KR20100028038A - 인플루엔자의 치료 및 예방 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인플루엔자의 치료 및/또는 예방에 유용한, 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자, 및 이를 코딩하는 핵산 구조체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조류 인플루엔자 감염에 대한 감수성이 낮아진 형질전환 가금류, 예컨대 닭을 생산하는데 사용할 수 있는 이중 가닥 RNA 분자(들)를 코딩하는 핵산 구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 예컨대 가금류에서 조류 인플루엔자를 치료 및/또는 예방하기 위한 치료제로서 사용할 수 있는 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
Description
본 발명은 인플루엔자의 치료 및/또는 예방에 이용가능한, 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자와 이를 코딩하는 핵산 구조체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조류 인플루엔자 감염에 대한 감수성이 감소된, 형질전환 동물, 예컨대 닭을 생산하는데 이용할 수 있는 이중 가닥의 RNA 분자(들)를 코딩하는 핵산 구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 예컨대 가금류에서 조류 인플루엔자를 치료 및/또는 예방하기 위한 치료제로서 이용할 수 있는 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
A형, B형 및 C형의 3가지 타입의 인플루엔자 바이러스들이 알려져 있으며, 이것들은 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)로 지칭되는 단일 가닥 (-)-센스 외막 RNA 바이러스 과에 속한다. 바이러스 게놈은 약 12000 내지 15000 뉴클레오티드 길이이며, 11개의 단백질들을 코딩하는 8개의 RNA 세그먼트(C형의 경우에는 7개)를 포함하고 있다.
인플루엔자 A 바이러스는 인간, 돼지, 말, 해양 포유류 및 조류와 같이 많은 동물에 감염된다(Nicholson et al., 2005). 이의 천연 저장소는 수생 조류이며, 조류 종들에서의 인플루엔자 바이러스 감염 대부분은 호흡기와 장관에 국소적인 경 미한 감염을 야기한다. 그러나, 이 바이러스는 가금류에서는 병원성이 높을 수 있으며, 갑작스러운 발병은 감염된 가금류 집단에서 높은 사망률을 초래할 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스는, 표면 당단백질, 즉 바이러스 부착과 세포로부터의 방출에 필요한 햄어글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)를 코딩하는 2가지 유전자의 항원성 영역의 대립유전자 차이를 기초로 서브타입으로 분류할 수 있다. 그외 다른 주요한 바이러스 단백질로는 핵단백질, 뉴클레오캡시드 구조 단백질, 매트릭스 단백질(M1 및 M2), 중합효소(Pa, PB1 및 PB2) 및 비구조 단백질(non-structural protein: NS1 및 NS2)이 있다.
인플루엔자 A 바이러스에서는 16개 이상의 HA 서브타입(H1 내지 H16)과 9개의 NA(N1 내지 N9) 항원 변형체들이 알려져 있다. 조류 인플루엔자 균주들은 또한 고병원성과 저병원성 균주로 특정할 수 있다. 저병원성 균주들은 통상적으로 HA 전구체의 절단 부위의 -1 및 -3 위치에 2개의 염기성 아미노산만을 가지고 있지만, 고병원성 균주는 다중-염기성 절단 부위를 가지고 있다. 서브타입 H5 및 H7은 가금류에서 고병원성 감염을 야기할 수 있으며, 어떤 서브타입들은 종 경계를 넘어 인간에게도 감염되는 것으로 확인되었다. 고병원성 H5 및 H7 바이러스는 또한 사육 가금류에서 저병원성 전구체로부터 생겨날 수 있다. 조류 인플루엔자의 감염 증상은 전형적인 인플루엔자 타입의 증상(열, 기침, 인후염 및 근육통)에서부터 결막염, 폐렴, 급성 호흡 곤란 및 그외 생명을 위협하는 합병증들에 이르기까지 다양하다.
가축 산업에 있어서 생산성과 복지 후생을 향상시키고 또한 인간의 건강에 대한 위험성을 감소시키기 위해, 가금과 같은 동물에서 인플루엔자 바이러스의 생존 및/또는 복제를 통제하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명자들은 감염된 동물 세포에서 인플루엔자 바이러스 복제 및/또는 생산을 감소시킬 수 있는 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자를 동정하였다.
이에, 본 발명은 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 제공하며, 상기 RNA 분자는 동종동계(isogenic)의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 감소시키거나, 동물세포에서의 감염성 인플루엔자 A 바이러스 입자의 생산을 감소시키거나, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
바람직하게는, 이중 가닥 영역은 하기 뉴클레오티드로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 2240 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(ii) 서열번호 2의 2257 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(iii) 서열번호 3의 2087 - 2233 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(iv) 서열번호 4의 1484 - 1565 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(v) 서열번호 6 내지 15 또는 52 내지 54 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열;
(vi) (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열;
(vii) 엄격 조건하에서 (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열.
일 예에서, 상기 RNA 분자는, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 감소시킨다. 다른 예로, 상기 RNA 분자는, 동종동계 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 감염성 인플루엔자 A 바이러스 입자의 생산을 감소시킨다. 또다른 예로, 상기 RNA 분자는, 동종동계 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
바람직하게는, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스이다.
본 발명의 핵산 구조체는 이중 가닥 영역을 포함하는 임의 타입의 RNA 분자를 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 이중 가닥 영역은 그 길이가 19개 이상의 염기쌍이다. 또한, 이중 가닥 영역은 그 길이가 100개 미만의 염기쌍인 것이 바람직하다.
특히 바람직한 예에 있어서, 코딩된 RNA 분자는 짧은 헤어핀 RNA이다.
바람직한 일 예로, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 7의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 9의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 6의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
바람직한 일 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 8의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 13의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 예에서, RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역은 서열번호 15의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 예로, 핵산 구조체는 2개 이상의 RNA 분자, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 RNA 분자를 코딩한다. 따라서, 본 발명은 2개 이상의 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 제공한다. 코딩되는 RNA 분자들은 상이하거나, 동일하거나, 또는 이의 조합일 수 있다. 나아가, 코딩되는 RNA 분자들은 동일하거나 상이한 인플루엔자 A 바이러스 유전자를 표적으로 하거나 또는 이의 조합을 표적으로 할 수 있다. 일 예로, 각 RNA 분자는 여러가지 인플루엔자 A 바이러스 유전자에 대응되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 각 RNA 분자가 RNA 중합효소 II 프로모터나 RNA 중합효소 III 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 본 발명의 핵산 구조체를 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 프로모터는 RNA 중합효소 III 프로모터이다.
일부 예에서, 프로모터 서열은, 핵산 구조체가 형질감염/형질전환되는, 동물 및/또는 세포, 또는 그 자손의 자연 발생적인 형성 프로모터 서열과 동일한 것이 바람직할 수 있다. 일 예로, 프로모터는 닭, 칠면조 및/또는 오리 유래의 프로모터이다.
바람직하게는, 프로모터는 U6, 7SK 및/또는 H1 프로모터 중에서 선택된다.
일 특정 예에서, U6 프로모터는 cU6-1, cU6-2, cU6-3, 및/또는 cU6-4이다.
다른 예로, 프로모터는 서열번호 22 내지 25 중에 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명자들은, shRNA의 전사를 도출하는데 필요한 최소 크기의 프로모터 서열이 함유된 U6 프로모터를 포함하고 있는 핵산 구조체가, shRNA 전사에 있어서, 상류 100 bp 서열이 부가된 US6 프로모터를 포함하는 구조체와 적어도 동일한 효과를 가지고 있다는 것을 예기치않게 확인하였다. 따라서, 본 발명의 일 예에 있어서, 프로모터는 서열번호 22 -25 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
또다른 예로, RNA 분자를 코딩하는 각 뉴클레오티드 서열은 상이한 RNA 중합효소 III 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 예로, RNA 분자는 서열번호 1 내지 5 중 임의의 하나에 의해 코딩되는 인플루엔자 A 바이러스 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
일 특정 예로, 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드는 PB15 PB2, PA, NP 및/또는 M1 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 조류 인플루엔자의 폴리펩타이드이다.
일 예로, 조류 인플루엔자는 고병원성 균주이다.
바람직하게는, 상기 조류 인플루엔자는 H5N1이다.
다른 예로, 상기 구조체는 인플루엔자 A 바이러스 서열과 자연 발생적인 숙주 동물 서열만을 포함한다. 예로, 구조체를 닭 형질감염용으로 제작하는 경우, 핵산 구조체는 닭의 서열과 인플루엔자 A 바이러스의 서열로 바람직하게 구성될 것이다. 따라서, 일 예로, 본 발명은, 구조체가 닭 및 인플루엔자 A 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성된, 본 발명의 핵산 구조체를 제공한다.
바람직한 예로, 본 발명의 핵산 구조체는 이중 가닥 영역을 포함하는 3개의 RNA 분자를 코딩하며, 상기 이중 가닥 영역은 하기 서열 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(i) 서열번호 9, 서열번호 13 및 서열번호 15,
(ii) 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8,
(iii) 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 12.
다른 바람직한 예에서, 핵산 구조체는 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단편은 서열의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 50개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 20개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 10개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 이중 가닥 영역을 포함하는 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자를 제공하며, 상기 이중 가닥 영역은 하기 뉴클레오티드 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 2240 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(ii) 서열번호 2의 2257 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(iii) 서열번호 3의 2087 - 2233 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(iv) 서열번호 4의 1484 - 1565 위치내에 있는 뉴클레오티드;
(v) 서열번호 6 내지 15 또는 52 내지 54 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열;
(vi) (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열;
(vii) 엄격 조건하에서 (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열.
일 예에서, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 동종동계 동물 세포에 비해 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스 복제를 감소시킨다. 다른 예로, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 동물 세포에 비해 동물에서에서의 감염성 인플루엔자 A 바이러스 입자의 생산을 감소시킨다. 또다른 예에서, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 동물 세포에 비해 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
다른 예로, 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나에 의해 코딩되는 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
바람직하게는, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자의 이중 가닥 영역의 길이는 19개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 예로, 이중 가닥 영역의 길이는 100개 미만의 뉴클레오티드이다.
일 예로, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는 이중 가닥 RNA를 포함한다.
바람직하게는, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는 짧은 간섭(interfering) RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA이다.
바람직한 일 예로, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단편은 서열의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 50개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 20개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 10개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 예에서, 핵산 구조체 및/또는 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자는 세포의 게놈에 존재한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체, 및/또는 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의, 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 세포는 원시 생식 세포(primordial germ cell), 예컨대 닭의 원시 생식 세포이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 비-인간(non-human) 형질전환 유기체를 제공한다. 형질전환 유기체는 임의의 유기체, 예컨대 동물 또는 식물일 수 있다.
일 예로, 형질전환 유기체는 비-인간 동물이다.
다른 예로, 형질전환 유기체는 조류이다. 바람직한 예로, 형질전환 유기체는 가금류이다. 보다 더 바람직한 예로, 형질전환 유기체는 닭, 칠면조 또는 오리이다.
일 예로, 본 발명의 형질전환 유기체는, 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함하며, 상기 서열은 이중 가닥 영역을 포함하는 하나 이상의 RNA 분자를 코딩한다. 서열번호 16 -21 및 61-63과 밀접하게 관련된 단편 및/또는 서열은, 유기체의 게놈에 삽입될 때 구조체의 5' 및/또는 3' 영역이 소실되거나, 및/또는 수많은 세대를 거쳐 세포 분열되면서 최초의 구조체와 비교하여 사소한 돌연변이들이 하나 또는 수개의 뉴클레오티드 차이를 형성하기 때문에, 본 예에 포함된다. 바람직하기로는, 단편은 서열의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 50개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 20개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 10개 이하의 뉴클레오티드가 소실된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 예로, 형질전환 유기체는 본 발명의 핵산 구조체를 2개 이상 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체, 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 본 발명의 벡터, 본 발명의 세포 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의, 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포는 이를 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 감염을 개체에서 치료 및/또는 예방할 수 있다. 예로, 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포는 닭, 칠면조 또는 오리와 같은 가금류를 조류 인플루엔자로부터 보호하는데 이용될 수 있다. 또한, 조류 집단에서 조류 인플루엔자가 국지적으로 발병하면, 조류 인플루엔자 발병을 억제하고자 하는 시도로, 주변 지역, 예컨대 주변 농장에서 조류를 감염으로부터 보호하는데 본 발명이 바람직하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체, 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 예로, 상기 방법은 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산, 벡터 및/또는 세포를 음용수 또는 에어로졸 형태로 투여하는 것을 포함한다.
일 특정 예로, 인플루엔자 A 바이러스는 조류 인플루엔자이다.
바람직하게는, 조류 인플루엔자는 고병원성 균주이다.
가장 바람직한 예로, 조류 인플루엔자는 H5N1이다.
바람직하게는, 개체는 조류이고, 더 바람직하게는 가금류이다. 가장 바람직한 예로, 개체는 닭, 칠면조 또는 오리이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에 있어서의, 본 발명의 핵산 구조체, 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 세포의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 동물로부터 수득한 샘플에서 본 발명의 핵산 구조체 및/또는 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 본 발명의 핵산 구조체 또는 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자를 포함하는 동물을 동정하는 방법을 제공한다.
일 예로, 상기 방법은 핵산 구조체나 이의 단편, 또는 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자 또는 이의 단편을 증폭시키는 것을 포함한다.
다른 예로, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
동물로부터 수득한 샘플을, 엄격 조건 하에서 핵산 구조체나 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자와 혼성화되는 프로브와 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 단계, 및
상기 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자에 대한 내성을 가진 비-인간 형질전환 동물의 육종 방법을 제공한다:
(i) 본 발명의 핵산 구조체를 비-인간 동물 세포에 도입하는 단계,
(ii) 상기 핵산 구조체를 포함하는 비-인간 형질전환 세포를 선별하는 단계,
(iii) 상기 비-인간 형질전환 세포로부터 비-인간 형질전환 동물을 재생하는 단계,
(iv) 상기 비-인간 형질전환 동물을 육종시켜, 형질전환 자손을 생산하는 단계, 및
(v) 인플루엔자에 내성을 보이는 상기 형질전환 자손을 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 식품의 제조 방법을 제공한다:
(i) 본 발명의 핵산 구조체를 동물 세포에 도입하는 단계,
(ii) 상기 핵산 구조체를 포함하는 형질전환 세포를 선별하는 단계,
(iii) 상기 형질전환 세포로부터 형질전환 동물을 재생하는 단계,
(iv) 상기 형질전환 동물을 육종시켜, 형질전환 자손을 생산하는 단계, 및
(v) 상기 형질전환 자손으로부터 식품을 제조하는 단계.
일 예로, 식품은 육류 및 알(egg) 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자에 내성을 보이는 비-인간 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 이중 가닥 RNA 분자를 코딩하며 트랜스포존(transposon)을 포함하는 제1 핵산을, 세포에 도입하는 단계,
(ii) 트랜스포자제(transposase)를 코딩하는 제2 핵산을 상기 세포에 도입하는 단계,
(ii) 상기 세포의 게놈에 상기 제1 핵산을 포함하고 있는 형질전환 세포를 선별하는 단계,
(iii) 상기 세포로부터 비-인간 형질전환 동물을 재생하는 단계, 및
(iv) 상기 비-인간 형질전환 동물을 육종하는 단계.
상기 제1 및 제2 핵산은 단일 핵산 분자로 세포에 도입되거나, 또는 별개의 핵산 분자로 세포에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 및 제2 핵산은 별개의 핵산 분자로 세포에 도입된다.
일 예로, 상기 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이고, 트랜스포자제는 Tol2 트랜스포자제이다.
다른 예로, 세포는 닭의 원시 생식 세포이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자에 내성을 보이는 비-인간 형질전환 동물을 제공한다.
일 예로, 상기 형질전환 동물은 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자는 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서 인플루엔자 바이러스 복제를 감소시킨다.
다른 예에서, 상기 형질전환 동물은 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자는 동종동계의 인플루엔자 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포와 비교하였을 때, 동물 세포에서 감염성 인플루엔자 바이러스의 입자의 생산을 감소시킨다.
다른 예에서, 상기 형질전환 동물은 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자는 동종동계의 인플루엔자 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포와 비교하였을 때, 동물의 인플루엔자 바이러스 감염 세포에서 인플루엔자 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킨다.
또다른 예에서, 비-인간 형질전환 동물은 닭이고, 인플루엔자는 인플루엔자 A이다.
바람직하게는, 상기 비-인간 형질전환 유기체는 본 발명의 핵산 구조체, 본 발명의 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 육종을 위한, 본 발명의 비-인간 형질전환 동물 또는 본 발명의 비-인간 형질전환 유기체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 식품 생산을 위한, 본 발명의 비-인간 형질전환 동물 또는 본 발명의 비-인간 형질전환 유기체의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 측면의 바람직한 특징 및 특성들은, 본 발명의 다른 많은 측면에도 적용가능함은 명확하다.
명세서 전체에서, 용어 "포함한다" 또는 "포함" 또는 "포함하는" 등의 변형어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 내포하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
이하, 본 발명은 하기의 비제한적인 예들과 첨부한 도면을 참조하여 설명된다.
발명의 상세한 설명
일반적인 기술들과 선정된 정의
특별히 언급된 경우를 제외하고는 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 분야(예, 세포 배양, 분자 유전학, 바이러스학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 받아들여야 한다.
특별히 언급된 경우를 제외하고는, 본 발명에서 사용한 분자 생물학, 바이러스학, 세포 배양 및 면역 기법들은 당해 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준 방법들이다. 이러한 기법들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (지금까지 업데이트된 모든 문헌들이 포함됨)와 같은 문헌들에 기술 및 설명되어 있으며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본원에서, "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"라는 용어들은, 본 발명의 핵산 구조체, 벡터, 세포 및/또는 핵산 분자를, 인플루엔자 A 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스의 감염 증상 중 한가지 이상을 줄이거나 또는 해소시키는데 충분한 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
"예방하는"이라는 용어는 인플루엔자 A 바이러스에 노출된 개체에서 감염 증상의 중증도를 경감시키거나, 또는 인플루엔자 A 바이러스에 노출된 개체를 인플루엔자 A 바이러스 감염의 한가지 이상의 증상으로부터 보호하는 것을 의미한다.
