BRPI0717157A2 - Vetor rinovírus recombinante - Google Patents

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BRPI0717157A2
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influenza
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BRPI0717157-9A2A
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Kirill Kalnin
Yanhua Yan
Harold Kleanthous
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Sanofi Pasteur Biologics Co
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR Rl- NOVÍRUS RECOMBINANTE".
Antecedentes da Invenção
Uma gripe pandêmica ocorre quando um novo subtipo de vírus da gripe aparece, contra qual a população global tem pouca ou nenhuma imunidade. Durante o século 20, gripes pandêmicas causaram milhões de morte, rompimento social, e perdas econômicas profundas pelo mundo. Os peritos em gripe concordam que outra doença pandêmica é provável de a- contecer, mas é desconhecida. O nível de prontidão global no momento quando uma doença pandêmica incide determinará a saúde pública e im- pacto econômico da doença. Nos dias de hoje, a Organização Mundial de Saúde (WHO) estima que existirão pelo menos várias centenas de milhões de visitas de pacientes de ambulatório, mais do que 25 milhões de admis- sões em hospitais, e vários milhões de mortes globalmente, dentro de um período muito curto. Estes interesses foram realçados em 2003, quando o vírus aviário H5N1 alcançou níveis epizoóticos em aves domésticas em um número de países asiáticos, e, em seguida, se espalhou pela Europa e Áfri- ca. Felizmente, sua transmissão a humanos foi rapidamente limitada, com 246 infecções documentadas, que estavam associadas com alta mortalida- de, perfazendo 144 mortes (14 de Setembro de 2006; World Health Organi- zation (WHO) Web site).
Vacinas da gripe convencionais são designadas para induzir neutralização das respostas do anticorpo contra a proteína hemaglutinina (HA) do vírus da gripe. Devido à tendência antigênica constante na proteína HA, a composição de vacina deve ser mudada cada ano para se equiparar às cepas virais circulantes antecipadas. Tal aproximação de vacina é inacei- tável em face de uma doença pandêmica, devido ao longo tempo requerido para o isolamento e identificação de uma cepa pandêmica, e construção e fabricação de uma vacina apropriada. Uma aproximação mais efetiva de controle ou prevenção de uma doença pandêmica da gripe contempla o de- senvolvimento de uma vacina "universal" capaz de induzir imunidade prote- tora contra vírus da gripe imunologicamente determinante recentemente identificado, altamente conservado. Tal vacina deve proporcionar proteção ampla através das cepas de vírus da grupe A. Adicionalmente, tal vacina pode ser fabricada o ano todo, estocada, e/ou administrada durante todo o ano.
A proteína matriz de gripe M2 foi demonstrada servir como um
alvo efetivo para desenvolvimento de vacina (DeFiIette et al., Virology 337:149-161, 2005). M2 é uma proteína de transmembrana de 97 aminoáci- dos vírus da gripe tipo A (Lamb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 78:4170- 4174, 1981; Lamb et al., Cell 40:627-633, 1985). A proteína madura forma homotetrâmeros (Holsinger et al., Virology 183:32-43, 1991; Sugrue et al., Virology 180:617-624, 1991) que tem atividade de canal de íon de pH indu- zível (Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992; Sugrue et al., Virology 180:617- 624, 1991). M2-tetrâmeros são expressos em alta densidade na membrana de plasma de células infectadas, e são também incorporadas em baixa fre- quência nas membranas de partículas de vírus maduras (Takeda et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100:14610-14617, 2003; Zebedee et al., J. Vi- rol. 62:2762-2772, 1998). O ectodomínio M2 N-terminal de 24-amino-ácidos (M2e) é altamente conservado entre vírus tipo A da gripe (Fiers et al., Vírus Res. 103:173-176, 2004). O alto grau de conservação de M2e pode ser ex- planado por restrições resultantes de seu relacionamento genético com M1, a proteína mais conservada do vírus (Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498, 1991), e a ausência de anticorpos específicos de M2e durante infecção natural (Black et ai, J. Gen. Virol. 74 (Pt. 1):143-146, 1993).
Conforme mostrado no alinhamento abaixo, obtido usando-se seqüências a partir da base de dados de gripe NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cqi). o vírus da gripe aviária H5N1 M2e parece estar se desenvolvendo para a seqüência de consenso encontrada em vírus humanos típicos H1, H2, e H3, sugerindo que proteção ampla, incluindo de novos vírus aviários, usando o epítope M2e de gripe "humano" pode ser uma possibilidade: Humano HlNl (SEQ ID NO: 1) MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD
Humano H5N12001-2006 (SEQ ID NO: 5) ......................T..........E........S........
HumanoH5N1 1997-2000(SEQIDNO:6) .....................LT....G.............S........
AviárioH5Nl 1983-1998 (SEQ ID NO: 6) .....................LT....G.............S........
O fenômeno de evolução do H5N1 M2e em direção a seqüência
de H1N1 M2e foi recentemente reportado baseado na análise de seqüên- cias de cepas 800 H5H1 isoladas de humanos e pássaros na Indonésia e Vietnam (Smith et al., Virology 350:258-268, 2006). O peptídeo aviário deri- vado M2e EVETPTRN (SEQ ID NO: 2), mas não seu "predecessor" EVETL- TRN (SEQ ID NO: 3), foi eficientemente reconhecido por um anticorpo mo- noclonal anti-humano M2e (Mab)(Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005). Isto é importante porque algumas mudanças da "gripe aviária" mos- traram anteriormente reduzir a eficiência de proteção provida pelos Mabs específicos de M2e humanos. Interessantemente, algumas mudanças de aminoácido "pássaro-gripe-similar" na patogenicidade reduzida de M2e de vírus humanos H1N1 em camundongos (Zharikova et al., J. Virol. 79:6644- 6654, 2005).
O WHO enfatiza a possibilidade de "ocorrência simultânea de eventos com potencial pandêmico com níveis de ameaça diferentes em paí- ses diferentes, como foi o caso em 2004 com oclusões de aves domésticas de H7N3 no Canadá e H5N1 na Ásia" (http://www.who.int/en/). Conforme é mostrado no alinhamento abaixo, M2e H7N7 difere em apenas um aminoá- cido a partir da variante "humanizada" de H5N1. O subtipo H7N7 tem de- monstrado a capacidade de ser transmissível entre espécies (Koopmans et al., Lancet 363:587-593, 2004), e pode ser letal para pessoas (Fouchier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 101:1356-1361, 2004). As outras cepas (H9N2) foram também mostradas serem capazes de infectar aves domésti- cas e difundir para as pessoas (Cameron et al., Virology 278:36-41, 2000; Li et al., J. Virol. 77:6988-6994, 2003; Wong et ai, Chest 129:156-168, 2006). HumanoHlNl (SEQIDNO: 1) MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD
Aviário/Equino H7N7 (SEQIDNO:51) ......................T....G...E.......S.........
Aviário H9Nx 1966-1996 (SEQIDNO:52) ......................T....G...E..K...S......... Aviário H9Nx 1997-2004 (SEQIDNO:53) ....................HT....G...........S.........
Humano H9N2 1999-2003 (SEQIDNO:54) ....................LT....G....E..K..S.........
Vacinas de proteína recombinantes baseadas em M2e foram mostradas para induzir respostas protetoras imunes contra provocação de vírus A da gripe homólogo e heterólogo (Fiers et aí., Vírus Res. 103:173- 176, 2004; Slepushkin et a/., Vaccine 13:1399-1402, 1995). Estudos mais recentes usando peptídeo M2e conjugado para lapa hemocianina e proteína de membrana externa de N. meningitides ilustram boas respostas imunes não apenas em camundongos, mas também em furões e macacos rhesus (Fan et ai, Vaccine 22:2993-3003, 2004). Proteção contra vírus A da gripe H1, H5, H6, e H9 com uma vacina M2e Iipossomal foi demonstrada em ca- mundongos recentemente (Fan et ai, Vaccine 22:2993-3003, 2004).
O desenvolvimento de sistemas de distribuição para antígenos da gripe é importante para o desenvolvimento de vacinas contra infecção de vírus da gripe, tais como vacinas pandêmicas. Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona, em um primeiro aspecto, vetor rinovírus que inclui antígenos, conforme descrito aqui, tais como antígeno do vírus da gripes (por exemplo, peptídeos M2e). Os vetores podem ser não- patogênicos em humanos (por exemplo, Rinovirus 14 Humano (HRV14). Os antígenos podem ser inseridos nos vetores da invenção no, por exemplo, local de um Imunogene de Neutralização selecionado a partir do grupo con- sistindo em Imunogene de Neutralização I (Niml), Imunogene de Neutraliza- ção Il (NimII) (por exemplo, entre aminoácidos 158 e 160 de Nimll), Imuno- gene de Neutralização Ill (Nimlll), e Imunogene de Neutralização IV (NimIV)1 ou uma combinação destes. O antígeno (por exemplo, antígeno do vírus da gripe) opcionalmente pode ser flanqueado por seqüências Iigadoras em uma ou ambas extremidades. O vetor rinovírus da invenção pode estar vivo ou inativado.
Em um segundo aspecto, a invenção proporciona composições
farmacêuticas que incluem o vetor rinovírus aqui descrito e um ou mais transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Opcionalmente, tais composições farmacêuticas podem adicionalmente incluir um adjuvante (por exemplo, adjuvantes baseados em alumínio ou chitin), e/ou um ou mais ingredientes ativos adicionais (por exemplo, uma proteína de núcleo de He- patite B fundida com uma seqüência de antígeno, tal como um seqüência M2e).
Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona métodos de induzir uma resposta imune a um antígeno (por exemplo, um antígeno do vírus da gripe) em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), envol- vendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica conforme descrita aqui. Em um exemplo, o indivíduo não tem, mas está em risco de desenvolver uma infecção, tal como uma infecção de vírus da gripe. Em ou- tro exemplo, o indivíduo tem uma infecção a qual o vetor induz imunidade, tal como uma infecção de vírus da gripe. Em vários exemplos, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo intranasalmente. Em um quarto aspecto, a invenção proporciona métodos de pro-
dução de composições farmacêuticas conforme aqui descritas, envolvendo mistura de um vetor rinovírus conforme aqui descrito e um ou mais transpor- tadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Opcionalmente, estes métodos podem envolver adição de adjuvantes, reconstituição de materiais liofilizados, e/ou mistura com outros ingredientes aditivos.
Em um quinto aspecto, a invenção proporciona molécula de áci- do nucléicos que codifica ou corresponde ao genoma do vetor rinovírus aqui descrito.
Em um sexto aspecto, a invenção proporciona peptídeos de Ni- mil incluindo uma ou mais seqüências de antígeno heterólogas, tal como seqüência de antígeno do vírus da gripe inserida (por exemplo, uma se- qüência M2e).
Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona métodos de ge- rar vetor rinovírus conforme aqui descrito, incluindo um antígeno, tal como um antígeno do vírus da gripe (por exemplo, vírus da gripe M2e). Estes mé- todos podem incluir as etapas de: (i) geração de uma biblioteca de vetores rinovírus recombinantes baseados em um clone de cDNA infeccioso que inclui seqüências de antígeno inseridas (por exemplo, seqüências de antí- geno do vírus da gripe), e (ii) seleção a partir dos vírus recombinantes de biblioteca que (a) mantêm seqüências inseridas após passagem, e (b) são neutralizadas com anticorpos contra a seqüência inserida. Em um exemplo destes métodos, o vetor rinovírus é rinovírus 14 humano (HRV14). Em ou- tros exemplos, a seqüência de antígeno inserida é inserida em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo de Niml, Nimll1 Nimlll, e NimIV. Opcionalmente, a seqüência de antígeno inserida é flanqueada em uma ou ambas as extremidades com seqüências Iigadoras aleatórias, conforme descrito aqui.
Em um oitavo aspecto, a invenção proporciona métodos de cul- tivo de vetor rinovírus incluindo seqüências de antígeno inseridas (por e- xemplo, antígeno do vírus da gripe). Estes métodos envolvem a passagem dos vetores em células HeLa ou MRC-5. A invenção proporciona várias vantagens. Por exemplo, o uso
de um sistema de vetor vivo para distribuir antígenos tais como M2e propor- ciona vantagens incluindo: (i) a capacidade de induzir respostas de anticor- po de duração longa forte com dose de vacina pouco simples, e (ii) grande escalabilidade de manufaturamento (isto é, mais doses e um custo inferior) quando comparado com sub-unidade ou vacinas mortas. Desse modo, em uma situação pandêmica, muito mais pessoas podem ser imunizadas em um período de tempo relativamente curto com uma vacina viva. Em adição, os vetores HRV da invenção podem ser distribuídos intranasalmente, resul- tando em ambas respostas imunes sistêmicas e mucosais. O uso de HRV14 proporciona vantagens adicionais, visto que é não-patogênico e é infrequen- temente observado em populações humanas (Andries et ai, J. Virol. 64:1117-1123, 1990; Lee et ai, Vírus Genes 9:177-181, 1995), que reduz a probabilidade de imunidade antivetor pré-existente em recipiente de vacina. Adicionalmente, a quantidade de HRV necessária para infectar humanos é muito pequena (uma dose infecciosa de cultura de tecido (TCID50) (Savolai- nen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006)), que é uma característica favorável em termos de eficiência de custo de manufa- turamento de vacina baseado em HRV.
Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão a- parentes a partir da Descrição Detalhada que se segue, dos Desenhos, e das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 é uma representação esquemática de uma partícula de vírus (painel superior) e genoma (painel inferior) de HRV14. O rinovirus 14 humano (HRV14) capsid exibe uma simetria pseudo-T=3(P=3) isoquedral e consiste de 60 cópias de proteínas virais VP1, VP2, VP3, e VP4, com VP4 na interface RNA-capsid (Rossmann et al., Nature 317:145-153, 1985). As proteínas VP1-3 formam um canhão contendo um local de ligação de recep- tor para um receptor celular, molécula de adesão intracelular 1 (ICAM-1) (Colonno et al., J. Virol. 63:36-42, 1989). Três locais imunogênicos de neu- tralização maiores (Nim), NimI(AB), Nimll, e Nimlll foram identificados na superfície da borda do canhão como locais de ligação para neutralização de anticorpos (Sherry et al., J. Virol. 57:246-257, 1986). A reconstrução das partículas de HRV14 foi criada no programa Chimera na base de estrutura de cristal de HRV14 com Niml-específico mAb17 (base de dados do banco dedados de proteína n° 1 RVF).
Figura 2 é descrita conforme se segue: (A) construções de HRV14- M2e criadas neste estudo. Um derivado do clone de HRV14 cDNA, plasmídeo pWR1, foi usado para construção de mutantes de inserção de M2e (SEQ ID NOS: 7-8). (B) Placas produzidas por bibliotecas de vírus HRV14-Nimll- XXX17AA e HRV14-Nimll-XXX23AA, bem como HRV14 tipo selvagem derivado de pWR1. A construção n° 1 não produz placas, conforme discutido no texto e suportado por dados adicionais (figuras 3 e 4), indicando que a estratégia Iiga- dora aleatória é um meio efetivo de projeto de novos epítopes em HRV.
Figura 3 mostra a estabilidade do inserto de M2e em constru- ções diferentes de HRV14-M2e. Os fragmentos contendo inserto eram RT- PCR amplificados com pares de prímeres, P1-up100Fw, VP1-dwn200Rv (verde), ou 14FAflll-1730Rv (vermelho), resultando em fragmentos de DNA "PCR Β" (verde) ou "PCR A" (vermelho), respectivamente. Estes fragmentos foram digeridos com Xhol. Eletroforese de gel de agarose resulta de HRV14- M2e quimera nas passagens 2, 3, e 4, e para bibliotecas de vírus de HRV14-Nimll-XXX17AA e HRV14-Nimll-XXX17AA nas passagens 4, são mostradas. Os dois fragmentos clivados (indicados por setas) representam vírus contendo inserto.
Figura 4 mostra interferência estérica do inserto 23 AA M2e no local Nimll com o domínio de ligação de receptor de HRV14. O inserto sem Iigadores pode se estender de Nimll e quase alcançar o lado oposto do ca- nhão (isto é, no local de Niml), conforme mostrado no desenho. Esta barrei- ra pode efetivamente bloquear a entrada do receptor no canhão. Um Iigador N-terminal pode mudar a posição do inserto (direção é mostrada pela seta) e dá acesso ao canhão. Este modelo molecular de sub-unidade de VP1-VP4 de HRV14-Nimll-M2e (23 AA) foi criado em Accelrys Discovery Studio (Ac- celrys Software, Inc). Isto ilustra nossa capacidade de projetar novos epíto- pes no HRV14 devido aos dados estruturais disponíveis e software de mo- delagem.
Figura 5 mostra os resultados de um teste de neutralização de redução de placa (PRNT) de HRV14, a biblioteca HRV14-Nimll-XXX23AA, e a biblioteca HRV14-Nimll-XXX17AA com anti-M2e Mab 14C2 (Abcam, Inc; Cat n° ab5416). Os resultados demonstram neutralização eficiente de am- bas bibliotecas, mas não do vírus de vetor (HRV14). A pureza de ambas bi- bliotecas (ausência de contaminação de WT) é também evidente a partir destes resultados.
Figura 6 mostra resposta de anticorpo de M2e-específico IgG
(amostras reunidas) em camundongos imunizados antes da provocação. Titulações de ponto final (ETs) são mostradas após titulações de grupo rele- vante. O tempo de imunizações correspondentes é mostrado em parênteses (dO e d21 representam dia O e dia 21, respectivamente). Figura 7 mostra respostas de anticorpo de HRV14-específico
IgG (amostras reunidas) em camundongos imunizados antes da provoca- ção. (A) - grupos imunizados com 1, 2, ou 3 doses de vírus de HRV14- M2e(17AA); (B) - grupos imunizados com uma ou duas doses de vírus ori- ginal de HRV14.
Figura 8 mostra respostas de anticorpo M2e-específico IgG indi- viduais de camundongos imunizados.
Figura 9 mostra isotipos de anticorpo M2e-específico IgGI e
lgG2a em camundongos imunizados conforme descrito na tabela 4: (A) IgGI ELISA (amostras reunidas de grupo); (B) lgG2a ELISA (amostras reunidas de grupo); (C) Titulações para figuras 9A e 9B; (D) Nível de M2-e-específico IgGI (pontos) e lgG2a (diamantes) em amostras de soro individuais (diluição 1:2,700) de grupo 4 (vermelho; primeiro e terceiro conjuntos de dados) e grupo 7 (verde; segundo e quarto conjuntos de dados) camundongos (ver tabela 4).
Figura 10 mostra anticorpos específicos de M2e de isotipo lgG2a em camundongos imunizados conforme descrito na tabela 4. (A) ELI- SA com peptídeo M2e (amostras reunidas de grupo); (B) Amostras de soro individuais (diluição 1:2,700) de grupo 4 (vermelho; primeiro conjunto de da- dos) e grupo 7 (verde; segundo conjunto de dados) camundongo (ver tabela 4) testados em ELISA contra peptídeo específico de M2e.
Figura 11 mostra anticorpos específicos de M2e de isotipo lgG2a em camundongos imunizados conforme descrito na tabela 4 (painel superior).
Figura 12 mostra taxas de sobrevivência de todos os grupos 28 dias após provocação com a cepa PR8 Gripe A.
Figura 13 mostra a morbidez de todos os grupos 28 dias após provocação com cepa PR8 Gripe A (figura 13A); Pesos de corpo individuais dentro do grupo 4 (figura 13B) e grupo 7 (figura 13C).
Figura 14 mostra de resposta de anticorpo M2e-específico IgG (amostras reunidas) em camundongos imunizados antes da provocação (pa- ra grupo ver tabela 5). Figura 15 mostra a morbidez (percentagem de peso corpóreo)
de todos os grupos durante 17 dias após provocação não-mortal com cepa PR8 Gripe A. Figura 16 mostra os resultados de teste de neutralização de re- dução de placa (PRNT) de HRV14 e HRV6 com soro de camundongo anti- HRV14-NimlVHRV6. Estes dados serviram como uma prova de imunodomi- nância de NimlVHRV6 no antecedente de HRV14 capsid, sugerindo um novo local para inserção de epítopes estranhos.
Figura 17 mostra proteção de camundongos Balb/c contra pro- vocação intranasal letal com vírus da gripe: A) percentagem de pós- provocação de sobrevivência, e B) pós-provocação de perda de peso.
Figura 18 é uma ilustração esquemática dos locais de inserção nas proteínas virion de HRV14. M2e pode ser introduzido nas posições indicadas de Niml (SEQ ID NO: 42), Nimll (SEQ ID NO: 40), Nimlll (SEQ ID NO: 41), e NimIV (SEQ ID NO: 43). XXXM2e significa bibliotecas de M2e aqui descritas.
Figura 19 é uma representação esquemática da região estrutural de HRV14, que mostra um local de inserção dentro de Nimll de VP2 con- forme usado em duas quimeras produzidas de acordo com a invenção. As seqüências de nucleotídeo destas quimeras, HRV14-M2e (17AA; SEQ ID NO: 44) e HRV14-M2e (23AA SEQ ID NO: 45), são também providas. Descrição Detalhada
A invenção proporciona vacinas de gripe universais (doença pandêmica), que são baseadas no uso de rinovírus humanos (HRV) como vetores para distribuição eficiente e apresentação de vírus da gripe univer- sais determinantes. Conforme descrito adicionalmente abaixo, o domínio extracelular da proteína matriz da gripe 2 (M2e) é um epítope "universal" que pode ser incluído em uma vacina de gripe universal (gripe A), de acordo com a invenção. Esta aproximação proporciona uma vacina pandêmica de gripe efetiva, que pode ser administrada intranasalmente para induzir imunidade mucosal local. Dois exemplos de vacinas de acordo com a invenção, HRV14-M2e (17AA) e HRV14-M2e (23AA), são esquematicamente ilustra- dos na figura 19, que também inclui as seqüências de nucleotídeo destes vírus. Estes são exemplos de candidatos de vacina de gripe universal. Ba- seado em informação tal como esta, aqueles versados na técnica podem agora construir candidatos de vacina incluindo seqüências de M2e, confor- me mostrado nestes exemplos, ou outros epítopes de gripe. Candidatos de vacina podem também serem construídos baseados em outros epítopes de não-gripe, conforme descrito adicionalmente abaixo. Os vetores, composi- ções de vacina, e métodos da invenção são descritos adicionalmente, con- forme segue. Vetores de HRV
Os vetores da invenção são baseados em rinovírus humanos, tais como o rinovírus humano 14 de sorotipo não-patogênico (HRV14). A partícula de vírus HRV14 e estrutura de genoma são esquematicamente ilustradas na figura 1, que mostra proteínas estruturais de vírus (VP1, VP2, VP3, e VP4), as proteínas não-estruturais (P2-A, P2-B, P-2C, P3-A, 3B(VPg), 3C, e 3D), bem como as localizações de locais imunogênicos de neutralização maiores em HRV14 (Nims: Niml, Nimll1 Nimlll, e NimIV).
Um exemplo de um clone molecular de HRV14 que pode ser usado na invenção é pWR3.26 (American Type Culture Collection: ATCC® Number: VRMC-7™). Este clone é descrito em detalhes adicionais abaixo, bem como por Lee et ai, J. Virology 67(4):2110-2122, 1993 (também ver Sequence Appendix 3). Fontes adicionais de HRV14 podem também serem usadas na invenção (por exemplo, ATCC Acesso No. VR284; também ver Acesso ao Banco de Genes Nos. L05355 e K02121; Stanway et ai, Nucleic Ácidos Res. 12(20):7859-7875, 1984; e Callahan et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82(3):732-736, 1985). Em adição ao HRV14, outros sorotipos de rinovírus humano podem ser usados na invenção. Conforme é conhecido na técnica, existem mais do que 100 sorotipos de rinovírus humano, qualquer dos quais pode ser na invenção usado após a derivação de um clone infec- cioso, na mesma maneira como HRV14. Embora aqui descrito com relação a HRV14, a invenção se aplica a outros sorotipos de rinovírus também.
Seqüências de antígeno podem ser inseridas nos vetores de HRV1 de acordo com a invenção, em locais diferentes, conforme descrito adicionalmente abaixo. Em um exemplo, as seqüências são inseridas no local de Nimll de um soro tipo tal como HRV14. Nimll (Imunoqene de Neu- tralização II) é uma região imunodominante em HRV14 que inclui aminoáci- do 210 de VP1 e aminoácidos 156, 158, 159, 161, e 162 de VP2 (Savolai- nen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006). Em um exemplo específico descrito abaixo, as seqüências são inseridas entre aminoácidos 158 e 160 de VP2. Inserções podem ser feitas em outros locais dentro do epítope Nimll também. Por exemplo, a inserção pode ser feita em qualquer das posições 156, 158, 159, 161, ou 162 de VP2, ou na posição 210 de VP1, ou combinações destes.
Locais adicionais nos quais inserções podem ser feitas, sozi- nhas ou em combinação com inserções em outros locais (por exemplo, o local de Nimll), incluem Niml (A e B), Nimlll1 e NimIV. Desse modo, inser- ções podem ser feitas, por exemplo, nas posições 91 e/ou 95 de VP1 (Ni- mlA), posições 83, 85, 138, e/ou 139 de VP1 (NimIB)1 e/ou posição 287 de VP1 (NimIII) (ver, por exemplo, figura 18). NimIV está na região carboxil- terminal de VP1, em uma região compreendendo a seguinte seqüência, que representa aminoácidos 274-289 de HRV14 VP1: NTEPVIKKRKGDIKSY (SEQ ID NO: 4). Inserções entre quaisquer aminoácidos nesta região são incluídas na invenção. Desse modo, a invenção inclui, por exemplo, inser- ções entre aminoácidos 274 e 275; 275 e 276; 276 e 277; 277 e 278; 278 e 279; 279 e 280; 280 e 281; 281 e 282; 282 e 283; 283 e 284; 284 e 285; 285 e 286; 286 e 287; 287 e 288; e 288 e 289. Em adição a estas inserções, a invenção inclui inserções onde um ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10) aminoácidos nesta região são retirados. Desse modo, por exemplo, a invenção inclui inserções entre aminoácidos 274 e 276; 275 e 277; 276 e 278; 277 e 279; 278 e 280; 279 e 281; 280 e 282; 281 e 283; 282 e 284; 283 e 285; 284 e 286; 285 e 287; 286 e 288; 287 e 289; 288 e 290; e 289 e 291.
