППдаадсаа ПдадППНаас адаадаПдПд ддНдбсПсас дсППааПдса ПадаасПаад ссасППаадд сссаадасПП ПаНаадаадП аассПсаааа ПсаасаааНП ададППсППИ ддааадППсс дПаНдсаПсП £саддс£с££ ааП^даддад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100

- 29 012965 бдссбдабба абдабсссбд ддббббдсбб аабдсббсбб ддббсаасбс сббссббаса 2160 сабдсаббда дббадббдбд дсадбдсбас бабббдсбаб ссабасбдбс саааааадба 2220 ссббдбббсб асб 2233 <210> 2 <211> 2341 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 2 адсдааадса ддсааассаб ббдаабддаб дбсаабссда ссббасбббб сббаааадбд60 ссадсасааа абдсбабаад сасаасбббс ссббабасбд дадасссбсс ббасадссаб120 дддасаддаа саддабасас сабддабасб дбсаасадда сасабсадба сбсадаааад180 ддаадабдда саасааасас сдааасбдда дсассдсаас бсаасссдаб бдабдддсса240 сбдссадаад асаабдаасс аадбддббаб дсссааасад а!бдбдбабб ддаддсдабд300 дсбббссббд аддаабссса бссбддбабб Сббдаааасб сдбдбаббда аасдабддад360 дббдббсадс ааасасдадб адасаадсбд асасааддсс дасадассба бдасбддасб420 сбааабадаа ассаассбдс бдсаасадса ббддссааса саабадаадб дббсадабса480 аабддссбса сддссаабда дбсбддаадд сбсабадасб бссббаадда бдбаабддад540 бсаабдааса аадаадаааб ддддабсаса асбсаббббс ададааадад асдддбдада600 дасаабабда сбаадааааб дабаасасад адаасаабдд дбааааадаа дсададаббд660 аасаааадда дббабсбааб бададсаббд асссбдааса сааОдассаа адаОдсИдад720 ададддаадс баааасддад адсааббдса ассссаддда бдсааабаад ддддбббдба780 басбббдббд адасасбддс ааддадбаба бдбдадааас ббдаасаабс адддббдсса840 дббддаддса абдадаадаа адсааадббд дсааабдббд бааддаадаб дабдассааб900 бсбсаддаса седаасбОбе бббсассабс аебддадаба асассааабд даасдааааб960 садаабссбс ддабдОбббб ддссабдабс асабабабда ссадааабса дсссдаабдд1020 ббсадааабд ббсбаадбаб бдсбссааба абдббсбсаа асаааабддс дадасОддда1080 ааадддбаба бдбббдадад саададбабд аааеббадаа сбсааабасс бдеадааабд1140 сбадсаадса бсдабббдаа абабббсааб даббсаасаа дааадаадаО бдаааааабс1200 сдасодсбсб баабададдд дасбдсабса ббдадсссбд даабдабдаб дддсабдббс12 60 аабабдббаа дсасбдбабб аддсдбсбсс абссбдаабс ббддасаааа дадабасасс1320 аадасбасбб аебддбддда бддбсббсаа бссбсбдасд аббббдебеб даббдбдааб1380 дсасссаабс абдаадддаб бсаадссдда дбсдасаддб бббабсдаас ебдбаадеба1440 сббддаабса абабдадсаа дааааадбеб басабаааса даасаддбас аШдаайс1500 асаадбббХб бебабедбба бдддбббдбб дссаабббса дсабддадсб бсссадбббб1560 ддддбдбебд ддабсаасда дбсадсддас абдадбаббд дадббаебдб сабсааааас1620 аабабдабаа асаабдабсб бддбссадса асадсбсааа бддсссббса дидйсабс1680 ааадаббаса ддбасаедба ссдабдссаб абаддбдаса сасааабаса аасссдаада1740 бсабббдааа бааадааасб дбдддадсаа асссдббсса аадебддаеб дсбддбсбсс1800 дасддаддсс сааабббаба саасаббада аабсбссаса ббссбдаадб сбдссбаааа1860 бдддааббда бддабдадда ббассадддд едбббабдеа асссасбдаа сссабббдбс1920 адссабааад аааббдаабс аабдаасааб дсадбдабда бдссадсаса бддбссадсс1980 ааааасаОдд адбабдабде бдббдсааса асасасбссб ддабссссаа аадааабсда2040

