KR20060026854A - ＰｏｌⅡ 프로모터 및 리보자임을 갖는 재조합 인플루엔자벡터 - Google Patents

ＰｏｌⅡ 프로모터 및 리보자임을 갖는 재조합 인플루엔자벡터 Download PDF

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KR20060026854A
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Abstract

본 발명은, 예를 들어 헬퍼 바이러스의 부재 하에 PolⅡ 프로모터 및 다수의 리보자임 서열을 포함하는 벡터를 이용한, 인플루엔자 바이러스의 제조에 유용한 조성물을 제공한다.
PolⅡ 프로모터, 리보자임, 벡터, 인플루엔자 바이러스

Description

ＰｏｌⅡ 프로모터 및 리보자임을 갖는 재조합 인플루엔자 벡터 {Recombinant Influenza Vectors with a PolII Promoter and Ribozymes}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2003년 5월 28일 출원된 미국출원 제60/473,797호 출원일에 대한 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 주장하고, 상기 문헌의 개시 내용은 이 거명을 통해 본원에 포함된 것으로 간주한다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미합중국 정부로부터의 허가(내셔널 인스티튜트 오브 앨러지 앤드 인펙셔스 디지지즈 퍼블릭 헬쓰 서비스 (National Institute of Allergy and Infectious Diseases Public Health Service)로부터의 허가 AI-47446)로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가질 수 있다.
(-)-센스 RNA 바이러스는 7개의 과, 즉 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 파라믹소바이러스과(Pramyxoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 보르나바이러스과(Bornaviridae), 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae) 및 아레나바이러스과(Arenaviridae)로 분류되며, 여기에는 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스 및 에볼라 바이러스와 같은 통상적인 인간 병원체, 및 가금류와 축산업에 경제적으로 중요한 영향을 미치는 동물 바이러스 (예컨대, 뉴케슬 질환 바이러스 및 우역(牛疫) 바이러스)가 포함된다. 앞쪽 4개의 과는 게놈이 분절화되지 않는다는 특징이 있는 반면, 뒤쪽 3개의 과는 각각 6-8개, 3개 또는 2개의 (-)-센스 RNA 분절(segment)로 구성된 게놈을 갖는다는 특징이 있다. (-)-센스 RNA 바이러스의 공통적인 특징은 이들 RNA 게놈의 (-) 극성에 있다 (즉, 바이러스 RNA (vRNA)가 mRNA에 상보적이므로 그 자체가 감염성은 아님). 바이러스 전사 및 복제를 개시하기 위해, vRNA는 바이러스 폴리머라제 복합체 및 핵단백질에 의해 각각 (+)-센스 mRNA 또는 cRNA로 전사되어야 하며, A형 인플루엔자 바이러스의 경우에는 바이러스 폴리머라제 복합체가 3개의 폴리머라제 단백질인 PB2, PB1 및 PA로 구성되어 있다. 바이러스 복제 과정에서, cRNA는 새로운 vRNA 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용한다. 모든 (-)-가닥 RNA 바이러스의 경우, vRNA 및 cRNA의 5'과 3' 양쪽 말단에 있는 비-코딩 영역이 바이러스 게놈의 전사 및 복제에 중요하다. 세포 mRNA 전사체 또는 바이러스 mRNA 전사체와 달리, cRNA 및 vRNA 둘 다는 5' 말단에서 캡핑되지도 않고 3' 말단에서 폴리아데닐화되지도 않는다.
많은 바이러스 단백질의 기본적인 기능은 생화학적으로 밝혀지고(지거나) 바이러스 감염의 관점에서 밝혀져 왔다. 그러나, 역 유전학 (reverse genetics) 시스템으로 인해, (-)-가닥 분절화 및 비-분절화 RNA 바이러스의 바이러스 복제 및 병원성에 대한 지식이 현저하게 증가하였으며, 또한 약독화 바이러스 생백신의 개 발에 대한 지식도 현저하게 증가하였다. 분자 바이러스학에서 사용되는 용어인 "역 유전학"은 클로닝된 cDNA로부터 유래한 게놈을 소유하는 바이러스의 생성으로서 정의된다 (고찰을 위해서는 문헌 [Neumann et al., 2002] 참조).
(-)-가닥 RNA 바이러스의 바이러스 복제를 개시하기 위해서는 vRNA(들) 또는 cRNA(들)이 폴리머라제 복합체 및 핵단백질과 함께 발현되어야 한다. 광견병 바이러스는 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 생성된 최초의 비-분절화 (-)-센스 RNA 바이러스였으며 (문헌 [Schnell et al. (1994)]), 이 재조합 광견병 바이러스는 전장 cRNA를 코딩하는 cDNA 작제물과 L, P 및 N 단백질에 대한 단백질 발현 작제물 (모두 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절 하에 있음)의 동시-형질감염에 의해 생성되었다. T7 RNA 폴리머라제가 제공된 재조합 백시니아 바이러스로의 감염에 의해 감염성 광견병 바이러스가 생성되었다. 이러한 T7 폴리머라제 시스템에 있어, T7 RNA 폴리머라제의 조절 하에 있는 전장 cRNA의 1차적인 전사는 캡핑되지 않은 cRNA 전사체를 생성하였다. 그러나, T7 RNA 폴리머라제에 대한 최적의 개시 서열을 형성하는 3개의 구아니딘 뉴클레오티드가 5' 말단에 부착되어 있었다. 생산성 감염 주기에 필수적인 cRNA 전사체의 진정한 3' 말단을 생성하기 위해, cRNA 전사체의 3' 말단에서의 정확한 자발촉매성 절단을 위해 간염 델타 리보자임(HDVRz) 서열을 사용하였다.
문헌 [Schnell et al. (1994)]에 의한 최초 보고 이후, 유사한 기술을 이용한 역 유전학 시스템으로 다수의 비-분절화된 (-)-가닥 RNA 바이러스가 생성되었다 (문헌 [Conzelmann, 1996], [Conzelmann, 1998], [Conzelmann et al., 1996], [Marriott et al., 1999], [Munoz et al., 2000], [Nagai, 1999], [Neumann et al., 2002], [Roberts et al., 1998], [Rose, 1996]). 원래의 복구(rescue) 절차를 개선한 방법으로는 안정하게 형질감염된 세포주 (문헌 [Radecke et al., 1996]) 또는 단백질 발현 플라스미드 (문헌 [Lawson et al., 1995])로부터의 T7 RNA 폴리머라제 발현, 또는 복구 효율의 증가를 위한 열 충격 절차 (문헌 [Parks et al., 1999])가 포함된다. T7 폴리머라제 시스템에 기초하여, 문헌 [Bridgen and Elliott (1996)]에서는 클로닝된 cDNA로부터 분얌웨라(Bunyamwera) 바이러스 (분야바이러스과)를 생성하여, T7 폴리머라제 시스템에 의해 분절화된 (-)-센스 RNA 바이러스를 인공적으로 생성할 수 있음을 입증하였다.
1999년에, 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 분절화된 A형 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위해, 세포 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 기초하여 플라스미드-기반의 역 유전학 기술이 창시되었다 (문헌 [Fodor et al., 1999], [Neumann and Kawaoka, 1999]). 인플루엔자 바이러스 RNA와 유사한 리보솜 RNA를 합성하는 핵인의 효소인 RNA 폴리머라제 Ⅰ은 5' 캡 또는 3' 폴리A 구조를 함유하지 않는다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 및 터미네이터 서열에 인접한, 인플루엔자 바이러스 cDNA를 함유하는 작제물의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사는 인플루엔자 vRNA 합성을 초래하였다 (문헌 [Fodor et al., 1999], [Neumann and Kawaoka, 1999], [Neumann and Kawaoka, 2001], [Pekosz et al., 1999]). 이 시스템은 매우 효율적이었으며, 형질감염 48시간 후에 플라스미드-형질감염된 세포의 상층액 1 ml 당 108개가 넘는 감염성 바이 러스 입자를 생성하였다. 그러나, RNA 폴리머라제 Ⅰ의 숙주 세포 특이성으로 인하여 RNA 폴리머라제 Ⅰ 시스템을 사용하는데 제한이 있다. 예를 들어, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터의 프로모터 서열은 이종 RNA 폴리머라제 Ⅰ (예컨대, 쥐과동물 RNA 폴리머라제 Ⅰ)에 의해 인식되지 않는다 (문헌 [Grummt et al., 1982], [Learned et al., 1982]).
따라서, 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 분절화된 (-)-가닥 RNA 바이러스, 예컨대 A형 인플루엔자 바이러스와 같은 오르쏘믹소바이러스를 제조하는 개선된 방법이 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 하기 단리 및(또는) 정제된 벡터들, 즉 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함 하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 BM2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 제공하며, 여기서 상기 벡터는 제1 (5') 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하고, 상기 제1 리보자임 서열은 바이러스 cDNA에 연결되어 있고, 상기 바이러스 cDNA는 전사 종결 서열에 연결된 제2 (3') 리보자임 서열에 연결되어 있다. 본 발명의 범위 내에 있는 리보자임으로는 테트라하이메나 리보자임, RNase P, 햄머헤드(hammerhead) 리보자임, 헤어핀 리보자임, 간염 리보자임, 및 합성 리보자임이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다 (대표적인 리보자임에 대해서는 문헌 [Kumar et al. (1995)], [Pley et al. (1994)], [Chowrira et al. (1994)], [Kijima et al. (1995)], 및 미국 특허 제5,631,115호 및 제5,683,902호 참조). RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 벡터 내의 리보자임 서열은 동일하거나 상이할 수 있으며, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 다수의 벡터가 사용되는 경우에는 각 벡터가 임의의 다른 벡터에 대해 동일하거나 상이한 리보자임 서열을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 한 벡터 내의 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 다른 벡터 내의 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터와 동일하거나 상이할 수 있다. cDNA는 프로모터에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터는 오르쏘믹소바이러스 단백질 (센스) 또는 vRNA (안티센스)를 코딩할 수 있다. 임의의 적합한 프로모터 또는 전사 종결 서열을 사용하여, 예컨대 바이러스 단백질, 바이러스를 제외한 병원체의 단백질, 또는 치료 단백질과 같은 소정의 단백질을 발현할 수 있다.
한 실시양태에서, vRNA 생성을 위한 하나 이상의 벡터는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상 (전부는 아님)의 vRNA 생성용 벡터는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터 이외의 프로모터를 포함하며, 그러한 프로모터로는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 (예컨대, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터), RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터, 또는 T3 프로모터가 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 vRNA용 벡터 내에 전사 종결 서열이 존재하는 경우, 상기 전사 종결 서열은 3' 리보자임 서열에 대해 3'에 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열인 것이 바람직하다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하지 않는 vRNA 벡터용 전사 종결 서열로 바람직한 것으로는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열, 또는 리보자임이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 비록 임의의 바이러스의 유전자(들)이 본 발명의 벡터 또는 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려되기는 하지만, 상기 벡터가 인플루엔자 cDNA, 예컨대 A형 (예를 들어, 15 HA 또는 9 NA 서브타입 중 어느 것을 포함하는 임의의 A형 인플루엔자 유전자), B형 또는 C형 인플루엔자 DNA (이 거명을 통해 그 내용이 본원에 포함된 것으로 간주하는 문헌 [Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA(1996)]의 챕터 45 및 46 참조)를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 다수의 오르쏘믹소바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이 조성물은 a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터 (여기서, 하나 이상의 벡터는 제1 리보자임 서열에 대해 5'에 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하고, 상기 제1 리보자임 서열은 바이러스 코딩 서열에 상응하는 서열에 대해 5'에 있고, 상기 바이러스 코딩 서열은 제2 리보자임 서열에 대해 5'에 있으며, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 대해 5'에 있음); 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터를 포함한다. 임의로는, 벡터 b)가 NP, NS, M, 예컨대 M1 및 M2, HA 또는 NA를 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 조성물은 a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 BM2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터 (여기서, 하나 이상의 벡터는 제1 리보자임 서열에 대해 5'에 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하고, 상기 제1 리보자임 서열은 바이러스 코딩 서열을 포함하는 바이러스 서열에 상응하는 서열에 대해 5'에 있고, 상기 바이러스 서열은 제2 리보자임 서열에 대해 5'에 있으며, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 대해 5'에 있음); 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터를 포함한다. 임의로는, 벡터 b)가 NP, NS, M, HA 또는 NA를 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다.
바람직하게는, 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터가 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 인플루엔자 바이러스 cDNA를 포함하는 벡터에 대한 프로모터가 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터를 포함하지만, 하나 이상의 vRNA용 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 vRNA용 벡터는 리보자임 서열에 인접한 바이러스 코딩 서열, 및 임의로는 3' 리보자임 서열에 대해 3'에 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상 (전부는 아님)의 vRNA 생성용 벡터가 전사 종결 서열, 예컨대 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열, 또는 리보자임을 포함한다. 한 실시양태에서, 2개 이상, 바람직하게는 그 이상 (예컨대, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개)의 vRNA 생성용 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, 제1 리보자임 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1 리보자임 서열은 바이러스 코딩 서열을 포함하는 바이러스 서열에 상응하는 서열에 대해 5'에 있고, 상기 바이러스 서열은 제2 리보자임 서열에 대해 5'에 있고, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 대해 5'에 있다. 각 vRNA 벡터 내의 각 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 임의의 다른 vRNA 벡터 내의 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터와 동일하거나 상이할 수 있다. 이와 유사하게, 각 vRNA 벡터 내의 각 리보자임 서열은 임의의 다른 vRNA 벡터 내의 리보자임 서열과 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 벡터 내의 리보자임 서열은 동일하지 않다. 바람직하게는, 벡터가 인플루엔자 DNA, 예컨대 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 DNA를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는, 임의로 5' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있는 5' 오르쏘믹소바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 상기 기재된 본 발명의 조성물을 포함하며, 여기서 상기 서열은 전사 종결 서열에 연결된 3' 오르쏘믹소바이러스 서열 (임의로 3' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있음)에 연결된 원하는 핵산 서열 (예컨대, 원하는 cDNA)에 연결되어 있다. 바람직하게는, cDNA와 같은 원하는 핵산 서열은 안티센스 배향이다. 오르쏘믹소바이러스 복제를 허용할 수 있는 숙주 세포에 그러한 조성물을 도입하면, 3' 오르쏘믹소바이러스 서열 (임의로 3' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있음)에 연결된 cDNA에 연결된 5' 오르쏘믹소바이러스 서열 (임의로 5' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있음)을 포함하는 벡터의 서열에 상응하는 vRNA를 포함하는 재조합 바이러스가 생성된다. 그러한 vRNA 생성용 벡터의 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터일 수 있으며, 임의로는 상기 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열 또는 리보자임과 같은 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 cDNA (관심 cDNA)를 포함하는 벡터는 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하고, 여기서 상기 제1 리보자임 서열은 관심 cDNA에 연결되어 있고, 상기 관심 cDNA는 제2 리보자임 서열에 연결되어 있으 며, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 상기 벡터는 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하고, 여기서 상기 제1 리보자임 서열은 5' 오르쏘믹소바이러스 서열 (임의로 5' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있음)에 연결되어 있고, 상기 5' 오르쏘믹소바이러스 서열은 관심 cDNA에 연결되어 있고, 상기 관심 cDNA는 3' 오르쏘믹소바이러스 서열 (임의로 3' 오르쏘믹소바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있음)에 연결되어 있고, 상기 3' 오르쏘믹소바이러스 서열은 제2 리보자임 서열에 연결되어 있으며, 상기 제2 리보자임 서열은 전사 종결 서열에 연결되어 있다. 다른 실시양태에서, 관심 cDNA는 단백질 발현용 벡터 내에 존재할 수 있다. 관심 cDNA는 vRNA용 벡터 내에 있든지 단백질 생성용 벡터 내에 있든지 무관하게, 암 요법 또는 백신, 또는 유전자 요법에 유용한 에피토프와 같은 면역원성 에피토프를 코딩할 수 있다.