Os vetores da invenção são produzidos usando-se métodos pa- drões de biologia molecular, que são exemplificados abaixo no caso de um vetor incluindo inserções em Nimll de HRV14. Em adição, e conforme é dis- cutido adicionalmente abaixo, os vetores da invenção podem ser adminis- trados na forma de vírus vivos, ou podem ser inativados antes da adminis- tração por, por exemplo, inativação de formalina ou tratamento de ultraviole ta, usando-se métodos conhecidos na técnica.
Opcionalmente, os vetores podem incluir seqüências Iigadoras entre as seqüências de vetor HVR e as seqüências de gripe inseridas, nas extremidades amino e/ou carboxil-terminal. Estas seqüências Iigadoras po- dem ser usadas para proporcionar flexibilidade às seqüências inseridas, ca- pacitando as seqüências inseridas a apresentarem o epítope inserido em uma maneira na qual pode induzir uma resposta imune. Exemplos de tais seqüências Iigadoras são providos abaixo. A identificação de seqüências Iigadoras a serem usadas com um inserto particular pode ser efetuada, por, por exemplo, o método de classificação de biblioteca da invenção conforme descrito aqui. Brevemente, neste método, bibliotecas são construídas que têm seqüências aleatórias em uma região desejada para identificação de seqüências Iigadoras efetivas. Vírus gerados a partir da biblioteca são testa- dos para viabilidade e imunogenicidade das seqüências inseridas, para iden- tificar Iigadores efetivos. Peptídeos Heterólogos
Os vetores virais da invenção podem ser usados para distribuir qualquer peptídeo ou proteína de valor profilático ou terapêutico. Por exem- plo, os vetores da invenção podem ser usados na indução de uma resposta imune (profilática ou terapêutica) a qualquer antígeno baseado em proteína que é inserido em uma proteína de HRV.
Os vetores da invenção podem cada incluir um epítope simples. Alternativamente, epítopes simples podem ser inseridos nos vetores, ou em um local simples (por exemplo, como um polítope, em que os epítopes dife- rentes podem ser separados por um Iigador flexível, tal como um estiramen- to de poliglicina de aminoácidos), em locais diferentes (por exemplo, os lo- cais diferentes Nim), ou em qualquer combinação dos mesmos. Os epítopes diferentes podem ser derivados de uma espécie simples de patogenia, ou podem ser derivados de espécies diferentes e/ou genêros diferentes. Os vetores podem incluir peptídeos múltiplos, por exemplo, cópias múltiplas de peptídeos conforme listadas aqui, ou combinações de peptídeos tais como aquelas listadas aqui. Como um exemplo, os vetores podem incluir peptí- deos humanos e aviários M2e (e/ou seqüências de consenso dos mesmos).
Antígenos que podem ser usados na invenção podem ser deri- vados de, por exemplo, agentes infecciosos tais como vírus, bactéria e pa- rasitas. Um exemplo específico de tal agente infeccioso é vírus da gripe, in- cluindo aqueles que infectam humanos (por exemplo, cepas A, B, e C), bem como vírus da gripe aviária. Exemplos de antígenos de vírus da gripe inclu- em aqueles derivados de M2, hemaglutinina (HA; por exemplo, qualquer um de H1-H16, ou sub-unidades dos mesmos) (ou sub-unidades HA HA1 e HA2), neuraminidase (NA; por exemplo, qualquer uma de N1-N9), M1, nu- cleoproteína (NP), e proteínas B.
Seqüências adicionais que podem ser incluídas nos vetores da invenção são seqüências de vírus da gripe M2e. Exemplos de tais seqüên- cias são providas através de todo este relatório descritivo e em Apêndice de Seqüência 1. Exemplos específicos de tais seqüências incluem as seguin- tes: MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 1); MSLLTEVETP- TRNEWECRCSDSSD (SEQ ID NO: 5); MSLLTEVETLTRNGWG- CRCSDSSD (SEQ ID NO: 6); EVETPTRN(SEQ ID NO: 2); SLLTEVETPIR- NEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 7); e SLLTEVETPIRNEWGCR (SEQ ID NO: 8). Seqüências adicionais M2e que podem ser usadas na invenção in- cluem seqüências a partir do domínio extracelular de proteína BM2 de gripe B (consenso MLEPFQ (SEQ ID NO:9)), e o peptídeo de M2e a partir da gri- pe aviária H5N1 (MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD) (SEQ ID NO: 6)).
Os peptídeos incluídos nos vetores da invenção podem incluir as seqüências completas, notadas acima, ou fragmentos incluindo epítopes capa- zes de induzir a resposta imune desejada. Tais fragmentos podem incluir, por exemplo, 2-20, 3-18, 4-15, 5-12, ou 6-10 fragmentos de aminoácido de dentro destes peptídeos. Adicionalmente, seqüências adicionais de amino e/ou carbo- xil terminal aminoácido podem ser incluídas em tais peptídeos. Desse modo, os peptídeos podem incluir, por exemplo, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, ou 5-6 tais aminoáci- dos, se de seqüências contíguas que ocorrem naturalmente, ou seqüências Iigadoras artificiais (também ver abaixo). Todos tais fragmentos de peptídeo possíveis das seqüências notadas acima são incluídas na invenção. Outros exemplos de peptídeos que são conservados na gripe podem ser usados na invenção, e incluem o peptídeo NBe conservado para gripe B (seqüência de consenso MNNATFNYTNVNPISHIRGS (SEQ ID NO: 10)). Exemplos adicionais de peptídeos de gripe que podem ser usados na invenção, bem como proteínas das quais tais peptídeos podem ser deriva- dos (por exemplo, por fragmentação) são descritos em US 2002/0165176, US 2003/0175290, US 2004/0055024, US 2004/0116664, US 2004/0219170, US 2004/0223976, US 2005/0042229, US 2005/0003349, US 2005/0009008, US 2005/0186621, Patente norte-americana N0 4.752.473, Patente norte-americana N0 5.374.717, Patente norte-americana 6.169.175, Patente norte-americana n° 6.720.409, Patente norte-americana n° 6.750.325, Patente norte-americana n° 6.872.395, WO 93/15763, WO 94/06468, WO 94/17826, WO 96/10631, WO 99/07839, WO 99/58658, WO 02/14478, WO 2003/102165, WO 2004/053091, WO 2005/055957, e os A- pêndices de Seqüência em anexo 1 e 2 (e referências citadas no mesmo), os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência. Adicionalmen- te, epítopes de gripe de célula TeB imunológicos/protetores conservados podem ser escolhidos a partir da base de dados www.immuneepitope.org, em que muitos epítopes de proteção cruzada promissores foram recente- mente identificados (Bui et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 104:246-251, 2007 e tabelas suplementares). A invenção pode empregar qualquer peptí- deo a partir dos recursos IEDB on-line, por exemplo, epítopes de vírus da gripe, incluindo epítopes de célula BeT descritos em Bui et ai, supra.
Epítopes protetores de outras patogenias humanas/veterinárias, tais como parasitas (por exemplo, malária), outros vírus patogênicos (por exemplo, vírus papilloma humano (HPV), vírus de herpes simplex (HSV), vírus de imunodeficiência humana (HIV; por exemplo, gag), e vírus de hepa- tite C (HCV)), e bactéria (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, Clostri- dium difficile, e Helicobacter pylori) podem também serem incluídos nos ve- tores da invenção. Vários epítopes apropriados destas outras patogenias podem ser facilmente encontrados na literatura. Por exemplo, epíto- pes/peptídeos protetores cruzados de proteína papilomavirus L2 que indu- zem anticorpos de neutralização cruzada amplamente que protegem de ge- nótipos de HPV diferentes foram identificados por Schiller e co-operadores, tais como aminoácidos 1-88, aminoácidos 1-200, ou aminoácidos 17-36 de proteína L2 de, por exemplo, vírus HPV16 (WO 2006/083984 A1;
Q LYKTC KQAGTC P P D11P KV (SEQ ID NO: 11)). Exemplos de patogenias adicionais, bem como antígenos e epítopes destas patogenias, que podem ser usados na invenção são providos em WO 2004/053091, WO 03/102165, WO 02/14478, e US 2003/0185854, os conteúdos dos quais são incorpora- dos aqui por referência. Exemplos adicionais de patogenias das quais antígenos podem
ser obtidos são listados na tabela 1, abaixo, e exemplos específicos de tais antígenos incluem aqueles listados na tabela 2. Em adição, exemplos espe- cíficos de epítopes que podem ser inseridos nos vetores da invenção são providos na tabela 3. Conforme é notado na tabela 3, epítopes que são usa- dos nos vetores da invenção podem ser epítopes de célula B (isto é, epíto- pes de neutralização) ou epítopes de célula T (isto é, epítopes específicos de célula T auxiliadora e de célula T citotóxica).
Os vetores da invenção podem ser usados para distribuir antí- genos em adição a antígenos derivados de patogenia. Por exemplo, os veto- res podem ser usados para distribuir antígenos associados a tumor em mé- todos imunoterapêuticos contra câncer. Numerosos antígenos associados a tumor são conhecidos na técnica e podem ser administrados de acordo com a invenção. Exemplos de cânceres (e antígenos associados a tumor corres- pondentes) são conforme segue: melanoma (proteína NY-ESO-1 (especifi- camente epítope CTL localizado nas posições de aminoácido 157-165), CAMEL, MART 1, gp100, proteínas relacionadas à tirosina TRP1 e 2, e MUC1); adenocarcinoma (proteína ErbB2); câncer coloretal (17-1A, 791Tgp72, e antígeno carcinoembriônico); câncer de próstata (PSA1 e PSA3). Proteína de choque térmico (hsp110) pode também ser usada como tal antígeno.
Em outro exemplo da invenção, proteínas exógenas que codifi- ca(m) um epítope(s) de um antígeno de indução de alergia a qual uma res- posta imune é desejada podem ser usados. Em adição, os vetores da in- venção podem incluir Iigantes que são usados para alcançar os vetores para distribuir peptídeos, tais como antígenos, para células particulares (por e- xemplo, células que incluem receptores para os ligantes) em indivíduos a quem os vetores são administrados.
O tamanho do peptídeo ou proteína que é inserido nos vetores da invenção pode variar em comprimento de, por exemplo, de 3-1000 ami- noácidos em comprimento, por exemplo, de 5-500, 10-100, 20-55, 25-45, ou 35-40 aminoácidos em comprimento, conforme pode ser determinado para ser apropriado por aqueles técnicos no assunto. Desse modo, peptídeos na faixa na faixa de 10-25, 12-22, e 15-20 aminoácidos em comprimento po- dem ser usados na invenção. Adicionalmente, os peptídeos aqui notados podem incluir seqüências adicionais, ou podem ser reduzidos em compri- mento, também conforme pode ser determinado para ser apropriado por aqueles técnicos no assunto. Os peptídeos aqui listados pode estar presen- tes nos vetores da invenção conforme mostrado aqui, ou podem ser modifi- cados por, por exemplo, substituição ou retirada de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos). Em adição, os peptídeos podem estar presentes nos vetores no contexto de peptídeos maiores. Opcionalmente, peptídeos tais como aqueles acima e em qualquer lugar aqui incluem seqüências adicionais nas extremidades amino e/ou car- boxil terminal, conforme discutido acima, se tais seqüências são naturalmen- te associadas com as seqüências de peptídeo (isto é, as seqüências com a qual os peptídeos são contíguos no vírus da gripe (ou outra fonte) genoma), ou não (por exemplo, seqüências Iigadoras sintéticas). Os peptídeos podem, desse modo, incluírem, por exemplo, 1-25, 2-20, 3-15, 4-10, ou 4-8 seqüên- cias de aminoácido em uma ou ambas extremidades. Como um exemplo específico, o peptídeo pode incluir 1-3 seqüências Iigadoras nas extremida- des amino e/ou carboxil terminal. Administração
Quando usados em métodos de imunização, os vetores da in- venção podem ser administrados como um agente profilático primário em adultos ou crianças em risco de infecção por uma patogenia particular, tal como vírus da gripe. Os vetores podem também serem usados como agen- tes secundários para tratamento de pacientes infectados por estimulação de uma resposta imune contra a patogenia da qual a antígeno de peptídeo é derivado. No contexto de imunização contra câncer, as vacinas podem ser administradas contra indivíduos em risco de desenvolver câncer ou a indiví- duos que já tem câncer.
Para aplicações de vacina, opcionalmente, adjuvantes que são conhecidos àqueles técnicos no assunto podem ser usados. Adjuvantes são selecionados baseado na rota de administração. No caso de administração intranasal, micropartículas de chitin (CMP) podem ser usadas (Asahi-Ozaki et ai., Microbes e Infection 8:2706-2714, 2006; Ozdemir et a/., Clinicai e Ex- perimental Allergy 36:960-968, 2006; Strong et ai, Clinicai e Experimental Allergy 32:1794-1800, 2002). Outros adjuvantes adequados para uso em administração via a rota mucosal (por exemplo, rotas intranasal ou oral) in- cluem a toxina instável a calor de E. coli (LT), ou derivados mutantes da mesma. No caso de vírus inativado, adjuvantes parenterais podem ser usa- dos incluindo, por exemplo, compostos de alumínio (por exemplo, um hidró- xido de alumínio, fosfato de alumínio, ou composto de hidroxifosfato de alu- mínio), formulações lipossomais, adjuvantes sintéticos, tais como (por e- xemplo, QS21), muramil dipeptídeo, monofosforil lipídeo A, ou polifosfazina.
