KR20060016095A

KR20060016095A - 백신 및 유전자 요법을 위한 고 역가 재조합 인플루엔자바이러스

Info

Publication number: KR20060016095A
Application number: KR1020057022564A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 가와오카
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2006-02-21
Also published as: NZ543446A; JP5695020B2; AU2004249133B2; BRPI0410702A; CN1826407B; CN1826407A; HK1082769A1; JP5215561B2; IL238584B; MX342639B; NO341506B1; UA92132C2; IL238584A0; US8475806B2; ES2593082T3; EP1631663A2; JP2007518395A; WO2004112831A3; EA200501890A1; BRPI0410702B1

Abstract

본 발명은 고 역가 인플루엔자 바이러스 단리물로부터의 서열을 포함하는, 예를 들어 헬퍼(helper) 바이러스의 부재 하에, 고 역가 인플루엔자 바이러스를 제조하는데 유용한 조성물을 제공한다.

Description

백신 및 유전자 요법을 위한 고 역가 재조합 인플루엔자 바이러스{HIGH TITER RECOMBINANT INFLUENZA VIRUSES FOR VACCINES AND GENE THERAPY}

관련 출원의 상호-참조

본 출원은 2003년 5월 28일 출원된 미국출원 제60/473,798호의 출원일의 35 U.S.C. §119(e) 하에서의 이익을 주장하고, 그의 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.

정부 권리의 진술

본 발명은 미합중국 정부로부터의 허가(더 내셔널 인스티튜트 오브 알러지 앤 인펙셔스 디지지즈 퍼블릭 헬쓰 서비스(the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Public Health Service)로부터의 허가 AI-47446)로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수 있다.

음성-센스(negative-sense) RNA 바이러스는 가금 및 가축 산업에 주요한 경제적 영향을 미치는 동물 바이러스(예를 들어, 뉴캐슬병(Newcastel disease) 바이러스와 린더페스트(Rinderpest) 바이러스) 뿐만 아니라, 호흡기 다핵체 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스 및 에볼라 바이러스와 같은, 보편적인 인간 병원체를 포함하는, 7개의 과(랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 보르나비리대(Bornaviridae), 오르쏘믹소비리대(Orthomyxoviridae), 분야비리대(Bunyaviridae) 및 아레나비리대(Arenaviridae))로 분류된다. 나중 3개가 각각 6 내지 8, 3 또는 2개의 음성-센스 RNA 분절로 이루어진 게놈을 갖는 반면, 처음 4개 과는 비분절화된 게놈을 특징으로 한다. 음성-센스 RNA 바이러스의 공통적 특징은 그들 RNA 게놈의 음 극성이다. 즉, 바이러스 RNA(vRNA)는 mRNA에 상보적이고 따라서 그 자체로 감염성이지 않다. 바이러스 전사와 복제를 개시하기 위하여, vRNA는 바이러스 폴리머라제 복합체와 핵단백질에 의해, 각각, 양성-센스(positive-sense) mRNA 또는 cRNA로 전사되어야 한다. A형 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스 폴리머라제 복합체는 세 폴리머라제 단백질 PB2, PB1 및 PA로 이루어져 있다. 바이러스 복제 동안, cRNA는 새로운 vRNA 분자의 합성을 위한 주형으로 기능한다. 모든 음성-가닥 RNA 바이러스의 경우, vRNA와 cRNA의 5' 및 3' 말단 모두에 있는 비-코딩 부위가 바이러스 게놈의 전사와 복제를 위해 결정적이다. 세포 또는 바이러스 mRNA 전사체와 달리, cRNA와 vRNA는 둘다 5' 말단에서 캡핑되지도 최 3' 말단에서 폴리아데닐화되지도 않는다.

많은 바이러스 단백질의 기본적 기능이 생화학적으로 및(또는) 바이러스 감염의 측면에서 규명되었다. 그러나, 역 유전학 시스템은 생 약독화 바이러스 백신의 개발 뿐만 아니라, 그들 바이러스 복제와 병원성에 관한 음성-가닥 분절 및 비-분절된 RNA 바이러스에 대한 우리의 지식을 획기적으로 증가시켰다. 역 유전학은, 그 용어가 분자 바이러스학에서 사용될 때, 클로닝된 cDNA들로부터 유래된 게놈을 갖는 바이러스의 생성으로 정의된다(검토를 위해, Neumann 등, 2002를 참조하라).

음성-가닥 RNA 바이러스의 바이러스 복제를 개시하기 위하여, vRNA(들) 또는 cRNA(들)는 폴리머라제 복합체와 핵단백질과 함께 공동발현되어야 한다. 광견병 바이러스는 클로닝된 cDNA로부터 전적으로 생성된 최초의 비-분절된 음성-센스 RNA 바이러스였다. 슈넬(Schnell) 등(1994)은 모두 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 제어 하에, 전장 cRNA를 코딩하는 cDNA 구조물과 L, P 및 N 단백질을 위한 단백질 발현 구조물의 공동형질감염에 의해 재조합 광견병 바이러스를 생성하였다. T7 RNA 폴리머라제를 제공한, 재조합 백시니아 바이러스로의 감염은 감염성 광견병 바이러스의 생성을 가져왔다. 이 T7 폴리머라제 시스템에서, T7 RNA 폴리머라제의 제어 하에 전장 cRNA의 일차 전사는 비-캡핑된 cRNA 전사체를 생성시켰다. 그러나, T7 RNA 폴리머라제를 위한 최적의 개시 서열을 형성하는, 3개의 구아니딘 뉴클레오티드가 5' 말단에 부착되었다. 생산적 감염 주기에 필수적인 cRNA 전사체의 진정한 3' 말단을 창출하기 위하여, 간염 델타 리보자임(HDVRz) 서열이 cRNA 전사체의 3' 말단에서 정확한 자가촉매적 절단을 위해 사용되었다.

슈넬 등(1994)에 의한 최고 보고 이래로, 유사한 기술을 이용한 역 유전학 시스템이 많은 비-분절된 음성 가닥 RNA 바이러스의 생성을 가져왔다(Conzelmann, 1996; Conzelmann, 1998; Conzelmann 등, 1996; Marriott 등, 1999; Munoz 등, 2000; Nagai, 1999; Neumann 등, 2002; Roberts 등, 1998; Rose, 1996). 원래 구제(rescue) 과정의 정제는 구제 효율을 증가시키기 위해 안정하게 형질감염된 세포주(Radecke 등, 1996) 또는 단백질 발현 플라스미드(Lawson 등, 1995)로부터의 T7 RNA 폴리머라제의 발현, 또는 열 쇼크 과정(Parks 등, 1999)을 포함하였다. T7 폴리머라제 시스템에 기초하여, 브리드겐(Bridgen)과 엘리오트(Elliott)(1996)는 클로닝된 cDNA들로부터 분얌웨라(Bunyamwera) 바이러스(분야비리대 과)를 창제하고 T7 폴리머라제 시스템에 의해 분절된 음성-센스 RNA 바이러스를 인공적으로 생성시킬 수 있는 가능성을 입증하였다.

1999년에서, 플라스미드-기초 역 유전학 기술이 클로닝된 cDNA들로부터 전적으로 분절된 A형 인플루엔자 바이러스의 생성을 위해 세포성 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 기초하여 만들어졌다(Fodor 등, 1999; Neumann 및 Kawaoka, 1999). 핵소체(nucleolar) 효소인, RNA 폴리머라제 Ⅰ은 인플루엔자 바이러스 RNA와 같이, 5' 캡이나 3' 폴리A 구조를 갖지 않는 리보솜 RNA를 합성한다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 터미네이터 서열에 의해 플랭킹(flanking)되는, 인플루엔자 바이러스 cDNA를 함유하는 구조물의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사는 인플루엔자 vRNA 합성을 일으켰다(Fodor 등, 1999; Neumann 및 Kawaoka, 1999; Neumann 및 Kawaoka, 2001; Pekosz 등, 1999). 이 시스템은 매우 효율적이어서, 형질감염-후 48 시간에 플라스미드-형질감염된 세포의 상청액 ㎖ 당 10⁸ 초과의 감염성 바이러스 입자를 생산하였다.

클로닝된 cDNA들로부터 전적으로 A형 인플루엔자 바이러스와 같은 고 역가 오르쏘믹소바이러스를 제조하는 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 고 역가, 예를 들어, 10⁹/㎖ 초과, 예를 들어, 10¹⁰/㎖ 초과의 인플루엔자 바이러스의 단백질중 적어도 하나, 또는 그의 일부를 코딩하는 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자(폴리뉴클레오티드), 또는 핵산 분자의 상보체를 제공한다. 일 태양에서, 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자는 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M 또는 NS, 또는 이들의 일부를 코딩한다. 여기에 사용되는 바, "실질적으로 동일한 활성"은 상응하는 전장 폴리펩티드의 활성 또는 단백질 수준의, 각각 약 80%, 90% 이상의 활성 또는 약 0.1%, 1%, 10%, 30%, 50%, 90%, 예를 들어, 100% 이하 또는 이상인 검출가능한 단백질 수준을 포함한다. 일 태양에서, 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자는 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한, 예를 들어, 적어도 80%, 예를 들어, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 99%의 인접 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일 태양에서, 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자는 서열 1 내지 8 중 하나와 실질적으로 동일한, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 인접 핵산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보체를 포함하고, 일 태양에서는, 또한 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 적어도 80%, 예를 들어, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 99%의, 인접 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일 태양에서, 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자는 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대하여, 하나 이상, 예를 들어, 2, 5, 10, 15, 20개 이상의, 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 잔기들의 10% 또는 20% 이하의 보존적 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환가능성을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린; 글루타믹-아스파틱; 및 아스파라긴-글루타민이다.

다른 태양에서, 본 발명의 단리 및(또는) 정제된 핵산 분자 또는 그의 상보체는 낮은 엄격도, 중간 엄격도 또는 엄격한 조건 하에서, 서열 1 내지 8 중 하나 또는 그의 상보체와 혼성화한다. 예를 들어, 아래 조건이 사용될 수 있다: 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP0₄, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 2×SSC, 0.1% SDS에서 세척(낮은 엄격도), 보다 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP0₄, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 1×SSC, 0.1% SDS에서 세척(중간 엄격도), 보다 바람직하게는 여전히 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP0₄, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 0.5×SSC, 0.1% SDS에서 세척(엄격한 조건), 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP0₄, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척(보다 엄격한 조건), 보다 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP0₄, 1 mM EDTA, 65 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척(매우 엄격한 조건). 일 태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 1 내지 8 중 하나와 실질적으로 동일한, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 인접 핵산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.