Сссабсббда абасаадбса аададдадба еббдаддабд аасааабдба ссаааддбде2100 бдсааОббаб 6бдааааабО сббссссадс адбб саб аса даадассадб сдддабабсс2160 адбабддбдд аддсбабддб ббссададсс сдааббдабд сасддаббда бббсдаабсб2220 ддааддабаа адааадаада дббсаебдад абсабдаада бсбдббссас саббдаадад2230 сбсадасддс ааааабадбд аабббадебб дбссббсабд аааааабдсс ббдбббсбас2340 б2341 <210> 3 <211> 2341 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 3 адсдааадса ддбсааббаб аббсаабабд дааадаабаа аадаасбасд ааабсбаабд60 бсдсадбсбс дсасссдсда дабасбсаса аааассассд бддассабаб ддссабаабс120 аадаадбаса сабсаддаад асаддадаад аасссадсас ббаддабдаа абддабдабд180 дсаабдааас аассаагаас адсадасаад аддабааедд ааабдаббсс бдададаааб240

- 30 012965 дадсааддас ааасР:РРаРд дадРааааРд ааРдаРдссд даРсадассд адрдарддра 300 РсассРсРдд сРдРдасаРд дРддааРадд ааРддассаа РаасаааРас адбРсаРРаб 360 ссаааааРсР асаааасРРа РРРРдааада дбсдаааддс РааадсаРдд аассРРРддс 420 ссРдРссаРР РРадааасса адРсааааРа сдрсддадад РРдасаРааа РссРддРсаР 4 80 дсадаРсРса дрдссаадда ддсасаддаР дРааРсаРдд аадРРдРРРР сссРаасдаа 540 дбдддадсса ддаРасРаас аРсддааРсд саасРаасда Раассааада даадааадаа 600 даасРссадд аРРдсааааР РРсРссРРРд аРддРРдсаР асардррдда дададаасРд 660 дрссдсаааа сдадаРРссР сссадрддср ддрддаасаа дсадрдрдра саррдаадрд 720 РРдсаРРРдз сОсааддаас аРдсРдддаа садаРдРаРа сРссаддадд ддаадрдадд 780 ааРдаРдаРд РРдаРсааад сРРдаРРаСР дсрдсРадда асарадрдад аададсрдса 84 0 дРаРсадсад аРссасРадс аСсРРСаСРд дадаРдРдсс асадсасаса даррддрдда 900 аРРаддаРдд РадасаРссР Раддсадаас ссаасадаад адсаадссдр ддаРаРаРдс 960 ааддсРдсаа РдддасРдад ааРРадсРса бссррсздрр РРддРддаРР сасаррраад 1020 адаасаадсд даРсаРсадР саадададад даададдрдс РРасдддсаа РсРРсаааса 1080 РРдаадаРаа дадрдсарда дддаРаРдаа дадРРсасаа РддРРдддад аададсааса 114 0 дссаРасРса даааадсаас саддадаРРд аГРсадсбда РадРдадРдд дададасдаа 1200 садбсдаРРд ссдаадсааР ааррдрддсс атддРаСОРб сасаададда РРдРаРдаРа 1260 ааадсадрса даддРдаРсР дааШсд!с ааРадддсда аРсаасдаРР дааРссРаРд 1320 саРсаасРРР РаадасаРРР РсадааддаР дсдааадрдс ЬНйсаааа РРддддадРО 1380 даассРаРсд асаардрдар дддааРдаРР дддаРаРРдс ссдасаРдас рссаадсаРс 1440 дадардРсаа рдададдадр дадааРсадс ааааРдддРд РадаРдадРа сРссадсасд 1500 дададддРад РддРдадсаР ОдассдРРРР РРдадааРсс дддассаасд аддаааРдРа 1560 сРасрдРсРс ссдаддаддр садрдаааса садддаасад адааасрдас ааРаасРРас 1620 РсаРсдРсаа ЬдаРдрддда дарраарддр ссрдаарсад рдррддрсаа рассрарсаа 1680 РддаРсаРса дааасРддда аасРдРРааа аРРсадРддР сссадаассс РасааРдсРа 1740 РасааРаааа рддаарррда ассаРРРсад РсРРРадРас сРааддссаР Рададдссаа 1800 РасадРдддР РРдбаадаас РсРдРРссаа саааРдаддд ардрдсррдд дасарррдар 1860 ассдсасада РааРаааасР РсРРсссРРс дсадссдсРс сассааадса аадРадааРд 1920 садРРсРссР саРРРасРдР дааРдРдадд ддаРсаддаа РдадааРасР РдОааддддс 1980 ааРРсРссРд раРРсаасРа Раасааддсс асдаададас рсасадррср сддаааддаР 2040 дсРддсасРР РаасРдаада сссадардаа ддсасадсрд дадрддадСс сдсРдРРсРд 2100 аддддаРРсс РсаРРсРддд сааадаадас аададаРаРд ддссадсасР аадсаРсааР 2160 даасРдадса ассРРдсдаа аддададаад дсраардрдс гааррдддса аддадасдРд 2220 дрдррддраа рдааасддаа асдддасРсР адсаРасРРа сРдасадсса дасадсдасс 2280 аааадааРРс ддаРддссаР сааРСадОдР сдааРадРРО ааааасдасс РРдРОРсРас 2340 Р 2341 <210> 4 <211> 1565 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 4 адсаааадса ассааасдаР ададсаРссд даасрсааас аРддРдсРсР дддааадаРс ададаасРса ддрдасдард дсаасРРаРс сРдардсаад дррддаасаа РРсРддаддд сРсаааддда сддаасссад РРдададддО дссадрдддр сбдсррсааа адРсаасРдд РРсаРсааад дсРРссааРд дддрадаРаа сРРасдааса РсддаааааР РсадРдаРРа срдсррррда сРаадаааас РссРРРаРда саасддсРдд ададдасаад дррсаасрср рддрдардда дрдадаардд ааРРРсааас ддаардсрда сддРРдсРса асдасРРРда асадссаадР РдРддаРддс ддасдааддр аааарардда

