EA017948B1 - Лечение и профилактика гриппа - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим двунитевую область, и конструкциям нуклеиновых кислот, кодирующим их, которые можно использовать для лечения и/или профилактики гриппа. В частности, настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, кодирующим молекулу(ы) двунитевой РНК, которые могут использоваться для получения трансгенной домашней птицы, например кур, так, чтобы они были, по меньшей мере, менее восприимчивы к инфекции птичьего гриппа. Представляются также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие двунитевую область, которая может использоваться в качестве терапевтического средства для лечения и/или профилактики, например, птичьего гриппа у домашней птицы.

Description

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим двунитевую область, и конструкциям нуклеиновых кислот, кодирующим их, которые можно использовать для лечения и/или профилактики гриппа. В частности, настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, кодирующим молекулу(ы) двунитевой РНК, которые могут использоваться для получения трансгенных животных, например цыплят, которые, по меньшей мере, менее восприимчивы к инфекции птичьего гриппа. Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим двунитевые области, которые могут использоваться в качестве терапевтических средств для лечения и/или профилактики, например, птичьего гриппа у домашней птицы.

Предшествующий уровень техники

Известны три типа вируса гриппа, типы А, В и С, и они относятся к семейству оболочечных вирусов, содержащих однонитевую отрицательную цепь РНК, называемых Ог11тотухоутбас. Длина вирусного генома составляет приблизительно от 12000 до 15000 нуклеотидов и содержит 8 сегментов РНК (7 у типа С), которые кодируют 11 белков.

Вирус гриппа А инфицирует многих животных, таких как свиньи, лошади, морские животные и птицы, а также людей (Мсйокои с1 а1., 2005). Его природным резервуаром являются водоплавающие птицы, и у птиц большинство инфекций вирусом гриппа вызывает легкие локализованные инфекции дыхательных путей и кишечного тракта. Однако вирус может быть высокопатогенным для домашней птицы, вызывая внезапные вспышки с высоким процентом смертности в популяции пораженной домашней птицы.

Вирусы гриппа А можно классифицировать на подтипы на основании аллельных изменений в антигенных областях двух генов, которые кодируют поверхностные гликопротеиды, а именно гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ), которые необходимы для прикрепления вируса и выхода из клеток. Другие основные вирусные белки включают нуклеопротеин, нуклеокапсидный структурный белок, матричные белки (М1 и М2), полимеразы (РА, РВ1 и РВ2) и неструктурные белки (N81 и N82).

У вируса гриппа А известны по меньшей мере 16 подтипов НА (Н1-Н16) и 9 ΝΑ (Ν1-Ν9) антигенных вариантов. Штаммы вируса птичьего гриппа могут также характеризоваться как низкопатогенные и высокопатогенные штаммы. Низкопатогенные штаммы обычно имеют только две основные аминокислоты в положениях -1 и -3 сайта расщепления предшественника НА, тогда как высокопатогенные штаммы имеют многоосновный сайт расщепления. Подтипы Н5 и Н7 могут вызвать высокопатогенные инфекции у домашней птицы, и было показано, что определенные подтипы преодолевают видовые барьеры и становятся инфекционными для людей. Высокопатогенные вирусы Н5 и Н7 могут также возникать из низкопатогенных предшественников у домашней птицы. Симптомы инфекции птичьего гриппа проявляются в диапазоне от обычных симптомов гриппа (лихорадка, кашель, боль в горле и мышечные боли) до конъюнктивита, пневмонии, острой дыхательной недостаточности и других угрожающих жизни осложнений.

Существует необходимость в разработке способов контроля существования и/или репликации вируса гриппа у животных, таких как домашняя птица, не только для повышения продуктивности и благополучия животных в промышленном животноводстве, но также для снижения рисков для здоровья людей.

Краткое описание сущности изобретения

Авторы идентифицировали молекулы нуклеиновых кислот, содержащие двунитевые области, которые способны снизить репликацию и/или продукцию вируса гриппа в инфицированных клетках животных.

Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу РНК, содержащую двунитевую область, где молекула РНК снижает репликацию вируса гриппа А в клетке животного и/или снижает продукцию инфекционных частиц вируса гриппа А в клетке животного и/или снижает экспрессию полипептида вируса гриппа А в клетке животного, инфицированной вирусом гриппа А, по сравнению с изогенной клеткой животного, инфицированной вирусом гриппа А, не имеющей молекулы РНК.

Предпочтительно двунитевая область содержит нуклеотидную последовательность нуклеотидов, выбранных из (ί) нуклеотидов в положениях от 2240 до 2341 последовательности 8Еф ΙΌ ΝΟ: 1, (ίί) нуклеотидов в положениях от 2257 до 2341 последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, (ш) нуклеотидов в положениях от 2087 до 2233 последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, (ίν) нуклеотидов в положениях от 1484 до 1565 последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, (ν) нуклеотидной последовательности любой из последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6-15, или 52-54, (νί) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из (ί)-(ν), (νίί) нуклеотидной последовательности, которая гибридизируется с любой из (ί)-(ν) в жестких условиях.

В одном из вариантов осуществления молекула РНК снижает репликацию вируса гриппа А в клетке животного по сравнению с изогенной клеткой животного, инфицированной вирусом гриппа А, не имею

- 1 017948 щей молекулы РНК. В другом варианте осуществления молекула РНК снижает продукцию инфекционных частиц вируса гриппа А в клетке животного по сравнению с изогенной клеткой животного, инфицированной вирусом гриппа А, не имеющей молекулы РНК. В еще одном варианте осуществления молекула РНК снижает экспрессию полипептида вируса гриппа А в клетке животного, инфицированной вирусом гриппа А, по сравнению с изогенной инфицированной клеткой животного, не имеющей молекулы РНК.

Предпочтительно вирус гриппа А представляет собой вирус птичьего гриппа.

Конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может кодировать любой тип молекулы РНК, содержащей двунитевую область. Предпочтительно длина двунитевой области составляет по меньшей мере 19 п.о. Также предпочтительно длина двунитевой области составляет менее чем 100 п.о.

В особенно предпочтительном варианте осуществления кодированная молекула РНК представляет собой короткую РНК-шпильку (8ЙРНК).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8ЕО Ш N0: 7.

В другом предпочтительном варианте осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 9.

В другом предпочтительном варианте осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 12.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 6.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 8.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 13.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления двунитевая область, кодируемая молекулой РНК, содержит последовательность нуклеотидов 8Е0 Ш N0: 15.

В некоторых случаях может быть желательно, чтобы конструкция нуклеиновой кислоты кодировала более одной молекулы РНК, например 2, 3, 4, 5 или более молекул РНК. Соответственно, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, которая кодирует две или более молекул РНК. Кодируемые молекулы РНК могут быть различными, или одинаковыми, или представлять собой их комбинацию. Кроме того, кодируемые молекулы РНК могут нацеливаться на одинаковые или различные гены вируса гриппа А или на их комбинацию. В одном из вариантов осуществления каждая молекула РНК содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую другому гену вируса гриппа А.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, где каждая молекула РНК кодируется нуклеотидной последовательностью, функционально связанной с промотором РНК полимеразы II или с промотором РНК полимеразы III. В предпочтительном варианте осуществления промоторы представляют собой промоторы РНК полимеразы III.

В некоторых случаях может быть желательно, чтобы последовательность промотора была такой же, как природная последовательность промотора животного и/или клетки, или ее потомства, в которую переносится/трансформируется конструкция нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой куриный, индюшачий и/или утиный промотор.

Предпочтительно промотор выбран из промотора И6, 78К и/или Н1.

В одном из конкретных вариантов осуществления промотор И6 представляет собой сИ6-1, сИ6-2, Сиб-3 и/или сИ6-4.

В еще одном конкретном варианте осуществления промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из любой последовательности 8Е0 Ш N0: 22-25.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что конструкции нуклеиновых кислот, содержащие промоторы И6, содержащие минимальное количество последовательности промотора, требуемое для индукции транскрипции 8ЙРНК, были по меньшей мере также эффективны при транскрибировании 8ЙРНК, как и конструкции, содержащие промоторы И6, с дополнительными 100 п.о. последовательности, находящейся выше по ходу транскрипции. Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретения промотор состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной их любой последовательности 5ЕО ГО N0: 22-25.

В еще одном варианте осуществления каждая нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу РНК, функционально связана с другим промотором РНК полимеразы III.

В одном из вариантов осуществления молекула РНК снижает экспрессию полипептида вируса гриппа А, кодируемого любой последовательностью 8Е0 Ш N0: 1-5.

В одном из конкретных вариантов осуществления полипептид вируса гриппа А может быть выбран из РВ1, РВ2, РА, № и/или М1. Предпочтительно полипептид представляет собой полипептид вируса птичьего гриппа.

В одном из вариантов осуществления штамм птичьего гриппа представляет собой высокопатогенный штамм.

- 2 017948

Предпочтительно вирус птичьего гриппа представляет собой Η5Ν1.

В другом варианте осуществления конструкция содержит только последовательности вируса гриппа А и природные последовательности животного-хозяина. Например, если конструкция сконструирована для трансфекции курице, то конструкция нуклеиновой кислоты желательно должна состоять из последовательностей кур и вируса гриппа А. Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, где конструкция состоит из нуклеотидных последовательностей кур и вируса гриппа А.

В предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует 3 молекулы РНК, содержащие двунитевую область, где двухнитевые области содержат нуклеотидные последовательности, выбранные из (1) 8 ЕС) ГО N0: 9, 8ЕС) ГО N0: 13 и 8ЕС) ГО N0: 15, (ίί) 8ЕС) ГО N0: 6, 8ЕС) ГО N0: 7 и 8ЕС) ГО N0: 8, (ίίί) 8ЕС) ΙΌ N0: 7, 8ЕС) ΙΌ N0: 9 и 8ЕС) ГО N0: 12.

В другом предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 16-21 и 61-63 или их фрагментов, или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 16-21 и 61-63. Предпочтительно фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, лишенную 100 нуклеотидов или менее с и/или 3'-конца последовательности, и/или 3'-конца последовательности, и/или 3'-конца последовательности, и/или 3'-конца последовательности.

5'-конца

5'-конца

5'-конца

5'-конца еще более предпочтительно 50 нуклеотидов или менее с еще более предпочтительно 20 нуклеотидов или менее с еще более предпочтительно 10 нуклеотидов или менее с

Настоящее изобретение, кроме того, относится к выделенной и/или экзогенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей двунитевую область, где двунитевая область содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из (ί) нуклеотидов в положениях от 2240 до 2341 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, (ίί) нуклеотидов в положениях от 2257 до 2341 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, (ίίί) нуклеотидов в положениях от 2087 до 2233 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3, (ίν) нуклеотидов в положениях от 1484 до 1565 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, (ν) нуклеотидной последовательности любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 6-15 или 52-54, (νί) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из (ί)-(ν), (νίί) нуклеотидной последовательности, которая гибридизируется с любой из (ί)-(ν) в жестких условиях.

В одном из вариантов осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты снижает репликацию вируса гриппа А в клетке животного по сравнению с изогенной инфицированной вирусом гриппа А клеткой животного, не содержащей молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты снижает продукцию инфекционных частиц вируса гриппа А в клетке животного по сравнению с изогенной клеткой животного, инфицированной вирусом гриппа А, не содержащей молекулы нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты снижает экспрессию полипептида вируса гриппа А в клетке животного, инфицированной вирусом гриппа А, по сравнению с изогенной, инфицированной вирусом гриппа А клеткой животного, не содержащей молекулы нуклеиновой кислоты.