본 발명의 핵산 분자는 인플루엔자 단백질을 발현하고(하거나), 예를 들어, 다른 인플루엔자 바이러스 유전자를 포함하는 다른 바이러스 유전자와의 키메라 유전자를 제조하고(하거나), 재조합 바이러스를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 단리된 폴리펩티드, 재조합 바이러스 및 본 발명의 핵산 분자 또는 재조합 바이러스와 접촉된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 아래 단리 및(또는) 정제된 벡터 중 적어도 하나를 제공한다: 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프 로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로서, 적어도 하나의 벡터는 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M, NS 또는 이들의 일부를 코딩하는 서열, 예를 들어, 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 임의로, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 대신 두 벡터, 예를 들어, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터와 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현 또는 코딩하거나, 인플루엔자 vRNA, 천연 및 재조합 vRNA를 발현하거나 코딩하는 단리 및 정제된 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 바람직하게는, 모든 유기체의 유전자(들)가 본 발명의 벡터 또는 방법에서 사용될 수 있을지라도, 벡터는 인플루엔자 cDNA, 예를 들어, A형 인플루엔자 DNA(예를 들어, 15개 HA 또는 9개 NA 서브타입 중 임의의 것을 포함하는 임의의 A형 인플루엔자 유전자), B형 또는 C형 인플루엔자 DNA(본원에 참고로 구체적으로 인용되는, Fields Virology(Fields 등(eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA(1996))의 45 및 46장을 참조하라)를 포함한다. cDNA는 프로모터에 대하여 센스 또는 안티센스 배향으로 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터는 인플루엔자 바이러스 단백질(센스) 또는 vRNA(안티센스)를 코딩할 수 있다. 임의의 적당한 프로모터 또는 전사 종결 서열이 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 바이러스 단백질 또는 펩티드, 비바이러스성 병원체의 단백질 또는 펩티드, 또는 치료용 단백질 또는 펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 복수의 인플루엔자 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 태양에서, 조성물은 (a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡 터로부터 선택되고, 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 본 발명의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 벡터로부터 선택되는 둘 이상의 벡터를 포함한다. 임의로, (b)의 벡터는 NP, NS, M, 예를 들어, M1 및 M2, HA 또는 NA를 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터는 추가로 전사 종결 서열을 포함한다.

다른 태양에서, 조성물은 (a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 BM2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프 로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되고, 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 본 발명의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 벡터로부터 선택되는 둘 이상의 벡터를 포함한다. 임의로, (b)의 벡터는 NP, NS, M, HA 또는 NA를 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터는 추가로 전사 종결 서열을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 관심 유전자 또는 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 예를 들어, 백신으로 유용한 면역원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 벡터 중 하나가 전사 종결 서열에 연결된, 임의로 3' 인플루엔자 바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된, 목적하는 핵산 서열, 예를 들어, 목적하는 cDNA에 연결된, 임의로 5' 인플루엔자 바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 대체되거나, 조성물이 이를 추가로 포함하는 상기한 바와 같은 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게는, cDNA와 같은 목적하는 핵산 서열이 안티센스 배향으로 있다. 인플루엔자 바이러스 복제를 허용하는 숙주 세포로의 그러한 조성물의 도입은 벡터의 서열에 상응하는 vRNA를 포함하는 재조합 바이러스를 생성시킨다. vRNA 생산을 위한 그러한 벡터에서의 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터일 수 있고, 임의로 벡터는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열과 같은 전사 종결 서열, 또는 리보자임을 포함한다. 일 태양에서, 목적하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 관심 cDNA를 포함한다. vRNA 생산을 위한 벡터에서건 단백질 생산을 위한 벡터에서건, 관심 cDNA는 암 요법이나 백신에 유용한 에피토프와 같은 면역원성 에피토프, 또는 유전자 요법에 유용한 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 바이러스를 제조할 때, 관심 유전자나 cDNA를 포함하는 벡터나 플라스미드가 인플루엔자 바이러스 유전자를 위한 벡터나 플라스미드를 치환할 수 있거나 모든 인플루엔자 바이러스 유전자를 위한 벡터나 플라스미드에 부가하여 존재할 수 있다.

복수의 본 발명의 벡터는 물리적으로 연결되거나 각 벡터는 개개의 플라스미드나 기타, 예를 들어, 선형의, 핵산 전달 비히클에 존재할 수 있다.

vRNA 또는 바이러스 단백질 발현 벡터의 프로모터나 전사 종결 서열은 프로모터나 임의의 다른 벡터에 대하여 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 인플루엔자 vRNA를 발현하는 벡터나 플라스미드는 적어도 하나의 특정 숙주 세포, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 양, 또는 인간 세포를 포함하는 영장류 세포와 같은 포유류, 또는 조류 숙주 세포에서의 발현이나, 바람직하게는 하나 초과의 숙주에서의 발현에 적당한 프로모터를 포함한다.

일 태양에서, vRNA 생산을 위한 하나 이상의 벡터는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 예를 들어, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터를 포함하지만, 그로 제한되지 않는 프로모터를 포함한다. vRNA 벡터를 위한 바람직한 전사 종결 서열은 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열, 또는 리보자임을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 범위 내의 리보자임은 테트라하이메나 리보자임, RNAse P, 해머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임, 간염 리보자임, 및 합성 리보자임을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일 태양에서, vRNA를 위한 적어도 하나의 벡터는 임의로 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열에 연결된, 또다른 리보자임 서열에 연결된 바이러스 코딩 서열에 연결된 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함한다. 일 태양에서, vRNA 생산을 위한 적어도 2개 및 바람직하게는 더 많은, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 벡터는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터 및 제1 리보자임 서열을 포함하고, 이때 상기 제1 리보자임 서열은 바이러스 코딩 서열을 포함하는 바이러스 서열에 상응하는 서열에 5'이고, 상기 바이러스 서열에 상응하는 서열은 제2 리보자임 서열에 대해 5'이며, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 대해 5'이다. 각각의 vRNA 벡터에 있는 각각의 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 임의의 다른 vRNA 벡터에 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터와 동일하거나 상이할 수 있다. 유사하게, 각각의 vRNA 벡터에 있는 각각의 리보자임 서열은 임의의 다른 vRNA 벡터에 있는 리보자임 서열과 동일하거나 상이할 수 있다. 일 태양에서, 단일 벡터에 있는 리보자임 서열은 동일하지 않다.

본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 본 발명의 복수의 벡터와 예를 들어, 순차적으로 또는 동시에, 예를 들어 감염성 인플루엔자 바이러스를 생성시키는데 유효한 양의 본 발명의 조성물을 사용하여 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 조성물과 접촉된 세포로부터 바이러스를 단리하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 추가로 단리된 바이러스와, 본 발명의 조성물이나 바이러스와 접촉된 숙주 세포를 제공한다. 다른 태양에서, 본 발명은 vRNA 또는 단백질 생산 벡터인 하나 이상의 벡터와 접촉시킨 후, vRNA 또는 단백질 생산 벡터인 다른 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 예를 들어, 바이러스 게놈으로 약독화 돌연변이를 도입함으로써, 인플루엔자 바이러스의 용이한 조작을 가능하게 한다. 추가로, 인플루엔자 바이러스는 강력한 체액성 및 세포성 면역성을 유도하므로, 본 발명은 특히 순차적으로 사용되어, 유전자 요법을 위한 반복된 사용을 허용할 수 있는, 바이러스의 천연 변이체의 이용가능성 측면에서, 이들 바이러스를 백신 벡터로서 크게 증진시킨다.

헬퍼(helper) 바이러스 감염을 요구하지 않는, 본원에 기재된 바이러스의 생산 방법은 바이러스 돌연변이유발 연구와, 백신(예를 들어, AIDS, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 리노바이러스, 필로바이러스, 말라리아, 허피스, 및 족구 질환에 대한 백신) 생산과 유전자 요법 벡터(예를 들어, 암, AIDS, 아데노신 디아미나제, 근위축증, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍 및 중추 신경계 종양)에 유용하다. 따라서, 의학적 요법에 사용하기 위한(예를 들어, 백신이나 유전자 요법을 위한) 바 이러스가 제공된다.

본 발명은 또한 병원체, 예를 들어, 세균, 바이러스 또는 기생체, 또는 악성 종양에 대해 개체를 면역화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체에게 임의로 애주번트와 배합된, 개체를 면역화하는데 유효한 양의 본 발명의 적어도 하나의 단리된 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 바이러스는 병원체에 의해 코딩되는 폴리펩티드나 종양-특이적 폴리펩티드를 포함하는 vRNA를 포함한다.

내생적 단백질의 감소된 양 또는 결여를 특징으로 하는 적응증이나 질환을 갖는 포유류에서 내생적 단백질의 발현을 강화하거나 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 포유류에게 포유류에서 내생적 단백질의 양을 강화하거나 증가시키는데 유효한 양의 본 발명의 단리된 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

도 1. 확립된 역 유전학 시스템의 개략도. RNP 형질감염 방법(A)에서, 정제된 NP와 폴리머라제 단백질은 시험관 내 합성된 vRNA를 사용하여 RNP들로 조립된다. 세포는 RNP들로 형질감염된 후, 헬퍼 바이러스 감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 방법(B)에서, RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 구제하고자 하는 vRNA를 코딩하는 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드가 세포로 형질감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의한 세포 내 전사는 합성 vRNA를 생성시키고, 헬퍼 바이러스로의 감염 시 자손 바이러스 입자로 팩키지된다. 양 방법으로, 형질감염체 바이러스(즉, 클로닝된 cDNA로부터 유래된 RNA를 함유하는 것들)는 헬퍼 바이러 스 집단으로부터 선별된다.

도 2. RNA 폴리머라제 Ⅰ 구조물 생성의 개략도. 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 cDNA들은 PCR에 의해 증폭되고, BsmBⅠ으로 분해되어, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터(P) 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터(T)를 포함하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 위치로 클로닝되었다(E. Hoffmann, Ph. D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany). 터미네이터 서열의 상류 티미딘 뉴클레오티드(*T)는 인플루엔자 바이러스 RNA의 3' 말단을 나타낸다. A형 인플루엔자 바이러스 서열이 굵은 글자로 표시되어 있다(서열 29 내지 40).