РсасРсасРд даСддадасР даРРддРдда Рдадддасдд сдаааддада РддаддассР сааадаадаа РсРдасРсас адсРсРРдРР сссРаддадд аРРддРсада асдаааааса РдсРдсасаа дррсдаадар саадРссРдс аадддаддда драсадссба аРдссаРРс! дсРсссаада дасРаРддаа адРдасаРса дарддадаас аррддасдар РРдаРссааа ааРаааРасс аРаРасадда аРааддсдаа аРдаРдаРсР сдсассддаа РсРддадссд аРдаРсааас адааРРдсРР ааадсааРда сРсасРРРРс сРдссРдссР РасРсРсРад абсадассаа дссдсаРРРд дддаадсРРР РсаадРасас аааРсаРддс дссадааРдс рсРасаРсса асадсРРаас РРдаадааса дадРааасдд РсРддсдсса ддсаРРссаа РддаРсссад саддРдсРдс дРдддаРсаа ардааадаар РддаРсаадР РадсасддРс дрдрдрардд РсддааРада аРдадааРсс аадаРсРаад ссасРададд РРдаасРдад дРсРсааддс сасРдаааРс аардрдсасс ааРададада рсссадРдсд ааадРддаРд адсРааРааР РРРдааРдаР даРдРдсРсР адРсааадда рдаРсддаас дРдсаасаРР дададададс РдсасРсаРа ассРдссдРа сссРРРсада адсасасаад адРаРРаадс адРРсаааРР аадсаддрас

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080

1140

1200

- 31 012965

ЕдддссаЕаа аЕсадсаЕас аЕддсадсаЕ аддаЕдаЕдд сЕсЕсддасд ЕсЕЕаЕЕЕсЕ сЕасЕ ддассадаад аассЕасдЕЕ ЕсааЕдддаа ааадЕдсаад ааааддсадс Есддадасаа

Еддаддааас сЕсадЕасад Еасададддд ассадаадаЕ дадсссдаЕс Едсададдад ассааЕсаас адаааЕсЕсс адаасаЕсЕд дЕдЕсЕЕЕсс дЕдссЕЕссЕ ЕасдасааЕЕ ададддсаЕс сЕЕЕЕдасад асаЕдаддас аддддсдддд ЕЕдасаЕдад ааадаааааЬ