Em adição, genes que codificam citocinas que têm atividades adjuvantes podem ser inseridos nos vetores da invenção. Desse modo, ge- nes que codificam citocinas, tais como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, ou IL-5, podem ser inseridos juntos com genes de antígeno estranhos para produzir uma vacina que resulta em respostas imunes aumentadas, ou para modular imunidade direcionada mais especificamente em direção às respostas celu- lares, humorais, ou mucosais. Alternativamente, citocinas podem ser distri- buídas, simultaneamente ou seqüencialmente, separadamente de um vírus de vacina recombinante por meios que são bem conhecidos (por exemplo, inoculação direta, DNA desprotegido, em um vetor viral, etc.).
Os vírus da invenção podem ser usados em combinação com outras aproximações de vacina. Por exemplo, os vírus podem ser adminis- trados em combinação com vacinas de sub-unidade incluindo os mesmos ou antígenos diferentes. Os métodos de combinação da invenção podem incluir coadministração de vírus da invenção com outras formas do antígeno (por exemplo, formas de sub-unidade ou veículos de distribuição incluindo proteína de núcleo de hepatite (por exemplo, partículas de núcleo de hepati- te B contendo peptídeo M2e na superfície produzida em E. coli (HBc-M2e; Fiers et ai, Vírus Res. 103:173-176, 2004; WO 2005/055957; US 2003/0138769 A1; US 2004/0146524A1; US 2007/0036826 A1)), ou vírus total ou parcial inativado). Alternativamente, os vetores da presente inven- ção podem ser usados em combinação com outras aproximações (tais como aproximações de sub-unidade ou HBc) em uma estratégia de impulso primá- rio, com ou os vetores da invenção, ou as outras aproximações sendo usa- das como a primária, seguido pelo uso da outra aproximação como o impul- so, ou o reverso. Adicionalmente, a invenção inclui estratégias de impulso primário empregando os vetores da presente invenção como ambos agentes primário e de impulso. Desse modo, tais métodos podem envolver uma ad- ministração inicial de um vetor de acordo com a invenção, com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) seguido de administrações que podem ocorrer uma ou mais semanas, meses, ou anos após a administração inicial.
Os vetores da invenção podem ser administrados em indivíduos, tais como mamíferos (por exemplo, indivíduos humanos) usando métodos padrões. No caso de administração intranasal, os vetores podem ser admi- nistrados na forma de gotas no nariz, ou por inalação de uma formulação aerolizada ou nebulizada. Os vírus podem estar na forma Iiofilizada ou dis- solvida em uma solução fisiologicamente compatível ou tampão, tal como salina ou água. Métodos padrões de preparação e formulação podem ser usados conforme descrito, por exemplo, em Remingtoris Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Adicionalmente, a determinação de uma quantidade e regime de dosagem apropriado pode prontamente ser determinada pelo versado na técnica. Os vetores da invenção podem ser administrados a indivíduos, tais como humanos, como vacinas mortas ou vivas. As vacinas vivas podem ser administradas intranasalmente usando-se métodos conhecidos àqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Grunberg et ai, Am. J. Respir. Crit.
Car. Med. 156:609-616, 1997). Quantidades e regimes de dosagens apro- priados podem ser prontamente determinados por aqueles versados na téc- nica. Como um exemplo, a faixa de dose pode ser, por exemplo, 103 a 108 pfu por dose. A vacina pode vantajosamente ser administrada em uma dose simples, contudo, reforços podem ser efetuados também, se determinado ser necessário por aqueles versados na técnica. Como para vacinas inativa- das, o vírus pode ser morto com, por exemplo, formalina ou tratamento de UV, e administrado intranasalmente a cerca de 108 pfu por dose, opcional- mente com adjuvante apropriado (por exemplo, chitin ou mutante LT; ver acima). Em tais aproximações, pode ser vantajoso administrar mais do que uma (por exemplo, 2-3) doses.
A invenção é baseada, em parte, nos seguintes exemplos expe- rimentais.
Exemplos Experimentais I. Construção de HRV14-Nimll-M2e quimeras Foi construído vírus recombinantes de HRV14 Nimll-M2e. Os
vírus mostraram expressarem M2e na superfície do virion, conforme de- monstrado pela capacidade de anti-M2e Mab para neutralizar a infectividade dos vírus recombinantes.
Três tipos de construções de HRV14-M2e foram criados (figura 2).
1. HRV14-Nimll-23AA conduzindo o 23 AA de M2e inserido en- tre AA159 e 160 de VP2 (local Nimll);
2. Biblioteca de HRV14-Nimll-XXX23AA. Este conjunto de cons- truções (biblioteca de plasmídeo) foi similar à primeira construção, exceto
para a presença de um Iigador N-terminal randomizado 3-AA fundido ao peptídeo. Este Iigador randomizado foi gerado pela seqüência de M2e u- sando-se um iniciador 5' (direto) contendo 9 nucleotídeos randomizados que codificam os aminoácidos do ligador; e
3. Biblioteca de HRV14-Nimll-XXX17AA. Esta biblioteca foi ge- rada do mesmo modo como a primeira, mas continha um peptídeo de M2e encurtado contendo apenas o primeiro 17 AA de M2e.
Para facilitar o processo de clonagem no clone infeccioso de
HRV14, o clone infeccioso de pWR3.26 foi modificado pela substituição de seu suporte de plasmídeo de pUC com aquele do vetor de pEt (Novagen). O plasmídeo de pWR1 resultante (figura 2) é mais estavelmente mantido em E. coli e mais fácil de manipular. A morfologia de placa de bibliotecas de ví- rus n° 2 e n° 3 diferida daquela do HRV14 original (figura 2B). O tamanho da placa das bibliotecas parece ser similar ao tipo selvagem, mas as placas eram opacas. A construção n° 1 não forma placas após transfecção.
Para monitorar estabilidade genética dos vírus construídos, nós incorporamos um local de clivagem de Xhol na parte intermediária da se- quência de M2e por mutagênese silenciosa. Um fragmento de RT-PCR obti- do de vírus contendo gene M2e que sofreu mutação é clivado por Xhol, en- quanto o produto de DNA correspondente produzido no HRV14 tipo selva- gem permanece não-digerido (figura 3). A construção quimérica de HRV14- Nimll-23AA (n° 1) resultou em vírus viável, mas preferivelmente vírus instá- vel. Conforme mostrado na figura 3, os dois produtos de digestão de Xhol de fragmento de "PCR A" são detectáveis somente na passagem 2, mas não nas passagens seguintes. As bibliotecas (n° 2) e (n° 3), ao contrário, mantêm estavelmente o inserto de M2e: fragmentos de "PCR B" obtidos de bibliotecas de vírus na 4a passagem em células H1 HeLa foram completa- mente digeridos por Xhol (figura 3). A instabilidade da construção n° 1 pode ser devido à interferência estérica do peptídeo inserido com o domínio de ligação de receptor (figura 4), que pode ser aliviado quando um ligador de- generado é provido, como nas construções n° 2 e n° 3. O ligador N-terminal randomizado pode ter re-direcionado o peptídeo para for à do canhão con- tendo o domínio de ligação de receptor que permite ligação eficiente do ví- rus a seu receptor (figura 4).
Foi efetuado estudos de neutralização com as bibliotecas de vírus com um anti-M2e Mab (14C2 MAb, Abcam1 Inc. Cat n° ab5416). A neu- tralização do vírus pode ser também usada como uma ferramenta para de- monstrar pureza das bibliotecas (isto é, a ausência de HRV14 tipo selva- gem). Os resultados de um teste de neutralização de redução de placa (PRNT) demonstraram especificidade extremamente alta e capacidade de neutralização de Mab 14C2 contra ambas as bibliotecas (figura 5).
Ambas as bibliotecas se mostraram serem extremamente sus- ceptíveis à neutralização pelo anti-M2e Mab (figura 5), enquanto o vírus de controle (pWR1) não foi neutralizado, mesmo na diluição mais baixa de 1:10 do Mab. Neutralização de cinqüenta por cento para ambas as bibliotecas foi observada à diluição de ~ 1:2.000.000 de anticorpo (concentração de esto- que de 14C2 foi 1 mg/ml). Tal neutralização eficiente dos vírus recombinan- tes mostrou que o peptídeo de M2e apresentado em Nimll de HRV14 está em uma conformação apropriada, facilmente reconhecível pelo anticorpo. II. Identificação de HRV14-Nimll-M2e recombinantes estáveis
Após 4 passagens em células H1 HeLa1 seis clones individuais de cada biblioteca foram purificados com placa e, após um adicional de 4 passagens, caracterizados por sequenciamento do inserto conduzido. Cada biblioteca deu origem a um clone viral dominante e que replica estavelmen- te. Todos os vírus isolados da biblioteca HRV14-Nimll-XXX23AA tinham a mesma seqüência de inserto, GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSD (SEQ ID NO: 12) com GHT como um Iigador N-terminal, pelo que todos os vírus a partir da biblioteca de HRV14-Nimll-XXX17AA exibiram a mesma seqüência, QPASLLTEVETPIRNEWGSR (SEQ ID NO: 13), mas com QPA como o Iiga- dor N-terminal. Todos os clones viáveis conduzindo o inserto 23 AA tinham uma substituição na posição de aminoácido 7 de uma tirosina para Iisina (posição 4 no inserto estranho de M2e). Os clones que conduzem o inserto de 17 AA todos continham seqüência de M2e tipo selvagem. Estes resulta- dos indicam que vírus HRV-M2e recombinantes geneticamente estáveis po- dem ser isolados. Em estudos adicionais in vivo, o potencial de HRV14- M2e(17AA) em proporcionar proteção contra cepa PR8 de gripe A foi avalia- do usando-se rota intraperitoneal de administração. III. Estudo in vivo com HRV14-Nimll-M2e recombinantes A. Experimento in vivo n° 1: Imunização intraperitoneal 1. Desenho experimental
Camundongos fêmeas Balb/c de 9 semanas de idade (8 ca- mundongos por grupo) foram preparados no dia O, em seguida reforçados no dia 21 por administração intraperitoneal com ou sucrose purificada HRV14-M2e(17AA; ver uma nota (4) para tabela 4) vírus a 5,0x106 pfu de HRV14-M2e(17 AA), 1,3x107 pfu de HRV14 parenteral, ou simulado (PBS) como controles negativos, misturados com 100 pg de adjuvante (hidróxido de alumínio) em um volume de 500 pL. Como um padrão ouro, um candida- to de vacina atual ACAM-FluA (partículas de núcleo recombinantes de He- patite B conduzindo 3 cópias de M2e) foi usado. O ultimo foi usado sozinho ou em combinação com HRV14-M2e ou HRV14 para preparo/reforço (tabela 4). Para demonstrar proteção, todos os camundongos foram submetidos a provocação com 4 LD50 de vírus de gripe A/PR/8/34 (H1N1) no dia 35. A morbidez e mortalidade foram monitoradas para 21 dias. Para testar o anti- corpo de soro contra o peptídeo conduzido, os camundongos foram sangra- dos antes da inoculação (linha base) e novamente no dia 33. Titulações de anticorpo específicas de M2e no soro foram determinadas por um ELISA estabelecido realizado em placas de microtitulação revestidas com peptídeo sintético de M2e. Titulações de M2e-específíco total IgG, Ig2a, e Ig2b foram determinadas.
2. Resultados
a. Imunogenicidade
i. IgG total em animais imunizados
Titulações de anticorpo específicas de M2e foram medidas para cada grupo usando amostras de soro reunidas (figura 6), bem como amos- tras de animal individuais (figura 7). Os resultados com amostras reunidas (figura 6) mostraram que preparo com HRV14 recombinante conduzindo o 17 AA M2e e reforço com ACAM-FluA induziu o mesmo nível de anticorpos como duas doses de partículas similares a vírus recombinante de núcleo- M2e de vírus da Hepatite B (10 pg/dose) (titulação de ponto final (ET) = 218.700). Reforço com ACAM-FluA induziu cerca de 100 vezes resposta específica de M2e mais alta quando preparado com HRV14-M2e(17AA) (grupo 4; ET=218.700) do que com vetor HRV14 (grupo 6; ET=2.700). Des- se modo, o efeito de preparo de HRV14-M2e é somente dependente do in- serto de M2e e não do vetor.
Baseado na suposição feita por Arnold et al., 2006 (Arnold, G. F. e Arnold, E. Chimeric Vírus Vaccine. 11/176,182[US 2006/0088549 A1], 1- 57. 4-27-2006. US. 7-7-2005), uma dose de imunização de 109 pfu de HRV14 corresponde a aproximadamente 10 pg de proteína. Nós estimamos grosseiramente que uma dose de imunização de vírus recombinante de HRV-M2e representa 10 ng de proteína. Levando-se em conta as diferenças na massa molecular e a multiplicidade de sub-unidades nas partículas de núcleo de Hepatite B recombinante, nós especulamos que uma dose de i- munização de HBc-M2e continha aproximadamente 10.000 vezes mais pro- teína M2e do que de HRV-M2e. Níveis de anticorpo comparáveis usando-se vetores de HRV talvez suportem um sistema de apresentação imunogênica usando-se uma metodologia de produção mais barata.