도 3. 분절된 음성-센스 RNA 바이러스를 생성시키는 제안된 역 유전학적 방법. RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 각각의 8개의 바이러스 RNA 분절에 대한 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드로 단백질 발현 플라스미드와 함께 세포를 형질감염시킨다. 비록 감염성 바이러스가 PA, PB1, PB2 및 NP를 발현하는 플라스미드로 생성될 수 있을지라도, 모든 나머지 구조 단백질([]에 나타냄)의 발현은 생성되는 바이러스에 따라 바이러스 생산의 효율을 증가시킨다.

도 4. 다양한 인플루엔자 바이러스의 역가.

정의

여기에 사용된 바, 용어 "단리 및(또는) 정제된"은 생체 내 물질과 결합되지 않거나, 시험관 내 물질로부터 실질적으로 정제되도록 하는, 본 발명의 벡터, 플라스미드 또는 바이러스의 시험관 내 제조, 단리 및(또는) 정제를 말한다. 단리된 바이러스 제제는 일반적으로 시험관 내 배양과 증식에 의해 얻어지고 실질적으로 다른 감염성 물질이 결여되어 있다.

여기에 사용된 바, "실질적으로 결여된"은 특정 감염성 물질에 대한 표준 검출 방법을 이용한 그 물질의 검출 수준 미만을 의미한다.

"재조합" 바이러스는, 예를 들어 바이러스 게놈에 변화를 도입하는 재조합 DNA 기술을 이용하여, 시험관 내에서 조작된 것이다.

여기에 사용된 바, 용어 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 분절"은 그 서열이 자연 발생적인 것이 아니거나, 그들이 천연 게놈에 위치된 바와 같이 위치하지 않는 자연 발생 서열에 상응하도록, 추후에 시험관 내에서 화학적으로 변형될 수 있는, 출처로부터 유래되거나 단리된 핵산, 예를 들어, DNA를 말한다. 출처로부터 "유래된" DNA의 예는 유용한 단편으로 확인되고, 그 다음에 필수적으로 순수한 형태로 화학 합성되는 DNA 서열일 것이다. 출처로부터 "단리된" 그러한 DNA의 예는 그것이 유전공학의 방법론에 의해, 본 발명에서 사용하기 위하여, 추가로 조작, 예를 들어, 증폭될 수 있도록, 화학적 수단, 예를 들어, 제한 엔도뉴클라제의 사용에 의해 상기 출처로부터 절제 또는 제거되는 유용한 DNA 서열일 것이다.

인플루엔자 바이러스 복제

A형 인플루엔자 바이러스는 총 10개의 단백질을 코딩하는 8개의 단일-가닥 음성-센스 바이러스 RNA들(vRNA들)의 게놈을 갖는다. 인플루엔자 바이러스 생활주기는 숙주 세포의 표면 상의 시알산-함유 수용체에 대한 헤마글루티딘(HA)의 결합으로 시작하고, 수용체-매개된 엔토시토시스가 뒤따른다. 후기 엔도솜의 낮은 pH는 HA의 형태적 전이를 촉발함으로써, HA2 서브유닛의 N-말단(소위 융합 펩티드)을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스와 엔도솜 막의 융합을 개시시키고, 매트릭스 단백질(M1)과 RNP 복합체가 세포질로 방출된다. RNP들은 vRNA를 캡시드화하는 핵단백질(NP)과, PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 폴리머라제 복합체로 이루어진다. RNP들은 전사와 복제가 일어나는 핵으로 수송된다. RNA 폴리머라제 복합체는 3개의 상이한 반응을 촉매한다: 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 갖는 mRNA의 합성, 전장 상보적 RNA(cRNA)의 합성 및 주형으로서 cDNA를 이용하는 게놈 vRNA의 합성. 새로이 합성된 vRNA들, NP 및 폴리머라제 단백질은 그런 다음 RNP들로 조립되고, 핵으로부터 수출(export)되며, 자손 바이러스 입자의 출아가 일어나는 원형질막으로 수송된다. 뉴라미니다제(NA) 단백질은 감염 후기에 시알릴로올리고당으로부터 시알산을 제거함으로써 결정적인 역할을 하여, 새로 조립된 비리온을 세포 표면으로부터 방출하고 바이러스 입자의 자가 응집을 방지한다. 비록 바이러스 조립은 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 포함하지만, 이들 상호작용의 성질은 대개 알려져 있지 않다.

비록 B형 및 C형 인플루엔자 바이러스가 A형 인플루엔자 바이러스와 구조적으로 및 기능적으로 유사할지라도, 몇몇 차이가 있다. 예를 들어, B형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 유사하게, C형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 그러나, CM1 단백질은 이 활성을 가질 것이다. 이온 채널 단백질의 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 홀신거(Holsinger) 등(1994) 및 WO 01/79273을 참조하라.

본 발명에서 사용될 수 있는 세포주 및 인플루엔자 바이러스

본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스의 수용체인 하나 이상의 시알산을 감소 또는 저하된 수준으로 발현하는 돌연변이 세포를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 효율적인 복제를 지지하는 어떠한 세포도 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득되는 바이러스는 재조합체(reassortant) 바이러스로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 세포는 WHO 인증된, 또는 인증가능한, 연속 세포주이다. 그러한 세포주를 인증하기 위한 요건은 가계, 성장 특성, 면역학적 마커, 바이러스 감수성, 발암성 및 저장 조건 중 적어도 하나에 관하여, 또한 동물, 알 및 세포 배양에서의 시험에 의한 특성분석을 포함한다. 그러한 특성분석은 세포가 검출가능한 외래 물질이 결여된 것을 확인하는데 사용된다. 일부 국가에서, 핵학이 또한 요구될 수 있다. 또한, 발암성은 바람직하게는 백신 생산을 위해 사용되는 것들과 동일한 계대 수준에 있는 세포에서 시험된다. 바이러스는 바람직하게는 백신 생산을 위해 불활성화되거나 약독화되기 전에, 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타난 방법에 의해 정제된다(예를 들어, World Health Organization, 1982를 참조하라).

최종 산물의 순도에 대한 적절한 시험이 포함될 수 있도록, 사용되는 세포주의 완전한 특성분석을 확립하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 세포의 특성분석을 위해 사용될 수 있는 데이터는 (a) 그의 기원, 유래 및 계대 내력에 관한 정보; (b) 그의 성장 및 형태학적 특성에 관한 정보; (c) 외래 물질의 시험 결과; (d) 세포가 다른 세포주 중에서 명확하게 인식되도록 하는 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 양상과 같은 구별되는 특징; 및 (e) 발암성에 대한 시험결과를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 숙주세포의 계대 수준, 또는 집단 이배체화는 가능한 한 낮다.

세포에서 생산되는 바이러스는 백신이나 유전자 요법 제제 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 과정은 세포 DNA, 기타 세포 성분 및 외래 물질의 강력한 제거를 일으킬 것이다. DNA를 강력하게 분해하거나 변성시키는 과정도 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mizrahi, 1990]을 참조하라.

백신

본 발명의 백신은 모든 병원체의 당단백질을 포함하는 면역원성 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 세균, 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일 태양에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 또는 HIV와 같은 렌티바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, CMV 또는 HSV와 같은 허피스 바이러스 또는 족구 질환 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 기타 바이러스 병원체의 백신 벡터일 수 있다.

완전한 비리온 백신은 한외여과에 의해 농축된 후 구역 원심분리나 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그것은 정제 전이나 후에 예를 들어, 포르말린이나 베타-프로피오락톤을 이용하여 불활성화된다.

서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 그러한 백신은 아래와 같이 제조될 수 있다: 계면활성제로의 처리에 의해 단편화된 바이러스 현탁액을 이용하여, 표면 항원을 예를 들어 초원심분리에 의해 정제한다. 따라서 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질과, NA도 포함한다. 사용되는 계면활성제는 예를 들어, 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(Bachmeyer, 1975)와 같은 양이온성 계면활성제, 암모늄 데옥시콜레이트(Laver & Webster, 1976)와 같은 음이온성 계면활성제; 또는 명칭 TRITON X100 하에 시판되고 있는 것과 같은 비온성 계면활성제일 수 있다. 헤마글루티닌은 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 비리온을 처리한 후 단리된 다음, 그랜드(Grand) 및 스케헬(Skehel)(1972)에 의해 기재된 것과 같은 방법에 의해 정제될 수 있다.

스플릿(split) 백신은 지질을 용해시키는 물질로의 처리에 가해진 비리온을 포함한다. 스플릿 백신은 아래와 같이 제조될 수 있다: 불활성화되거나 되지 않은, 위와 같이 수득된 정제 바이러스의 수성 현탁액을 교반 하에 계면활성제와 결합된, 에틸에테르나 클로로포름과 같은 지질 용매에 의해 처리한다. 바이러스 외피 지질의 용출은 바이러스 입자의 단편화를 일으킨다. 그들의 원래 지질 환경이 제거된 주로 헤마글루티닌과 뉴라미니다제, 및 코어 또는 그 분해산물로 구성된, 스플릿 백신을 함유하는 수상이 회수된다. 그런 다음 입자의 불활성화가 이미 행해지지 않은 경우 잔여 감염성 입자를 불활성화시킨다.

불활성화 백신. 본 발명의 불활성화 인플루엔자 바이러스 백신은 포르말린 또는 β-프로피오락톤 처리와 같지만 그로 제한되지 않는, 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 불활성화함으로써 제공된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 불활성화 백신 유형은 전체-바이러스(WV) 백신 또는 서브비리온(SV)(스플릿) 백신을 포함할 수 있다. SV 백신이 지질-함유 바이러스 외피를 가용화하는 계면활성제로 파쇄된 후, 잔여 바이러스가 화학적 불활성화된 정제된 바이러스를 함유하는 반면, WV 백신은 손상되지 않은, 불활성화 바이러스를 함유한다.

또한, 사용될 수 있는 백신은 표면 항원 또는 서브유닛 백신으로 언급되는, 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, SV 및 표면 항원(즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. 유행성 바이러스와 면역학적으로 관련된 NA 항원과 관련되지 않은 HA를 함유하는 실험적 불활성화 WV 백신은 통상적인 백신 보다 덜 효과적인 것 같다(Orga 등, 1977). 두 관련 표면 항원을 함유하는 불활성화 백신이 바람직하다.