본 발명의 다수의 벡터가 물리적으로 연결되거나, 또는 각 벡터가 개별 플라스미드 또는 다른 (예컨대, 선형) 핵산 전달 비히클(vehicle)에 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어 본 발명의 조성물을 감염성 인플루엔자 바이러스 산출에 유효한 양으로 사용하여, 소정의 세포를 본 발명의 다수의 벡터와 접촉 (예컨대, 순차적으로 또는 동시에 접촉)시키는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 조성물과 접촉한 세포로부터 바이러스를 단리하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 단리된 바이러스 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물 또는 바이러스와 접촉한 숙주 세포도 추가로 제공 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 세포를 하나 이상의 벡터 (vRNA용 벡터 또는 단백질 생성용 벡터)와 접촉시킨 후에, 다른 벡터 (vRNA용 벡터 또는 단백질 생성용 벡터)와 접촉시키는 것을 포함한다.
하기 기재되는 바와 같이, A형 인플루엔자 바이러스는 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 제조되었다. 더욱이, 동일한 접근법을 이용하여 다른 바이러스가 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 비-분절화된 (-)-가닥 RNA 바이러스 (즉, 파라믹소바이러스과, 랍도바이러스과 및 필로바이러스과) 또는 다른 분절화된 (-)-가닥 RNA 바이러스 (예컨대, 아레나바이러스과 및 분야바이러스과)를 생성하게 할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 예를 들어 감쇠(attenuating) 돌연변이를 바이러스 게놈에 도입함으로써 인플루엔자 바이러스의 용이한 조작이 가능해진다. 추가로, 인플루엔자 바이러스는 강력한 체액성 및 세포성 면역을 유도하기 때문에, 본 발명은 백신 벡터로서 (특히, 바이러스 천연 변이체의 입수가능성 관점에서) 이들 바이러스를 현저하게 증진시키며, 이는 순차적으로 이용되어 유전자 요법에 대한 반복 사용을 가능하게 할 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현 또는 코딩하거나 또는 인플루엔자 vRNA (천연 및 재조합 vRNA 둘 다)를 발현 또는 코딩하는 단리 및 정제된 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 관심 유전자 또는 관심 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 예를 들어 백신으로서 유용한 면역원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인플루엔자 vRNA를 발현하는 벡터 또는 플라스미드는 특 정 숙주 세포 (예를 들어, 조류 또는 포유류 숙주 세포, 예컨대 개과 동물 세포, 고양이과 동물 세포, 말과 동물 세포, 소과 동물 세포, 양과 동물 세포, 또는 인간 세포를 비롯한 영장류 세포)에서의 발현에 적합한 프로모터, 또는 바람직하게는 둘 이상의 숙주에서의 발현에 적합한 프로모터를 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 인플루엔자 vRNA의 제조에 유용한 DNA를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 플라스미드가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열을 포함한다. 관심 유전자 또는 관심 오픈 리딩 프레임을 포함하는 벡터 또는 플라스미드에 있어서, 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임이 인플루엔자 바이러스의 5' 및 3' 인플루엔자 바이러스 서열 (각각 5' 및 3' 비-코딩 서열 포함)에 인접하는 것이 바람직하며, 한 실시양태에서는 5' 및 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 인접한 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임이 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터 및 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 바이러스를 제조할 때, 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 벡터 또는 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 게놈에 대한 벡터 또는 플라스미드를 대체할 수 있으며, 또한 모든 인플루엔자 바이러스 유전자 대한 벡터 또는 플라스미드에 추가하여 사용될 수 있다.
헬퍼 바이러스 감염이 필요하지 않는 본원 기재의 바이러스 제조 방법은 바이러스 돌연변이유발 연구에 유용하고, 또한 백신 (예를 들어, AIDS, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 리노바이러스, 필로바이러스, 말라리아, 허피스, 및 아구창(鵝口瘡)에 대한 백신) 및 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 암, AIDS, 아데노신 데아미나제, 근위축증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍 및 중추신경계 종양에 대한 유전자 요법 벡터)의 제조에 유용하다. 이와 같이, 의학 요법 (예를 들어, 백신 또는 유전자 요법)에 사용하기 위한 바이러스가 제공된다.
또한, 본 발명은 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 병원체, 또는 악성 종양에 대해 개체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 소정량의 본 발명에 따른 하나 이상의 단리된 바이러스를, 임의로 개체의 면역화에 효과적인 아주반트(adjuvant)와 함께 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 이 바이러스는 병원체 또는 종양-특이적 폴리펩티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 vRNA를 포함한다.
또한, 내생 단백질의 양이 감소되거나 내생 단백질이 결여된다는 특징이 있는 징후 또는 질환에 걸린 포유류에서 내생 단백질의 발현을 증대 또는 증가시키는 방법도 제공된다. 이 방법은 포유류에서 내생 단백질의 양을 증대 또는 증가시키기에 효과적인 양의 본 발명의 단리된 바이러스를 푸유류에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 포유류가 인간이다.
도 1은 확립된 역 유전학 시스템의 개략도이다. RNP 형질감염 방법 (A)에서, 정제된 NP와 폴리머라제 단백질은 시험관내 합성된 vRNA를 사용하여 RNP로 조립된다. 세포는 RNP로 형질감염된 후, 헬퍼 바이러스 감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 방법 (B)에서, RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 복구되는 vRNA를 코딩하는 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드가 세포로 형질감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의한 세포내 전사는 합성 vRNA를 생성시키고, 헬퍼 바이러스 로의 감염시 자손 바이러스 입자로 팩키징된다. 양 방법으로, 형질감염체 바이러스 (즉, 클로닝된 cDNA로부터 유래된 RNA를 함유하는 것들)는 헬퍼 바이러스 집단으로부터 선별된다.
도 2는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 작제물 생성의 개략도이다. 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 cDNA는 PCR에 의해 증폭되고, BsmBⅠ으로 분해되고, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 (P) 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터 (T)를 함유하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 부위에 클로닝되었다 (문헌 [E. Hoffmann, Ph.D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany]). 터미네이터 서열 상류의 티미딘 뉴클레오티드 (*T)는 인플루엔자 바이러스 RNA의 3' 말단을 나타낸다. A형 인플루엔자 바이러스 서열은 굵은 글자로 나타내어져 있다 (서열 26-37).
도 3은 분절화된 (-)-센스 RNA 바이러스를 생성시키기 위해 제안된 역 유전학 방법을 나타낸다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 각각의 8개의 바이러스 RNA 분절에 대한 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드가 단백질 발현 플라스미드와 함께 세포에 형질감염된다. 비록 감염성 바이러스가 PA, PB1, PB2 및 NP를 발현하는 플라스미드에 의해 생성될 수 있을지라도, 모든 나머지 구조 단백질(대괄호로 나타냄)의 발현은 생성되는 바이러스에 따라 바이러스의 생성 효율을 증가시킨다.
도 4는 형질감염체 바이러스로 감염된 세포에서의 FLAG 에피토프 검출을 나타낸다. 항체 염색을 이용하여, PR8-WSN-FL79 (A, D) 또는 A/WSN/33 야생형 바이 러스 (B, E)로 감염된 MDCK 세포, 또는 모의(mock)-감염된 MDCK 세포 (C, F)에서 NA를 동정하였다. 감염 9시간 후, 세포를 파라포름알데히드로 고정하고, 트리톤(Triton) X-100으로 처리하고, 항-FLAG (A-C) 또는 항-WSN NA (D-F) 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 강한 골지 염색 (적색)이 양성 샘플 (A, D 및 E)에서 명백히 나타난다.
도 5는 PA 돌연변이체의 회수를 나타낸다. 각 바이러스의 PA 유전자는 1226 bp 단편 (mRNA의 위치 677 내지 1903, 레인 1, 3, 5)을 산출하는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 증폭되었으며, 이어서 이를 제한효소 Bsp120Ⅰ (mRNA의 위치 846, 레인 4, 7) 또는 PvuⅡ (mRNA의 위치 1284, 레인 2, 6)로 분해하였다. PCR 산물에 Bsp120Ⅰ 또는 PvuⅡ 부위가 존재했기 때문에, 각각 169 bp 및 1057 bp의 단편 또는 607 bp 및 619 bp의 단편이 산출되었다. MW는 분자량 마커를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 인플루엔자 서열을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 (서열 1 내지 16)를 나타낸다.
도 7은 GFP 단백질을 코딩하는 인플루엔자 바이러스-유사 (VLP) RNA를 생성하기 위한 pPolⅠ-GFP 플라스미드를 나타낸다. 이 플라스미드는, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터에 인접한 A형 인플루엔자 바이러스 분절 5의 5'과 3' 비코딩 영역들 사이에 안티센스 배향으로 된 GFP 유전자 (pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA)로부터 유래함)를 함유한다. 개별 단백질 발현 플라스미드, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, GFP 리포터 유전자 코딩 cDNA 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드를 293T 세포에 형질 감염시켰다. RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의한 세포내 전사를 통해 (-) 극성의 GFP vRNA가 산출되었으며, 이는 거꾸로 쓰여진 문자로 나타내져 있다. VLP를 함유하는 상층액을 수거하고, 인플루엔자 헬퍼 바이러스와 혼합하여, MDCK 세포에 접종하였다.
도 8은 A형 인플루엔자 바이러스의 PA, PB1, PB2 및 NP 단백질이 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 생성된 GFP vRNA를 캡시드화시켜 GFP 발현을 초래함을 나타낸다. 리포터 유전자 vRNA의 세포내 합성을 위한 RNA 폴리머라제 Ⅰ-GFP 유전자 플라스미드와 함께, PB2, BP1, PA 및 NP 단백질을 발현하는 플라스미드 (A) 또는 NP 단백질을 발현하는 플라스미드 하나를 제외한 모든 플라스미드 (B)로 293T 세포를 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 48시간 후에 고정하고, 형광현미경으로 GFP 발현을 측정하였다.
도 9는 감염성 인플루엔자 VLP의 생성을 나타낸다. RNA 폴리머라제 Ⅰ-GFP 유전자 플라스미드와 함께, 각각 상이한 바이러스 구조 단백질을 발현하는 9개의 플라스미드 (A) 또는 NP용 작제물을 제외한 8개의 플라스미드 (B)로 293T 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, VLP-함유 상층액을 수집하고, A/WSN/33 헬퍼 바이러스와 혼합하여, MDCK 세포에 접종하였다. 감염 10시간 후에 세포를 고정하고, 형광현미경으로 GFP 발현을 측정하였다.
도 10은 재조합 DNA 분자로 게놈이 증대된 세포에서 인플루엔자 NS2 단백질을 발현하는 Cre 리컴비나제(recombinase)의 용도에 대한 개략도이다. 상기 세포의 게놈은 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하며, 상기 프로모터는 부위 특이적 재조합 부위 (예컨대, loxP)에 연결되어 있고, 상기 재조합 부위는 전사 중지 서열에 연결되어 있으며, 상기 전사 중지 서열은 NS2 유전자와 연결된 제1 부위 특이적 재조합 부위와 동일한 배향으로 제2 부위 특이적 재조합 부위에 연결되어 있다.
도 11은 복제 결함 인플루엔자 바이러스의 제조를 나타낸다.
도 12는 pCAGGS-2Ribo-1의 벡터 맵이다. 척추동물 세포에서, RNA 폴리머라제 Ⅱ는 강력한 닭 β-액틴 프로모터/CMV 인핸서 카세트의 조절 하에 이중 리보자임 카세트의 RNA 전사를 구동시킨다. 바이러스 cDNA는 햄머헤드 리보자임 부위 (HamRz)의 하류 및 HDV 리보자임 부위 (HDVRz)의 상류에 클로닝되어 있다.
도 13은 역 유전학을 위한 전장 vRNA를 생성하는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템의 개략도이다. RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의해 생성된 1차 mRNA 전사체에는 2개의 리보자임 부위 (HamRz 및 HDVRz)에 인접한 vRNA가 포함된다. 리보자임에 의한 자발촉매성 절단은 진정한 5' 및 3' 말단을 갖는 vRNA를 생성시키며, 이는 바이러스 전사 및 복제에서 주형으로서 작용한다.
도 14는 클로닝된 cDNA로부터의 HK3PB2-627E 바이러스 생성을 나타낸다. HK3/PB2-627E의 PA, PB1, NP, M, NS, NA 및 HA vRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 시스템에 의해 합성되는 반면, PB2 vRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템에 의해 제공된다. 단백질 발현 작제물에 의해 발현된 바이러스 NP 및 폴리머라제 단백질은 vRNA를 복제 및 전사시켜, 모든 바이러스 단백질의 합성 및 복제형 인플루엔자 바이러스의 생성을 초래한다.
도 15는 클로닝된 cDNA로부터의 WSN/HK3PB2-627E 바이러스 생성을 나타낸다. A/WSN/33의 PA, PB1, NP, M, NS, NA 및 HA vRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 시스템에 의해 합성되는 반면, WSN/HK3PB2-627E의 PB2 vRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템에 의해 제공된다. 단백질 발현 작제물에 의해 발현된 바이러스 NP 및 폴리머라제 단백질은 vRNA를 복제 및 전사시켜, 모든 바이러스 단백질의 합성 및 복제형 인플루엔자 바이러스의 생성을 초래한다.
도 16은 예시적인 햄머헤드 (HH), 헤어핀 (HP) 및 HDV 리보자임 서열 (서열 23 내지 25)을 나타낸다. 화살표는 자가-프로세싱 부위를 나타낸다.
정의
본원에 사용된 용어 "단리 및(또는) 정제된"은 생체내 물질과 결합되지 않거나, 시험관내 물질로부터 실질적으로 정제되도록 하는, 본 발명의 벡터, 플라스미드 또는 바이러스의 시험관내 제조, 단리 및(또는) 정제를 말한다. 단리된 바이러스 제제는 일반적으로 시험관내 배양과 증식에 의해 얻어지고 실질적으로 다른 감염성 물질이 없다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은 특정 감염성 물질에 대한 표준 검출 방법을 이용하여 그 물질을 검출한 경우에 검출 수준 미만으로 나타나는 것을 의미한다. "재조합" 바이러스는, 예를 들어 바이러스 게놈에 변화를 도입하는 재조합 DNA 기술을 이용하여 시험관내에서 조작된 것이다. 본원에 사용된 용어 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 분절"은 그 서열이 자연 발생적인 것이 아니거나, 그들이 원래 게놈에 위치된 대로 위치하지 않는 자연 발생 서열에 상응하도록, 추후에 시험관내에서 화학적으로 변형될 수 있는, 공급원으로부터 유래되거나 단리된 핵산 (예를 들어, DNA)을 말한다. 공급원으로부터 "유래된" DNA의 예는 유용한 단편으로 동정되고, 이후 본질적으로 순수한 형태로 화학 합성되는 DNA 서열일 것이다. 공급원으로부터 "단리된" 그러한 DNA의 예는 그것이 유전공학의 방법론에 의해 본 발명에서 사용하기 위하여, 추가로 조작 (예를 들어, 증폭)될 수 있도록 화학적 수단 (예를 들어, 제한 엔도뉴클라제의 사용)에 의해 상기 공급원으로부터 절제 또는 분리된 유용한 DNA 서열일 것이다.
