ES2593082T3 - Virus de la gripe recombinantes a título elevado para vacunas y terapia génica - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una pluralidad de vectores de virus de la gripe, que comprende a) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB1 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB2 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de HA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NP del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de M del virus de la gripe vinculado a una secuencia de transcripción de la terminación, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NS del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, en los que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M y NS poseen una región codificante para un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1-6, y en los que los ADNc para HA y NA no poseen SEQ ID NO: 7 u 8, y en el que el vectores con ADNc de la gripe comprenden un promotor de la ARN polimerasa I y una secuencia de terminación de la ARN polimerasa I; y b) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NP del virus de la gripe.
Description
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DESCRIPCIÓN
Virus de la gripe recombinantes a título elevado para vacunas y terapia génlca Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio a tenor de 35 U.S.C § 119(e) de la fecha de presentación de la solicitud de Estados Unidos n.° de serie 60/473.798, presentada el 28 de mayo de 2003.
Declaración de derechos del Gobierno
La presente Invención se realizó con una subvención del Gobierno de los Estados Unidos de América (subvención AI-47446 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas del Servicio de Sanidad Pública). El Gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invención.
Antecedentes de la Invención
Los virus ARN de sentido negativo se clasifican en siete familias (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae) que Incluyen patógenos humanos comunes, tales como virus respiratorio sincitial, virus de la gripe, virus del sarampión y virus del Ébola, así como virus animales con gran Impacto económico en las industrias avícola y ganadera (por ejemplo, virus de la enfermedad de Newcastle y virus de la peste bovina). Las primeras cuatro familias se caracterizan por genomas no segmentados, mientras que las tres últimas poseen genomas compuestos por seis a ocho, tres, o dos segmentos ARN de sentido negativo, respectivamente. La característica común de los virus ARN de sentido negativo es la polaridad negativa de su genoma de ARN; es decir, el ARN viral (ARNv) es complementario al ARNm y, por lo tanto, no es infeccioso por sí mismo. Con el fin de iniciar la transcripción y la replicaclón viral, el ARNv tiene que transcribirse en un ARNm de sentido positivo o ARNc, respectivamente, mediante el complejo de la pollmerasa viral y la nucleoproteína; para virus de la gripe A, el complejo de la polimerasa viral se compone de tres proteínas polimerasa PB2, PB1, y PA. Durante la replicaclón viral, el ARNc sirve como molde para la síntesis de nuevas moléculas de ARNv. Para todos los virus ARN de cadena negativa, las regiones no codificantes tanto en los extremos terminales 5' como 3' del ARNv y ARNc son críticas para la transcripción y replicaclón del genoma viral. A diferencia de los transcritos de ARNm celular o viral, ARNc y ARNv no se protegen con caperuza en el extremo 5' ni se poliadenilizan en el mismo extremo 3'.
Se han esclarecido bioquímicamente y/o en el contexto de la infección viral las funciones básicas de numerosas proteínas virales. No obstante, los sistemas de genética inversa han aumentado drásticamente nuestro conocimiento de los virus ARN segmentado y no segmentado de cadena negativa con respecto a su replicación y patogenicidad viral, así como el desarrollo de vacunas de virus vivos atenuados. La genética inversa, cuando el término se utiliza en virología molecular, se define como la generación del virus que posee un genoma obtenido a partir de ADNc clonados (para una revisión, véase, Neumann et al., 2002).
Con el fin de iniciar la replicaclón viral de virus ARN de cadena negativa, el(los) ARNv(s) o ARNc(s) ha(n) de coexpresarse con el complejo de la pollmerasa y la nucleoproteína. El virus de la rabia fue el primer virus ARN no segmentado de sentido negativo generado por completo a partir de ADNc clonado: Schnell et al. (1994) generaron virus de la rabia recomblnantes por medio de la cotransfección de una construcción de ADNc codificante del ARNc de longitud completa y construcciones de expresión de proteínas para las proteínas L, P, y N, todo bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7. La infección por virus vacuna recombinante, que proporcionó ARN polimerasa T7, dio lugar a la generación de un virus Infeccioso de la rabia. En este sistema de la polimerasa T7, la transcripción primaria del ARNc de longitud completa bajo el control de la ARN polimerasa T7 resultó en un transcrito de ARNc sin protección con caperuza. No obstante, tres nucleótidos de guanidina, que forman la secuencia de iniciación óptima para la ARN pollmerasa T7, se unieron al extremo 5'. Con el fin de crear un auténtico extremo 3' del transcrito de ARNc que es esencial para un ciclo infeccioso productivo, se utilizó la secuencia de la ribozima de hepatitis delta (RzVHD) para la escisión autocatalítlca exacta en el extremo 3' del transcrito de ARNc.
Desde el informe Inicial de Schnell et al. (1994), los sistemas de genética inversa utilizan técnicas similares dirigidas a la generación de numerosos virus ARN no segmentado de cadena negativa (Conzelmann, 1996; Conzelmann, 1998; Conzelmann et al., 1996; Marriott etal., 1999; Muñoz et al., 2000; Nagai, 1999; Neumann et al., 2002; Roberts et al., 1998; Rose, 1996). Las mejoras del procedimiento de rescate original incluyó la expresión de la ARN polimerasa T7 a partir de estirpes celulares transfectadas de forma estable (Radecke et al., 1996) o a partir de plásmidos de expresión de proteínas (Lawson et al., 1995), o procedimientos de choque térmico para aumentar la eficacia de rescate (Parks et al., 1999). En base al sistema de la polimerasa T7, Bridgen y Elllott (1996) crearon un virus Bunyamwera (familia Bunyaviridae) a partir de ADNc clonados y demostraron la factibilidad de generar artificialmente un virus ARN segmentado de sentido negativo por el sistema de la polimerasa T7.
En 1999, se generó una técnica de genética inversa basada en plásmidos en base a la ARN polimerasa I celular para la generación de un virus de la gripe A segmentado completamente a partir de ADNc clonados (Fodor et al., 1999; Neumann y Kawaoka, 1999). La ARN polimerasa I, una enzima nucleolar, sintetiza el ARN rlbosomal que, al
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igual que el ARN del virus de la gripe, no contiene estructuras de caperuza en 5 'o poliA en 3'. La transcripción de la ARN polimerasa I de una construcción que contiene un ADNc de gripe viral, flanqueado por el promotor de la ARN pollmerasa I y secuencias termlnadoras, se tradujo en una síntesis de ARNv de la gripe (Fodor et al., 1999; Neumann y Kawaoka, 1999; Neumann y Kawaoka, 2001; Pekosz et al., 1999). El sistema era altamente eficaz, produciendo más de 108 partículas Infecciosas de virus por mi de sobrenadante de células transfectadas con plásmido, 48 horas post-transfecclón.
Se necesita un método para preparar ortomlxovirus a título elevado, tal como virus de la gripe A, completamente a partir de ADNc clonados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición que comprende una pluralidad de vectores del virus de la gripe, que comprende
a) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB1 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB2 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de HA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NP del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de M del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NS del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, en los que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M y NS poseen una región codificante para un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1-6, y en los que los ADNc para HA y NA no poseen SEQ ID NO: 7 u 8, y en el que el vectores con ADNc de la gripe comprenden un promotor de la ARN pollmerasa I y una secuencia de terminación de la ARN polimerasa I; y
b) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NP del virus de la gripe. Preferentemente, dicha composición comprende además un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de HA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M2 del virus de la gripe, o un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NS2 del virus de la gripe.
En el presente documento se divulga una molécula de ácido nucleico aislado y/o purificado (pollnucleótldo) codificante de al menos una de las proteínas de un título elevado, por ejemplo, títulos superiores a 109/ml, por ejemplo, superiores a 101°/ml de virus de la gripe, o su porción, o el complemento de la molécula de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico aislado y/o purificado puede codificar HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M, o NS, o una su porción al tener sustancialmente la misma actividad que un polipéptido correspondiente codificado por una de las SEC ID NOs: 1-8. Como se utiliza en el presente documento, "sustanclalmente la misma actividad" Incluye una actividad que es aproximadamente 0,1 %, 1 %, 10 %, 30 %, 50 %, 90 %, por ejemplo, hasta 100 % o más, o un nivel de proteína detectable de aproximadamente 80 %, 90 % o más, la actividad o nivel de proteína, respectivamente, del polipéptido de longitud completa correspondiente.
"Sustituciones conservativas de aminoácidos" se refieren a la intercambiabilidad de residuos con cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas-hidroxilas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos preferentes de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina; fenilalanina-tirosina; lisina-arginina; alanina-valina; glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina.
La molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento puede emplearse para expresar las proteínas de la gripe, para preparar genes quiméricos, por ejemplo, con otros genes virales incluyendo otros genes del virus de la gripe, y/o para preparar un virus recombinante. Por consiguiente, también se divulgan polipéptidos aislados, virus recombinantes, y células huésped en contacto con las moléculas de ácido nucleico o virus recombinantes divulgados
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Por consiguiente, las composiciones de la invención comprenden vectores o plásmidos aislados y purificados, que expresan o codifican proteínas del virus de la gripe, o expresan o codifican ARNv de la gripe, tanto ARNv nativo como recombinante. Los vectores comprenden ADNc de la gripe, que a no ser que se especifique lo contrario, puede ser, por ejemplo, ADN de la gripe A (por ejemplo, cualquier gen de la gripe A que incluye cualquiera de los 15 subtipos HA o 9 NA), B o C (véanse, los capítulos 45 y 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Uppincott-Raven Publ., Filadelfia, PA (1996). A no ser que se especifique lo contrario, el ADNc puede encontrarse en orientación sentido o antisentido con respecto al promotor. Por consiguiente, a no ser que se especifique lo contrario, un vector de la invención puede codificar una proteína del virus de la gripe (sentido) o ARNv (antisentido). A no ser que se especifique lo contrario, cualquier promotor o secuencia de terminación de la transcripción adecuado puede emplearse para expresar una proteína o péptido, por ejemplo, una proteína o un péptido viral, una proteína o péptido de un patógeno no viral, o una proteína o péptido terapéutico. Una composición de la invención puede comprender asimismo un gen o marco de lectura abierto de interés, por ejemplo, un gen extraño codificante de un péptido o proteína ¡nmunogénico útil como una vacuna. Por consiguiente, otra realización de la invención comprende una composición de la invención como se ha descrito previamente comprendiendo además un vector que comprende un promotor vinculado a secuencias de virus de la gripe en 5' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 5' vinculadas a un ADNc de interés vinculado a secuencias del virus de la gripe en 3' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 3' vinculadas a una secuencia de terminación de la transcripción. Preferentemente, el ADNc se encuentra en orientación antisentido. La introducción de dicha composición en una célula huésped tolerante para la replicación del virus de la gripe da lugar a un virus recombinante que comprende ARNv correspondiente a las secuencias del vector. El promotor en dicho vector para la producción de ARNv puede ser un promotor de la ARN polimerasa I, un promotor de la ARN polimerasa II, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor T7, un promotor T3, y el vector comprende opcionalmente una secuencia de terminación de la transcripción, tal como una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa I, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa III o una ribozima. El ADNc de interés, ya sea en un vector para la producción de ARNv o proteína, puede codificar un epítopo ¡nmunogénico, tal como un epítopo útil en una terapia o vacuna contra el cáncer, o un péptido o poli péptido útil en la terapia génica. En la preparación del virus, el vector o plásmido que comprende el gen o el ADNc de interés puede añadirse a vectores o plásmidos para todos los genes virales de la gripe.
Una pluralidad de los vectores de la invención puede vincularse físicamente o cada vector puede estar presente en un plásmido individual u otro, por ejemplo, vehículo de administración de ácido nucleico, lineal.
A menos que se especifique lo contrario, el promotor o la secuencia de terminación de la transcripción en un ARNv o vector de expresión de la proteína del virus puede ser Idéntico o diferente en relación con el promotor o cualquier otro vector. Preferentemente, a menos que se especifique lo contrario, el vector o plásmido que expresa ARNv de la gripe comprende un promotor adecuado para la expresión en al menos una célula huésped particular, por ejemplo, células huésped aviar o de mamífero, tales como células caninas, felinas, equinas, bovinas, ovinas, o de primates incluyendo células humanas, o preferentemente, para la expresión en más de un huésped.
En una realización, a menos que se especifique lo contrario, uno o más vectores para la producción de ARNv comprenden un promotor, incluyendo, entre otros, un promotor de la ARN polimerasa I, por ejemplo, un promotor de la ARN polimerasa I humano, un promotor de la ARN polimerasa II, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor T7, o un promotor T3. A menos que se especifique lo contrario, las secuencias de terminación de la transcripción preferentes para los vectores de ARNv Incluyen, entre otros, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa I, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa III, o una ribozima. A menos que se especifique lo contrario, las ribozimas en el alcance de la Invención Incluyen, entre otros, rlbozlmas tetrahymena, RNasa P, rlbozimas cabeza de martillo, ribozimas en horquilla, ribozima de la hepatitis, así como ribozimas sintéticas.