В другом варианте осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению снижает экспрессию полипептида вируса гриппа А, кодируемого любой последовательностью 8ЕС) ГО N0: 1-5.

Предпочтительно, длина двунитевой области выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 19 п.о. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно длина двунитевой области составляет менее 100 п.о.

В одном из вариантов осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты содержит двунитевую РНК.

Предпочтительно выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой интерферирующую короткую РНК или короткую РНК-шпильку.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 16-21 и 61-63 или их фрагментов, или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 16-21 и 61-63. Предпочтительно фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, лишенную 100 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или 3'-конца последовательности, еще более предпочтительно 50 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или 3'-конца последовательности, еще более предпочтительно 20 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или 3'-конца последовательности, еще более предпочтительно 10 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или 3'-конца последовательности.

- 3 017948

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты и/или выделенная и/или экзогенная молекула нуклеиновой кислоты присутствует в геноме клетки.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к вектору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, и/или к выделенной, и/или экзогенной молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к клетке, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, выделенную и/или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор по изобретению.

В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой примордиальную зародышевую клетку, например куриную примордиальную зародышевую клетку.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к трансгенному организму, не являющемуся организмом человека, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, выделенную и/или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку по изобретению. Трансгенный организм может представлять собой любой организм, например животное или растение.

В одном из вариантов осуществления трансгенный организм представляет собой животное, исключая человека.

В другом варианте осуществления трансгенный организм представляет собой птицу. В предпочтительном варианте осуществления трансгенный организм представляет собой домашнюю птицу. В еще более предпочтительном варианте осуществления трансгенный организм представляет собой курицу, индюшку или утку.

В одном из вариантов осуществления трансгенный организм по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей 8ЕО ГО N0: 16-21 и 61-63 или их фрагментов, или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательностей 8Е0 ГО N0: 16-21 и 61-63, кодирующей по меньшей мере одну молекулу РНК, содержащую двунитевую область. Фрагменты и/или последовательности, тесно связанные с последовательностями 8Е0 ГО N0: 16-21 и 61-63, охватываются этим вариантом осуществления, поскольку 5'-области и/или З'-области конструкции могут быть утрачены при интеграции в геном организма, и/или небольшие мутации во время клеточного деления по многим поколениям могут привести к одному или нескольким различиям нуклеотидов по сравнению с первоначальной конструкцией. Предпочтительно фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, лишенную 100 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или З'-конца последовательности, еще более предпочтительно 50 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или З'-конца последовательности, еще более предпочтительно 20 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или З'-конца последовательности, еще более предпочтительно 10 нуклеотидов или менее с 5'-конца и/или З'-конца последовательности.

В еще одном варианте осуществления трансгенный организм содержит две или более конструкции нуклеиновых кислот по изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к композиции, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, выделенную и/или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, вектор по изобретению, клетку по изобретению и/или молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.

Конструкции нуклеиновых кислот, выделенные и/или экзогенные молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева по изобретению могут использоваться для лечения и/или профилактики инфекции индивида вирусом гриппа А. Например, конструкции нуклеиновых кислот, выделенные и/или экзогенные молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева могут использоваться для защиты домашней птицы, такой как, но ими не ограничиваясь, курица, индюшка или утка, от птичьего гриппа. Кроме того, в случае локализованной вспышки птичьего гриппа в популяции птиц, может быть желательной защита от инфекции птиц в окружающих областях, например, на прилегающих фермах, для усиления сдерживания вспышки птичьего гриппа.

Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или профилактики инфекции индивида вирусом гриппа А, причем способ включает введение индивиду конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора по изобретению и/или клетки по изобретению.

В одном из вариантов осуществления способ включает введение конструкции нуклеиновой кислоты, выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки в питьевой воде или аэрозоле.

В одном из конкретных вариантов осуществления вирус гриппа А представляет собой вирус птичьего гриппа.

Предпочтительно вирус птичьего гриппа относится к высокопатогенному штамму.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления вирус птичьего гриппа представляет собой вирус штамма Η5Ν1.

Предпочтительно индивидом является птица, предпочтительно домашняя птица. В наиболее предпочтительном варианте осуществления индивидом является курица, индюшка или утка.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу снижения экспрессии одного или не

- 4 017948 скольких генов вируса гриппа А в клетке, причем способ включает введение в клетку выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора по изобретению, и/или клетки по изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики инфекции вирусом гриппа А.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации животного, содержащего конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению и/или выделенную и/или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, причем способ включает определение присутствия или отсутствия конструкции по изобретению или выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в образце, полученном у животного.

В одном из вариантов осуществления способ включает амплификацию конструкции нуклеиновой кислоты или ее фрагмента или выделенной и/или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагмента.

В другом варианте осуществления способ включает приведение образца, взятого у животного, в контакт с зондом, который гибридизируется в жестких условиях с конструкцией нуклеиновой кислоты или с выделенной и/или экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты с образованием комплекса, и определение присутствия или отсутствия комплекса.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу выведения устойчивого к гриппу трансгенного животного, исключая человека, причем способ включает:

(ί) введение конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению в клетку животного, исключая человека, (ίί) выбор трансгенной клетки, не являющейся клеткой человека, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, (ш) регенерацию трансгенного животного, исключая человека, из трансгенной клетки, не являющейся клеткой человека, (ίν) выведение трансгенного животного, исключая человека, для получения трансгенного потомства и (ν) отбор трансгенного потомства, которое устойчиво к гриппу.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения пищевого продукта, причем способ включает:

(ί) введение конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению в клетку животного, (ίί) выбор трансгенной клетки, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, (ίίί) регенерацию трансгенного животного из трансгенной клетки, (ίν) выведение трансгенного животного для получения трансгенного потомства и (ν) получение пищевого продукта из трансгенного потомства.

В одном из вариантов осуществления пищевой продукт выбран из мяса и яиц.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения устойчивого к гриппу трансгенного животного, исключая человека, включающему:

(ί) введение в клетку первой нуклеиновой кислоты, содержащей транспозон, где нуклеиновая кислота кодирует молекулу двунитевой РНК, (ίί) введение в клетку второй нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, (ίί) выбор трансгенной клетки, содержащей первую нуклеиновую кислоту в геноме клетки, (ίίί) регенерацию трансгенного животного, исключая человека, из клетки и (ίν) выведение трансгенного животного, исключая человека.

Первая и вторая нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку на одну молекулу нуклеиновой кислоты или, альтернативно, могут быть введены в клетку на отдельные молекулы нуклеиновой кислоты. Предпочтительно первая и вторая нуклеиновые кислоты вводят в клетку на отдельные молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления транспозон представляет собой транспозон То12, а транпозаза представляет собой транспозазу То12.

В еще одном варианте осуществления клетка представляет собой куриную примордиальную зародышевую клетку.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к резистентному к гриппу трансгенному животному, исключая человека.

В одном из вариантов осуществления трансгенное животное содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу РНК, содержащую двунитевую область, где молекула РНК снижает репликацию вируса гриппа в клетке животного по сравнению с инфицированной вирусом гриппа изогенной клеткой животного, не содержащей молекулы РНК.

В другом варианте осуществления трансгенное животное содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу РНК, содержащую двунитевую область, где молекула РНК снижает продукцию частиц вируса гриппа в клетке животного по сравнению с инфицированной вирусом гриппа изо

- 5 017948 генной клеткой животного, не содержащей молекулу РНК.

В другом варианте осуществления трансгенное животное содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу РНК, содержащую двунитевую область, где молекула РНК снижает экспрессию полипептида в инфицированной вирусом гриппа клетке по сравнению с инфицированной вирусом гриппа изогенной клеткой животного, не содержащей молекулу РНК.

В еще одном из вариантов осуществления трансгенное животное, исключая человека, представляет собой курицу, а грипп представляет собой грипп А.

Предпочтительно трансгенный организм, исключая человека, содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, выделенную или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, вектор по изобретению и/или клетку по изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению трансгенного животного, исключая человека, по изобретению или трансгенного организма, исключая человека, по изобретению для выведе ния.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению трансгенного животного, исключая человека, по изобретению или трансгенного организма, исключая человека, по изобретению для получения пищевого продукта.

Очевидно, что предпочтительные признаки и характеристики одного из аспектов изобретения могут использоваться в большом числе других аспектов изобретения.

В настоящем описании слово содержать или его варианты, такие как содержит или содержащий означает включение указанных элементов, целых чисел или стадий или групп элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или групп элементов, целых чисел или стадий.

Изобретение ниже описано путем следующих неограничивающих примеров со ссылкой на сопровождающие чертежи.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - РСК для кассет для экспрессии кйРНК. Схематическое представление стратегии РСК, используемой для получения векторов экспрессии кйРНК. В РСК использовались прямые праймеры, спаренные с обратными праймерами, содержащими все компоненты кйРНК. Все конечные продукты РСК состояли из куриного промотора иб или 78К, смысловой кйРНК, петли, антисмысловой кйРНК, концевой последовательности и сайта Х1юЕ

Фиг. 2 - конструкция трансгена М\УН-1. А - отдельные единицы транскрипции были получены с использованием подхода с использованием РСК в один этап. Продукты РСК содержат куриный промотор ροϊ III и компоненты кйРНК (смысловую, петельную, антисмысловую и концевую последовательности). В - эти три транскрипционные единицы лигировались вместе с использованием совместимых сайтов 8аП и ΧΙιοΙ на 5'-конце и З'-конце продуктов РСК. С - конечный трансген содержит 3 транскрипционные единицы, которые экспрессируют 3 отдельных кйРНК к целевым генам вируса гриппа А.

Фиг. 3 - плазмидная карта ρδΙιιΓΓίΙ (6151 п.о.). На карте имеют метку и заштрихованы 4 клонированных области куриного генома. Указаны сайты рестрикции клонирования, а также другие релевантные сайты рестрикции. Трансгены М\УН вставлены в необычный сайт ЕсоК1, расположенный между МЕ1 200 и ОКМ5 200. Сайты фермента ΗίηάΙΙΙ р1С20Н могут использоваться для эксцизии всех трансгенов М\УН. включая заполняющую/буферную фланкирующую последовательность в виде одиночного фрагмента для вставки в геном курицы.

Фиг. 4 - контрольное заражение вирусом гриппа трансгенных мышей. А - изменение массы в % у мышей, экспрессирующих кйХР-1496, в сравнении с мышами, экспрессирующими кйЕОЕР. В - относительная вирусная экспрессия гена у мышей, экспрессирующих кйЫР-1496, в сравнении с мышами, экспрессирующими кйЕОЕР.

	Указатель к списку последовательностей
8ЕО ΙΌ N0: 1 8ЕО ΙΌ N0: 2 8ЕО ΙΌ N0: 3 8ЕО ΙΌ N0: 4 8ЕО ΙΌ N0: 5	консенсусная нуклеотидная последовательность гена РВ2 вируса гриппа А. консенсусная нуклеотидная последовательность гена РВ1 вируса гриппа А. консенсусная нуклеотидная последовательность гена РА вируса гриппа А. консенсусная нуклеотидная последовательность гена ИР вируса гриппа А. консенсусная нуклеотидная последовательность гена М1 вируса гриппа А.

8ЕО ΙΌ N0: 6-15 - нуклеотидная последовательность молекул нуклеиновой кислоты, которые нацелены на гены вируса гриппа А и/или кодируемую ими мРНК.

8Е0 ΙΌ N0: 16 - нуклеотидная последовательность М\УН1 и последовательности наполнителей. Наполнитель 5' (нуклеотиды 1-1748); СИ6-3 8ЙМР-592 (нуклеотиды 1759-2234); си6-1 511РЛ-2087 (нуклеотиды 2235-2622); СИ6-4 5ШР-1496 (нуклеотиды 2623-2974); наполнитель 3' (нуклеотиды 2985-4745).