O nível de anticorpos de M2e foi inversamente proporcional a um número de doses de HRV14-M2e(17AA). De fato, três doses de vírus de HRV14-M2e(17AA) (grupo 1) induziram a resposta específica de M2-e mais baixa (ET=2.700), pelo que dois regimes de dose induziram 10 vezes mais alta (grupo 2; ET=24.300) e uma dose 3 vezes mais alta do que duas doses (grupo 5; ET=72.900). Para verificar se esta correlação é devido à imunida- de antivetor, nós testamos separadamente a resposta imune de todos os grupos para vetor de HRV14 (figura 7). Todos os três tipos de administra- ções de HRV14-M2e(17AA) (1, 2, ou 3 doses) mostraram níveis compará- veis de resposta específica de HRV14 (ET=72.900) (figura 7A). Este argu- mento contra imunidade de antivetor como uma razão para resposta imune diminuída para M2-e e sugere que administração de uma dose pode ser su- ficiente.
ELISA específico de M2e de amostras de soro individuais (figura 8) detectou as mesmas diferenças intragrupo conforme foram mostradas com amostras reunidas: os níveis de anticorpo médio em camundongos in- dividuais de grupos 4 e 7 foram significantemente mais altos do que para qualquer outro grupo estudado conforme foi mostrado em duas diluições de soro (1:300 e 1:2.700) ii. Subtipos lgG2a, lgG2b, e IgGI de anticorpos em animais i-
munizados
O isotipo Ab específico M2 dominante em camundongos vacina- dos de M2e foi mostrado ser lgG2b com algum lgG2a (Jegerlehner et aí., J. Immunol. 172.9:5598-5605, 2004). Estes dois isotipos foram mostrados se- rem os mediadores mais importantes de citotoxicidade dependente de anti- corpo (ADCC) em camundongos (Denkers et aí., J. Immunol. 135:2183, 1985), que é acreditado ser o maior mecanismo para proteção dependente de M2e. Neste estudo nós testamos grupo reunido e amostras de soro indi- viduais para titulações de isotipo de IgGI, lgG2a, e lgG2b. Os grupos 4 (preparo com HRV14-M2e (17AA)/reforço com A-
CAM-FIuA) e 7 (preparo/reforço com ACAM-FluA) demonstraram as titula- ções mais altas de anticorpos de IgGI e lgG2a entre outros grupos (figura 9). As titulações de IgGI foram significantemente mais altas no grupo 7 do que no grupo 4 (figura 9A e 9D), pelo que as titulações de lgG2a foram mais altas no grupo 4 (figura 9B e 9D), pelo que as titulações de lgG2b de ani- mais do grupo 7 foram mais altas do que no grupo 4 (figura 10). O anticorpo específico de M2e de isotipo lgG2a em camundongos imunizados é mostra- do na figura 11.
b. Morbidez e mortalidade Os camundongos foram monitorados para morbidez e mortali-
dade para 28 dias após provocação com cepa PR8. Conforme é mostrado na figura 12, o grupo 4 demonstrou a taxa de sobrevivência mais alta (80%) em comparação a todos os outros grupos estudados, pelo que o grupo 7 não mostrou diferença significante com controle negativo (PBS). O grupo 4 foi também um campeão em morbidez: as mudanças do peso corpóreo fo- ram significantemente menos dramáticas do que em todos os outros grupos (figura 13A, B). Desse modo, o vírus HRV14-M2e (17 AA) é altamente imunogê- nico e protetor em camundongos. Ele compara respostas ao regime de pro- teína recombinante tradicional e uma combinação dos dois em um regime de preparo-reforço. O ultimo demonstrou uma resposta imune significante- mente diferente do que a proteína recombinante sozinha: duas doses de HBc recombinante conduzindo M2e (Acam-FIuA) induziram subtipo de anti- corpo IgGI dominante, pelo que preparo com HRV14-M2e(17AA) e reforço com Acam-FIuA gerou um lgG2a como um isotipo dominante, que foi mos- trado ser importante para ADCC. Além disso, o ultimo grupo demonstrou
proteção mais alta sobre todos os outros grupos.
É importante notar que devido ao HRV notar réplica em camun- dongos, inoculação de HRV-M2e recombinantes neste modelo é com um adjuvante parenteral adequado e imunização simulada com uma vacina ina- tivada. Nós propomos avaliar ultimamente em humanos, duas opções: vaci-
na de vírus de HRV14-M2e recombinante viva e/ou vacina inativada (por exemplo, inativada por formalina) coadministrada com um adjuvante paren- teral licenciado tal como hidróxido de alumínio.
B. Experimento in vivo n° 2. Imunização intranasal
1. Vírus usados para imunização
Neste estudo in vivo, o potencial de HRV14-M2e (17AA) para
proporcionar proteção contra provocação não-mortal com cepa PR8 de Gri- pe A foi avaliado usando-se rota intranasal de administração. Nota: a se- qüência de HRV14-M2e (17AA) foi descrita acima.
2. Desenho experimental
Camundongos fêmeas Balb/c de 9 semanas de idade (8 ca-
mundongos por grupo) foram preparados no dia 0, em seguida reforçados nos dias 21 por administração intranasal com ou sucrose purificada HRV14- M2e(17AA) ou vírus HRV14 (ver uma nota (3) para tabela 5) a 108 pfu por dose (grupos 3-6), misturados com 5 pg de Toxina Instável ao Calor de E.
coli (LT) adjuvante em um volume de 50 μ!_. Como um padrão ouro, uma vacina compreendendo partículas de núcleo de Hepatite B recombinante conduzindo 3 cópias de M2e (AcamFIuA) foi usada. A última foi usada sozi- nha ou em combinação com HRV14-M2e ou HRV14 para preparo/reforço (tabela 5). Para demonstrar proteção, todos os camundongos foram subme- tidos à provocação com 4 LD50 de vírus de gripe A/PR/8/34 (H1N1) no dia 35. Morbidez e mortalidade foram monitoradas por 21 dias. Para testar o anticorpo de soro contra o peptídeo conduzido, os camundongos foram san- grados antes da inoculação (linha base) e novamente no dia 33. Titulações de anticorpo específico de M2e no soro foram determinadas por um ELISA estabelecido realizado em placas de microtitulação revestidas com M2e sin- tético. Titulações de M2-e específico total de IgG, Ig2a, e Ig2b foram deter- minadas.
3. Resultados
a. Imunogenicidade
i. Titulações de anticorpo específico de M2e
Titulações de anticorpo foram medidas para cada grupo usando- se amostras de soro reunidas (figura 14). Uma dose de HRV14 recombinan- te conduzindo o 17 AA M2e e um reforço com ACAM-FluA induziu níveis compráveis de IgG total como duas doses de partículas similares a vírus recombinante de M2e-núcleo de vírus de Hepatite B (10 ug/dose) (titulação de ponto final (ET) > 218.700; figura 14A). Os últimos resultados são consis- tentes com os dados obtidos com rota IP de imunização. Uma dose de HRV14-M2e induziu nível comparável de IgG total específico de M2e como uma dose de AcamFIuA (ET=24.300). Uma diminuição duas vezes na carga de vírus de HRV14-M2e não tinha tido muito de um efeito no nível de IgG total (grupo 7; ET-=24.300). Como no caso de administração de IP, preparo com HRV14-
M2e e reforço com AcamFIuA gerou o nível mais alto de lgG2a (figura 14C; ET»218,700). Uma dose de HRV14-M2e induziu nível levemente mais alto de lgG2a do que uma dose de AcamFIuA (ET=72,900 vs ET=24,300). As titulações mais altas lgG2b (figura 14B) e IgGI (figura 14D) foram demons- tradas para duas doses de AcamFIuA.
b. Morbidez
Camundongos foram monitorados para morbidez por 17 dias após provocação não-mortal com cepa PR8 (figura 15). Uma dose de HRV14-M2e proporcionou a proteção comparável de doença como duas doses de AcamFIuA ou preparo com HRV14-M2e e reforço com AcamFIuA. Os camundongos no grupo 2 (uma dose de AcamFIuA) mostraram sinais significantes de doença. O grupo de controle (grupo 4) demonstrou perda de peso corpóreo severa durante os primeiros 9 dias após provocação.
IV. Novo imunogene de neutralização dominante (NimIV) em vírus HRV14, um local de inserção recentemente descoberto de epítopes estranhos
Nós identificamos um novo imunogene de neutralização de
HRV: Imunogene de Neutralização ]V (NimIV). Ele pode ser usado para o desenvolvimento de vacinas recombinantes de inserção de epítope. NimIV é altamente imunogênico, induzindo titulações de neutralização de vírus altas em camundongos. NimIV de HRVs envolve uma região C-terminal da prote- ína estrutural VP1. Este epítope pode ser trocado entre sorotipos de HRV diferentes. Se NimIV de um HRV é introduzido em outro vírus de sorotipo, ele confere no recombinante quimérico resultante as características de neu- tralização do sorotipo doador. Peptídeos de NimIV sintéticos foram mostra- dos serem eficientemente reconhecidos por anticorpos específicos de soro- tipo correspondentes em experimentos de ELISA e mancha de Western. Especificamente, uma quimera de HRV14-NimlVHRV6 foi produzida pela substituição do NimlVHRV14 em HRV14 com NimIV de vírus de HRV6. Este vírus foi eficientemente neutralizado com anticorpos policlonais anti-HRV6 e também induziram respostas de neutralização de anti-HRV6 em camundon- gos. A titulação de neutralização de 50% de soro de camundongos imuniza- dos com HRV14-NimlVHRV6 foi - 1:800 contra vírus de HRV6, e somente 1:400 contra HRV14 (figura 16). Para comparação, titulação de neutraliza- ção de 50% de soro anti-HRV14 de camundongo contra vírus homólogo é 1:1400, mostrando que o NimIV específico de HRV6 reduziu significante- mente a eficiência de neutralização de vírus por anticorpos contra o HRV14 Nims remanescente (I, II, e III).
V. Modelo de provocação de gripe em camundongo A eficiência protetora de candidatos de vacina pode ser testada em um modelo de provocação de gripe de camundongo usando-se cepas de vírus apropriadas. A cepa de provocação de gripe de prototipo usada em nossos estudos é cepa adaptada de camundongo A/PR/8/34 (H1N1). O ví- rus foi obtido de American Type Culture Collection (número de catálogo VR- 1469, lote número 2013488) e adaptado para crescimento in vivo por pas- sagem serial em camundongos Balb/c. Para passagem de camundongo, o vírus foi inoculado intranasalmente e homogenados de tecido de pulmão foram preparados 3 dias mais tarde. O homogenado foi passado encoberto em camundongos adicionais através da passagem 5. Uma passagem adi- cional foi usada para preparar alíquotas de homogenado de pulmão que serve como o estoque de provocação.
Para provocação de camundongos, o vírus é distribuído intrana- salmente em um volume de 50 μΙ_. Os camundongos são anestesiados du- rante inoculação para inibir o reflexo de mordaça, e permitir passagem do vírus nos pulmões. Os camundongos infectados com uma dose letal perde- ram peso rapidamente, e muitos morreram 7-9 dias após inoculação. A dose letal média (LD50) de vírus adaptado de camundongo A/PR/8/34 foi determi- nada para ser 7,5 unidades de formação de placa (pfu) em camundongos adultos Balb/c. Os resultados para um experimento de proteção típico são mostrados na figura 17. Os grupos de 10 camundongos foram ou imuniza- dos com adjuvante de hidróxido de alumínio ou imunizados com 10 pg de imunogênio de peptídeo de M2e de gripe misturado com hidróxido de alumí- nio. O imunogênio consiste em partículas similares a vírus de proteína de núcleo de hepatite B que expressam peptídeo de M2e. Os camundongos foram imunizados duas vezes em intervalos de 3 semanas, e provocados intranasalmente 4 semanas mais tarde com 4 LD50 de vírus adaptado de camundongo A/PR/8/34. Todos os camundongos no grupo imunizado simu- lado morreram pelo 10° dia após provocação, enquanto somente 1 camun- dongo morreu no grupo imunizado. A perda no peso ocorreu após provoca- ção em ambos os grupos, mas foi maior no grupo imunizado simulado.
Outras cepas de vírus da gripe serão similarmente adaptadas para crescer em pulmões de camundongo. Em alguns casos, as cepas po- dem ser usadas sem adaptação in vivo, e podem não se tornarem suficien- temente patogênicas mesmo após passagem serial no pulmão. Neste caso, preferivelmente do que medindo a morbidez e mortalidade, será medida a replicação do vírus no pulmão e tecidos turbinados nasais. Os tecidos são cultivados 3 dias após provocação, rompidos por sonicação em 1 ml de meio de cultura de tecido, e titulados para concentração de vírus por placa ou ensaio de TCID50.