En una realización, a menos que se especifique lo contrario, un vector para ARNv comprende al menos un promotor de la ARN polimerasa II vinculado a una secuencia de ribozima vinculada a secuencias codificantes virales vinculadas a otras secuencias de ribozima, vinculadas opcionalmente a una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II. En una realización, a menos que se especifique lo contrario, al menos 2 y preferentemente más, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, vectores para la producción de ARNv comprenden un promotor de la ARN polimerasa II, una primera secuencia de ribozima, que se encuentra en el extremo 5' en una secuencia correspondiente a las secuencias virales incluyendo secuencias codificantes virales, que se encuentra en el extremo 5' en una segunda secuencia de ribozima, que se encuentra en el extremo 5' en una secuencia de terminación de la transcripción. A menos que se especifique lo contrario, cada promotor de la ARN polimerasa II en cada vector de ARNv puede ser idéntico o diferente al promotor de la ARN polimerasa II en cualquier otro vector de ARNv. Del mismo modo, a menos que se especifique lo contrario, cada secuencia de ribozima en cada vector de ARNv puede ser idéntica o diferente a las secuencias de ribozima en cualquier otro vector de ARNv. En una realización, a menos que se especifique lo contrario, las secuencias de ribozima en un único vector no son idénticas.
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La invención también proporciona un método para preparar un virus de la gripe. El método comprende poner en contacto una célula con una composición de la Invención, en una cantidad eficaz para producir un virus de la gripe Infeccioso. La invención también incluye el aislamiento de un virus de una célula en contacto con la composición. Por consiguiente, la solicitud divulga además un virus aislado, así como una célula huésped en contacto con la composición o virus de la invención. En otra realización, la invención Incluye un método para preparar un virus de la gripe, que comprende poner en contacto una célula con un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB1 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB2 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de HA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NP del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de M del virus de la gripe vinculado a una secuencia de transcripción de la terminación, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NS del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NP del virus de la gripe, con el fin de producir un virus Infeccioso, en los que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M o NS poseen una región codificante para un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1-6, y en los que los ADNc para HA y NA no poseen SEQ ID NO: 7 u 8, y en los que los vectores con ADNc del virus de la gripe comprenden un promotor de la ARN pollmerasa I y una secuencia de terminación de la ARN pollmerasa I.
El método de la invención permite una fácil manipulación de virus de la gripe, por ejemplo, por la Introducción de mutaciones atenuantes en el genoma viral. Además, dado que los virus de la gripe inducen una fuerte inmunidad humoral y celular, la invención potencia en gran medida estos virus como vectores de vacunas, en particular en vista de la disponibilidad de variantes naturales del virus, que pueden emplearse secuencialmente, permitiendo su uso repetitivo para terapia génica.
Los métodos para producir virus descritos en el presente documento, que no requieren la infección por virus auxiliar, resultan útiles en estudios de mutagénesis viral, y en la producción de vacunas (por ejemplo, para el SIDA, gripe, hepatitis B, hepatitis C, rinovirus, filovirus, malaria, herpes, y enfermedad de pie y boca) y vectores de terapia génica (por ejemplo, para el cáncer, SIDA, adenosina deaminasa, distrofia muscular, deficiencia de ornitina transcarbamilasa y tumores del sistema nervioso central). Por consiguiente, se divulga un virus para su uso en terapia médica (por ejemplo, para una vacuna o terapia génica).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Diagrama esquemático de sistemas establecidos de genética inversa. En el método de transfección de RNP (A), las proteínas NP y pollmerasa purificadas se ensamblan en RNPs con uso de ARNv sintetizado in vitro. Las células se transfectan con RNPs, seguido por la infección por virus auxiliar. En el método de la ARN pollmerasa I (B), un plásmido contiene el promotor de la ARN polimerasa I, un ADNc codifica el ARNv a rescatar, y el termlnador de la ARN pollmerasa I se transfecta en las células. La transcripción intracelular por la ARN pollmerasa I produce un ARNv sintético, que se empaqueta en partículas de virus de la progenie tras la infección por un virus auxiliar. Con ambos métodos, los virus transfectantes (es decir, aquellos que contienen ARN obtenido a partir de ADNc clonado), se seleccionan entre la población del virus auxiliar.
Figura 2. Diagrama esquemático de la generación de construcciones de la ARN pollmerasa I. Los ADNc obtenidos a partir de virus de la gripe se amplificaron mediante PCR, se digirieron con BsmB\ y se clonaron en los sitios BsmB\ del vector pHH21 (E. Hoffmann, tesis doctoral, Justus, Universidad de Liebig, Giessen, Alemania), que contiene el promotor (P) de la ARN pollmerasa I humano y el terminador (T) de la ARN pollmerasa I de ratón. El nucleótldo de tlmldlna aguas arriba de la secuencia terminadora (*T) representa el extremo 3'del ARN de gripe viral. Las secuencias del virus de la gripe A se muestran en negrita. (SEQ ID NO: 29- 40).
Figura 3. Método de genética inversa propuesto para generar virus ARN segmentado de sentido negativo. Los plásmidos que contienen el promotor de la ARN pollmerasa I de un ADNc para cada uno de los ocho segmentos de ARN viral, y el termlnador de la ARN pollmerasa I se transfectan en células junto con los plásmidos de expresión de proteínas. Aunque los virus infecciosos pueden generarse con plásmidos que expresan PA, PB1, PB2 y NP, la expresión de todas las proteínas estructurales restantes (mostradas entre corchetes) aumenta la eficacia de la producción del virus en función del virus generado.
Figura 4. Título de diferentes virus de la gripe.
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Descripción detallada de la invención Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, el término "aislado y/o purificado" se refiere a la preparación in vitro, al aislamiento y/o purificación de un vector, plásmido o virus, de modo que no se asocia con sustancias in vivo, o se purifica sustancialmente a partir de sustancias in vitro. Una preparación de virus aislado se obtiene generalmente mediante el cultivo y la propagación in vitro y está sustancialmente libre de otros agentes infecciosos.
Como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente libre" significa por debajo del nivel de detección de un agente infeccioso particular al utilizar métodos de detección convencionales para ese agente.
Un virus "recombinante" es aquel que se ha manipulado in vitro, por ejemplo, utilizando técnicas de ADN recombinante para introducir cambios en el genoma viral.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ácido nucleico recombinante" o "secuencia o segmento de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, al ADN que se ha obtenido o aislado a partir de una fuente, que puede alterarse posteriormente de forma química in vitro, por lo que su secuencia no está presente de manera natural, o corresponde a secuencias presentes de manera natural que no se posicionan como se colocarían en el genoma nativo. Un ejemplo de ADN "obtenido" a partir de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil y que a continuación se sintetiza químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de dicho ADN "aislado" de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se escinde o elimina de dicha fuente por medios químicos, por ejemplo, por medio del uso de endonucleasas de restricción, de modo que puede manipularse adicionalmente, por ejemplo, amplificarse, para su uso en la invención, por la metodología desarrollada por ingeniería genética.
Reolicación del virus de la gripe
Los virus de la gripe A poseen un genoma de ocho ARN monocatenarios de sentido negativo virales (ARNvs) que codifican un total de diez proteínas. El ciclo de vida del virus de la gripe comienza con la unión de la hemaglutinina (HA) a receptores que contienen ácido siálico en la superficie de la célula huésped, seguido de la endocitosis mediada por el receptor. El bajo pH en los endosomas tardíos desencadena un cambio conformacional en la HA, exponiendo de este modo el N-terminal de la subunidad HA2 (el denominado péptido de fusión). El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana viral y endosomal, y la proteína de matriz (M1) y los complejos RNP se liberan en el citoplasma. RNPs consisten en la nucleoproteína (NP), que encapsida ARNv, y el complejo de la polimerasa viral, que se forma por las proteínas PA, PB1, y PB2. RNPs se transportan en el núcleo, en el que tiene lugar la transcripción y la replicación. El complejo de la ARN polimerasa cataliza tres reacciones diferentes: la síntesis de un ARNm con la estructura de la caperuza en 5' y poliA en 3' de un ARN complementario de longitud completa (ARNc), y de ARNv genómico utilizando el ADNc como molde. Los ARNv sintetizados recientemente, NP y las proteínas de la polimerasa se ensamblan en RNPs, se exportan desde el núcleo, y se transportan a la membrana plasmática, en la que se produce la gemación de partículas del virus de la progenie. La proteína de la neuraminidasa (NA) desempeña un papel crucial en la infección mediante la eliminación de ácido siálico de sialiloligosacáridos, liberando en consecuencia los viriones recién ensamblados de la superficie celular y previniendo la autoagregación de partículas de virus. Aunque el ensamblaje del virus implica las interacciones proteína-proteína y proteína-ARNv, la naturaleza de estas interacciones es en gran parte desconocida.
Aunque los virus de la gripe B y C son estructural y funcionalmente similares al virus de la gripe A, existen algunas diferencias. Por ejemplo, el virus de la gripe B no posee una proteína M2 con actividad del canal iónico. Del mismo modo, el virus de la gripe virus C no posee una proteína M2 con actividad del canal iónico. No obstante, es probable que la proteína CM1 posea esta actividad. La actividad de una proteína del canal iónico puede medirse por métodos adecuadamente conocidos en la materia, véanse, por ejemplo, Holsinger etal. (1994) y el documento WO 01/79273.
Estirpes celulares v virus de la gripe que pueden utilizarse en la presente invención
Según la presente invención, cualquier célula que soporta la replicación eficaz del virus de la gripe puede emplearse en la invención, incluyendo las células mutantes que expresan niveles reducidos o disminuidos de uno o más ácidos siálicos que son receptores del virus de la gripe. Los virus obtenidos por medio de los métodos pueden realizarse en un virus de genoma reordenado.
Preferentemente, las células son estirpes celulares certificadas, o certificables continuas WHO. Los requisitos para la certificación de dichas estirpes celulares incluyen la caracterización con respecto al menos una de genealogía, características de crecimiento, marcadores inmunológicos, tumorigenicidad, susceptibilidad del virus y condiciones de almacenamiento, así como ensayos en animales, huevos, y cultivo celular. Dicha caracterización se utiliza para confirmar que las células están libres de agentes adventicios detectables. En algunos países, puede requerirse cariologia. Además, la tumorigenicidad se ensaya preferentemente en células que se encuentran en el mismo nivel de pase que las utilizadas para la producción de vacunas. El virus se purifica preferentemente mediante un proceso
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que se ha demostrado que proporciona resultados consistentes, antes de inactivarse o atenuarse para la producción de vacunas (véase, por ejemplo, la Organización Mundial de la Salud, 1982).
Resulta preferente establecer una caracterización completa de las estirpes celulares que se utilizarán, por lo que pueden incluirse los ensayos de pureza apropiados del producto final. Los datos que pueden utilizarse para la caracterización de una célula que se va a utilizar en la presente invención incluyen (a) información sobre su origen, derivación, y antecedentes del pase; (b) información sobre su crecimiento y características morfológicas; (c) resultados de los ensayos de los agentes adventicios; (d) características distintivas, tales como patrones bioquímicos, inmunológicos, y citogenéticos que permiten que las células se reconozcan con claridad entre otras estirpes celulares; y (e) resultados de los ensayos de tumorigenicidad. Preferentemente, el nivel de pase, o duplicación de la población de la célula huésped utilizada es lo más reducido posible.
Resulta preferente que el virus producido en la célula esté muy purificado antes de la vacuna o la formulación de la terapia génica. En general, los procedimientos de purificación darán lugar a la extensa eliminación del ADN celular, otros componentes celulares, y agentes adventicios. Se pueden utilizar igualmente procedimientos que degradan o desnaturalizan ampliamente el ADN. Véase, por ejemplo, Mizrahi, 1990.
Vacunas
Una vacuna puede comprender proteínas inmunogénicas incluyendo glicoproteínas de cualquier patógeno, por ejemplo, una proteína ¡nmunogénlca de una o más bacterias, virus, levaduras u hongos.
Una vacuna completa de virión se concentra por ultrafiltración y después se purifica por centrifugación zonal o por cromatografía. Se inactiva antes o después de la purificación utilizando por ejemplo formalina o beta-propiolactona.
Una vacuna de subunidades comprende glicoproteínas purificadas. Dicha vacuna puede prepararse de la siguiente manera: utilizando suspensiones virales fragmentadas por medio del tratamiento con detergente, se purifican los antígenos de superficie, por ejemplo por medio de ultracentrifugación. Por consiguiente, las vacunas de subunidades contienen principalmente proteínas HA, y también NA. El detergente utilizado puede ser detergente catiónico, por ejemplo, tal como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Bachmeyer, 1975), un detergente aniónico, tal como desoxicolato de amonio (Laver & Webster, 1976); o un detergente no iónico, tal como el comercializado con el nombre TRITON X100. La hemaglutinina también puede aislarse después del tratamiento de los viriones con una proteasa, tal como bromelina; purificada luego por un método, tal como el descrito por Gran y Skehel (1972).