본원에서, 바이러스 병원체에 "내성"을 보이는 동물은 바이러스 병원체에 노출되었을 때, 예컨대 인플루엔자 바이러스에 노출되었을 때, 감수성 동물에 비해 질병의 증상이 경감되었거나 증상을 나타내지 않는다.
본원에서, "조류"라는 용어는 비제한적으로 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치(finch), 매, 까마귀 및 타조, 에뮤(emu)와 화석조(cassowary) 등의 주금류(ratites)와 같은 유기체 등의 분류학상 조류 강의 유기체의 모든 종, 아종 또는 속(race)을 의미한다. 상기 용어는 다양한 공지된 갈루스 갈루스(Gallus gallus)(닭) 주, 예컨대 백색 레그혼(White Leghorn), 갈색 레그혼(Brown Leghorn), 바드 록(Barred-Rock), 서섹스(Sussex), 뉴 햄프셔(New Hampshire), 로드 아일랜드(Rhode Island), 오스트랄로프(Australorp), 코니시(Cornish), 미노르카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이(California Gray), 이탈리아 패트리지 색(Italian Partidge-coloured), 뿐만 아니라, 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 시판하여 이익을 얻을 만한 양으로 상업적으로 육종한 그외 가금 주를 포함한다.
"가금류"라는 용어는 육류 또는 알로 유지되거나, 포획하거나 또는 사육한 모든 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 타조, 게임 헨(game hen), 비둘기, 뿔닭(guinea fowl), 꿩, 메추라기, 오리, 거위 및 에뮤를 포함한다.
본원에서, "조류 인플루엔자 바이러스"는 조류에 감염될 수 있는 모든 인플루엔자 A 바이러스를 의미한다. 조류 인플루엔자 바이러스의 예로는, 비제한적으로 서브타입 H1 내지 H16, 및 N1 내지 N9 중 어느 하나를 포함하며, 고병원성 균주와 저병원성 균주를 포함한다. 일 예로, 조류 인플루엔자 바이러스는 H5 서브타입이다. 다른 예로, 조류 인플루엔자 바이러스는 H7 서브타입의 조류 인플루엔자 바이러스이다. 다른 예로, 조류 인플루엔자 바이러스는 H5N1 서브타입의 조류 인플루엔자 바이러스이다.
"인플루엔자 A 바이러스 폴리펩타이드"라는 용어는 인플루엔자 A 바이러스 유전자에 의해 코딩되는 임의의 단백질, 예컨대 PB1, PB1-F2, PB2, 중합효소 PA (PA), 헴어글루티닌 (HA), 뉴클레오시드 단백질 (NP), 뉴라미니다제 (NA), 매트릭스 단백질 1 (Ml), 매트릭스 단백질 2 (M2), 비구조 단백질 1 (NS1) 및 비구조 단백질 2 (NS2)를 의미한다.
본원에서 "바이러스 복제"는 숙주 세포에서 바이러스 게놈의 증폭을 의미한다.
본원에서, "바이러스 입자"라는 용어는 단백질 쉘(shell)이나 캡시드로 둘러싸인 핵산을 포함하는, 전체 바이러스 구조에 관한 것으로 이해된다. 또한, 어떤 바이러스 입자들은 단백질 쉘을 둘러싸고 있는 당단백질 외막을 포함하며, 이러한 경우, 바이러스 입자라는 용어는 또한 바이러스 외막도 포함한다. "감염성 바이러스 입자"는 유기체의 세포에 도입되어 복제될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 유전자의 "발현을 감소시킨다" 또는 "발현을 감소시키는"은, 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 폴리펩타이드 서열의 번역이 하향-조절되거나 저해되는 것을 의미한다. 하향-조절 또는 저해 정도는, 숙주 세포에 제공되는 핵산 구조체 또는 핵산 분자의 성질 및 양, 상기 구조체로부터 발현되는 RNA 분자(들)의 고유성(the identity), 특성, 및 수준, 투여 후 시간 등에 따라 달라질 것이지만, 예컨대 표적 유전자 단백질 발현 및/또는 관련 표적 또는 세포성 기능에 검출가능한 감소, 예컨대 바이러스 복제 수준의 감소 등과 같이 분명해질 것이며, 바람직하게는 본 발명에 따라 처리되지 않은 세포에 비해 10%, 33%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 저해 수준이 달성될 것이다.
본원에서, "개체"라는 용어는 동물, 예컨대 조류나 포유류를 의미한다. 일 예로, 개체는 인간이다. 다른 예로, 개체는 조류, 예컨대 닭, 칠면조 또는 오리 등의 조류일 수 있다.
"샘플"은 본 발명의 핵산 구조체, 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포를 함유하고 있는 것으로 의심되는 물질을 의미한다. 샘플은 소스로부터 직접 수득한 것을 사용하거나 또는 한단계 이상의 (부분) 정제를 거친 후 사용할 수 있다. 샘플은 본 발명의 방법을 방해하지 않는 통상적인 매질내 형태로 준비할 수 있다. 전형적으로, 샘플은 상세하게 후술하는 바와 같은 수용액 또는 생물학적 유액이다. 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 침, 타액, 생리 유액, 안구 수정체의 액(ocular lens fluid), 땀, 변, 뇨, 모유, 복수, 점액, 활액, 복막액, 경피 삼출물, 인두 삼출물, 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 기관 흡입물(tracheal aspiration), 뇌척수액, 정액, 경부 점막, 질 배출물, 요도 배출물, 양수 등의 생리액과 같은, 모든 소스로부터 유래할 수 있다. 일 예로, 샘플은 혈액 또는 이의 분획이다. 전처리는, 예컨대 혈액으로부터 혈장 제조, 점액 희석 등을 포함할 수 있다. 처리 방법은 방해 성분들의 여과, 증류, 분리, 농축, 불활성화 및 시약의 첨가를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 테스트하기 전에 선택하고 전처리하는 것은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 따라서 추가적인 설명은 필요하지 않을 것이다.
본원에서, 용어 "트랜스포존"은, 트랜스포존과 삽입 부위 간에 광범위한 DNA 서열 상동성도, 고전적인 상동적인 교차에 필요한 재조합 효소도 필요하지 않은, 프로세스에 의해, 유기체의 게놈내에서 한 위치에서 다른 위치로 이동(이주)할 수 있는 유전자 요소를 의미한다.
본원에서, "동종동계"는 필연적으로 동일한 게놈 DNA가 특징인 유기체 또는 세포를 의미하며, 예로 상기 게놈 DNA는 동종동계의 유기체나 세포의 게놈 DNA와 약 92% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 동일하다.
본원에서, "도입"이라는 용어는 핵산 구조체 또는 핵산 분자와 관련하여, 가능한 가장 넓은 의미로 해석되어야 하며, 핵산 구조체 또는 핵산 분자를 세포나 유기체에 존재하도록 하는 모든 방법을 포함한다. 예로, 핵산 구조체 또는 핵산 분자는 예컨대 전기천공과 같은 임의의 적합한 형질감염 또는 형질전환 기법을 통해 네이키드 DNA로서 세포에 전달될 수 있다. 다른 예로, 핵산 구조체 또는 핵산 분자를 게놈에 삽입하여, 세포에서 트랜스유전자에 의해 발현시킬 수 있다.
RNA
간섭
용어 "RNA 간섭", "RNAi" 또는 "유전자 침묵화"는 일반적으로 이중 가닥의 RNA 분자가 이러한 이중 가닥의 RNA 분자와 실질적인 상동성 또는 전체 상동성을 공유하고 있는 핵산의 발현을 감소시키는 것을 의미한다. 그러나, 최근 들어, RNA 간섭이 비-RNA 이중 가닥 분자를 이용하여 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다(예, US 20070004667 참조).
본 발명은 RNA 간섭에 있어 이중 가닥 영역을 포함하거나 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 핵산 분자는 전형적으로 RNA이지만, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이중 가닥 영역은 19개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 예컨대 약 19 내지 23개의 뉴클레오티드이어야 하거나, 또는 더 길 수 있으며, 예컨대 30 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 100개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 전체 유전자 전사체에 대응하는 전장 서열을 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 이의 길이는 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드이다.
타겟화된 전사체에 대한 핵산 분자의 이중 가닥 영역의 동일성 정도는 90% 이상이어야 하며, 더 바람직하게는 95-100%이어야 한다. 상기 핵산 분자는 물론 분자를 안정화시키도록 작용할 수 있는 무관련 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"라는 용어는 예컨대 서열-특이적인 방식으로 RNAi를 중개함으로써 유전자 발현을 저해하거나 하향 조절할 수 있는 리보뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 의미하며, 이때 이중 가닥 부분은 그 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 예컨대, siRNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 핵산 분자일 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 타겟 핵산 분자나 이의 일부분에서 뉴클레오티드 서열이 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 센스 영역은 타겟 핵산 서열이나 이의 일부분에 대응되는 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다. siRNA는 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 가닥은 안티센스 가닥인 2개의 분리된 올리고뉴클레오티드로부터 조합될 수 있으며, 상기 안티센스 및 센스 가닥들은 자기-상보적이다.
본원에서, siRNA 용어는 서열 특이적 RNAi, 예컨대 마이크로-RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 핵산(siRNA), 짧은 간섭 변형 올리고뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 siRNA, 전사 후 유전자 침묵 RNA(ptgsRNA) 등을 매개할 수 있는 핵산 분자를 설명하기 위해 사용되는 그외 용어들과 동일한 의미이다. 아울러, 본원에서, RNAi 용어는 전사 후 유전자 침묵화, 번역 저해 또는 에피제네틱스(epigenetics: 후생유전)와 같은 서열 특이적인 RNA 간섭을 설명하는데 사용되는 다른 용어들과 동일한 의미이다. 예컨대, 본 발명의 siRNA 분자를 사용하여 후생유전적으로 유전자를 전사 후 레벨이나 전사전 레벨 모두에서 침묵시킬 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명의 siRNA 분자에 의한 유전자 발현의 후생유전적 조절은 유전자 발현을 변형시키기 위한 염색질 구조의 siRNA 매개 변형으로 인한 것일 수 있다.
"shRNA" 또는 "짧은-헤어핀 RNA"는, 50개 미만, 바람직하게는 약 19개 내지 약 23개의 뉴클레오티드가 동일한 RNA 분자 상에 위치한 상보적인 서열과 염기 쌍을 이루고 있으며, 상기 서열과 상보적인 서열이 2곳의 염기 상보성 영역에 의해 형성된 시스템 구조 위에 단일 가닥 루프 구조를 형성하고 있는 약 4개 이상 내지 약 15개의 뉴클레오티드로 구성된 쌍을 이루지 않은 영역에 의해 분리되어 있는, RNA 분자를 의미한다. 단일 가닥 루프 서열의 예로는 5' UUCAAGAGA 3'가 있다.
포함된 shRNA는 듀얼 또는 바이-핑거 및 다중-핑거 헤어핀 dsRNA이며, RNA 분자는 단일 가닥의 스페이서 영역에 의해 분리되어 있는 상기 줄기-루프 구조 2개 이상을 포함한다.
일단 설계가 되면, 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 시험관내 전사, 재조합에 의해 또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 특성을 개선하기 위해, 뉴클레오티드의 변형 또는 유사체를 도입할 수 있다. 개선되는 특성으로는, 뉴클레아제 내성 증가 및/또는 세포막 투과력 증가를 포함한다. 이에, "핵산 분자" 및 "이중-가닥 RNA 분자"는 비제한적으로 이노신, 크산틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸-, 2-프로필- 및 그외 알틸-아데닌류, 5-할로 우라실, 5-할로 사이토신, 6-아자 사이토신 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 80티올알킬 아데닌류, 8-하이드록실 아데닌 및 그외 8-치환된 아데닌류, 8-할로 구아닌류, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌류, 8-하이드록실 구아닌 및 그외 치환된 구아닌류, 그외 아자 및 데아자 아데닌류, 그외 아자 및 데아자 구아닌류, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 사이토신과 같이, 합성 변형 염기를 포함한다.
핵산
"분리된 핵산 분자"는 일반적으로 이의 천연 상태(조금이라도 자연 상태로 존재한다면)에서 조합되어 있거나 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열들로부터 분리된, 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 분리된 핵산 분자는 천연적으로 조합되어 있는 다른 성분들이 60% 이상, 더 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상 없다. 나아가, 용어 "핵산 분자"는 용어 "폴리뉴클레오티드"와 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
핵산과 관련하여 "외인성"이라는 용어는 세포에 또는 세포-결여 발현 시스템에 존재할 때 이의 천연 상태에 비해 양에 변화가 있는 핵산(본 발명의 핵산 구조체 포함)을 의미한다. 특히 바람직한 예로, 세포는 상기 핵산 또는 핵산 구조체를 자연적으로는 포함하지 않는 세포이다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의 단편을 의미한다. 이는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 탄수화물, 지질, 단백질 또는 다른 물질과 조합되어 본원에 명시된 특정 활성을 수행할 수 있다.
핵산 분자의 동일성%는 갭 형성 패널티 = 5, 갭 연장 패널티 = 0.3의 GAP(Needleman and Wunsch, 1970) 분석(GCG program)으로 정하였다. 쿼리 서열(query sequence)은 19개 이상의 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 19개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이로 2개의 서열들을 정렬한다. 다른 예로, 쿼리 서열은 150개 이상의 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 150개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이로 2개의 서열을 정렬한다. 다른 예로, 쿼리 서열은 300개 이상의 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 300개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이로 2개의 서열을 정렬한다. 바람직하게는, 2개의 서열은 전체 길이로 정렬된다.
정의된 핵산 분자와 관련하여, 상기에서 제시된 것 보다 높은 상동성%도 바람직한 구현예에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 적용가능한 경우에, 최소 상동성% 측면에서, 핵산 분자는, 해당 지명된 서열번호에 대해, 90% 이상, 더 바람직하게는 91% 이상, 더 바람직하게는 92% 이상, 더 바람직하게는 93% 이상, 더 바람직하게는 94% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 96% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상, 더 바람직하게는 99.1% 이상, 더 바람직하게는 99.2% 이상, 더 바람직하게는 99.3% 이상, 더 바람직하게는 99.4% 이상, 더 바람직하게는 99.5% 이상, 더 바람직하게는 99.6% 이상, 더 바람직하게는 99.7% 이상, 더 바람직하게는 99.8% 이상, 더 더욱 바람직하게는 99.9% 이상 상동한, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 분자는 인플루엔자 A 바이러스 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 엄격 조건 하에서 선택적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서, 엄격 조건 하는, (1) 낮은 이온 세기 및 고온에서의 세정, 예컨대 0.015 M NaCl/0.0015 M 소듐 사이트레이트/0.1% NaDodSO4, 50 ℃를 사용하는 조건; (2) 혼성화 과정 중에 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 예컨대 50% (vol/vol) 포름아미드와 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50 mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 6.5 와 750 mM NaCl, 75 mM 소듐 사이트레이트, 42 ℃; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 사이트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5 x 덴하트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리한 연어 정자 DNA(50 g/ml), 0.1% SDS 및 0.2 x SSC와 0.1% SDS 중의 10% 덱스트란 설페이트, 42 ℃ 조건이다.
본 발명의 핵산 분자는, 자연적으로 형성되는 분자에 비해, 뉴클레오티드 잔기의 결손, 삽입 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 가진, 영역(예, 천연적으로 형성되는 프로모터)을 가질 수 있다. 돌연변이는 자연적으로 형성되거나(즉, 천연 소스로부터 분리됨) 또는 합성(예, 전술한 바와 같이 핵산에 부위-특이적 돌연변이 유발) 돌연변이일 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 형성되거나 또는 재조합될 수 있다.
통상, 핵산의 단량체들은 포스포다이에스테르 결합이나 이와 유사한 형태로 연결되어, 비교적 짧은 단량체 유닛들, 예컨대 12-18에서부터 수백개의 단량체 유닛들의 길이의 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 포스포다이에스테르 결합으로는, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포르아미데이트가 있다.
핵산 구조체
본원에서, "핵산 구조체"는 본원에서 정의된 이중 가닥 RNA 분자를 코딩하는 모든 핵산 분자를 의미하며, 벡터내 핵산 분자, 세포내에 염색체내 핵산 분자로서 존재하는 경우의 핵산 분자, 그리고 게놈에 삽입된 핵산 분자를 포함한다. 전형적으로, 핵산 구조체는 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA, 또는 이의 조합일 것이다. 나아가, 핵산 구조체는 전형적으로 이중 가닥 RNA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함할 것이다. 핵산 구조체는, 이중 가닥 RNA 분자의 제1 단일 가닥을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있으며, 상보적인(제2) 가닥은 상이하거나 또는 바람직하게는 동일한 핵산 구조체에 의한 제2 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 핵산 구조체는 원형 분자이거나 선형 단편일 수 있으며, 복제할 수 있거나 할 수 없다. 당업자는, 본 발명의 핵산 구조체가 적정 벡터내에 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 핵산 구조체의 수여체로의 형질감염 또는 형질전환은, 세포가 핵산 구조체에 의해 코딩된 RNA 분자를 발현할 수 있게 한다.
본 발명의 핵산 구조체는 동일하거나 및/또는 복수개의 상이한 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA 등의 한가지 이상(예, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)을 복수의 카피수로 발현할 수 있다. 서로 상이한 이중 가닥 서열에 의해 표적되는 서열이 동일하거나 상이한 유전자내 서열이거나, 또는 2개의 상이한 유전자내 서열인지와는 무관하게, 서로 "동일한" 것으로 간주되는 RNA 분자는 동일한 이중 가닥 서열만을 포함하는 것이며, 서로 "상이한" 것으로 간주되는 RNA 분자는 상이한 이중 가닥 서열을 포함할 것이다.