인플루엔자 바이러스 복제
A형 인플루엔자 바이러스는 총 10개의 단백질을 코딩하는 8개의 단일-가닥 (-)-센스 바이러스 RNA (vRNA)의 게놈을 갖는다. 인플루엔자 바이러스 생활사는 숙주 세포의 표면에서 시알산-함유 수용체에 대한 헤마글루티닌(HA)의 결합으로 시작하고, 수용체-매개된 내포작용(endocytosis)이 뒤따른다. 후기 엔도좀의 낮은 pH는 HA의 형태적 전이를 촉발함으로써, HA2 서브유닛의 N-말단 (소위 융합 펩티드)을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스와 엔도좀 막의 융합을 개시시키고, 매트릭스 단백질 (M1)과 RNP 복합체가 세포질로 방출된다. RNP는 vRNA를 캡시드화하는 핵단백질 (NP)과, PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 폴리머라제 복합체로 이루어진다. RNP는 전사와 복제가 일어나는 핵으로 수송된다. RNA 폴리머라제 복합체는 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 갖는 mRNA의 합성, 전장 상보적 RNA (cRNA)의 합성 및 주형으로서 cDNA를 사용한 게놈 vRNA의 합성이라는 3가지 상이한 반응을 촉매한다. 새로이 합성된 vRNA, NP 및 폴리머라제 단백질은 그런 다음 RNP로 조립되고, 핵으로부터 배출(export)되고, 자손 바이러스 입자의 버딩(budding)이 일어나는 원형질막으로 수송된다. 뉴라미니다제 (NA) 단백질은 감염 후기에 시알릴로올리고당으로부터 시알산을 제거함으로써 결정적인 역할을 하여, 이에 의해 새로 조립된 비리온을 세포 표면으로부터 방출하고 바이러스 입자의 자가 응집을 방지한다. 비록 바이러스 조립에는 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용이 관여하지만, 이들 상호작용의 성질은 대개 알려져 있지 않다.
비록 B형 및 C형 인플루엔자 바이러스가 A형 인플루엔자 바이러스와 구조적으로나 기능적으로 유사할지라도, 몇몇 차이가 있다. 예를 들어, B형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 유사하게, C형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 그러나, CM1 단백질이 이 활성을 가질 것이다. 이온 채널 단백질의 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Holsinger et al. (1994)] 및 WO 01/79273호 참조).
토고토바이러스( Thogotovirus )
토고토바이러스 (THOV)는 오르쏘믹소바이러스과의 신규한 속(genus)이다. 토고토바이러스는 진드기에 의해 전염되며, 낙타, 염소 및 소를 비롯한 가축에서 발견되어 왔다. 따라서, THOV는 진드기 및 척추동물 세포에서 복제할 수 있다. THOV 게놈은 단일-가닥의 (-)-센스 RNA로 된 6개의 분절을 포함한다. 가장 큰 3개의 분절에 의해 코딩된 단백질은 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 단백질인 PB2, PB1 및 PA에 대해 상당한 상동성을 나타낸다. 분절 5는 인플루엔자 바이러스 NP와 관련된 단백질을 코딩한다. 분절 4에 의해 코딩되는 THOV 당단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA에 대한 상동성이 없으며, 단지 배큘로바이러스(Baculovirus) 당단백질에 대한 서열 유사상을 나타낼 뿐이다. 가장 작은 분절은 매트릭스 단백질을 코딩하는 것으로 생각되며, 어떤 인플루엔자 바이러스 단백질과도 유사하지 않다. 인플루엔자 바이러스와 마찬가지로, vRNA의 3' 및 5' 말단 둘 다가 프로모터 활성에 필요하며, 이 활성은 각각 vRNA 3' 및 5' 말단의 말단 14 및 15번째 뉴클레오티드에 위치한다.
THOV의 mRNA 합성은 숙주 세포-유래의 캡 구조에 의해 프라이밍된다. 그러나, 인플루엔자 바이러스와는 반대로, 캡 구조만이 (추가의 뉴클레오티드 없이) 세포 mRNA로부터 절단된다 (문헌 [Albo et al., 1996], [Leahy et al., 1997], [Weber et al., 1996]). 시험관내 절단 분석 결과, 인플루엔자 바이러스에 대해 입증된 바와 같이 (문헌 [Cianci et al., 1995], [Hagen et al., 1994]), vRNA의 5' 및 3' 말단 둘 다가 엔도뉴클레아제 활성에 필요하지만 (문헌 [Leahy et al., 1998]) 모델 cRNA 프로모터의 부가에 의해 엔도뉴클레아제 활성이 자극되지 않음 (문헌 [Leahy et al., 1998])이 밝혀졌다. THOV에 대해 "후크(hook)" 구조가 제안된 바 있는데 (문헌 [Leahy et al., 1997], [Weber et al., 1997]), 이는 인플루엔자 바이러스에 대해 제안된 코르크스크류(corkscrew) 구조 (문헌 [Flick et al., 1996])와 유사하다. 그러나, 이 "후크" 구조는 THOV vRNA 프로모터에서만 발견된다. cRNA 프로모터 서열은 cRNA의 5' 말단에서 위치 2와 9 사이 및 3과 8 사이의 염기쌍 형성을 허용하지 않는다. 이들 뉴클레오티드 사이에 염기쌍이 형성되도록 위치 3 또는 8을 변경하면 엔도뉴클레아제 활성이 자극되는데, 이는 제안된 "후크" 구조를 지지하는 강력한 증거이다 (문헌 [Leahy et al., 1998]). 더욱이, 이 구조는 THOV 생활사의 조절에 대해 결정적인 요인일 수 있으며, "후크" 구조를 형성하는 vRNA 프로모터는 PB2 엔도뉴클레아제 활성을 자극함으로써 전사되도록 할 수 있다. 이와 반대로, cRNA 프로모터는 "후크" 구조를 형성하지 않을 수 있고, 따라서 엔도뉴클레아제 활성을 자극할 수 없어서 복제를 초래한다.
분야바이러스과
분야바이러스과에는 인간에서 출혈성 발열 또는 뇌염성 발열 (예를 들어, 리프트밸리열(Lift fever valley), 한탄(Hantaan), 라크로스(La Crosse), 및 크리미아-콩고(Crimean-Congo) 출혈성 발열)을 유발하는 몇몇 바이러스가 포함된다. 구형 및 외피형 비리온은 단일-가닥의 (-)-센스 RNA로 된 3개의 분절을 함유한다 (문헌 [Elliott, 1997]에서 고찰됨). 가장 큰 분절 (L)은 바이러스 RNA 폴리머라제 단백질 (L 단백질)을 코딩하는 반면, M 분절은 2개의 바이러스 당단백질인 G1 및 G2와 비-구조 단백질 (NSm)을 코딩한다. 가장 작은 분절 (S)는 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 및 제2 비-구조 단백질 (NSs)을 코딩한다. 바이러스 복제 및 전사는 세포질에서 일어나며, 새로이 조립된 비리온은 골지체의 막을 통해 버딩된다.
문헌 [Bridgen ＆ Elliott (1996)]에서는, 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 감염성 분얌웨라 바이러스을 생성하는 역 유전학 시스템이 확립된 바 있다. 상기 문헌에서는 광견병 바이러스에 대해 문헌 [Schnell et al. (1994)]에 처음으로 기재된 전략, 즉 바이러스 폴리머라제 및 핵단백질을 발현하는 세포에서 (+)-센스 안티게놈 RNA를 코딩하는 ((-)-센스 게놈 RNA를 코딩하지는 않음) cDNA를 세포내에서 전사시키는 전략을 따랐다. 문헌 [Bridgen ＆ Elliott (1996)]에서는 T7 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스로 HeLaT4+ 세포를 감염시키고, S, M 및 L 분절에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 플라스미드로 상기 세포를 형질감염시켰다. 이어서, T7 폴리머라제 프로모터 및 간염 델타 바이러스 리보자임에 인접한 전장 안티-게놈 cDNA를 코딩하는 3개의 플라스미드로 상기 세포를 형질감염시켰다. 백시니아 바이러스 입자에 비해 분야바이러스 입자의 수를 상대적으로 증가시키기 위해, 상기 문헌의 저자들은 분얌웨라 바이러스는 복제되지만 백시니아 바이러스는 복제되지 않는 모기 세포를 사용하였다. 이 프로토콜은 분야바이러스과를 유전공학적으로 조작하는데 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 상이한 분야바이러스과 바이러스로 세포를 동시감염시켜서는 용이하게 수득할 수 없는 재조합체 바이러스(reassortant virus)를 생성하기 위해서도 이용될 수 있다.
전사 및 복제에 필요한 분야바이러스 프로모터 요소 및 바이러스 단백질을 연구하기 위해, 문헌 [Dunn et al. (1995)]에서는 분얌웨라 S RNA 분절의 5'과 3' 비-번역 영역 사이에 (-)-센스 배향으로 CAT 유전자를 클로닝하였다. L 및 S 분절에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 작제물로 세포를 형질감염시키고, 이어서 상기 세포를 시험관내에서 전사된 RNA로 형질감염시켰으며, 그 결과 CAT 활성이 나타났다. 분야바이러스 S 분절은, 중첩 리딩 프레임에서 2개의 단백질인 N 및 NSs를 코딩한다. 이들 2가지 단백질 모두가 전사 및 복제에 필요한지 결정하기 위해, N 또는 NSs만을 발현하는 작제물을 CAT 활성에 대해 시험하였다. L 단백질과 함께 N 단백질을 발현시키면 CAT 활성이 나타난 반면, NSs 발현 작제물만으로는 CAT 활성이 검출되지 않았다. 따라서, L 및 N 단백질이 분야바이러스-유사 RNA의 전사 및 복제에 충분하다.
인플루엔자 바이러스와 같이, 분야바이러스 RNA의 말단 서열은 상보적이며 고도로 보존적이다. 따라서, 이들 서열 요소가 분야바이러스 프로모터를 규정하고 프로모터 활성에 중요하다고 생각되었다. 바이러스 RNA의 3' 말단에서 5개의 뉴클레오티드를 결실시키면 CAT 발현이 극적으로 감소한다 (문헌 [Dunn et al., 1995]). 이와 반대로, 5' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 부가하거나 3' 말단에 11 또는 35개의 뉴클레오티드를 부가하면 CAT 발현이 없어지지 않는다 (문헌 [Dunn et al., 1995]). 따라서, 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 복합체와 마찬가지로 분야바이러스 폴리머라제 단백질도 내부에서 전사 및(또는) 복제를 개시할 수 있음이 분명하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 세포주 및 인플루엔자 바이러스
본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스에 대한 수용체인 하나 이상의 시알산을 감소 또는 저하된 수준으로 발현하는 돌연변이 세포를 비롯하여, 인플루엔자 바이러스의 효율적인 복제를 지지하는 어떠한 세포도 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득되는 바이러스는 재조합체 바이러스로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 세포는 WHO에서 인증되거나 인증가능한 연속 세포주이다. 그러한 세포주를 인증하기 위한 요건으로는 가계, 증식 특성, 면역학적 마커, 바이러스 감수성, 발암성 및 저장 조건 중 적어도 하나에 대한 특성분석, 및 동물, 알 및 세포 배양물에서의 시험에 의한 특성분석이 있다. 그러한 특성분석은 세포가 검출가능한 외래 물질이 없음을 확인하는데 이용된다. 일부 국가에서, 핵학이 또한 요구될 수 있다. 또한, 발암성은 바람직하게는 백신 생산을 위해 사용되는 것들과 동일한 계대 수준에 있는 세포에서 시험된다. 바이러스는, 바람직하게는 백신 생산을 위해 불활성화되거나 약독화되기 전에, 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타난 방법에 의해 정제된다(예를 들어, 문헌 [World Health Organization, 1982] 참조).
최종 산물의 순도에 대한 적절한 시험이 포함될 수 있도록, 사용되는 세포주의 완전한 특성분석을 확립하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 세포의 특성분석을 위해 이용될 수 있는 데이터로는 (a) 그의 기원, 유래 및 계대 내력에 관한 정보; (b) 그의 증식 및 형태학적 특성에 관한 정보; (c) 외래 물질의 시험 결과; (d) 세포가 다른 세포주 사이에서 명확하게 인식되도록 하는 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 패턴과 같은 구별가능한 특징; 및 (e) 발암성에 대한 시험결과가 있다. 사용되는 숙주세포의 계대 수준, 또는 집단 이배수화(doubling)는 가능한 한 낮은 것이 바람직하다.
세포에서 생성되는 바이러스는 백신이나 유전자 요법용으로 제제화하기 전에 고도로 정제하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 절차는 세포 DNA, 기타 세포 성분 및 외래 물질의 철저한 제거를 초래할 것이다. DNA를 철저하게 분해하거나 변성시키는 절차도 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Mizrahi, 1990] 참조).
백신
본 발명의 백신은 임의 병원체의 당단백질을 비롯한 면역원성 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 백신 벡터, 또는 HIV와 같은 렌티바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, CMV 또는 HSV와 같은 허피스 바이러스 또는 아구창 바이러스 등을 비롯한 기타 바이러스 병원체의 백신 벡터일 수 있다.
완전한 비리온 백신은 한외여과에 의해 농축된 후 구역 원심분리나 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그것은 정제 전이나 후에, 예를 들어 포르말린이나 베타-프로피오락톤을 사용하여 불활성화된다.
서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 그러한 백신은 세제로의 처리에 의해 단편화된 바이러스 현탁액을 이용하여, 예를 들어 초원심분리에 의해 표면 항원을 정제함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질을 포함하며, 또한 NA도 포함한다. 사용되는 세제는, 예를 들어 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 (문헌 [Bachmeyer, 1975])와 같은 양이온성 세제, 암모늄 데옥시콜레이트 (문헌 [Laver ＆ Webster, 1976], [Webster et al., 1977])와 같은 음이온성 세제, 또는 상품명 트리톤(TRITON) X100으로 시판되고 있는 것과 같은 비온성 세제일 수 있다. 헤마글루티닌은 또한 브로멜린(bromelin)과 같은 프로테아제로 비리온을 처리한 후에 단리될 수 있고, 이어서 문헌 [Grand and Skehel (1972)]에 기재된 것과 같은 방법에 의해 정제될 수 있다.
스플릿(split) 백신은 지질을 용해시키는 물질로 처리한 비리온을 포함한다. 스플릿 백신은, 불활성화되거나 되지 않은, 위와 같이 수득된 정제 바이러스의 수성 현탁액을 교반 하에 세제와 연계된 에틸에테르나 클로로포름과 같은 지질 용매에 의해 처리함으로써 제조될 수 있다. 바이러스 외피의 지질을 용해시키면 바이러스 입자가 단편화된다. 그들의 원래 지질 환경이 제거된, 헤마글루티닌과 뉴라미니다제, 및 코어 또는 그 분해 산물로 주로 구성된 스플릿 백신 함유 수성상이 회수된다. 그런 다음 이것이 이미 행해지지 않은 경우 잔여 감염성 입자가 불활성화된다.
불활성화 백신. 본 발명의 불활성화 인플루엔자 바이러스 백신은 포르말린 또는 β-프로피오락톤 처리와 같은, 그러나 그로 제한되지 않는 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 불활성화함으로써 제공된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 불활성화 백신의 유형으로는 전체-바이러스(WV) 백신 또는 서브비리온(SV)(스플릿) 백신이 있을 수 있다. SV 백신이 지질-함유 바이러스 외피를 가용화하는 세제로 파쇄된 후에 잔여 바이러스가 화학적으로 불활성화된 정제된 바이러스를 함유하는 반면, WV 백신은 손상되지 않은 불활성화 바이러스를 함유한다.