생 약독화 바이러스 백신. 생 약독화 인플루엔자 바이러스 백신 또한 공지의 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 약독화는 바람직하게는 공지의 방법에 따라 약독화된 유전자를 약독화된 공여자 바이러스로부터 복제된 단리물 또는 재조합된 바이러스로 도입시킴으로써 단일 단계로 달성된다(예를 들어, Murphy, 1993을 참조하라). A형 인플루엔자 바이러스에 대한 내성은 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역반응의 발생에 의해 매개되므로, 이들 표면 항원을 코딩하는 유전자는 재조합된 바이러스 또는 고 성장 임상적 단리물로부터 나와야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 부모로부터 유래된다. 이 접근에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다. 아니면, 이들 유전자는 임상적 바이러스 단리물의 표면 항원을 갖는 재조합체로 도입될 수 없다.

많은 공여자 바이러스가 인플루엔자 바이러스를 재현가능하게 약독화하는 그들의 능력에 대해 평가되어 왔다. 비제한적 예로서, A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2) 저온 적응(ca) 공여자 바이러스가 약독화된 백신 생산을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Edwards, 1994; Murphy, 1993을 참조하라). 부가하여, 생 약독화된 재조합 바이러스 백신은 ca 공여자 바이러스를 본 발명의 병원성의 복제된 바이러스와 교배함으로써 생성될 수 있다. 재조합 자손은 그런 다음 약독화된 A/AA/6/60(H2N2) ca 공여자 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 저해하는 H2N2 항혈청 존재 하에, 25 ℃(병원성 바이러스의 복제를 위해 제한적인)에서 선별된다.

많은 계열의 H1N1 및 H3N2 재조합체가 인간에서 평가되었고, 만족스럽게 (a) 감염성이고, (b) 혈청음성 소아와 면역학적으로 준비된 성인을 위해 약독화되며, (c) 면역원성이고, (d) 유전적으로 안정한 것으로 확인되었다. ca 재조합체의 면역원성은 그들의 복제 수준에 필적한다. 따라서, 새로운 야생형 바이러스에 의한 ca 공여자 바이러스의 6개의 도입가능 유전자의 획득은 감수성 성인 및 소아를 백신접종하는데 사용하기 위하여 이들 바이러스를 재현가능하게 약독화하였다.

다른 약독화 돌연변이를 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자로 도입시켜 이들 돌연변이 유전자를 함유하는 감염성 바이러스를 구제할 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 비-코딩 부위, 및 코딩 부위로 도입될 수 있다. 그러한 약독화 돌연변이는 또한 HA 또는 NA 이외의 유전자, 예를 들어, PB2 폴리머라제 유전자(Subbarao 등, 1993)로 도입될 수 있다. 따라서, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되는 약독화 돌연변이를 갖는 새로운 공여자 바이러스도 생성될 수 있으며, 그러한 새로운 공여자 바이러스는 A/AA/6/60 ca 공여자 바이러스에 대해 상기된 것과 유사한 방식으로 생 약독화 재조합체 H1N1 및 H3N2 백신 후보의 감소에 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지의 적당한 약독화 공여자 균주를 본 발명의 인플루엔자 바이러스와 재조합시켜 포유류의 백신접종에 사용하는데 적당한 약독화 백신을 얻을 수 있다(Enami 등, 1990; Muster 등, 1991; Subbarao 등, 1993).

그러한 약독화 바이러스는 원래 임상적 단리물의 것들과 실질적으로 유사한 항원 결정기를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이것은 약독화 백신의 목적이, 백신이 백신접종되는 포유류에서 심각한 병원성 증상을 유도하는 변화를 최소한으로 유발하도록 하는 정도로 감염성을 결핍시킴과 동시에, 바이러스의 원래 임상적 단리물과 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 것이기 때문이다.

따라서, 바이러스는 동물, 예를 들어, 포유류에서 면역 반응을 유도하는 백신으로서, 공지의 방법에 따라, 약독화 또는 불활성화되고, 제제화되고 투여될 수 있다. 그러한 약독화 또는 불활성화된 백신이 임상 분리물 또는 그로부터 유래된 고 성장 균주의 것과 실질적으로 유사한 항원성을 유지하는지 여부를 결정하기 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 공지의 방법은 공여자 바이러스의 항원 결정기를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항혈청 또는 항체의 사용; 화학적 선별(예를 들어, 아만타딘 또는 리만티딘); HA 및 NA 활성 및 저해; 및 항원 결정기를 코딩하는 공여자 유전자(예를 들어, HA 또는 NA 유전자)가 약독화 바이러스에 존재하지 않는지를 확인하기 위한 DNA 스크리닝(예를 들어, 프로브 혼성화 또는 PCR)을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Robertson 등, 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry 등, 1985; Robertson 등, 1992]을 참조하라.

제약 조성물

접종이나 비경구 또는 경구 투여를 위해 적당한, 본 발명의 제약 조성물은 약독화 또는 불활성화 인플루엔자 바이러스를 포함하고, 임의로 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 추가로 포함한다. 조성물은 추가로 당업계에 알려져 있는 바와 같은 보조제나 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Berkow 등, 1987; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992]을 참조하라. 본 발명의 조성물은 일반적으로 개개 용량(단위 용량) 형태로 제공된다.

통상적인 백신은 일반적으로 그들 조성물로 들어가는 균주 각각으로부터의 헤마글루티닌 약 0.1 내지 200 ㎍, 바람직하게는 10 내지 15 ㎍을 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주요 성분을 형성하는 백신은 A, B 또는 C형의 바이러스, 또는 이들의 임의의 조합, 예를 들어, 세 타입 중 적어도 2개, 상이한 서브타입의 적어도 2개, 동일한 타입의 적어도 2개, 동일한 서브타입의 적어도 2개, 또는 상이한 단리물(들) 또는 재조합체(들)을 포함할 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 A형은 H1N1, H2N2 및 H3N2 서브타입을 포함한다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및(또는) 유화액을 포함하며, 당업계에 알려진 보조제나 부형제를 함유할 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 담체나 폐색성 드레싱이 피부 투과성을 증가시키고 항원 흡수를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 투여형은 일반적으로 액체 투여형을 함유하는 리포좀 용액을 포함할 수 있다. 리포좀을 현탁하기 위해 적당한 형태는 정제수와 같은 당업계에 보편적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 유화액, 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 불활성 희석제 이외에, 그러한 조성물은 또한 애주번트, 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향료 또는 방향제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Berkow 등, 1992; Avery's, 1987; Osol, 1980; 및 Katzung, 1992]을 참조하라.

본 발명의 조성물이 개체에 투여하기 위해 사용될 때, 추가로 염, 완충제, 애주번트, 또는 조성물의 효능을 향상시키기 위해 바람직한 기타 물질을 포함할 수 있다. 백신을 위해, 애주번트, 특정 면역 반응을 강화할 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 정상적으로, 애주번트와 조성물은 면역 체계에 제공하기 전에 혼합되거나, 별도로, 그러나 면역화되는 유기체의 동일한 위치로 제공된다. 백신 조성물에서 사용하기에 적당한 재료의 예는 오솔(Osol)(1980)에 제공되어 있다.

백신에서의 불균일성은 2-50개의 균주나 그 안의 임의의 범위나 값과 같은, 적어도 2개의 인플루엔자 바이러스 균주 대신 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대적 항원 조성을 갖는 A 또는 B형 인플루엔자 바이러스 균주가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 백신은 당업계에 알려진 기술을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 단일 균주에서 변이를 위해 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 적어도 하나의 화학요법 화합물, 예를 들어 유전자 요법의 경우, 면역억제제, 소염제 또는 면역증강제, 및 백신의 경우, 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤즈이미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양괴사인자-알파, 티오세미카바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 포스카르네트, 포스포노아세트산, 어사이클로비르, 디데옥시뉴클레오시드, 프로테아제 저해제, 또는 강시클로비르를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 화학요법제를 추가 또는 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 카트정(Katzung)(1992), 및 그의 각각 798-800 및 680-681면에서 인용된 참조문헌을 참조하라.

조성물은 또한 다양하지만 소량의 무-엔도톡신 포름알데히드와, 조성물이 투여되는 유기체에 안전하고 바람직하지 않은 영향에 기여하지 않는 것으로 확인된 보존제를 함유할 수 있다.

제약학적 목적

조성물(또는 그것이 유발하는 항혈청)의 투여는 "예방" 또는 "치료" 목적일 수 있다. 예방적으로 투여되는 경우, 백신인 본 발명의 조성물은 병원체 감염의 어느 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 어느 후속 감염을 예방하거나 약화하는 역할을 한다. 예방적으로 제공될 때, 본 발명의 유전자 요법 조성물은 질환의 어느 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 예방하거나 약화하는 역할을 한다.

치료적으로 제공될 때, 약독화 또는 불활성화 바이러스 백신은 실제 감염의 증상이 검출될 때 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 임의의 실제적 감염을 약화하는 역할을 한다. 예를 들어, 문헌[Berkow 등, 1992; Avery, 1987; 및 Katzung, 1992]을 참조하라. 치료적으로 제공될 때, 유전자 요법 조성물은 질환의 증상이나 징후가 검출되면 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 그 질환의 증상이나 징후를 약화하는 역할을 한다.

따라서, 본 발명의 약독화 또는 불활성화 백신 조성물은 감염의 발병 전에(예상되는 감염을 예방하거나 약화하기 위하여) 또는 실제 감염의 시작 후에 제공될 수 있다. 유사하게, 유전자 요법을 위하여, 조성물은 장애나 질환의 어느 증상이 발현되기 전이나 하나 이상의 증상이 검출된 후 제공될 수 있다.

조성물은 그의 투여가 수혜 환자에 의해 견뎌질 수 있으면 "약리학적으로 허용되는"이라고 말해진다. 그러한 물질은 투여되는 양이 생리학적으로 유의하면 "치료 유효량"으로 투여된다고 말해진다. 본 발명의 조성물은 그의 존재가 수혜 환자의 생리에 검출가능한 변화를 일으키면, 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스의 적어도 하나의 균주에 대한 적어도 하나의 일차 또는 이차 체액성 또는 세포성 면역반응을 증진시키면, 생리학적으로 유의하다.

제공되는 "보호"는 절대적일 필요는 없으며, 즉, 환자들의 대조 집단이나 세트(set)에 비해 통계학적으로 유의한 개선이 있으면 인플루엔자 감염이 완전히 예방되거나 근절될 필요는 없다. 보호는 인플루엔자 바이러스 감염 증상의 중증도나 발병 신속성을 완화하는 것으로 제한될 수 있다.