또한, 핵산 구조체는 추가적인 유전자 인자를 포함할 수 있다. 구조체에 포함될 수 있는 상기 인자의 유형은 어떠한 방식으로도 한정되지 않으며, 당업자가 선택할 수 있다. 일부 예들에서, 핵산 구조체는 트랜스유전자로서 숙주 세포내에 삽입된다. 이러한 예로, 트랜스유전자 삽입 프로세스로부터 RNA 분자를 코딩하는 서열을 보호하여 외부 전사 진행(external transcription read through) 위험성을 줄이게 되어 있는 구조체에 "스투퍼(stuffer)" 단편이 포함되는 것이 바람직할 수 있다. 스투퍼 단편은 또한 예컨대 프로모터와 코딩 서열 및/또는 말단 성분 간의 거리를 확장시키 위해 구조체에 포함될 수 있다. 스투퍼 단편은 5 - 5000 이상의 뉴클레오티드 길이 중 임의 길이일 수 있다. 프로모터들 사이에 하나 이상의 스투퍼 단편이 있을 수 있다. 다수개의 스투퍼 단편이 있는 경우에, 이것은 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. 스투퍼 DNA 단편은 바람직하게는 상이한 서열이다. 바람직하게는, 스투퍼 서열은 이것이 삽입되어진 세포 내부에서 발현되는 서열과 동일한 서열 또는 이의 후대를 포함한다. 다른 예로, 핵산 구조체는 이중 가닥 RNA(들)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(들) 측면에 있는 스투퍼 영역들을 포함한다. 다른 예로, 핵산 구조체는 이동가능 요소, 예컨대 이중 가닥 RNA(들)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 측면에 있는 말단 역위 반복 서열이 특징인 트랜스포존을 포함할 수 있다. 적합한 트랜스포존의 예로는 Tol2, mini-Tol, Sleeping Beauty, Mariner 및 Galluhop가 있다.
핵산 구조체에 포함될 수 있는 추가적인 유전자 인자의 다른 예로는, GFP 또는 RFP와 같은 형광 마커 단백질에 대한 하나 이상의 유전자 등의 리포터 유전자; 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 또는 분비형의 배아 알카린 포스파타제 등의 분석이 용이한 효소; 또는 호르몬이나 사이토카인과 같이 면역분석에 쉽게 이용할 수 있는 단백질이 있다. 본 발명의 구현에에서 사용할 수 있는 다른 유전자 인자들로는, 아데노신 데아미나제, 아미노글리코딕 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 또는 약물 내성과 같이, 세포에 선택적인 증식 이점을 부여하는 단백질 코딩 물질이 있다.
핵산 구조체가 동물에 형질감염되는 경우, 프로모터와 임의의 추가적인 유전자 인자들은 동물의 게놈에서 자연적으로 형성되는 뉴클레오티드 서열들로 구성되는 것이 바람직하다. RNA 분자를 코딩하는 서열은 인플루엔자 A 바이러스 서열로 구성되는 것이 또한 바람직하다.
프로모터
본원에서, "프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 직접 전사시킬 수 있는 핵산 서열로서, 그 예로는 RNA 중합효소 II와 RNA 중합효소 III 프로모터가 있다. 또한, 세포 타입-특이적인, 조직-특이적인 또는 시기-특이적인 방식으로 프로모터-의존적인 유전자 발현의 조절가능성을 부여하는데 충분하거나 또는 외부 물질 또는 신호에 의해 유도가능한 이들의 전사 조절 인자들(예, 인핸서)도 이러한 정의에 포함된다.
프로모터를 포함하는 핵산 구조체가 숙주 세포에 형질감염될 때, 프로모터는 천연적으로 동물의 게놈에서 형성되는 것이 바람직하다. 예로, 형질전환 동물이 닭인 경우, 프로모터는 바람직하게는 닭의 프로모터이고; 형질전환 동물이 칠면조인 경우, 프로모터는 칠면조 프로모터가 바람직하며; 형질전환 동물이 오리인 경우, 프로모터는 바람직하게는 오리 프로모터이다.
본원에서 "작동가능하게 연결된"은 2가지 이상의 핵산(예, DNA) 세그먼트들 간의 기능적인 관계를 의미한다. 전형적으로, 이는 전사 조절 인자의 전사되는 서열과의 기능적 관계를 의미한다. 예로, 프로모터가 적정 세포에서 코딩 서열의 전사를 자극 또는 조정한다면, 프로모터는 본원에 정의된 이중 가닥 RNA 분자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임과 같은 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 인자들은 물리적으로 전사된 서열에 인접되어 있으며, 즉, 이는 cis-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 인자들, 예컨대 인핸서는 이것이 전사를 강화시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접되거나 또는 근접하게 위치될 필요는 없다.
"RNA 중합효소 III 프로모터" 또는 "RNA pol III 중합효소" 또는 "중합효소 III 프로모터" 또는 "pol III 프로모터"는 이의 본래의 의미로는, 세포에서 RNA 중합효소 III와 조합되거나 상호작용하여 이것과 작동가능하게 연결된 유전자 또는 이의 임의 천연 또는 조작된 변형체를 전사시키며, 선택된 숙주 세포에서 RNA 중합효소 III와 상호작용하여 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 전사시키게 될, 임의의 척추동물, 무척추동물 또는 포유류, 예컨대 닭, 인간, 설치류, 돼지, 소, 영장류, 유인원 등의 프로모터를 의미한다. U6 프로모터(예, 닭 U6, 인간 U6, 설치류 U6), H1 프로모터 또는 7SK 프로모터는 RNA 중합효소 III와 상호작용하여 이의 동족(cognate) RNA 산물, 즉 U6 RNA, Hl RNA, 또는 7SK RNA 각각을 전사하기 위한, 모든 무척추, 척추, 또는 포유류의 프로모터나 천연적으로 발견되는 다형성 변형체나 돌연변이를 의미한다. 적합한 프로모터의 예로는 cU6-1 (서열번호 22), cU6-3 (서열번호 23), cU6-4 (서열번호 24) 및 c7SK (서열번호 25)가 있다. 일부 예에서, 5' 측면 영역에 존재하는 U6, H1 및 7SK 등의 타입 III RNA pol III 프로모터가 바람직하며, TATA 박스를 포함하며 내부 프로모터 서열(internal promoter sequence)이 없는 것이 바람직하다. 내부 프로모터는 pol III 5S rRNA, tRNA 또는 VA RNA 유전자들에서 있다. 7SK RNA pol III 유전자에는 약한 내부 프로모터와 전사에 필요한 유전자의 5' 측면 영역내 서열이 포함되어 있다. 특정 용도, 예컨대 조류 또는 인간 바이러스에 대한 헤어핀 RNA와 같은 이중 가닥 RNA 분자를 발현시키기 위해, 핵산 구조체에 이용되는 pol III 프로모터는, 숙주 세포 RNA 중합효소에 의한 최적 결합 및 전사를 고려하여 선택하는 것이 좋을 수 있으며, 예컨대 조류 숙주 세포에서 조류 인플루엔자 바이러스(H5N1)와 같은 조류 바이러스에 대한 복수개의 헤어핀 dsRNA를 전사하도록 설계된 발현 구조체내의 조류 pol III 프로모터 등이 있다.
"상이한" 중합효소 프로모터는 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III 프로모터, 이의 다형성 및 돌연변이와 같은 변형체와 같은 임의의 2개의 RNA 중합효소 프로모터를 의미하며, 이들은 특정 종에서 상이한 동종 전사체, 예컨대 3개의 "상이한" 중합효소 프로모터들로 간주되는 인간 7SK 프로모터, 인간 U6 프로모터 및 인간 H1 프로모터의 전사를 수행할 것이다. 또한, "상이한" 중합효소 프로모터들은 예컨대 cU6-1, cU6-2, cU6-3 및 cU6-4 프로모터들이 "상이한" 프로모터들로 간주되는 닭의 U6 패밀리 프로모터와 같이, 패밀리 프로모터의 각각의 구성원을 의미한다. 본 발명의 구조체에서 상이한 중합효소 프로모터의 사용은 재정렬 또는 결손과 같은 분자내 및/또는 분자간 재조합 발생 가능성을 낮출 것이다.
일부 측면에서, 복수 카피수의 "동일한 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III 프로모터는 본 발명의 핵산 구조체에 포함될 수 있다. 일부 예들에서, 본 발명의 핵산 구조체는 복수 카피수의 동일한 프로모터를 포함할 수 있으며, "상이한" 중합효소 프로모터는 없으며; 예컨대 3, 4, 5 또는 그 이상의 U6 프로모터 각각은 shRNA와 같은 RNA 분자를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다. 선택적으로, 일부 예들에서, 2개 이상의 중합효소 프로모터 이외에도 다른 프로모터들을, 예컨대 하나 이상의 중합효소 I 프로모터들, 하나 이상의 미토콘드리아 프로모터 등을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 복수의 중합효소 프로모터들(2, 3, 4, 5 또는 그 이상)을 포함하는 발현 구조체를, 복수의 dsRNA 헤어핀 또는 shRNA들을 발현하도록 조작되며, 이러한 경우, "상이한" RNA 중합효소 프로모터가 포함되었는지와는 관계없이, 동일한 중합효소 프로모터 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 카피로 사용할 수도 있다.
일부 예들에서, 또한, 핵산 구조체는 조직-특이적인 프로모터나 세포-특이적인 프로모터를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 프로모터에 적용되는 경우 "조직 특이적"이라는 용어는 상이한 타입의 조직(예, 뇌)에서는 동일한 대상 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없으면서 특이적인 조직 타입(예, 폐)에 대해서는 대상 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다. 이러한 조직 특이적인 프로모터로는, Ick, 미오게닌 또는 thy1과 같은 프로모터들이 있다. 프로모터에 적용되는 경우 "세포 특이적"이라는 용어는 동일한 조직내의 상이한 타입의 세포에서는 동일한 대상 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없으면서 특이적인 타입의 세포에서의 대상 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다(예, Higashibata, et al. (2004); Hoggatt, et al. (2002); Sohal, et al, (2001); and Zhang, et al., (2004)). 또한, 프로모터에 적용되는 경우 용어 "세포 특이적"은 단일 조직내 한 영역에서 대상 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터를 의미한다. 다른 예로, 프로모터는 구성적(constitutive)이거나 또는 조절가능할 수 있다. 또한, 프로모터는 여러가지 특이성을 지니도록 변형될 수 있다.
핵산의 증폭
"중합효소 연쇄 반응"("PCR")은 "상류" 및 "하류" 프라이머로 구성된 "프라이머 쌍" 또는 "프라이머 세트"와, DNA 중합효소와 같은 중합 촉매제, 및 전형적으로 열-안정적인 중합효소를 이용하여 타겟 폴리뉴클레오티드의 복제 카피를 만드는 반응이다. PCR 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로, "PCR" (Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)에 기술되어 있다. PCR은 생물학적 샘플로부터 분리한 역전사 mRNA로부터 수득되는 cNDA 상에 수행할 수 있다.
프라이머는 흔히 약 20개의 뉴클레오티드 길이이며 최소 약 15개 뉴클레오티드 길이로 구성된 올리고뉴클레오티드로서, PCR 반응 중에 타겟 서열에 서열 특이적인 양상으로 혼성화하여 연장될 수 있다. 좀더 긴 핵산 분자, 예컨대 적어도 50 내지 100개 이상의 뉴클레오티드 길이의 핵산 분자를 프라이머로 사용할 수 있다. 앰플리콘, PCR 산물, PCR 단편 또는 증폭 산물은 타겟 서열의 신생 합성 카피와 프라이머를 포함하는 연장 산물이다. 다중 PCR 시스템에는 2개 이상의 앰플리콘이 동시적으로 제조되게 하는 복수의 프라이머 세트가 포함된다. 프라이머는 타겟 서열에 완벽하게 들어맞을 수 있거나, 또는 특이적인 타겟 서열에 제한 효소나 촉매성 핵산 인지/절단 부위를 도입시킬 수 있는 내부 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 앰플리콘의 포획 또는 검출을 용이하게 하기 위해 추가적인 서열 및/또는 변형되거나 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
DNA, 프라이머의 이에 상보적인 서열에 어닐링, 그리고 중합효소를 이용한 어닐링된 프라이머의 연장은 타겟 서열이 지수적으로 증폭되게 한다. 용어 타겟, 타겟 서열 또는 주형은 증폭되는 핵산 서열을 의미한다. 다른 핵산 증폭 기법으로는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 있다. 우선, 상보적인 DNA(cDNA)를 역전사효소로 RNA 주형으로부터 만든 다음 수득되는 cDNA를 대상으로 PCR을 수행한다.
다른 증폭 방법으로는 EP 0 320 308에 기술된 리가제 연쇄 반응("LCR")이 있다. LCR에서, 2개의 상보적인 프로브 쌍들을 제조하고, 타겟 서열의 존재 중에 각각의 쌍은 접촉하도록 타겟의 맞은편 상보적인 가닥에 결합할 것이다. 리가제의 존재 시, 2종의 프로브 쌍들은 단일 유닛을 형성하도록 연결될 것이다. PCR에서와 같이 열 순환에 의해, 결합된 연결 유닛들이 타겟으로부터 해리되어 과잉의 프로브 쌍들의 연결을 위한 "타겟 서열"로서 제공된다. 미국 특허 4,883,750에는 타겟 서열에 프로브 쌍을 결합시키기 위한 LCR과 유사한 방법이 기술되어 있다.
그외 핵산 분자의 증폭 방법들도 당업자들에게 공지되어 있으며, 등온 증폭 방법과 전사를 기초로한 증폭 시스템이 있다. 핵산 구조체, 이의 단편, 또는 분리된 또는 외인성 핵산 분자나 이의 단편을 증폭시키는 임의의 적합한 방법을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
일부 예들에서, 본 발명의 핵산 구조체 및/또는 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 벡터는 예컨대 플라스미드, 바이러스 또는 예컨대 박테리오파지, 아데노바이러스, 아데노-조합 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스로부터 유래된 인공 염색체일 수 있다. 이러한 벡터들로는 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래 벡터, 예컨대 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 인자 및 바이러스로부터 유래된 벡터, 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 플라스미드와 박테리오파지의 유전자 인자들로부터 유래된 벡터, 코스미드 및 파지미드가 있다. 따라서, 벡터의 일 예는 이중 가닥의 DNA 파지 벡터이다. 다른 예시적인 벡터로는 이중 가닥의 DNA 바이러스 벡터가 있다.
핵산 구조체가 삽입되는 벡터는 또한 이동가능한 인자, 예컨대 이중 가닥 RNA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 측면에 있는 말단 역위 반복 서열이 특징인 트랜스포존을 포함할 수 있다. 적합한 프랜스포존의 예로는 Tol2, Mini-Tol2, Sleeping Beauty, Mariner 및 Galluhop가 있다. 본원에서 Tol2 트랜스포존은 Mini-Tol2와 같은 Tol2로부터 유래된 트랜스포존이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조체, 핵산 분자 및/또는 벡터가 도입되어진 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 숙주 세포는 예컨대 dsRNA 분자를 생산 또는 발현하기 위한 생산 시스템으로서 이용할 수 있다. 시험관내 생산을 위해, 진핵 세포나 원핵 세포를 사용할 수 있다.
유용한 원핵 숙주 세포는 동물, 식물 또는 진균 세포일 수 있다. 동물 세포로서, CHO, COS, 3T3, DFl, CEF, MDCK 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, 또는 Vero 세포와 같은 포유류 세포, 제노푸스 난모세포와 같은 양서류 세포, 또는 Sf9, Sf21 또는 Tn5 세포와 같은 곤충 세포를 사용할 수 있다. DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포(dhfr-CHO) 또는 CHO K-1도 사용할 수 있다. 벡터는, 예컨대 칼슘 포스페이트 방법, DEAE-덱스트란 방법, 양이온성 리포좀 DOTAP(Boehringer Mannheim) 방법, 전기천공, 리포펙션 등에 의해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.
유용한 원핵 세포로는 E. coli와 같은 박테리아 세포, 예컨대 JM109, DH5a, 및H BlOl, 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)가 있다.
동물 세포에 대해 DMEM, MEM, RPMl 1640 또는 IMDM와 같은 배양 배지를 사용할 수 있다. 배양 배지는 소 태아 혈청(FCS)와 같은 혈청 보충물을 첨가하거나 첨가하지 않고 사용할 수 있다. 배양 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 8이다. 세포는 전형적으로 약 15 내지 200시간 동안 약 30 ℃ 내지 40 ℃에서 배양하며, 배양 배지는 교체하거나, 공기를 공급하거나 또는 필요에 따라서는 교반할 수 있다.
비-인간 형질전환 동물
"비-인간 형질전환 동물"은 동일한 종이나 품종의 야생형 동물에서 발견되지 않는 핵산 구조체("트랜스유전자")를 포함하는, 비-인간 동물이다. 본원에서 언급되는 "트랜스유전자"는 생물공학 분야에서 일반적인 의미를 가지며, 재조합 DNA 또는 RNA 기법에 의해 생산 또는 변형되었으며, 동물, 바람직하게는 조류 세포에 도입되어진, 유전자 서열이다. 트랜스유전자는 동물 세포 유래의 유전자 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 트랜스유전자는 예컨대 형질전환에 의해 서와 같이 인간 조작에 의해 동물에 도입되어졌지만, 당업자에게 공지된 모든 방법을 사용할 수 있다. 트랜스유전자는 염색체에 도입된 유전자 서열 뿐만 아니라 염색체 외의 서열도 포함한다.
형질전환 동물의 제조 기법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법에 대해 유용한 일반 교재는 Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)이다.
이종의 DNA를 예컨대 수정란에 도입할 수 있다. 예를 들면, 전능성 또는 다능성 줄기 세포를, 미세주입, 칼슘 포스페이트 매개 침강, 리포좀 융합, 레트로바이러스 감염 또는 그외 수단에 의해 형질전환시킬 수 있으며, 그런 후, 형질전환된 세포를 배아에 도입하고 배아는 형질전환 동물이 된다. 일 예로, 발생중인 배아에 원하는 DNA를 포함하는 레트로바이러스를 감염시키고, 감염된 배아로부터 형질전환 동물을 만든다. 그러나, 다른 예로, 적합한 DNA들을 바람직하게는 단일 세포 단계에서 배아의 전핵 또는 세포질에 함께 주입하고, 배아를 성숙형 형질전환 동물로 발생되게 한다.
형질전환 동물을 제조하는데 사용하는 다른 방법은 표준 방법에 의해 전핵 단계의 난에 핵산을 미세주입하는 것을 포함한다. 주입된 난은 가임신 상태의 수여체의 난관에 이동시키기 전에 배양한다.