또한, 사용될 수 있는 백신으로는 표면 항원 또는 서브유닛 백신으로 언급되는, 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들이 있다. 일반적으로, SV 및 표면 항원 (즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. 유행성 바이러스와 면역학적으로 관련된 NA 항원과 관련되지 않은 HA를 함유하는, 실험적으로 불활성화된 WV 백신은 통상적인 백신 (문헌 [Orga et al., 1977]) 보다 덜 효과적인 것 같다. 두 관련 표면 항원을 함유하는 불활성화 백신이 바람직하다.
약독화 바이러스 생백신. 약독화 인플루엔자 바이러스 생백신 또한 공지의 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 약독화는 바람직하게는 공지의 방법에 따라 약독화된 공여자 바이러스로부터, 복제된 단리물 또는 재조합체 바이러스로 약독화된 유전자를 전달함으로써 단일 단계로 달성된다 (예를 들어, 문헌 [Murphy, 1993] 참조). A형 인플루엔자 바이러스에 대한 내성은 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역반응의 발생에 의해 매개되므로, 이들 표면 항원을 코딩하는 유전자가 재조합체 바이러스 또는 고도 증식 임상 단리물로부터 나와야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 부모로부터 유래된다. 이 접근법에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다. 그렇지 않으면, 이들 유전자는 임상적 바이러스 단리물의 표면 항원을 갖는 재조합체로 전달될 수 없다.
많은 공여자 바이러스가 인플루엔자 바이러스를 재현가능하게 약독화하는 그들의 능력에 대해 평가되어 왔다. 비제한적 예로서, A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2) 저온 적응(ca) 공여자 바이러스가 약독화된 백신 생산을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Edwards, 1994], [Murphy, 1993] 참조). 부가하여, 약독화된 재조합체 바이러스 생백신은 ca 공여자 바이러스를 본 발명의 병원성의 복제된 바이러스와 교배함으로써 생성될 수 있다. 이후에, 재조합체 자손은 약독화된 A/AA/6/60(H2N2) ca 공여자 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 저해하는 H2N2 항혈청의 존재 하에, 25℃ (병원성 바이러스의 복제를 위해 제한적임)에서 선별된다.
큰 시리즈의 H1N1 및 H3N2 재조합체가 인간에서 평가되었고, (a) 감염성, (b) 혈청음성 어린이와 면역학적으로 준비된 성인을 위한 약독화, (c) 면역원성 및 (d) 유전적 안정성의 측면에서 만족스러운 것으로 확인되었다. ca 재조합체의 면역원성은 그들의 복제 수준과 일맥상통한다. 따라서, 새로운 야생형 바이러스에 의한 ca 공여자 바이러스의 6개의 전달가능한 유전자의 획득은 감수성 성인 및 어린이를 백신접종하는데 사용하도록 이들 바이러스를 재현가능하게 약독화하였다.
다른 약독화 돌연변이가 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자로 도입되어 이들 돌연변이 유전자를 함유하는 감염성 바이러스를 복구할 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 비-코딩 영역, 및 코딩 영역으로 도입될 수 있다. 그러한 약독화 돌연변이는 또한 HA나 NA 이외의 유전자, 예를 들어 PB2 폴리머라제 유전자 (문헌 [Subbarao et al., 1993])로 도입될 수 있다. 따라서, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되는 약독화 돌연변이를 갖는 새로운 공여자 바이러스도 생성될 수 있으며, 그러한 새로운 공여자 바이러스는 A/AA/6/60 ca 공여자 바이러스에 대해 상기된 것과 유사한 방식으로 약독화 재조합체 H1N1 및 H3N2 생백신 후보의 감소에 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지의 적합한 약독화 공여자 균주가 본 발명의 인플루엔자 바이러스와 재조합되어 포유류의 백신접종에 사용하기 적합한 약독화 백신을 얻을 수 있다 (문헌 [Ewami et al., 1990], [Muster et al., 1991], [Subbarao et al., 1993]).
그러한 약독화 바이러스는 원래 임상적 단리물의 것들과 실질적으로 유사한 항원 결정기를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이것은 약독화 백신의 목적이, 백신이 백신접종되는 포유류에서 심각한 병원성 증상을 유도하는 최소한의 변화를 유발하는 정도로 감염성을 결여시킴과 동시에, 바이러스의 원래 임상적 단리물과 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 것이기 때문이다.
따라서, 바이러스는 동물, 예를 들어 포유류에서 면역 반응을 유도하는 백신으로서, 공지의 방법에 따라, 약독화 또는 불활성화되고, 제제화되고 투여될 수 있다. 그러한 약독화 또는 불활성화된 백신이 임상 단리물 또는 그로부터 유래된 고도 증식 균주의 것과 유사한 항원성을 유지하는지 여부를 결정하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 공지의 방법은 공여자 바이러스의 항원 결정기를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항혈청 또는 항체의 사용; 화학적 선별(예를 들어, 아만타딘(amantadine) 또는 리만티딘(rimantidine)); HA 및 NA 활성 및 저해; 및 항원 결정기를 코딩하는 공여자 유전자 (예를 들어, HA 또는 NA 유전자)가 약독화 바이러스에 존재하지 않는지를 확인하기 위한 DNA 스크리닝 (프로브 혼성화 또는 PCR과 같은)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Robertson et al., 1988], [Kilbourne, 1969], [Aymard-Henry et al., 1985], [Robertson et al., 1992] 참조).
제약 조성물
접종이나 비경구 또는 경구 투여를 위해 적당한, 본 발명의 제약 조성물은 약독화 또는 불활성화 인플루엔자 바이러스를 포함하고, 임의로 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀전을 추가로 포함한다. 조성물은 추가로 당업계에 알려져 있는 보조제나 부형제를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1987], [Goodman et al., 1990], [Avery's Drug Treatment, 1987], [Osol, 1980], [Katzung, 1992] 참조). 본 발명의 조성물은 일반적으로 개개 용량(단위 용량) 형태로 제공된다.
통상적인 백신은 일반적으로 당해 조성물로 들어가는 균주 각각으로부터의 헤마글루티닌 약 0.1 내지 200 ㎍, 바람직하게는 10 내지 15 ㎍을 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주성분을 형성하는 백신은 A, B 또는 C형의 바이러스, 또는 이들의 임의 조합, 예를 들어 3가지 유형 중 적어도 2개, 상이한 서브타입의 적어도 2개, 동일한 유형의 적어도 2개, 동일한 서브타입의 적어도 2개, 또는 상이한 단리물(들) 또는 재조합체(들)을 포함할 수 있다. 인간 A형 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H2N2 및 H3N2 서브타입을 포함한다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및(또는) 에멀전을 포함하며, 당업계에 알려진 보조제나 부형제를 함유할 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 담체나 폐색성 드레싱이 피부 투과성을 증가시키고 항원 흡수를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 투여형은 일반적으로 액체 투여형을 함유하는 리포좀 용액을 포함할 수 있다. 리포좀을 현탁하기 위해 적합한 형태로는 정제수와 같이 당업계에 보편적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 에멀전, 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르가 있다. 불활성 희석제 이외에, 그러한 조성물은 또한 아주반트, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 또는 감미제, 향료, 또는 방향제를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992], [Goodman et al., 1990], [Avery's, 1987], [Osol, 1980] 및 [Katzung, 1992] 참조).
본 발명의 조성물이 개체에 투여하기 위해 사용될 때, 추가로 염, 완충액, 아주반트, 또는 조성물의 효능을 향상시키기 위해 바람직한 기타 물질을 포함할 수 있다. 백신의 경우, 아주반트, 즉 특정 면역 반응을 강화할 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 정상적으로, 아주반트와 조성물은 면역계에 제공하기 전에 혼합되거나, 또는 별도로, 그러나 면역화되는 유기체의 동일한 부위로 제공된다. 백신 조성물에서 사용하기에 적당한 재료의 예는 문헌 [Osol (1980)]에 제공되어 있다.
백신에서의 불균일성은 2-50개 균주나 그 안의 어느 범위나 값과 같은, 적어도 2개의 인플루엔자 바이러스 균주용으로 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대적 항원 조성물을 갖는 A 또는 B형 인플루엔자 바이러스 균주가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 백신은 당업계에 알려진 기술을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 단일 균주에서 변이를 위해 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 적어도 하나의 화학요법 화합물, 예를 들어 유전자 요법을 위한 면역억제제, 소염제 또는 면역증강제, 및 백신을 위한 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤즈이미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양괴사인자-알파, 티오세미카르바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 포스카르네트, 포스포노아세트산, 아시클로버, 디데옥시뉴클레오시드, 프로테아제 저해제, 또는 간시클로버를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 화학요법제를 추가 또는 부가적으로 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Katzung (1992)], 및 상기 문헌의 798-800 및 680-681면에 각각 인용된 참고문헌 참조).
조성물은 또한 다양하지만 소량의 무-엔도톡신 포름알데히드와, 조성물이 투여되는 유기체에서 안전하고 바람직하지 않은 영향에 기여하지 않는 것으로 확인된 보존제를 함유할 수 있다.
약제학적 목적
조성물(또는 그것이 유발하는 항혈청)의 투여는 "예방" 또는 "치료" 목적일 수 있다. 예방적으로 투여되는 경우, 백신인 본 발명의 조성물은 병원체 감염의 임의 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 임의의 후속 감염을 예방하거나 약화시키는 역할을 한다. 예방적으로 투여되는 경우, 본 발명의 유전자 요법 조성물은 질환의 임의 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 예방하거나 약화시키는 역할을 한다.
치료적으로 투여하는 경우, 약독화 또는 불활성화 바이러스 백신은 실제 감염의 증상이 검출되면 제공한다. 화합물(들)의 치료적 투여는 임의의 실제 감염을 약화시키는 역할을 한다 (예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992], [Goodman et al, 1990], [Avery, 1987] 및 [Katzung, 1992] 참조). 치료적으로 투여하는 경우, 유전자 요법 조성물은 질환의 증상이나 징후가 검출되면 제공한다. 화합물(들)의 치료적 투여는 그 질환의 증상이나 징후를 약화시키는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 약독화 또는 불활성화 백신 조성물은 감염의 발병 전에(예상되는 감염을 예방하거나 약화시키기 위하여) 또는 실제 감염의 시작 후에 제공될 수 있다. 유사하게, 유전자 요법의 경우, 조성물은 장애나 질환의 임의 증상이 발현되기 전이나 하나 이상의 증상이 검출된 후에 제공될 수 있다.
조성물은 그의 투여가 수혜 환자에 의해 견뎌질 수 있으면 "약리학상 허용되는"이라고 말해진다. 그러한 물질은 투여되는 양이 생리학적으로 유의하면 "치료 유효량"으로 투여된다고 말해진다. 본 발명의 조성물은 그의 존재가 수혜 환자의 생리에 검출가능한 변화를 일으키면, 예를 들어 감염성 인플루엔자 바이러스의 적어도 하나의 균주에 대한 적어도 하나의 일차 또는 이차 체액성 또는 세포성 면역반응을 증진시키면 생리학적으로 유의하다.
제공되는 "보호"는 절대적일 필요는 없으며, 즉 대조군 집단이나 환자 세트에 비해 통계학적으로 유의한 개선이 있으면 인플루엔자 감염이 완전히 예방되거나 근절될 필요는 없다. 보호는 인플루엔자 바이러스 감염 증상의 중증도나 개시 신속성을 완화시키는 것으로 제한될 수 있다.
약제 투여
본 발명의 조성물은 수동 면역화 또는 능동 면역화에 의해 하나 이상의 병원체, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 내성을 부여할 수 있다. 능동 면역화에서, 불활성화 또는 약독화 생백신 조성물은 숙주 (예를 들어, 포유류)에게 예방적으로 투여되며, 투여에 대한 숙주의 면역반응은 감염 및(또는) 질환으로부터 보호한다. 수동 면역화의 경우, 유발된 항혈청이 회수되고 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발되는 감염을 갖는 것으로 의심되는 수혜자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 조성물은 능동 면역화에 의해 예방적 또는 치료적 수준의 목적하는 유전자 산물을 생성시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 백신은 여성 및 태아나 신생아 (태반을 통하거나 모유에 있는 항체의 수동적 도입을 통해) 둘 다를 보호하는 역할을 하는 면역반응의 생성을 유발하기에 충분한 시간과 양의 조건 하에서, 포유류 여성 (임신 또는 출산시, 또는 그 이전)에게 제공된다.
따라서, 본 발명에는 장애나 질환, 예를 들어 적어도 하나의 병원체 균주에 의한 감염의 예방 또는 약화 방법이 포함된다. 본원에 사용된 백신은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화 (또는 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화시킨다고 말해진다. 본원에 사용된 유전자 요법 조성물은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화 (즉, 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화시킨다고 말해진다.
본 발명의 적어도 하나의 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 바이러스, 또는 그의 조성물은 앞서 기재된 제약 조성물을 이용하여, 의도한 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다.
예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 비내, 경구 또는 경피 경로와 같은 다양한 비경구 경로에 의할 수 있다. 비경구 투여는 볼루스 주사에 의하거나 시간에 걸친 점진적 관류일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 이용하는 바람직한 양식은 근육내 또는 피하 적용에 의한 것이다 (예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992], [Goodman et al., 1990], [Avery, 1987] 및 [Katzung, 1992] 참조).
인플루엔자 바이러스 관련된 병리를 예방, 억제 또는 치료하기 위한 전형적 투여 계획은 단일 치료로서 투여되거나, 1 주 내지 약 24 개월, 또는 그 안의 어느 범위나 값 이하와 그를 포함하는 기간에 걸쳐, 증가 또는 부스터 용량으로서 반복되는, 본원에 기재된 유효량의 백신 조성물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"은 목적으로 하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 것이다. 유효 용량은 수혜자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 존재하는 경우, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 의존할 것임이 이해되어야 한다. 아래 제공되는 유효 용량의 범위는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 그러나, 가장 바람직한 용량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개개 대상에게 맞추어질 것이다 (예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992], [Goodman et al., 1990], [Avery's, 1987], [Ebadi, 1985] 및 [Katsung, 1992] 참조).
포유류 (예를 들어, 인간) 또는 조류 성체 유기체를 위한 약독화 바이러스 백신의 용량은 약 103-107 플라크 형성 단위(PFU)/㎏, 또는 그 안의 어느 범위나 값일 수 있다. 불활성화 백신의 용량은 약 0.1 내지 200 ㎍, 예를 들어 50 ㎍의 헤마글루티닌 단백질 범위일 수 있다. 그러나, 용량은 기존 백신을 출발점으로 사용하여, 통상적 방법에 의해 결정시 안전하고 유효한 양이어야 한다.
복제된 바이러스 백신의 각 용량 중의 면역활성 HA의 용량은 적당한 양, 예를 들어 1-50 ㎍ 또는 그 안의 어느 범위나 값, 또는 보통 3세 이상의 어린이를 위해 성분 당 15 ㎍, 및 3세 미만의 어린이를 위해 성분 당 7.5 ㎍인, U.S. 퍼블릭 헬스 서비스(PHS)에 의해 권장되는 양을 함유하도록 표준화될 수 있다. NA의 양 또한 표준화될 수 있지만, 이 당단백질은 가공 정제와 저장 동안 불안정할 수 있다 (문헌 [Kendal et al., 1980], [Kerr et al., 1975]). 각 0.5-㎖ 용량의 백신은 바람직하게는 대략 10억개 내지 500억개의 바이러스 입자, 바람직하게는 100억개의 입자를 함유한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 및 바이러스. 293T 인간 배아 신장 세포 및 마딘-다비(Madin-Darby) 개과동물 신장 세포(MDCK)를 각각 10％ 송아지 태아 혈청이 보충된 둘베코즈 변형 이글 배지(DMEM) 및 5％ 신생 송아지 혈청을 함유하는 변형 이글즈 배지(MEM)에서 유지하였다. 모든 세포를 5％ CO2에서 37℃에 유지하였다. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33(H1N1) 및 A/PR/8/34(H1N1)를 10-일령 알에서 증식시켰다.