제약학적 투여

본 발명의 조성물은 수동 면역화 또는 능동 면역화에 의해 하나 이상의 병원체, 예를 들어, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 내성을 부여할 수 있다. 능동 면역화에서, 불활성화 또는 약독화 생 백신 조성물은 숙주(예를 들어, 포유류)에게 예방적으로 투여되며, 투여에 대한 숙주의 면역반응은 감염 및(또는) 질환으로부터 보호한다. 수동 면역화의 경우, 유발된 항혈청이 회수되고 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발되는 감염을 갖는 것으로 의심되는 수혜자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 조성물은 능동 면역화에 의해 예방적 또는 치료적 수준의 목적하는 유전자 산물을 생성시킬 수 있다.

일 태양에서, 백신은 여성 및 태아나 신생아(태반을 통과하거나 모유에 있는 항체의 수동적 도입을 통해) 둘다를 보호하는 역할을 하는 면역반응의 생성을 유발하기에 충분한 시간과 양의 조건 하에서, 포유류 여성(임신 또는 출산 시나 이전)에게 제공된다.

따라서 본 발명은 장애나 질환, 예를 들어, 적어도 하나의 병원체 균주에 의한 감염의 예방 또는 약화 방법을 포함한다. 여기에 사용된 바, 백신은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화(즉, 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화한다고 말해진다. 여기에 사용된 바, 유전자 요법 조성물은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화(즉, 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화한다고 말해진다.

본 발명의 적어도 하나의 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 바이러스, 또는 그의 조성물은 이미 기재된 제약 조성물을 이용하여, 의도한 목적을 달성하는 어떠한 수단에 의해서도 투여될 수 있다.

예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 비내, 경구 또는 경피 경로와 같은 다양한 비경구 경로에 의할 수 있다. 비경구 투여는 볼루스 주사에 의하거나 시간에 걸친 점진적 관류일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 이용하는 바람직한 양식은 근육내 또는 피하 적용에 의한 것이다. 예를 들어, 문헌[Berkow 등, 1992; Avery, 1987: 및 Katzung, 1992]을 참조하라.

인플루엔자 바이러스 관련된 병리를 예방, 억제 또는 치료하기 위한 전형적 투여계획은 단일 치료로서 투여되거나, 1 주 내지 약 24 개월, 또는 그 안의 어느 범위나 값 이하와 그를 포함하는 기간에 걸쳐, 강화 또는 부스터 용량으로서 반복되는, 여기에 기재된 유효량의 백신 조성물의 투여를 포함한다.

본 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"은 목적으로 하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 것이다. 유효 용량은 수혜자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 존재하는 경우, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 의존할 것임이 이해된다. 아래 제공되는 유효 용량의 범위는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 그러나, 가장 바람직한 용량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개개 대상에게 맞추어질 것이다. 예를 들어, 문헌[Berkow 등, 1992; Avery's, 1987; 및 Katsung, 1992]을 참조하라.

포유류(예를 들어, 인간) 또는 조류 성체 유기체를 위한 약독화 바이러스 백신의 용량은 약 10³-10⁷ 플라크 형성 단위(PFU)/㎏, 또는 그 안의 어느 범위나 값일 수 있다. 불활성화 백신의 용량은 약 0.1 내지 200, 예를 들어, 50 ㎍의 헤마글루티닌 단백질 범위일 수 있다. 그러나, 용량은 현존 백신을 출발점으로 사용하여, 통상적 방법에 의해 결정되는 바 안전하고 유효한 양이어야 한다.

복제된 바이러스 백신의 각 용량 중의 면역활성 HA의 용량은 적당한 양, 예를 들어, 1-50 ㎍ 또는 그 안의 어느 범위나 값, 또는 보통 3세 이상의 소아를 위해 성분 당 15 ㎍, 및 <3세 소아를 위해 성분 당 7.5 ㎍인, U.S. 퍼블릭 헬스 서비스(PHS)에 의해 권장되는 양을 함유하도록 표준화될 수 있다. NA의 양 또한 표준화될 수 있지만, 이 당단백질은 가공 정제와 저장 동안 불안정할 수 있다(Kendal 등, 1980). 각 0.5-㎖ 용량의 백신은 바람직하게는 대략 10-500억 바이러스 입자, 바람직하게는 100억 입자를 함유한다.

본 발명은 아래 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.

실시예 1

재료 및 방법

세포 및 바이러스. 293T 인간 배아 신장세포 및 매딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포(MDCK)를 각각 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 둘베코즈 변형 이글 배지(DMEM) 및 5% 신생 송아지 혈청을 함유하는 변형 이글즈 배지(MEM)에서 유지하였다. 모든 세포를 5% CO₂에서 37 ℃에 유지하였다. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33(H1N1) 및 A/PR/8/34(H1N1)를 10-일령 알에서 증식시켰다.

플라스미드의 제작. RNA 폴리머라제 Ⅰ 구조물을 생성시키기 위하여, A/WSN/33 또는 A/PR/8/34 바이러스 RNA로부터 유래된 클로닝된 cDNA들을 RNA 폴리머라제 Ⅰ의 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 도입하였다. 간략하게, 클로닝된 cDNA들을 BsmBⅠ 위치를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭하고, BsmBⅠ으로 분해하고, BsmBⅠ 위치에 의해 분리된, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 위치로 클로닝하였다(도 2). A/WSN/33 균주의 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS 유전자를 아래 플라스미드를 이용하여 PCR-증폭하였다: 각각, pSCWPB2, pGW-PB1, 및 pSCWPA(모두 유니버시티 오브 캘리포니아 로스 엔젤레스의 데비 나약(Debi Nayak) 박사로부터 얻음), 및 pWH17, pWNP152, pT3WNA15(Castrucci 등, 1992), pGT3WM 및 pWNS1. 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 PB1 유전자를 pcDNA774(PB1)(Perez 등, 1998)을 주형으로 이용하여 증폭하였다. 프라이머 서열에 대해서는 도 6을 참조하라. 유전자가 원치않는 돌연변이를 갖지 않음을 보장하기 위해, PCR-유래된 단편을 자동서열결정기(USA, CA, 어플라이드 바이오시스템 인크(Applied Biosystem Inc.))로 제조자에 의해 권장되는 프로토콜에 따라 서열결정하였다. A/WSN/33 바이러스의 HA, NP, NA 및 M1 유전자를 코딩하는 cDNA들을 기재된 바와 같이(Huddleston 등, 1982) 클로닝하고 진핵 발현 벡터 pCAGGS/MCS(닭 β-액틴 프로모터에 의해 제어됨)로 서브클로닝하여(Niwa 등, 1991), 각각 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 및 pCAGGS-WSN-M1-2/1을 생성하였다. A/PR/8/34 바이러스로부터의 M2 및 NS2 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 pCAGGS/MCS로 클로닝하여, pEP24c 및 pCA-NS2를 생성시 켰다. 마지막으로, pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) 및 pcDNA787(PA)을 사이토메갈로바이러스 프로모터의 제어 하에 PB2, PB1 및 PA 단백질을 발현시키는데 사용하였다(Perez 등, 1998).

감염성 인플루엔자 입자의 생성. 293T 세포(1×10⁶)를 트랜스 IT LT-1(위스콘신, 매디슨, 판베라(Panvera))을 사용하여 제조자의 지시에 따라 상이한 양의 최대 17개 플라스미드로 형질감염시켰다. 간략하게, DNA와 형질감염 시약을 혼합하고(DNA ㎍ 당 2 ㎕ 트랜스 IT-LT-1), 실온에서 45 분간 인큐베이션하고 세포에 가하였다. 6 시간후, DNA-형질감염 시약 혼합물을 0.3% 우혈청 알부민 및 0.01% 송아지 태아 혈청을 함유하는 Opti-MEM(메릴랜드, 게이스버그, 기브코(Gibco)/BRL)으로 대체하였다. 형질감염 후 상이한 시간에, 바이러스를 상청액으로부터 수획하고 MDCK 세포 상에서 적정하였다. 헬퍼 바이러스가 이 과정에 의해 요구되지 않으므로, 회수된 형질감염체 바이러스를 플라크 정제 없이 분석하였다.

바이러스를 생산하는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율 결정. 형질감염 24 시간후, 293T 세포를 0.02% EDTA로 단일 세포로 분산시켰다. 그런 다음 세포 현탁액을 10-배 희석하고 24-웰 플레이트에 있는 MDCK 세포의 컨플루언트(confluent) 단일층으로 옮겼다. 바이러스를 헤마글루티닌화 분석법에 의해 검출하였다.

면역염색 분석법. 인플루엔자 바이러스로의 감염 9 시간후, 세포를 인산염-완충 염수(PBS)로 2회 세척하고 실온에서 20 분간 3.7% 파라포름알데히드(PBS 중) 로 고정하였다. 다음에, 그들을 0.1% Triton X-100으로 처리하고 뉴만(Neumann) 등(1997)에 의해 기재된 바와 같이 가공하였다.

결과

바이러스 RNA 분절, 세 폴리머라제 서브유닛 및 NP 단백질의 플라스미드-주도된 발현에 의한 감염성 바이러스의 생성. 정제된 비리온으로부터 추출된 RNP들의 혼합물로의 세포의 형질감염이 감염성 인플루엔자 입자를 생성하였을지라도, 이 전략은 8개의 상이한 시험관 내 생성된 RNP들과 함께 사용될 때 효율적일 것 같지 않다. cDNA들로부터 전적으로 감염성 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위하여, 8개의 바이러스 RNP들을 생체 내에서 생성시켰다. 따라서, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터에 의해 플랭킹된, A/WSN/33 바이러스의 전장 바이러스 RNA들에 대한 cDNA들을 함유하는 플라스미드를 제조하였다. 원칙적으로, 이들 8개의 플라스미드의 진핵세포로의 형질감염은 모든 8개의 인플루엔자 vRNA들을 합성하여야만 한다. 그런 다음 단백질 발현 플라스미드의 공동형질감염에 의해 생성된 PB2, PB1, PA 및 NP 단백질은 vRNA들을 복제 및 전사되는 기능적 vRNP들로 조립하여, 궁극적으로 감염성 인플루엔자 바이러스를 형성하여야 한다(도 3). 1×10⁶ 293T 세포를 단백질 발현 플라스미드(1 ㎍의 pcDNA762(PB2), 1 ㎍의 pcDNA774(PB1), 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA), 및 1 ㎍의 pCAGGS-WSN-NP0/14) 및 1 ㎍의 각각의 아래 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(pPolⅠ-WSN-PB2, pPolⅠ-WSN-PB1, pPolⅠ-WSN-PA, pPolⅠ-WSN-HA, pPolⅠ-WSN-NP, pPolⅠ-WSN-NA, pPolⅠ-WSN-M 및 pPolⅠ-WSN-NS)로 형질감염시켰다. 감소된 양의 pcDNA787(PA)를 사용하는 결정은 이전 관찰(Mena 등, 1996)과, 바이러스-유사 입자(VLP들)의 생성을 위한 최적 조건에 대한 데이터(결과 미도시)에 기초하였다. 293T 세포의 형질감염 24 시간후, ㎖ 당 7×10³ pfu의 바이러스를 상청액에서 발견하여(실험 1, 표 1), 전적으로 플라스미드로부터 A형 인플루엔자 바이러스를 생산하는 역 유전학의 능력을 처음으로 입증하였다.