또한, 형질전환 동물은 핵 전이 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 공여 동물 유래 섬유모세포를 조절 서열의 통제 하에 결합 도메인이나 대상의 결합 파트너에 대한 코딩 서열이 도입된 플라스미드로 안정적으로 형질감염시킨다. 그런 후, 안정적인 형질감염체를 탈핵한 난모세포와 융합시키고, 배양한 다음 암컷 수여체에 이식한다.
형질전환 동물을 제조하기 위해 사용할 수 있는 다른 방법으로는 정자-매개 유전자 전이(SMGT)가 있다. 이 방법은 Lavitrano et al. (1989)에 의해 최초로 개시되었다.
형질전환 동물을 제조하기 위한 다른 방법은, 링커를 이용한 정자-매개 유전자 전이 기법(LB-SMGT)이다. 이 방법은 미국 특허 7,067,308에 기술되어 있다. 간략하게는, 신선하게 수득한 정액을 헹구고, 설치류 단일클론 항체 mAbC(ATCC 수탁번호 PTA-6723로 기탁된 하이브리도마에서 분비됨)와 인큐베이션한 다음, 구조체 DNA와 인큐베이션한다. 단일클론 항체는 DNA가 정액에 결합하는 것을 돕는다. 그런 후, 정자/DNA 복합체는 인위적으로 암컷에 임신시킨다.
복제-결함성 레트로바이러스를 갓 낳은 난의 닭 배반엽의 배하강에 주입하여, 생식계 형질전환 닭을 제조할 수 있다(미국 특허 5,162,215; Bosselman et al., 1989; Thoraval et al., 1995). 외래 유전자를 가지고 있는 레트로바이러스 핵산을 무작위로 배아 세포의 염색체에 삽입하여, 생식계에 트랜스유전자가 일부 있는 형질전환 동물을 발생시킨다. 삽입 부위에 위치 효과를 해소시키기 위한 융합된 유전자 구조체의 5' 또는 3' 영역에 삽입된 인슐레이터 인자들의 사용이 개시되어 있다(Chim et al., 1993).
생식계 형질전환 동물을 제조하는 다른 방법은, 트랜스포존, 예컨대 TOl2 트래스포존을 이용하여 본 발명의 핵산 구조체를 동물의 게놈에 삽입하는 방법이다. Tol2 트랜스포존은 메다카물고기인 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes)로부터 최초로 분리되었으며, 트랜스포존 hAT 패밀리에 속하는 것으로서, Koga et al. (1996) 및 Kawakami et al. (2000)에 기술되어 있다. Mini-Tol2은 Tol2의 변이체로서, Balciunas et al. (2006)에 기술되어 있다. Tol2 및 Mini-Tol2 트랜스포존은, Tol2 트랜스포자제와 함께 작용하였을 때 유기체의 게놈으로 트랜스유전자의 삽입을 촉진시킨다. Tol2 트랜스포자제를 분리된 비-복제성 플라스미드 상에서 전달함으로써, Tol12 또는 Mini-Tol2 트랜스포존과 트랜스유전자만 게놈에 삽입되고, Tol2 트랜스포자제를 포함하는 플라스미드는 한정된 횟수의 세포 분열 동안에 없어진다. 따라서, 삽입된 Tol2 또는 Mini-Tol2 트랜스포존은 더 이상 후속적인 전이를 할 수 없게 될 것이다. 부가적으로, Tol2는 자연적으로 형성되는 조류 트랜스포존이라는 것은 알려져 있지 않기 때문에, 조류 세포, 예컨대 닭 세포에서 추가적인 전이를 초래할 수 있는 내인성 트랜스포자제 활성은 없다.
그외 적합한 트랜스포존 시스템을 본 발명의 방법들에 사용할 수 있다. 예로, 트랜스포존 시스템은 Sleeping Beauty, Frog Prince 또는 Mos1 트랜스포존 시스템일 수 있으며, 또는 tc1/mariner 또는 트랜스포존 hAT 패밀레에 속하는 모든 트랜스포존을 사용할 수 있다.
조류 배아 줄기 세포를 수여 배아로 주입하여 키메라 조류를 생산하는 것은 US 7,145,057에 기술되어 있다. 제조되는 키메라를 교배하여 게놈에 외인성 DNA가 있는 형질전환 조류를 만든다. 조류의 원시 생식 세포(PGC)를 장기간 배양하여 형질전환 닭을 만드는 방법은 미국 특허 출원 20060206952에 기술되어 있다. 공지된 방법으로 숙주 조류 배아와 조합하는 경우, 상기한 변형된 PGC는 생식세포를 통해 전달되어 형질전환 자손이 만들어진다.
임의의 적정 바이러스를 기반으로한 바이러스 전달 시스템을 사용하여 본 발명의 핵산 구조체를 세포에 전달할 수 있다. 또한, 하이브리드 바이러스 시스템을 이용할 수 있다. 바이러스 전달 시스템의 선택은, 대상 세포, 조직 또는 장기로의 전달 효율, 시스템의 형질전이 효율, 병원성, 면역성, 독성 등과 같은 다양한 변수에 따라 결정될 것이다. 모든 이용에 적합한 하나의 바이러스 시스템이 없다는 것은 분명하다. 본 발명에 이용하기 위한 바이러스 시스템을 선정하는 경우, 핵산 구조체-함유성 바이러스 입자가, 바람직하게는, 1) 재생산가능하고 안정적으로 증식되며; 2) 고역가로 정제할 수 있으며; 및 3) 타겟화된 전달(광범위하게 유포되지 않으면서, 핵산 발현 구조체를 대상 세포, 조직 또는 장기에 전달)할 수 있는, 시스템을 선정하는 것이 중요하다.
조성물 및 투여
바람직한 예에서, 본 발명의 조성물은 적정 담체를 포함하는 약학 조성물이다. 적합한 약학 담체, 부형제 및/또는 희석제로는, 락토스, 슈크로스, 전분 분말, 탈크 분말, 알코노익산의 셀룰로스 에스테르, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 산화물, 셀룰로스 결정, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 젤라틴, 글리세린, 소듐 알기네이트, 항세균제, 항진균제, 아라비아 검, 아카시아 검, 인산과 황산의 소듐 및 칼슘염들, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 폴리비닐 알코올, 염수 및 물이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 예들에서, 본 발명의 핵산 구조체(들) 및/또는 핵산 분자는 US 4,897,355; US 5,264,618; 또는 US 5,459,127에 기재된 조성물과 같은 하나 이상의 양이온성 지질 또는 양이온성 양쪽 친매성 물질과 복합체를 형성한다. 다른 예로, 이것은 양이온성 지질을 포함하며 선택적으로 중성 지질과 같은 다른 성분을 포함하는, 리포좀/리포좀 조성물과 복합체를 형성한다(예, US 5,279,833; US 5,283,185; 및 US 5,932,241). 다른 예로, 이것은 US 5,837,533; 6,127,170; 및 6,379,965의 다중 기능성의 분자 복합체, 또는 바람직하게는 WO 03/093449의 다중 기능성 분자 복합체 또는 오일/물 양이온성 양친매성 에멀젼과 복합체를 형성한다. WO 03/093449에는 핵산, 콜레스테롤 또는 지방산을 포함하는 엔도좀 분해성 스퍼민(endosomolytic spermine), 및 세포 표면 분자에 대한 리간드를 포함하는 타겟팅 스퍼민을 포함하는 조성물을 나타내고 있다. 조성물의 음전하에 대한 양전하의 비는 포괄적으로 0.1 내지 2.0, 바람직하게는 0.5 내지 1.5이며, 엔도솜 분해성 스퍼민은 조성물내에 스퍼민-함유 분자를 20% 이상 포함하며, 타겟팅 스퍼민은 조성물내에 스퍼민-함유성 분자를 10% 이상 포함한다. 바람직하게는, 음전하에 대한 양전하 비는 포괄적으로 0.8 내지 1.2, 예컨대 0.8 내지 0.9이다.
핵산 구조체, 핵산 분자 및/또는 조성물의 투여는 조류 난에 주입함으로써 쉽게 달성할 수 있으며, 일반적으로 기낭(air sac)에 주사한다. 기낭은 난내 투여의 가장 바람직한 경로이지만, 요낭과 같은 다른 영역이나 난막 요막액(chorion allantoic fluid)에도 주입에 의해 주입할 수 있다. 반드시 상업적으로 허용불가능한 수준은 아니지만은, 기낭이 투여의 타겟이 아닌 경우에는 부화율이 약간 감소할 수 있다. 바늘이 난이나 조직 및 발생중인 배아의 장기나 배아를 둘러싼 배체외막(extra-embryonic membrane)에 과도한 손상을 야기하지 않는 것이 바람직하지만, 본 발명의 실시에 주입 메카니즘이 결정적인 것은 아니다.
일반적으로, 약 22 게이지의 바늘이 장착된 피하 주사기가 조류에서의 난내 투입에 적합하다. 본 발명의 방법은 US 4,903,635, US 5,056,464, US 5,136,979 및US 20060075973에 언급된 시스템과 같은 자동 주입 시스템과 함께 이용하기에 특히 잘 맞다.
다른 예로, 본 발명의 핵산 구조체, 핵산 분자 및/또는 조성물은 에어로졸 또는 스프레이 건조 제형의 흡입에 의해서와 같이 폐 전달을 통해 투여된다. 예컨대, 에어로졸을 흡입기나 분무기(nebulizer)(예, 미국 4,501,729)에 의해 투여하여, 핵산 분자를 해당 폐 조직에 신속하게 국소 유입시킬 수 있다. 미분화된 핵산 조성물의 흡입성 건조 입자를 포함하는 고형 미립자 조성물을, 건조되거나 또는 동결건조된 핵산 조성물을 분쇄한 다음 예컨대 400 메쉬 체를 통해 미분화된 조성물을 통과시켜, 큰 덩어리를 분쇄하거나 분리함으로써, 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산 조성물을 포함하는 고형 미립자 조성물은 선택적으로 에어로졸의 형성을 용이하게 하기 위해 제공하는 분산제 뿐만 아니라 다른 치료 화합물을 포함할 수 있다. 적합한 분산제로는 락토스가 있으며, 이는 1:1 중량비와 같이 임의의 적합한 비율로 핵산 화합물과 혼합할 수 있다. 분무기는, 협소한 벤트리 구멍을 통한 압축 가스, 전형적으로 공기 또는 산소의 가속화(acceleration)나 또는 초음파 교반(ultrasonic agitation) 중 어느 한가지 방법으로, 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 치료 에어로졸 미스트로 변환시키는 상업적으로 구입가능한 장치이다. 분무기에 사용하기에 적합한 제형은 활성 성분을 액체 담체내로 제형의 최대 40% w/w, 바람직하게는 20 %w/w 미만의 함량으로 포함한다. 담체는 전형적으로 물 또는 수계 희석 알코올 용액이며, 바람직하게는, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 다른 적합한 염의 첨가에 의해 생체 유액과 등장성으로 만든 용액이다. 선택적인 첨가제로는, 제형이 멸균으로 제조되지 않는 경우에는 보존제, 예컨대 메틸 하이드록시벤조에이트, 항산화제, 조미료, 휘발성 오일, 완충제, 유화제 및 그외 제형 계면활성제를 포함한다. 활성 조성물과 계면활성제를 포함하는 고형 입자 에어로졸은 마찬가지로 임의의 고형 미립자 에어로졸 제조기로 만들 수 있다. 개체에 고형 미립자 치료제를 투여하기 위한 에어로졸 제조기는 전술한 바와 같이 흡입가능한 입자를 만들며, 인간 투여에 적합한 속도로 치료 조성물의 미리 결정된 정량 용량을 포함하는 부피의 에어로졸을 만들어낸다.
또한, 본 발명의 핵산 구조체, 핵산 분자 및/또는 조성물을 동물 사료나 음용수에 첨가할 수 있다. 동물이 식이와 함께 치료학적으로 적정한 정량을 섭취할 수 있도록 사료 및 음용수 조성물을 제형화하는 것이 편리할 수 있다. 또한, 사료 또는 음용수에 첨가하기 위한 프리믹스로서 조성물로 제시하는 것이 편리할 수 있다.
도 1. shRNA 발현 카세트의 PCR. shRNA 발현 벡터를 제조하기 위해 사용한 PCR 전략의 도시한 것이다. PCR에는 모든 shRNA 구성 성분들을 포함하는, 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 최종 PCR 산물 모두 닭의 U6 또는 7SK 프로모터, shRNA 센스, 루프, shRNA 안티센스, 종결 서열 및 XhoI 부위로 구성되어 있다.
도 2. MWH-I 트랜스유전자의 구축. A, 개별 전사 유닛들을 한단계 PCR 방법을 제조하였다. PCR 산물에는 닭의 pol III 프로모터와 shRNA 구성 성분들(센스, 루프, 안티센스 및 종결 서열)이 포함되어 있다. B, 3가지 전사 유닛들을 PCR 산물의 5' 및 3' 말단 상의 양립하는 SalI 및 XhoI 부위를 이용하여 함께 연결하였다. C, 최종 트랜스유전자에는 3개의 개별 shRNA를 발현하여 선택한 인플루엔자 A 바이러스 유전자를 표적으로 하는, 3종의 전사 유닛들이 포함되어 있다.
도 3. pStuffit의 플라스미드 맵(6151 bp). 닭 게놈의 4가지 클론닝한 영역들을 표지하여 맵에 표시하였다. 클로닝 제한 부위와 그외 도입된 관련 제한 부위도 표시되어 있다. MWH 트랜스유전자는 ME1 200과 GRM5 200 사이에 위치한 고유 EcoRI 부위에 삽입된다. pIC20H의 HindIII 효소 부위를 이용하여, stuffer/buffer 측면 서열을 포함하는 전체 MWH 트랜스유전자를 닭 게놈에 삽입하기 위한 단일 단편으로서 적출할 수 있다.
도 4. 형질전환 마우스의 인플루엔자 기회 감염(challenge). A, shNP-1496을 발현하는 마우스 대비 shEGFP를 발현하는 마우스의 중량 변화%. B, shNP-1496을 발현하는 마우스 대비 shEGFP를 발현하는 마우스의 상대적인 바이러스 유전자 발현
서열목록
서열번호 1 - 인플루엔자 A PB2 유전자의 컨센서스(consensus) 뉴클레오티드 서열
서열번호 2 - 인플루엔자 A PB1 유전자의 컨센서스 뉴클레오티드 서열
서열번호 3 - 인플루엔자 A PA 유전자의 컨센서스 뉴클레오티드 서열
서열번호 4 - 인플루엔자 A NP 유전자의 컨센서스 뉴클레오티드 서열
서열번호 5 - 인플루엔자 A M1 유전자의 컨센서스 뉴클레오티드 서열
서열번호 6 내지 15 - 인플루엔자 A 유전자를 표적하는 핵산의 뉴클레오티드 서열 및/또는 이로부터 코딩되는 mRNA
서열번호 16 - MWH1 및 stuffer 서열의 뉴클레오티드 서열. 5' stuffer (뉴클레오티드 1-1748); cU6-3 shMP-592 (뉴클레오티드 1759-2234); cU6-1 shPA-2087 (뉴클레오티드 2235-2622); cU6-4 shNP-1496 (뉴클레오티드 2623-2974); 3' stuffer (뉴클레오티드 2985-4745).
서열번호 17 - MWH2 및 stuffer 서열의 뉴클레오티드 서열. 5' stuffer (뉴클레오티드 1-1748); cU6-4 shPBl-2257 (뉴클레오티드 1774-2125); cU6-1 shPB2-2240 (뉴클레오티드 2126-2513); c7SK shPBl-129 (뉴클레오티드 2514-2911); 3' stuffer (뉴클레오티드 2936-4696).
서열번호 18 - MWH3 및 stuffer 서열의 뉴클레오티드 서s. 5' stuffer (뉴클레오티드 1-1748); cU6-4 shNP-1484 (뉴클레오티드 1774-2129); cU6-1 shPA-2087 (뉴클레오티드 2130-2517); c7SK shPBl-2257 (뉴클레오티드 2518-2917); 3' stuffer (뉴클레오티드 2947-4702).
서열번호 19 - MWH1의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 20 - MWH2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 21 - MWH3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 22 - 닭 U6-1 프로모터(cU6-l)의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 23 - 닭 U6-3 프로모터(cU6-3)의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 24 - 닭 U6-4 프로모터(cU6-4)의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 25 - 닭 7SK 프로모터의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 26 내지 51 - 올리고뉴클레오티드 프라이머들
서열번호 52 내지 54 - 인플루엔자 A 유전자를 표적하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및/또는 이로부터 코딩되는 mRNA.
서열번호 55 내지 60 - 올리고뉴클레오티드 프라이며.
서열번호 61 - MWH4의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 62 - MWH3 및 Tol2 트랜스포존의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 63 - MWH4 및 Tol2 트랜스포존의 뉴클레오티드 서열.
실시예 1. 트랜스유전자 포함용 shRNA 서열의 선택
인플루엔자 A에서 가장 보존성이 높은 유전자 PB1, PB2, PA, NP 및 M1을 RNAi 타겟팅을 위해 선택하였다. 본 발명자들은, siVirus (web-based antiviral siRNA design software for highly divergent viral sequences, Naito et al., 2006)를 이용하여 선택한 유전자들에서 보존성이 높은 영역들을 규명하였고, 또한 shRNA 선택을 위해 스크리닝할 수 있는 siRNA 서열을 추측하였다. 소프트웨어로, shRNA 설계에 특히 대상이 되는 분석한 다수의 인플루엔자 A 게놈 세그먼트내 영역, 즉 PB1, PB2, PA 및 NP의 3' 영역을 강조 처리하였다. 보다 구체적으로는, 이들은, 세그먼트 1(PB2 유전자) 뉴클레오티드 2240-2341; 세그먼트 2(PB1 유전자) 뉴클레오티드 2257-2341 ; 세그먼트 3(PA 유전자) 뉴클레오티드 2087-2233 및; 세그먼트 5(NP 유전자) 뉴클레오티드 1484-1565이었다.