플라스미드의 제작. RNA 폴리머라제 Ⅰ 작제물을 생성시키기 위하여, A/WSN/33 또는 A/PR/8/34 바이러스 RNA로부터 유래된 클로닝된 cDNA를 RNA 폴리머라제 Ⅰ의 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 도입하였다. 간략하게, 클로닝된 cDNA를 BsmBⅠ 부위를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭하고, BsmBⅠ으로 분해 하고, BsmBⅠ 부위에 의해 분리된 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 부위로 클로닝하였다 (도 2). A/WSN/33 균주의 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS 유전자를 각각 pSCWPB2, pGW-PB1, 및 pSCWPA (모두 유니버시티 오브 캘리포니아 로스 엔젤레스의 데비 나약(Debi Nayak) 박사로부터 얻음), 및 pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (문헌 [Castrucci et al., 1992]), pGT3WM 및 pWNS1 플라스미드를 사용하여 PCR-증폭하였다. 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 PB1 유전자를, 주형으로 pcDNA774(PB1) (문헌 [Perez et al., 1998])을 이용하여 증폭하였다. 프라이머 서열에 대해서는 도 6을 참조하다. 유전자가 원치않는 돌연변이를 갖지 않음을 보장하기 위해, PCR-유래된 단편을 자동서열분석기(미국 캘리포니아주 소재의 어플라이드 바이오시스템 인크.(Applied Biosystem Inc.))로 제조자에 의해 권장되는 프로토콜에 따라 서열분석하였다. A/WSN/33 바이러스의 HA, NP, NA 및 M1 유전자를 코딩하는 cDNA를 문헌 [Huddleston et al., 1982]에 기재된 바와 같이 클로닝하고, 진핵 발현 벡터 pCAGGS/MCS(닭 β-액틴 프로모터에 의해 조절됨)로 서브클로닝하여 (문헌 [Niwa et al., 1991]), 각각 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 및 pCAGGS-WSN-M1-2/1를 생성하였다. A/PR/8/34 바이러스로부터의 M2 및 NS2 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 pCAGGS/MCS로 클로닝하여, pEP24c 및 pCA-NS2를 생성시켰다. 마지막으로, pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) 및 pcDNA787(PA)를 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 PB2, PB1 및 PA 단백질을 발현시키는데 사용하였다 (문헌 [Perez et al., 1998]).
감염성 인플루엔자 입자의 생성. 293T 세포(1×106)를 트랜스 IT LT-1(위스콘신주 매디슨 소재의 판베라(Panvera))을 사용하여 제조자의 지시에 따라 상이한 양의 최대 17개 플라스미드로 형질감염시켰다. 간략하게, DNA와 형질감염 시약을 혼합하고 (DNA 1 ㎍ 당 2 ㎕의 트랜스 IT-LT-1), 실온에서 45 분간 인큐베이션하고 세포에 가하였다. 6 시간 후, DNA-형질감염 시약 혼합물을 0.3％ 소혈청 알부민 및 0.01％ 송아지 태아 혈청을 함유하는 Opti-MEM (메릴랜드주 게이터스버그 소재의 깁코/비알엘(Bibco/BRL))으로 대체하였다. 형질감염 후 상이한 시간에, 바이러스를 상층액으로부터 수거하고 MDCK 세포 상에서 적정하였다. 헬퍼 바이러스가 이 과정에 의해 요구되지 않으므로, 회수된 형질감염체 바이러스를 플라크 정제 없이 분석하였다.
바이러스를 생성하는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율 결정. 형질감염 24 시간 후, 293T 세포를 0.02％ EDTA로 단일 세포로 분산시켰다. 그런 다음 세포 현탁액을 10-배 희석하고 24-웰 플레이트에 있는 MDCK 세포의 전면생장(confluent) 단일층으로 옮겼다. 바이러스를 헤마글루티닌 분석에 의해 검출하였다.
면역염색 분석. 인플루엔자 바이러스로의 감염 9 시간 후, 세포를 인산염-완충 염수(PBS)로 2회 세척하고 실온에서 20 분간 3.7％ 파라포름알데히드(PBS 중)로 고정하였다. 다음에, 그들을 0.1％ 트리톤 X-100으로 처리하고 문헌 [Neumann et al. (1997)]에 기재된 바와 같이 가공하였다.
결과
바이러스 RNA 분절, 3개의 폴리머라제 서브유닛 및 NP 단백질의 플라스미드-구동된 발현에 의한 감염성 바이러스의 생성. 정제된 비리온으로부터 추출된 RNP의 혼합물로 세포를 형질감염시켜 감염성 인플루엔자 입자가 생성되었을지라도, 이 전략은 8개의 상이한 시험관내 생성된 RNP와 사용될 때 효율적일 것 같지 않다. 전적으로 cDNA로부터 감염성 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위하여, 8개의 바이러스 RNP를 생체내에서 생성시켰다. 따라서, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터에 의해 연결된, A/WSN/33 바이러스의 전장 바이러스 RNA에 대한 cDNA를 함유하는 플라스미드를 제조하였다. 원칙적으로, 이들 8개의 플라스미드의 진핵세포로의 형질감염은 모든 8개의 인플루엔자 vRNA의 합성을 일으켜야만 한다. 그런 다음 단백질 발현 플라스미드의 공형질감염에 의해 생성된, PB2, PB1, PA 및 NP 단백질은 vRNA를 복제 및 전사되는 기능적 vRNP로 조립하여, 궁극적으로 감염성 인플루엔자 바이러스를 형성한다(도 3). 1×106개 293T 세포를 단백질 발현 플라스미드(1 ㎍의 pcDNA762(PB2), 1 ㎍의 pcDNA774(PB1), 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA), 및 1 ㎍의 pCAGGS-WSN-NP0/14) 및 1 ㎍의 각각의 아래 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(pPolⅠ-WSN-PB2, pPolⅠ-WSN-PB1, pPolⅠ-WSN-PA, pPolⅠ-WSN-HA, pPolⅠ-WSN-NP, pPolⅠ-WSN-NA, pPolⅠ-WSN-M 및 pPolⅠ-WSN-NS)로 형질감염시켰다. 감소된 양의 pcDNA787(PA)를 사용하는 결정은 이전 관찰 (문헌 [Mena et al., 1996])과, 바이러스-유사 입자(VLP)의 생성을 위한 최적 조건에 대한 데이터(데이타 미도시)에 기초하였다. 293T 세포의 형질감염 24 시간 후, ㎖ 당 7×103 pfu의 바이러스를 상층액에서 발견하여(실험 1, 표 1), 전적으로 플라스미드로부터 A형 인플루엔자 바이러스를 생성하는 역 유전학의 능력을 처음으로 입증하였다.
클로닝된 cDNA로부터 인플루엔자 바이러스를 생성하는데 사용된 플라스미드 세트*
실험
RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드:+ 1 2 3 4 5 6 7 8
PB1 + + - - - - - -
PR8-PB1 - - + + + + + +
PB2 + + + + + + + +
PA + + + + + + + +
HA + + + + + + + +
NP + + + + + + + +
NA + + + + + + + +
M + + + + + + + +
NS + + + + + + + +
단백질 발현 플라스미드:
PB1 + + + + + + +
PB2 + + + + + + - +
PA + + + + + + - +
NP + + + + + + + -
HA - + - + + + + +
NA - + - + + + + +
M1 - + - + + + + +
M2 - + - + + + + +
NS2 - + - + + + + +
바이러스 역가(pfu/㎖) 7×103 7×103 1×103 3×104 0 0 0 0
* 293T 세포를 표시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 24(실험 1 및 2) 또는 48 시간(실험 3-8) 후, 상층액 중의 바이러스 역가를 MDCK 세포 상에서 결정하였다. + 다르게 표시되지 않으면, 플라스미드를 A/WSN/33 바이러스의 RNA를 나타내는 cDNA로 제작하였다.
모든 바이러스 구조 단백질의 동시발현으로의 인플루엔자 바이러스 생성 효율. 바이러스 NP 및 폴리머라제 단백질의 발현이 인플루엔자 바이러스의 플라스미드-구동된 생성을 위해 충분할지라도, 효율의 향상이 가능하였다. 이전 연구에서, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질 (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2 및 NS2)의 발현은 리포터 클로람페니콜-아세틸트랜스퍼라제 유전자 (문헌 [Mena et al., 1996])를 코딩하는 인공적 vRNA를 함유한 VLP를 생성하였다. 따라서, 단지 바이러스 RNA 복제와 전사에 요구되는 것들 대신, 구조 단백질의 전체 보충물의 이용가능성은 바이러스 생성 효율을 향상시킬 수 있다. 이 목적을 위해, 293T 세포를 최적량의 바이러스 단백질 발현 플라스미드 (VLP 생성에 의해 판단됨; 비공개 데이터) [1 ㎍의 pcDNA762(PB2) 및 pcDNA774(PB1); 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA); 1 ㎍의 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0/14, 및 pCAGGS-WNA15; 2 ㎍의 pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0.3 ㎍의 pCA-NS2; 및 0.03 ㎍의 pEP24c(M2를 위한)]를, 1 ㎍의 각 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드 (실험 2, 표 1)와 함께 형질감염시켰다. PA, PB1, PB2 및 NP만을 발현하는 플라스미드 (실험 3, 표 1) 또는 모든 인플루엔자 구조 단백질을 발현하는 플라스미드 (실험 4, 표 1)와 함께, PB1 유전자를 제외하고는 (재조합체 바이러스를 생성하기 위한 노력으로 pPolⅠ-PR/8/34-PB1이 PB1 유전자를 대체함) 동일한 세트의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드로 제2 세트의 세포를 형질감염시켰다. WSN 바이러스의 수율은 형질감염 후 24 시간 (실험 1 및 2, 표 1) 또는 36 시간 (데이타 미도시)에 그다지 상이하지 않았다. 그러나, PR/8/34-PB1으로의 바이러스의 수율에서 10-배 초과의 증가가 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질이 제공되었을 때 발견되었다 (실험 3 및 4, 표 1). PA, PB1, PB2 또는 NP 단백질의 발현을 위한 플라스미드 중 하나가 결여된 음성 대조군은 바이러스를 전혀 생성하지 않았다 (실험 5-8, 표 1). 따라서, 생성되는 바이러스에 따라, 모든 A형 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 발현이 역 유전학 방법의 효율을 상당히 향상시켰다.
다음으로, 세포의 형질감염 후 바이러스 생성의 역학을, A/PR/8/34-PB1 유전자를 갖는 바이러스를 생성시키는데 사용된 플라스미드 세트를 이용하여 결정하였다. 3개의 실험 중 2개에서, 바이러스가 형질감염 24 시간 후 처음 검출되었다. 그 때 측정된 역가 (103 pfu/㎖ 초과)는 형질감염 후 48 시간까지 106 pfu/㎖ 초과로 증가하였다 (표 2). 바이러스를 생성하고 있는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율을 측정하기 위하여, 293T 세포를 형질감염 24 시간 후 EDTA (0.02％)로 처리하여 세포를 분산시킨 후, 제한 희석 연구를 수행하였다. 이 실험에서, 유리 바이러스가 이 시점에 배양 상층액에서 발견되지 않았다. 이러한 결과는 103.3개 세포 중 하나가 감염성 바이러스 입자를 생성하고 있었음을 가리켰다.
293T 세포로의 플라스미드 형질감염 후 바이러스 생성의 역학*
플라스미드 형질감염 후 시간 배양 상층액 중 바이러스 역가(pfu/㎖)
실험
1 2 3
6 0 ND ND
12 0 ND 0
18 0 ND 0
24 0 2×103 6×103
30 ND 5×104 9×104
36 6×102 >1×105 7×105
42 ND >1×106 5×106
48 8×104 >1×106 1×107
* 293T 세포를 A/PR/8/34 바이러스로부터 유래된 PB1 유전자를 제외하고 A/WSN/33 바이러스 유전자를 코딩하는 8개의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드와, 본문에 기재되어 있는 9개의 단백질 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 상이한 시점에, MDCK 세포의 배양 상층액 중 바이러스를 적정하였다. ND = 행해지지 않음.
NA 단백질에서 FLAG 에피토프를 함유하는 인플루엔자 바이러스의 회수. 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스의 게놈으로 돌연변이의 도입을 허용하였는지를 검증하기 위하여, NA 단백질에 FLAG 에피토프 (문헌 [Castrucci et al., 1992])를 함유하는 바이러스를 생성하였다. 293T 세포를 요구되는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 및 단백질 발현 플라스미드와 함께, NA 단백질과 단백질 머리부분의 바닥에 있는 FLAG 에피토프를 모두 코딩하는 cDNA를 함유하는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드 (pPolⅠ-WSN-NA/FL79)로 형질감염시켰다. 회수된 바이러스 (PR8-WSN-FL79)가 사실상 NA-FLAG 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여, PR8-WSN-FL79 또는 A/WSN/33 야생형 바이러스로 감염된 세포의 면역염색 분석을 수행하였다. FLAG 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 PR8-WSN-FL79로 감염된 세포를 검출하였지만, 야생형 바이러스로 감염된 세포는 검출하지 못했다 (도 4). PR8-WSN-FL79 바이러스의 회수는 태그가 부착되지 않은 야생형 바이러스 (데이타 미도시)에 대한 것만큼 효율적이었다. 이들 결과는 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 돌연변이를 도입하는 것을 허용함을 가리킨다.
PA 유전자에 돌연변이를 함유하는 감염성 인플루엔자 바이러스의 생성. PA 유전자에 돌연변이를 갖는 바이러스를 생성하기 위하여, 2개의 침묵 돌연변이를 도입하여 제한 엔도뉴클레아제에 대한 새로운 인식 서열 (mRNA의 위치 846의 Bsp120Ⅰ 및 위치 1284의 PvuⅡ)을 생성하였다. 이전에는, 신뢰할만한 선별 체계의 결여로 인해, 역 유전학에 의해 이 유전자를 변형시키는 것이 불가능하였다. 형질감염체 바이러스인 PA-T846C 및 PA-A1284C를 회수하였다. 회수된 형질감염체 바이러스를 2회의 연속적 제한 희석에 의해 생물학적으로 클로닝하였다. 회수된 바이러스가 실제로 PA 유전자에 돌연변이를 갖는 형질감염체인지의 여부를 검증하기 위하여, PA 유전자에 대한 cDNA를 역전사효소-PCR에 의해 수득하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, PA-T846C 및 PA-A1284C 바이러스는 새로 도입된 제한효소 부위의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, PA 유전자 내에 예상된 돌연변이를 가졌다. 역전사 단계가 없는 동일한 바이러스 샘플과 프라이머의 PCR은 어떠한 산물도 생성하지 못하여 (데이타 미도시), 실제로 PA cDNA가 바이러스를 생성하는데 사용된 플라스미드 대신 vRNA로부터 기원하였음을 나타내었다. 이들 결과는 돌연변이화된 유전자를 갖는 바이러스가 어떻게 헬퍼 바이러스를 사용하지 않고 생성 및 회수될 수 있는지를 설명한다.