Tabela 1 - Lista de exemplos de patogenias das quais epíto- pes/antígenos/peptídeos podem ser derivados VÍRUS: Flaviviridae
Vírus da Febre Amarela Vírus da Encefalite Japonesa Vírus da Dengue, tipos 1, 2, 3 & 4
Vírus de West Nile
Vírus de Encefalite de Suporte Espesso
Vírus de Hepatite C (por exemplo, genótipos 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 4a, 4b, 4c, e4d) Papoviridae:
Papilomavírus
Retroviridae
Vírus da Imunodeficiência Humana, tipo I Vírus da Imunodeficiência Humana, tipo Il Vírus da Imunodeficiência de Símio
Vírus de linfócito T Humano, tipos I & Il Hepnaviridae
Vírus da Hepatite B Picornaviridae Vírus da Hepatite A
Rinovírus Poliovírus Herpesviridae:
Vírus da Herpes simplex, tipo I Vírus da Herpes simplex, tipo Il Citomegalovírus Vírus de Epstein Barr
Vírus de Varicella-Zoster
Togaviridae
Alfavírus Vírus da Rubeola Paramixoviridae:
Vírus Respiratório sincitial Paravírus da gripe Vírus de Sarampo Vírus de Mumps Ortomixoviridae
Vírus da gripe
Filoviridae
Vírus de Marburg Vírus Ebola
Rotoviridae:
Rotavírus Coronaviridae
Coronavírus Adenoviridae Adenovírus
Rhabdoviridae
Rabiesvírus
BACTÉRIA: Enterotoxigênica E. coli Enteropatogênica E. coli Campylobacter jejuni Helicobacter pylori Salmonella typhi Vibrio cholerae Clostridium difficile Clostridium tetani Streptococccus pyogenes Bordetella pertussis Neisseria meningitides Neisseria gonorrhoea Legionella neumophilus Clamydial spp. Haemophilus spp. Shigella spp. PARASITAS: Plasmodium spp. Schistosoma spp. Trypanosoma spp. Toxoplasma spp. Cryptosporidia spp. Pneumocystis spp. Leishmania spp.
Tabela 2 - Exemplos de antígenos selecionados de vírus listados VÍRUS ANTÍGENO
Flaviviridae
Vírus da Febre Amarela Nucleocapsid, M & E glicoproteínas
Vírus de Encefalite Japonesa
Vírus da Dengue, tipos 1, 2, 3 & 4 Vírus de West Nile
Vírus de Eneefalite de Suporte Espesso
Vírus de Hepatite C Nucleocapsid, E1 & E2 glicoproteínas
Papoviridae:
Papilomavírus protepina capsid L1 & L2, proteína
de transformação E6 & E7 (oncop- genes)
Retroviridae
Vírus da Imunodeficiência Himana, tipo I gag, pol, vif, tat, vpu, env, nef Vírus da Imunodeficiência Humana, tipo Il Vírus da Imunodeficiência de Símio Vírus de linfócito T humano, tipos I & Il gag, pol, env Tabela 3 - Exemplos de epítopes de célula B e T de vírus/antígenos listados
VIRUS ANTÍ-
GENO
Flaviviridae
Hepatite C Nucleo- capsid
E1 gli- CTL
coprote-
ína
E2 gli- CTL
coprote-
ína
EPÍTO- LOCALI- SEQÜÊNCIA (5'-3Ί PE ZACÃO
CTL 2-9 STNPKPQR (SEQID NO: 14)
35-44 YLLPRRGPRL (SEQ ID NO: 15) 41-49 GPRLGVRAT (SEQ ID NO: 16) 81-100 YPWPLYGNEGCGWAGWLLSP
(SEQ ID NO: 17) 129-144 GFADLMGYIPLVGAPL (SEQ IDNO: 18)
132-140 DLMGYIPLV (SEQ IDNO: 19) 178-187 LLALLSCLTV (SEQ ID NO: 20) 231-250 REGNASRCWVAVTPTVATRD (SEQ ID NO: 21)
Bcell
686-694 STGLIHLHQ (SEQ IDNO: 22)
725-734 LLADARVCSC (SEQ ID NO: 23) 489-496 CWHYPPRPCGI (SEQ ID NO: 24) 569-578 CVIGGVGNNT (SEQ ID NO: 25) 460-469 RRLTDFAQGW (SEQ ID NO: 26) 621-628 TlNYTIFK (SEQ ID NO: 27) 384-410 ETH VTG G NAG RTTAG LVG L-
LTPGAKQN (SEQ ID NO: 28) 411 -437 IQLINTNGSWHINSTALNCNES-
LNTGW (SEQ ID NO: 29) 441-460 LFYQHKFNSSGCPERLASCR
(SEQ ID NO: 30) 511 -546 PSPVWGTTDRSGAPTYSW-
GANDTDVFVLNNTRPPL (SEQ ID Papoviridae
HPV 16 Ε7
HPV 18
Ε7
auxilia- dor T
411-416
auxilia- dor T
auxilia- dor T
CTL 49-57 célula B 10-14 38-41
44-48 44-55
NO: 31)
IQLINT (SEQIDNO: 32)
48-54 DRAHYNI (SEQ ID NO: 33)
RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 34) EYMLD (SEQ ID NO: 35) IDGP (SEQ IDNO: 36) QAEPD (SEQ ID NO: 37) VNHQHLPARRA (SEQ ID NO: 38)
81-90 DDLRAFQQLF (SEQ ID NO: 39) Tabela 4. Grupos de imunização (Estudo Intraperitoneal)
Número do grupo Número de animais Preparo Reforço Adj Dosagem (dias) 1 8 HRV14- M2e(17AA) HRV14- M2e(17AA) Alum 0,7,21 2 8 HRV14 M2e(17AA) HRV14- M2e(17AA) Alum 0,21 3 8 HRV14 HRV14 Alum 0,21 4 8 HRV14- M2e(17AA) ACAM-FluA Alum 0,21 8 HRV14- M2e(17AA) HBcAg Alum 0,21 6 8 HRV14 ACAM-FluA Alum 0,21 7 8 ACAM-FluA ACAM-FluA Alum 0,21 8 8 HBcAg HBcAg Alum 0,21 9 8 PBS PBS Alum 0,21
Notas para tabela 4:
(1) ACAM-FIuA - é uma vacina candidata de Gripe A universal atual baseada no antígeno de núcleo de Hepatite B (HBc) que conduz três cópias de peptídeo 23 AA M2-e; usada como um padrão ouro; a dose = 10 pg por camundongo
(2) HBcAg é um antígeno de HBc "descoberto"; usado como controle transportador para ACAM-FluA; a dose = 10 pg por camundongo (3) HRV14 é HVR14 "tipo selvagem" produzido de clone infec- cioso pWR3.26 (ATCC); usado como um controle transportador para HRV14-M2e(17AA)
(4) HRV14M2e(17AA) é vírus HRV14 conduzindo seqüência QPASLLTEVETPIRNEWGSR (SEQ ID NO: 13) entre 159 AA e 160AA de
VP2 (local de Nimll). Os primeiros três aminoácidos (QPA) deste inserto re- presentam um Iigador único selecionado de biblioteca HRV14M2eXXX(17AA) conforme descrito anteriormente
(5) ADJ= adjuvante (alum foi usado em todas as imunizações) (6) Todos os grupos foram imunizados por administração intraperitoneal
Tabela 5. Grupos de imunização (Estudo Intranasal)
Número de grupo Número de animais Preparo Reforço Adj Dosagem (dias) 1 8 AcamFIu-A AcamFIuA LT 0,21 2 8 AcamFIu-A LT 0 3 8 HRV14- M2e(17AA) LT 0 4 8 HRV14 LT 0 8 HRV14- M2e(17AA) AcamFIuA LT 0,21 6 8 HRV14 ACAM-FluA LT 0,21
Notas para tabela 5:
(1) ACAM-FluA - é uma vacina de Gripe A baseada no antígeno de núcleo de Hepatite B (HBc) que conduz três cópias de peptídeo 23 AA
M2-e; usada como um padrão ouro; a dose = 10 pg por camundongo
(2) HRV14 é HVR14 "tipo selvagem" produzido de clone infec- cioso pWR3.26 (ATCC); usado como um controle transportador para HRV14-M2e(17AA)
(3) HRV14M2e(17AA) é vírus HRV14 conduzindo seqüência QPASLLTEVETPIRNEWGSR (SEQ ID NO: 13) entre 159 AA e 160AA de
VP2 (local de Nimll). Os primeiros três aminoácidos (QPA) deste inserto re- presentam um Iigador único selecionado de uma biblioteca HRV14M2eXXX(17AA) conforme descrito anteriormente
(5) ADJ= adjuvante (LT - Toxina Instável ao Calor de E. coli) (6) Todos os grupos foram imunizados por administração intra-
nasal
(7) Grupos 3, 4, 5, e 6 foram imunizados com vírus correspon- dentes a 108 pfu por dose
Outras Concretizações
Todas as publicações e patentes citadas neste relatório descriti- vo são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual ou patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. O uso de formas singulares aqui, tais como "um" e "o," não exclui indicação da forma plural correspondente, a menos que o contexto indique ao contrário. Embora a invenção tenha sido descrita em algum deta- lhe por meio de ilustração e exemplo para proposta de clareza de compre- ensão, será prontamente aparente àqueles versados na técnica à luz dos ensinamentos da invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem fugir do espírito ou escopo das reivindicações em a- nexo.
Outras concretizações estão dentro das reivindicações que se
seguem.
Referências
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<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 1
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20
<210> 2 <211> 8 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe aviária) <400> 2
Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe aviária) <4 00> 3
Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn 1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Rhinovírus (rhinovirus humano) <400> 4
Asn Thr Glu Pro Val Ile Lys Lys Arg Lys Gly Asp Ile Lys Ser Tyr
1 5 10 15
< 210 > 5 <211> 24
<212> PRT
<213> Virus da gripe Α, B (vírus da gripe humana)
<4 00> 5
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
20
<210> 6 <211> 24 <212> PRT
<213> Virus da gripe A, B (vírus da gripe aviária; vírus da gripe humana) <4 00> 6
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 7
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20
<210> 8 <211> 17 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 8
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15
Arg
<210> 9 <211> 6 <212> PRT
<213> Vírus da gripe B (vírus da gripe humana)
<4 00> 9
Met Leu Glu Pro Phe Gln 1 5
<210> 10 <211> 20 <212> PRT
<213> Vírus da gripe B (vírus da gripe humana) <4 00> 10
Met Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His 10 15
Ile Arg Gly Ser 20
<210> 11 <211> 20 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16) <4 00> 11
Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile 1 5 10 15
Ile Pro Lys Val 20
<210> 12 <211> 26 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Sintético <4 00> 12
Gly His Thr Ser Leu Leu Lys Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 10 15
Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 25
<210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Sintético
< 4 00> 13
Gln Pro Ala Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 10 15
Trp Gly Ser Arg 20
<210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 14
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg 1 5
<210> 15 <211> 10 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 15
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu 10
<210> 16 <211> 9 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 16
Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 1 5
<210> 17 <211> 20 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 17
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp
1 5 10 15
Leu Leu Ser Pro 20
<210> 18 <211> 16 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 18 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 10 15
<210> 19 <211> 9 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 19
Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val 1 5
<210> 20 <211> 10 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 20
Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val 10
<210> 21 <211> 20 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 21
Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Val Thr Pro Thr Val 10 15
Ala Thr Arg Asp
20
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C)
<4 00> 22
Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 23
Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys 10
<210> 24 <211> 11 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 24
Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly I] 10
<210> 25 <211> 10 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 25
Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr 10
<210> 26 <211> 10 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 26
Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala Gln Gly Trp 10
<210> 27 <211> 8 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 27
Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys 1 5
<210> 28 <211> 27 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 28
Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu 10 15
Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn 25
<210> 29 <211> 27 <212> PRT
<213> Flavivirus (virus da hepatite C) <4 00> 29
Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala 10 15
Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp 25
<210> 30 <211> 20 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 30
Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu 10 15
Ala Ser Cys Arg 20
<210> 31 <211> 36 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <400> 31
Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr
25 30
Arg Pro Pro Leu
35
<210> 32 <211> 6 <212> PRT
<213> Flavivírus (vírus da hepatite C) <4 00> 32 Ile Gln Leu Ile Asn Thr 1 5
<210> 33 <211> 7 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16) <400> 33
Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16) <4 00> 34
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 35 <211> 5 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16)
<4 00> 35
Glu Tyr Met Leu Asp 1 5