8Е0 ΙΌ N0: 17 - нуклеотидная последовательность М\УН2 и последовательности наполнителей. Наполнитель 5' (нуклеотиды 1-1748); СИ6-4 8ЙРВ1-2257 (нуклеотиды 1774-2125); си6-1 8ЙРВ2-2240 (нуклеотиды 2126-2513); е78К 8ЙРВ1-129 (нуклеотиды 2514-2911); наполнитель 3' (нуклеотиды.29364696).

8Е0 ΙΌ N0: 18 - нуклеотидная последовательность М\УН3 и последовательности наполнителей.

- 6 017948

Наполнитель 5' (нуклеотиды 1-1748); СИ6-4 511ΝΡ-1484 (нуклеотиды 1774-2129); сИб-1 кйРА-2087 (нуклеотиды 2130-2517); с7ЗК кйРВ1-2257 (нуклеотиды 2518-2917); наполнитель 3' (нуклеотиды 2947-4702).

8ЕО Ш N0: 19 - нуклеотидная последовательность М\УН1.

8Е0 Ш N0: 20 - нуклеотидная последовательность М\УН2.

8Е0 Ш N0: 21 - нуклеотидная последовательность М\УН3.

8Е0 Ш N0: 22 - нуклеотидная последовательность куриного промотора иб-1 (сИ6-1).

8Е0 Ш N0: 23 - нуклеотидная последовательность куриного промотора иб-3 (сИ6-3).

8Е0 Ш N0: 24 - нуклеотидная последовательность куриного промотора иб-4 (сИ6-4).

8Е0 Ш N0: 25 - нуклеотидная последовательность куриного промотора 7ЗК.

8Е0 Ш N0: 26-51 - олигонуклеотидные праймеры.

8Е0 Ш N0: 52-54 - нуклеотидные последовательности молекул нуклеиновой кислоты, которые нацелены на гены вируса гриппа А, и/или мРНК, кодируемую ими.

8Е0 Ш N0: 55-60 - олигонуклеотидные праймеры.

8Е0 Ш N0: 61 - нуклеотидная последовательность М\УН4.

8Е0 Ш N0: 62 - нуклеотидная последовательность М\УН3 и транспозона То12.

8Е0 Ш N0: 63 - нуклеотидная последовательность М\УН4 и транспозона То12.

Подробное описание изобретения

Общие методики и выбранные определения.

Если нет конкретных указаний, то все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, которые понятны среднему специалисту в данной области (например, в области клеточных культур, молекулярной генетики, вирусологии, иммунологии, иммуногистохимии, белковой химии и биохимии).

Если нет конкретных указаний, то методики молекулярной биологии, вирусологии, клеточной культуры и иммунологии, используемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данной области. Такие методики описаны и объяснены в литературе в таких источниках, как 1. РетЬа1, А Ртасбса1 Ошбе Ю Мо1еси1аг СЗошпд. бо1т \УПсу апб Зопк (1984), 1. ЗашЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬоиг ЬаЬота1огу Ргекк (1989), Т.А. Вго\\п (ебйот), Еккепба1 Мо1еси1аг Вю1оду: А Ртасбса1 Арртоасй, Уо1ишек 1 апб 2, ШЬ Ргекк (1991), Э.М. 01оует апб Β.Ό. Натек (ебйотк), ^NА С1ошпд: А Ртасбса1 Арртоасй, Уо1ишек 1-4, 1ЯЬ Ргекк (1995 апб 1996), апб Е.М. АикиЬе1 е! а1. (ебйотк), Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Отеепе РиЬ. Аккоаа1ек апб \УПеу-1п1егкс1епсе (1988, включая все усовершенствования до настоящего времени), Еб Наботе апб Эау|б Ьапе (ебйотк) АпбЬоб1ек: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬоиг ЬаЬога1огу, (1988), апб ЕЕ. Со1фап е! а1. (ебйотк) Сиггеп! Рго!осо1к ш 1шшипо1оду, 1ойп \УПеу & Зопк (включая все усовершенствования до настоящего времени) и включены в настоящее описание путем ссылки.

Используемые в настоящем описании термины лечение, лечить или обработка включают введение терапевтически эффективного количества конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, клетки и/или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, достаточного для снижения или устранения по меньшей мере одного симптома инфекции вирусом гриппа А, в частности инфекции вирусом птичьего гриппа.

Термин профилактика относится к защите индивида, подвергающегося воздействию вируса гриппа А, от развития по меньшей мере одного симптома инфекции вирусом гриппа А, или снижения тяжести симптома инфекции у индивида, подвергающегося воздействию вируса гриппа А.

Как используется в настоящем изобретении, у животного, резистентного к вирусному патогену, отмечают уменьшение или отсутствие симптомов заболевания по сравнению с восприимчивым животным, при воздействии вирусного патогена, например при воздействии вируса гриппа.

Используемый в настоящем описании термин птичий относится к любому виду, подвиду или породе организма таксономического класса Ауек (птицы), такие как, но ими не ограничиваясь, курица, индюшка, утка, гусь, перепел, фазаны, попугаи, вьюрки, соколы, вороны и бескилевые птицы, включая страуса, эму и казуара. Этот термин включает различные известные линии 6а11ик да11ик (куры), например белые леггорны, коричневые леггорны, полосатые, сассекские, ньюхэмпширские, родайлендские, австралорпские, корнишские, миноркские, амрокские, калифорнийские серые, итальянские оранжевые, а также линии индюшек, фазанов, перепелов, уток, страусов и другой домашней птицы, разводимой в промышленных количествах.

Термин домашняя птица включат всех птиц, содержащихся, разводимых или одомашненных для получения мяса или яиц, например кур, индюшек, страусов, диких кур, голубей, цесарок, фазанов, перепелов, уток, гусей и эму.

Используемый в настоящем описании термин вирус птичьего гриппа относится к любому вирусу гриппа А, который может инфицировать птиц. Примеры вирусов птичьего гриппа включают, но ими не ограничиваются, любые один или несколько из подтипов Н1-Н16 и №-N9 и включают высокопатогенные и низкопатогенные штаммы. В одном из вариантов осуществления вирус птичьего гриппа относится к подтипу Н5. В другом варианте осуществления вирус птичьего гриппа относится к подтипу Н7. В другом варианте осуществления вирус птичьего гриппа относится к подтипу Н5N1.

- 7 017948

Термин полипептид вируса гриппа А относится к любому белку, который кодируется геном вируса гриппа А, например РВ1, РВ1-Е2, РВ2, полимеразе РА (РА), гемагглютинину (НА), нуклеокапсидному белку (ΝΡ), нейраминидазе (ΝΑ), матричному белку 1 (М1), матричному белку 2 (М2), неструктурному белку 1 (N81) и неструктурному белку 2 (N82).

Используемый в настоящем описании термин репликация вируса относится к амплификации вирусного генома в клетке-хозяине.

Под используемым в настоящем описании термином частица вируса следует понимать всю структуру вируса, содержащую нуклеиновую кислоту, окруженную белковой капсулой или капсидом. Некоторые частицы вируса также включают гликопротеиновую оболочку, окружающую белковую капсулу, и в этом случае термин частица вируса также включает обрлочку вируса. Инфекционная частица вируса способна проникать в клетку организма и реплицироваться в ней.

Под термином снижает экспрессию или снижение экспрессии полипептида или гена подразумевается, что происходит супрессия регуляции или ингибирование трансляции полипептидной последовательности и/или транскрипции нуклеотидной последовательности. Степень супрессии регуляции или ингибирования применяют в зависимости от природы и количества конструкции нуклеиновой кислоты или молекул нуклеиновой кислоты, введенных клетке-хозяину, идентичности, природы и уровня молекулы (молекул) РНК, экспрессированных из конструкции, времени после введения и т.д., но очевидно, например, в виде выявляемого уменьшения экспрессии белка гена-мишени и/или связанной мишени, или клеточной функции, или, например, уменьшения уровня вирусной репликации и т.д.; желательно, степень ингибирования составляет более чем 10, 33, 50, 75, 90, 95 или 99% по сравнению с клеткой, не обработанной в соответствии с настоящим изобретением.

Используемый в настоящем описании термин индивид относится к животному, например птице или млекопитающему. В одном из вариантов осуществления индивидом является человек. В других вариантах осуществления индивидом может быть птица, например домашняя птица, такая как курица, индюшка или утка.

Образец относится к материалу, предположительно содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и/или клетки по изобретению. Образец может быть взят непосредственно из источника или после по меньшей мере одной стадии (частичной) очистки. Образец может быть получен в любой подходящей среде, которая не мешает проведению способа по изобретению. Обычно образец представляет собой водный раствор или биологическую жидкость, как более подробно описано ниже. Образец может быть получен из любого источника, такого как физиологическая жидкость, включая кровь, сыворотку, плазму, слюну, мокроту, жидкость глазных линз, потовую жидкость, фекалии, мочу, молоко, асцитическую жидкость, слизь, синовиальную жидкость, жидкость брюшной полости, трансдермальные экссудаты, глоточные экссудаты, бронхоальвеолярный лаваж, трахеальные аспирации, спинномозговую жидкость, семенную жидкость, слизь шейки матки, выделения из влагалища или уретры, амниотическую жидкость и т.п. В одном из вариантов осуществления образец представляет собой кровь или ее фракцию. Предварительная обработка может включать, например, получение плазмы из крови, разбавление вязкой жидкости и т.п. Способы обработки могут включать фильтрацию, перегонку, сепарацию, концентрацию, инактивацию мешающих компонентов и добавление реагентов. Выбор и предварительная обработка биологических образцов перед тестированием хорошо известны в данной области и не требуют дополнительного описания.

Используемый в настоящем описании термин транспозон относится к генетическому элементу, который может двигаться (смещаться) из одного положения в другое в пределах генома организма способами, которые не требуют ни обширной гомологии последовательностей ДНК между транспозоном и сайтом вставки, ни рекомбинационных ферментов для классического гомологичного кроссинговера.

Используемый в настоящем описании термин изогенные относится к организмам или клеткам, которые характеризуются, по существу, идентичной геномной ДНК, например геномная ДНК по меньшей мере примерно на 92%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% идентична геномной ДНК изогенного организма или клетки.

Используемый в настоящем описании термин введение, внедрение, относящийся к конструкции нуклеиновой кислоты или молекуле нуклеиновой кислоты, следует понимать в самом широком возможном смысле, и он включает любой способ, приводящий к получению конструкции нуклеиновой кислоты или молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующих в клетке или организме. Например, конструкция нуклеиновой кислоты или молекула нуклеиновой кислоты могут быть доставлены в клетку в виде депротеинизированной ДНК посредством любой подходящей методики трансфекции или трансформации, такой как, например, электропорация. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты или молекула нуклеиновой кислоты могут быть вставлены в геном и/или экспрессированы трансгеном в клетке.

Интерференция РНК.

Термины интерференция РНК, РНК1 или получение молчащего гена относятся, как правило, к способу, при котором молекула двунитевой РНК подавляет экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, с которой молекула двунитевой РНК имеет существенную или полную гомологию. Однако позднее было показано, что интерференции РНК можно достичь с использованием двунитевых молекул,

- 8 017948 не являющихся молекулами РНК (см., например, заявку на патент США 20070004667).

Настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие и/или кодирующие двунитевые области для интерференции РНК. Молекулы нуклеиновой кислоты обычно представляют собой РНК, но могут содержать химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотиды.