Una vacuna fraccionada comprende viriones que se han sometido al tratamiento con agentes que disuelven lípidos. Una vacuna fraccionada puede prepararse de la siguiente manera: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como se ha descrito previamente, inactivado o no, se trata, con agitación, mediante disolventes lipidíeos, tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de la envoltura viral conduce a una fragmentación de las partículas virales. La fase acuosa se recupera conteniendo la vacuna fraccionada, constituida principalmente de hemaglutinina y neuraminidasa con su entorno lipídico original eliminado, y el núcleo o sus productos de degradación. A continuación, las partículas infecciosas residuales se inactivan si es que esto aún no se ha realizado.
Vacunas inactivadas. Las vacunas del virus de la gripe inactivadas de la invención se proporcionan mediante la inactivación del virus replicado de la invención utilizando métodos conocidos, tales como, entre otros, tratamiento con formalina o p-propiolactona. Los tipos de vacunas inactivadas que pueden utilizarse en la invención pueden incluir vacunas virales completas (VC) o vacunas de subviriones (VS) (fragmentación). La vacuna VC contiene un virus intacto, inactivado, mientras que la vacuna VS contiene un virus purificado interrumpido con detergentes que solubilizan la envoltura viral que contiene lípidos, seguido de la inactivación química del virus residual.
Además, las vacunas que pueden utilizarse incluyen aquellas que contienen las proteínas de superficie HA y NA aisladas, referidas como vacunas de antígeno de superficie o de subunidades. En general, son similares las respuestas a las vacunas VS y de antígeno superficie (es decir, HA o NA purificada). Una vacuna VC inactivada experimental que contiene un antígeno de NA inmunológicamente relacionado con el virus epidémico y una HA no relacionada parecen ser menos eficaces que las vacunas convencionales (Ogra et al., 1977). Resultan preferentes las vacunas inactivadas que contienen antígenos de superficie relevantes.
Vacunas de virus vivos atenuados. Las vacunas del virus de la gripe vivo atenuado pueden utilizarse asimismo para prevenir o tratar la infección por el virus de la gripe, según etapas de métodos conocidos. La atenuación se consigue preferentemente en una única etapa mediante la transferencia de genes atenuados de un virus donante atenuado a un virus aislado o de genoma reordenado replicado según métodos conocidos (véase, por ejemplo, Murphy, 1993). Dado que la resistencia al virus de la gripe A se media por el desarrollo de una respuesta inmunitaria a las glicoproteínas HA y NA, los genes codificantes de estos antígenos de superficie han de provenir de virus de genoma reordenado o aislados clínicos de alto crecimiento. Los genes atenuados se obtienen a partir del progenitor atenuado. En este enfoque, los genes que confieren atenuación no codifican preferentemente las glicoproteínas HA y NA. De lo contrario, estos genes no podrían transferirse a genomas reordenados que llevan los antígenos de
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superficie del aislado del virus clínico.
Muchos virus donantes se han evaluado por su capacidad para atenuar de forma reproducible virus de la gripe. Como ejemplo no limitante, el virus donante adaptado al frío (af) A/Ann Arbor(AA)/6/60 (H2N2) puede utilizarse para la producción de vacunas atenuadas (véanse, por ejemplo, Edwards, 1994; Murphy, 1993). Adicionalmente, las vacunas de virus vivo atenuado de genoma reordenado, pueden generarse apareando el virus donante af con un virus replicado virulento. La progenie de genoma reordenado se selecciona entonces a 25 °C, (restrictiva para la replicación del virus virulento), en presencia de un antisuero H2N2, que inhibe la replicación de los virus que llevan los antígenos de superficie del virus donante af atenuado A/AA/6/60 (H2N2).
Una gran serie de genomas reordenados H1N1 y H3N2 se han evaluado en seres humanos y se descubrió que eran satisfactoriamente: (a) infecciosos, (b) atenuados para niños seronegativos y adultos inmunológicamente estimulados, (c) y estables inmunogénica y (d) genéticamente. La inmunogenicidad de los genomas reordenados af iguala su nivel de replicación. Por consiguiente, la adquisición de los seis genes transferibles del virus donante af por nuevos virus naturales ha atenuado de forma reproducible estos virus para su uso en la vacunación de adultos y niños susceptibles.
Otras mutaciones atenuantes pueden introducirse en los genes del virus de la gripe mediante mutagénesis dirigida al sitio para rescatar virus infecciosos que llevan estos genes mutantes. Las mutaciones atenuantes pueden introducirse en regiones no codificantes del genoma, así como en regiones codificantes. Dichas mutaciones atenuantes también pueden introducirse en genes distintos a HA o NA, por ejemplo, el gen de la polimerasa PB2 (Subbarao et al., 1993). Por consiguiente, los nuevos virus donantes también pueden generarse llevando mutaciones atenuantes introducidas por mutagénesis dirigida al sitio, y dichos nuevos virus donantes pueden utilizarse en la reducción de los candidatos de vacuna vivos atenuados de genoma reordenado H1N1 y H3N2 de manera análoga a la descrita previamente para el virus del donante af A/AA/ 6/60. Del mismo modo, otras cepas donantes atenuadas conocidas y adecuadas pueden presentar un genoma reordenado con un virus de la gripe de la invención para obtener vacunas atenuadas adecuadas para su uso en la vacunación de mamíferos (Enami et al., 1990; Muster etal., 1991; Subbarao et al., 1993).
Resulta preferente que dichos virus atenuados mantengan los genes de los virus que codifican determinantes antigénicos sustancialmente similares a los de los aislados clínicos originales. Esto se debe a que el fin de la vacuna atenuada es proporcionar sustancialmente la misma antigenicidad que el aislado clínico original del virus, mientras que al mismo tiempo carece de infectividad en la medida en que la vacuna provoca un cambio mínimo de inducción de una condición patógena grave en el mamífero vacunado.
En consecuencia, el virus puede atenuarse o inactivarse, formularse y administrarse, según métodos conocidos, como una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en un animal, por ejemplo, un mamífero. Los métodos se conocen adecuadamente en la materia para determinar si dichas vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido antigenicidad similar a la del aislado clínico o cepa de alto crecimiento obtenido del mismo. Dichos métodos conocidos incluyen el uso de antisueros o anticuerpos para eliminar virus que expresan determinantes antigénicos del virus donante; selección química (por ejemplo, amantadina o rimantidina); actividad e inhibición de HA y NA; y exploración de ADN (tal como hibridación por sonda o PCR) para confirmar que los genes donantes que codifican los determinantes antigénicos (por ejemplo, genes HA o NA) no están presentes en los virus atenuados. Véanse, por ejemplo, Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson etal., 1992.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, adecuadas para la inoculación o para la administración parenteral u oral, que comprenden una composición según la reivindicación 1, comprenden opcionalmente además soluciones, suspensiones, y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Las composiciones pueden comprender además agentes auxiliares o excipientes, conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, Berkow et al., 1987; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992. La composición de la invención se presenta generalmente en forma de dosis individuales (dosis unitarias).
Las vacunas convencionales contienen generalmente de manera aproximada 0,1 a 200 pg, preferentemente 10 a 15 pg de hemaglutinina de cada una de las cepas que se emplean en su composición. La vacuna que forma el constituyente principal de la composición de vacuna de la invención puede comprender un virus de tipo A, B o C, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, al menos dos de los tres tipos, al menos dos de los diferentes subtipos, al menos dos del mismo tipo, al menos dos del mismo subtipo, o un aislado(s) o genoma(s) reordenado(s) diferente(s). El virus de la gripe humana tipo A incluye los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2.
Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y/o emulsiones estériles acuosas o no acuosas, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la materia. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Transportadores o vendajes oclusivos pueden utilizarse para aumentar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción de antígeno. Las formas farmacéuticas líquidas para
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administración oral pueden comprender generalmente una solución de liposomas que contiene la forma farmacéutica líquida. Las formas adecuadas para la suspensión de liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, y elixires que contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la materia, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones también pueden incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, o agentes edulcorantes, aromatizantes, o perfumantes. Véanse, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery’s, 1987; Osol, 1980; y Katzung, 1992.
Cuando una composición de la presente invención se utiliza para la administración a un individuo, puede comprender, además, sales, tampones, adyuvantes, u otras sustancias deseables para mejorar la eficacia de la composición. Se pueden utilizar vacunas, adyuvantes, sustancias que pueden aumentar una respuesta inmunitaria específica. Normalmente, el adyuvante y la composición se mezclan antes de la presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado, pero en el mismo sitio del organismo a inmunizar. Se proporcionan ejemplos de materiales adecuados para su uso en composiciones de vacunas en Osol (1980).
La heterogeneidad en una vacuna puede proporcionarse mediante la mezcla de virus de la gripe replicados al menos en dos cepas del virus de la gripe, tales como 2-50 cepas o cualquier intervalo o valor en el mismo. Resultan preferentes las cepas de virus de la gripe A o B con una composición antigénica actual. Según la presente invención, las vacunas pueden proporcionarse para variaciones en una única cepa de un virus de la gripe, utilizando técnicas conocidas en la materia.
Una composición farmacéutica según la presente invención puede comprender adicionalmente o además al menos un compuesto quimioterapéutico, por ejemplo, para terapia génica, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o potenciadores inmunitarios, y para vacunas, agentes quimioterapéuticos incluyen, entre otros, gammaglobulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol, interferón-a, interferón-p, interferón-y, factor de necrosis tumoral-alfa, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxnucleosidas, un inhibidor de proteasa, o ganciclovir. Véanse, por ejemplo, Katzung (1992), y las referencias citadas en el mismo en las páginas 798-800 y 680-681, respectivamente.
La composición puede contener igualmente cantidades variables aunque pequeñas de formaldehído libre de endotoxinas, y conservantes, que se han comprobado que son seguros y no contribuyen a efectos indeseables en el organismo al que se administra la composición.
Fines farmacéuticos
La administración de la composición (o los antisueros que se obtienen) puede tener un fin "profiláctico" o "terapéutico". Cuando se proporciona profilácticamente, las composiciones de la invención que son vacunas, se proporcionan antes de manifestar cualquier síntoma de una infección patógena. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar cualquier infección posterior. Cuando se proporciona profilácticamente, las composiciones de terapia génica de la invención, se proporcionan antes de manifestar cualquier síntoma de una enfermedad. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar uno o más síntomas asociados con la enfermedad.
Cuando se proporciona terapéuticamente, una vacuna viral atenuada o ¡nactivada se proporciona tras la detección de un síntoma de infección actual. La administración terapéutica del(los) compuesto(s) sirve para atenuar cualquier infección actual. Véanse, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery, 1987; y Katzung, 1992. Cuando se proporciona terapéuticamente, una composición de terapia génica se proporciona tras la detección de un síntoma o indicio de la enfermedad. La administración terapéutica del(los) compuesto(s) sirve para atenuar un síntoma o indicio de esa enfermedad.
Por consiguiente, una composición de vacuna atenuada o ¡nactivada de la presente invención puede proporcionarse así antes de la aparición de la infección (para prevenir o atenuar una infección anticipada) o después del inicio de una infección actual. Del mismo modo, para la terapia génica, la composición puede proporcionarse antes de manifestar cualquier síntoma de un trastorno o enfermedad o después de detectar uno o más síntomas.
Se dice que una composición es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede tolerarse por un paciente receptor. Se dice que dicho agente se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Una composición de la presente invención es fisiológicamente significativa si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor, por ejemplo, mejora al menos una respuesta inmunitaria primaria o secundaria humoral o celular frente al menos una cepa de un virus de la gripe infeccioso.
La "protección" proporcionada no necesita ser absoluta, es decir, la infección de la gripe no tiene por qué prevenirse o erradicarse completamente, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población o conjunto de control de pacientes. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o la rapidez de la aparición de los síntomas de la infección por el virus de la gripe.
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Administración farmacéutica
Una composición de la presente invención puede conferir resistencia a uno o más patógenos, por ejemplo, una o más cepas del virus de la gripe, ya sea por inmunización pasiva o inmunización activa. En la inmunización activa, una composición de vacuna viva atenuada o inactivada se administra profilácticamente a un huésped (por ejemplo, un mamífero), y la respuesta inmunitaria del huésped en cuanto a la administración protege contra la infección y/o enfermedad. Para la inmunización pasiva, los antisueros obtenidos pueden recuperarse y administrarse a un receptor sospechoso de tener una infección causada por al menos una cepa del virus de la gripe. Una composición de terapia génica de la presente invención puede producir niveles profilácticos o terapéuticos del producto génico deseado mediante inmunización activa.
En una realización, la vacuna se proporciona a una hembra de mamífero (en el embarazo o antes del embarazo o parto), en condiciones de tiempo y cantidad suficientes para provocar la producción de una respuesta inmunitaria que sirve para proteger tanto a la hembra como al feto o recién nacido (a través de la incorporación pasiva de los anticuerpos por la placenta o en la leche de la madre).