<210> 36 <211> 4 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16) <4 00> 36 Ile Asp Gly Pro 1
<210> 37 <211> 5 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 16) <4 00> 37
Gln Ala Glu Pro Asp 1 5
<210> 38 <211> 11 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 18) <400> 38
Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala 10
<210> 39 <211> 10 <212> PRT
<213> Vírus da papiloma (vírus da papiloma humana 18) <4 00> 39
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe 10
<210> 40 <211> 5 <212> PRT
<213> Rhinovírus (rhinovirus humano) <400> 40
Ser Ala Asn Glu Val 1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Rhinovirus (rhinovirus humano) <4 00> 41
Asn Ala Asn Arg Gln Asn Glu
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Rhinovirus (rhinovirus humano)
<4 00> 42
Asp Asn His Arg Glu 1 5
<210> 43 <211> 16 <212> PRT
<213> Rhinovirus (rhinovirus humano) <400> 43
Asn Thr Glu Pro Val Ile Lys Lys Arg Lys Gly Asp Ile Lys Ser Tyr 10 15
<210> 44 <211> 2628 <212> DNA <213> Quimera de vírus da gripe A, B / Rhinovírus <400> 44
atgggcgctc aggtttctac acagaaaagt ggatctcacg aaaatcaaaa cattttgacc 60
aatggatcaa atcagacttt cacagttata aattactata aggatgcagc aagtacatca 120
tcagctggtc aatcactgtc aatggaccca tctaagttta cagaaccagt taaagatctc 180
atgcttaagg gtgcaccagc attgaattca cccaatgttg aggcctgtgg ttatagtgat 240
agagtacaac aaatcacact cgggaattca acaataacaa cacaagaagc agccaacgct 300
gttgtgtgtt atgctgaatg gccagagtac cttccagatg tggacgctag tgatgtcaat 360
aaaacttcaa aaccagacac ttctgtctgt aggttttaca cattggatag taagacatgg 420
acaacaggtt ctaaaggctg gtgctggaaa ttaccagatg cactcaaaga tatgggtgtg 480
ttcgggcaaa acatgttttt ccactcacta ggaagatcag gttacacagt acacgttcag 540
tgcaatgcca caaaattcca tagcggttgt ctacttgtag ttgtaatacc agaacaccaa 600
ctggcttcac atgagggtgg caatgtttca gttaaataca cattcacgca tccaggtgaa 660
cgtggtatag atttatcatc tgcacagccc gcatcattat taacagaagt tgaaacacca 720
ataagaaatg aatggggctc gagaaatgaa gtgggagggc ctgtcaagga tgtcatatac 780
aatatgaatg gtactttatt aggaaatctg ctcattttcc ctcaccagtt cattaatcta 840
agaaccaata atacagccac aatagtgata ccatacataa actcagtacc cattgattca 900
atgacacgtc acaacaatgt ctcactgatg gtcatcccta ttgcccctct tacagtacca 960
actggagcaa ctccctcact ccctataaca gtcacaatag cacctatgtg cactgagttc 1020
tctgggataa ggtccaagtc aattgtgcca caaggtttgc caactacaac tttgccgggg 1080
tcaggacaat tcttgaccac agatgacagg caatccccca gtgcactgcc aaattatgag 1140
ccaactccaa gaatacacat accagggaaa gttcataact tgctagaaat tatacaggta 1200
gatacactca ttcctatgaa caacacgcat acaaaagatg aggttaacag ttacctcata 1260
ccactaaatg caaacaggca aaatgagcag gtttttggga caaacctgtt tattggtgat 1320
ggggtcttca aaactactct tctgggtgaa attgttcagt actatacaca ttggtctgga 1380
tcacttagat tctctttgat gtatactggt cctgccttgt ccagtgctaa actcattcta 1440
gcatacaccc cgcctggtgc tcgtggtcca caggacagga gagaagcaat gctaggtact 1500
catgttgtct gggatattgg tctgcaatcc accatagtaa tgacaatacc atggacatca 1560
ggggtgcagt ttagatatac tgatccagat acatacacca gtgctggctt tctatcatgt 1620
tggtatcaaa cttctcttat acttccccca gaaacgaccg gccaggtcta cttattatca 1680
ttcataagtg catgtccaga ttttaagctt aggctgatga aagatactca aactatctca 1740
cagactgttg cactcactga aggcttaggt gatgaattag aagaagtcat cgttgagaaa 1800 acgaaacaga cggtggcctc aatctcatct ggtccaaaac acacacaaaa agtccccata 1860
ctaactgcaa acgaaacagg ggccacaatg cctgttcttc catcagacag catagaaacc 1920
agaactacct acatgcactt taatggttca gaaactgatg tagaatgctt tttgggtcgt 1980
gcagcttgtg tgcatgtaac tgaaatacaa aacaaagatg ctactggaat agataatcac 2040
agagaagcaa aattgttcaa tgattggaaa atcaacctgt ccagccttgt ccaacttaga 2100
aagaaactag aactcttcac ttatgttagg tttgattctg agtataccat actggccact 2160
gcatctcaac ctgattcagc aaactattca agcaatttgg tggtccaagc catgtatgtt 2220
ccacctggtg ccccgaatcc aaaagagtgg gacgattaca catggcaaag tgcttcaaac 2280
cccagtgtat tcttcaaggt gggggataca tccaggttta gtgtgcctta tgtaggattg 2340
gcatcagcat ataattgttt ttatgatggt tactcacatg atgatgcaga aactcagtat 2400
ggcataactg ttctaaacca tatgggtagt atggcattca gaatagtaaa tgaacatgat 24 60
gaacataaaa ctcttgtcaa gatcagagtt tatcacaggg caaagcacgt tgaagcatgg 2520
attccaagag cacccagagc actaccctac acatcaatag ggcgcacaaa ttatcctaag 2580
aatacagaac cagtaattaa gaagaggaaa ggtgacatta aatcctat 2628
<210> 45
<211> 2646 <212> DNA
<213> Quimera de vírus da gripe A,B / Rhinovirus <400> 45
atgggcgctc aggtttctac acagaaaagt ggatctcacg aaaatcaaaa cattttgacc 60
aatggatcaa atcagacttt cacagttata aattactata aggatgcagc aagtacatca 120
tcagctggtc aatcactgtc aatggaccca tctaagttta cagaaccagt taaagatctc 180
atgcttaagg gtgcaccagc attgaattca cccaatgttg aggcctgtgg ttatagtgat 240
agagtacaac aaatcacact cgggaattca acaataacaa cacaagaagc agccaacgct 300
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gcccctctta cagtaccaac tggagcaact ccctcactcc ctataacagt cacaatagca 1020
cctatgtgca ctgagttctc tgggataagg tccaagtcaa ttgtgccaca aggtttgcca 1080
actacaactt tgccggggtc aggacaattc ttgaccacag atgacaggca atcccccagt 1140
gcactgccaa attatgagcc aactccaaga atacacatac cagggaaagt tcataacttg 1200
ctagaaatta tacaggtaga tacactcatt cctatgaaca acacgcatac aaaagatgag 1260
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caggtctact tattatcatt cataagtgca tgtccagatt ttaagcttag gctgatgaaa 1740
gatactcaaa ctatctcaca gactgttgca ctcactgaag gcttaggtga tgaattagaa 1800
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acacaaaaag tccccatact aactgcaaac gaaacagggg ccacaatgcc tgttcttcca 1920
tcagacagca tagaaaccag aactacctac atgcacttta atggttcaga aactgatgta 1980
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<213> Virus da gripe Α, B (vírus da gripe humana) <400> 46
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 10 15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20
<210> 47 <211> 23 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 47
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20
<210> 48 <211> 23 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <400> 48
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys 10 15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20
<210> 49 <211> 23 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 49 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20
<210> 50
<211> 7212 <212> DNA
<213> Rhinovírus (rhinovírus humano) <400> 50
ttaaaacagc ggatgggtat cccaccattc gacccattgg gtgtagtact ctggtactat 60 gtacctttgt acgcctgttt ctccccaacc acccttcctt aaaattccca cccatgaaac 120 gttagaagct tgacattaaa gtacaatagg tggcgccata tccaatggtg tctatgtaca 180
agcacttctg tttccccgga gcgaggtata ggctgtaccc actgccaaaa gcctttaacc 240
gttatccgcc aaccaactac gtaacagtta gtaccatctt gttcttgact ggacgttcga 300
tcaggtggat tttccctcca ctagtttggt cgatgaggct aggaattccc cacgggtgac 360
cgtgtcctag cctgcgtggc ggccaaccca gcttatgctg ggacgccctt ttaaggacat 420
ggtgtgaaga ctcgcatgtg cttggttgtg agtcctccgg cccctgaatg cggctaacct 480
taaccctgga gccttatgcc acgatccagt ggttgtaagg tcgtaatgag caactccggg 540
acgggaccga ctactttggg tgtccgtgtt tctcattttt cttcatattg tcttatggtc 600
acagcatata tatacatata ctgtgatcat gggcgctcag gtttctacac agaaaagtgg 660
atctcacgaa aatcaaaaca ttttgaccaa tggatcaaat cagactttca cagttataaa 720
ttactataag gatgcagcaa gtacatcatc agctggtcaa tcactgtcaa tggacccatc 780
taagtttaca gaaccagtta aagatctcat gcttaagggt gcaccagcat tgaattcacc 840
caatgttgag gcctgtggtt atagtgatag agtacaacaa atcacactcg ggaattcaac 900
aataacaaca caagaagcag ccaacgctgt tgtgtgttat gctgaatggc cagagtacct 960
tccagatgtg gacgctagtg atgtcaataa aacttcaaaa ccagacactt ctgtctgtag 1020
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atacataaac tcagtaccca ttgattcaat gacacgtcac aacaatgtct cactgatggt 1500
catccctatt gcccctctta cagtaccaac tggagcaact ccctcactcc ctataacagt 1560
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aggtttgcca actacaactt tgccggggtc aggacaattc ttgaccacag atgacaggca 1680
atcccccagt gcactgccaa attatgagcc aactccaaga atacacatac cagggaaagt 1740
tcataacttg ctagaaatta tacaggtaga tacactcatt cctatgaaca acacgcatac 1800
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tgttcagtac tatacacatt ggtctggatc acttagattc tctttgatgt atactggtcc 1980
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tgaattagaa gaagtcatcg ttgagaaaac gaaacagacg gtggcctcaa tctcatctgg 2400
tccaaaacac acacaaaaag tccccatact aactgcaaac gaaacagggg ccacaatgcc 2460
tgttcttcca tcagacagca tagaaaccag aactacctac atgcacttta atggttcaga 2520
aactgatgta gaatgctttt tgggtcgtgc agcttgtgtg catgtaactg aaatacaaaa 2580
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atcaataggg cgcacaaatt atcctaagaa tacagaacca gtaattaaga agaggaaagg 3180
tgacattaaa tcctatggtt taggacctag gtacggtggg atttatacat caaatgttaa 3240
aataatgaat taccacttga tgacaccaga agaccaccat aatctgatag caccctatcc 3300 aaatagagat ttagcaatag tctcaacagg aggacatggt gcagaaacaa taccacactg 3360
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aggagtgatg aaaggggttg ggccagcaga accaggagac tgcggtggga ttttgagatg 3540
catacatggt cccattggat tgttaacagc tggaggtagt ggatatgttt gttttgctga 3600
catacgacag ttggagtgta tcgcagagga acaggggctg agtgattaca tcacaggttt 3660
gggtagagct tttggtgtcg ggttcactga ccaaatctca acaaaagtca cagaactaca 3720
agaagtggcg aaagatttcc tcaccacaaa agttttgtcc aaagtggtca aaatggtttc 3780
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tcaggtgcct tacattgaaa gacaagcaaa tgatggatgg ttcagaaagt ttaatgatgc 3960
atgtaatgct gcaaagggat tggaatggat tgctaataag atttccaaac tgattgaatg 4020
gataaaaaac aaagtacttc cccaagccaa agaaaaacta gaattttgta gtaaactcaa 4080
acaacttgat atactagaga gacaaataac caccatgcat atctcgaatc caacacagga 4140
aaaacgagag cagttgttca acaacgtatt gtggttggaa caaatgtcgc aaaagtttgc 4200
cccacattat gccgttgaat caaaaagaat cagggaactc aagaacaaaa tggtaaatta 4260
tatgcaattt aaaagtaaac aaagaactga accagtgtgt gtattaatcc atggtacacc 4320
cggttctggt aaatcattaa caacatccat tgtgggacgt gcaattgcag aacacttcaa 4380
ttcagcagta tattcacttc caccagatcc caagcacttt gatggttatc agcaacagga 4440
agttgtgatt atggatgatc tgaaccaaaa tccagatgga caggatataa gcatgttttg 4500
tcaaatggtt tcttcagtgg atttcttgcc tccaatggct agtttagata acaagggcat 4560
gttattcacc agtaattttg ttctagcctc cacaaattct aacacactaa gccccccaac 4620
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tactacctac acaaagaatg gaaaactcaa tgcaggcatg tcaaccaaga catgcaaaga 4740
ttgccatcaa ccatctaatt tcaagaaatg ttgccccctg gtctgtggaa aagctattag 4800
cttggtagac agaactacca acgttaggta tagtgtggat caactggtca cagctattat 4860
aagtgatttc aagagcaaaa tgcaaattac agattcccta gaaacactgt ttcaaggacc 4920
agtgtataaa gatttagaga ttgatgtttg caacacacca cctccagaat gtatcaacga 4980
tttactgaaa tctgtagatt cagaagagat tagggaatat tgtaagaaga agaaatggat 5040
tatacctgaa attcctacca acatagaaag ggctatgaat caagccagca tgattattaa 5100
tactattctg atgtttgtca gtacattagg tattgtttat gtcatttata aattgtttgc 5160
tcaaactcaa ggaccatatt ctggtaaccc gcctcacaat aaactaaaag ccccaacttt 5220 acgcccagtt gttgtgcaag gaccaaacac agaatttgca ctatccctgt taaggaaaaa 5280
cataatgact ataacaacct caaagggaga gttcacaggg ttaggcatac atgatcgtgt 5340
ctgtgtgata cccacacacg cacagcctgg tgatgatgta ctagtgaatg gtcagaaaat 5400
tagagttaag gataagtaca aattagtaga tccagagaac attaatctag agcttacagt 5460
gttgacttta gatagaaatg aaaaattcag agatatcagg ggatttatat cagaagatct 5520
agaaggtgtg gatgccactt tggtagtaca ttcaaataac tttaccaaca ctatcttaga 5580
agttggccct gtaacaatgg caggacttat taatttgagt agcaccccca ctaacagaat 5640
gattcgttat gattatgcaa caaaaactgg gcagtgtgga ggtgtgctgt gtgctactgg 5700
taagatcttt ggtattcatg ttggcggtaa tggaagacaa ggattttcag ctcaacttaa 5760
aaaacaatat tttgtagaga aacaaggcca agtaatagct agacataagg ttagggagtt 5820
taacataaat ccagtcaaca cgccaaccaa gtcaaaatta catcccagtg tattctatga 5880
tgttttccca ggtgacaagg aacctgctgt attgagtgac aatgatccca gactggaagt 5940
taaattgact gaatcattat tctctaagta caaggggaat gtaaatacgg aacccactga 6000
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ttctgaactt acactaaaag aagcattata tggagtagat ggactagaac ctatagatat 6120
tacaaccagt gcaggatttc cctatgtgag tcttgggatc aaaaagagag acattctgaa 6180
caaagagacc caggacacag aaaagatgaa gttttatcta gacaagtatg gcattgactt 6240