Двунитевые области должны представлять собой по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, например примерно 19-23 нуклеотида, или могут быть длиннее, например 30 или 50 нуклеотидов или 100 нуклеотидов или более. Может использоваться полноразмерная последовательность, соответствующая всему транскрипту гена. Предпочтительно двунитевые области имеют длину от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов.

Степень идентичности двунитевой области молекулы нуклеиновой кислоты с транскриптоммишенью должна составлять по меньшей мере 90%, а еще более предпочтительно 95-100%. Молекула нуклеиновой кислоты может, конечно, содержать несвязанные последовательности, которые могут функционировать для стабилизации молекулы.

Используемый в настоящем описании термин короткая интерферирующая РНК или ыРНК относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит рибонуклеотид, способный ингибировать или подавляюще регулировать экспрессию гена, например, путем опосредования РНК1 специфическим для последовательности образом, где двунитевая часть имеет длину менее чем 50 нуклеотидов, предпочтительно длину от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов. Например, ктРНК может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую аутокомплементарные смысловые и антисмысловые области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле-мишени нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловую область, имеющую нуклеотидную последовательность, соответствующую молекуле-мишени нуклеиновой кислоты или ее части. К1РНК может быть собрана из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна нить представляет собой смысловую нить, а другая представляет собой антисмысловую нить, где антисмысловая и смысловая нити являются аутокомплементарными.

Используемый в настоящем описании термин к!РНК эквивалентен другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны опосредовать специфическую для последовательности РНК1, например микро-РНК (Ш1РНК), короткую шпильку РНК (кбРНК), короткий интерферирующий олигонуклеотид, короткую интерферирующую нуклеиновую кислоту (κίΝΆ), короткий интерферирующий модифицированный олигонуклеотид, химически модифицированную ктРНК, посттранскрипционную вызывающую молчание гена РНК (р!д&РНК) и др. Кроме того, используемый в настоящем описании термин РНК1 эквивалентен другим терминам, используемым для описания специфической для последовательности интерференции РНК, такой как посттранскрипционный вызов молчания гена, транскрипционное ингибирование или эпигенетика. Например, молекулы ктРНК по изобретению могут использоваться для эпигенетически молчащих генов или на посттранскрипционном уровне или на претранскрипционном уровне. В неограничивающем примере, эпигенетическая регуляция экспрессии гена молекулами К1РНК по изобретению может происходить в результате опосредованной К1РНК модификации структуры хроматина для изменения экспрессии гена.

Под кбРНК или короткой шпилькой РНК подразумевается молекула РНК, в которой менее чем примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов, спарены основаниями с комплементарной последовательностью, расположенной на той же молекуле РНК, и где указанная последовательность и комплементарная последовательность разделены неспаренной областью по меньшей мере от примерно 4 до примерно 15 нуклеотидов, которая образует однонитевую петлю над стволовой структурой, созданной двумя областями комплементарности оснований. Пример последовательности однонитевой петли включает 5' ииСЛЛСЛСЛ 3'.

Встроенные кбРНК представляют собой двойные или двупальцевые и многопальцевые шпильки б&РНК, в которых молекула РНК содержит две или более таких стволо-петельных структур, разделенных однонитевыми спейсерными областями.

После конструирования молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие двунитевую область, можно получать любым способом, известным в данной области, например транскрипцией ίη νίΐτο, рекомбинантно или синтетическим средством.

Модификации или аналоги нуклеотидов могут быть введены для улучшения свойств молекул нуклеиновой кислоты по изобретению. Улучшенные свойства включают повышенную устойчивость к нуклеазе и/или повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Соответственно, термины молекула нуклеиновой кислоты и молекула двунитевой РНК включают синтетически модифицированные основания, такие как, но ими не ограничиваются, инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галоидурацил, 5-галоидцитозан, 6-азацитозин и 6азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галоидаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8-галоидгуанины, 8аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.

Нуклеиновые кислоты.

- 9 017948

Под выделенной молекулой нуклеиновой кислоты понимают молекулу нуклеиновой кислоты, которая, по существу, была отделена от нуклеотидных последовательностей, с которыми она связана, или связана в своем природном состоянии (если оно вообще существует в природе). Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 60% лишена, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75% лишена, а еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% лишена других компонентов, с которыми она природно связана. Кроме того, термин молекула нуклеиновой кислоты в настоящем описании используется взаимозаменяемо с термином полинуклеотид.

Термин экзогенная в контексте нуклеиновой кислоты относится к нуклеиновой кислоте (включая конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению), когда она присутствует в клетке, или в бесклеточной экспрессионной системе, в измененном количестве, по сравнению с ее природным состоянием. В особенно предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку, которая в природе не содержит нуклеиновую кислоту или конструкцию нуклеиновой кислоты.

Термины молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид относятся к олигонуклеотиду, полинуклеотиду или любому их фрагменту. Это может быть ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения и комбинируется с углеводородом, липидами, белком или другими материалами для реализации конкретной активности, определенной в настоящем описании.

Процент идентичности молекулы нуклеиновой кислоты определяется анализом САР (№еб1ешап апб \Уип5с11. 1970) (программа ССС) со штрафом за пропуск = 5 и штрафом за удлинение = 0,3. Исследуемая последовательность имеет длину по меньшей мере 19 нуклеотидов, и анализ САР выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 19 нуклеотидов. Альтернативно, исследуемая последовательность имеет длину по меньшей мере 150 нуклеотидов, и анализ САР выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 150 нуклеотидов. Альтернативно, исследуемая последовательность имеет длину по меньшей мере 300 нуклеотидов, и анализ САР выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 300 нуклеотидов. Предпочтительно две последовательности выравнивают по всей их длине.

В отношении определенных молекул нуклеиновой кислоты, следует понимать, что величины % идентичности, превышающие указанные выше, включают предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, если это применимо, в свете величин минимального % идентичности предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 91%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 92%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 93%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 94%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 96%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,8%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична релевантной номинированной 8ЕО Ш N0.

Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может селективно гибридизироваться с полинуклеотидом, который кодирует полипептид вируса гриппа А в жестких условиях. Используемые в настоящем описании жесткие условия представляют собой условия, при которых (1) используется низкая ионная сила и высокая температура для промывания, например 0,015М №С1/0,0015М цитрат натрия/0,1% ΝαΌο68Ο₄ при 50°С; (2) используется во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, буфером 5,0 мМ фосфата натрия при рН 6,5 с 750 мМ №С1, 75 мМ цитрата натрия при 42°С, или (3) используется 50% формамид, 5х88С (0,75М №С1, 0,075М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 х раствора ЭспйагбЕ ДНК обработанной ультразвуком спермы лосося (50 г/мл), 0,1% 8Ό8 и 1,0% декстран сульфат при 42°С в 0,2х88С и 0,1% 8Ό8.

Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут, по сравнению с природными молекулами, иметь области (например, природные промоторы), которые имеют одну или несколько мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замещения нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо природными (т.е. выделенными из природного источника), либо синтетическими (например, полученными выполнением направленного на сайт мутагенеза на нуклеиновой кислоте, как описано выше). Таким образом, очевидно, что полинуклеотиды по изобретению могут быть либо природными, либо рекомбинантными.

Обычно мономеры нуклеиновой кислоты связаны связями сложного фосфодиэфира или его аналогов с образованием олигонуклеотидов в диапазоне размера от относительно коротких мономерных единиц, например 12-18, до нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги связей сложного фосфодиэфира

- 10 017948 включают фосфортиоат, фосфордитиоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат.

Конструкции нуклеиновых кислот.

Используемый в настоящем описании термин конструкция нуклеиновой кислоты относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу двунитевой РНК, как определено в настоящем описании, и включает молекулу нуклеиновой кислоты в векторе, молекулу нуклеиновой кислоты, если она присутствует в клетке в виде молекулы внехромосомной нуклеиновой кислоты, и молекулу нуклеиновой кислоты, которая интегрирована в геном. Обычно конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой двунитевую ДНК или двунитевую РНК или их комбинацию. Кроме того, конструкция нуклеиновой кислоты обычно содержит подходящий промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания, кодирующей двунитевую РНК. Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать первую рамку считывания, кодирующую первую одну нить молекулы двунитевой РНК, причем комплементарная (вторая) нить кодируется второй открытой рамкой считывания другой, или предпочтительно той же конструкцией нуклеиновой кислоты. Конструкция нуклеиновой кислоты может представлять собой линейный фрагмент или циркулярную молекулу, и она может или не может быть способна к репликации. Специалисту в данной области будет понятно, что конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может быть включена внутрь подходящего вектора. Трансфекция или трансформация конструкции нуклеиновой кислоты в клетку-реципиент обеспечивает возможность клетке экспрессировать молекулу РНК, кодируемую конструкцией нуклеиновой кислоты.

Конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может экспрессировать его множественные копии и/или одна или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более) включают множественные различные молекулы РНК, содержащие двунитевую область, например короткую шпильку РНК. Молекулы РНК, рассматриваемые как такие же, как каждая другая из тех, которые содержат только такую же двунитевую последовательность, и молекулы РНК, рассматриваемые как отличные друг от друга, будут содержать другие двунитевые последовательности, независимо от того, будут ли последовательности, предполагаемые быть мишенями каждой другой двунитевой последовательности, в пределах одного и того же или другого гена, или последовательностями двух различных генов.

Конструкция нуклеиновой кислоты может также содержать дополнительные генетические элементы. Типы элементов, которые могут быть включены в конструкцию, никоим образом не ограничиваются и могут быть выбраны специалистом в данной области. В некоторых вариантах осуществления конструкцию нуклеиновой кислоты вводят в клетку-хозяин как трансген. В таких случаях может быть желательно введение в эту конструкцию вспомогательных фрагментов, которые предназначены для защиты последовательностей, кодирующих молекулу РНК, от процесса вставки трансгена и для снижения риска считывания внешней транскрипции. Вспомогательные фрагменты могут также быть включены в конструкцию для увеличения расстояния между, например, промотором и кодирующей последовательностью и/или компонентом терминатора. Длина фрагмента вспомогательной последовательности может составлять любую длину от 5 до 5000 или более нуклеотидов. Между промоторами может быть один или несколько вспомогательных фрагментов. В случае множественных вспомогательных фрагментов их длина может быть одинаковой или различной. Вспомогательные фрагменты ДНК предпочтительно представляют собой различные последовательности.

Предпочтительно вспомогательные последовательности содержат последовательность, идентичную последовательности, обнаруживаемой внутри клетки, или ее потомства, в которые они были вставлены. В других вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит вспомогательные области, фланкирующие открытую рамку(и) считывания, кодирующие одну или несколько двунитевых РНК.

Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты может включать элемент, способный к перемещению, например транспозон, характеризуемый концевыми, инвертированными последовательностями повторов, фланкирующий открытые рамки считывания, кодирующий одну или несколько двунитевых РНК. Примеры подходящих транспозонов включают То12, мини-ΤοΙ, 81еершд ВсаШу. Маппег апб Оа1Ιιιΐιορ.

Другие примеры дополнительного генетического элемента, которые могут быть включены в конструкцию нуклеиновой кислоты, включают ген-репортер, такой как один или несколько генов для флуоресцентного маркерного белка, такого как ОРР или КЕР; легко анализируемый фермент, такой как βгалактозидаза, люцифераза, β-глюкуронидаза, хлорамфеникол ацетилтрансфераза или секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза; или белки, для которых общедоступны иммуноанализы, такие как гормоны или цитокины. Другие генетические элементы, которые могут найти применение в вариантах осуществления настоящего изобретения, включают те, которые кодируют белки, придающие клеткам селективное преимущество роста, такие как аденозиндеаминаза, аминогликолевая фосфотрансфераза, дигидрофолатредуктаза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, или устойчивость к лекарственным средствам.