Едсдддссаа аасаассаЕЕ сдаааЕсаЕа адЕсЕЕсдад ЕааЕдаадда асссЕЕдЕЕЕ

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1565 <210> 5 <211> 1027 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 5 адсаааадса сЕсЕаЕсаЕс Едсадддаад дЕсассЕсЕд аддасЕдсад саЕддасааа сааадаааЕс саасаддаЕд асадаЕЕдсЕ ааЕсадасаЕ ддсЕддаЕсд ддЕдсаадсд Е сЕЕсЕЕдаа дЕдаЕссЕсЕ ЕЕдаЕсдЕсЕ сЕЕсЕасдда ддЕадаЕаЕЕ ссдЕсаддсс аасассдаЕс асЕаадддда сдЕадасдсЕ дсадЕЕааас ЕсасСсадЕС ддддсЕдЕда дасЕсссадс дадаасадаа адЕдадсаад аЕдадаасса ааЕЕЕдсадд сасЕаЕЕдсс ЕЕЕЕЕЕсааа аддадЕдсса дааадаЕдад сссЕсааадс ЕЕдаддЕЕсЕ ЕЕЕЕаддаЕЕ ЕЕдЕссаааа ЕдЕаЕаддаа аЕЕсЕдсЕдд ссасЕдаадЕ аЕсддЕсЕса ЕддЕЕЕЕадс садсададдс ЕЕдддасЕса ссЕаЕсадаа дсаааЕаЕса ЕдсаЕЕЕасс аадЕсЕаЕда

ЕсЕЕсЕаасс сдадаЕсдса саЕддааЕдд ЕдЕдЕЕсасд ЕдсссЕЬааЕ дсЕсаададд ЕдсасЕЕдсс ддсаЕЕЕддс ЕаддсаааЕд садсасЕаса саЕддаддЕЕ ЕссЕадсЕсс асдааЕдддд ЕЕдддаЕсЕЕ дксдсШаа дддаадааЕа даддЕсдааа сададасЕЕд сЬааадасаа сЕсассдЕдс дддаасдддд дадаЕаасаЕ адЕЕдЕаЕдд сЕддЕаЕдЕд дЕдасаасаа дсЕааддсЕа дсЕадЕсадд адЕдсЕддЕс дЕдсадаЕдс дсасЕЕдаса аЕасддасЕд Есдаааддаа сдЕасдЕасЕ аадаЕдЕсЕЕ дассааЕссЕ ссадЕдадсд аЕссаааЕаа ЕссаЕддддс дссЕсаЕаЕа саассЕдЕда ссааЕссасЕ ЕддадсаааЕ сЕадасаааЕ ЕдаааааЕда аасддЕЕсаа ЕЕдЕддаЕЕс аааддадддс садсададЕд сЕдЕддаЕдс ЕдасдаЕддЕ саЕЕЕЕдЕса дсаЕададсЕ ддадЕааааа асЕассЕЕдЕ

ЕЕсЕасЕ

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

10ГГ <210 6 <211> 890 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 6 адсаааадса дддЕдасааа аасаЕааЕдд аЕссааасас ЕдЕдЕсаадс ЕЕЕсаддЕад60 аЕЕдсЕЕЕсЕ ЕЕддсаЕдЕс сдсааасдад ЕЕдсадасса адаасЕаддс даЕдссссаЕ120

ЕссЕЕдаЕсд дсЕЕсдссда даЕсадаааЕ сссЕаададд ааддддсадЕ асЕсЕсддЕс180

ЕддасаЕсаа дасадссаса сдЕдсЕддаа адсадаЕадЕ ддадсддаЕЕ сЕдааадаад240 ааЕссдаЕда ддсасЕЕааа аЕдассаЕдд ссЕсЕдЕасс ЕдсдЕсдсдЕ ЕассЕаасЕд300 асаЕдасЕсЕ ЕдаддаааЕд ЕсаадддасЕ ддЕссаЕдсЕ саЕасссаад садааадЕдд360 саддсссЕсЕ ЕЕдЕаЕсада аЕддассадд сдаЕсаЕдда ЕаадаасаЕс аЕасЕдааад420 сдаасЕЕсад ЕдЕдаЕЕЕЕЕ дассддсЕдд адасЕсЕааЕ аЕЕдсЕаадд дсЕЕЕсассд480 аададддадс ааЕЕдЕЕддс даааЕЕЕсас СаЕЕдосЕЕс ЕсЕЕссадда саЕасЕдсЕд540 аддаЕдЕсаа аааЕдсадЕЕ ддадЕссЕса ЕсддаддасЕ ЕдааЕддааЕ даЕаасасад600

ЕЕсдадЕсЕс ЕдааасЕсЕа сададаЕЕсд сЕЕддадаад садЕааЕдад ааЕдддадас660 сЕссасЕсас Ессаааасад ааасдадааа Еддсдддаас ааЕЕаддЕса даадЕЕЕдаа720 даааЕаадаЕ ддЕЕдаЕЕда адаадЕдада сасааасЕда адаЕаасада дааЕадЕЕЕЕ780 дадсаааЕаа саЕЕЕаЕдса адссЕЕасаЕ сЕаЕЕдсЕЕд аадЕддадса ададаЕаада840 асЕЕЕсЕсдЕ ЕЕсадсЕЕаЕ ЕЕадЕасЕаа аааасасссЕ ЕдЕЕЕсЕасЕ890 <210> 7 <211> 1775 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 7