클로닝된 cDNA로부터 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 사용된 플라스미드 세트^*		실험
이하에 대한 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드:^†		1	2	3	4	5	6	7	8
	PB1	+	+	-	-	-	-	-	-
	PR8-PB1	-	-	+	+	+	+	+	+
	PB2	+	+	+	+	+	+	+	+
	PA	+	+	+	+	+	+	+	+
	HA	+	+	+	+	+	+	+	+
	NP	+	+	+	+	+	+	+	+
	NA	+	+	+	+	+	+	+	+
	M	+	+	+	+	+	+	+	+
	NS	+	+	+	+	+	+	+	+
이하에 대한 단백질 발현 플라스미드:
	PB1	+	+	+	+	+		+	+
	PB2	+	+	+	+	+	+	_	+
	PA	+	+	+	+	+	+	-	+
	NP	+	+	+	+	+	+	+	-
	HA	-	+	-	+	+	+	+	+
	NA	-	+	-	+	+	+	+	+
	M1	-	+	-	+	+	+	+	+
	M2	-	+	-	+	+	+	+	+
	NS2	-	+	-	+	+	+	+	+
바이러스 역가(pfu/㎖)		7×10³	7×10³	1×10³	3×10⁴	0	0	0	0
* 293T 세포를 표시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 24(실험 1 및 2) 또는 48 시간(실험 3-8) 후, 상청액 중 바이러스 역가를 MDCK 세포 상에서 결정하였다. † 다르게 표시되지 않으면, 플라스미드를 A/WSN/33 바이러스의 RNA들을 나타내는 cDNA들로 제작하였다.

모든 바이러스 구조 단백질의 공동발현으로의 인플루엔자 바이러스 생산의 효율. 바이러스 NP 및 폴리머라제 단백질의 발현이 인플루엔자 바이러스의 플라스미드-주도된 생성을 위해 충분할지라도, 효율을 향상시킬 수 있는 것이 가능하였다. 이전 연구에서, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2 및 NS2)의 발현은 리포터 클로람페니콜-아세틸트랜스퍼라제 유전자(Mena 등, 1996)를 코딩하는 인공적 vRNA를 함유한 VLP들을 생성하였다. 따라서, 단지 바이러스 RNA 복제와 전사에 요구되는 것들 대신, 구조 단백질의 전체 성분의 이용가능성은 바이러스 생산의 효율을 향상시킬 수 있다. 이 목적을 위해, 293T 세포를 최적량의 바이러스 단백질 발현 플라스미드(VLP 생산에 의해 판단됨; 비공개 데이터): 1 ㎍의 pcDNA762(PB2) 및 pcDNA774(PB1); 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA); 1 ㎍의 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0/14, 및 pCAGGS-WNA15; 2 ㎍의 pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0.3 ㎍의 pCA-NS2; 및 0.03 ㎍의 pEP24c(M2를 위한)로, 1 ㎍의 각 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(실험 2, 표 1)와 함께, 형질감염시켰다. 두번째 세트의 세포들을, 재조합체 바이러스를 생성하기 위한 노력으로 PB1 유전자 대신 pPolⅠ-PR/8/34-PB1을 사용한 것을 제외하고는 동일한 세트의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드로, PA, PB1, PB2 및 NP만을 발현하는 플라스미드(실험 3, 표 1) 또는 모든 인플루엔자 구조 단백질을 발현하는 것들(실험 4, 표 1)과 함께 형질감염시켰다. WSN 바이러스의 수율은 형질감염 후 24 시간(실험 1 및 2, 표 1) 또는 36 시간(결과 미도시)에서 그다지 상이하지 않았다. 그러나, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질이 제공되었을 때, PR/8/34-PB1을 갖는 바이러스의 수율에서 10-배 초과의 증가가 발견되었다(실험 3 및 4, 표 1). NP 단백질의 PA, PB1, PB2의 발현을 위한 플라스미드 중 하나가 결여된 음성 대조군은 어떠한 바이러스도 생성하지 않았다(실험 5-8, 표 1). 따라서, 생성되는 바이러스에 따라, 모든 A형 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 발현이 역 유전학 방법의 효율을 상당히 향상시켰다

다음으로, 세포의 형질감염 후 바이러스 생산의 역학을 A/PR/8/34-PB1 유전자를 갖는 바이러스를 생성시키는데 사용된 플라스미드 세트를 이용하여 결정하였다. 3회 실험 중 2번에서, 바이러스가 형질감염 24 시간후 처음 검출되었다. 그 때 측정된 역가, >10³ pfu/㎖은 형질감염 후 48 시간후 >10⁶ pfu/㎖로 증가하였다(표 2). 바이러스를 생산하고 있는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율을 측정하기 위하여, 293T 세포를 형질감염 24 시간후 EDTA(0.02%)로 처리하여 세포를 분산시킨 후, 제한 희석 연구를 수행하였다. 이 실험에서, 어떠한 유리 바이러스도 이 시점에서는 배양 상청액에서 발견되지 않았다. 결과는 10^3.3 세포 중 하나가 감염성 바이러스 입자를 생성하고 있음을 가리켰다.

293T 세포로의 플라스미드 형질감염 후 바이러스 생산의 역학*	배양 상청액 중 바이러스 역가(pfu/㎖)
플라스미드 형질감염 후 시간	실험
플라스미드 형질감염 후 시간	1	2	3
6	0	ND	ND
12	0	ND	0
18	0	ND	0
24	0	2×10³	6×10³
30	ND	5×10⁴	9×10⁴
36	6×10²	>1×10⁵	7×10⁵
42	ND	>1×10⁶	5×10⁶
48	8×10⁴	>1×10⁶	1×10⁷
* 293T 세포를 A/PR/8/34 바이러스로부터 유래된 PB1 유전자를 제외한, A/WSN/33 바이러스 유전자를 코딩하는 8개의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드와 본문에 기재되어 있는 9개의 단백질 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 상이한 시점에, MDCK 세포에 있는 배양 상청액 중 바이러스를 적정하였다. ND = 행해지지 않음.

NA 단백질에서 FLAG 에피토프를 함유하는 인플루엔자 바이러스의 회수. 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스의 게놈으로 돌연변이의 도입을 허용하였는지를 검증하기 위하여, NA 단백질에 FLAG 에피토프(Castrucci 등, 1992)를 함유하는 바이러스를 생성하였다. 293T 세포를 요구되는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 및 단백질 발현 플라스미드와 함께, NA 단백질과 단백질 머리의 바닥의 FLAG 에피토프를 모두 코딩하는 cDNA를 함유하는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(pPolⅠ-WSN-NA/FL79)로 형질감염시켰다. 회수된 바이러스(PR8-WSN-FL79)가 사실상 NA-FLAG 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여, PR8-WSN-FL79 또는 A/WSN/33 야생형 바이러스로 감염된 세포의 면역염색 분석법을 수행하였다. FLAG 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 PR8-WSN-FL79로 감염된 세포를 검출하였지만, 야생형 바이러스로 감염된 것들은 그러하지 않았다. PR8-WSN-FL79 바이러스의 회수는 태그되지 않은 야생형 바이러스에 대한 것만큼 효율적이었다(결과 미도시). 이들 결과는 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 돌연변이를 도입하는 것을 허용함을 가리킨다.

PA 유전자에 돌연변이를 함유하는 감염성 인플루엔자 바이러스의 생성. PA 유전자에 돌연변이를 갖는 바이러스를 생산하기 위하여, 두 침묵 돌연변이를 제한 엔도뉴클레아제에 대한 새로운 인식 서열(mRNA의 위치 846의 Bsp120Ⅰ 및 위치 1284의 PvuⅡ)을 만들어 도입하였다. 이전에는, 신뢰할만한 선별 체계의 결여로 인해, 역 유전학에 의해 이 유전자를 변형시키는 것이 불가능하였다. 형질감염체 바이러스, PA-T846C 및 PA-A1284를 회수하였다. 회수된 형질감염체 바이러스를 두 연속적 제한 희석에 의해 생물학적으로 클로닝하였다. 회수된 바이러스가 정말 PA 유전자에 돌연변이를 갖는 형질감염체인지를 검증하기 위하여, PA 유전자에 대한 cDNA를 역전사효소-PCR에 의해 수득하였다. PA-T846C 및 PA-A1284C 바이러스는 새로 도입된 제한위치의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, PA 유전자 내에 예상된 돌연변이를 가졌다. 역전사 단계가 없는 동일한 바이러스 샘플과 프라이머의 PCR은 어떠한 산물도 생산하지 못하여(결과 미도시), PA cDNA가 정말로 바이러스를 생성하는데 사용된 플라스미드 대신 vRNA로부터 기원하였음을 나타내었다. 이들 결과는 돌연변이된 유전자를 갖는 바이러스가 어떻게 헬퍼 바이러스를 사용하지 않고 생산 및 회수될 수 있는지를 설명한다.