Если конструкция нуклеиновой кислоты трансфецируется животному, то желательно, чтобы промотор и любые дополнительные генетические элементы состояли из нуклеотидных последовательностей,

- 11 017948 которые встречаются в природе в геноме животного. Кроме того, желательно, чтобы последовательности, кодирующие молекулы РНК, состояли из последовательностей вируса гриппа А.

Промоторы.

Используемый в настоящем описании термин промотор относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая способна направлять транскрипцию функционально связанной молекулы нуклеиновой кислоты, и включает, например, промоторы РНК полимеразы II и РНК полимеразы III. В это определение также включены те транскрипционные регуляторные элементы (например, усилители), которые достаточны для придания регулируемости зависимой от промотора экспрессии гена специфичным для типа клетки, специфичным для ткани или специфичным для времени образом, или которые являются индуцируемыми внешними агентами или сигналами.

Если конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая промотор, трансфецирована в животноехозяин, то желательно, чтобы промотор был тем, который встречается в природе в геноме животного. Например, когда трансгенное животное представляет собой курицу, то промотор представляет собой предпочтительно куриный промотор; когда трансгенное животное представляет собой индюшку, то промотор представляет собой предпочтительно индюшачий промотор; и когда трансгенное животное представляет собой утку, то промотор представляет собой предпочтительно утиный промотор.

Используемый в настоящем описании термин функционально связанный относится к функциональной связи между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). Обычно он относится к функциональной связи транскрипционного регуляторного элемента с транскрибированной последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как открытая рамка считывания, кодирующая определенную в настоящем описании молекулу двунитевой РНК, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке. Как правило, транскрипционные регуляторные элементы промотора, которые функционально связаны с транскрибированной последовательностью, являются физически смежными с транскрибированной последовательностью, т.е. они являются цис-действующими. Однако некоторые транскрипционные регуляторные элементы, такие как усилители, не должны быть физически смежными или расположенными в непосредственной близости к кодирующим последовательностям, чью транскрипцию они усиливают.

Под терминами промотор РНК полимеразы III, или промотор РНК ροϊ III, или промотор полимеразы III, или промотор ροϊ III подразумевают промотор любого беспозвоночного, позвоночного или млекопитающего, например курицы, человека, мыши, свиньи, коровы, примата, обезьяны и т.д., который в своем естественном контексте в клетке ассоциируется или взаимодействует с РНК полимеразой III для транскрипции ее функционально связанного гена или любого его варианта, природного или полученного методами генной инженерии, который взаимодействует с выбранной клеткой-хозяином с РНК полимеразой III для транскрипции функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты. Под промотором иб (например, куриным Иб, человеческим Иб, мышиным Иб) промотором Н1 или промотором 78К подразумевается промотор любого беспозвоночного, позвоночного или млекопитающего или полиморфный вариант или мутант, который, как обнаруживается в природе, взаимодействует с РНК полимеразой III для транскрипции его родственного по женской линии продукта РНК, т.е. соответственно иб РНК, Н1 РНК или 78К РНК. Примеры подходящих промоторов включают еИб-1 (8Еф ГО N0: 22), еИб-3 (81Ю ГО N0: 23), еИб-4 (8ЕО ГО N0: 24) и е78К (8ЕО ГО N0: 25).

Предпочтительно при некоторых вариантах применения используются промоторы РНК ροϊ III типа III, включая иб, Н1 и 78К, которые существуют в области, фланкирующей 5', и включают ТАТА-блоки и лишены внутренних промоторных последовательностей. Внутренние промоторы встречаются для ροϊ III 58 рРНК, тРНК или УА РНК генов. Ген 78К ροϊ РНК III содержит слабый внутренний промотор и последовательность в области, фланкирующей 5' гена, необходимого для транскрипции. Промоторы ροϊ III для использования в конструкции нуклеиновой кислоты для конкретного применения, например для экспрессии молекул двунитевой РНК, таких как шпильки РНК против птичьего или человеческого вируса, могут быть преимущественно выбраны для оптимального связывания и транскрипции РНК полимеразы III клетки-хозяина, например, включая птичьи промоторы ροϊ III в конструкции экспрессии, предназначенной для транскрипции множества шпилек б&РНК против птичьего вируса, такого как вирус птичьего гриппа (Н5Ю) в птичьих клетках-хозяевах.

Под различными промоторами полимеразы подразумеваются любые два промотора РНК полимеразы, такие как промоторы РНК полимеразы II или РНК полимеразы III, включая варианты, такие как их полиморфизмы и мутанты, которые в определенном виде запустят транскрипцию различных родственных по материнской линии транскриптов, таких как, например, человеческий промотор 78К, человеческий промотор Иб и человеческий промотор Н1, которые считаются тремя различными промоторами полимеразы. Различные промоторы полимеразы также относятся к отдельным членам семейства промоторов, таких как, например, семейство куриных промоторов иб, в котором промоторы еИб-1, еИб-2, еИб-3 и/или еИб-4 считаются различными промоторами. Использование различных промоторов полимеразы в конструкциях по настоящему изобретению снизит возможность явлений внутри- и/или межмолекулярной рекомбинации, таких как перестройки или делеции.

- 12 017948

В некоторых аспектах множественные копии одного и того же промотора РНК полимеразы II или РНК полимеразы III могут быть включены в конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению могут содержать множественные копии одного и того же промотора полимеразы без другого промотора полимеразы; например 3, 4, 5 или более промоторов Иб, каждый из которых функционально связан с последовательностью, кодирующей молекулу РНК, такую как кйРНК. Необязательно, в некоторых вариантах осуществления другие промоторы могут быть включены в дополнение к двум или более промоторам полимеразы, например один или несколько промоторов полимеразы I, один или несколько митохондриальных промоторов и т.д. В одном аспекте конструкция экспрессии, содержащая множественные промоторы полимеразы (2, 3, 4, 5 или более) подвергается манипуляциям генной инженерии для экспрессии множественных шпилек бкРНК или кйРНК, и в этом случае могут использоваться 2, 3, 4, 5 или более копий одного и того же промотора полимеразы, независимо от того, включен ли также другой промотор РНК полимеразы или нет.

В некоторых случаях может также быть желательно, чтобы конструкция нуклеиновой кислоты содержала промотор, специфичный для ткани или специфичный для клетки. Термин специфичный для ткани применительно к промотору относится к промотору, который способен направлять селективную экспрессию представляющей интерес нуклеотидной последовательности на определенный тип ткани (например, легкие) при относительном отсутствии экспрессии той же представляющей интерес нуклеотидной последовательности в другом типе ткани (например, мозге). Такие специфичные для ткани промоторы включают такие промоторы как Ек, миогенин или 1Ьу1. Термин специфичный для клетки применительно к промотору относится к промотору, который способен направлять селективную экспрессию представляющей интерес нуклеотидной последовательности на определенный тип клетки при относительном отсутствии экспрессии той же представляющей интерес нуклеотидной последовательности в другом типе клетки в пределах той же ткани (см., например, Н1дакЫЬа1а, с1 а1. (2004); Ноддай, с1 а1. (2002); 8ойа1, с1 а1., (2001); и Ζΐιηηβ, с1 а1., (2004)). Термин специфичный для клетки применительно к промотору также означает промотор, способный содействовать селективной экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в области в пределах одной ткани. Альтернативно, промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми. Кроме того, промоторы могут быть модифицированы так, чтобы иметь различные специфичности.

Амплификация нуклеиновой кислоты.

Полимеразная реакция синтеза цепи (РСК) представляет собой реакцию, при которой получают копии репликатов полинуклеотида-мишени с использованием пар праймеров или набора праймеров, состоящие из праймера выше по ходу транскрипции и ниже по ходу транскрипции, и катализатора полимеризации, такого как ДНК полимераза, и обычно термически устойчивого фермента полимеразы. Способы РСК известны в данной области, и о них идет речь, например, в РСК (Ей. МЛ. МеРйегкои аий 8.6. Мо11ег (2000) ВЮ8 8с1еиййс РиЬйкйегк Ь1б, ОхГогб). РСК может выполняться на кДНК, полученной в результате обратной транскрипции мРНК, выделенной из биологических образцов.

Праймер часто представляет собой олигонуклеотид, как правило, длиной примерно 20 нуклеотидов, при минимуме примерно 15 нуклеотидов, который способен гибридизироваться специфичным для последовательности типом с последовательностью-мишенью и растягиваться во время РСК. В качестве праймера могут также использоваться более длинные молекулы нуклеиновой кислоты, например молекулы нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 50, или 100, или более нуклеотидов. Ампликоны или продукты РСК или фрагменты или продукты амплификации РСК представляют собой продукты растягивания, которые содержат праймер и вновь синтезированные копии последовательностей-мишеней.

Мультиплексные системы РСК содержат множественные наборы праймеров, что приводит к одновременной продукции более чем одного ампликона. Праймеры могут быть совершенным образом подобраны для соответствия последовательностям-мишеням, или они могут содержать внутренние ошибочно спаренные основания, что может привести к введению рестрикционного фермента или сайтов распознавания/расщепления каталитической нуклеиновой кислоты в специфичные последовательности-мишени. Праймеры могут также содержать дополнительные последовательности и/или модифицированные или меченые нуклеотиды для содействия захвату или выявлению ампликонов. Повторные циклы тепловой денатурации ДНК, отжиг праймеров в их комплементарные последовательности и растягивание праймеров полимеразой после отжига приводят к экспоненциальной амплификации последовательностимишени.

Термины мишень, или последовательность-мишень, или матрица относятся к последовательностям нуклиновых кислот, которые являются амплифицированными.

Другой методикой амплификации нуклеиновых кислот является обратная транскрипцияполимеразная реакция синтеза цепи (КТ-РСК). Во-первых, комплементарную ДНК (кДНК) получают из матрицы РНК с использованием фермента обратной транскриптазы, а затем выполняется РСК на полученной кДНК.

Другим способом амплификации является лигазная реакция синтеза цепи (ЬСК), раскрытая в ЕР 0320308. При ЬСК получают 2 пары комплементарных зондов, и в присутствии последовательности

- 13 017948 мишени каждая пара связывается с противоположными комплементарными нитями мишени так, что они примыкают друг к другу. В присутствии лигазы две пары зондов свяжутся для образования одной единицы. Путем циклического изменения температуры, как при РСК, связанные лигированные единицы диссоциируются от мишени и затем служат в качестве последовательностей-мишеней для лигирования избыточных пар зондов. В патенте США № 4883750 описан способ, аналогичный ЬСК, для связывания пар зондов с последовательностью-мишенью.

Другие способы амплификации молекул нуклеиновой кислоты известны специалистам в данной области и включают способы изотермической амплификации и системы амплификации на основе транскрипции. Любой подходящий способ амплификации конструкции нуклеиновой кислоты или его фрагмента или выделенной или экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагмента может использоваться в способах по настоящему изобретению.

Векторы и клетки-хозяева.

В некоторых случаях может быть желательна вставка конструкции нуклеиновой кислоты и/или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в вектор. Вектор может представлять собой, например, плазмиду, вирус или искусственную хромосому, полученную, например, из бактериофага, аденофируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса, поксвируса или герпесвируса. Такие векторы включают хромосомные, эписомные и полученные из вируса векторы, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, дрожжевых хромосомных элементов и вирусов, векторы, полученные из их комбинаций, такие как векторы, полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофага, космид и фагемидов. Таким образом, один иллюстративный вектор представляет собой вектор фага двунитевой ДНК. Другой иллюстративный вектор представляет собой вирусный вектор двунитевой ДНК.