- 32 012965 адсаааадса ддддааааЕа аааасаасса аааУдааддс ааассЕасУд дУссЕдЕУаУ60 дЕдсасЕЕдс адсЕдсадаЕ дсадасасаа ЕаУдЕаГадд сЕассаЕдсд аасааЕЕсаа120 ссдасасЕдЕ ЕдасасадЕа сЕсдадаада аЕдУдасадУ дасасасЕсЕ дЕЕаассЕдс180

Есдаадасад ссасаасдда ааасЕаЕдЕа даЕЕаааадд ааЕадсссса сЕасааУЕдд240 ддаааЕдЕаа саЕсдссдда УддсЕсЕЕдд дааасссада аЕдсдассса сЕдсЕЕссад300

ЕдадаЕсаУд дЕсаУасаУУ дЕадааасас сааасЕсЕда дааЕддааЕа ЕдУУаЕссад360 дадаУУУсаУ сдасУаСдад дадсУдаддд адсааЕЕдад сУсадУдУса УсаУУсдааа420 даУУсдаааУ аУУЬсссааа дааадсУсаУ ддсссаасса саасасааас ддадУаасдд480 садсаУдсУс ссаЕдадддд аааадсадУУ УЕУасадааа УУУдсУаУдд сУдасддада540 аддадддсУс аУасссааад сЕдаааааУУ сУУаУдУдаа сааааааддд ааадаадЕсс600

УУдУасУдУд дддУаУУсаУ сасссдссУа асадЕаадда асаасадааУ сУсУаУсада660 аУдааааУдс УУаУдУсУсУ дУадУдасУУ саааУУаУаа саддадаУУУ ассссддааа720

Уадсадааад асссааадУа ададаЕсаад сУдддаддаУ даасЕаУУас УддассУУдс780

Уаааасссдд адасасааУа аУаУУУдадд саааУддааа УсЕааУадса ссааУдЕаУд840 сУЕЕсдсасЕ дадУададдс ЕУУдддУссд дсаУсаУсас сУсааасдса ЕсааЕдсаЕд900 адУдУаасас даадУдУсаа асассссУдд дадсУаУааа садсадУсЕс ссУУассада960 аУаУасассс адЕсасааУа ддададЕдсс сааааЕасдЕ саддадУдсс аааУУдадда1020

УддУУасадд асУааддаас аЕУссдУсса УУсааУссад аддЕсЕаУЕЕ ддадссаЕЕд1080 ссддЕУУУаЕ Удааддддда УддасУддаа УдаУадаУдд аЕддУаУддУ УаЕсаУсаУс1140 адааУдааса дддаУсаддс УаУдсадсдд аУсаааааад сасасааааУ дссаУУаасд1200 ддаУУасааа сааддУдаас асУдУУаУсд адааааУдаа саУУсааУУс асадсУдУдд1260 дУааадааУУ саасаааУУа даааааадда УддааааУУУ аааУаааааа дУУдаУдаУд1320 даУУУсЕдда саУУУддаса УаУааУдсад ааУУдСУадУ УсУасУддаа ааУдааадда1380 сУсУддаУУУ ссаУдасУса ааУдУдаада аУсУдУаУда дааадУаааа адссааУУаа1440 адааУааУдс сааадаааУс ддаааУддаУ дУУУУдадЕУ сУассасаад УдУдасааУд1500 ааУдсаУдда аадУдУаада ааУдддасУУ аУдаУУаУсс саааУаУУса даададУсаа1560 адЕУдаасад ддааааддУа даУддадУда ааУУддааУс ааУддддаУс ЕаУсадаЬУс1620

УддсдаУсЕа сЕсаасЕдЕс дссадЕЕсас УддЕдсЕЕЕЕ ддЕсЕсссЕд ддддсааЕса1680 дУУЕсУддаЕ дЕдУЕсЕааУ ддаЕсЕУУдс адЕдсадааЕ аУдсаЕсЕда даУУадааУУ1740

