KR102584623B1 - 오리 유래 rna 폴리머라제 i 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 - Google Patents

오리 유래 rna 폴리머라제 i 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오리 유래의 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 오리 유래 RNA 폴리머라제 I 프로모터를 이용하면 높은 효율로 조류인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있다. 또한, 변이 조류인플루엔자 바이러스 및 신규 조류인플루엔자 바이러스 발생시 구축된 바이러스 생산 시스템을 바탕으로 백신 후보주 라이브러리 및 진단액을 조기에 확보하여 국내 산업의 피해를 최소화할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

오리 유래 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 {Duck-derived RNA polymerase I promoter and recombinant vector containing the same}
본 발명은 오리 유래의 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
H5형 고병원성 조류인플루엔자(avian influenza, AI) 바이러스는 1997년 홍콩에서 처음으로 가금류에서 사람으로 직접 질병이 전파되면서, 세계적으로 주목받기 시작하였다. H5형 고병원성 조류인플루엔자(avian influenza, AI) 바이러스는 2000년대 초반 이후 중국, 동남아에서 상재화되기 시작하였고, 이후 가금류와 야생조류에서의 바이러스의 순환 감염이 늘어나면서 야생조류를 통한 국가 간 · 대륙 간 전파 사례가 급증하고 있다. 특히 Gs/Gd 계열 (Goose/Guangdong lineage)에 속하는 H5형 고병원성 AI 바이러스는 유전적 변이가 지속적으로 일어나, 다양한 혈청형 및 유전형의 바이러스가 끊임없이 생성·유행되고 있다.
우리나라도 2003년 이후 H5N1, H5N8 및 H5N6형 고병원성 조류인플루엔자의 발생으로 막대한 사회·경제적인 피해를 입었으며, 앞으로도 질병 재유입의 가능성이 존재한다. 특히, 2016-2017년 고병원성 조류인플루엔자 발생으로 단기간에 사상 최대의 피해가 발생하였고, 이로 인해 2018년 조류인플루엔자 긴급 백신을 위한 국가항원은행이 설립되었다. 현재 항원은행용 H5형 조류인플루엔자 백신주는 역유전학 시스템을 사용하여 생산되고 있다. 현재 전 세계적으로 사용하고 있는 인플루엔자 유전자 재조합 바이러스 제작기술은 사람 유래의 프로모터를 이용한 역유전학 시스템을 기반으로 하고 있다(Hoffmann et a l., 2000).
사람의 경우, 인체 유래 인플루엔자 바이러스 연구와 백신주 생산을 위한 연구가 활발하여, 인체 유래 인플루엔자 바이러스 생산을 위한 최적화된 역유전학 시스템이 확립되어 있다. 그러나 인체에 최적화된 역유전학 시스템으로는 조류인플루엔자 바이러스의 백신 제조를 위한 재조합 바이러스 생산 및 병원성 등과 관련된 유전자마커 규명 등에 한계가 있다. 따라서 조류 세포에서 작동하는 조류 유래 프로모터를 포함한 벡터 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2006-0026854호 (2006.03.24 공개)
본 발명자들은 조류인플루엔자 바이러스의 백신 제조를 위해 효율적인 재조합 바이러스 생산 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 오리에서 유래한 폴리머라제 I 프로모터를 사용하는 경우, 인간에서 유래한 프로모터를 사용하는 경우보다 효과적으로 재조합 조류인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양해 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명자들은 조류인플루엔자 바이러스의 백신 제조를 위해 효율적인 재조합 바이러스 생산 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 오리에서 유래한 폴리머라제 I 프로모터를 사용하는 경우, 인간에서 유래한 프로모터를 사용하는 경우보다 효과적으로 재조합 조류인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 오리(Anas platyrhynchos) 유래의 RNA 폴리머라제 I 프로모터인 것이다. Anas platyrhynchos는 청둥오리라고 불리며, 대한민국에서 흔하게 관찰되는 오리류 중 하나이다. Anas platyrhynchos는 철새이며 조류인플루엔자 바이러스를 옮기는 원인이 되기도 한다.