본 발명자들은 siVirus로부터 29개의 예상되는 siRNA 서열들을 선택하여, shRNA 선택을 위해 스크리닝하였다(표 1). 특이적인 타겟 유전자에 대한 가능성 있는 siRNA 서열을 선택하는데 이용할 수 있는 몇가지 알고리즘들이 있다. 그러나, 이들 예상한 많은 siRNA들은 발현된 shRNA로부터 처리되었을 때 효과적으로 기능하지 않는 것으로 확인되었다. Taxman et al. (2006)은, 특히, 효과적인 shRNA 분자를 예측하기 위한 알고리즘을 설계하였고, 본 발명자들은 shRNA 예측을 개선시키기 위해 알고리즘을 맞게 변형하였다. 본 발명자들은 변형된 Taxman 알고리즘을 29개의 선택한 siRNA에 적용하여, 인플루엔자 A 바이러스 복제의 특이적 저해에 있어서의 shRNA를 테스트하기 위한 서열을 선정하였다.
표 1. 알고리즘을 이용한 인플루엔자 A 유전자를 타겟팅하는 shRNA 서열의 선택
Taxman 알고리즘을 이용한 shRNA 선택에 4가지 기준이 있다. 기준 중 3가지는 최대 4점 미만으로 평가한다. 이 기준은, 1) 서열의 5' 말단에 C 또는 G = 1점, 5' 말단에 A 또는 T = -1점; 2) 3' 말단에 A 또는 T = 1점, 3' 말단에 C 또는 G = -1점; 3) 7개의 3' 염기에 A 또는 T 5개 이상 = 2점, 7개의 3' 염기에 A 또는 T 4개 이상 = 1점이다. 최고값의 shRNA 서열이 바람직하다. 4번째 기준은 19개의 뉴클레오티드 서열에 대한 shRNA 서열에서 가운데 6개 염기들(안티센스 가닥의 9- 14 염기에 혼성화하는 센스 가닥의 6-11 염기들)의 자유 에너지(free-energy) 계산을 기초로 한다. 중앙 듀플렉스(central duplex)가 ΔG > -12.9 kcal/mol인 shRNA가 바람직하다. 본 발명자들이 사용한 변형된 Taxman 알고리즘은 Freier et al. (1986)에 의해 공개된 바와 같이, RNA 이중 구조 안정성 예측을 위한 여러가지 자유 에너지 매개변수를 이용한다. 알고리즘을 기초로, 본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스 복제를 저해할 수 있는 능력을 테스트하는데 효과적일 수 있는 가능성이 있는 shRNA로 이용하기 위해, siVirus siRNA 서열들 중 13개를 선택하였다. 선택한 서열들은 표 1에 굵은 글씨로 강조하여 나타나 있으며, 이의 5' -> 3' 서열은 표 2에 나타나 있다. 이들 13가지의 서열을 사용하여, 10개의 shRNA의 발현을 위한 ddRNAi 플라스미드를 구축하였다.
표 2. 바이러스 저해 분석을 위해 선택한 shRNA 서열
실시예
2. 닭 프로모터 서열
트랜스유전자 구조체를 제작할 때, 프로모터 서열에 중합효소의 효과적인 부착을 실시하기 위한 상류 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다는 것은 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 닭의 U6 프로모터를 제작하고, shRNA의 전사를 도출하는데 필요한 프로모터 서열을 최소량으로 포함하도록 테스트하여, 트랜스유전자 구조체의 전체 크기를 줄일 수 있었다. 2가지 버전의 구조체들, pcU6~4 shNP-1496 및 pcU6-4 (+100) shNP-1496을, RNase 보호 분석을 통한 shRNA의 발현 또는 바이러스 침묵화에 대해 테스트하였다. 제1 플라스미드에는, shNP-1496 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는데 필요한 최소 닭 U6-4 서열이 포함되어 있다. 제2 플라스미드에는 cU6-4 프로모터의 상류 100 bp 여분 서열이 포함되어 있다. 상류 100 bp의 여분 서열이 포함되어 있는 제2 구조체는 보다 나은 shRNA 발현을 제공할 것으로 예상되었다.
표 3에 이들 2가지 플라스미드로부터 shRNA 발현에 의해 유도되는 바이러스 생산의 저해를 측정하기 위한 헴어글루틴화 분석(HA 분석) 결과를 자세하게 나타낸다. 본 분석을 수행하기 위해, MDCK 세포를 대수기로 배양한 다음 Amaxa Nucleofector를 이용하여 shRNA 플라스미드를 전기천공에 의해 전달하였다. 형질감염된 세포를 8시간 후에 저병원성의 H1N1 A/PR/8/34 (PR8) 인플루엔자 A 바이러스로, moi(multiplicity of infection) 범위로 감염시켰다. 바이러스 역가(HA 유닛)를 감염 후 48시간에 HA 분석을 수행하여 측정하였다. 분석은 V형 바닥의 96웰 플레이트에서 수행하였다. 바이러스 샘플의 연속 2배 희석물을 동일 부피의 닭 적혈구 0.5% (vol/vol) 현탁물과 혼합하여, 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 유착성의 동질적인 적혈구 층이 포함된 웰은 양성으로 표시하였다.
HA 분석 실험에서, 최소 프로모터 서열을 포함하고 있는 pcU6-4 shNP-1496이 테스트한 모든 MOI에서 여분의 상류 프로모터 서열과 mock 플라스미드가 포함된 pcU6-4 (+100) shNP-1496 보다 바이러스 침묵화에 더욱 효과적이었다.
표 3. 헴어글루틴화 분석의 결과(HA 분석)
MOI .001 | MOI .0001 | MOI .00001 | |
Mock 플라스미드 | 32 | 32 | 16 |
pcU6-4 (+100) shNP-1496 | 32 | 16 | 4 |
pcU6-4 shNP-1496 | 4 | 2 | 2 |
실시예
3. 선택한
shRNA
의 발현을 위한
ddRNAi
플라스미드의 구축
닭의 중합효소 III 프로모터들인 cU6-1(유전자은행 등재번호 DQ531567), cU6-3 (DQ531569), cU6-4 (DQ531570) 및 c7SK (EF488955)를 주형으로 사용하여, 1단계 PCR을 통해, 선택한 shRNA에 대한 ddRNAi 발현 플라스미드를 구축하였다(도 1). 플라스미드 구축을 위한 PCR에서는, cU6-1 프로모터에 대해서는 TD218 또는 TD275와 쌍을 이루는 프라이머 TD315를 사용하고; cU6-4 프로모터에 대해서는 TD216, TD274 또는 TD302와 쌍을 이루는 TD175를 사용하고; cU6-3 프로모터에 대해서는 TD217과 쌍을 이루는 TD176을 이용하고; c7SK 프로모터에 대해서는 TD307 또는 TD316과 쌍을 이루는 TD269를 이용하였다(증폭된 특이적인 shRNA의 프라이머 서열 및 내용에 대한 표 4 참조). 각 PCR에서 역방향 프라이머들은 각 프로모터 서열의 맨끝 20 nt, shRNA 센스, 루프, 및 shRNA 안티센스 서열을 포함하도록 제작하였고, HPLC로 정제하였다. 전장의, 증폭된 발현 카세트 산물을 pGEM-T Easy에 연결하고, 서열 분석하였다.
선택한 13개의 shRNA들 중에서, 7개의 서열에 대한 발현 플라스미드들을 성공적으로 구축하였다. 바이러스 저해 분석에 사용한 최종 shRNA 발현 플라스미드의 명칭은 pcU6-1-shPB2-2240, pcU6-1-shPA-2087, pucU6-3-shMP-592, pcU6-4-shNP- 1496, pcU6-4-shNP-1484, pc7SK-shPB1-129, pcU6-4-shPB 1-2257 및 pc7SK-shPB 1-2257이었다. cU6-1과 무관한 대조군 플라스미드도 구축하여, 바이러스 저해 분석에서 mock 비교용으로 이용하였다(하기 참조). 이러한 mock 플라스미드를 위해, 정방향 프라이머 TD135를 chU6-1 프로모터의 맨끝 20 nt와 그외 모든 관련없는 shRNA(shirr) 성분으로 구성된 역방향 TD155 프라이머와 쌍을 지었다. PCR 산물을 pGEM-T Easy에 연결하고, 서열 분석하였다.
각 ddRNAi 플라스미드를, 각 shRNA가 천연 U6 또는 7SK 전사체의 +1 위치에 있도록 구축하였다. XhoI 제한효소 부위를 pGEM-T Easy에 삽입되는 전장 shRNA 산물의 스크리닝을 가능하도록 하기 위해 종결 신호의 하류에 만들었다. 모든 최종 shRNA 발현 벡터들은 전장의 닭 U6 또는 7 SK 프로모터 중 어느 하나, shRNA 센스 서열, 루프, 서열, shRNA 안티센스 서열, 종결 서열 및 XhoI 부위로 구성된다. 모든 shRNA에 사용한 루프 서열은 5' UUCAAGAGA 3'이었다.
표 4. 사용한 프라이머의 서열과 설명
실시예
4. 선택된
shRNA
의 바이러스 저해 테스트
표 5는 shRNA 발현 플라스미드에 의해 유도된 바이러스 생산의 저해를 측정하기 위한 햄어글루틴화 분석(HA 분석) 실험의 결과를 요약한 것이다. 이러한 분석을 실시하기 위해, Mock 세포를 대수기로 배양한 다음, Amaxa Nucleofector™를 이용하여 shRNA 플라스미드를 전기천공으로 주입하였다. 형질전환된 세포에, 8시간 후, 인플루엔자 A 바이러스로 저병원성 균주 H1N1 A/PR/8/34 (PR8) 또는 고병원성 H5N1 A/chicken/Vietnam/008/2004 (H5N1) 중 어느 하나를 moi(multiplicity of infection) 범위로 감염시켰다. 바이러스 역가(HA 유닛)를 감염 후 48시간에 HA 분석을 수행하여 측정하였다. 분석은 V형 바닥의 96웰 플레이트에서 수행하였다. 바이러스 샘플의 연속 2배 희석물을 동일 부피의 닭 적혈구 0.5% (vol/vol) 현탁물과 혼합하여, 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 유착성의 동질적인 적혈구 층이 포함된 웰은 양성으로 표시하였다.
표 5에 요약 개시한 모든 HA 분석 실험에서, shPBl-2257, shNP-1484 및 shNP-1496을 발현하는 플라스미드들은 mock 플라스미드와 비교하여 PR8과 H5N1 바이러스의 생산을 모두 매우 효과적으로 저해할 수 있었다. shPB1-2257과 shNP-1484의 경우에, 이들은 다수의 실험들에서 양쪽 바이러스 모두를 완전하게 복제 저해할 수 있었는데, 이는 이의 효능을 입증하는 것이다. 또한, shPA-2087 및 shMP-592를 발현하는 플라스미드들도 바이러스의 생산을 효과적으로 저해할 수 있었지만 shPB1-2257, shNP-1484 및 shNP-1496 만큼 효과적이진 않았다. shPB1-129 분자는 저병원성의 PR8 균주의 생산을 저해하였지만, 고병원성의 H5N1 균주를 저해하진 못하였다. 마지막으로, shPB2-2240은 처음에 잠재적인 타겟 shRNA 서열로 동정되었지만, 테스트한 2가지 바이러스 어느 것에서도 복제를 저해할 수 없었다.
표 5. mdck 세포에서의 인플루엔자 바이러스 제조에 대한 shRNA의 효과. 괄호안 숫자는 moi이다.
실험 | shRNA 발현 구조체 | 바이러스 생산(역가, HA 단위) | |||||||
PR8 (0.1) | PR8 (0.01) | PR8 (0.001) | PR8 (0.0001) | PR8 (0.00001) | H5N1 (0.01) | H5N1 (0.001) | H5N1 (0.0001) | ||
1 | Mock | 512 | 256 | 64 | 16 | ||||
pcU6-4 shNP-1484 | 256 | 128 | 16 | 4 | |||||
pc7SK shPB1-2257 | 128 | 16 | 4 | 0 | |||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 128 | 32 | 4 | 0 | |||||
2 | Mock | 256 | 128 | 128 | |||||
pcU6-4 shNP-1496 | 64 | 32 | 8 | ||||||
pcU6-4 shNP-1484 | 32 | 16 | 2 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-1 shPB1-2240 | 256 | 128 | 128 | ||||||
pc7SK shPB1-129 | 128 | 64 | 32 | ||||||
3 | Mock | 64 | 128 | 64 | |||||
pcU6-4 shNP-1496 | 32 | 8 | 2 | ||||||
pcU6-4 shNP-1484 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-1 shPA-2087 | 128 | 128 | 32 | ||||||
pcU6-3 shMP-592 | 128 | 32 | 32 | ||||||
4 | Mock | 64 | 16 | 4 | |||||
pcU6-4 shNP-1484 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-3 shNP-1484 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
5 | Mock | 64 | 32 | 16 | |||||
pcU6-4 shNP-1496 | 2 | 2 | 2 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pc7SK shPB1-2257 | 8 | 16 | 16 | ||||||
6 | Mock | 64 | 32 | 8 | |||||
pcU6-4 shNP-1496 | 16 | 8 | 2 | ||||||
pcU6-1 shPA-2087 | 32 | 16 | 8 | ||||||
pcU6-3 shMP-592 | 32 | 8 | 4 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
7 | Mock | 64 | 64 | 32 | |||||
pcU6-4 shNP-1496 | 8 | 2 | 0 | ||||||
pcU6-1 shPA-2087 | 64 | 32 | 16 | ||||||
pcU6-3 shMP-592 | 32 | 16 | 4 | ||||||
pcU6-4 shPB1-2257 | 0 | 0 | 0 | ||||||
pcU6-1 shPB2-2240 | 64 | 64 | 32 | ||||||
pc7SK shPB1-129 | 64 | 64 | 32 | ||||||
8 | Mock | 64 | 64 | 32 | |||||
MWH1 | 32 | 16 | 8 | ||||||
MWH2 | 64 | 64 | 16 | ||||||
MWH3 | 8 | 8 | 4 | ||||||
MWH4 | 4 | 4 | 0 |
실시예
5. 멀티-
워헤드
(
MWH
:
Multi
-
Warhead
) 트랜스유전자의 구축
RNAi 전략에서 바이러스 타겟 서열의 가변성 위험도를 더욱 낮추기 위해, 하나의 트랜스유전자로부터 복수의 shRNA를 발현시키는 것이 매우 좋은 것으로 결정되었다. 이들 "멀티-워헤드"(MWH) 트랜스유전자는, 전술한 여러가지 인플루엔자 A 바이러스 유전자의 보존된 서열을 타겟팅하는 개별 shRNA 분자를 발현하는, 각각에 상이한 닭 pol III 프로모터(cU6-l, cU6-3, cU6-4 및 c7SK)가 있는 복수의 전사 유닛들로 구성된다. 프로모터 서열들은 닭에 천연적이며, 소형의 21 bp shRNA 서열들은 이미 감염되었거나 백신 접종받은 새에 존재하고 있을 것이다. RNAi 타겟은 인플루엔자 A 바이러스에 절대적으로 특이적이며, 그래서 이러한 특이적인 트랜스유전자로부터 타겟 효과는 없어지지 않을 것이다.
4가지 MWH 트랜스유전자를 하기와 같이 선택한 shRNA로부터 구축하였다:
a. MWH 1 - cU6-3 shMP-592; cU6-1 shPA-2087; cU6-4 shNP-1496
각 MWH 트랜스유전자에는 닭의 pol III 프로모터로부터 하나의 shRNA 분자를 독립적으로 발현하는 3개의 전사 유닛들이 포함되어 있다. 이 3개의 개별 전사 유닛들은 한단계 PCR을 이용하여 증폭하였으며, 제조되는 단편들은 서로 연결하여 MWH 트랜스유전자를 만들었다(도 2). 그러면, MWH는 하나의 트랜스유전자로부터 3개의 개별 shRNA들을 발현시킬 수 있다. MWH1에 대한 3개의 전사 유닛들은 cU6-4 shNP-1496; cU6-3 shMP-592; 및 cU6-1 shPA-2087이다. cU6-4 shNP-1496 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD233 및 역방향 프라이머 TD216으로 증폭하였고, cU6-3 shMP-592 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD234 및 역방향 프라이머 TD217로 증폭하였고, cU6-1 shPA-2087 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD232 및 역방향 프라이머 TD218로 증폭하였다(프라이머에 대한 상세 내용은 표 4에 개시되어 있음). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하였는데, 각각에는 5' SalI 제한효소 부위와 3' XhoI 제한효소 부위가 포함되어 있다. 이들 제한효소 부위 모두는 상용가능한 돌출 부위(compatible overhang)를 가지고 있어, 개별 전사 유닛들을 서로 연차적으로 연결하여 최종 MWH 트랜스유전자를 제조할 수 있다(도 2).
b. MWH 2 - cU6-4 shPB1-2257; cU6-1 shPB2-2240; c7SKshPB1-129
MWH2에 대한 3가지 전사 유닛들은 cU6-4 shPB1-2257; cU6-1 shPB2-2240 및; c7SK shPB1-129이다. cU6-4 shPB1-2257 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD233 및 역방향 프라이머 TD274를 이용하여 증폭하고, cU6-1 shPB2-2240 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD232 및 역방향 프라이머 TD275를 이용하여 증폭하고, c7SK shPBl-129 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD306 및 역방향 프라이머 TD307를 이용하여 증폭하였다(프라이머에 대한 상세 내용은 표 4에 기재되어 있음). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하고 순차적으로 연결하여, 도 2와 상기에서 언급한 최종 MWH 트랜스유전자를 구축하였다.
c. MWH3 - cU6-4 shNP-1484; cU6-1 shPA-2087; c7SKshPBl-2257
MWH3에 대한 3가지 전사 유닛들은 cU6-4 shNP-1484; cU6-1 shPA- 2087 및; c7SK shPBl-2257이다. cU6-4 shNP-1484 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD233 및 역방향 프라이머 TD302를 이용하여 증폭하고, cU6-1 shPA-2087 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD232 및 역방향 프라이머 TD218을 이용하여 증폭하고, c7SK shPBl-2257 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD306 및 역방향 프라이머 TD316을 이용하여 증폭하 였다(프라이머에 대한 상세 내용은 표 4에 기재되어 있음). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하고 순차적으로 연결하여, 도 2와 상기에서 언급한 최종 MWH 트랜스유전자를 구축하였다.
d. MWH4 - cU6-4 shPBl-2257; cU6-3 shNP-1484; cU6-1 shPA-2087
MWH4에 대한 3가지 전사 유닛들은 cU6-4 shPB 1-2257; cU6-3 shNP- 1484 및; cU6-1 shPA-2087이다. cU6-4 shPB 1-2257 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD233 및 역방향 프라이머 TD274를 이용하여 증폭하고, cU6-3 shNP-1484 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD234 및 역방향 프라이머 TD343를 이용하여 증폭하고, cU6-1 shPA-2087 전사 유닛은 정방향 프라이머 TD232 및 역방향 프라이머 TD218 이용하여 증폭하였다(프라이머에 대한 상세 내용은 표 4에 기재되어 있음). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하고 순차적으로 연결하여, 도 2와 상기에서 언급한 최종 MWH 트랜스유전자를 구축하였다.