ЕсададаУаЕ даддааааас асссЕЕдУЕЕ сЕасЕ1775 <210> 8 <211> 1413 <212> ДНК <213> Вирус гриппа <400> 8 адсаааадса ддддУЕЕааа аЕдааЕссаа аУсадааааЕ ааЕаассаУЕ ддаЕсааЕсУ60 дУсЕддУадУ сддасУааЕУ адссЕааУаУ ЕдсаааЕадд дааЕаУааЕс УсааУаУдда120

УЕадссаЕУс ааЕЕсааасУ ддаадУсааа ассаЕасЕдд ааЕаУдсаас саааасаЕса180

ЕУассЕаУаа аааЕадсасс ЕдддЕааадд асасаасЕУс адЕдаУаУЕа ассддсааЕУ240 саЕсЕсЕЕЕд ЕсссаЕссдЕ дддЕдддсЕа ЕаЕасадсаа адасааЕадс аЕаадааЕЕд300 дЕЕссааадд адасдЕЕЕЕЕ дЕсаЕаадад адсссЕЕЕаЕ ЕЕсаЕдЕЕсЕ сасЕЕддааЕ360 дсаддассЕЕ ЕЕЕЕсЕдасс сааддЕдссЕ ЕасЕдааЕда саадсаЕЕса адЕдддасЕд420

ЕУааддасад аадсссЕЕаГ адддссЕЕаа ЕдадсУдссс ЕдУсддУдаа дсУссдЕссс480 сдЕасааУУс аадаЕУУдаа УсддЕУдсУУ ддЕсадсаад УдсаЕдЕсаУ даУддсаЕдд540 дсЕддсЕаас ааУсддааЕЕ ЕсаддЕссад аЕааЕддадс адЕддсУдУа УУааааУаса600 асддсаУааЕ аасЕдааасс аЕааааадУУ ддаддаадаа ааУаЕУдадд асасаададУ660 сУдааУдЕдс сЕдУдУаааЕ ддЕЕсаУдУЕ ЕЕасЕаЕааЕ дасЕдаУддс ссдадЕдаЕд720 ддсЕддссУс дЕасааааУЕ ЕЕсаадаЕсд ааааддддаа ддЕЕасЕааа ЕсааЕададУ780

ЕдааЕдсасс ЕааЕЕсЕсас ЕаЕдаддааУ дУЕссЕдУЕа сссЕдаУасс ддсааадЕда840

ЕдЕдЕдУдУд сададасааЕ ЕддсаУддЕЕ сдаассддсс аЕдддУдУсЕ ЕЕсдаЕсааа900 ассЕддаУЕа ЕсаааЕадда ЕасаЕсЕдса дУддддЕЕЕЕ сддЕдасаас ссдсдЕсссд960 аадаЕддаас аддсадсЕдЕ ддЕссадУдЕ аУдЕЕдаУдд адсааасдда дЕааадддаУ1020

ЕУЕсаЕаЕад дЕаУддЕааУ ддУдЕЕЕдда Еаддааддас саааадЕсас адЕЕссадас1080 аЕдддУЕЕда даЕдаУЕЕдд даЕссЕааУд даЕддасада дасЕдаУадУ аадУЕсЕсЕд1140

Едаддсаада ЕдЕУдУддса аЕдасЕдаУЕ ддЕсадддЕа ЕадсддаадЕ ЕЕсдЕЕсаас1200 аУссЕдадсЕ дасадддсЕа дасЕдЕаЕда ддссдУдсЕЕ сЕдддЕЕдаа ЕЕааЕсаддд1260 дасдассЕаа адааааааса аЕсЕддасЕа дЕдсдадсад саЕЕЕсЕЕЕЕ ЕдЕддсдЕда1320 аЕадЕдаУас ЕдЕадаЕУдд ЕсЕЕддссад асддУдсУда дУЕдссаУЕс адсаЕЕдаса1380 адУадЕсЕдЕ ЕсаааааасЕ ссЕЕдЕЕЕсЕ асЕ1413

- 33 012965 <210> 9 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 9 сасасасддЕ сбссдддадс дааадсаддс а 31 <210> 10 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 10 дддРЕЬдРа^ Мзд^дЬдЬса сс 22 <210> 11 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 11 ссаддасасЕ ςθΒΒΡίΡσϋΈ бсас 24 <210> 12 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 12 сасасаддбс ЕссбаЕДадД адааасаадд саЕРЕ 35 <210> 13 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 13 сасасаддЕс Рссдддадсд ааадсаддЕс 30