RNA 폴리머라제(RNAP 혹은 RNApol)는 RNA 중합효소로도 불리며 DNA로부터 1차 전사체(primary transcript) RNA를 합성하는 효소이다. RNA 폴리머라제는 DNA를 이용하여 RNA 사슬을 만드는 전사과정에 필수적이므로 모든 생물과 많은 바이러스에 존재한다. 진핵생물 핵 RNA 폴리머라제는 여러 종류가 있어 각각 다른 종류의 RNA를 합성하며 세균의 RNA 폴리머라제와 구조나 기작이 유사하다. RNA 폴리머라제 I은 전구체 rRNA(pre-rRNA) 45S를 합성한다. 전구체 rRNA는 리보솜을 구성하는 주요 RNA인 28S, 18S, 5.8S rRNA가 된다.
본 명세서의 용어 "프로모터(promoter)"는 전사의 시작에 관여하는 유전자의 상류 영역을 가리킨다. 즉, RNA 폴리머라제가 결합하는 DNA 가닥의 부위를 말하며, 일반적으로 특정 유전자의 시작부위로부터 1kbps 안쪽에 있는 경우가 대부분이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 유전자 클로닝을 위한 벡터 또는 단백질의 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 명세서에서 용어 유전자는 전사 단위, 및 이 전사 단위에 인접해 있으며 (예를 들어, 상류 및 하류에 위치해 있으며) 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역을 지칭한다. 전사 단위는 RNA 분자로 전사되는 일련의 뉴클레오타이드이다. 전사 단위는 코딩 영역을 포함할 수 있다. "코딩 영역"은 비-가공된 preRNA (즉, 엑손 및 인트론을 둘 다 포함하는 RNA 분자)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 비-가공된 preRNA는 후속해서 mRNA로 가공된다. 전사 단위는 비-코딩 RNA를 코딩할 수 있다. 비-코딩 RNA는 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자이다. 비-코딩 RNA의 예는 마이크로RNA(microRNA)를 포함한다. 전사 단위의 경계는 일반적으로 5' 말단에서는 개시 부 위 및 3' 말단에서는 전사 종결자에 의해 결정된다. "조절 영역"은 전사 단위에 작동적으로 연결되어 있으며 이의 발현을 조절하는 뉴클레오타이드 서열이다. 조절 서열의 비-제한적인 예로는, 프로모터, 인핸서, 전사 개시 부위, 번역 시작 부위, 번역 정지 부위, 전사 종결자 및 폴리(A) 신호를 포함한다. 전사 단위의 상류에 위치하는 조절 영역은 5' UTR로 지칭될 수 있으며, 전사 단위의 하류에 위치하는 조절 영역은 3' UTR로 지칭될 수 있다. 조절 영역은 전사될 수 있으며, 비-가공된 preRNA의 일부일 수 있다.
본 발명은 또한, 코딩서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 상기 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 코딩 서열은 예를 들면, 전체 유전자, 또는 그의 일정한 영역을 코딩하는 서열일 수 있다. 본 발명에 있어서 "작동가능하게 연결된"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 벡터는 상기 서열과 작동가능하게 연결된 5′및 3′조절서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6-His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 추가적으로 포함하는 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속하며 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스 게놈은 8개의 단일 가닥 바이러스 RNA (vRNA) 절편을 함유한다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 8개의 게놈 절편은 크기 순서대로 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS이다. PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS는 내부 단백질과 비구조 단백질을 암호화하며, 골격 절편으로 지칭될 수 있다. HA 및 NA 절편은 표면 당단백질을 암호화한다. 본 발명의 방법은 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 재배열 인플루엔자 B 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스의 경우, 8개의 게놈 절편은 다음과 같이 11개의 단백질을 암호화한다: 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 2개의 기질 단백질 (M1 및 M2), 이종삼량체 RNA-의존성 RNA 중합효소 (하나의 중합효소 산성 소단위 (PA), 및 2개의 중합효소 염기성 소단위 (PB1 및 PB2)로 구성됨), 핵단백질 (NP), 및 2개의 비구조 단백질 (NS1 및 NS2; NS2는 핵 수출 단백질 (NEP)이라고도 함). 일부 인플루엔자 A 바이러스는 또한 세포사멸 촉진 펩티드인 PB1-F2를 발현한다. PB2, PA, HA, NP 및 NA 절편은 각각 단일 발현 단백질을 암호화한다. PB1, M 및 NS 절편은 하나 이상의 단백질을 암호화한다. PB1 절편은 PB1 단백질뿐만 아니라 PB1-F2 단백질 (PB1 절편의 +1 판독 프레임에 암호화됨)을 암호화한다. M 절편은 M1 및 M2 단백질을 암호화한다. NS 절편은 NS1 및 NS2/NEP 단백질을 암호화한다. M2 및 NS2/NEP 단백질은 M 및 NS 절편으로부터 스플라이싱된 mRNA에서 발현된다.