4가지의 최종 MWH 트랜스유전자들은, H5N1 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 HA 분석에서 바이러스 생산을 저해하는 능력에 대해 테스트하였다(표 4, 실험 8). MWH 3 및 4가 가장 효과적인 트랜스유전자였다. 또한, MWH 1도 효과적으로 H5N1 바이러스의 생산을 저해하였지만, MWH 2는 MWH 1만큼 효과적이진 않았다.
실시예
6.
MWH
트랜스유전자의
pStuffit
벡터로의
클로닝
각각의 MWH를 pSuffit 플라스미드에 클로닝하였다(도 3). 이 플라스미드는 닭의 게놈 DNA의 stuffer/buffer 단편들 사이에 MWH 트랜스유전자가 삽입되게 하여, 트랜스유전자 삽입 프로세스 및 외부 전사 진행으로부터 MWH 서열을 잠재적으 로 보호한다. ME1 및 GRM5 stuffer 단편들은 닭의 게놈으로부터 유래된 거대 인트론 서열들 중에서 선택하였으며(즉, 게놈 데저트), MWH 트랜스유전자의 발현을 방해할 수 있는 전사 요소들이 전혀 없다. 유전자은행에 기재된 특정 영역은 ME1 1500 (chr3) gb|AADN02002420.1 30995-32489 bp ; ME1 200 (chr 3) gb|AADN02002420.1 5079-5276 bp 및; GRM5 1500 (chr 1) gb|AADN02004814.1 13141-13113, 13078-12911, 12848-11638 bp; GRM5 200 (chr 1) gb|AADN02004814.1 10126-9927 bp이다.
플라스미드
pStuffit
구축
플라스미드 pStuffit는, 닭 게놈의 4가지 영역들을 제한효소 부위에 의해 지시되는 특정 순서로 pIC20H 클로닝 벡터에 클로닝하여 구축하였다(도 3). 표 6에 열거된 단편들을 먼저 표 7에 나열된 프라이머들을 이용하여 PCR 증폭시킨 다음, pGEM-T Easy (Invitrogen)에 각각 클로닝하고, 서열분석하였다. 이들 단편들을 pGEM-T Easy에서 잘라내, 표 5에 열거된 제한효소를 이용하여 순차적으로 클로닝하였다. 먼저, GRM5 200을 pIC20H에 클로닝한 다음, ME1 200, GRM5 1500 및 ME1 1500 순서로 클로닝하였다. 각 클로닝 단계에서 제조되는 플라스미드를 제한효소 절단과 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 최종 조립한 플라스미드를 pStuffit로 칭하였다.
표 6. pStuffit 구축. 클로닝한 단편의 명칭과 이의 증폭에 사용된 프라이머들
단편 명칭 | 프라이머 | 효소 부위 |
GRM5 200 | TD277 / TD278 | EcoRI / EcoRV |
ME1 200 | TD281 / TD282 | BamHI / EcoRI |
GRM5 1500 | TD279 / TD280 | EcoRV / XhoI |
ME1 1500 | TD283 / TD284 | SphI / BamHI |
표 7. pStuffit 구축. PCR 프라이머 명칭과 서열. 제한효소 부위는 밑줄 표시함
프라이머 명칭 | 프라이머 서열 | 클로닝 효소 |
TD277 | GAATTCCATACCACTGCGAG GGTGCCAAGTCATGGGACTGATACTC(서열번호 43) | EcoRI |
TD278 | GATATCTTAATTAACTGGAAGGTTGCAGTAAG(서열번호 44) | EcoRV |
TD279 | GATATCTTGT CCCTTCCAGG AACAG(서열번호 45) | EcoRV |
TD280 | CTCGAGATTTAAATAGATTGCAGCACAAGGAG(서열번호 46) | XhoI |
TD281 | GGATCCTTAATTAACTGGAAACTAGGACGTGGAAG(서열번호 47) | BamHI |
TD282 | GAATTCCGAGACCATCCACGTGCTGCTTACTGCAGCTACG TCGAATG(서열번호 48) | EcoRI |
TD283 | GCATGCATTTAAATGACAGCAGCAGGTGAAAGAC(서열번호 49) | SphI |
TD284 | GGATCCTCAAGTGGGTGCTCAGGAAG(서열번호 50) | BamHI |
MWH
트랜스유전자의
pStuffit
로의 삽입
pStuffit 벡터는 GRM5 200 서열과 ME1 서열 사이에 위치한 고유 EcoRI 제한효소 부위를 가지고 있어, 각 MWH 트랜스유전자의 삽입이 가능하다. 각각의 MWH 트랜스유전자를, 상기 EcoRI 부위에 연결시켜 pStuffit에 삽입하였다. 또한, 측면 서열을 다양한 길이로 가진구조체의 적출을 가능하게 하기 위해 PacI과 SwaI을 포함시켰다(도 3). pIC20H 벡터의 HindIII 제한효소 부위를 이용하여 클로닝 서열 전체를 적출할 수 있다. 따라서, 각각의 MWH 삽입체가 포함된 최종 pStuffit 플라스미드를 HindIII 제한효소로 잘라, 정제할 최종 삽입체를 분리하고, 정자 매개 유전자 전이(SMGT) 프로세스에 사용하였다.
실시예
7. 링커를 이용한 정자-매개 유전자 전이
수정된 닭의 수정란에 구조체를 전달하는 과정은, 링커를 이용한 정자 매개 유전자 전이에 의해 달성할 수 있다. 이러한 과정은 US 7,067,308에 개시된 바와 같이 수행한다. 간략하게 설명하면, 신선하게 회수한 닭 정액을 헹구고, 설치류 단일클론 항체 mAbC(ATCC 수탁번호 PTA-6723로 기탁된 하이브리도마에서 분비됨)와 인큐베이션한 다음, 구조체 DNA와 인큐베이션한다. 첨가된 단일클론 항체는 DNA가 정액에 결합하는 것을 돕는다. 그런 후, 정자/DNA 복합체는 인위적으로 암컷에 임신시킨다. 이러한 과정은 수정 사이에 72시간을 두고 4번 반복한다. 1차 수정 후 2일째부터 마지막 수정 후 3일째까지 매일 난을 수거하였다.
실시예
8.
Tol2
에
MWH
트랜스유전자의 삽입 및 닭으로의 전달
MWH 3(서열번호 21) 및 MWH 4(서열번호 61) 트랜스유전자를 Tol2 트랜스포존 벡터 pminiTol2/MCS((서열번호 64); Balciunas et al., 2006)에 클로닝하였다. 이 2가지 트랜스유전자들을 SalI 및 XhoI으로 이중 절단하여 pGEM-T Easy 벡터로부터 잘라내었다. 이 단편을 Tol2 트랜스포존 벡터의 다중클로닝 부위에 있는 고유한 XhoL 부위에 연결하였다.
닭 배아에 MWH 3 Tol2 구조체(서열번호 62) 및 MWH 4 Tol2 구조체(서열번호 63)를 전달하는 과정은 PGC(Primordial Germ Cell)를 이용하여 달성할 수 있다. 간략하게는, PGC를 공여체 닭 배아로부터 수득하며, 이때 PGC는 배아가 2일 되었을 때 혈액으로부터 수득하거나 또는 5.5일된 배아의 생식선으로부터 수득한다. PGC는 자기 항체 세포 분리(MACS)를 이용하여 혈액이나 생식선으로부터 정제한다. 정제된 PGC에 Tol2 구조체와 Tol2 트랜스포자제를 코딩하는 개별 플라미스드(pCMV-Tol2; 서열번호 65; Balciunas et al., 2006)를 Amaxa Nucleofector를 이용하여 전기천공으로 주입한다. 그런 후, 세포를 2.5일된 수여 배아에 다시 주입한다. 형 질전환된 PGC는 이동하여 발생중인 배아의 생식선을 확립하게 된다.
닭의 배아에 Tol2 구조체를 전달하는 과정 역시 막 낳은 난의 배반엽의 직접 전기천공 처리에 의해 달성할 수 있다. 간략하게는, 막 낳은 수정된 난을 열어, ㅂ배반엽을 노출시킨다. 배반엽에 Tol2 구조체 DNA를 미세모세 파이펫을 이용하여 Tol2 트랜스포자제를 코딩하는 플라스미드를 함께 주입한다. 그런 후, 배반엽을 BTX ECM830 Electro Square Porator를 이용하여 난내(in ovo) 전기천공하였다. PGC는 배반엽의 중앙에 위치하고 있으며, 이들 세포에 전기천공 후 구조체를 형질전환시킨다면, 세포는 발생중인 배아의 생식선내에서 생식 세포가 되게 진행될 것이다.
실시예
9. 형질전환체의
G0
자손 스크리닝
1주령의 GO 자손의 날개 정맥이나 깃 끝부분에서 소량의 혈액을 채혈하였다. 게놈 DNA를 QIAmp DNA Blood Mini kit (Qiagen)를 이용하여 날개 정맥 혈액으로부터 준비하였다. 깃 끝부분의 혈액으로부터의 DNA는 QuickExtract™ DNA 추출용액(Epicentre Biotechnologies)을 이용하여 준비하였다. 이들 샘플을 대상으로 2가지 테스트를 수행하여, 구조체의 존재를 확인하였다.
서든
블롯
표 8에 열거되어 있는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 게놈 샘플을 주형으로 PCR을 수행하였다. 그런 후, PCR 혼합물을 아가로스 겔에 전개하고, 막으로 이동시킨 후, 방사선 표지된 닫힌(locked) 핵산 프로브(표 8)와 혼성화하였다. 혼성화 및 고엄격 용액에서의 세정 후, 막을 X-레이 필름에 감광하였다. 수 득한 사진에서 검출되어 지는 정확한 크기의 밴드는 양성을 의미한다.
표 8. 서든 블롯 PCR 분석에서 사용한 올리고뉴클레오티드. 밑줄 친 글자는 닫힌 핵산 염기를 나타낸다.
작용 | 명칭 | 서열 |
정방향 프라이머 | TD320 | TTGCCCCCAAACAGCAA(서열번호 55) |
역방향 프라이머 | TD321 | GACCATCCACGTGCTGCTTA(서열번호 56) |
프로브 | TD319 | CATTCGACGTAGCTGCA(서열번호 57) |
실시간 정량
PCR
표 9에 나열된 프라이머를 이용하여 게놈 샘플을 대상으로 실시간 PCR을 수행하였다. 본 분석에서는 양성 샘플을 결정하기 위한 이중 가닥의 DNA에 대한 SYBR Green 시약의 결합과, 후속적인 용융 곡선 분석을 이용하였다.
표 9. 실시간 PCR 분석에 사용한 프라이머
작용 | 명칭 | 서열 |
정방향 프라이머 | BC_F_03 | GCAGCACGTGGATGGTCTC(서열번호 58) |
역방향 프라이머(프로모터 cU6-4) | TD251 | TCTTCCGCCGTCCCAVAATT(서열번호 59) |
역방향 프라이머(프로모터 cU6-3) | TD252 | GCTTAGAAAGCCTGACGTCT(서열번호 60) |
실시예
10. 형질전환 조류의 테스트
LB
-
SMGT
G0 집단에서 형질전환체로 동정되는 새를 가두어 성적으로 성숙할 때까지 사육하였다. 새가 성숙되면, 새를 교배 실험에 사용하여 각 세포에 구조체 카피를 가지고 있는 G1 형질전환 자손을 만들었다. 서든 블롯 및 실시간 PCR을 다시 실시하여 G1 자손의 형질전환 특성을 확인하였다.
구조체의 삽입부와 카피수와 관련하여, 게놈 서든 블롯 및 PCR을 이용한 보다 상세한 분석을 이들 새에 대해 수행하였다.
해당 구조체 삽입체를 가지고 있는 것으로 동정된 G1 새를 성적으로 성숙할 때까지 키웠다. 이들 새로부터 나온 G2 자손들 중 일부를 동물 실험에 사용하여 다양한 조류 인플루엔자 균주에 대한 내성을 검증하였다. 그외 G2 새는 다양한 조직과 다양한 연령들에서 구조체의 발현에 대해 분석하였다.
Tol2
트랜스포존
Tol2 형질전환된 PGC를 받았거나 또는 Tol2 구조체를 전기천공으로 주입받은 G0 배아가 부화될 것이다. G0 수컷 닭만 유지시키고 성적으로 성숙할 때까지 키울 것이다. 수컷 새로부터 정액을 수득하고, PCR을 실시하여 어떠한 새가 해당 구조체를 포함하는지는 확인한다. PCR 양성으로 나온 새를 교배 실험에 사용하여, 각 세포에 구조체 카피를 가지고 있는 G1 형질전환 자손을 만든다. 서든 블롯과 실시간 PCR을 다시 실시하여, G1 자손의 형질전환 특성을 확인한다.
실시예
11. 모델 시스템-인플루엔자 A 내성 형질전환 마우스
본 발명자들은 형질전환 마우스를 제조하기 위해 2개의 shRNA 트랜스유전자 카세트를 제조하였다. 각 카세트에는 shNP-1496 또는 shEGFP 중 어느 하나의 발현을 위해 마우스 U6 프로모터가 포함되어 있다. 그런 후, 2개의 트랜스유전자를 사용하여 렌티바이러스 기법으로 형질전환 마우스를 제조하였다. 간단하게는, shNP-1496 및 shEGFP shRNA 트랜스유전자 카세트를 렌티바이러스 유전자 전달 벡터(AusGene, Bentleigh, Australia)에 클로닝하였다. 그 후, 형질전환성 바이러스 구조체를 렌티바이러스 입자로 패킹하였다. 렌티바이러스의 역가를 측정하고, 렌티바이러스 입자를 초기 단계의 마우스 배아의 위난강 공간에 주입하였다. 배아를 가임신 상태의 암컷에 재이식한 다음, 생겨난 자손을 서든 블롯 분석으로 스크리닝하였다. 트랜스유전자 중 어느 하나가 안정적으로 병합된 형질전환 원조 마우스를 수득하였다. 이 원조 마우스를 야생형 마우스와 교배하여, F1 자손을 만들었다. 그 후, 형질전환 F1 마우스에서 인플루엔자 A 감염에 대한 내성에 대해 챌린지 실험(challenge experiment)으로 테스트하였다.
챌린지 실험에서는, 각각 5마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹으로 이루어졌다. 그룹1 및 그룹2 각각은 shNP-1496 shRNA의 마우스 5마리가 포함되었다. 그룹3에는 shEGFP shRNA의 마우스 5마리가 포함되었다. 그룹2 및 그룹3에는, 저병원성 H1N1 A/PR/8/34(PR8) 인플루엔자 A 바이러스를 5 x 102 TCID50으로 코내 기회 투여하였다. 그룹1에는 바이러스 없이 포스페이트 완충화된 염수를 기회 투여하였다. 개회 투여 후 10일간 매일 체중을 모니터링하고, 실험 종료 시에 마우스를 안락사시켜, 바이러스 RNA의 qPCR 측정을 위해 폐 샘플을 채취하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, shNP-1496 트랜스유전자의 형질전환 마우스는 무관한 shEGFP 트랜스유전자의 마우스에 비해 감염에 대해 탁월한 내성 수준을 보였다. shNP-1496 마우스는 PBS 대조군과 비교하였을 때 실험 기간 동안 체중 감소가 없었다. 비교로, shEGFP 마우스에서는 체중이 통계학적으로 유의하게 감소된 것으로 나타났는데, 이는 인플루엔자 바이러스의 활발한 감염을 의미한다. 바이러스 RNA를 그룹2와 그룹3의 마우스로부터 채취한 폐 샘플에서 측정하였을 때, shNP-1496 트랜스유전자의 마우스에서는 무관한 shEGFP 트랜스유전자를 가진 마우스에 비해 바이러스 RNA가 90% 이상 낮았다. 이러한 전체적인 결과들은, shNP-1496과 같은 인플루엔자 A 바 이러스를 특이적으로 타겟하는 shRNA 분자를 가지고 있는 형질전환 마우스가 HlNl A/PR/8/34 (PR8) 인플루엔자 A 바이러스의 기회 감염 실험에서 높은 내성을 보인다는 것을 나타낸다.
당업자라면, 광의적으로 기술된 본 발명의 사상 또는 범위로부터 이탈되지 않으면서 구체적인 예로 나타낸 본 발명에 많은 변형 및/또는 수정을 가할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 모든 측면들이 예시적이며 비제한적인 것으로 간주된다.
본원에서 논의되고 및/또는 언급된 모든 공개 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 US 60/938,315와 AU 2007902616에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 장치, 논문 등에 대한 언급은 단지 본 발명의 내용을 전달하기 위한 목적이다. 그러나, 임의의 또는 모든 이러한 사항들이, 본 출원의 각 청구항에 대한 우선일 이전에 공지된 것으로서, 선행기술의 기초가 된다거나 본 발명에 속하는 기술 분야에서 공지된 일반 기술임을 용인하는 것은 아니다.