gcctctagtt acatatatta aggatgaatt aagaagtgtt gacaaagtcc gattagggaa 6300
aagtagatta attgaagcct ccagtttgaa tgattctgtt aacatgagaa tgaaactagg 6360
caacctttac aaagcattcc atcaaaatcc cggtgttctg actgggtcag cagtgggttg 6420
tgatcctgat gtgttttggt ctgtcatccc ttgcttaatg gatgggcacc tgatggcatt 6480
tgattactct aattttgatg cctctttgtc accagtttgg tttgtctgtc tagagaaggt 6540
tttgaccaag ttaggctttg caggctcttc attaattcaa tcaatttgta atacccatca 6600
tatctttagg gatgaaatat atgtggttga aggtggcatg ccctcagggt gttcaggaac 6660
cagcatattc aattccatga tcaacaacat aatcattagg actttgatat tagatgcata 6720
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ttatccttat gaactggatc cacaagtgtt ggcaactctt ggtaaaaatt atggactaac 6840
catcacaccc ccagacaaat ctgaaacttt tacaaaaatg acatgggaaa acttgacatt 6900
tttaaagaga tacttcaagc ctgatcaaca atttcccttt ttggttcacc cagttatgcc 6960
catgaaagat atacatgagt caatcagatg gacaaaggat cctaaaaaca cacaggatca 7020
cgtccgatca ttatgcatgt tagcatggca ctcaggagaa aaagagtaca atgaattcat 7080
tcagaagatc agaactactg acattggaaa atgtctaatt ctcccagaat acagcgtact 7140 taggaggcgc tggttggacc tcttttaggt taacaatata gacacttaat ttgagtagaa
gtaggagttt at
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> Vírus da gripe Α, B (vírus da gripe aviária) <400> 51
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20
<210> 52 <211> 24 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe aviária) <4 00> 52
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15
Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20
<210> 53 <211> 24 <212> PRT
<213> Vírus da gripe A, B (vírus da gripe aviária) <4 00> 53
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr His Thr Arg Asn Gly Trp Gly 10 15
Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20
<210> 54 <211> 24 <212> PRT <213> Virus da gripe A, B (vírus da gripe humana) <4 00> 54
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15
Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp
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(6 X M -ri " ..... " " Apêndice de Seqüência 2 EPÍTOPES DE CÉLULA T DE GRIPE Tabela 1. Epítopes de CLT de vírus da Gripe A da Nucleoproteína
Posições de Aminoáci- do (ref.) Hospedeiro Restrição de MHC 44-52 (ref. 14) Humano H LA-A1 50-63 (ref.3) camundongo (CBA) H-2Kk 91-99 (ref. 13) Humano HLA-Aw68 147-158 (ref.5) camundongo (Balb/c) H-2Kd 265-273 (ref. 14) Humano HLA-A3 335-349 (ref.1) Humano HLA-B37 335-349 (ref.2) Camundongo HLA-B37 365-380 (ref.2) Camundongo H-2Db 366-374 (ref.9) camundongo (C57B1/6) H-2Db 380-388 (ref. 16) Humano HLA-B8 383-391 (ref. 16) Humano HLA-B27 Tabela 2. Epítopes de auxiliador T de vírus da Gripe A da Nucleoproteína Posições de Aminoáci- do (ref.) Hospedeiro Restrição de MHC 55-69 (ref.8) camundongo (Balb/c) H-2Kd 182-205 (ref. 11) humano 187-200 (ref.8) camundongo (CBA) H-2Kk 216-229 (ref.8) camundongo (Balb/c) H-2Kd 206-229 (ref. 11) humano HLA-DR1, HLA-DR2 en HLA-DRwI 3 260-283 (ref.8) camundongo (CBA) camundongo (C57B1/6) camundongo (B10.s) H-2Kk H-2Db H-2s 297-318 (ref.11) humano 338-347 (ref. 16) humano HLA-B37 341-362 (ref.11) humano 413-435 (ref.8) camundongo (C57B1/6) H-2Db Tabela 3. Epítopes de célula T de vírus da Gripe A de Outras Proteínas Vi- rais
Peptídeo Hospedeiro Tipo de célula T Restrição de MHC PB1(591-599) (ref. 14) Humano CLT HLA-A3 HA(204-212)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kd HA(210-219)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kd HA(259-266)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kk HA(252-271)(ref. 7) camundongo CLT H-2Kk HA(354-362)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kk HA(518-526)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kk HA(523-545)(ref. 10) camundongo CLT NA(76-84)(ref. 16) camundongo CLT H-2Dd NA(192-201)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kd M1(17-29)(ref. 6) Humano Auxiliador T HLA-DR1 M1(56-68)(ref. 4) Humano CLT HLA-A2 M 1(58-66) (ref. 12) Humano CLT HLA-A2 M1(128-135)(ref. 15) Humano CLT HLA-B35 NS1(122-130)(ref. 15) Humano CLT HLA-A2 NS1(152-160)(ref. 16) camundongo CLT H-2Kk Apêndice de Seqüência 3 Rinovírus humano 14 (HRV14). Seqüência de amino ácido codificada é obti- da por translação de nucleotídeos 629-7168 de seqüência colocada abaixo (SEQ ID NO: 50).
1 ttaaaacagc ggatgggtat cccaccattc gacccattgg gtgtagtact ctggtactat 61 gtacctttgt acgcctgtCt ctccccaacc acccttcctt aaaattccca cccatgaaac
121 gttagaagct tgacattaaa gtacaatagg tggcgccata tccaatggtg tctatgtaca 181 agcacttctg tttccccgga gcgaggtata ggctgtaccc actgccaaaa gcctttaacc 241 gttatccgcc aaccaactac gtaacagtta gtaccatctt gttcttgact ggacgttcga 301 tcaggtggat tttccctcca ctagtttggt cgatgaggct aggaattccc cacgggtgac 361 cgtgtcctag cctgcgtggc ggccaaccca gcttatgctg ggacgccctt ttaaggacat 421 ggtgtgaaga ctcgcatgtg cttggttgtg agtcctccgg cccctgaatg cggctaacct 481 taaccctgga gccttatgcc acgatccagt ggttgtaagg tcgtaatgag caactccggg 541 acgggaccga ctactttggg tgtccgtgtt tctcattttt cttcatattg tcttatggtc 601 acagcatata tatacatata ctgtgatcat gggcgctcag gtttctacac agaaaagtgg 661 atctcacgaa aatcaaaaca ttttgaccaa tggatcaaat cagactttca cagttataaa 721 ttactataag gatgcagcaa gtacatcatc agctggtcaa tcactgtcaa tggacccatc 783 taagtttaca gaaccagtta aagatctcat gcttaagggt gcaccagcat tgaattcacc 841 caatgttgag gcctgtggtt atagtgatag agtacaacaa atcacactcg ggaattcaac 901 aataacaaca caagaagcag ccaacgctgt tgtgtgttat gctgaatggc cagagtacct 961 tccagatgtg gacgctagtg atgtcaataa aacttcaaaa ccagacactt ctgtctgtag
1021 gttttacaca ttggatagta agacatggac aacaggttct aaaggctggt gctggaaatt 1081 accagatgca ctcaaagata tgggtgtgtt cgggcaaaac atgtttttcc actcactagg 1141 aagatcaggt tacacagtac acgttcagtg caatgccaca aaattccata gcggttgtct 1201 acttgtagtt gtaataccag aacaccaact ggcttcacat gagggtggca atgtttcagt 1261 taaatacaca ttcacgcatc caggtgaacg tggtatagat ttatcatctg caaatgaagt 1321 gggagggcct gtcaaggatg tcatatacaa Catgaatggt actttattag gaaatctgct 1381 cattttccct caccagttca ttaatctaag aaccaataat acagccacaa tagtgatacc 1441 atacataaac tcagtaccca ttgattcaat gacacgtcac aacaatgtct cactgatggt 1501 catccctatt gcccctctta cagtaccaac 1561 cacaatagca cctatgtgca ctgagttctc 1621 aggtttgcca actacaactt tgccggggtc 1681 atcccccagt gcactgccaa attatgagcc 1741 tcataacttg ctagaaatta tacaggtaga 1801 aaaagatgag gttaacagtt acctcatacc 1861 ttttgggaca aacctgttta ttggtgatgg 1921 tgttcagtac tatacacatt ggtctggatc 1981 tgccttgtcc agtgctaaac tcattctagc 2041 ggacaggaga gaagcaatgc taggtactca 2101 catagtaatg acaataccat ggacatcagg 2161 atacaccagt gctggctttc tatcatgttg 2221 aacgaccggc caggtctact tattatcatt 2281 gctgatgaaa gatactcaaa ctatctcaca 234 1 tgaattagaa gaagtcatcg ttgagaaaac 24 01 tccaaaacac acacaaaaag tccccatact 2461 tgttcttcca tcagacagca tagaaaccag 2521 aactgatgta gaatgctttt tgggtcgtgc 2581 caaagatgct actggaatag ataatcacag 2641 caacctgtcc agccttgtcc aacttagaaa 2701 tgattctgag tataccatac tggccactgc 2761 caatttggtg gtccaagcca tgtatgttcc 2821 cgattacaca tggcaaagtg cttcaaaccc 2881 caggtttagt gtgccttatg taggattggc 2 941 ctcacatgat gatgcagaaa ctcagtatgg 3001 ggcattcaga atagtaaatg aacatgatga 3061 tcacagggca aagcacgttg aagcatggat 3121 atcaataggg cgcacaaatt atcctaagaa
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Claims (31)

1.Vetor rinovírus compreendendo um antígeno do vírus da gri- pe.
2. Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o vetor rinovírus não é patogênico em humanos.
3. Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 2, em que o vetor rinovírus é Rinovírus Humano 14 (HRV14).
4. Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno do vírus da gripe compreende um peptídeo M2e.
5. Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno da gripe é inserido no local de um imunogene de neutralização se- lecionado a partir do grupo consistindo em Imunogene de Neutralização I (Niml), Imunogene de Neutralização Il (NimII)1 Imunogene de Neutralização Ill (NimMI), e Imunogene de Neutralização IV (NimIV)1 ou uma combinação destes.
6.Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 5, em que o antígeno do vírus da gripe é inserido no local de Imunogene de Neutraliza- ção Il (Nimll).
7.Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 6, em que o antígeno da gripe é inserido entre aminoácidos 158 e 160 de Nimll.
8.Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno do vírus da gripe é flanqueado por seqüências Iigadoras em uma ou ambas extremidades.
9.Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o vetor rinovírus está vivo.
10.Vetor rinovírus, de acordo com a reivindicação 1, em que o vetor rinovírus é inativado.
11.Composição farmacêutica compreendendo o vetor rinovírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1-10 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
12.Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação11, compreendendo adicionalmente um adjuvante.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente um ou mais ingredientes ativos adicio- nais.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, compreendendo adicionalmente uma proteína de núcleo de Hepatite B com seqüências de M2e.
15. Método de induzir uma resposta imune a um vírus da gripe em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo a com- posição farmacêutica como definido em qualquer uma das reivindicações 11-14.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o indiví- duo não tem, mas está em risco de desenvolver infecção do vírus da gripe.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o indiví- duo tem infecção do vírus da gripe.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a com- posição é administrada ao indivíduo intranasalmente.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o indiví- duo é um humano.
20. Método de produção de uma composição farmacêutica, compreendendo misturar o vetor rinovírus como definido na reivindicação 1, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
21. Molécula de ácido nucleico que codifica ou corresponde ao genoma do vetor rinovírus como definido na reivindicação 1.
22. Peptídeo de Nimll compreendendo um antígeno da gripe inserido.
23. Método de gerar um vetor rinovírus compreendendo um an- tígeno do vírus da gripe, o método compreendendo as etapas de: (i) geração de uma biblioteca de vetor rinovírus recombinante baseado em um clone de cDNA infeccioso que compreende seqüências do antígeno do vírus da gripe inseridas, e (ii) seleção a partir dos vírus recombinantes da biblioteca que (a) mantém seqüências inseridas após passagem, e (b) são neutralizados com anticorpos contra a seqüência inserida.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o vetor rinovírus é rinovírus humano 14 (HRV14).
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a se- quência de antígeno da gripe inserida é inserida em uma posição seleciona- da a partir do grupo consistindo de Niml, Nimll, Nimlll, e NimIV.
26. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a se- qüência de antígeno do vírus da gripe inserida é uma seqüência M2e.
27. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a se- quência de antígeno do vírus da gripe inserida é flanqueada em uma ou ambas extremidades com seqüências Iigadoras aleatórias.
28. Método de cultivo de um vetor rinovírus compreendendo um antígeno do vírus da gripe, o método compreendendo a passagem do vetor em células HeLa ou MRC-5.
29. Vetor rinovírus compreendendo uma patogenia, câncer, ou antígeno baseado em alérgeno, conforme descrito aqui.
30. Composição farmacêutica compreendendo um vetor rinoví- rus como definido na reivindicação 29.
31. Método de indução de uma resposta imune a um antígeno de uma patogenia, câncer, ou antígeno baseado em alérgeno, conforme descrito aqui, o método compreendendo a administração de um vetor ou composição como definido na reivindicação 29 ou reivindicação 30.
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