논의

여기에 기재된 역 유전학 시스템은 클로닝된 cDNA들로부터 전적으로 A형 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 생산할 수 있도록 한다. 브리드겐 및 엘리오트(1996) 또한 분얌웨라(Bunyamwera) 바이러스(분야비리대 과)를 생성하는데 역 유전학을 사용하였지만, 그것은 단지 세 분절의 음성-센스 RNA만을 함유하고, 그 생산 효율은 10² pfu/10⁷ 세포로 낮았다. 비록 바이러스 수율은 실험간에 상이하였지만, 일관되게 > 10³ pfu/10⁶ 세포가 8 분절을 함유하는 인플루엔자 바이러스에 대해 관찰되었다. 여기 위에서 기재된 역 유전학 시스템의 높은 효율에 대한 몇몇 설명이 있다. 시험관 내에서 RNP들을 생산하는 대신(Luytjes 등, 1989), RNP들을 RNA 폴리머라제 Ⅰ을 사용하여 vRNA들의 세포 내 합성과 바이러스 폴리머라제 단백질 및 NP의 플라스미드-주도 발현을 통해 생체 내에서 생성하였다. 또한, 플라스미드로 쉽게 형질감염되는 293T 세포(Goto 등, 1997)를 사용하여 큰 집단의 세포가 바이러스 생산을 위해 필요한 모든 플라스미드를 받는 것을 보장하였다. 또한, 성장하는 세포에서 가장 풍부하게 발현되는 효소 중 하나인, RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 생산된 다수의 전사체가 아마도 시스템의 총 효율성에 기여하였을 것이다. 이들 특징으로 인해, vRNA의 캡시드화를 위한 상응하게 풍부한 수의 vRNA 전사체 및 적당한 양의 바이러스 단백질, 핵에서의 RNP들의 형성 및 이들 복합체의 세포 막으로의 수출이 유도되어, 새로운 바이러스가 조립되고 방출된다.

이전에 확립된 역 유전학 시스템(Enami 등, 1990; Neumann 등, 1994; Luytjes 등, 1989; Pleschka 등, 1996)은 헬퍼-바이러스 감염 및 따라서 소수의 형질감염체가 방대한 수의 헬퍼 바이러스로부터 회수되는 것을 허용하는 선별 방법을 요구하였다. 그러한 전략은 아래 cDNA-유래된 유전자 중 하나를 갖는 인플루엔자 바이러스를 생성하는데 사용되었다: PB2(Subbarao 등, 1993), HA(Enami 등, 1991: Horimoto 등, 1994), NP(Li 등, 1995), NA(Enami 등, 1990), M(Castrucci 등, 1995; Yasuda 등, 1994) 및 NS(Enami 등, 1991). HA 및 NA 유전자에 적용가능한 것들을 제외한, 대부분의 선별 방법은 성장 온도, 숙주 범위 제한, 또는 약물 민감성에 의존하여, 유전자 산물의 기능적 분석을 위한 역 유전학의 유용성을 제한한다. 신뢰할만한 항체-주도 선별 시스템이 이용가능한 HA 및 NA 유전자로조차, 뚜렷한 성장 결함을 갖는 바이러스를 생산하는 것이 어렵다. 반대로, 여기에 기재된 역 유전학 시스템은 헬퍼 바이러스를 요구하지 않고 어느 유전자 분절에 돌연변이나 심각한 성장 결함을 갖는 형질감염체를 생성하는 것을 허용한다. A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 어느 유효한 돌연변이를 도입하는 기술을 갖는 것은 연구자가 바이러스 게놈의 비번역 부위의 조절 서열의 성질, 바이러스 단백질의 구조-기능 관계, 및 숙주-범위 제한 및 바이러스 병원성의 분자적 기초와 같은, 많은 오래된 문제를 해결할 수 있게 한다.

비록 불활성화 인플루엔자 백신이 이용가능할지라도, 그들의 효능은 부분적으로 국소 IgA 및 세포독성 T 세포 반응을 유발하는 그들의 제한된 능력으로 인해 최적 이하이다. 지금 진행 중인 저온-적응 생 인플루엔자 백신의 임상시험은, 그들이 인플루엔자 증상을 유발하지 않지만, 여전히 보호 면역성을 유도하도록, 최적으로 약독화됨을 암시한다(Keitel & Piedra, 1998에서 검토). 그러나, 예비적 결과는 이들 생 바이러스 백신이 최량의 불활성화 백신(Keitel & Piedra, 1998에서 검토) 보다 유의하게 더 유효하지 않아, 추가 개량의 여지가 있음을 나타낸다. 하나의 가능성은 상기된 역 유전학 시스템으로 저온-적응 백신을 변형하는 것일 것이다. 대안으로는, 내부 단백질을 코딩하는 유전자에 여러 약독화 돌연변이를 갖는 "주" A형 인플루엔자 균주를 생산하는데 역 유전학을 사용함으로써 스크래치로부터 출발할 수 있다. 여기에 기재된 역 유전학 시스템의 가장 매력적인 적용은 인플루엔자 바이러스의 새로운 HA 또는 NA 서브타입이 연루되는 의심되는 세계적 유행병의 경우 약독화 생-바이러스 백신의 신속한 생산에 있을 수 있다.

이 새로운 역 유전학 시스템은 대개 백신 벡터로서의 인플루엔자 바이러스의 사용을 증가시킬 것이다. 바이러스는 인플루엔자 바이러스 단백질에 더하여 외래 단백질이나 면역원성 에피토프를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 9번째 분절(Enami 등, 1991)로서 외래 단백질을 갖는 바이러스를 생성할 수 있고 그들을 생 백신으로 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 강력한 세포-매개 및 체액성 면역반응을 자극할 뿐 아니라, 그들은 광범위한 어레이(array)의 비리온 표면 HA 및 NA 단백질(예를 들어, 15개 HA 및 9개 NA 서브타입 및 그들의 유행성 변이체)을 제공하여, 동일한 표적 집단의 반복된 면역화를 허용할 수 있다.

리포터 유전자를 코딩하는 인공적 vRNA를 갖는 인플루엔자 VLP들을 바이러스 구조 단백질과 vRNA를 백시니아-T7 폴리머라제 시스템(Mena 등, 1996)을 이용하여 발현시켜 생산하였다. 역 유전학을 이용하여, 이제 vRNA 전사 및 복제에 요구되는 단백질(즉, PA, PB1, PB2 및 NP)을 코딩하는 vRNA들, 및 관심 단백질을 코딩하는 vRNA들을 함유하는 VLP들을 생성할 수 있다. 그러한 VLP들은 유용한 유전자 전달 비히클일 수 있다. 중요하게는, 그들의 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전자의 결여는 VLP-유전자 요법 후 감염성 바이러스가 생산되지 않음을 보장할 것이다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 숙주 염색체로 통합되지 않기 때문에, VLP 시스템은 세포의 단기 형질도입만을 요구하는 상황(예를 들어, 암 치료를 위해)에서 유전자 요법에 적당할 것이다. 아데노바이러스 벡터(Kovesdi 등, 1997)와 반대로, 인플루엔자 VLP들은 HA 및 NA 변이체 모두를 함유하여, 표적 집단의 반복된 치료를 허용할 수 있다.

오르쏘믹소비리대 과는 A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스, 및 최근에 분류된 토고토바이러스(Thogotovirus)를 포함한다. 여기에 기재된 클로닝된 cDNA들로부터 전적으로 감염성 A형 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 전략은 임의의 오르쏘믹소바이러스, 및 아마도 다른 분절된 음성-센스 RNA 바이러스(예를 들어, 분야비리대, 아레나비리대)에도 적용될 것이다. 기술적 제한 없이 바이러스 게놈을 조작하는 능력은 바이러스 생활주기 및 그들의 조절, 바이러스 단백질의 기능 및 바이러스 병원성의 분자적 기작의 연구를 위해 심오한 의미를 갖는다.

실시예 2

인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34에 대한 역 유전학 시스템을 개발하기 위하여, 제조자의 지시에 따라 RNeasy 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여, 바이러스 RNA를 매디슨 고 성장 변이체(PR8HG), A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 요막액으로부터 추출하였다. cDNA를 MMLV-RTase(프로메가(Promega)) 및 Uni12 프라이머를 이용하여 합성하였다. cDNA들을 밤새 아래를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다:

프라이머 세트

DNA 폴리머라제: pfu 천연 DNA 폴리머라제(스트라타진(Stratagene))

PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분리하고 겔 추출 키트(퀴아젠)를 이용하여 아가로스 겔로부터 추출하였다. 추출된 유전자를 다카라(Takara) 결찰 키트 버전 Ⅱ(다카라)를 이용하여 pT7Blue 평활 벡터(노바젠(Novagen))에 결찰하였다. 5 시간 후, 결찰된 유전자를 JM109(PB2, M 및 NS 유전자) 또는 DH5알파(PA, PB1 및 NP)로 형질전환하였다. 각 유전자에 대한 6개의 콜로니를 TB에서 8 시간 동안 배양하였다. 플라스미드를 세균 배양물로부터 추출하고, 유전자 당 네 클론을 서열결정하였다.

pT7Blue 중 PA, NP, M 및 NS 유전자를 BsmBⅠ 효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 의해 절제하였다. PB1 유전자를 BsaⅠ(뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 절제하였다. 절제된 유전자를 밤새 BsmBⅠ으로 분해된 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 pPolⅠR 벡터로 결찰하였다. pT7Blue 중의 PB2 유전자의 전방 단편을 BsrGⅠ(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 BamHⅠ(로슈(Roche))에 의해 절제하고, 후방 단편을 BsrGⅠ(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 SpeⅠ(로슈)에 의해 절제하였다. 절제된 단편을 혼합하고 BsaⅠ에 의해 분해하였다. 6 시간 후, 분해된 유전자를 PCR 정제 키트(퀴아젠)를 이용하여 정제하고 밤새 pPolⅠR 벡터의 BsmBⅠ 위치 사이에 결찰하였다.

결찰된 PB1, PA, NP, M 및 NS-pPolⅠR 유전자를 밤새 JM109(M 및 NS 유전자) 또는 DH5알파(PB1, PA 및 NP 유전자)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환된 세균의 콜로니를 밤새 LB에서 배양하였다. 결찰된 PB2-pPolⅠR을 밤새 JM109를 형질전환하는데 사용하였다.

플라스미드를 세균 배양물로부터 추출하고 유전자 삽입물을 효소 분해에 의해 확인하였다. PB2-PolⅠR에 의해 형질전환된 세균의 콜로니를 LB에서 8 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 플라스미드를 추출하고 유전자 삽입을 효소 분해에 의해 확인하였다. 모든 pPolⅠ 구조물을 서열결정하여 그들이 원치않는 돌연변이를 함유하지 않음을 보장하였다.

PR8HG에 대한 pPolⅠR 구조물을 A/WSN/33(WSN)-HA 및 NA, A/HongKong/483/97(HK)-HAavir 및 NA, 또는 A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA 및 NA PolⅠ 구조물 및 A/WSN/33의 폴리머라제 단백질 및 NP에 대한 네 단백질-발현 구조물을 갖는 293T 인간 배아 신장 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 293T 세포로부터의 상청액을 계열 희석하고(무희석에서 10^-7까지), 9-일령의 배발생된 계란의 요막 강으로 감염시켰다. 감염된 알의 요막액을 수획하고 그들의 바이러스 역가를 HA 분석법에 의해 시험하였다(표 3).