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<150> AU 2007902616
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<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 8
cgggacucua gcauacuua 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 9
gcaauugagg agugccuga 19
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 10
ccaggaaaug cugagaucga a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 11
gaguaaugaa ggaucuuauu u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 12
aucuuauuuc uucggagaca a 21
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
<400> 13
ggaucuuauu ucuucggag 19
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
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<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> strand of dsRNA
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<210> 16
<211> 4749
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid construct
<400> 16
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<210> 17
<211> 4700
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<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid construct
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attctacatt caatatcttt agcaaatctt tctgctgtag ccagattact ccaacataag 3600
atttctggtt tctgggaagg atgcccatcc ctgagatatg caaggtcagg ctggatgggg 3660
tgctgggcac ctgatggagc tgtagatgtc cctgttcatt gcaggggatt tgaactgaat 3720
ggcctttaag ggtccttttc aactcaaaca gttgaatgat tctgtggttt ccaaggatag 3780
ggagggtcct aacattcaaa gctagactgg gaaagaagaa aaagacaaaa attcttggtt 3840
atttcattgc tttggtagtt ccatcagcag ataaaattat aggtctcttc ttggtctagt 3900
gtaagaaatg cctgggaatc attttatcac aaaaatcttt ctgtttgcat gttttcttct 3960
gtacttacca atcacactaa atgagttgga ttaaaatttt gggaggttga gcagaaaatg 4020
ttcttaagta ttaatatcaa ttcttcacat ttaaaatgtg caaatatttt gaggggtgtt 4080
agtaggcttt gctcctctga aatttacctt tatggtttaa tcaggtgatg cctccagttg 4140
tgcaagtagc cactaacaat aatgtttttt cctactaatg ggaaggtggc aaacattata 4200
ttcagtggat tactaataat tttaaggagg aagtcttttc aatctaatta acaagaaatg 4260
tgagtaacaa atgacggata tttgtcataa aacaacagtc atcttctctt acatgtgtaa 4320
atataacatt gtattttaca taagccagtc agaaatcttc acaagtcttg gatagttcca 4380
gattgtaact cctgatgctt agctctatca ggatgatatg actcagaaac gttagttcta 4440
tcaacctagt ttccaactct tccttgcttt taatgatttg tggagctcta ctctgaacca 4500
gcctggcttt gaagtaaatc tccttcactc atcatcagca cacttttttt gaaaagccac 4560
gtcacttata gaatcctact tatgttgtgg ctcgatgaac atgtgttaac actgtggatc 4620
aggggagcgg gagtgagcag tacaggaggg aaaatatgat tggaaactcc ttgtgctgca 4680
atctatttaa atctcgagct cgcgaa 4706
<210> 19
<211> 1242
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Multiple shRNA construct 1
<400> 19
gaattcgatt gtcgaccaga cagacgtcag gctttctaag cctggactga gtaagagcgg 60
aagagctcca cagcactctg agtgcgcaca gaccgcgcgt acagcgcaca gccgcgcggc 120
cgctccttca ggcactgccg acgacagccc aggcggaggt cctgagcgcc ggcgctaaat 180
ttgcataaag aactacccag gagccctcgc gcgcggaaac gggcaaaaag gggcttctaa 240
tatggaaata ttacgccgaa tcgcgttaca aatcggctaa gcgggcctaa gagttaacaa 300
gatgtgctat taagcggagc cttttggtgg gaagaaatgg agtagtcact gtgttctaaa 360
agaacttgca gaatgagcct ttaaataccg cagtctcgat gctcttagtc cactacagct 420
aaggctatgg agcaaatttc aagagaattt gctccatagc cttagctgta gtgttttttg 480
gaactcgacc gaagaaccga gcgctgctgg ccttaaagtc ccaccaaaac tctgaagaaa 540
cgaagccaga cccggcactc agcgggcagc ccgcgcctcc cgccgcccca cagtgccgcg 600
cgcgtgcatt tgcatagcgc ggtgctcgca gggggaaact caccccctca agtccgcccc 660
ccgcttcccg cccgctgtcc cgcacctcat cagtgctgtg cgctgtctgt gtcccccagc 720
acgcactctt tgctgttctt acccggaggc ttgccctatc cttgaggttt ctatttttta 780
ggctataaat accgcctagg aggtagagat attcgcaatt gaggagtgcc tgattcaaga 840
gatcaggcac tcctcaattg cttttttgga actcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 900
ggctcccgcc ccgcccctat atgcaaagca gagaacttcc cgccgtgcac cgcgcgcaat 960
cggaagagaa tttgggcact tcagacccaa aaaaaaaccc aaaacttctg cgaaaaagaa 1020
agaatctcag cggagtaaat agggattttt gttaaagagg tgataccaga agaagaaata 1080
tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 1140
ctgtccgaga gacactgggg tttggatctt atttcttcgg agttcaagag actccgaaga 1200
aataagatcc ttttttggaa ctcgagaatc actagtgaat tc 1242
<210> 20
<211> 1181
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Multiple shRNA construct 2
<400> 20
gcggccgcgg gaattcgatt gtcgacgaat tgtgggacgg cggaagacgg gctcccgccc 60
cgcccctata tgcaaagcag agaacttccc gccgtgcacc gcgcgcaatc ggaagagaat 120
ttgggcactt cagacccaaa aaaaaaccca aaacttctgc gaaaaagaaa gaatctcagc 180
ggagtaaata gggatttttg ttaaagaggt gataccagaa gaagaaatat gcaaatacaa 240
cgccagctca ccgctactta aaaatcatga tataatagag gcttaaatac tgtccgagag 300
acactggggt ttgatctgtt ccaccattga attcaagaga ttcaatggtg gaacagatct 360
tttttggaac tcgaccgaag aaccgagcgc tgctggcctt aaagtcccac caaaactctg 420
aagaaacgaa gccagacccg gcactcagcg ggcagcccgc gcctcccgcc gccccacagt 480
gccgcgcgcg tgcatttgca tagcgcggtg ctcgcagggg gaaactcacc ccctcaagtc 540
cgccccccgc ttcccgcccg ctgtcccgca cctcatcagt gctgtgcgct gtctgtgtcc 600
cccagcacgc actctttgct gttcttaccc ggaggcttgc cctatccttg aggtttctat 660
tttttaggct ataaataccg cctaggaggt agagatattc cgggactcta gcatacttat 720
tcaagagata agtatgctag agtcccgttt tttggaactc gacgaggctc agtgtcacgc 780
agagcgcggg acgagcgctc cgagccctcc cagtgccgcc cccaaggcag ggcggccggc 840
gcagctcccc gcagcccgcc agtgggaagg ctctgctttg cataacgcgc aaggcctgct 900
gggaggaaag cggagcgaga aagagcgtta acgtgcgccg agtgttttag agcaaaagca 960
ttcagacctg aagcagcgct gagagatgcc tctgccgccc atttactgga acgttcagac 1020
ccaccgcaag tcaccgtgac cttgaggaca ctgagctgtt ggccgttata tagcacttgg 1080
ggcagctcgt agctttcagg atacaccatg gatacttcaa gagagtatcc atggtgtatc 1140
ctgtttttgg aactcgagaa tcactagtga attcgcggcc g 1181
<210> 21
<211> 1196
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Multiple shRNA construct 3
<400> 21
gcggccgcgg gaattcgatt gtcgacgaat tgtgggacgg cggaagacgg gctcccgccc 60
cgcccctata tgcaaggcag agaacttccc gccgtgcacc gcgcgcaatc ggaagagaat 120
ttgggcactt cagacccaaa aaaaaaccca aaacttctgc gaaaaagaaa gaatctcagc 180
ggagtaaata gggatttttg ttaaagaggt gataccagaa gaagaaatat gcaaatacaa 240
cgccagctca ccgctactta aaaatcatga tataatagag gcttaaatac tgtccgagag 300
acactggggt ttatcttatt tcttcggaga caattcaaga gattgtctcc gaagaaataa 360
gatttttttg gaactcgacc gaagaaccga gcgctgctgg ccttaaagtc ccaccaaaac 420
tctgaagaaa cgaagccaga cccggcactc agcgggcagc ccgcgcctcc cgccgcccca 480
cagtgccgcg cgcgtgcatt tgcatagcgc ggtgctcgca gggggaaact caccccctca 540
agtccgcccc ccgcttcccg cccgctgtcc cgcacctcat cagtgctgtg cgctgtctgt 600
gtcccccagc acgcactctt tgctgttctt acccggaggc ttgccctatc cttgaggttt 660
ctatttttta ggctataaat accgcctagg aggtagagat attcgcaatt gaggagtgcc 720
tgattcaaga gatcaggcac tcctcaattg cttttttgga agtcgacgag gctcagtgtc 780
acgcagagcg cgggacgagc gctccgagcc ctcccagtgc cgccccccaa ggcagggcgg 840
ccggcgcagc tccccgcagc ccgccagtgg gaaggctctg ctttgcataa cgcgcaaggc 900
ctgctgggag gaaagcggag cgagaaagag cgttaacgtg cgccgagtgt tttagagcaa 960
aagcattcag acctgaagca gcgctgagag atgcctctgc cgcccattta ctggaacgtt 1020
cagacccacc gcaagtcacc gtgaccttga ggacactgag ctgttggccg ttatatagca 1080
cttggggcag ctcgtagctt tgatctgttc caccattgaa ttcaagagat tcaatggtgg 1140
aacagatctt ttttggaact cgagaatcac tagtgaattc gcggccgcga attcca 1196
<210> 22
<211> 325
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cU6-1 promoter sequence
<400> 22
cgaagaaccg agcgctgctg gccttaaagt cccaccaaaa ctctgaagaa acgaagccag 60
acccggcact cagcgggcag cccgcgcctc ccgccgcccc acagtgccgc gcgcgtgcat 120
ttgcatagcg cggtgctcgc agggggaaac tcaccccctc aagtccgccc cccgcttccc 180
gcccgctgtc ccgcacctca tcagtgctgt gcgctgtctg tgtcccccag cacgcactct 240
ttgctgttct tacccggagg cttgccctat ccttgaggtt tctatttttt aggctataaa 300
taccgcctag gaggtagaga tattc 325
<210> 23
<211> 394
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cU6-3 promoter sequence
<400> 23
cagacagacg tcaggctttc taagcctgga ctgagtaaga gcggaagagc tccacagcac 60
tctgagtgcg cacagaccgc gcgtacagcg cacagccgcg cggccgctcc ttcaggcact 120
gccgacgaca gcccaggcgg aggtcctgag cgccggcgct aaatttgcat aaagaactac 180
ccaggagccc tcgcgcgcgg aaacgggcaa aaaggggctt ctaatatgga aatattacgc 240
cgaatcgcgt tacaaatcgg ctaagcgggc ctaagagtta acaagatgtg ctattaagcg 300
gagccttttg gtgggaagaa atggagtagt cactgtgttc taaaagaact tgcagaatga 360
gcctttaaat accgcagtct cgatgctctt agtc 394
<210> 24
<211> 287
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cU6-4 promoter sequence
<400> 24
tgaattgtgg gacggcggaa gacgggctcc cgccccgccc ctatatgcaa agcagagaac 60
ttcccgccgt gcaccgcgcg caatcggaag agaatttggg cacttcagac ccaaaaaaaa 120
acccaaaact tctgcgaaaa agaaagaatc tcagcggagt aaatagggat ttttgttaaa 180
gaggtgatac cagaagaaga aatatgcaaa tacaacgcca gctcaccgct acttaaaaat 240
catgatataa tagaggctta aatactgtcc gagagacact ggggttt 287
<210> 25
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 7SK promoter sequence
<400> 25
gtccagccat ccacctccca ccaatacttc cccactgaac catgtccctc agtagcacag 60
ggtttgtgga acgcctcctg ggacggtgcc tcccccacct gccacgcagc ccattccagc 120
acctgacact tctggagacg aaatttttcc taacgtccaa cctgagtctc ccctggtgca 180
acttgaggct gttcccctga ctcccatcgc tagttacgtg ggaagaaaag acccctaaga 240
ccaccccgtg caaccaccag cccatcccca ccacgcccac tgaccgggcc cctcagtgcc 300
acagcagcac ggttctcgag cgcttcgcag gacggtgagc actgcccgga acctctgcac 360
ggcctcagca acgcgacttt cagccggggt cgctgcccag gagccggcgg cttcggagcg 420
cagagcgagg cgggagagct ccggccgcgg gaggctcagt gtcacgcaga gcgcgggacg 480
agcgctccga gccctcccag tgccgccccc aaggcagggc ggccggcgca gctccccgca 540
gcccgccagt gggaaggctc tgctttgcat aacgcgcaag gcctgctggg aggaaagcgg 600
agcgagaaag agcgttaacg tgcgccgagt gttttagagc aaaagcattc agacctgaag 660
cagcgctgag agatgcctct gccgcccatt tactggaaac gttcagaccc accgcaagtc 720
accgtgacct tgagacactg agctgttggc cgttatatag cacttggggc agctcgtagc 780
ttt 783
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 26
cgaagaaccg agcgctgc 18
<210> 27
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 27
gggctcgagt tccaaaaaag cgcagtgtta ctccacttct cttgaaagtg gagtaacact 60
gcgctgaata ccgcttcctc ctgag 85
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 28
gaattgtggg acggcggaag 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 29
cagacagacg tcaggctttc 20
<210> 30
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 30
ctcgagttcc aaaaaaggat cttatttctt cggagtctct tgaactccga agaaataaga 60
tccaaacccc agtgtctctc gga 83
<210> 31
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 31
ctcgagttcc aaaaaacact acagctaagg ctatggagca aattctcttg aaatttgctc 60
catagcctta gctgtagtgg actaagagca tcgagactg 99
<210> 32
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 32
ctcgagttcc aaaaaagcaa ttgaggagtg cctgatctct tgaatcaggc actcctcaat 60
tgcgaatatc tctacctcct agg 83
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 33
gtcgaccgaa gaaccgagcg ctgc 24
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 34
gtcgacgaat tgtgggacgg cggaag 26
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 35
gtcgaccaga cagacgtcag gctttc 26
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 36
gaggctcagt gtcacgcaga 20
<210> 37
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 37
ctcgagttcc aaaaaagatc tgttccacca ttgaatctct tgaattcaat ggtggaacag 60
atcaaacccc agtgtctctc gga 83
<210> 38
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 38
ctcgagttcc aaaaaacggg actctagcat acttatctct tgaataagta tgctagagtc 60
ccggaatatc tctacctcct agg 83
<210> 39
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 39
ctcgagttcc aaaaaaatct tatttcttcg gagacaatct cttgaattgt ctccgaagaa 60
ataagataaa ccccagtgtc tctcgga 87
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 40
gtcgacgagg ctcagtgtca cgcag 25
<210> 41
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 41
ctcgagttcc aaaaaacagg atacaccatg gatactctct tgaagtatcc atggtgtatc 60
ctgaaagcta cgagctgccc caa 83
<210> 42
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 42
ctcgagttcc aaaaaagatc tgttccacca ttgaatctct tgaattcaat ggtggaacag 60
atcaaagcta cgagctgccc caa 83
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 43
gaattccata ccactgcgag ggtgccaagt catgggactg atactc 46
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 44
gatatcttaa ttaactggaa ggttgcagta ag 32
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 45
gatatcttgt cccttccagg aacag 25
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 46
ctcgagattt aaatagattg cagcacaagg ag 32
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 47
ggatccttaa ttaactggaa actaggacgt ggaag 35
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 48
gaattccgag accatccacg tgctgcttac tgcagctacg tcgaatg 47
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 49
gcatgcattt aaatgacagc agcaggtgaa agac 34
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 50
ggatcctcaa gtgggtgctc aggaag 26
<210> 51
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 51
ctcgagttcc aaaaaaatct tatttcttcg gagacaatct cttgaattgt ctccgaagaa 60
ataagatgac taagagcatc gagactg 87
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> dsNA coding sequence
<400> 52
cagcgaccaa aagaauucgg a 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dsNA coding sequence
<400> 53
aagaauucgg auggccauca a 21
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dsNA coding sequence
<400> 54
guggauucuu gaucgucuu 19
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 55
ttgcccccaa acagcaa 17
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 56
gaccatccac gtgctgctta 20
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucoleotide primer
<400> 57
cattcgacgt agctgca 17
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 58
gcagcacgtg gatggtctc 19
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 59
tcttccgccg tcccacaatt 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 60
gcttagaaag cctgacgtct 20
<210> 61
<211> 1206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid construct
<400> 61
gacgtcgacg aattgtggga cggcggaaga cgggctcccg ccccgcccct atatgcaaag 60
cagagaactt cccgccgtgc accgcgcgca atcggaagag aatttgggca cttcagaccc 120
aaaaaaaaac ccaaaacttc tgcgaaaaag aaagaatctc agcggagtaa atagggattt 180
ttgttaaaga ggtgatacca gaagaagaaa tatgcaaata caacgccagc tcaccgctac 240
ttaaaaatca tgatataata gaggcttaaa tactgtccga gagacactgg ggtttgatct 300
gttccaccat tgaattcaag agattcaatg gtggaacaga tcttttttgg aactcgacca 360
gacagacgtc aggctttcta agcctggact gagtaagagc ggaagagctc cacagcactc 420
tgagtgcgca cagaccgcgc gtacagcgca cagccgcgcg gccgctcctt caggcactgc 480
cgacgacagc ccaggcggag gtcctgagcg ccggcgctaa atttgcataa agaactaccc 540
aggagccctc gcgcgcggaa acgggcaaaa aggggcttct aatatggaaa tattacgccg 600
aatcgcgtta caaatcggct aagcgggcct aagagttaac aagatgtgct attaagcgga 660
gccttttggt gggaagaaat ggagtagtca ctgtgttcta aaagaacttg cagaatgagc 720
ctttaaatac cgcagtctcg atgctcttag tctcttattt cttcggagac aattcaagag 780
attgtctccg aagaaataag atttttttgg aactcgaccg aagaaccgag cgctgctggc 840
cttaaagtcc caccaaaact ctgaagaaac gaagccagac ccggcactca gcgggcagcc 900
cgcgcctccc gccgccccac agtgccgcgc gcgtgcattt gcatagcgcg gtgctcgcag 960
ggggaaactc accccctcaa gtccgccccc cgcttcccgc ccgctgtccc gcacctcatc 1020
agtgctgtgc gctgtctgtg tcccccagca cgcactcttt gctgttctta cccggaggct 1080
tgccctatcc ttgaggtttc tattttttag gctataaata ccgcctagga ggtagagata 1140
ttcgcaattg aggagtgcct gattcaagag atcaggcact cctcaattgc ttttttggaa 1200
ctcgag 1206
<210> 62
<211> 1664
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid construct
<400> 62
cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatagatc tctcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 300
ggctcccgcc ccgcccctat atgcaaggca gagaacttcc cgccgtgcac cgcgcgcaat 360
cggaagagaa tttgggcact tcagacccaa aaaaaaaccc aaaacttctg cgaaaaagaa 420
agaatctcag cggagtaaat agggattttt gttaaagagg tgataccaga agaagaaata 480
tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 540
ctgtccgaga gacactgggg tttatcttat ttcttcggag acaattcaag agattgtctc 600
cgaagaaata agattttttt ggaactcgac cgaagaaccg agcgctgctg gccttaaagt 660
cccaccaaaa ctctgaagaa acgaagccag acccggcact cagcgggcag cccgcgcctc 720
ccgccgcccc acagtgccgc gcgcgtgcat ttgcatagcg cggtgctcgc agggggaaac 780
tcaccccctc aagtccgccc cccgcttccc gcccgctgtc ccgcacctca tcagtgctgt 840
gcgctgtctg tgtcccccag cacgcactct ttgctgttct tacccggagg cttgccctat 900
ccttgaggtt tctatttttt aggctataaa taccgcctag gaggtagaga tattcgcaat 960
tgaggagtgc ctgattcaag agatcaggca ctcctcaatt gcttttttgg aagtcgagga 1020
ggctcagtgt cacgcagagc gcgggacgag cgctccgagc cctcccagtg ccgcccccca 1080
aggcagggcg gccggcgcag ctccccgcag cccgccagtg ggaaggctct gctttgcata 1140
acgcgcaagg cctgctggga ggaaagcgga gcgagaaaga gcgttaacgt gcgccgagtg 1200
ttttagagca aaagcattca gacctgaagc agcgctgaga gatgcctctg ccgcccattt 1260
actggaacgt tcagacccac cgcaagtcac cgtgaccttg aggacactga gctgttggcc 1320
gttatatagc acttggggca gctcgtagct ttgatctgtt ccaccattga attcaagaga 1380
ttcaatggtg gaacagatct tttttggaac tcgaggtcga ctctagagcg gccgcgcgca 1440
ctagtgaatt ccatggatat caagcttaaa caagaatctc tagttttctt tcttgctttt 1500
acttttactt ccttaatact caagtacaat tttaatggag tactttttta cttttactca 1560
agtaagattc tagccagata cttttacttt taattgagta aaattttccc taagtacttg 1620
tactttcact tgagtaaaat ttttgagtac tttttacacc tctg 1664
<210> 63
<211> 1723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid construct
<400> 63
cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatagatc tctcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 300
ggctcccgcc ccgcccctat atgcaaagca gagaacttcc cgccgtgcac cgcgcgcaat 360
cggaagagaa tttgggcact tcagacccaa aaaaaaaccc aaaacttctg cgaaaaagaa 420
agaatctcag cggagtaaat agggattttt gttaaagagg tgataccaga agaagaaata 480
tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 540
ctgtccgaga gacactgggg tttgatctgt tccaccattg aattcaagag attcaatggt 600
ggaacagatc ttttttggaa ctcgaccaga cagacgtcag gctttctaag cctggactga 660
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gccgcgcggc cgctccttca ggcactgccg acgacagccc aggcggaggt cctgagcgcc 780
ggcgctaaat ttgcataaag aactacccag gagccctcgc gcgcggaaac gggcaaaaag 840
gggcttctaa tatggaaata ttacgccgaa tcgcgttaca aatcggctaa gcgggcctaa 900
gagttaacaa gatgtgctat taagcggagc cttttggtgg gaagaaatgg agtagtcact 960
gtgttctaaa agaacttgca gaatgagcct ttaaataccg cagtctcgat gctcttagtc 1020
tcttatttct tcggagacaa ttcaagagat tgtctccgaa gaaataagat ttttttggaa 1080
ctcgaccgaa gaaccgagcg ctgctggcct taaagtccca ccaaaactct gaagaaacga 1140
agccagaccc ggcactcagc gggcagcccg cgcctcccgc cgccccacag tgccgcgcgc 1200
gtgcatttgc atagcgcggt gctcgcaggg ggaaactcac cccctcaagt ccgccccccg 1260
cttcccgccc gctgtcccgc acctcatcag tgctgtgcgc tgtctgtgtc ccccagcacg 1320
cactctttgc tgttcttacc cggaggcttg ccctatcctt gaggtttcta ttttttaggc 1380