- 34 012965 <210> 14 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 14 сасасасдРс РссаРсаРас ааРссРсРРд ¹ 30 <210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400 15 сРссРсРдаР ддРддсаРас 20 <210 16 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 16 сасасаддРс РссРаРРадР адааасаадд РсдРРР 36 <210> 17 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Синтетический праймер <400> 17 сасасасдРс Рссдддадсд ааадсаддРа с 31 <210> 18 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер

- 35 012965 <400> 18 сасасасдЕс ЕссЕаЕЕадЕ адааасаадд ЕасЕЕ 35 <210> 19 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический праймер <400> 19 сасасасдЕс Ессдддадса ааадсадддд 30 <210> 20 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 20 сасасасдЕс ЕссЕаЕЕадЕ адааасаадд дЕдЕЕЕЕ 37 <210> 21 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 21 сасасасдЕс Ессдддадса ааадсадддЕ а 31 <210> 22 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 22 сасасасдЕс ЕссЕаЕЕадЕ адааасаадд дЕаЕЕЕЕЕ 38 <210> 23

- 36 012965 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 23 сасасаддЪс -Ьссдддадса ааадсаддад 1: 31 <210> 24 <211> 38 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 24 сасасаддАс РддСаЕНадЬ адааасаадд адЪТЕ'ЬХР 38 <210> 25 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 25 сасасасдЪс 1:ссдддадса ааадсаддЪа д 31 <210> 26 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 26 ' сасасасдрс РссРаССад!: адааасаадд Еад^ТОБХ 38 <210> 27 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер <400> 27

- 37 012965 сасасасдРс Рссдддадса ааадсадддр д 31

<210>	28
<211>	37
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220> <223>	Синтетичес кий	праймер
<400>	28

сасасасдРс РссРаРРадР адааасаадд дРдРРРР 37 <210 29 <211> 33 .

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический вектор <400> 29 дддРРаРРдд адасддРасс дРсРссРссс ссс 33 <210> 30 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический вектор <400 30 ддддддадда дасддРассд РсРссааРаа ссс 33 <210> 31 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический вектор/кДНК вирусного гриппа <220>

<221> необяз_характеристика <222> (1)...(18) <223> η = А,Т,С ог С <400> 31 сдРсРспРаР РадРадаа 18

- 38 012965 <210> 32

<211>	17
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Синтетический вектор/кДНК вирусного	гриппа
<220>
<221>	необяз характеристика
<222>	(1) · . · (17)
<223>	η = А,Т,С ог С
<400>	32
РЕЕЕдсбссс пдадасд		17
<210>	33
<211>	17
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Синтетический вектор/кДНК вирусного	гриппа
<220>
<221>	необяз характеристика
<222>	(1) ... (17)
<223>	η - А,Т,С ог С
<400>	33
сдбсРспддд адсаааа		... 17
<210>	34
<211>	18
<212>	ΓΛΙΆ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Синтетический вектор/кДНК вирусного	гриппа
<220>
<221>	необяз характеристика
<222>	(1)---(18)
<223>	η = А,Т,С ог 0
<400>	34
РРскаскаак апдадасд		18
<210>	35
<211>	11
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

- 39 012965 <220>

<223>	Син т е ти ч е с кий	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<4 С0>	35
ЕаДЬадДада а			11
<210>	36
<211>	10
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<400>	36
дддадсаааа			10
<210>	37
<211>	15
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<4 00>	37
дддДДаДДад Бадаа			15
<210>	38
<211>	13
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<400>	38
ЪБББдсБссс ссс			13
<210>	39
<211>	13
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<400>	39
ддддддадса ааа			13
<210	40
<211>	15
<212>	ДНК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	вектор/кДНК вирусного	гриппа
<400	40
РЪсДасБааЕ аассс			15

Claims (36)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для получения 6+2 реассортантного рекомбинантного вируса гриппа с высоким титром, содержащая множество векторов вирусов гриппа, включающая в себя:

   а) векторы для продуцирования вРНК, включающие вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка № вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка ΝΑ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка Νδ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем кДНК для РВ1, РВ2, ΡΑ, №, М и Νδ содержат последовательности, которые соответствуют последовательностям, кодирующим полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из δΕΟ Ш ΝΟ: 1-6, а кДНК для НА и ΝΑ не содержат последовательности, соответствующие δΕΟ Ш ΝΟ: 7 или 8, и векторы по подпункту а) содержат промотор РНК-полимеразы I и последовательность терминации РНКполимеразы I; и