Вектор, в который вставлена конструкция нуклеиновой кислоты, может также включать перемещаемый элемент, например транспозон, характеризуемый концевыми инвертированными последовательностями повторов, фланкирующими открытые рамки считывания, кодирующие одну или несколько двунитевых РНК. Примеры подходящих транспозонов включают То12, мини-То12, 81еер1пд Всаи1у. Магтег апб Са11и1ор. Ссылка на транспозон То12 в настоящем описании включает транспозон, полученный из То12, такой как мини-То12.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, в которую была введена конструкция нуклеиновой кислоты, молекула нуклеиновой кислоты и/или вектор по настоящему изобретению. Клетку-хозяин по настоящему изобретению можно использовать, например, в качестве продукционной системы для получения или экспрессии молекулы бкРНК. Для получения ίη νίΙΐΌ могут использоваться эукариотические клетки или прокариотические клетки.

Подходящие для использования эукариотические клетки-хозяева могут представлять собой животные, растительные или грибковые клетки. В качестве клеток животных могут использоваться клетки млекопитающих, такие как СНО, 0Ό8, 3Т3, ΌΡ1, СЕР, миеломы МОСК, почек детеныша хомячка (ВНК), НеЬа или клеток Уего, клеток амфибий, таких как ооциты Хепорик, или клетки насекомых, такие как клетки 8Г9, 8Г21 или Тп5. Могут также использоваться клетки СНО, не имеющие гена ЭНРР (бЫг-СНО) или СНО К-1. Вектор может быть введен в клетку-хозяин, например, способом с использованием фосфата кальция, способом с использованием ΌΕΑΕ-декстрана, способом с использованием катионной липосомы ^ΟТΑР (ВоеЬппдег МаппРет), электропорацией, липофекцией и т.д.

Подходящие для использования прокариотические клетки включают бактериальные клетки, такие как Е.со11, например ДМ109, ИН5а и НВ101, или ВасШик киЫШк.

Для клеток животных может использоваться культуральная среда, такая как ИМЕМ, МЕМ, КРМ11640 или ГМЭМ. Культуральная среда может использоваться с добавкой сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (РС8), или без нее. рН культуральной среды составляет предпочтительно примерно от 6 до 8. Клетки обычно культивируются при примерно 30-40°С в течение примерно 15-200 ч, и культуральная среда может при необходимости замещаться, аэрироваться или перемешиваться.

Трансгенные животные, исключая человека.

Термин трансгенное животное, исключая человека, относится к животному, исключая человека, которое содержит конструкцию нуклеиновой кислоты (трансген), не обнаруживаемую у животного дикого типа того же вида или породы. Указанный в настоящем описании трансген имеет обычное значение в области биотехнологии и включает генетическую последовательность, которая была получена или изменена технологией рекомбинантной ДНК или РНК и которая была введена в клетку животного, предпочтительно птицы. Трансген может включать генетические последовательности, полученные из клетки животного. Обычно трансген вводится животному манипуляцией человека, такой как, например, трансформация, но может использоваться любой способ, как известно специалисту в данной области. Трансген включает генетические последовательности, которые вводятся в хромосому, а также те, которые являются внехромосомными.

Методики для получения трансгенных животных хорошо известны в данной области. Полезным руководством по этому предмету является НоибеЫпе, Тгапкдешс ашта1к - Сепегабоп апб Ике (Нагоооб Асабетю, 1997).

- 14 017948

Гетерологичная ДНК может вводиться, например, в оплодотворенную яйцеклетку. Например, тотипотентные или плюрипотентные стволовые клетки могут быть трансформированы микроинъекцией, осаждением, опосредованным фосфатом кальция, слиянием липосом, ретровирусной инфекцией или другими средствами, трансформированные клетки затем вводятся в эмбрион, и эмбрион затем развивается в трансгенное животное. В одном способе развивающиеся эмбрионы инфицируются ретровирусом, содержащим желательную ДНК, и трансгенные животные получаются из инфицированного эмбриона. Однако в альтернативном способе соответствующие ДНК совместно инъецируются в пронуклеус или цитоплазму эмбрионов предпочтительно на одной клеточной стадии, и эмбрионам предоставляется возможность развиться в зрелых трансгенных животных.

Другой способ, используемый для получения трансгенного животного, включает микроинъекцию стандартными способами нуклеиновой кислоты в яйцеклетки на пронуклеарной стадии. Затем инъецированные яйцеклетки культивируются перед переносом в яйцеводы ложно беременных реципиентов.

Трансгенные животные могут также быть получены технологией ядерного переноса. С использованием этого способа фибробласты от животных-доноров устойчиво трансфецируются плазмидой, включающей кодирующие последовательности, для домена связывания или связывания представляющего интерес партнера под контролем регуляторных последовательностей. Затем устойчивые трансфектанты сливаются с энуклеированными ооцитами, культивируются и переносятся в самок-реципиентов.

Опосредованный спермой перенос гена (8МОТ) представляет собой другой способ, который может использоваться для генерирования трансгенных животных. Этот способ был впервые описан ЬауПгапо с1 а1. (1989).

Другой способ получения трансгенных животных представляет собой технологию основанного на линкере опосредованного спермой переноса гена (ЬВ-8МОТ). Эта процедура описана в патенте США № 7067308. Вкратце, свежесобранная сперма промывается и инкубируется с мышиным моноклональным антителом тЛЬС (секретируемым гибридомой с присвоенным номером доступа в АТСС РТА-6723) и затем ДНК конструкции. Моноклональное антитело содействует связыванию ДНК со спермой. Затем проводится искусственное осеменение самок комплексом спермы/ДНК.

Трансгенные куры зародышевой линии могут быть получены инъекцией ретровируса с дефектной репликацией в подзародышевую полость куриных бластодерм в свежеотложенные яйца (патент США № 5162215; Во88е1таи е! а1., 1989; Т1югауа1 е! а1., 1995). Ретровирусная нуклеиновая кислота, несущая инородный ген, беспорядочно вставляется в хромосому эмбриональных клеток, генерируя трансгенных животных, некоторые из которых несут трансген в их зародышевой линии. Было описано применение изоляторных элементов, вставленных в 5'-области или З'-области конструкции гибридного гена, для преодоления воздействий положения в сайте вставки (СЫиа е! а1., 1993).

Другой способ генерирования трансгенных животных зародышевой линии осуществляется использованием транспозона, например транспозона То12, для интеграции конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению в геном животного. Транспозон То12, который был впервые выделен из рыбы медака Огу/1а8 1айре§, и относится к семейству ВАТ транспозонов, описан в публикации Кода е! а1. (1996) аий Ка\\акат1 е! а1. (2000). Мини-То12 представляет собой вариант То12 и описан в публикации Ва1сшпа§ е! а1. (2006). Транспозоны То12 и мини-То12 облегчают интеграцию трансгена в геном организма при совместном действии с То12 транспозазы. Путем доставки То12 транспозазы на отдельной не реплицирующейся плазмиде только транспозон То12 или мини-То12 и трансген интегрирован в геном, и плазмида, содержащая То12 транспозазу, утрачивается в пределах ограниченного числа клеточных делений. Таким образом, интегрированный транспозон То12 или мини-То12 больше не имеет способности подвергаться последующему явлению транспозиции. Кроме того, поскольку То12, как известно, не является природным птичьим транспозоном, в клетке птицы, например в куриной клетке, то эндогенная активность транспозазы для вызова дальнейших явлений транспозиции отсутствует.

В способах по настоящему изобретению может использоваться любая другая подходящая система транспозона. Например, система транспозона может представлять собой систему транспозона 81еертд ВеаШу. Бгод Ргтсе или МоИ, или может использоваться любой транспозон, относящийся к семейству !с1/тагшег или ВАТ транспозонов.

Инъекция птичьих эмбриональных стволовых клеток в эмбрионы реципиентов для получения химерных птиц описана в патенте США № 7145057. Выведение полученной химеры дает трансгенных птиц, чей геном состоит из экзогенной ДНК.

Способы получения трансгенных кур из долгосрочных культур птичьих примордиальных зародышевых клеток (РОС) описаны в заявке на патент США 20060206952. При комбинировании с птичьим эмбрионом-хозяином известными процедурами эти модифицированные РОС переносятся по зародышевой линии для получения трансгенного потомства.

Вирусная система доставки на основе любого соответствующего вируса может использоваться для доставки конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в клетку. Кроме того, могут использоваться гибридные вирусные системы. Выбор вирусной системы доставки зависит от различных параметров, таких как эффективность доставки в клетку, ткань или орган, представляющие интерес, эффективность трансдукции системы, патогенность, иммунологические аспекты и опасения токсичности и

- 15 017948 тому подобных. Ясно, что нет одной вирусной системы, которая подходит для всех видов применения. При выборе вирусной системы доставки для использования в настоящем изобретении важно выбрать систему, где вирусные частицы, содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты, предпочтительно 1) воспроизводимо и устойчиво распространяются; 2) способны очищаться до высоких титров и З) способны опосредовать нацеленную доставку (доставку конструкции экспрессии нуклеиновой кислоты в клетку, ткань или орган, представляющие интерес, без широкораспространенной диссеминации).

Композиции и введение.

В предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую подходящий носитель. Подходящие фармацевтические носители, эксципиенты и/или разбавители включают, но ими не ограничиваются, лактозу, сахарозу, порошок крахмала, порошок талька, сложные эфиры алканоевых кислот целлюлозы, стеарат магния, оксид магния, кристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, желатин, глицерин, альгинат натрия, антибактериальные средства, противогрибковые средства, гуммиарабик, аравийскую камедь, соли натрия и калия фосфорной и серной кислот, поливинилпирролидон и/или поливиниловый спирт, солевой раствор и воду.

В некоторых вариантах осуществления конструкция(и) нуклеиновой кислоты и/или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению образуют комплексы с одним или несколькими катионными липидами или катионными амфифилами, такие как композиции, раскрытые в патентах США № 4897З55; 5264618 или 5459127. В других вариантах осуществления они образуют комплексы с липосомой/липосомной композицией, которая включает катионный липид и, необязательно, включает другой компонент, такой как нейтральный липид (см., например, патенты США № 52798ЗЗ; 528З185 и 59З2241). В других вариантах осуществления они образуют комплексы с многофункциональными молекулярными комплексами по патентам США № 58З75ЗЗ; 6127170 и 6З79965 или, желательно, многофункциональными молекулярными комплексами или масляно/водными катионными амфифильными эмульсиями по \¥0 0З/09З449. В последней заявке речь идет о композиции, которая включает нуклеиновую кислоту, эндосомолитический спермин, который включает холестерин или жирную кислоту, и нацеливающий спермин, который включает лиганд для молекулы клеточной поверхности. Соотношение между положительным и отрицательным зарядом композиции составляет от 0,1 до 2,0, предпочтительно 0,5 и 1,5 включительно; эндосомолитический спермин составляет по меньшей мере 20% содержащих спермин молекул в композиции; и нацеливающий спермин составляет по меньшей мере 10% содержащих спермин молекул в композиции. Желательно, чтобы соотношение между положительным и отрицательным зарядом композиции составляло от 0,8 до 1,2 включительно, например от 0,8 до 0,9 включительно.

Введение конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы и/или композиции нуклеиновой кислоты может подходящим образом достигаться инъекцией в куриное яйцо и, как правило, инъекцией в воздушный мешок. Несмотря на то, что воздушный мешок является предпочтительным путем введения ίη ονο, другие области, такие как желточный мешок или аллантоисная жидкость хориона, также могут инокулироваться инъекцией. Частота вылупления из яиц может немного снизиться, когда воздушный мешок не является мишенью для введения, хотя необязательно на промышленно неприемлемых уровнях. Механизм инъекции не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, хотя предпочтительно, чтобы игла не вызывала ненужного повреждения яйца или тканей и органов развивающегося эмбриона или внеэмбриональных мембран, окружающих эмбрион.