tataaatacc gcctaggagg tagagatatt cgcaattgag gagtgcctga ttcaagagat 1440
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tagtgaattc catggatatc aagcttaaac aagaatctct agttttcttt cttgctttta 1560
cttttacttc cttaatactc aagtacaatt ttaatggagt acttttttac ttttactcaa 1620
gtaagattct agccagatac ttttactttt aattgagtaa aattttccct aagtacttgt 1680
actttcactt gagtaaaatt tttgagtact ttttacacct ctg 1723
<210> 64
<211> 3459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pminiTol2
<400> 64
gggcgaattg ggcccagagg tgtaaagtac ttgagtaatt ttacttgatt actgtactta 60
agtattattt ttggggattt ttactttact tgagtacaat taaaaatcaa tacttttact 120
tttacttaat tacatttttt tagaaaaaaa agtacttttt actccttaca attttattta 180
cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc acttcattct attttccctt gctattacca 240
aaccaattga attgcgctga tgcccagttt aatttaaata gatctggcca tctagagcgg 300
ccgcgcgcac tagtgaattc catggatatc aagcttaaac aagaatctct agttttcttt 360
cttgctttta cttttacttc cttaatactc aagtacaatt ttaatggagt acttttttac 420
ttttactcaa gtaagattct agccagatac ttttactttt aattgagtaa aattttccct 480
aagtacttgt actttcactt gagtaaaatt tttgagtact ttttacacct ctgctcgacc 540
atatgggaga gctcccaacg cgttggatgc atagcttgag tattctatag tgtcacctaa 600
atagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 660
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 720
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 780
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 840
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 900
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 960
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ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1080
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1140
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1200
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1260
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1320
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1380
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1440
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1500
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1560
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1620
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1680
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 1740
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 1800
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 1860
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 1920
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1980
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2040
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2100
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2160
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2220
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2280
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2340
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2400
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2460
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2520
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2580
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2640
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 2700
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 2760
aagtgccacc tgatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 2820
aggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 2880
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 2940
agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 3000
ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 3060
cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 3120
gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 3180
aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca 3240
ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggctgcg 3300
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 3360
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taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactata 3459
<210> 65
<211> 5693
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCMV-Tol2
<400> 65
ggccgccacc atggaggaag tatgtgattc atcagcagct gcgagcagca cagtccaaaa 60
tcagccacag gatcaagagc acccgtggcc gtatcttcgc gaattctttt ctttaagtgg 120
tgtaaataaa gattcattca agatgaaatg tgtcctctgt ctcccgctta ataaagaaat 180
atcggccttc aaaagttcgc catcaaacct aaggaagcat attgagagaa tgcacccaaa 240
ttacctcaaa aactactcta aattgacagc acagaagaga aagatcggga cctccaccca 300
tgcttccagc agtaagcaac tgaaagttga ctcagttttc ccagtcaaac atgtgtctcc 360
agtcactgtg aacaaagcta tattaaggta catcattcaa ggacttcatc ctttcagcac 420
tgttgatctg ccatcattta aagagctgat tagtacactg cagcctggca tttctgtcat 480
tacaaggcct actttacgct ccaagatagc tgaagctgct ctgatcatga aacagaaagt 540
gactgctgcc atgagtgaag ttgaatggat tgcaaccaca acggattgtt ggactgcacg 600
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ttccgctgca cttgcctgca aaagattaat gggctctcat acttttgagg tactggccag 720
tgccatgaat gatatccact cagagtatga aatacgtgac aaggttgttt gcacaaccac 780
agacagtggt tccaacttta tgaaggcttt cagagttttt ggtgtggaaa acaatgatat 840
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attccagcta ccaaaacatc aaaagtgtgc ctgtcactta cttaacctag tctcaagcgt 1020
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ggctgttgac agaattcttc aaatttgcaa agaagcagga gaaggcgcac ttcggaatat 1260
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ggcctgtgtt tcagacacca gggagtctct gctcacgttt cctgctattt gcagcctctc 1800
tatcaagact aatacacctc ttcccgcatc ggctgcctgt gagaggcttt tcagcactgc 1860
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tctactgaag ttaaatctga ggttttacaa ctttgagtag actagtctga agggcgaatt 1980
ctgcagatat ccatcacact ggcggccgcg gggatccaga catgataaga tacattgatg 2040
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 2100
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 2160
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttcg gatcctctag 2220
agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 2280
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 2340
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 2400
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2460
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2520
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2580
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2640
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2700
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 2760
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 2820
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2880
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2940
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3000
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3060
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 3120
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ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3240
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3300
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3360
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3420
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3480
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 3540
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3600
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 3660
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 3720
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 3780
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 3840
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 3900
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 3960
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 4020
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 4080
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 4140
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 4200
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 4260
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4320
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 4380
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 4440
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 4500
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ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 4620
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cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca 4740
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 4800
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 4860
aaacgacggc cagtgaattc gagcttgcat gcctgcaggt cgttacataa cttacggtaa 4920
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ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 5040
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 5100
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 5160
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 5220
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 5280
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 5340
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 5400
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 5460
tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccggactct agaggatccg gtactcgagg 5520
aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag tttagtcttt ttgtctttta tttcaggtcc 5580
cggatccggt ggtggtgcaa atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct 5640
aggcctgtac ggaagtgtta cttctgctct aaaagctgcg gaattgtacc cgc 5693
Claims (73)
- 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체로서,상기 RNA 분자는, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 감소시키거나, 동물세포에서의 감염성 인플루엔자 A 바이러스 입자의 생산을 감소시키거나, 및/또는 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 하기 서열들로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체:(i) 서열번호 1의 2240 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;(ii) 서열번호 2의 2257 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;(iii) 서열번호 3의 2087 - 2233 위치내에 있는 뉴클레오티드;(iv) 서열번호 4의 1484 - 1565 위치내에 있는 뉴클레오티드;(v) 서열번호 6 내지 15 또는 52 내지 54 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열;(vi) (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열;(vii) 엄격 조건하에서 (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 혼성화되는 뉴클레오티 드 서열.
- 제2항에 있어서, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 감소시키는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제2항에 있어서, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스 입자의 생산을 감소시키는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제2항에 있어서, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 인플루엔자 A로 감염된 동물 세포에서의 인플루엔자 A 바이러스 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 19개 이상의 염기쌍 길이인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 100개 미만의 염기쌍 길이인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자가 짧은 헤어핀 RNA인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 분자에 의해 코딩되는 이중 가닥 영역이 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 구조체가 2개 이상의 RNA 분자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제16항에 있어서, 각 RNA 분자가 상이한 인플루엔자 A 바이러스 유전자에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 각 RNA 분자가 RNA 중합효소 II 프로모터 또는 RNA 중합효소 III 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제18항에 있어서, 상기 프로모터가 RNA 중합효소 III 프로모터인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 프로모터가 닭, 칠면조 및/또는 오리의 프로모터인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 프로모터가 U6, 7SK 및/또는 H1 프로모터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제21항에 있어서, 상기 U6 프로모터가 cU6-1, cU6- 2, cU6-3 및/또는 cU6-4인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한항에 있어서, RNA 분자를 코딩하는 각 뉴클레오티드 서열이 상이한 RNA 중합효소 III 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드가 PBl, PB2, PA, NP 및/또는 M1 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드가 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열에 의해 코딩된 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 조류 인플루엔자 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제26항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자가 H5N1인 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한항에 있어서, 상기 구조체가 닭 및 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한항에 있어서, 이중 가닥 영역을 포함하는 3개의 RNA 분자를 코딩하며, 상기 이중 가닥 영역이 하기 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체:(i) 서열번호 9, 서열번호 13 및 서열번호 15,(ii) 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 및(iii) 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 12.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한항에 있어서, 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 이중 가닥 영역을 포함하는 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자로서,상기 이중 가닥 영역이 하기 뉴클레오티드들로부터 선택되는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자:(i) 서열번호 1의 2240 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;(ii) 서열번호 2의 2257 - 2341 위치내에 있는 뉴클레오티드;(iii) 서열번호 3의 2087 - 2233 위치내에 있는 뉴클레오티드;(iv) 서열번호 4의 1484 - 1565 위치내에 있는 뉴클레오티드;(v) 서열번호 6 내지 15 또는 52 내지 54 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열;(vi) (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열;(vii) 엄격 조건하에서 (i) 내지 (v) 중 어느 하나와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열.
- 제31항에 있어서, 상기 핵산 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 세포에 비해, 동물세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 핵산 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 세포에 비해, 동물세포에서의 감염성 인플루엔자 A 바이러스의 입자 생산을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산 분자가, 동종동계의 인플루엔자 A 바이러스 감염되었으나 상기 핵산 분자가 없는 세포에 비해, 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 동물세포에서의 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자가, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나에 의해 코딩되는 인플루엔자 A 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 19개 이상의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 100개 미만의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제37항 중 어느 한항에 있어서, 상기 분자가 이중 가닥 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제38항 중 어느 한항에 있어서, 짧은 간섭(interfering) RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제31항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서, 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체 및/또는 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산, 및/또는 제41항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
- 제42항에 있어서, 닭의 원시 생식 세포(primordial germ cell)인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산, 제41항에 따른 벡터, 및/또는 제42항 또는 제43항에 따른 세포를 포함하는 비-인간 형질전환 유기체.
- 제44항에 있어서, 비-인간 동물인 것을 특징으로 하는 형질전환 유기체.
- 제45항에 있어서, 조류인 것을 특징으로 하는 형질전환 유기체.
- 제46항에 있어서, 가금류인 것을 특징으로 하는 형질전환 유기체.
- 제47항에 있어서, 닭, 칠면조 또는 오리인 것을 특징으로 하는 형질전환 유기체.
- 제44항 내지 제48항 중 어느 한항에 있어서, 서열번호 16 -21 및 61-63 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 또는 서열번호 16 - 21 및 61 - 63 중 에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함하며, 하나 이상의 RNA 분자가 이중 가닥 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 유기체.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산, 제41항에 따른 벡터, 및/또는 제42항 또는 제43항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
- 개체에게, 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산, 제41항에 따른 벡터, 및/또는 제42항 또는 제43항에 따른 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 방법이 핵산 구조체, 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포를 음용수나 에어로졸로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스가 조류 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항 내지 제53항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 조류인 것을 특징 으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 개체가 가금류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 개체가 닭, 칠면조 또는 오리인 것을 특징으로 하는 방법.
- 세포에 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
- 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산, 제41항에 따른 벡터, 및/또는 제42항 또는 제43항에 따른 세포의 용도.
- 동물로부터 수득한 샘플에서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 및/또는 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리된 및/또는 외인성 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체, 및/또는 제31항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 분리 된 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 동물을 동정하는 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 방법이 핵산 구조체나 이의 단편, 또는 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자 또는 이의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 방법이동물로부터 수득한 샘플을, 엄격 조건 하에서 핵산 구조체나 분리된 및/또는 외인성 핵산 분자와 혼성화하는 프로브와 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 단계, 및상기 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 인플루엔자에 대한 내성을 가진 비-인간 형질전환 동물의 육종 방법으로서,(i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체를 비-인간 동물 세포에 도입하는 단계,(ii) 상기 핵산 구조체를 포함하는 비-인간 형질전환 세포를 선별하는 단계,(iii) 상기 비-인간 형질전환 세포로부터 비-인간 형질전환 동물을 재생하는 단계,(iv) 상기 비-인간 형질전환 동물을 육종시켜, 형질전환 자손을 생산하는 단계, 및(v) 인플루엔자에 내성을 보이는 상기 형질전환 자손을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 식품의 제조 방법으로서,(i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 핵산 구조체를 동물 세포에 도입하는 단계,(ii) 상기 핵산 구조체를 포함하는 형질전환 세포를 선별하는 단계,(iii) 상기 형질전환 세포로부터 형질전환 동물을 재생하는 단계,(iv) 상기 형질전환 동물을 육종시켜, 형질전환 자손을 생산하는 단계, 및(v) 상기 형질전환 자손으로부터 식품을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 비-인간 형질전환 동물의 제조 방법으로서,(i) 이중 가닥 RNA 분자를 코딩하며 트랜스포존(transposon)을 포함하는 제1 핵산을, 세포에 도입하는 단계,(ii) 트랜스포자제(transposase)를 코딩하는 제2 핵산을 상기 세포에 도입하는 단계,(ii) 상기 세포의 게놈에 상기 제1 핵산을 포함하고 있는 형질전환 세포를 선별하는 단계,(iii) 상기 세포로부터 비-인간 형질전환 동물을 재생하는 단계, 및(iv) 상기 비-인간 형질전환 동물을 육종하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존이고, 트랜스포자제는 Tol2 트랜스포자제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 세포가 닭의 원시 생식 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 인플루엔자에 대해 내성을 가진 비-인간 형질전환 동물.
- 제67항에 있어서, 상기 형질전환 동물이 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 인플루엔자 바이러스의 복제를 감소시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
- 제67항에 있어서, 상기 형질전환 동물이 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 동물 세포에서의 인플루엔자 바이러스 입자의 생산을 감소시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
- 제67항에 있어서, 상기 형질전환 동물이 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 핵산 구조체를 포함하며, 상기 RNA 분자가, 동종동계의 인플루엔자 바이러스로 감염되었으나 상기 RNA 분자가 없는 동물 세포에 비해, 인플루엔자 바이러스로 감염된 동물 세포에서 인플루엔자 바이러스의 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
- 제67항 내지 제70항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-인간 형질전환 동물이 닭이고, 상기 인플루엔자가 인플루엔자 A인 것을 특징으로 하는 방법.
- 육종에 있어서의, 제44항 내지 제49항 중 어느 한항에 따른 비-인간 형질전환 유기체 또는 제67항 내지 제71항 중 어느 한항에 따른 비-인간 형질전환 동물의 용도.
- 식품 제조에 있어서의, 제44항 내지 제49항 중 어느 한항에 따른 비-인간 형질전환 유기체 또는 제67항 내지 제71항 중 어느 한항에 따른 비-인간 형질전환 동물의 용도.
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