논의
본원에 기재된 역 유전학 시스템은 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 A형 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 생성할 수 있도록 한다. 문헌 [Bridgen and Elliott(1996)]에서는 또한 분얌웨라 바이러스(분야바이러스과)를 생성하는데 역 유전학을 이용하였지만, 그것은 단지 (-)-센스 RNA의 분절 3개만을 함유하고, 그 생성 효율은 102 pfu/107개 세포로 낮았다. 비록 바이러스 수율은 실험간에 상이하였지만, 8개 분절을 함유하는 인플루엔자 바이러스에 대해 103 pfu/106개 세포 초과의 수율이 일관되게 관찰되었다. 본원의 상기에 기재된 역 유전학 시스템의 높은 효율에 대한 몇몇 설명이 있다. 시험관내에서 RNP를 생성하는 대신 (문헌 [Luytjes et al., 1989]), RNP를 RNA 폴리머라제 Ⅰ을 사용한 vRNA의 세포내 합성과 바이러스 폴리머라제 단백질 및 NP의 플라스미드-구동 발현을 통해 생체내에서 생성하였다. 또한, 플라스미드로 쉽게 형질감염되는 293T 세포 (문헌 [Goto et al., 1997])의 사용이, 큰 집단의 세포가 바이러스 생성을 위해 필요한 모든 플라스미드를 수용하도록 보장하였다. 또한, 생장하는 세포에서 가장 풍부하게 발현되는 효소 중 하나인 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 생성된 다수의 전사체가 시스템의 전체 효율에 기여했을 가능성이 높다. 이들 특징은 상응하게 풍부한 수의 vRNA 전사체 및 적당한 양의 vRNA 캡드시화용 바이러스 단백질, 핵에서의 RNP의 형성, 및 이들 복합체의 새로운 바이러스가 조립되고 방출되는 세포 막으로의 수송에 이르게 하였다.
이전에 확립된 역 유전학 시스템 (문헌 [Enami et al., 1990], [Neumann et al., 1994], [Luytjes et al., 1989], [Pleschka et al., 1996])은 헬퍼-바이러스 감염을 필요로 하며, 따라서 소수의 형질감염체를 방대한 수의 헬퍼 바이러스로부터 회수할 수 있는 선별 방법도 필요하다. 그러한 전략은 하기 cDNA-유래된 유전자 중 하나를 갖는 인플루엔자 바이러스를 생성하는데 이용되었다: PB2 (문헌 [Subbarao et al., 1993]), HA (문헌 [Enami et al., 1991], [Horimoto et al., 1994]), NP (문헌 [Li et al., 1995]), NA (문헌 [Enami et al., 1990]), M (문헌 [Castrucci et al., 1995], [Yasuda et al., 1994]) 및 NS (문헌 [Enami et al., 1991]). HA 및 NA 유전자에 적용가능한 것들을 제외한 대부분의 선별 방법은 증식 온도, 숙주 범위 제한, 또는 약물 민감성에 의존하며, 따라서 유전자 산물의 기능적 분석을 위한 역 유전학의 유용성을 제한한다. 신뢰할만한 항체-구동 선별 시스템이 이용가능한 HA 및 NA 유전자를 사용하더라도, 두드러진 증식 결함을 갖는 바이러스를 생성하는 것이 어렵다. 반대로, 본원에 기재된 역 유전학 시스템은 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않고 임의의 유전자 분절에 돌연변이를 갖거나 심각한 증식 결함을 갖는 형질감염체를 생성하는 것을 허용한다. 이 장점은 돌연변이화된 PA 유전자를 갖는 형질감염체 바이러스의 회수를 나타내는 도 5에 입증되어 있다. A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 어느 유효한 돌연변이를 도입하는 기술이 있으면, 연구자가 바이러스 게놈의 비번역 영역에 있는 조절 서열의 성질, 바이러스 단백질의 구조-기능 관계, 및 숙주-범위 제한 및 바이러스 병원성의 분자적 기초와 같은, 많은 오래된 문제를 해결할 수 있을 것이다.
비록 불활성화 인플루엔자 백신이 입수가능할지라도, 그들의 효능은 부분적으로 국소 IgA 및 세포독성 T 세포 반응을 유발하는 그들의 제한된 능력으로 인해 최적 이하이다. 지금 진행 중인 저온-적응 인플루엔자 생백신의 임상시험은, 그러한 백신이 인플루엔자 증상을 유발하지 않지만 여전히 보호 면역성을 유도하도록 최적으로 약독화됨을 암시한다 (문헌 [Keitel ＆ Piedra, 1998]에서 검토). 그러나, 예비적 결과는 이들 바이러스 생백신이 최상의 불활성화 백신 (문헌 [Keitel ＆ Piedra, 1998]에서 검토)보다 유의하게 더 효과적이지 않아, 추가 개선의 여지가 있음을 나타낸다. 하나의 가능성은 상기 역 유전학 시스템으로 저온-적응 백신을 변형하는 것일 것이다. 대안으로는, 내부 단백질을 코딩하는 유전자에 다수의 약독화 돌연변이를 갖는 "마스터(master)" A형 인플루엔자 균주를 생성하는데 역 유전학 시스템을 이용함으로써 무(無)에서 시작할 수 있다. 본원에 기재된 역 유전학 시스템의 가장 매력적인 적용은 인플루엔자 바이러스의 새로운 HA 또는 NA 서브타입이 연루되는, 세계적 유행병으로 의심된 경우에 약독화 바이러스 생백신을 신속하게 생산하는 것에 있을 수 있다.
이 새로운 역 유전학 시스템은 대개 백신 벡터로서의 인플루엔자 바이러스의 사용을 증가시킬 것이다. 바이러스는 인플루엔자 바이러스 단백질에 더하여 외래 단백질이나 면역원성 에피토프를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 9번째 분절 (문헌 [Enami et al., 1991])로서 외래 단백질을 갖는 바이러스를 생성할 수 있고, 이를 생백신으로 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 강력한 세포-매개 및 체액성 면역반응을 자극할 뿐 아니라, 그들은 광범위한 어레이의 비리온 표면 HA 및 NA 단백질 (예를 들어, 15 HA 및 9 NA 서브타입 및 그들의 유행성 변이체)을 제공하여, 동일한 표적 집단의 반복된 면역화를 가능하게 할 수 있다.
리포터 유전자를 코딩하는 인공적 vRNA를 갖는 인플루엔자 VLP를, 바이러스 구조 단백질과 vRNA를 백시니아-T7 폴리머라제 시스템 (문헌 [Mena et al., 1996])을 이용하여 발현시킴으로써 생성하였다. 역 유전학을 이용하여, 본원에서는 vRNA 전사 및 복제에 요구되는 단백질 (즉, PA, PB1, PB2 및 NP)을 코딩하는 vRNA, 및 관심있는 단백질을 코딩하는 vRNA를 함유하는 VLP를 생성할 수 있다. 그러한 VLP는 유용한 유전자 전달 비히클일 수 있다. 중요하게는, 상기 VLP에 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전자가 결여되어 있기 때문에, VLP-유전자 요법 후에 감염성 바이러스가 생성되지 않음이 확실할 것이다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 숙주 염색체로 통합되지 않기 때문에, VLP 시스템은 세포의 단기 형질도입만을 요구하는 상황 (예를 들어, 암 치료를 위해)에서 유전자 요법에 적당할 것이다. 아데노바이러스 벡터 (문헌 [Kovesdi et al., 1997])와 반대로, 인플루엔자 VLP는 HA 및 NA 변이체 모두를 함유하여, 표적 집단의 반복된 치료를 가능하게 할 수 있다.
오르쏘믹소바이러스과는 A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스, 및 최근에 분류된 토고토바이러스를 포함한다. 전적으로 본원에 기재된 클로닝된 cDNA로부터 감염성 A형 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 전략은 임의의 오르쏘믹소바이러스, 및 아마도 다른 분절화된 (-)-센스 RNA 바이러스 (예를 들어, 분야바이러스과, 아레나바이러스과)에도 적용될 것이다. 기술적 제한 없이 바이러스 게놈을 조작하는 능력은 바이러스 생활사 및 그의 조절, 바이러스 단백질의 기능, 및 바이러스 병원성의 분자적 기작의 연구를 위해 심오한 의미를 갖는다.
실시예 2
인플루엔자 바이러스 단백질 PB2 , PB1 , PA 및 NP 의 발현은 인공 바이러스 RNA의 복제 및 전사를 초래한다. 인플루엔자 VLP를 생성하기 위해, 생체내 인플루엔자 바이러스 RNA의 세포내 합성을 위한 RNA 폴리머라제 Ⅰ 시스템을 사용하였다 (도 7). 이 시스템에서, 안티센스 배향으로 리포터 유전자를 코딩하는 cDNA는 인플루엔자 바이러스 RNA의 5' 및 3' 비코딩 영역에 인접되어 있었다. 이 카세트를 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 터미네이터 사이에 삽입하였다. 이러한 작제물을 진핵 세포로 형질감염시키면 세포성 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 리포터 유전자가 전사되고, 그에 따라 인플루엔자 바이러스-유사 RNA가 생성되었다 (문헌 [Neumann et al., 1994]). 인플루엔자 바이러스 감염시, 인공 vRNA가 바이러스 폴리머라제 복합체에 의해 복제 및 전사되고, 리포터 유전자를 발현하였다.
PB2, PB1, PA 및 NP 단백질의 발현이 RNA 폴리머라제 Ⅰ-유래 전사체에 의해 코딩된 리포터 유전자의 발현을 초래하는지를 판단하기 위해, 닭 β-액틴 프로모터의 조절 하에 A/WSN/33 (H1N1) 바이러스의 NP 단백질을 발현하는 플라스미드 (pCAGGS-WSN-NP0/14), 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 A/PR/8/34 바이러스의 폴리머라제 단백질을 발현하는 플라스미드 [pcDNA762(PB2), pcDNA774(PB1) 및 pcDNA787(PA)] (각각 1 ㎍), 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 리포터 유전자 작제물 (pPolⅠ-GFP)을 인간 배아 신장 (293T) 세포로 형질감염시켰다. 48시간 후에, 세포의 30％ 내지 40％가 GFP를 발현하였다 (도 8). 이와 달리, GFP 발현은 폴리머라제 또는 NP 단백질이 결여된 형질감염 세포에서는 검출할 수 없었다. 이러한 결과는 NP 및 3개의 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 단백질이 RNA 폴리머라제 Ⅰ-유래 GFP vRNA를 복제 및 전사하는 기능적 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다.
최적의 vRNA 전사 및 복제. 최적의 리포터 GFP 발현을 위해 필요한 플라스미드 DNA의 양을 결정하기 위해, 본 발명자들은 폴리머라제 단백질 및 NP의 발현을 조절하였다. 선행 연구에서는 다량의 PA가 전사/복제 시스템에서 리포터 유전자의 발현 정도를 감소시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Mena et al., 1996]). 따라서, 단계적인 방식으로 플라스미드로부터 PA의 발현을 감소시켜, GFP의 최고 발현을 초래하는 pcDNA787(PA) 주형의 양이 0.1 ㎍이라는 것을 확인하였다. RNP 복합체의 주요 구조 성분인 NP를 사용할 때는, 다량의 단백질 발현 플라스미드가 요구될 수 있다. 그러나, 보다 다량의 플라스미드는 GFP-양성 293T 세포의 갯수에 감지될 정도로 영향을 미치지 않았다. 또한, PB2 및 PB1 단백질 발현 플라스미드의 여러 양 (1.0 내지 0.03 ㎍)들이 293T 세포에서의 GFP 발현에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 모든 후속 실험에서, pcDNA787(PA)는 0.1 ㎍을 사용하였고, pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) 및 pCAGGS-WSN-NP0/14는 1.0 ㎍을 사용하였다.
클로닝된 cDNA로부터 인플루엔자 VLP 의 형성. 백시니아 바이러스 T7 RNA 폴리머라제 시스템을 사용한 선행 연구로부터 인플루엔자 VLP의 형성은 9개의 인플루엔자 바이러스 단백질 (PB2, PB1, PA, HA, NA, NP, M1, M2 및 NS2)을 필요로 한다는 것을 알 수 있었다 (문헌 [Mena et al., 1996]). 이와 달리, NS1 단백질은 입자 형성을 위해 불필요하였다 (문헌 [Mena et al., 1996]). VLP 생성을 위한 효율적인 플라스미드-구동 시스템을 확립하기 위해, HA, NA, M1, M2 및 NS2 유전자를 코딩하는 cDNA를 생성하였다. cDNA를 진핵성 발현 벡터 pCAGGS/MCS로 클로닝하여 (닭 β-액틴 프로모터에 의해 조절됨), 각각 pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15, pCAGGS-WSN-M1-2/1, pEP24c 및 pCA-NS2를 생성하였다. 각 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 확인하였다.
VLP를 생성하기 위해, 106개의 293T 세포를 각 단백질 발현 플라스미드 1.0 ㎍ (0.1 ㎍을 사용한 pcDNA787(PA) 제외) 및 리포터 유전자 작제물 pPolⅠ-GFP 1 ㎍으로 형질감염시켰다. 배양물 상층액을 형질감염 48시간 후에 수거하고 A/WSN/33 바이러스와 혼합하여 GFP vRNA의 복제 및 전사를 위해 필요한 인플루엔자 바이러스 단백질을 제공하였다. 그 후에 혼합물을 MDCK 세포에 접종하였다. 인큐베이션 10시간 후에, 450개 입자/상층액 ml에 해당하는 GFP-양성 MDCK 세포가 검출되었다 (표 3). 따라서, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 플라스미드-구동 발현은 GFP vRNA를 함유하는 감염성 인플루엔자 VLP의 형성을 초래하였다. 더욱이, GFP vRNA가 MDCK 세포로 전달되었다.
인플루엔자 바이러스의 최적의 조립. VLP 형성을 또한 상이한 양의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 리포터 유전자 작제물 뿐만 아니라, HA, NA, M1, M2 및 NS2 플라스미드 DNA를 발현하는 세포에서 연구하였다. pPolⅠ-GFP를 사용한 실험에서, 플라스미드 DNA 1.0 ㎍은 VLP를 생성하는 데 있어서 매우 효율적이었으나, 2.0 ㎍ 또는 3.0 ㎍일 경우에는 그 효율성이 상당히 감소하였다. NS2 및 M2 단백질은 감염 후기에 소량으로 발현되기 때문에, 비교적 소량의 발현 플라스미드가 최적의 VLP 형성을 위해 요구될 것 같다. M2 발현 작제물을 1.0 ㎍에서 0.3 ㎍으로 감소시키면 GFP-양성 MDCK 세포의 갯수가 10배 넘게 증가하였다 (표 3). 플라스미드를 0.03 ㎍으로 다시 감소시켜도 VLP의 갯수를 증가시키지 않았다. NS2의 경우에, 시험한 소량의 플라스미드 (0.1 ㎍)는 덜 효율적인 VLP의 형성과 관련있었다 (표 3).
M1 단백질은 비리온의 주요 구조 성분이었다. 따라서, 높은 수준의 M1 발현이 효율적인 VLP의 형성을 위해 필요할 것 같다. 이러한 예상을 M1 플라스미드 DNA 1.0 ㎍ 또는 2.0 ㎍으로 형질감염시킨 세포에서의 VLP 형성을 비교하는 실험으로 시험하였다. 표 3에서 알 수 있는 것처럼, 보다 다량의 플라스미드가 GFP-양성 MDCK 세포의 갯수를 10배 넘게 증가시켰다. HA 및 NA 단백질을 발현하는 플라스미드의 2가지 상이한 양 (1 ㎍ 대 2 ㎍)을 비교하였을 때 VLP 형성에 대해 어떠한 차이점도 감지되지 않았고, 후속 실험에서 사용하기 위해 각 플라스미드 (pEWSN-HA, pCAGGS-WNA 15) 1 ㎍이 선택되었다. 전반적으로, 이들 연구에서 VLP 형성의 효율성은 100배 넘게 증가하였고, 궁극적으로 상층액 1 ml 당 104개가 넘는 감염성 인플루엔자 바이러스 입자를 생성하였다 (도 9).