   б) векторы для продуцирования мРНК, включающие вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РА вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РВ1 вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РВ2 вируса гриппа, или вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок № вируса гриппа.
2. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что векторы по подпункту б) дополнительно включают вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок НА вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок ΝΑ вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок М1 вируса гриппа, вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок М2 вируса гриппа, или вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок Νδ2 вируса гриппа.
3. 3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа А.
4. 4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа В.
5. 5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что промотор РНК-полимеразы I представляет собой человеческий промотор РНК-полимеразы I.
6. 6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что все векторы по подпункту б) содержат промотор РНК-полимеразы II.
7. 7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту а) является отдельной плазмидой.
8. 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту б) является отдельной плазмидой.
9. 9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый из векторов, приведенных в подпункте б), дополнительно содержит последовательность терминации РНК-транскрипции.
10. 10. Композиция по п.1, дополнительно содержащая вектор, включающий промотор, связанный с 5'концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК, соединенной с 3'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.
11. 11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.
12. 12. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.
13. 13. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.
14. 14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой подтип Н5.
15. 15. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что Н5 НА представляет собой мутантный Н5 с авиру

    - 41 012965 лентным сайтом расщепления.
16. 16. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, РА, ΝΡ, М и N8 имеют нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-6 или комплементарным им последовательностям.
17. 17. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, РА, ΝΡ, М и N8 кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом, кодируемым одной из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-6.
18. 18. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, РА, ΝΡ, М и N8 содержат область, кодирующую полипептид, кодируемый одной из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-6.
19. 19. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, РА, ΝΡ, М и Ν8 соответствуют последовательностям 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-6.
20. 20. Способ получения инфекционного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с композицией по п.1 в количестве, эффективном для получения инфекционного вируса гриппа.
21. 21. Способ по п.20, дополнительно включающий выделение вируса.
22. 22. Способ получения переносчика (носителя) для доставки генов, включающий обеспечение контактирования клеток с композицией по п.10 в количестве, эффективном для получения вируса гриппа, который является указанным переносчиком, и выделение вируса.
23. 23. Способ получения 6+2 реассортантного рекомбинантного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NΡ вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК Ν8 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РА вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ1 вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ2 вируса гриппа, и вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим № вируса гриппа, так чтобы получать инфекционный вирус, причем кДНК для РВ1, РВ2, РА, №, М и Ν8 содержат последовательности, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-6, а кДНК для НА и NА не содержат последовательностей, соответствующих 8ЕЦ Ш ΝΟ: 7 или 8, и векторы для продуцирования вРНК содержат промотор РНК-полимеразы Ι и последовательность терминации РНК-полимеразы Ι.
24. 24. Способ по п.23, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим НА вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NА вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим М1 вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим М2 вируса гриппа, и вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим Ν82 вируса гриппа.
25. 25. Способ по п.23 или 24, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с 5'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК или ее фрагментом, соединенной (или соединенным) с З'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.
26. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.
27. 27. Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.

    - 42 012965
28. 28. Способ по п.25. отличающийся тем. что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.
29. 29. Способ по п.23. дополнительно включающий выделение вируса.
30. 30. Способ по п.23. отличающийся тем. что НА представляет собой подтип Н5.
31. 31. Способ по п.23. отличающийся тем. что кДНК для РВ1. РВ2. ΡΑ. ΝΡ. М и Ν8 имеют нуклеотидные последовательности. по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1-6 или комплементарным им последовательностям.
32. 32. Способ по п.23. отличающийся тем. что кДНК для РВ1. РВ2. ΡΑ. ΝΡ. М и Ν8 кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом. кодируемым одной из последовательностей δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1-6.
33. 33. Способ по п.23. отличающийся тем. что кДНК для РВ1. РВ2. ΡΑ. ΝΡ. М и Ν8 имеют кодирующую область для полипептида. кодируемого одной из последовательностей δΕφ Ш ΝΟ: 1-6.
34. 34. Способ по п.23. отличающийся тем. что кДНК для РВ1. РВ2. ΡΑ. ΝΡ. М и Ν8 комплементарны последовательностям δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1-6.
35. 35. Выделенный 6+2 реассортантный рекомбинантный вирус гриппа. полученный способом по п.31. содержащий вирусную геномную РНК для Н5 НА. который выращивают в куриных эмбрионах до титра по меньшей мере 10¹⁰ ΕΌ₅₀Δι.τ
36. 36. Реассортантный вирус гриппа по п.35. отличающийся тем. что Н5 НА представляет собой мутантный Н5.