인플루엔자 B 바이러스의 경우, 8개의 게놈 절편은 또한 11개의 단백질을 암호화하지만, 인플루엔자 A 바이러스와 약간의 차이점이 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우 PB2, PA, HA 및 NP 절편이 각각 단일 발현 단백질을 암호화하고, NS 절편은 NS1 및 NS2/NEP 단백질을 암호화한다. PB1-F2 단백질은 인플루엔자 B 바이러스에 존재하지 않으며, 이는 PB1 절편이 PB1 단백질만을 암호화하는 것을 의미한다. NA 단백질 외에도 인플루엔자 B 바이러스의 NA 절편은 대체 -1 판독 프레임에서 NB 기질 단백질을 암호화한다. NB 기질 단백질은 인플루엔자 A의 M2 단백질에 해당한다. M 절편은 M1 단백질을 암호화하고, 대체 +2 판독 프레임에서 BM2 단백질을 암호화한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 바이러스 벡터는 a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택된 벡터 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 벡터, 및 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 벡터로부터 선택된 벡터일 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현 또는 코딩하거나 또는 인플루엔자 vRNA를 발현 또는 코딩하는 단리 및 정제된 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 관심 유전자 또는 관심 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 예를 들어 백신으로서 유용한 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함할 수 있다. 관심 유전자 또는 관심 오픈 리딩 프레임을 포함하는 벡터 또는 플라스미드에 있어서, 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임이 인플루엔자 바이러스의 5' 및 3' 인플루엔자 바이러스 서열 (각각 5' 및 3' 비-코딩 서열 포함)에 인접하는 것이 바람직하며, 구체적인 일 실시양태에 있어서, 5' 및 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 인접한 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임이 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 RNA 폴리머라제 I 전사 종결 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 바이러스를 제조할 때, 상기 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 벡터 또는 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 게놈에 대한 벡터 또는 플라스미드를 대체할 수 있으며, 또한 모든 인플루엔자 바이러스 유전자 대한 벡터 또는 플라스미드에 추가하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다수의 벡터가 물리적으로 연결되거나, 또는 각 벡터가 개별 플라스미드 또는 다른 (예컨대, 선형) 핵산 전달 비히클(vehicle)에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", 형질도입된" 또는 "형질감염된' 은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 조류 세포인 것이다.
본 명세서에서 용어 "조류(avian)", "새", "조류(aves)", 또는 "ava"는 모두 같은 의미를 갖는 것으로 간주되며 구분되지 않고 사용될 것이다. "조류"는 분류 집단 "ava"에 속하는 모든 종, 아종 또는 품종을 일컫는 것으로 간주된다. 바람직한 구현예에서, "새"는 분류학적 기준의 모든 동물을 일컫는다.