Se divulgan métodos para prevenir o atenuar un trastorno o enfermedad, por ejemplo, una infección al menos por una cepa de patógeno. Como se utiliza en el presente documento, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si la administración da lugar a la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o condición de la enfermedad, o a la inmunidad total o parcial del individuo hacia la enfermedad. Como se utiliza en el presente documento, se dice que una composición de terapia génica previene o atenúa una enfermedad si su administración da lugar a la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o condición de la enfermedad, o a la inmunidad total o parcial del individuo hacia la enfermedad.
Un régimen típico para prevenir, suprimir, o tratar una patología relacionada con el virus de la gripe, comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición de vacuna como se describe en el presente documento, se administra como tratamiento único, o se repite como dosificaciones para potenciar o de refuerzo, durante un periodo hasta e inclusive entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor en el mismo.
Según la presente invención, una "cantidad eficaz" de una composición es aquella que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que la dosificación eficaz dependerá de la edad, sexo, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación no pretenden limitar la invención y representan intervalos de dosis preferentes. No obstante, la dosificación más preferente se adaptará al sujeto individual, como entiende y determina un experto en la materia. Véanse, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery, 1987; y Katsung, 1992.
La dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (por ejemplo, ser humano) u organismo adulto aviar puede presentar aproximadamente 103-107 unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. La dosis de la vacuna inactivada puede oscilar aproximadamente entre 0,1 y 200, por ejemplo, 50 pg de proteína de hemaglutinina. Sin embargo, la dosis ha de ser una cantidad segura y eficaz como se determina por métodos convencionales, utilizando las vacunas existentes como punto de partida.
La dosificación de HA inmunorreactiva en cada dosis de vacuna de virus replicado puede estandarizarse para contener una cantidad adecuada, por ejemplo, 1-50 pg o cualquier intervalo o valor en el mismo, o la cantidad recomendada por el Servicio de Sanidad Pública de EE. UU. (SSP), que es por lo general de 15 pg por componente para niños mayores de 3 años, y 7,5 pg por componente para niños <3 de años. La cantidad de NA también puede estandarizarse, sin embargo, esta glicoproteína puede ser lábil durante la purificación y el almacenamiento del procesador (Kendal et al., 1980). Cada dosis de 0,5 mi de vacuna contiene de manera preferente aproximadamente 1-50 mil millones de partículas de virus, y preferentemente 10 mil millones de partículas.
La invención se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Materiales v métodos
Células y virus. Las células de riñón embrionarias humanas 293T y las células de riñón caninas Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10 % y en medio modificado de Eagle (MEM) que contenía suero bovino de recién nacido al 5%, respectivamente. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5%. Los virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1) y A/PR/8/34 (H1N1) se propagaron en huevos con 10 días de vida.
Construcción de plásmidos. Para generar construcciones de ARN polimerasa I, los ADNc clonados obtenidos a partir de ARN viral A/WSN/33 o A/PR/8/34 se introdujeron entre las secuencias promotoras y terminadoras de la ARN polimerasa I. En pocas palabras, los ADNc clonados se amplificaron por PCR con cebadores que contienen sitios BsmB\, se digirieron con BsmB\, y se clonaron en los sitios BsmB\ del vector pHH21 que contiene el promotor de la
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ARN polimerasa I humano y el terminador de la ARN pollmerasa I de ratón, separados por sitios SsmBI (Figura 2). Los genes PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M y NS de la cepa A/WSN/33 se amplificaron por PCR al utilizar los siguientes plásmidos: pSCWPB2, pGW-PB1, y pSCWPA (todos obtenidos del Dr. Debi Nayak de la Universidad de California, Los Ángeles), y pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Castrucci ef al., 1992), pGT3WM, y pWNS1, respectivamente. El gen PB1 del virus de la gripe A/PR/8/34 se amplificó utilizando pcDNA774 (PB1) (Pérez ef al., 1998) como molde. Véase, la Figura 6 para las secuencias de los cebadores. Para garantizar que los genes estaban libres de mutaciones no deseadas, los fragmentos obtenidos a partir de PCR eran las secuencias con un autosecuenciador (Applied Biosystem Inc., CA, EE. UU.) según el protocolo recomendado por el fabricante. Los ADNc codificadores de los genes HA, NP, NA, y M1 del virus A/WSN/33 se clonaron como se ha descrito (Huddleston ef al., 1982) y se subclonaron en el vector de expresión eucariota pCAGGS/MCS (controlado por el promotor p-actina de pollo) (Niwa ef al., 1991), dando lugar a pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO-14, pCAGGS- WNA15, y pCAGGS-WSN-M 1-2/1, respectivamente. Los genes M2 y NS2 del virus A/PR/8/34 se amplificaron por PCR y se clonaron en pCAGGS/MCS, produciendo pEP24c y pCA-NS2. Finalmente, pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) y pcDNA787(PA) se utilizaron para expresar las proteínas PB2, PB1, y PA bajo el control del promotor de citomegalovirus (Perez ef al., 1998).
Generación de partículas infecciosas de la gripe. Las células 293T (1 x 106) se transfectaron con un máximo de 17 plásmidos en cantidades diferentes con el uso de Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, se mezclaron el ADN y el reactivo de transfección (2 pl de Trans IT LT-1 por pg de ADN), se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos y se añadieron a las células. Seis horas más tarde, la mezcla del ADN y el reactivo de transfección se sustituyeron por Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) que contiene seroalbúmina bovina al 0,3 % y suero fetal bovino al 0,01 %. En diferentes momentos después de la transfección, se recogieron los virus del sobrenadante y se titularon en células MDCK. Puesto que no se requirió un virus auxiliar por este procedimiento, los virus transfectantes recuperados se analizaron sin purificación en placa.
Determinación del porcentaje de células transfectadas con plásmido que producen virus. Veinticuatro horas después de la transfección, las células 293T se dispersaron con EDTA al 0,02 % en células únicas. La suspensión celular se diluyó 10 veces y se transfirió a monocapas confluentes de células MDCK en placas de 24 pocilios. Los virus se detectaron mediante el ensayo de hemaglutinación.
Ensayo de inmunotinción. Nueve horas después de la infección por el virus de la gripe, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada fosfato (STF) y se fijaron con paraformaldehído al 3,7 % (en STF) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se trataron con Tritón X-100 al 0,1 % y se procesaron como describen Neumann ef al. (1997).
Resultados
Generación de virus infecciosos mediante la expresión estimulada con el plásmido de segmentos de ARN viral, tres subunidades de polimerasa v proteína NP. Aunque la transfección de las células con una mezcla de RNPs extraídas de viriones purificados da lugar a partículas de la gripe infecciosas, es probable que esta estrategia no sea eficaz cuando se utiliza con ocho RNPs diferentes generadas in vitro. Para producir virus de la gripe infecciosos completamente a partir de ADNc, se generaron ocho RNPs virales in vivo. Por consiguiente, se prepararon plásmidos que contienen ADNc para los ARN virales de longitud completa del virus A/WSN/33, flanqueados por el promotor de la ARN polimerasa I humano y el terminador de la ÁRN polimerasa I de ratón. En principio, la transfección de estos ocho plásmidos en células eucariotas debería dar lugar a la síntesis de los ocho ÁRNvs de la gripe. Las proteínas PB2, PB1, PAy NP, generadas por cotransfección de los plásmidos de expresión de proteínas, deben ensamblar entonces los ARNvs en RNPvs funcionales que se replican y transcriben, formando, en última instancia virus de la gripe infecciosos (Figura 3). Se transfectaron 1 x 106 células 293T con plásmidos de expresión de proteínas (1 pg de pcDNA762(PB2), 1 pg de pcDNA774(PB1), 0,1 pg de pcDNA787(PA), 1 pg de pCAGGS- WSN-NPO/14) y 1 pg de cada uno de los siguientes plásmidos de la ARN polimerasa I (pPo1l-WSN-PB2, pPoll- WSN-PB1, pPo1 l-WSN-PA, pPo1 l-WSN-HA, pPo1 l-WSN-NP, pPo1l-WSN-NA, pPo1 l-WSN-M y pPo1 l-WSN-NS). La decisión de utilizar una cantidad reducida de pcDNA787(PA) se basó en observaciones previas (Mena ef al., 1996), y datos en condiciones óptimas para la generación de partículas similares a virus (PSV) (datos no mostrados). Se hallaron veinticuatro horas después de la transfección de células 293T, 7 x 103 ufp de virus por mi en el sobrenadante (Experimento 1, Tabla 1), lo que demuestra por vez primera la capacidad de la genética inversa para producir virus de la gripe A completamente a partir de plásmidos.
Tabla 1. Grupos de plásmidos utilizados para producir virus de la gripe a partir de ADNc clonado*
- Experimento
- Plásmidos de la ARN polimerasa I para:*
- 1 2 3 4 5 6 7 8
- PB1 + + - - - - - -
- PR8 PB1 + + + + + +
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- Experimento
- Plásmidos de la ARN polimerasa I para:f
- 1 2 3 4 5 6 7 8
- PB2 + + + + + + + +
- PA + + + + + + + +
- HA + + + + + + + +
- NP + + + + + + + +
- NA + + + + + + + +
- M + + + + + + + +
- NS + + + + + + + +
- Plásmidos de expresión de proteínas para:
- PB1 + + + + + + +
- PB2 + + + + + + - +
- PA + + + + + + - +
- NP + + + + + + + -
- HA - + - + + + + +
- NA - + - + + + + +
- M1 - + - + + + + +
- M2 - + - + + + + +
- NS2 - + - + + + + +
- Título del virus (ufp/ml)
- 7x 103 7x 103 1 x 103 3x104 0 0 0 0
- *Las células 293T se transfectaron con los plásmidos indicados. Veinticuatro (Experimentos 1 y 2) o cuarenta y ocho horas (Experimentos 3-8) más tarde, se determinó el título del virus en el sobrenadante en células MDCK. f A menos que se especifique lo contrario, los plásmidos se construyeron con ADNcs que representan los ARN del virus A/WSN/33.
Eficacia de la producción de virus de la gripe con la coexpresión de todas las proteínas estructurales virales. Aunque la expresión de las proteínas NP y polimerasa virales es suficiente para la generación estimulada por el plásmido de los virus de la gripe, era posible mejorar la eficacia. En estudios previos, la expresión de todas las proteínas estructurales del virus de la gripe (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2 y NS2) dio lugar a PSVs que contenían un ARNv artificial codificante de un gen Indicador de la cloranfenlcol-acetiltransferasa (Mena et al., 1996). Por consiguiente, la disponibilidad de todo el complemento de proteínas estructurales, en lugar de solo aquel requerido para la replicación y la transcripción del ARN viral, podría mejorar la eficacia de la producción del virus. Con este fin, las células 293T se transfectaron con cantidades óptimas de plásmidos de expresión de proteínas virales (a juzgar por la producción de PSV; datos no publicados): 1 pg de pcDNA762(PB2) y pcDNA774(PB1); 0,1 pg de pcDNA787(PA); 1 pg de pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO/14 y pCAGGS-WNA15; 2 pg de pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0,3 pg de pCA-NS2; y 0,03 pg de pEP24c (para M2) junto con 1 pg de cada uno de los plásmidos de la ARN polimerasa I (Experimento 2, Tabla 1). Un segundo grupo de células se transfectó con el mismo grupo de los plásmidos de la ARN polimerasa I, a excepción del gen PB1, para el que pPo1l-PR/8/34-PB1 se sustituyó en un esfuerzo por generar un virus de genoma reordenado, junto con plásmidos que expresan únicamente PA, PB1, PB2 y NP (Experimento 3, Tabla 1) o aquellos que expresan todas las proteínas estructurales de la gripe (Experimento 4, Tabla 1). Los rendimientos del virus WSN no se diferencian apreciablemente a las 24 horas (Experimentos 1 y 2, Tabla 1) o a las 36 horas (datos no mostrados) post-transfecclón. No obstante, se halló un aumento de más de 10 veces en los rendimientos del virus con PR/8/34-PB1 cuando se proporcionaron todas las proteínas estructurales virales de la gripe (Experimentos 3 y 4, Tabla 1). Los controles negativos, que carecían de uno de los plásmidos para la expresión de las proteínas PA, PB1, PB2, NP, no produjeron virus alguno (Experimentos 5-8, Tabla 1). Por consiguiente, dependiendo del virus generado, la expresión de todas las proteínas estructurales del virus de la gripe A mejoraron apreciablemente la eficacia del método de genética inversa.
A continuación, la cinética de la producción del virus después de la transfección de las células se determinó utilizando el grupo de plásmidos utilizados para generar un virus con el gen A/PR/8/34-PB1. En dos de los tres experimentos, el virus se detectó por primera vez a las 24 horas después de la transfección. El título medido en aquel momento, >103 ufp/ml, había aumentado a > 106 ufp/ml a las 48 horas después de la transfección (Tabla 2).
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Para estimar el porcentaje de células transfectadas con plásmidos que producían virus, las células 293T se trataron con EDTA (0,02 %) a las 24 horas después de la transfección para dispersar las células y a continuación se realizaron estudios de dilución limitantes. En este experimento, ningún virus libre se encontró en el sobrenadante del cultivo en este intervalo de tiempo. Los resultados indicaron que se generó 1 partícula de virus infecciosa de cada 103,3 células.