Как правило, шприц для подкожных инъекций, снабженный иглой приблизительно 22 калибра, подходит для введения в птичье яйцо. Способ по настоящему изобретению особенно хорошо приспособлен для использования с автоматизированным инъекционным устройством, таким как устройства, описанные в патентах США № 490З6З5; 5056464; 51З6979 и заявке на патент США И8 2006007597З.

В другом варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, молекула и/или композиция нуклеиновой кислоты вводится посредством легочной доставки, например ингаляцией высушенного состава в виде аэрозоля или спрея. Например, аэрозоль может вводиться ингаляционным устройством или распылителем (см., например, патент США № 4501729), обеспечивающими быстрое местное поглощение молекул нуклеиновой кислоты в соответствующие легочные ткани. Твердые композиции в форме частиц, содержащих вдыхаемые сухие частицы микронизированных композиций нуклеиновой кислоты, могут быть получены помолом высушенных или лиофилизированных композиций нуклеиновой кислоты и затем пропусканием микронизированной композиции, например, через сито 400 меш для разрушения или отделения больших агломератов. Твердая композиция в форме частиц, содержащая композиции нуклеиновой кислоты по изобретению, может, необязательно, содержать диспергент, который служит для содействия образованию аэрозоля, а также терапевтических соединений. Подходящим диспергентом является лактоза, которая может смешиваться с соединением нуклеиновой кислоты в любом подходящем соотношении, например в соотношении 1 к 1 по массе.

Распылители представляют собой выпускаемые промышленностью устройства, которые преобразуют растворы или суспензии активного ингредиента в туман терапевтического аэрозоля или посредством ускорения сжатого газа, обычно воздуха или кислорода, через узкое отверстие Вентури или посредством ультразвукового перемешивания. Подходящие составы для использования в распылителях содер

- 16 017948 жат активный ингредиент в жидком носителе в количестве до 40% мас./мас., предпочтительно менее чем 20% мас./мас. состава. Носитель представляет собой обычно воду или разбавленный водный спиртовой раствор, предпочтительно изготовленный изотоническим с биологическими жидкостями добавлением, например, хлорида натрия или других подходящих солей. Необязательные добавки включают консерванты, если состав не получен стерильным, например, метилгидроксибензоат, антиоксиданты, ароматизаторы, летучие масла, забуферивающие агенты и эмульгаторы и другие поверхностно-активные вещества состава. Аэрозоли твердых частиц, содержащие активную композицию и поверхностно-активное вещество, могут быть аналогичным образом получены любым генератором аэрозоля твердых частиц. Генераторы аэрозоля для введения индивиду терапевтических средств в форме твердых частиц продуцируют частицы, которые могут вдыхаться, как объясняется выше, и генерируют объем аэрозоля, содержащий заданную отмеренную дозу терапевтической композиции со скоростью, подходящей для введения человеку.

Конструкция нуклеиновой кислоты, молекулы и/или композиция по изобретению может также добавляться в корм или питьевую воду животного. Может быть удобным составление композиции корма и питьевой воды так, чтобы животное принимало их в терапевтически целесообразном количестве вместе с его рационом. Может также быть удобным предоставление композиции в виде премикса для добавления в корм или питьевую воду.

Примеры

Пример 1. Выбор последовательностей 8ЙРНК для включения в трансгены.

Для нацеливания на РНК1 были выбраны самые высококонсервативные гены, РВ1, РВ2, РА, ПР и М1 вируса гриппа А. Авторы использовали 81У1ти8 (компьютерную программу на основе информации из интернета конструкции антивирусной 81РНК для высокодивергентных вирусных последовательностей, №и ίο с1 а1., 2006) для идентификации высококонсервативных областей внутри выбранных генов, а также для прогнозирования последовательностей 81РНК, скрининг которых может производиться для выбора 8ЙРНК. Эта компьютерная программа выявила ряд областей в пределах анализируемых геномных сегментов вируса гриппа А, которые представляли особый интерес для конструкции 8ЙРНК, а именно 3'области РВ1, РВ2, РА и ИР. Конкретнее, они представляли собой сегмент 1 (ген РВ2), нуклеотиды 22402341; сегмент 2 (ген РВ1), нуклеотиды 2257-2341; сегмент 3 (ген РА), нуклеотиды 2087-2233 и сегмент 5 (ген ИР), нуклеотиды 1484-1565.

Авторы выбрали 29 прогнозированных последовательностей 81РНК из программы 81У1ти8 для скрининга с целью выбора 8ЙРНК (табл. 1). Имеются несколько алгоритмов для выбора потенциальных последовательностей 81РНК для определенных генов-мишеней. Однако было показано, что многие из этих прогнозированных 81РНК эффективно не функционируют при получении из экспрессированных 8ЙРНК. Тахтап с1 а1. (2006), в частности сконструировали алгоритм для прогноза эффективных молекул 8ЙРНК, и авторы разработали свою собственную модификацию алгоритма для улучшения прогноза 8ЙРНК. Авторы применили модифицированный алгоритм Тахтап к 29 511РНК. выбранным с использованием программы 81У1ги8 с тем, чтобы выбрать последовательности для тестирования в качестве 8ЙРНК для специфического ингибирования репликации вируса гриппа А.

- 17 017948

Таблица 1 Алгоритм выбора последовательностей 8ЙРНК, нацеленных на гены вируса гриппа А

бЫША	Балльная оценка 5*-конца	ДСг центральная	Балльная сценка З'-конца	А+Т в 3’	Балльная оценка
РВ1-6	1	-13.8	1	2	4
РВ1-129	1	-12.7	-1	1	1
РВ1-2257	1	-13.9	1	2	4
РВ2-2210	1	-14.7	1	2	4
РВ2-2240	1	-14.1	1	2	4
РВ2-8	1	-11.8	1	1	3
РВ2-10	-1	-12.2	1	1	1
РА-44	-1	-13.1	-1	2	0
РА-739	1	-10.9	-1	0	0
РА-2087	1	-13.6	1	0	2
РА-2110	-1	-17.2	1	2	2
РА-2131	-1	-12.6	-1	0	-2
ΝΡ-224	-1	-15.3	1	2	2
ΝΡ-231	-1	-12.8	-1	0	-2
ΝΡ-344	1	-13.4	1	2	4
ΝΡ-390	-1	-13.5	1	0	0
ΝΡ-771	1	-11.4	1	1	3
ΝΡ-778	-1	-13.3	1	1	1
ΝΡ-1472	1	-11.4	1	2	4
ΝΡ-1484	-1	-8.7	1	1	1
ΝΡ-1496	1	-8.7	-1	0	0
МР-37	1	-13.3	1	0	2
МР-331	1	-13.3	1	2	4
МР-480	1	-14	-1	0	0
МР-554	1	-12.0	1	2	4
МР-592	1	-13.4	1	1	3
МР-598	-1	-14.5	1	0	0
МР-934	1	-11	-1	0	0
МР-5	1	-10.8	1	2	4

Имеются 4 критерия для выбора 8ЙРНК с использованием алгоритма Тахтап. 3 из критериев оценены в баллах из максимального числа 4 очка. Этими критериями являются 1) С или С на 5'-конце последовательности = 1 очко, А или Т на 5'-конце = -1 очко; 2) А или Т на З'-конце = 1 очко; С или С на 3'конце = -1 очко; 3) 5 или более А или Т в семи основаниях 3' = 2 очка; 4) А или Т в семи основаниях 3' = 1 очко. Предпочтительны последовательности 8ЙРНК с самыми высокими балльными оценками. Четвертый критерий основан на расчете свободной энергии 6 центральных оснований последовательности 8ЙРНК (основания 6-11 смысловой нити, гибридизированной с основаниями 9-14 антисмысловой нити) для 19-нуклеотидной последовательности. Предпочтительны 8ЙРНК с центральным дуплексом АС>-12.9 ккал/моль. Модификация алгоритма Тахтап авторами заключается в использовании других параметров свободной энергии для прогнозов устойчивости дуплекса РНК, как опубликовано Рге1ег с1 а1. (1986). На основании алгоритма авторы выбрали 13 последовательностей 8ЙРНК с использованием программы 81У1гц8 для применения в потенциально эффективных 8ЙРНК с целью тестирования их способности ингибировать репликацию вируса гриппа А. Выбранные последовательности выделены жирным шрифтом в табл. 1, а их последовательность 5'-3' показана в табл. 2. Эти 13 последовательностей использовали для построения плазмид ббРНЮ для экспрессии 10 8ЙРНК.

- 18 017948

Таблица 2

Последовательность кйРНК, выбранных для анализов ингибирования вируса

δίιΒΝΑ	Последовательность 5 ’-З ’
РВ1-129	САООАиАСАССАиООАиАС (ВЕО ГО N0:6)
РВ1-2257	ОАисиоииссАссдииоАА (вео го νο:7)
РВ2-2240	ссесАсисиАОСАиАсииА (вео го N0:8)
РВ2-8	САОСОАССААААОААТТСООА (ВЕО ГО N0:52)
РВ2-10	ААОААТТСООАТОСЗССАТСАА (ВЕО ГО N0:53)
РА-2087	осААииоАоеАоиоссиоА (вео го νο:9)
ΝΡ-771	ССАООАААиОСиОАОАиССАА (ВЕО ГО N0:10)
ΝΡ-1472	оАоиААисААООАисиилиии (βεοιονο:1ι)
ΝΡ-1484	АисиидииисииссзбАОАСАА (вео го νο:12)
ΝΡ-1496	ооАисииАииисиисооАо (вео го N0:13)
МР-554	САСиААиСАОАСАивАОАА (ВЕО ГО N0:14)
МР-592	СиАСАОСиААООСиАиООА (ВЕО ГО N0:15)
МР-5	ОТООАТТСТТОАТССТСТТ (ВЕО ГО N0:54)

Пример 2. Куриные промоторные последовательности.

Известно, что при конструировании конструкции трансгена желательно включить промоторы, которые включают находящуюся выше по ходу транскрипции последовательность для обеспечения возможности эффективного прикрепления фермента полимеразы к промоторным последовательностям. Несмотря на это, куриные промоторы И6 были предназначены и тестированы для содержания минимального количества промоторной последовательности, требуемого для вызова транскрипции кйРНК, таким образом, обеспечивая возможность уменьшения общего размера конструкции трансгена.

Два варианта конструкций, рсИ6-4 кй№-1496 и рсИ6-4 (+100) кй№-1496, тестировали для выявления экспрессии кйРНК посредством анализов защиты РНКзы или на вызванное молчание вируса. Первая плазмида содержит минимальную куриную последовательность И6-4, требуемую для экспрессии короткой РНК-шпильки кй№-1496. Вторая плазмида содержит добавочную последовательность размером 100 п.о. выше по ходу транскрипции промотора сИ6-4. Ожидалось, что вторая конструкция, содержащая добавочную последовательность размером 100 п.о., обеспечила бы лучшую экспрессию кйРНК.

В табл. 3 представлены детали результатов эксперимента с анализом гемагглютинации (анализа Г А) для измерения ингибирования продукции вируса, вызванной экспрессией кйРНК из обеих плазмид. Для проведения этого анализа клетки МОСК выращивали до логарифмической фазы и затем подвергали электропорации плазмидами кйРНК с использованием прибора Атаха №1с1соГсс1ог. Затем трансфецированные клетки через 8 ч инфицировали низкопатогенным вирусом гриппа А НШ1 А/РК/8/34 (РК8) в диапазоне множественности инфекций (то1). Титр вируса (в единицах ГА) измеряли через 48 ч после инфекции выполнением анализов ГА. Анализы проводили в 96-луночном планшете с У-образным дном. Серийные двукратные разведения образцов вируса смешивали с равным объемом 0,5% суспензии (об./об.) куриных эритроцитов и инкубировали на льду в течение 1 ч. Лунки, содержащие прилипший однородный слой эритроцитов, оценивали в баллах как положительный результат.