상기 조류는 예를 들어, 닭, 오리 또는 메추리 일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 숙주 세포를 제공할 수 있는 임의의 조류를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조류는 오리일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들어, 닭 배아 섬유모세포(chicken embryo fibroblast, CEF), QT-35 세포, QM-7세포 또는 LMH(chicken hepatoma cell line), DF-1 세포, CCL-141 세포, QT-6 세포와 같은 조류 세포일 수 있다. 다만, 숙주 세포는 이에 한정되지는 않으며, 본 발명의 벡터를 안정적, 연속적으로 발현시킬 수 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예컨대, 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양해 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
용어 "바이러스 제조"는 살아있는 바이러스, 감쇠된 바이러스 및/또는 바이러스 유사입자(virus-like particles, VLP)의 제조를 지칭할 수 있다. 제조는 1) 유기체 (예를 들어, 난황), 배양된 세포 (예를 들어, 조류 세포) 또는 시험관 내 (예를 들어, 세포 용혈물)에서의 제조를 비롯한 일반적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명을 이용해 생산가능한 바이러스는 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, AIV), 전염성 기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus, IBV), 감염성 활액낭 질환 바이러스(infectious bursal disease virus, IBDV), 마렉병 바이러스(Marek's disease virus, MDV), 조류 메타뉴모바이러스(avian metapneumovirus, aMPV), 전염성 F낭병 바이러스 (infectious bursal disease virus, IBDV), 또는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV) 일 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고 조류 세포를 숙주세포로 하여 생산할 수 있는 모든 바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 조류 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 상기 조류 유래 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 단계, 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에, 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는, 5' 바이러스 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있는 5' 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 상기 서열은 전사 종결 서열에 연결된 3' 바이러스 서열에 연결된 원하는 핵산 서열 (예컨대, 원하는 cDNA)에 연결되어 있다. 바람직하게는, cDNA와 같은 원하는 핵산 서열은 안티센스 배향이다. 바이러스 복제를 허용할 수 있는 숙주 세포에 상기 조성물을 도입하면, 3'바이러스 서열에 연결된 cDNA에 연결된 5' 바이러스 서열을 포함하는 벡터의 서열에 상응하는 vRNA를 포함하는 재조합 바이러스가 생성된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
(c) 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
(d) 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양해 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
(e) 본 발명의 오리 유래 RNA 폴리머라제 I 프로모터를 이용하면 높은 효율로 조류인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있다. 또한, 변이 조류인플루엔자 바이러스 및 신규 조류인플루엔자 바이러스 발생시 구축된 바이러스 생산 시스템을 바탕으로 백신 후보주 라이브러리 및 진단액을 조기에 확보하여 국내 산업의 피해를 최소화할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 폴리머라제 I의 전사 시작부위 (+1)를 기준으로 -8에서 +11까지의 염기서열을 종별로 비교한 모식도를 나타낸다.
도 2는 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자와 폴리머라제 I 터미네이터 유전자가 포함된 pUC57 벡터에 250, 500, 750 및 1,000개 뉴클레오타이드 길이의 오리 유래 프로모터를 각각 삽입하여 제조한 리포터(reporter) 플라스미드의 모식도를 나타낸다.
도 3a는 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자와 폴리머라제 I 터미네이터 유전자가 포함된 pUC57 벡터에 250, 500, 750 및 1,000개 뉴클레오타이드 길이의 오리 유래 프로모터를 각각 삽입하여 제조한 리포터(reporter) 플라스미드의 벡터맵을 나타낸다.
도 3b는 제작한 리포터 플라스미드 벡터를 DF-1과 QT6 세포에 도입하여 루시퍼레이즈의 활성도를 측정하는 과정의 모식도를 나타낸다.
도 4는 DF-1과 QT6 세포에서 루시퍼레이즈 발현양을 측정하여 오리 유래 프로모터의 길이 별 활성을 비교한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 오리 유래 RNA 폴리머라제(polymerase) I 프로모터 유전자 검색
본 발명은 NCBI Genbank 데이터베이스에 공개된 오리(Anas platyrhynchos)의 전체 유전자 샷건 서열(GenBank accession no. NW_024010378.1)을 오리(Anas platyrhynchos)의 18S rRNA 서열 (GenBank accession no. XR_003493879) 및 28S rRNA 서열(GenBank accession no. XR_003493880)과 비교 분석하여 오리 RNA 폴리머라제 I 전사 개시 부위를 예측하였다. 이를 바탕으로 오리 RNA 폴리머라제 I 프로모터 부위를 분석하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 전사 개시 부위의 주변에 같은 조류 유래인 닭의 RNA 폴리머라제 I 프로모터와 유사한 염기서열 규칙성이 확인되었다.