Tabla 2. Cinética de la producción del virus tras la transfección con plásmidos en células 293T*
- Horas tras la transfección por plásmido
- Títulos del virus en el sobrenadante del cultivo (upf/ml)
- Experimento
- 1
- 2 3
- 6
- 0 SR SR
- 12
- 0 SR 0
- 18
- 0 SR 0
- 24
- 0 2 x 103 6 x 103
- 30
- SR 5 x 104 9 x 104
- 36
- 6 x 102 > 1 x 105 7x 10®
- 42
- SR > 1 x 106 5x 10®
- 48
- 8 x 104 > 1 x 10® 1 x 107
* Las células 293T se transfectaron con ocho plásmidos de la ARN polimerasa I codificantes de genes del virus A/WSN/33 a excepción del gen PB1, que se obtiene a partir del virus A/PR/8/34, y nueve plásmidos de expresión de proteínas como se describe en el texto. En diferentes intervalos de tiempo, se titularon virus en el sobrenadante del cultivo en células MDCK. SR = sin realizar.
Recuperación del virus de la gripe que contiene el epítopo FLAG en la proteína NA. Para verificar que el nuevo sistema de genética inversa permita la Introducción de mutaciones en el genoma de los virus de la gripe A, se generó un virus que contiene un epítopo FLAG (Castruccl et al., 1992) en la proteína NA. Las células 293T se transfectaron con un plásmido de la ARN polimerasa I (pPo1l-WSN-NA/FL79) que contenía un ADNc codificante de tanto la proteína NA como de un epítopo FLAG en la parte Inferior de la cabeza de la proteína, junto con la ARN polimerasa I y los plásmidos de expresión de la proteína requeridos. Para confirmar que el virus recuperado (PR8- WSN-FL79) expresó de hecho la proteína NA-FLAG, se llevaron a cabo ensayos de inmunotlnclón de las células infectadas por virus natural PR8-WSN-FL79 o A/WSN/33. Un anticuerpo monoclonal frente al epítopo FLAG detectó células infectadas por PR8-WSN-FL79, pero no aquellas Infectadas por el virus natural. La recuperación del virus PR8-WSN-FL79 era tan eficaz como la de los virus naturales sin etiquetar (datos no mostrados). Estos resultados indican que el nuevo sistema de genética inversa permite introducir mutaciones en el genoma del virus de la gripe A.
Generación del virus de la gripe Infeccioso que contiene mutaciones en el gen PA. Para producir virus que poseen mutaciones en el gen PA, se Introdujeron dos mutaciones silenciosas creando nuevas secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción (Bsp120l en la posición 846 y Pvull en la posición 1.284 del ARNm). Previamente, no fue posible modificar este gen mediante genética inversa, debido a la falta de un sistema de selección fiable. Se recuperaron los virus transfectantes, PAT846C y PA-A1284. Los virus transfectantes recuperados se clonaron biológicamente mediante dos diluciones limitantes consecutivas. Para verificar que los virus recuperados se transfectaron de hecho con mutaciones en el gen PA, se obtuvo ADNc para el gen PA por PCR con transcriptasa inversa. Los virus PA-T846C y PA-A1284C poseían las mutaciones esperadas en el gen PA, como se demostró por la presencia de los sitios de restricción recién introducidos. PCR de las mismas muestras virales y cebadores sin la etapa de transcripción inversa no pudo producir ningún producto (datos no mostrados), lo que indica que el ADNc de PA se originó de hecho a partir del ARNv en lugar del plásmido utilizado para generar los virus. Estos resultados ¡lustran cómo los virus con genes mutados pueden producirse y recuperarse sin utilizar virus auxiliares.
Discusión
Los sistemas de genética inversa descritos en el presente documento permiten producir de manera eficaz virus de la gripe A completamente a partir de ADNc clonados. Bridgen y Elliott (1996) también utilizaron la genética inversa para generar un virus Bunyamwera (familia Bunyaviridae), pero este contiene solo tres segmentos de ARN de sentido negativo, y la eficacia de su producción fue baja, 1(r ufp/107 células. Aunque los rendimientos de los virus diferían entre los experimentos, se observaron consistentemente > 103 ufp/106 células para el virus de la gripe, que contiene ocho segmentos. Hay varias explicaciones para la alta eficacia del sistema de genética inversa descrito anteriormente. En lugar de producir RNPs in vitro (Luytjes et al., 1989), se generaron RNPs in vivo mediante la
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síntesis intracelular de ARNvs utilizando ARN polimerasa I y a través de la expresión estimulada con plásmidos de las proteínas de la polimerasa viral y NP. Asimismo, el uso de células 293T, que se transfectan fácilmente con plásmidos (Goto et al., 1997), aseguró que una gran población de células recibiese todos los plásmidos necesarios para la producción del virus. Además, el gran número de transcritos producidos por la ARN polimerasa I, que se encuentra entre las enzimas expresadas más abundantemente en células en crecimiento, contribuyó probablemente a la eficacia general del sistema. Estas características se dirigieron a un número proporcionalmente abundante de transcritos de ARNv y cantidades adecuadas de la proteína viral para la encapsidación de ARNv, formación de RNPs en el núcleo, y exportación de estos complejos a la membrana celular, en la que los nuevos virus se ensamblan y se liberan.
Los sistemas de genética Inversa previamente establecidos (Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Luytjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996) requieren la Infección por virus auxiliar y, por lo tanto, los métodos de selección permiten que un pequeño número de transfectantes se recupere de un gran número de virus auxiliares. Dichas estrategias se han empleado para generar virus de la gripe que poseen uno de los siguientes genes obtenidos a partir de ADNc: PB2 (Subbarao et al., 1993), HA (Enami et al., 1991: Horimoto et al., 1994), NP (L¡ et al., 1995), NA (Enami et al., 1990), M (Castrucci et al., 1995; Yasuda et al., 1994) y NS (Enami et al., 1991). La mayoría de los métodos de selección, a excepción de los aplicables a los genes HA y NA, dependen de la temperatura de crecimiento, restricción del espectro de huésped, o sensibilidad a los fármacos, lo que limita la utilidad de la genética inversa para el análisis funcional de los productos génicos. Incluso con los genes HA y NA, para los cuales se disponen sistemas de selección estimulados por anticuerpos fiables, resulta difícil producir virus con defectos de crecimiento prominentes. En cambio, el sistema de genética inversa descrito en el presente documento no requiere virus auxiliares y permite generar transfectantes con mutaciones en cualquier segmento génico o con graves defectos de crecimiento. Al tener la tecnología para introducir cualquier mutación viable en el genoma del virus de la gripe A, los investigadores abordan una serie de cuestiones duraderas, tales como la naturaleza de las secuencias reguladoras en las regiones no traducidas del genoma viral, relaciones estructura-función de las proteínas virales, bases moleculares de la restricción del espectro del huésped y patogenicidad viral.
Aunque se disponen vacunas de la gripe inactivadas, su eficacia es subóptima debido en parte a su limitada capacidad para obtener respuestas de IgA local y linfocitos T cltotóxlcos. Los ensayos clínicos de vacunas de la gripe vivas adaptadas al frío puestas en marcha sugieren ahora que dichas vacunas se atenúan de manera óptima, de modo que no causarán síntomas de la gripe, aunque inducirán aún Inmunidad protectora (revisado en Keitel y Piedra, 1998). No obstante, los resultados preliminares Indican que estas vacunas de virus vivos no serán significativamente más eficaces que la mejor vacuna ¡nactlvada (revisado en Keitel y Piedra, 1998), dejando un margen para mejoras adicionales. Una posibilidad sería la de modificar una vacuna adaptada al frío con el sistema de genética inversa descrito anteriormente. Alternativamente, se podría empezar de cero mediante el uso de la genética inversa para producir una cepa de la gripe A "maestra" con múltiples mutaciones atenuantes en los genes que codifican proteínas Internas. La aplicación más intrigante del sistema de genética inversa descrito en el presente documento puede residir en la rápida producción de vacunas de virus vivos atenuados en los casos sospechosos de pandemias que Implican nuevos subtipos de HA o NA del virus de la gripe.
Este nuevo sistema de genética inversa potenciará probablemente el uso de virus de la gripe como vectores de vacuna. Los virus pueden modificarse por Ingeniería genética para expresar proteínas extrañas o epítopos inmunogénlcos además de las proteínas virales de la gripe. Se podría generar, por ejemplo, virus con proteínas extrañas como noveno segmento (Enami et al., 1991) y utilizarlos como vacunas vivas. No solo los virus de la gripe estimulan fuertes respuestas ¡nmunltarlas mediadas por células y humorales, sino que también ofrecen una amplia matriz de la superficie del virión de las proteínas de NA y HA (por ejemplo, 15 subtipos de HA y 9 de NA y sus variantes epidémicas), lo que permite la Inmunización repetida de la misma población diana.
Los PSV de la gripe que poseen un ARNv artificial que codifica un gen indicador se han producido por la expresión de proteínas estructurales virales y ARNv con el sistema vaccinia-polimerasa T7 (Mena et al., 1996). Utilizando la genética inversa, ahora pueden generarse PSVs que contienen ARNvs que codifican las proteínas requeridas para la transcripción y replicación del ARNv (es decir, PA, PB1, PB2 y NP), así como ARNvs que codifican proteínas de interés. Dichos PSV pueden ser vehículos de administración de genes útiles. Es importante destacar que, su falta de genes codificantes de las proteínas estructurales virales podría asegurar que no se produzcan virus infecciosos después de la terapia génica con PSV. Dado que el genoma del virus de la gripe no se integra en el cromosoma huésped, el sistema de PSV sería adecuado para la terapia génica en situaciones que requieren solamente la transducción a corto plazo de células (por ejemplo, para el tratamiento contra el cáncer). En cambio, con respecto a vectores de adenovirus (Kovesdi et al., 1997), los PSV de la gripe podrían contener tanto variantes de HA como NA, permitiendo el tratamiento repetido de las poblaciones diana.
La familia Orthomyxoviridae comprende virus de la gripe A, B y C, así como Thogotovirus recientemente clasificado. La estrategia para la generación de virus infecciosos de la gripe A completamente a partir de ADNc clonados descritos en el presente documento se aplicaría a cualquier ortomixovirus, y tal vez también a otros virus ARN segmentado de sentido negativo (por ejemplo, Bunyaviridae, Arenaviridae). La capacidad para manipular el genoma viral sin limitaciones técnicas tiene profundas repercusiones en el estudio de los ciclos de vida viral y su regulación, la función de las proteínas virales y los mecanismos moleculares de patogenicidad viral.
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Ejemplo 2
Para desarrollar un sistema de genética Inversa para la gripe A/Puerto Rico/8/34, el ARN viral se extrajo del fluido alantoideo de A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), variante de alto crecimiento Madison (PR8HG), utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) según el protocolo del fabricante. ADNc se sintetizó utilizando MMLV-RTase (Promega) y el cebador Uni 12. Los ADNc se amplificaron por PCR durante la noche utilizando lo siguiente:
Grupos de cebadores
PB1: Ba PB1-1 y PB1-1735R (fragmento frontal), PBL-903y Ba-PB1-2341R (fragmento posterior)
Ba-PB1-1 CACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA (SEQ ID NO: 9)
173PB1-1735R GGGTTTGTATTTGTGTGTCACC (SEQ ID NO: 10)
233PB1-903 CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC (SEQ ID NO: 11) Ba-PB1-2341R CACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATTT (SEQ ID NO: 12)
PB2: Ba PB2-1 y B2 1260R (fragmento frontal), WSN PB2 sec-2 y Ba-PB2-2341R (fragmento posterior)
Ba-PB2-1 CACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC (SEQ ID NO: 13)
B2 1260R CACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG (SEQ ID NO: 14)
WSN PB2 sec-2 CTCCTCTGATGGTGGCATAC (SEQ ID NO: 15) Ba-PB2-2341R CACACAGGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGTCGTTT (SEQ ID NO: 16)
PA:
Bm-PA-1 CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC (SEQ ID NO: 17)
Bm-PA-2233R
CACACACGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGTACTT (SEQ ID NO: 18)
HA:
Bm-HA-1: CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG (SEQ ID NO: 19)
Bm-NS-890R:
CACACACGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGGT GTTTT (SEQ ID NO: 20)
NP:
Bm-NP-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA(SEQ ID NO: 21)
Bm-NP-1565R
CACACACGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGGT ATTTTT (SEQ ID NO: 22)
NA:
Ba-NA-1: CACACAGGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGAGT (SEQ ID NO: 23)
Ba-NA-1413R:
CACACAGGTCTGGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT (SEQ ID NO: 24)
M:
Bm-M-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEQ ID NO: 25)
Bm-M-1027R
CACACACGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGTAGTTTTT (SEQ ID NO: 26)
NS:
Bm-NS-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTG (SEQ ID NO: 27)
Bm-NS-890R
CACACACGT CTCCT ATT AGT AGAAACAAGGGT GTTTT (SEQ ID NO: 28)
ADN polimerasa: ufp ADN pollmerasa nativa (Stratagene).
Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel y se extrajeron del gel de agarosa utilizando un kit de extracción de gel (Qiagen). Los genes extraídos se ligaron en vector romo pT7Blue (Novagen) utilizando un kit de ligamento ver. II Takara (Takara). Tras 5 horas, los genes vinculados se transformaron en JM109 (genes PB2, M, y NS) o DH5alfa (PA, PBL, y NP). Seis colonias de cada gen se cultivaron en TB durante 8 horas. Los plásmidos se extrajeron a partir del cultivo de bacterias, y se secuenciaron cuatro clones por gen.
Los genes PA, NP, M y NS en pT7Blue se escindieron por la enzima Bsm Bl (New England Biolabs). El gen PB1 se escindió por Bsa I (New England Biolabs). Los genes escindidos se vincularon durante la noche con el vector pPollR que contiene el promotor de la ARN pollmerasa I humano y el terminador de la ARN pollmerasa I de ratón
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que se digirieron con Bsm Bl. El fragmento frontal del gen PB2 en pT7Blue se escindió por Bsr Gl (New England Blolabs) y Bam Hl (Roche), y el fragmento posterior se escindió por Bsr Gl (New England Biolabs) y Spe I (Roche). Los fragmentos escindidos se mezclan y se digieren por Bsa I. Tras 6 horas, los genes digeridos se purificaron utilizando un kit de purificación por PCR (Qiagen) y se vincularon durante la noche entre los sitios Bsm Bl del vector pPollR.
Los genes PB1, PA, NP, M, y NS-pPo1IR vinculados se utilizaron para transformar JM109 (genes M y NS) o DH5alfa (genes PB1, PA y NP) durante la noche. Las colonias de bacterias transformadas se cultivaron en LB durante la noche. PB2-pPo1IR vinculado se utilizó para transformar JM109 durante la noche.
Los plásmidos se extrajeron de los cultivos bacterianos y los insertos génicos se confirmaron por digestión enzlmátlca. Las colonias de bacterias transformadas por PB2-Po1IR se cultivaron en LB durante 8 horas. Los plásmidos se extrajeron entonces y el inserto génico se confirmó por digestión enzimática. Todas las construcciones pPoll se secuenciaron para asegurarse de que no contenían mutaciones no deseadas.
Las construcciones pPollR para PR8HG se transfectaron en células de riñón embrionario humano 293T con construcciones AM/SN/33(WSN)-HA y NA, A/Hong Kong/483/97(HK)-HAavir y NA, o A/Kawasaki/01 (Kawasaki)-HA y NA Poli y cuatro construcciones de expresión de proteínas para las proteínas polimerasa y NP de A/WSN/33. Los sobrenadantes de las células 293T transfectadas se diluyeron en serie (sin diluir a 10'7) y se infectaron en las cavidades alantoideas de huevos de pollo embrionados con 9 días de vida. Se recogieron los fluidos alantoideos de los huevos infectados y sus títulos del virus se ensayaron mediante el ensayo de HA (Tabla 3).
Tabla 3
- Virus que poseen genes PR8 junto con los siguientes genes HA y NA
- Título de HA (HAU/ml) de fluido alantoideo de huevos inoculados con sobrenadantes de 293T diluidos en:
- sin diluir
- 10'1 10'2 10'3 10'4 10'5 10'6 10'7
- WSN-HA NA
- <1 <1 200 <1 <1 <1 <1 <1
- HK-HAavir NA
- 100 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1
- Kawasaki-HA NA
- <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1
Las muestras de HA positivas (virus con WSN-HA NA en 10-2 y virus con HK-HAavir NA sin diluir) se diluyeron en serie a partir de 10'2 a 10'8 y se infectaron 100 ul de cada dilución en huevos de pollo embrionados. Los fluidos alantoideos de los huevos infectados se recogieron y sus títulos de virus se ensayaron por el ensayo de HA (Tabla 4). El 50 % de la dosis infecciosa del huevo (DIHso) de A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) preparada a partir de plásmidos era de 101o,33/ml, y el título de HA era 1: 3200.
Se prepararon un virus recombinante con los genes HA y NA de A/Hong Kong/213/2003 (H5N1) y el resto de los genes del virus de la gripe de tipo A procedente de PR8HG. El título del virus recombinante era 10 ■ DIHso/ml, y el título de HA era 1:1600.
Tabla 4
- Virus que poseen genes PR8 junto con los siguientes genes HA y NA
- Título de HA (HAU/mJ) en cada dilución
- 10-2
- 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
- WSN-HANA
- 160 40 40 320 40 640 <1
- HK-HAavir NA
- 400 800 400 400 400 800 <1
Secuencias de genes PR8
AGCGAAAGCA GGTAC7GATC CAAAATGGAA GATTTTGTGC GACAATGCTT
CAATCCGATG ATTGTCGAGC TTGCGGAAAA AACAATGAAA GAGTATGGGG
AGGACCTGAA A ATCGAAAC A AAC AAATTTG CAGC AATATG CACTCACTTG
GAAGTATGCT TCATGTATTC AGATTTTCAC TTCATC AATG AGCAAGGCGA
GTCAATAATC GTAGAACTTG GTGATCCAAA TGC ACTTTTG AAGCACAGAT
TT GAAATAAT CGAGGGAAGA GATCGCACAA TGGCCTGGAC AGTAGTAAAC
AGTATTTGCA ACACTACAGG GGCTGAGAAA CCAAAGTTTC TACCAGATTT
GTATGATTAC AAGGAGAATA GATTCATCGA AATTGGAGTA ACAAGGAGAG
AAGTTCAC AT ATACTATCTG GAAAAGGCC A ATAAAATTAA ATCTGAGAAA
ACACACATCC ACATTTTCTC GTTCACTGGG GAAGAAATGG CCACAAAGGC
AGACTACACT CTCGATGAAG AAAGCAGGGC TAGGATCAAA ACCAGACTAT
TCACCATAAG ACAAGAAATG GCCAGCAGAG GCCTCTGGGA TTCCTTTCGT
C AGTCCG AGA GAGGAGAAGA GACAATTGAA GAAAGGTTTG AAATCACAGG
AACAATGCGC AAGCTTGCCG ACCAAAGTCT CCCGCCGAAC TTCTCCAGCC
TTGAAAATTT TAGAGCCTAT GTGGATGGAT TCGAACCGAA CGGCTACATT
GAGGGCAAGC TGTCTCAAAT GTCCAAAGAA GTAAATGCTA GAATTGAACC
TTTTTTGAAA ACAAC ACCAC GACCACTTAG ACTTCCGAAT GGGCCTCCCT
GTTCTCAGCG GTCCAAATTC CTGCTGATGG ATGCCTTAAA ATTAAGCATT i
GAGGACCGAA GTCATGAAGG AGAGGGAATA CCGCTATATG ATGCAATCAA
ATGCATGAGA ACATTCTTTG GATGGAAGGA ACCCAATGTT GTTAAACCAC
ACGAAAAGGG AATAAATCCA AATTATCTTC TGTCATGGAA GCAAGTACTG
GCAGAACTGC AGGACATTGA GAATGAGGAG AAAATTCCAA
AGACTAAAAA
TATGAAGAAA ACAAGTCAGC TAAAGTGGGC ACTTGGTGAG AACATGGCAC
CAGAAAAGGT AGACTTTGAC GACTGXAAAG ATGTAGGTGA TTTGAAGCAA
TATGATAGTG ATGAACCAGA ATTGAGGTCG CTTGCAAGTT GGATTCAGAA
TGAGTTTAAC AAGGCATGCG AACTGACAGA TTCAAGCTGG ATAGAGCTCG
ATGAGATTGG AGAAGATGTG GCTCCAATTG AACACATTGC AAGCATGAGA
AGGAATTATT TCACATCAGA GGTGTCTCAC TGCAGAGCCA
CAGAATACAT
AATGAAGGGA GTGTACATCA ATACTGCCTT GCTTAATGCA TCTTGTGCAG
CAATGGATGA TTTCCAATTA ATTCCAATGA TAAGCAAGTG TAGAACTAAG
GAGGGAAGGC GAAAGACCAA CTTGTATGGT TTCATCATAA AAGGAAGATC
CCACTTAAGG AATGACACCG ACGTGGTAAA CTTTGTGAGC ATGGAGTTTT
CTCTC ACTGA CCCAAGACTT GAACCAC ATA AATGGG AGAA GTACTGTGTT
CTTGAGATAG GAGATATGCT TATAAGAAGT GCCATAGGCC AGGTTTCAAG
GCCCATGTTC TTGTATGTGA GAACAAATGG AACCTCAAAA ATTAAAATGA
AATGGGGAAT GGAGATGAGG CGTTGCCTCC TCCAGTCACT TCAACAAATT
GAGAGTATG A TTGAAGCTGA GTCCTCTGTC AAAGAGAAAG ACATGACCAA
AGAGTTCTTT GAGAACAAAT C AGAAACATG GCCCATTGGA GAGTCCCCCA
AAGGAGTGGA GGAAAGTTCC ATTGGGAAGG TCTGCAGGAC TTTATTAGCA
AAGTOGGTAT TCAACAGCTT GTATGCATCT CCACAACTAG AAGGATTTTC
AGCTGAATCA AGAAAACTGC TTCTTATCGT TCAGGCTCTT AGGGACAACC
TGGAACCTGG GACCTTTGAT CTTGGGGGGC TATATGAAGC AA1TGAGGAG
TGCCTGATTA ATGATCCCTG GGTTTTGCTT AATGCTTCTT GGTTCAACTC
CTTCCTTACA CATGCATTGA GTTAGTTGTG GCAGTGCTAC TATTTGCTAT
CCATACTGTC CAAAAAAGTA CCTTGTTTCT ACT (SEQIDNOrl)
PB1
AGCGAAAGCA GGCAAACCAT TTGAATGGAT GTCAATCCGA CCTTACTTTT CTTAAAAGTG CCAGCACAAA ATGCTATAAG CACAACTTTC
CCTTATACTG GAGACCCTCC TIACAGCCAT GGGACAGGAA CAGGATACAC
CATGGATACT GTCAACAGGA CACATCAGTA CTCAGAAAAG GGAAGATGGA
CAACAAACAC CGAAACTGGA GCACCGCAAC TCAACCCGAT TGATGGGCCA
CTGCCAGAAG ACAATGAACC AAGTGGTTAT GCCCAAACAG ATTGTGTATT
GGAGGCGATG GCTTTCCTTG AGGAATCCCA TCCTGGTATT TTTGAAAACT
CGTGTATTGA AACGATGGAG GTTGTTCAGC AAACACGAGT AGACAAGCTG
AC ACAAGGCC GACAGACCTA TGACTGGACT CTAAATAGAÁ ACCAACCTGC
TGCAACAGCAITGGCCAACA CAATAGAAGT GTTCAGATCA AATGGCCTCA
CGGCCAATGA GTCTGGAAGG CTCATAGACT TCCTTAAGGA TGTAATGGAG
TCAATGAACA AAGAAGAAAT GGGGATCACA ACTCATTTTC AGAGAAAGAG
ACGGGTGAGA GACAATATGA CTAAGAA AAT GATAACACAG AGAACAATGG
GTAAAAAGAA GCAGAGATTG AACAAAAGGA GTTATCTAAT TAGAGCATTG
ACCCTGAACA CAATGACCAA AGATGCTGAG AGAGGGAAGC TAAAACGGAG
AGCAATTGCA ACCCCAGGGA TGCAAATAAG GGGGTTTGTA TACTTTGTTG
AGACACTGGC AAGGAGTATA TGTGAGAAAC TTGAACAATC AGGGTTGCCA
GTTGGAGGC A ATGAGAAGAA AGC AAAGTTG GCAAATGTTG TAAGGAAGAT
GATGACC AAT TCTCAGGACA CCGAACTTTC TTTCACCATC ACTGGAGATA
ACACCAAATG GAACGAAAAT CAGAATCCTC GGATGTTTTT GGCCATGATC
ACATATATGA CCAGAAATCA GCCCGÁATGG TTC AGAAATG TTCTAAGTAT
TGCTCCAATA ATGTTCTCAA ACAAAATGGC GAGACTGGGA AAAGGGTATA
TGTTTGAGAG C AAG AGTATG AAACTTAGAA CTC AAATACC TGCAGAAATG
CTAGCAAGC A TCGATTTGAA ATATTTCAAT GATTCAACAA
GAAAGAAGAT
TGAAAAAATC CGACCGCTCT TAATAGAGGG GACTGCATCA TTGAGCCCTG
GAATGATGAT GGGC ATGTTC AATATGTTAA GCACTGTATT AGGCGTCTCC
ATCCTGAATC TTGGACAAAA GAGATACACC AAGACTACTT ACTGGTGGGA
TGGTCTTC AA TCCTCTGACG ATTTTGCTCT GATTGTGAAT GCACCCAATC
ATGAAGGGAT TCAAGCCGGA GTCGACAGGT TTTATCGAAC CTGTAAGCTA
CTTGGAATC A ATATGAGCAA GAAAAAGTCT TACATAAACA GAACAGGTAC
ATTTGAATTC ACAAGTTTTT TCTATCGTTA TGGGTTTGTT
GCCAATTTCA
GCATGG AGCT TCCCAGTTTT GGGGTGTCTG GGATCAACGA GTCAGCGGAC
ATGAGTATTG GAGTTACTGT CATCAAAAAC AATATGATAA ACAATGATCT
TGGTCCAGCA ACAGCTCAAA TGGCCCTTCA GTTGTTCATC AAAGATT ACA
GGTACACGTA CCGATGCCAT ATAGGTGACA CACAAATACA AACCCGAAGA
TCATTTGAAA TAAAGAAACT GTGGGAGCAA ACCCGTTCCA AAGCTGGACT
GCTGGTCTCC GACGGAGGCC CAAATTTATA CAACATTAGA AATCTCCACA
TTCCTGAAGT CTGCCTAAAA TGGGAATTGA TGGATG AGGA TTACCAGGGG
CGTTTATGCA ACCCACTGAA CCCATTTGTC AGCCATAAAG AAATTGAATC
AATGAAC AAT GCAGTGATGA TGCC AGCACA TGGTCC AGCC AAAAACATGG
AGTATG ATGC TGTTGC AAC A ACACACTCCT GGATCCCC AA AAGAAATCGA
TCCATCTTGA ATACAAGTCA AAGAGGAGTA CTTGAGGATG AACAAATGTA
CCAAAGGTGC TGCAATTTAT TTGAAAAATT CTTCCCCAGC AGTTCATACA
GAAGACCAGT CGGGATATCC AGTATGGTGG AGGCTATGGT TTCCAGAGCC
CGAATTGATG CACGGATTGA TTTCGAATCT GGAAGGATAA AGAAAGAAGA
GTTCACTGAG ATCATGAAGA TCTGTTCCAC CATTGAAGAG CTCAGACGGC
AAAAATAGTG AATTTAGCTT GTCCTTC ATG AAAAAATGCC
TTGTTTCTAC
T
(SEQ IDNO:2)
PB2
AGCGAAAGCA GGTCAATTAT ATTCAATATG GAAAGAATAA AAGAACTACG
AAATCTAATG TCGCAGTCTC GCACCCGCGA GATACTCACA AAAACCACCG
TGGACCATAT GGCCATAATC AAGAAGTACA CATCAGGAAG ACAGGAGAAG
AACCCAGCAC TTAGGATGAA ATGGATGATG GCAATGAAAT ATCCAATTAC
AGCAGACAAG AGGATAACGG AAATGATTCC TGAGAGAAAT GAGCAAGGAC
AAACTTTATG GAGTAAAATG AATGATGCCG GATCAGACCG AGTGATGGTA
TCACCTCTGG CTGTGACATG GTGGAATAGG AATGGACCAA TAACAAATAC
AGTTCATTAT CCAAAAATCT ACAAAACTT A TTTTGAAAGA GTCGAAAGGC
TAAAGCATGG AACCTTTGGC CCTGTCCATT TTAGAAACCA AGTCAAAATA