감염성 VLP의 형성을 위한 플라스미드 DNA의 최적량*
발현용 플라스미드 DNA의 양 (㎍) VLP 형성의 상대적인 효율성†
PB2 PB1 PA HA NP NA M1 M2 NS2 GFP vRNA
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 28
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.03 1.0 1.0 17
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 28
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 0.3 1.0 24
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 0.1 1.0 11
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 28
1.0 1.0 0.1 1.0 1.0 1.0 2.0 0.1 1.0 1.0 220
* 293T 세포를 모두 9개의 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 발현 플라스미드 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ-GFP 유전자 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, VLP를 함유하는 상층액을 수집하고, A/WSN/33 헬퍼 바이러스와 혼합하고, MDCK 세포에 접종하였다. 세포를 감염 10시간 후에 고정시키고, GFP 발현을 형광현미경으로 측정하였다. M1, M2 및 NS2 플라스미드의 양만을 다르게 하여 (굵은 글씨) MDCK 세포에서의 GFP 발현을 위한 최적량을 결정하였다. † VLP 형성의 상대적인 효율성을 5개의 현미경 시역에서 GFP-양성 세포의 갯수를 카운팅하여 측정하였다. 각 플라스미드 1 ㎍을 함유하는 샘플 (450개의 감염성 VLP/상층액 ml를 수거함)을 기준 (1의 값)으로 선택하였다.
전적으로 플라스미드로부터 생성된 VLP 의 신뢰성 VLP가 진정한 인플루엔자 바이러스와 동일한 방식으로 감염을 개시한다는 것을 입증하기 위해, VLP를 WSN HA에 대한 항체로 중화시켰다. 플라스미드로 형질감염된 293T 세포로부터 유래된 VLP를 함유하는 상층액을 안티-WSN HA 모노클로날 항체의 풀 또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)의 G 단백질에 대한 모노클로날 항체 (음성 대조군)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 안티-WSN HA 모노클로날 항체의 풀에 의해 중화되지 않은, A/PR/8/34 헬퍼 바이러스를 혼합물에 첨가하고 MDCK 세포에 접종하였다. 안티-WSN-HA-특이적 모노클로날 항체만이 VLP를 중화시켰고, 이는 HA가 VLP가 세포에 부착되고 진입하는 것을 매개한다는 것을 나타낸다.
그 후에, VLP의 형성을 위해 필요한 최소 세트의 단백질을 확인하였다. 3개의 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 및 NP가 vRNA의 복제 및 전사를 위해 필수적이라는 것이 입증되었다 (문헌 [Honda et al., 1988]). 따라서, 이들 4개의 단백질 각각은 포함되지만, HA, NA, M1, M2 또는 NS2는 결국 제외되었다. 이들 플라스미드를 제외한 것은 형질감염된 293T 세포에서의 GFP vRNA의 복제/전사에 영향을 미치지 않았다. HA, NA, M1 또는 NS2 단백질이 결여된 형질감염된 293T 세포로부터 유래된 상층액은 감염된 MDCK 세포에서 GFP 발현을 진행시키지 않았고, 이는 감염성 VLP가 없다는 것을 나타낸다. 감염성 VLP가 M2를 제외하고는 검출되었지만 그 갯수가 적었다 (완전한 세트의 구조 단백질과 비교하였을 때 500배 넘게 감소함). 따라서, 백시니아-바이러스 시스템의 연구의 데이타에 따라, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질이 효율적인 감염성 VLP의 형성을 위해 필요하였다 (문헌 [Mena et al., 1996]).
VSV 당단백질은 VLP 의 생성에서 HA 및 NA 단백질을 대체할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질을 수용체 결합 및 융합에서 소정의 기능을 하는, VSV G 단백질로 대체하였다. pPolⅠ-GFP; 최적량의 PB2, PB1, PA, NP, M1, M2 및 NS2 발현 작제물; 및 1 ㎍의 VSV-G 작제물 (pCAGGS-VSV-G)로 형질감염된 293T 세포에서, 인플루엔자 바이러스 당단백질에 대한 VSV-G 단백질의 치환은 VLP 형성에 불리하게 영향을 미치지 않았다. 이와 달리, HA 및 NA보다는, VSV-G가 바이러스 당단백질로서 작용할 때 보다 많은 GFP-양성 세포가 반복하여 발견되었다. 따라서, VSV G 단백질은 인플루엔자 비리온에 효율적으로 혼입될 수 있고 바이러스 방출 및 진입에서 HA 및 NA와 마찬가지로 소정의 기능을 할 수 있었다.
감염성 인플루엔자 바이러스 입자를 생성하기 위한 효율적인 시스템은 이 바이러스를 사용하는 연구에서 이로울 것이고 잠재적으로는 유전자 요법을 위한 백신 및 벡터를 생성할 때도 이로울 것이다. 기존의 백시니아 바이러스 시스템과 달리, 본원에 기술되어 있는 VLP 생성 방법은 세포의 초기 형질감염 및 VLP의 생성량 (104개가 넘는 감염성 입자/상층액 ml) 둘 다에 있어서 매우 효율적이었다. 또한, 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드만으로 실시되어 (즉, 임의의 다른 바이러스 단백질 없이), 결과의 해석을 매우 단순화하였다. 또다른 주요 장점은 비리온 형성에서 치명적인 돌연변이의 영향, RNP 복합체의 팩키징, 바이러스 버딩, 및 결합 및 융합 과정을 연구할 수 있다는 것이다. 또한, 전술한 시스템은 다른 바이러스, 예를 들면 파라믹소바이러스 및 랍도바이러스에서도 마찬가지로 잘 작용할 것 같다.
인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질은 기능적으로 VSV 당단백질 G에 의해 대체될 수 있었다. 인플루엔자 바이러스가 재조합 SV40 바이러스에 의해 제공될 때 VSV G 단백질을 혼입할 수 없다는 것은 이미 보고되었다 (문헌 [Naim et al., 1993]). 본원에 기술되어 있는 결과는 HA 또는 NA가 VLP의 형성에서 필수적이지 않다는 것을 설명하지만, 이들 당단백질이 다른 바이러스 단백질과의 상호작용에서 소정의 역할을 하여, 꼬리부분이 없는 HA, NA 또는 둘 다를 발현하는 바이러스의 길어진 형상에 의해 설명되는 것처럼 비리온의 구조에 영향을 미친다는 것을 배제할 수는 없었다 (문헌 [Garcia-Sastre et al., 1995], [Jin et al., 1994], [Jin et al., 1997], [Mitnaul et al., 1996]).
전술한 플라스미드-기재의 시스템은 치료 유전자 전달을 위해 특히 유용할 수 있었다. 전사 및 복제를 위해 필요한 단백질 (즉, NP 및 폴리머라제)을 코딩하는 vRNA 뿐만 아니라, 관심 단백질을 코딩하는 vRNA를 함유하는 VLP를 제작할 수 있었다. 이들 입자는 감염성이고 지정된 유전자를, 복제되고 전사될 표적 세포에 전달할 수 있었다. 이들 입자가 바이러스 유전자의 완전한 상보체를 함유하지 않기 때문에, 이들은 감염성 자손 바이러스를 생성할 수 없었다. 이러한 특징은, 바이러스 게놈이 숙주 염색체로 통합되지 않는 것과 함께, 인간 및 비인간 대상체에게서 유전자 전달의 생물학적 안전성을 보장할 것이다. 최종적으로, 15개의 HA 및 9개의 NA 서브타입 및 이들의 변이체의 유용성이 VLP의 반복적인 투여를 가능하게 하여, 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터를 반복하여 사용할 때 직면하게 되는 주요 장애물 중 하나인, 벡터-생성 단백질에 대한 면역저항성을 극복하였다. 플라스미드-구동 시스템의 추가의 이점은 암 치료에서와 같이, 외래 단백질의 단기 발현만이 필요한 상황에서 이해될 것이다.
실시예 3
Cre-loxP 시스템을 사용함으로써, 본 발명자들은 복제-결함 바이러스의 생성을 위한 팩키징 세포주를 생성할 수 있었다. 예를 들면, 2개의 loxP 부위에 인접한 전사 중지 카세트 (예를 들면, 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)의 pBS302; 및 문헌 [Sauer et al., 1993], [Lasko et al., 1992], [Pichel et al., 1993], [Bolivar et al., 1977], [Stuhl et al., 1981], [Stuhl, 1985], [Fiers et al., 1978]) 및 바이러스 유전자 중 하나를 함유하는 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 프로모터 서열에서 개시된 전사는 전사 중지 부위에서 차단되었다. 따라서, 바이러스 유전자는 전사 및 번역되지 않았다. 이러한 벡터로 안정하게 형질감염된 세포를 loxP 시스템으로 클로닝된 유전자를 코딩하는 vRNA가 결여된 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 이 바이러스는 또한 Cre 단백질을 코딩하는 또다른 vRNA를 함유하였다. 이 바이러스는 그의 vRNA 중 하나가 결여되었기 때문에 정상 세포에서 생존 불가능하였다. 그러나, 팩키징 세포주에서, vRNA로부터 발현된 Cre 단백질은 loxP 부위에서 재조합을 일으키고, 전사 중지 부위의 결실을 초래하였다. 따라서, 각 바이러스 유전자(들)은 이제 전사 및 발현되어, 바이러스가 이들 세포에서 증폭되었다 (도 10).
또한, loxP 시스템에 의해 조절되는 후기 바이러스 단백질 (즉, HA, NA, M1, M2 및 NS2)을 발현하는 팩키징 세포주를 제작하였다 (도 12). HA 및 NA는 다른 바이러스 수용체-결합 및 융합 단백질 (예를 들면, 에볼라(Ebola) GP, 마버그(Marburg) GP, 분야바이러스과 당단백질 GP1 및 GP2, 랍도바이러스 및 파라믹소바이러스의 G 및(또는) F 단백질, 토고토바이러스 당단백질, 및 (+)-가닥 RNA 바이러스의 당단백질)에 의해 대체될 수 있었다. 복제/전사를 위해 필요한 단백질 (즉, 폴리머라제 및 NP 단백질)을 코딩하는 vRNA, 관심 유전자를 코딩하는 vRNA, 및 Cre를 코딩하는 vRNA를 함유하는 바이러스-유사 입자를 생성하였다. 이들 vRNA는 팩키징 세포주에서 바이러스-유사 입자로 팩키징되었다.
이들 바이러스-유사 입자는 (i) 바이러스 유전자의 완전한 상보체를 함유하지 않고, 그에 따라 감염성 자손 입자가 형성될 수 없어서, 엄격한 안전성 문제를 충족시키고; (ii) 외래 단백질을 높은 수준으로 발현할 것이고; (iii) 주요 항원인 바이러스 당단백질 (HA, NA)을 발현시키지 않고, 따라서 바이러스 단백질에 대한 숙주 면역 반응이 제한될 것이기 때문에 이들은 백신 및 유전자 요법 목적으로 사용될 수 있다.
실시예 4
임의의 척추동물 세포주, 예를 들면 인간 293T 세포, 쥐과동물 NA 세포 또는 햄스터(hamster) BHK-21 세포에서 인플루엔자 바이러스, 예를 들면 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스의 생성을 유도할 수 있는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템을 확립하였다. 인플루엔자 A vRNA가 발현되고, RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의해 RNA 전사체로부터 유래된 분절 (PB2)을 함유하는, A형 인플루엔자 바이러스가 생성되었다.
재료 및 방법
세포
원숭이 바이러스 40 T 항원의 유전자를 구성적으로 발현하는 293 세포주의 유도체인 293T 인간 배아 신장 세포 (문헌 [DuBridge et al., 1989])를 10％의 FCS, 4 mM의 L-글루타민, 및 항생제를 보충한 DMEM (글루코스 농도: 4.5 g/ℓ)에 유지하였다. 마딘-다비 개과동물 신장 세포 (MDCK)를 5％의 신생 송아지 혈청, 4 mM의 L-글루타민 및 항생제를 함유하는 이글즈 염(Eagle's salt)을 갖는 최소 필수 배지 (MEM)에서 성장시켰다.
플라스미드 제작
RNA 폴리머라제 Ⅱ 구동의 vRNA 발현 벡터의 작제물은 RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의해 매개된 전사가 β-액틴 닭 프로모터/CMV 인핸서 카세트에 의해 진행되는 pCAGGS-MCS (문헌 [Hatta et al., 2001], [Niwa et al., 1991])를 기재로 하였다. HDVRz 카세트를 pX8dT (문헌 [Schnell et al., 1984])로부터 프라이머 5'-GCATGCGAAGACTTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCT-3' (서열 17) 및 5'-AGATCTAGGGAGCTCTCCCTTAGCCATCCGA-3' (서열 18)을 사용하여 증폭시키고 BglⅡ 및 SphⅠ 제한 부위를 사용하여 pCAGGS-MCS로 클로닝하였다. HamRz 카세트를 pCAGGS-MCS에서 EcoRⅠ 및 NsiⅠ 부위를 사용하여 5'-AATTCTTTCTACTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCCGGAGTCCCGGGTCGGAGACGATGCA-3' (서열 19) 및 5'-TCGTCTCCGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGTAGAAAG-3' (서열 20)의 올리고링커(oligolinker) 라이게이션에 의해 제작하였다. 생성된 PolⅡ/이중 리보자임 벡터 pCAGGS-2Ribo-1 (도 12)을 BbsⅠ 및 BsmBⅠ으로 분해하는 것은 5'-CGTCTCCGGTCAGTAGAAACAAGG-3' (서열 21) 및 5'-CGTCTCCACCCAGCAAAAGCAGG-3' (서열 22)를 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻어진 바이러스 cDNA 작제물을 삽입하기 위한 선형 벡터를 생성하였다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 구동의 발현 및 5' 및 3' 말단에서 두 리보자임의 후속 자가촉매성 절단은 진정한 3' 및 5' 말단을 갖는 인플루엔자 A vRNA 분자를 초래하였다 (도 13). pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E는 아미노산 627번 위치에서 단일 Lys-대-Glu 치환이 일어난 HK483의 PB2 vRNA를 발현시켰다.
재조합 바이러스의 생성
RNA 폴리머라제 Ⅰ 역 유전학 시스템만을 기재로 하는 재조합 A형 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33 및 HK3/PB2-627E의 생성은 각각 문헌 [Neumann et al. (1999)] 및 [Hatta et al. (2001)]에 의해 개시되었다.
HK3/PB2-627E (도 14) 또는 WSN/HK483 PB2 627E (도 14)를 생성하기 위해, 293T 세포를 RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 각 바이러스의 나머지 RNA 분절을 생성하기 위한 플라스미드 (각각 0.1 ㎍, pPolⅠ 플라스미드)와 함께 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E (0.1 ㎍, PB2 분절의 생성을 위해)로 형질감염시켰다. 이들 세포를 또한 WSN/33의 PA, PB1, PB2 및 NP의 단백질 발현 작제물 (각각 1 ㎍)로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, 293T 세포 상층액의 분취물을 수집하고 바이러스를 MDCK 세포에서 증폭시키거나 플라크 분석법에 의해 MDCK 세포에서 적정하였다. 재조합 바이러스의 추가의 분석을 위해, 바이러스 RNA를 바이러스 상층액으로부터 추출하고 PB2 vRNA를 RT-PCR 및 서열분석 반응으로 분석하였다. 음성 대조군으로서, PB2의 vRNA 발현 작제물을 형질감염 혼합물로부터 제외하였고, pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E 대신 PB2 vRNA의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 발현 작제물을 사용한 것이 양성 대조군으로 작용하였다.