실시예 2: 오리 유래 RNA 폴리머라제(polymerase) I 프로모터 유전자 확보 및 플라스미드 제작
프로모터의 길이에 따른 활성 변화를 비교하기 위하여 250, 500, 750 및 1,000 bp 뉴클레오타이드 길이의 4종류의 프로모터를 선정하였다(서열번호 1 내지 서열번호 4). 각각의 프로모터는 유전자 합성을 통하여 확보하였다. 유전자 합성은 Genscript (Piscataway, New Jersey, USA)에 의뢰하였다. 상기 합성을 통해 확보한 프로모터 유전자들은 도 2 및 도 3a에 나타낸 바와 같이, 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자와 폴리머라제 I 터미네이터 유전자가 포함된 pUC57 벡터에 각각 삽입하여 리포터(reporter) 플라스미드를 완성하였다.
실시예 3: 오리 유래 RNA 폴리머라제(polymerase) I 프로모터의 활성도 평가
실시예 2에서 제작한 4종류의 플라스미드에서 루시퍼레이즈 발현양을 측정하여 프로모터 활성을 평가하였다. 루시퍼레이즈 발현 측정 과정은 도 3b에 나타내었다. 상기 4종류의 리포터 플라스미드와, 인플루엔자 바이러스의 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP)을 활용하기 위하여 A/PR/8/34 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP 유전자를 pcDNA3.1(+) 벡터에 각각 삽입한 플라스미드를 사용하였다. 추가적으로 상대 정량을 위하여 레닐라 루시퍼레아제를 발현하는 pGL4.73(Promega, USA)을 사용하였다. 구체적으로, 상기 리포터 플라스미드들의 프로모터 활성을 알아보기 위하여 계태아 섬유아세포주인 DF-1 및 메추리 섬유아세포주인 QT-6 세포에, RNP 발현 플라스미드와 pGL4.73 및 4종류의 리포터 플라스미드를 각각 형질도입(transfection) 한 다음, 48시간 후 루시퍼레이즈의 발현양을 측정하였다. 루시퍼레이즈 발현량의 측정은 9회 반복해 측정하였다.
결과는 도 4, 표 1 및 표2에 나타내었다.
도 4 및 표 1에 나타낸 바와 같이, DF-1 및 QT-6 세포에서 250 bp 길이부터 1,000 bp 길이까지 총 네 종류의 오리 유래 RNA 폴리머라제 I 프로모터 모두 루시퍼레이즈 발현이 가능한 것을 확인하였다. 특히, 250 bp 길이의 오리 유래 폴리머라제 I 프로모터가 나머지 길이의 오리 유래 폴리머라제 I 프로모터보다 높은 발현 효율성을 보였다. 구체적으로 250bp 길이의 오리 유래 폴리머라제 I 프로모터는 500 내지 1000bp 길이의 오리 유래 폴리머라제 I 프로모터와 대비하여 약 30% 내지 300% 높은 루시퍼레이즈 발현량을 나타내었다.
DF-1 세포주에서 프로모터 길이에 따른 루시퍼레이즈 발현량의 상대적 비교
대조군 250bp 프로모터 500bp 프로모터 750bp 프로모터 1000bp 프로모터
평균 0.06 278.95 138.81 104.66 100.00
표준편차 0.09 15.88 4.56 10.64 8.91
QT-6 세포주에서 프로모터 길이에 따른 루시퍼레이즈 발현량의 상대적 비교
대조군 250bp 프로모터 500bp 프로모터 750bp 프로모터 1000bp 프로모터
평균 0.07 156.11 120.25 89.81 100.00
표준편차 0.01 6.91 11.47 22.36 17.71

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것인, 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 오리(Anas platyrhynchos) 유래의 RNA 폴리머라제 I 프로모터인 것인, 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 추가적으로 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포는 조류 세포인 것인, 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양해 바이러스를 생산하는 방법.
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농림축산검역검사기술개발, 최종보고서, 농림축산검역본부 주관(2016.12.) 1부.* *

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