아래 HA 및 NA 유전자와 함께 PR8 유전자를 갖는 바이러스	아래로 희석된 293T 상청액으로 접종된 알로부터의 요막액의 HA 역가(HAU/㎖)
아래 HA 및 NA 유전자와 함께 PR8 유전자를 갖는 바이러스	무희석	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7
WSN-HA NA	<1	<1	200	<1	<1	<1	<1	<1
HK-HAavir NA	100	<1	<1	<1	<1	<1	<1	<1
Kawasaki-HA NA	<1	<1	<1	<1	<1	<1	<1	<1

HA-양성 샘플(10^-2에서 WSN-HA NA를 갖는 바이러스 및 무희석에서 HK-HAavir NA를 갖는 바이러스)을 10^-2부터 10^-8까지 계열 희석하고 각 희석물의 100 ㎕를 배발생된 계란으로 감염시켰다. 감염된 알의 요막액을 수획하고 그들의 바이러스 역가를 HA 분석법에 의해 시험하였다(표 4). 플라스미드로부터 제조된 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 50% 알 감염 용량(EID₅₀)은 10^10.33/㎖였고, HA 역가는 1:3200이었다.

A/Hong Kong/213/2003(H5N1)으로부터의 HA 및 NA 유전자 및 PR8HG로부터의 A형 인플루엔자 바이러스 유전자의 나머지를 갖는 재조합 바이러스를 제조하였다. 재조합 바이러스의 역가는 10^10.67 EID₅₀/㎖였고, HA 역가는 1:1600이었다.

아래 HA 및 NA 유전자와 함께 PR8 유전자를 갖는 바이러스	각 희석에서 HA 역가(HAU/㎖)
아래 HA 및 NA 유전자와 함께 PR8 유전자를 갖는 바이러스	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8
WSN-HA NA	160	40	40	320	40	640	<1
HK-HAavir NA	400	800	400	400	400	800	<1

PR8 유전자의 서열:

실시예 3

인플루엔자 바이러스 A/Hong Kong/213/2003(H5N1, HK213)은 닭에서 전신적으로 복제하여, 치명적인 감염을 유발한다. 더욱이, 이 바이러스는 닭 배아에 치명적이다. 따라서, 그의 표면 단백질이 현재 돌고 있는 병원성 조류 인플루엔자 바이러스와 매우 관련되어 있을지라도, HK213은 그것을 배발생된 계란에서 성장시키려는 시도가 저질 요막액의 생산을 가져오므로 백신 균주로서 사용될 수 없다. 부가적으로, 백신 생산에서 이 고 병원성 바이러스의 사용은 백신 작업자를 위해 안전하지 않다. 주 백신 균주로서 A/PR/8/34를 사용할 수 있는 가능성을 시험하기 위하여, HK213의 헤마글루티닌(HA) 유전자의 절단 위치(여러 염기성 아미노산을 함유하는)를 병원성으로부터 비병원성 표현형으로(RERRRKKR(서열 9)로부터 ----TETR로) 돌연변이시켰다. 돌연변이된 HA 유전자를 함유하는 바이러스는 닭에서 비-치명적, 국소화된 감염을 일으켰다. 부가적으로, 돌연변이된 바이러스는 닭 배아에 치명적이지 않았다. 따라서, 배발생된 알에서 돌연변이된 바이러스의 성장은 양질의 요막액을 생성시켰고, 이 약독화된 형태에서, 바이러스는 백신 생산자에 대해 안전하다.

계란에서 다른 A/PR/8/34 PR8 균주 보다 10 배 잘 자라는(10¹⁰ EID₅₀/㎖; HA 역가: 1:8,000), HK213으로부터의 뉴라미니다제(NA) 및 돌연변이된 HA 유전자, 및 고-역가 A/PR/8/34(H1N1, HG-PR8) 바이러스로부터의 모든 나머지 유전자를 함유하는 재조합 바이러스(실시예 2)를 배발생된 계란에서 생성시켰다. 현재 돌고 있는 병원성 조류 인플루엔자 바이러스와 관련된 표면 단백질을 발현하는 이 재조합 바이러스는 배발생된 계란에서 고 역가로 성장하였다(도 4). 따라서, HG-PR8의 HA 및 NA 유전자의 인플루엔자 바이러스의 현재 돌고 있는 균주의 것들로의 대체는 안전하게 생산될 수 있는 백신 균주를 생성하였으며, 주 백신 균주로서의 PR8-HG의 용도를 입증하였다.

참조문헌

모든 간행물, 특허 및 특허출원은 본원에 참고로 인용된다. 상기 명세서에서 본 발명을 그의 특정 바람직한 태양에 관하여 설명하고, 많은 상세내용을 설명 목적을 위해 기재하였지만, 본 발명이 부가적인 태양을 가질 수 있고 여기에 설명된 특정 상세내용은 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Kawaoka, Yoshihiro <120> High Titer Recombinant Influenza Viruses for Vaccines and Gene Therapy <130> 800.038WO1 <150> US 60/473,798 <151> 2003-05-28 <160> 40 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2233 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 1 agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60 attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca 120 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac 180 ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg 240 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac 300 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360 aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg 480 gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa 540 accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt 600 cagtccgaga gaggagaaga 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<211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 11 ccaggacact gaaatttctt tcac 24 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 12 cacacaggtc tcctattagt agaaacaagg cattt 35 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 13 cacacaggtc tccgggagcg aaagcaggtc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 14 cacacacgtc tccatcatac aatcctcttg 30 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 15 ctcctctgat ggtggcatac 20 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 16 cacacaggtc tcctattagt agaaacaagg tcgttt 36 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 17 cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggta c 31 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 18 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tactt 35 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 19 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggg 30 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 20 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttt 37 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 21 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt a 31 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 22 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtattttt 38 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 23 cacacaggtc tccgggagca aaagcaggag t 31 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 24 cacacaggtc tggtattagt agaaacaagg agtttttt 38 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 25 cacacacgtc tccgggagca aaagcaggta g 31 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 26 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tagttttt 38 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 27 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt g 31 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 28 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttt 37 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector sequence <400> 29 gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector sequence <400> 30 ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc 33 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(18) <223> n = A,T,C or G <400> 31 cgtctcntat tagtagaa 18 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 32 ttttgctccc ngagacg 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 33 cgtctcnggg agcaaaa 17 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(18) <223> n = A,T,C or G <400> 34 ttctactaat angagacg 18 <210> 35 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 35 tattagtaga a 11 <210> 36 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 36 gggagcaaaa 10 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 37 gggttattag tagaa 15 <210> 38 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 38 ttttgctccc ccc 13 <210> 39 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 39 ggggggagca aaa 13 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 40 ttctactaat aaccc 15

Claims

서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M, NS 또는 이들의 일부를 코딩하는 핵산 분절, 또는 핵산 분절의 상보체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M 또는 NS를 코딩하는 핵산 분절, 또는 핵산 분절의 상보체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 8 중 하나 또는 그의 상보체와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 8 중 하나 또는 그의 상보체와 중간 엄격도 조건 하에서 혼성화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 프로모터가 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T3 프로모터 또는 T7 프로모터인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드에 대하여 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
(a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되고, 이때 하나 이 상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터; 및

(b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되고, 임의로 또한 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되며, 이때 임의로 하나 이상의 벡터가 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터

를 포함하는, 복수의 인플루엔자 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
(a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 NB 및 NA에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되고, 이때 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터; 및

(b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되고, 임의로 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔 자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되며, 이때 임의로 하나 이상의 벡터가 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 둘 이상의 벡터

를 포함하는, 복수의 인플루엔자 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, HA가 A형 HA인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, HA가 B형 HA인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, (a)의 복수의 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 조성물.
제12항에 있어서, RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터가 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, (a)의 모든 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, (a)의 각 벡터가 별개의 플라스미드 상에 존재하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, (b)의 각 벡터가 별개의 플라스미드 상에 존재하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, (b)의 각 벡터가 RNA 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 관심 cDNA에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 관심 cDNA가 센스(sense) 배향으로 있는 것인 조성물.
제18항에 있어서, 관심 cDNA가 안티센스(antisense) 배향으로 있는 것인 조성물.
제18항에 있어서, 관심 cDNA가 면역원성 폴리펩티드 또는 병원체의 펩티드 또는 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 것인 조성물.
감염성 인플루엔자 바이러스를 생성시키는데 유효한 양의 제8항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
제22항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제22항의 방법에 의해 수득된 바이러스.
인플루엔자 바이러스를 생성시키는데 유효한 양의 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 세포와 접촉시키고, 바이러스를 단리하는 것을 포함하는, 유전자 전달 비히클의 제조 방법.
제25항의 방법에 의해 수득된 바이러스.
제8항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉된 세포.
제24항 또는 제26항의 바이러스로 감염된 세포.
서열 1에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플 루엔자 바이러스 PA, 서열 2에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 PB1, 서열 3에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 PB2, 서열 4에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 NP, 서열 7에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA, 서열 8에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 NA, 서열 5에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 및(또는) 서열 6에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 인플루엔자 바이러스 NS인 인플루엔자 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분절, 및 프로모터를 포함하는 벡터.
전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터와 세포를 접촉시켜 감염성 바이러스를 생성시키는 것을 포함하고, 이때 바이러스 cDNA를 포함하는 하나 이상의 벡터내 프로모터가 전사 종결 서열에 연결된 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
제30항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이 러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 관심 cDNA 또는 그의 단편에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 관심 cDNA가 면역원성 폴리펩티드 또는 병원체의 펩티드 또는 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 관심 cDNA가 센스 배향으로 있는 것인 방법.
제32항에 있어서, 관심 cDNA가 안티센스 배향으로 있는 것인 방법.
제32항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열 7에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 HA를 코딩하는 것이 아니고(아니거나) 서열 8에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 NA를 코딩하는 것이 아닌 방법.
제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제30항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 바이러스.
제38항의 바이러스와 접촉된 세포.
제38항의 바이러스로 감염된 세포.
개체를 면역화하는데 유효한 양의 제38항의 바이러스를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체에 대해 개체를 면역화하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 인플루엔자 바이러스.