결과
진정한 5' 및 3' 말단을 갖는 전장 인플루엔자 A vRNA를 합성하기 위해, pCAGGS-2Ribo-1을 제작하였다 (도 12). 그 후에 전장 바이러스 RNA로부터 유래된 cDNA를 삽입하여 HRz에 의해 5' 말단에서 인접시키고 HDVRz 서열에 의해 3' 말단에서 플래킹시켰다. 이 이중 리보자임 카세트의 발현은 닭 β-액틴 프로모터/CMV 인핸서 카세트에 의해 상류에서 조절되었다. 이러한 작제물을 세포로 형질감염시킬 때, 바이러스 서열을 비롯하여 이중 리보자임 카세트는 세포성 RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의해 전사되고, 전사체의 양 말단에서 자가촉매성 리보자임 절단으로 진정한 vRNA의 생성을 초래하였다 (도 13).
이 접근법의 실현 가능성을 시험하기 위해 플라스미드 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E를 제작하였다. 이 작제물은 두 리보자임 부위 사이의 아미노산 627번 위치에서 Glu를 함유하는 HK3/PB2-627E의 PB2 vRNA를 코딩하였다. 이 작제물을 역 유전학 접근법으로 293T 세포에서 12개의 플라스미드를 동시발현시킴으로써 시험하였다: PB2 vRNA는 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E에 의해 발현되고, HK3/PB2-627E의 나머지 vRNA (PA, PB1, NP, M, NS, NA, HA)는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 시스템에 의해 발현되고, 단백질 발현 플라스미드는 A/WSN/33의 PA, PB1, PB2 및 NP를 제공하였다 (도 14). 음성 대조군으로서, PB2의 vRNA 발현 작제물을 형질감염 혼합물로부터 제외하였고, 양성 대조군으로서, pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E를 PB2 vRNA의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 발현 작제물 (pPolⅠ-PB2/483-627E)로 대체하였다. 형질감염 48시간 후에, 293T 세포 상층액의 분취물을 MDCK 세포와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 내에, 세포 변성 효과 (CPE)가 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E 또는 pPolⅠ-PB2/483-627E로 형질감염된 293T 세포로부터 유래된 상층액에서 관찰되었고, 이는 이들 세포에서 인플루엔자 바이러스가 생성되었다는 것을 나타낸다. CPE는 PB2 vRNA 발현 플라스미드가 없을 때는 관찰되지 않았다. 인플루엔자 비리온이 실제로 RNA 폴리머라제 Ⅰ과 인플루엔자 vRNA를 발현하는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 작제물의 조합으로 생성되었다는 것을 입증하기 위해, vRNA를 MDCK 세포 상층액으로부터 단리하고 PB2 RT-PCR 생성물을 아미노산 627번 위치에서 서열분석하였다. 재조합 바이러스는 실제로 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E에 의해 코딩된 PB2 유전자를 함유하였다.
RNA 폴리머라제 Ⅰ/이중 리보자임 시스템의 기능성을 추가로 입증하기 위해, 293T 세포를 A/WSN/33의 PA, PB1, PB2 및 NP의 단백질 발현을 위한 플라스미드와 함께, HK3/PB2-627E의 PB2 vRNA의 생성을 위해서는 pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E로 A/WSN/33의 PA, PB1, NP, M, NS, NA, HA vRNA의 생성을 위해서는 pPolⅠ 플라스미드로 형질감염시켰다 (도 15). 바이러스 5 × 103 pfu/ml가 형질감염 48시간 후에 293T 세포의 상층액에서 발견되었고, 이는 PB2 vRNA를 비롯한 모든 vRNA가 pPolⅠ 플라스미드에 의해 발현될 때 양성 대조군에서 관찰되는 것과 유사하였다.
논의
이 연구는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템이 진정한 5' 및 3' 말단을 갖는 인플루엔자 A vRNA를 생성할 수 있다는 것을 입증하였다. 이 시스템에서, 강력한 닭 β-액틴 프로모터/CMS 인핸서 카세트는 vRNA의 5' 말단 (HRz) 및 3' 말단 (HDVRz)에서 리보자임 서열에 인접한 인플루엔자 A vRNA를 코딩하는 RNA 전사체의 발현을 진행시켰다. 리보자임 부위에서의 이러한 1차 RNA 전사체의 자가촉매성 절단이 인플루엔자 A vRNA의 생성을 초래하였다.
이 시스템을 사용하여, RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템으로부터 유래된 PB2 vRNA를 지니는 재조합 A형 인플루엔자 바이러스를 생성하였다. 따라서, 이 실험은 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템에 의해 생성된 인플루엔자 A vRNA 분자의 기능성을 명확하게 입증하였고, 이는 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스 및(또는) 클로닝된 cDNA로부터의 다른 분절화된 RNA 바이러스의 생성을 허용할 것임을 나타낸다.
신규한 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템은 지금까지 개시된 (-)-가닥 RNA 바이러스의 두 역 유전학 시스템과 비교하여 여러가지 주요한 장점을 제공하였다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 숙주 세포 특이성을 갖지 않았다. 따라서, 이 RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 역 유전학 시스템을 임의의 척추동물 세포주에서 사용할 수 있었다. 이와 달리, RNA 폴리머라제 Ⅰ은 숙주-특이적이었다: 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ은 마우스 프로모터로부터 전사를 개시할 수 없고 그 반대도 마찬가지였다 (문헌 [Grummt et al., 1982], [Learned et al., 1982]). 또한, T7 폴리머라제 시스템과 비교하였을 때, RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템은 별개의(in trans) RNA 폴리머라제의 발현 및 바이러스 RNA 말단의 정확한 트리밍(trimming)을 요구하지 않는 장점을 제공하였다. 다수의 바이러스에서 바이러스 RNA 게놈의 정확한 3' 말단의 합성이 효율적인 바이러스 생성을 위해 중요하였다. 그러나, T7 RNA 폴리머라제 시스템에서는, 효율적인 전사를 위해 다수의 경우에서 바이러스 복제를 촉발하는 효율성을 감소시켜 역 유전학에 의한 재조합 바이러스의 생성을 감소시키는, 1개 내지 3개의 G 뉴클레오티드를 첨가할 필요가 있었다. RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템은 신뢰할 수 있는 바이러스 RNA와 동일한 말단을 갖는 RNA 분자를 합성하였다.
결론적으로, RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템이 진정한 인플루엔자 A vRNA를 인공적으로 합성하는 능력이 입증되었다. 이는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 기재의 역 유전학 시스템으로부터 유래된 RNA 분절을 지니고 있는 분절화된 (-)-가닥 RNA 바이러스의 생성에 대해 첫번째로 개시한 것이다. RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템이 숙주 세포 종과 관련하여 제한받지 않기 때문에, 생물학적 안전성에 대한 대책으로 매우 제한된 수의 세포주만을 사용할 수 있었던 백신 생산에 큰 영향을 미칠 것이다. 닭 배아 섬유아세포는 생백신의 생산용으로 승인받을 것 같고, 따라서 이들 세포에서 후보 균주가 역 유전학에 의해 생성되었다. 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터가 닭 배아 섬유아세포에서 기능하지 않기 때문에 (데이타 도시하지 않음), RNA 폴리머라제 Ⅰ을 기재로 하는 역 유전학 시스템은 이 시스템에서 성공적이지 않을 것이다. RNA 폴리머라제 Ⅱ/이중 리보자임 시스템은 이러한 한계점을 극복할 것이고 인플루엔자 및 다른 (-)-가닥 RNA 바이러스의 백신 생산을 위한 역 유전학 시스템의 광범위한 용도의 근거를 제공할 것이다.
참고문헌
Figure 112005068108428-PCT00001
Figure 112005068108428-PCT00002
Figure 112005068108428-PCT00003
Figure 112005068108428-PCT00004
Figure 112005068108428-PCT00005
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 거명을 통해 본원에 포함된 것으로 간주한다. 상기 명세서에서 본 발명을 그의 특정 바람직한 실시양태에 관하여 설명하고, 많은 상세내용을 설명 목적으로 기재하였지만, 본 발명이 부가적인 실시양태를 가질 수 있고 본원에 기술된 특정 상세내용은 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Kawaoka, Yoshihiro Hamm, Stefan Ebihara, Hideki WARF - Wisconsin Alumni Research Foundation <120> Recombinant Influenza Vectors with A PolII Promoter and Ribozymes for Vaccines and Gene Therapy <130> 800.037WO1 <150> US 60/473,797 <151> 2003-05-28 <160> 37 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 1 cacacacgtc tcgtattagt agaaacaagg tcgtttttaa actattcgac actaattgat 60 ggccatccga attcttttgg 80 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 2 cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggtc aattatattc aatatggaaa gaataaaaga 60 actaagg 67 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 3 cacacacgtc tcgtattagt agaaacaagg cattttttca tgaaggacaa gctaaattca 60 ctatttttgc cgtctgagct cttcaatgg 89 <210> 4 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 4 cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggca aaccatttga atggatgtca atccgacttt 60 acttttc 67 <210> 5 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 5 ccaacccgtc tcctattagt agaaacaagg tacttttttg gacagtatgg atagcaaata 60 gtagcattgc cacaactatc tcaatgcatg tgtgaggaag gag 103 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 6 ccaacccgtc tccgggagcg aaagcaggta ctgattcaaa atggaagatt ttgtgcgaca 60 atgcttc 67 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 7 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttttcc 40 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 8 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggg aaaataaaaa caacc 45 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 9 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtatttttct ttaattg 47 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 10 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt agataatcac tc 42 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 11 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg agttttttga acaaac 46 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 12 cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggag tttaaatgaa tccaaacc 48 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 13 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tagtttttta ctccagc 47 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 14 cacacacgtc tccgggagca aaagcaggta gatattgaaa g 41 <210> 15 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 15 cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttttta ttattaaata agc 53 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 16 cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt gacaaagaca taatgg 46 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 17 gcatgcgaag acttgggtcg gcatggcatc tccacctcct 40 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 18 agatctaggg agctctccct tagccatccg a 31 <210> 19 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligolinker <400> 19 aattctttct actctgatga gtccgtgagg acgaaacccg gagtcccggg tcggagacga 60 tgca 64 <210> 20 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligolinker <400> 20 tcgtctccga cccgggactc cgggtttcgt cctcacggac tcatcagagt agaaag 56 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 21 cgtctccggt cagtagaaac aagg 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 22 cgtctccacc cagcaaaagc agg 23 <210> 23 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic hammerhead (HH) sequence <400> 23 gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aagaggucaa agcucgaaag 60 cgagaguagu cgagaugaaa gcaucuccug accuca 96 <210> 24 <211> 115 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic hairpin (HP) sequence <400> 24 gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aaacuccagu ggcaguccug 60 uugaaaaaca gagaagccaa ccagagaaac acacguugug guauauuacc uggua 115 <210> 25 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic HDV ribozyme sequence <400> 25 gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aaacuccaaa gggucggcau 60 ggcaucucca ccuccucgcg guccgaccug ggcuacuucg guaggcuaag 110 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector sequence <400> 26 gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector sequence <400> 27 ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc 33 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(18) <223> n = A,T,C or G <400> 28 cgtctcntat tagtagaa 18 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 29 ttttgctccc ngagacg 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(17) <223> n = A,T,C or G <400> 30 cgtctcnggg agcaaaa 17 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(18) <223> n = A,T,C or G <400> 31 ttctactaat angagacg 18 <210> 32 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 32 tattagtaga a 11 <210> 33 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 33 gggagcaaaa 10 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 34 gggttattag tagaa 15 <210> 35 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 35 ttttgctccc ccc 13 <210> 36 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 36 ggggggagca aaa 13 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic vector/influenza viral cDNA sequence <400> 37 ttctactaat aaccc 15

Claims (41)

  1. a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되며, 이때 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임(ribozyme) 서열에 연결된 바이러스 cDNA에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 2개 이상의 벡터; 및
    b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절(segment)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 인플루엔 자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 임의로는 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터
    를 포함하는, 다수의 오르쏘믹소바이러스(orthomyxovirus) 벡터를 포함하는 조성물.
  2. a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 NB 및 NA에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하 게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되며, 이때 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임 서열에 연결된 바이러스 cDNA에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 2개 이상의 벡터; 및
    b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 임의로는 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 또는 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택된 2개 이상의 벡터
    를 포함하는, 다수의 오르쏘믹소바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HA가 A형 HA인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, HA가 B형 HA인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, a)의 다수의 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, a)의 모든 벡터가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, a)의 각 벡터가 별개의 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, b)의 각 벡터가 별개의 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전부는 아니지만 a)의 하나 이상의 벡터의 프로모터가 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터, 또는 T3 프로모터인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터가 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하지 않는 하나 이상의 벡터의 전사 종결 서열이 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열 또는 리보자임인 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, b)의 각 벡터가 RNA 전사 종결 서열을 더 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 오르쏘믹소바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 오르쏘믹소바이러스 서열에 연결된 관심 cDNA에 연결된 5' 오르쏘믹소바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 오르쏘믹소바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 관심 cDNA가 센스 배향인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 관심 cDNA가 안티센스 배향인 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임 서열에 연결된 3' 오르쏘믹소바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 오르쏘믹소바이러스 서열에 연결된 관심 cDNA에 연결된 5' 오르쏘믹소바이러스 비코딩 서 열을 포함하는 5' 오르쏘믹소바이러스 서열에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 조성물.
  17. 제13항 또는 제16항에 있어서, 관심 cDNA가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 치료 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 것인 조성물.
  18. 감염성 인플루엔자 바이러스의 산출에 효과적인 양의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 더 포함하는 방법.
  20. 제19항의 방법에 의해 수득되는 바이러스.
  21. 인플루엔자 바이러스의 산출에 효과적인 양의 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키고, 바이러스를 단리하는 것을 포함하는, 유전자 전달 비히클(vehicle)을 제조하는 방법.
  22. 제21항의 방법에 의해 수득되는 바이러스.
  23. 제1항 또는 제2항의 조성물과 접촉시킨 세포.
  24. 제20항 또는 제22항의 바이러스로 감염시킨 세포.
  25. 제2 리보자임 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 cDNA에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하며, 이때 인플루엔자 바이러스 cDNA가 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 인플루엔자 바이러스 M1 cDNA, 인플루엔자 바이러스 M2 cDNA, 인플루엔자 바이러스 NS2 cDNA, 인플루엔자 바이러스 BM2 cDNA, 또는 인플루엔자 바이러스 NS cDNA인 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 제2 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열을 더 포함하는 벡터.
  27. 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터와 세포를 접촉시켜 감염성 바이러스를 산출하는 것을 포함하며, 이때 바이러스 cDNA를 포함하는 하나 이상의 벡터에 있는 프로모터가 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임 서열에 연결된 바이러스 cDNA에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 방법.
  29. 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 NB 및 NA에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터와 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 바이러스 cDNA를 포함하는 하나 이상의 벡터가 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임 서열에 연결된 바이러스 cDNA에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA 및 NB를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 BM2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결 된 관심 cDNA 또는 그의 단편에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 방법.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 제2 리보자임 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 관심 cDNA 또는 그의 단편에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 제1 리보자임 서열에 연결된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터를 포함하는 벡터를 더 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 관심 cDNA가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 치료 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것인 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 A형 HA인 방법.
  35. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 B형 HA인 방법.
  36. 제27항 또는 제29항에 있어서, a)의 모든 벡터가 RNA PolⅡ 프로모터를 포함 하는 것인 방법.
  37. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 더 포함하는 방법.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 바이러스.
  39. 제38항의 바이러스와 접촉시킨 세포.
  40. 제38항의 바이러스로 감염시킨 세포.
  41. 개체를 면역화시키기에 효과적인 양의 제38항의 바이러스를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 병원체에 대해 면역화시키는 방법.
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