CGTCGGAGAG TTGACATAAA TCCTGGTCAT GCAGATCTCA GTGCCAAGGA
GGCACAGGAT GTAATCATGG AAGTTGTTTT CCCTAACGAA GTGGGAGCCA
GGATACTAAC ATCGGAATCG CAACTAACGA TAACCAAAGA GAAGAAAGAA
GAACTCCAGG ATTGCAAAAT TTCTCCTTTG ATGGTTGCAT ACATGTTGGA
GAGAGAACTG GTCCGCAAAA CGAGATTCCT CCCAGTGGCT GGTGGAACAA
GCAGTGTGTA CATTGAAGTG TTGCATTTGA CTCAAGGAAC ATGCTGGGAA
CAGATGTATA CTCCAGGAGG GGAAGTGAGG AATGATGATG TTGATCAAAG
CTTGATTATT GCTGCTAGGA ACATAGTGAG AAGAGCTGCA GTATCAGCAG
ATCCACTAGC ATCTTTATTG GAGATGTGCC ACAGCACACA GATTGGTGGA
ATTAGGATGG TAG ACATCCT TAGGC AGAAC CCAACAGAAG AGCAAGCCGT
GGATATATGC AAGGCTGCAA TGGGACTGAG AATTAGCTCA TCCTTCAGTT
TTGGTGGATT CACATTTAAG AGAACAAGCG GATCATCAGT CAAGAGAGAG
GAAGAGGTGC TTACGGGCAA TCTTCAAACA TTGAAGATAA GAGTGCATGA
GGGATATGAA GAGTTCACAA TGGTTGGGAG AAGAGCAACA GCCATACTCA
GAAAAGCAAC CAGGAGATTG ATTCAGCTGA TAGTGAGTGG GAGAGACGAA
CAGTCGATTG CCGAAGCAAT AATTGTGGCC ATGGTATTTT CACAAGAGGA
TTGTATGATA AAAGCAGTCA GAGGTG ATCT GAATTTCGTC AATAGGGCGA
ATCAACGATT GAATCCTATG CATCAACTTT TAAGACATTT TCAGAAGGAT
GCGAAAGTGC TTTTTCAAAA TTGGGGAGTT GAACCTATCG ACAATGTGAT
GGGAATGATT GGGATATTGC CCGACATGAC TCCAAGCATC GAGATGTCAA
TGAGAGGAGT GAGAATCAGC AAAATGGGTG TAGATGAGTA CTCCAGCACG
GAGAGGGTAG TGGTGAGCAT TGACCGTTTT TTGAGAATCC GGGACCAACG
AGGAAATGTA CTACTGTCTC CCGAGGAGGT CAGTGAAACA CAGGGAACAG
AGAAACTGAC AATAACTTAC TCATCGTCAA TGATGTGGGA GATTAATGGT
CCTGAATCAG TGTTGGTCAA TACCTATCAA TGGATCATCA GAAACTGGGA
AACTGTTAAA ATTCAGTGGT CCCAGAACCC TACAATGCTA TACAATAAAA
TGGAATTTGA ACCATTTCAG TCTTTAGTAC CTAAGGCCAT TAGAGGCCAA
TACAGTGGGT TTGTAAGAAC TCTGTTCCAA CAAATGAGGG ATGTGCTTGG
GACATTTGAT ACCGC ACAGA TAATAA AACT TCTTCCCTTC GCAGCCGCTC
CACCAAAGCA AAGTAGAATG C AGTTCTCCT C ATTTACTGT GAATGTGAGG
GGATCAGGAA TGAGAATACT TGTAAGGGGC AATTCTCCTG TATTCAACTA
TAACAAGGCC ACGAAGAGAC TCACAGTTCT CGGAAAGGAT GCTGGCACTT
TAACTGAAGA CCCAGATGAA GGCACAGCTG GAGTGGAGTC CGCTGTTCTG
AGGGGATTCC TCATTCTGGG CAAAGA AGAC AAGAGATATG GGCCAGCACT
AAGCATCAAT GAACTGAGCA ACCTTGCGAA AGGAGAGAAG GCTAATGTGC
TAATTGGGCA AGGAGACGTG GTGTTGGTAA TGAAACGGAA ACGGGACTCT
AGC ATACTTA CTGACAGCCA GACAGCGACC AAAAGAATTC GGATGGCCAT
CAATTAGTGT CGAATAGTTT AAAAACGACC TTGTTTCTAC T (SEQ ID NO: 3)
AGCAAAAGCA GGGTAGAXAA TCACTCACTG AGTGACATCA AAATCATGGC GTCTCAAGGC ACCAAACGAT CTTACGAACA GATGGAGACT
GATGGAGAAC GCCAGAATGC CACTGAAATC AGAGCATCCG TCGGAAAAAT
GATTGGTGGA ATTGGACGAT TCTACATCCA AATGTGCACC GAACTCAAAC
TCAGTGATTA TGAGGGACGG TTGATCCAAA ACAGCTTAAC AATAGAGAGA
ATGGTGCTCT CTGCTTTTGA CGAAAGGAGA AATAAATACC TTGAAGAACA
TCCCAGTGOG GGGAAAGATC CTAAGAAAAC TGGAGGACCT ATATACAGGA
GAGTAAACGG AAAGTGGATG AGAGAACTCA TCCTTTATGA CAAAGAAGAA
ATAAGGCGAA TCTGGCGCCÁ AGCTAATAAT GGTGACGATG CAACGGCTGG
TCTGACTCAC ATGATGATCT GGCATTCCAA TTTGAATGAT GCAACTTATC
AGAGGACAAG AGCTCTTGTT CGCACCGGAA TGGATCCCAG GATGTGCTCT
CTGATGCAAG GTTCAACTCT CCCTAGGAGG TCTGGAGCCG CAGGTGCTGC
AGTCAAAGGA GTTGGAACAA TGGTGATGGA ATTGGTCAGA ATGATCAAAC
GTGGGATCAA TGATCGGAAC TTCTGGAGGG GTGAGAATGG ACGAAAAACA
AGAATTGCTT ATGAAAGAAT GTGCAACATT CTCAAAGGGA AATTTCAAAC
TGCTGCACAA AAAGCAATGA TGGATCAAGT GAGAGÁGAGC CGGAACCCAG
GGAATGCTGA GTTCGAAGAT CTCACTTTTC TAGCACGGTC TGCACTCATA
TTGAGAGGGT CGGTTGCTCA CAAGTCCTGC CTGCCTGCCT GTGTGTATGG
ACCTGCCGTA GCCAGTGGGT ACGACTTTGA AAGGGAGGGA TACTCTCTAG
TCGGAATAGA CCCTTTCAGA CTGCTTCAAA ACAGCCAAGT GTACAGCCTA
ATCAGACCAA ATGAGAATCC AGCACACAAG AGTCAACTGG TGTGGATGGC
ATGCCATTCT GCCGCATTTG AAGATCTAAG AGTATTAAGC TTCATCAAAG
GGACGAAGGT GCTCCCAAGA GGGAAGCTTT CCACTAGAGG AGTTCAAATT
GCTTCCAATG AAAATATGGA GACTATGGAA TCAAGTACAC TTGAACTGAG
AAGCAGGTAC TGGGCCATAA GGACCAGAAG TGGAGGAAAC ACCAATCAAC
AGAGGGCATC TGCGGGCCAA ATCAGCATAC AACCTACGTT CTCAGTACAG
AGAAATCTCC CTTTTGACAG AACAACCATT ATGGCAGCAT TCAATGGGAA
TACAGAGGGG AGAAC ATCTG ACATGAGGAC CGAAATCATA AGGATGATGG
AAAGTGCAAG ACCAGAAGAT GTGTCTTTCC AGGGGCGGGG AGTCTTCGAG
CTCTCGGACG AAAAGGCAGC GAGCCCGATC GTGCCTTCCT TTGACATGAG
TAATGAAGGA TCTTATTTCT TCGGAGACAA TGCAGAGGAG TACGACAATT
AAAGAAAAAT ACCCTTGTTT CTACT (SEQ ID NO:4)
AGCAAAAGCA GGTAGATATT GAAAG ATGAG TCTTCTAACC GAGGTCGAAA
CGTACGTACT CTCTATCATC ccgtcaggcc ccctcaaagc CGAGATCGCA
C AG AGACTTG AAG atgtctt TGC AGGGAAG AAC ACCGATC TTGAGGTTCT
C ATGGAATGG CTAA AGACAA gaccaatcct gtc acctctg ACTAAGGGGA
TTTTAGGATT TGTGTTCACG CTCACCGTGC CCAGTGAGCG AGGACTGCAG
CGTAGACGCT TTGTCCAAAA TGCCCTTAAT GGGAACGGGG ATCCAAATAA
CATGGACAAA GCAGTTAAAC TGTATAGGAA GCTCAAGAGG GAGATAACAT
TCCATGGGGC CAAAGAAATC TCACTCAGTT ATTCTGCTGG TGCACTTGCC
AGTTGTATGG GCCTCATATA CAAC AGGATG GGGGCTGTGA CCACTGAAGT
GGCATTTGGC CTGGTATGTG CAACCTGTG A ACAGATTGCT GACTCCCAGC
ATCGGTCTCA TAGGCAAATG GTGACAACAA CCAATCCACT AATCAGACAT
GAGAACAGAA TGGTTTTAGC CAGCACTACA GCTAAGGCTA TGGAGCAAAT
GGCTGGATCG AGTGAGCAAG CAGCAGAGGC CATGGAGGT GCTAGTCAGG
CTAGAC AAAT GGTGCAAGCG ATGAGAACC A TTGGGACTCA TCCTAGCTCC
AGTGCTGGTC TGAAAAATGA TCTTCTTGAA AATTTGCAGG CCTATCAGAA
ACGAATGGGG GTGCAGATGC AACGGTTCAA GTGATCCTCT CACTATTGCC
GCAAATATCA TTGGGATCTT GCACTTGACA TTGTGGATTC TTGATCGTCT
TTTTTTCAAA TGCATTTACC GTCGCTTTAA ATACGGACTG AAAGGAGGGC
CTTCTACGGA AGGAGTGCC A AAGTCTAXG A GGGAAGAATA TCGAAAGGAA
CAGCAG AGTG CTGTGGATGC TGACGATGGT CATTTTGTCA GCATAGAGCT
GGAGTAAAAA ACTACCTTGT TTCTACT (SEQ ID NO:5)
AGC AAAAGC A GGGTGAC AAA AACATAATGG ATCCAAACAC TGTGTCAAGC
TTTCAGGTAG ATTGCTTTCT TTGGCATGTC CGCAAACGAG TTGCAGACCA
AGAACTAGGC GATGCCCCAT TCCTTGATCG GCTTCGCCGA GATCAGAAAT
CCCTAAGAGG AAGGGGCAGT ACTCTCGGTC TGGACATCAA GACAGCCACA
CGTGCTGGAA AGCAGATAGT GGAGCGGATT CTGAAAGAAG AATCCGATGA
GGCACTTAAA ATGACCATGG CCTCTGTACC TGCGTCGCGT TACCTAACTG
ACATGACTCTTGAGGAAATG TGAAGGGACT GGTCCATGCT CATACCCAAG
C AG AAAGTGG CAGGCCCTCT TTGTATC AGA ATGGACC AGG CGATCATGGA
TAAGAACATC ATACTGAA AG CGAACTTCAG TGTGATTTTT GACCGGCTGG
AGACTCTAAT ATTGCTAAGG GCTTTCACCG AAGAGGGAGC AATTGTTGGC
GAAATTTCAC CATTGCCTTC TCTTCCAGGA CATACTGCTG AGGATGTCAA
AAATGC AGTT GGAGTCCTCA TCGGAGGACT TGAATGGA AT GATAACACAG
TTCGAGTCTC TGAAACTCTA CAGAGATTCG CTTGGAGAAG CAGTAATGAG
AATGGGAGAC CTCCACTCAC TCCAAAACAG AAACGAGAAA TGGCGGGAAC
AATTAGGTCA GAAGTTTGAA GAAATAAGAT GGTTGATTGA AGAAGTGAGA
CACAAACTGA AGATAACAGA GAATAGTTTT GAGCAAATAA CATTTATGCA
AGCCTTACAT CTATTGCTTG AAGTGGAGCA AGAGATAAGA ACTTTCTCGT
TTCAGCTTAT TTAGTACTAA AAAACACCCT TGTTTCTACT (SEQ ID NO:6)
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAACCT
ACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGAT
GCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACAC
TGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGT
GACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTAT
GTAGATTAAAAGGAATAGCCCCAGTACAATTGG
GGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGAO
CCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATT
GTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTT
CATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAG
CTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCT
CATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGG
CAGCATGCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTA
TGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAG
CTGAAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACT
GTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGA
ACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGA
CTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAA
TAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTA
TTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATA
ATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGC
ACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCAC
CTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCC
TGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGA
ATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGT
GCC AAATTGAGGATGGTTACAGG ACTAAG G AAC
ATrCCGXOCAITCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTT
ATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGG
ATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAG
CGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACG
GGATTAC AAAC AAGGTG A AC ACT GTTATCGAGAAA ATGAACATTC AA
TTCAC AGCTGTGGGTA AAGAATTC AACAAATTA
gaaaaaaggatggaaaatttaaataaaaaagttgatgatggatttct
GGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGT
tctactggaaaatgaaaggactctggatttccatgactcaaatgtga
agaatctgtatgagaaagtaaaaagccaattaa
AGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGmTGAGTTCTACCAC
AAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGA
AATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAA
CAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATC
AATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTC
ACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCA
GTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCT
GAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAAC
ACCCTTGTTTCTACT (SEQ ID NO:7)
AGCAAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAAATCAGAAAATAATAAC
CATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATT
AGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCA
TTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGG
AATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAA
AGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATT
CATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAAT
AGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTT
GTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACC
TTTTTTCTGACCCAAGGTGCCTTACTGAATGA
CAAGCATTCAAGTGGGACTGTTAAGGACAGAAGCCCTTATAGGGCCT
TAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCC
CGTACAATTCAAGATTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTC
ATGATGGCATGGGCTGGCTAACAATCGGAATT
TCAGGTCCAGATAATGGAGCAGTGGCTGTÁTTAAAATACAACGGCAT
AAT AACTGA A ACC AT AAA A A GTTGG AGG AAG AA
AATATTGAGGACACAAGAGTCTGAATGTGCCTGTGTAAATGGTTCAT
GTTTTACTATAATGACTGATGGCCCGAGTGATG
GGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAAAAGGGGAAGGTTACT
AAATCAATAGAGTTGAATGCACCTAATTCTCAC
TATGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCAAAGTGATGTGTGT
GTGCAGAGACAATTGGCATGGTTCGAACCGGCC
ATGGGTGTCTTTCGATCAAAACCTGGATTATCAAATAGGATACATCT
GCAGTGGGGTTTTCGGTGACAACCCGCGTCCCG
AAGATGGAACAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATGTTGATGGAGCAAAC
GGAGTAAAGGGATTTTCATATAGGTATGGTAAT
GGTGTTTGGATAGGAAGGACCAAAAGTCACAGTTCCAGACATGGGTT
TGAGÁTGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGA
GACTGATAGTAAGTTCTCTGTGAGGCAAGATGTTGTGGCAATGACTG
ATTGGTCAGGGTATAGCGGAAGTTTCGTTCAAC
ATCCTGAGCTGACAGGGCTAGACTGTATGAGGCCGTGCTTCTGGGTT
GAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAAAACA
ATCTGGACTAGTGCGAGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGAT
ACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGA
GTrGCCATTCAGCATTGACAAGTAGTCTGTTCAAAAAACTCCTTGTTT
CTACT (SEQ ID NO: 8)
5 Ejemplo 3
El virus de la gripe A/Hong Kong/213/2003 (H5N1, HK213) se replica sistémicamente en pollos, causando la infección letal. Es más, este virus es letal en embriones de pollo. Por consiguiente, a pesar de que sus proteínas de superficie se relacionan altamente con los virus de la gripe aviar patógenos circulantes actualmente, HK213 no 10 puede utilizarse como una cepa de vacuna como Intento de crecimiento en huevos de pollo embrionados, lo que origina la producción de fluido alantoideo de mala calidad. Adlcionalmente, el uso de este virus altamente virulento en la producción de vacunas no es seguro para los trabajadores de la vacuna. Para ensayar la viabilidad del uso de
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A/PR/8/34 como cepa de vacuna maestra, el sitio de escisión del gen de la hemaglutinina (HA) de HK213 (que contiene múltiples aminoácidos básicos) se mutó a partir de un fenotipo virulento a avirulento (de RERRRKKR (SEQ ID NO: 9) a —TETR). Un virus que contiene el gen HA mutado produjo infección localizada no letal en pollos. Adicionalmente, el virus mutado era no letal en embriones de pollo. Por consiguiente, el crecimiento del virus mutado en huevos embrionados produjo fluido alantoideo de alta calidad, y en esta forma atenuada, el virus es seguro para los productores de vacunas.
Un virus recombinante que contiene los genes de neuraminidasa (NA) y HA mutada de HK213, y todos los genes restantes del virus de título alto A/PR/8/34 (H1N1, HG-PR8) (Ejemplo 2), que crece 10 veces mejor que otras cepas A/PR/8/34 PR8 en huevos (1010 DIHso/ml; título HA: 1:8.000), se generó en huevos de pollo embrionados. Este virus recombinante, que expresa proteínas de superficie relacionadas con los virus de la gripe aviar patógenos circulantes actualmente, creció hasta títulos elevados en huevos de pollo embrionados (Figura 4). Por consiguiente, la sustitución de los genes HA y NA de HG-PR8 con los de una cepa actualmente circulante del virus de la gripe originó una cepa de vacuna que puede producirse de forma segura, y demuestra el uso de PR8-HG como una cepa de vacuna maestra.
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Claims (26)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Una composición que comprende una pluralidad de vectores de virus de la gripe, que comprendea) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB1 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB2 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de HA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NP del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de M del virus de la gripe vinculado a una secuencia de transcripción de la terminación, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NS del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, en los que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M y NS poseen una región codificante para un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1-6, y en los que los ADNc para HA y NA no poseen SEQ ID NO: 7 u 8, y en el que el vectores con ADNc de la gripe comprenden un promotor de la ARN pollmerasa I y una secuencia de terminación de la ARN polimerasa I; yb) un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NP del virus de la gripe.
- 2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de HA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M2 del virus de la gripe, o un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NS2 del virus de la gripe.
- 3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M y NS poseen una Identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos 90 % con una de las SEQ ID NO: 1-6 o su complemento.
- 4. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el ADNc para HA es un subtipo de H5.
- 5. La composición de la reivindicación 1, en la que HA es una HA de tipo A.
- 6. La composición de la reivindicación 1, en la que el promotor de la ARN polimerasa I es un promotor de la ARN polimerasa I humano.
- 7. La composición de la reivindicación 1, en la que cada vector de a) se encuentra en un plásmido distinto.
- 8. La composición de la reivindicación 1, en la que cada vector de b) se encuentra en un plásmido distinto.
- 9. La composición de la reivindicación 1, en la que cada uno de los vectores de b) comprende además una secuencia de terminación de la transcripción de ARN.
- 10. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un vector que comprende un promotor vinculado a secuencias del virus de la gripe en 5' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 5’ vinculadas a un ADNc de interés vinculado a secuencias del virus de la gripe en 3' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 3’vinculadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
- 11. La composición de la reivindicación 10, en la que el ADNc de interés se encuentra en orientación sentido.
- 12. La composición de la reivindicación 10, en la que el ADNc de interés se encuentra en orientación antisentido.
- 13. La composición de la reivindicación 10, en la que el ADNc de interés comprende un marco de lectura abierto codificante de un polipéptido o péptido inmunogénico de un patógeno o un polipéptido o péptido terapéutico.
- 14. Un método para preparar un virus de la gripe, que comprende: poner en contacto una célula con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en una cantidad eficaz para producir un virus de la gripe infeccioso.51015202530354045505560
- 15. El método de la reivindicación 14, que comprende además el aislamiento del virus.
- 16. Un método para preparar un vehículo de administración génica, que comprende: poner en contacto células con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en una cantidad eficaz para producir un virus de la gripe, y el aislamiento del virus.
- 17. Un método para preparar un virus de la gripe, que comprende poner en contacto una célula con un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB1 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de PB2 del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de HA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NP del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NA del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de M del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un ADNc de NS del virus de la gripe vinculado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de PB2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NP del virus de la gripe, con el fin de producir un virus infeccioso, en los que los ADNc para PB1, PB2, PA, NP, M o NS poseen una región codificante para un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1-6, y en los que los ADNc para HA y NA no poseen SEQ ID NO: 7 u 8, y en los que los vectores con ADNc del virus de la gripe comprenden un promotor de la ARN polimerasa I y una secuencia de terminación de la ARN polimerasa I.
- 18. El método de la reivindicación 17, en el que el ADNc para HA es un subtipo de H5.
- 19. El método de la reivindicación 17, que comprende además un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de HA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NA del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M1 del virus de la gripe, un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de M2 del virus de la gripe, y un vector que comprende un promotor vinculado operativamente a un segmento de ADN codificante de NS2 del virus de la gripe.
- 20. El método de la reivindicación 17 o 19, que comprende además un vector que comprende un promotor vinculado a secuencias del virus de la gripe en 5' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 5’ vinculadas a un ADNc de interés o un fragmento de este último vinculado a secuencias del virus de la gripe en 3' que comprenden secuencias no codificantes del virus de la gripe en 3'vinculadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
- 21. El método de la reivindicación 20, en el que el ADNc de interés comprende un marco de lectura abierto codificante de un polipéptido o péptido inmunogénico de un patógeno o un polipéptido o péptido terapéutico.
- 22. El método de la reivindicación 20, en el que el ADNc de interés se encuentra en orientación sentido.
- 23. El método de la reivindicación 20, en el que el ADNc de interés se encuentra en orientación antisentido.
- 24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, que comprende además el aislamiento del virus.
- 25. Un virus de la gripe de genoma reordenado aislado que comprende ARN genómicos virales con secuencias en SEQ ID NO: 1-6 y polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 1-6 o un polipéptido con una sustitución conservativa en relación con el polipéptido codificado por al menos una de las SEQ ID NO. 1-6, y ARN genómicos virales para HA y NA que no poseen secuencias en SEQ ID NO: 7-8, en los que el ARN genómico viral para HA es un subtipo de H5, y en el que el virus de genoma reordenado crece en huevos con un título de al menos 10 DIHso/ml.
- 26. El virus de genoma reordenado de la reivindicación 25, en el que el H5 HA posee un fenotipo avirulento.
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