В эксперименте с анализом ГА, рсИ6-4 кй№-1496, содержащий минимальную промоторную последовательность, был более эффективен в вызове молчания вируса при всех тестированных Μ0Ι, чем рсИ6-4 (+100) кй№-1496, который содержал дополнительную промоторную последовательность выше по ходу транскрипции и ложную плазмиду.

Таблица 3

Результаты анализа гемагглютинации (анализа Г А)

	ΜΟΙ .001	ΜΟΙ .0001	ΜΟΙ .00001
Ложная плазмида	32	32	16
рсиб-4 (+100) 811ΝΡ-1496	32	16	4
рсИб-4 5ΗΝΡ-1496	4	2	2

Пример 3. Конструкция плазмид ббРНК1 для экспрессии выбранных кйРНК.

Промоторы куриной полимеразы III СИ6-1 (номер доступа в ОепБаик ΩΟ531567). сИ6-3 (ΌΟ531569). сИ6-4 (ΌΟ531570) и с78К (ЕР488955) использовали в качестве матриц для конструкции плазмид экспрессии 66РНК1 для выбранных кйРНК, посредством одноэтапной РСК (фиг. 1). В РСК для конструкции плазмид использовался праймер ΤΌ135, спаренный с ΤΌ218 или ΤΌ275 для промотора сИ61; ΤΌ175, спаренный, с ΤΌ216, ΤΌ274 или ΤΌ302 для промотора сИ6-4; ΤΌ176, спаренный с ΤΌ217 для промотора сИ6-3; ΤΌ269, спаренный с ΤΌ307 или ΤΌ316 для промотора с78К (последовательность праймера и детали определенной амплифицированной 8ЙРНК показаны в табл. 4). Обратные праймеры в каждой РСК были сконструированы для содержания последних 20 нуклеотидов каждой промоторной

- 19 017948 последовательности, смысловой кйРНК, петли и антисмысловой последовательности кйРНК и были очищены ВЭЖХ. Амплифицированные продукты экспрессионной полноразмерной кассеты лигировали в рСЕМ-Т Еаку и затем проводили определение последовательностей.

Из выбранных 13 кйРНК экспрессионные плазмиды были успешно сконструированы для 7 из последовательностей. Конечные экспрессионные плазмиды кйРНК, использованные в анализах ингибирования вируса, были названы рсиб-1-к1РВ2-2240, рсиб-1-к1РА-2087, рсиб-3-к1МР-592, рсиб-4-кЮТ-149б, ρου6-4-51ιΝΡ-1484. рс78К-к1РВ1-129, рсиб-4-к1РВ1-2257 и рс78К-к!РВ1-2257. Также конструировали не относящуюся к сиб-1 контрольную плазмиду и использовали для ложного сравнения в анализах ингибирования вируса (см. ниже). Для этой ложной плазмиды прямой праймер ΤΌ135 спаривали с обратным праймером ΤΌ155, содержащим последние 20 нуклеотидов промотора сШб-11 и всех других нерелевантных компонентов кйРНК (кЫгг). Продукт РСК лигировали в рСЕМ-Т Еаку и затем проводили определение последовательностей.

Каждую плазмиду йбРНК1 конструировали так, что начало каждой последовательности кйРНК находилось в положении +1 нативных транскриптов иб или 78К кпРНК. Сайт рестрикционного фермента Х1ю1 создавали методом генной инженерии ниже по ходу транскрипции от сигнала терминации для обеспечения возможности скрининга для выявления продуктов полноразмерной кпРНК, вставленных в рСЕМ-Т Еаку. Все конечные векторы экспрессии кпРНК состояли из любого из куриных полноразмерных промоторов иб или 78К, смысловой последовательности кпРНК, петельной последовательности, антисмысловой последовательности кпРНК, концевой последовательности и сайта Х1ю1. Петельная последовательность, использованная во всех кпРНК, представляла собой 5' ииСААСАСА 3'.

Пример 4. Тестирование выбранных кпРНК на ингибирование вируса.

В табл. 5 сведены результаты экспериментов с анализом гемагглютинации (анализом ГА) для измерения ингибирования продукции вируса, вызванной плазмидами экспрессии кпРНК. Для проведения этих анализов клетки МОСК, выращивали до логарифмической фазы и затем подвергали электропорации плазмидами кйРНК с использованием прибора Атаха №.1с1еоГес1ог™. Затем трансфецированные клетки через 8 ч инфицировали вирусом гриппа А, или низкопатогенным Η1Ν1 А/РК/8/34 (РК8), или высокопатогенным Η5Ν1 А/куриный/вьетнамский/008/2004 (Р5Т1), в диапазоне множественности инфекций (то1). Титр вируса (в единицах ГА) измеряли через 48 ч после инфекции выполнением анализов ГА. Анализы проводили в 9б-луночных планшетах с У-образным дном. Серийные двукратные разведения образцов вируса смешивали с равным объемом 0,5% суспензии (об./об.) куриных эритроцитов и инкубировали на льду в течение 1 ч. Лунки, содержащие прилипший однородный слой эритроцитов, оценивали в баллах как положительный результат.

Таблица 4

Последовательность и детали использованных праймеров

Название Последовательность 5 ’-З’ Локализация/признак

Τϋ135

ТЦ155

Τϋ175

Τϋ176

Τϋ216

ΤΟ217

Τϋ218

ТО232

ΤΟ233

Τϋ234

Τϋ269

Τ0274

Τ0275

Τ0302

ТО306

ΤΟ307

Τϋ316

ΤΟ343

ССААСААСС6АССССТОС (8ΕΟ. Ю N0:26) ОСССТССАСТТССААААААССССАСТСТТАСТССАСТТСТСТТСАААСТССАСТААСАСТССССТСАА ТАССССТТССТССТСАС (ЗЕО ΙΟ N0:27)

СААТТСТСССАССССССААС (ЗЕО ГО N0:28) САСАСАСАССТСАСССТТТС(ЗЕО ГО N0:29) СТССАСТТССААААААССАТСТТАТТТСТТСССАСТСТСТТСААСТСССААСАААТААСАТССАААССС САСТСТСТСТСССА (ЗЕО ГО N0:30)

СТССАСТТССААААААСАСТАСАССТААСССТАТССАССАААТТСТСТТСАААТТТССТССАТАСССТТ АОСТОТАОтеОАСТААОАОСАТССАеАСТе (ЗЕО Ю N0.31)

СТСеАСТТССААААААССААТТСАОСАСТСССТСАТСТСТТСААТСАСССАСТССТСААТТСССААТА

С116-1 сие-1 выпсие-4 сив-з

СЦ6-4 3ΗΝΡ-1496

С116-3 зЬМР-592 сие-1 зНРА-2087

ТСТСТАССТССТАСС (ЗЕО ГО N0:32)

СТССАСССААСААСССАССССТСС (ЗЕО ГО N0:33) Т0135 + ЗаИ

СТССАССААТТСТСССАССССССААС (ЗЕО Ю N0:34) ТО175 + За!1

СГССАССАСАСАСАСОТСАОССТТТС (ЗЕО ГО N0:35) . Т017б + 5а11

САСССТСАСТСТСАСССАСА (ЗЕО ГО N0:36) С73К

СТСВАСТТССААААААСАТСТСТТССАССАТТСААТСТСТТСААТТСААТССТСВААСАСАТСАААССС сЦб-4 зЬРВЧСАСТСТСТСТСССА (ЗЕО Ю N0:37) 2257

СТСВАСТТССААААААССВСАСТСТАбСАТАСТТАТСТСТТСААТААСТАТССТАСАСТСССССААТАТ с116-1 ЗНРВ2СТСТАССТССТАСС (ЗЕО ГО N0:38) 2240

СТССАСТТССАААААААТСТТАТТТСТТССВАСАСААТСТСТТСААТТСТСТСССААСАААТААвАТААА сЦ6-4 3ΚΝΡ-1484 ССССАСТСТСТСТСССА (ЗЕО ГО N0:39)

СТССАССАСССТСАСТСТСАСССАО (ЗЕО ГО N0:40) ТО269 + ЗаП

СТСОАОТТССААААААСАеОАТАСА.ССАТОСАТАСТСТСТТСААСТАТССАТССТеТАТССТСАААССТ с73К 3Ϊ1ΡΒ1-129 АССАССТОССССАА (ЗЕО Ю N0:41) СТСеАОТТССААААААеАТСТОТТССАССАТТСААТСТСТТСААТТСААТСОТССААСАСАТСАААОСТ с73К зЬРВ 1 -2257 АССАССТОССССАА (ЗЕО Ю N0:42) СТССАСТТССАААААААТСТТАТТТСТТСССАСАСААТСТСТТСААТТСТСТСССААСАААТААСАТСА сиб-3 εΗΝΡ-1484 СТААСАССАТССАСАСТС (ЗЕО ΙΟ N0:51)

Во всех экспериментах с анализом ГА, суммированных в табл. 5, плазмиды, экспрессирующие КЙРВ1-2257, кЮТ-1484 и кЮТ-149б, были способны очень эффективно ингибировать продукцию и РК8, и Η5Ν1 вирусов по сравнению с ложной плазмидой. В случае КЙРВ1-2257 и кШР-1484 они были способны полностью ингибировать репликацию обоих вирусов в ряде экспериментов, подтверждая их эффективность. Плазмиды, экспрессирующие кйРА-2087 и кйМР-592, также были способны эффективно ингибировать продукцию вирусов, но не так эффективно как КЙРВ1-2257, кЮТ-1484 и кЮТ-149б. Молекула

- 20 017948 δΡΡΒΙ-129 ингибировала продукцию низкопатогенного штамма РК8, но не ингибировала высокопатогенный штамм Н5Ы1. Наконец, несмотря на первоначально идентифицированную в качестве потенциальной последовательности-мишени 5Ι1ΡΗΚ. 511ΡΒ2-2240. была неспособна ингибировать репликацию любого из тестированных вирусов.

Пример. 5. Конструкция трансгенов с МиШ-Аагйеаб (МАН).

Было определено, что существенную выгоду имеет экспрессия множества 8ЙРНК из одного трансгена для дальнейшего снижения риска вариабельности вирусной последовательности-мишени для стратегии РНК1. Эти трансгены с МиШ-Аагйеаб (МАН) состоят из множественных транскрипционных единиц, каждой с другим куриным промотором ροϊ III (сиб-1, сИб-З, сИб-4 и е78К), экспрессирующим отдельные молекулы 8ЙРНК, нацеленной на консервативные последовательности описанных выше различных генов вируса гриппа А. Промоторные последовательности являются естественными для кур, и небольшие последовательности 8ЙРНК из 21 п.о. уже присутствовали бы у инфицированных А1 или вакцинированных птиц. Мишени РНК1 являются абсолютно специфическими для вирусов гриппа А, и, таким образом, не было бы эффектов в виде промахов мишени при таком специфическом трансгене.

Были сконструированы 4 трансгена МАН из выбранных 8ЙРНК следующим образом.

а) МА 111 - сИб-З 8ЙМР-592; сИб-1 5ЙРА-2087; сИб-4 8ЙЫР-149б.

Каждый трансген МАН содержит 3 транскрипционные единицы, которые независимо экспрессируют одну молекулу 8ЙРНК из куриного промотора ροϊ III. 3 отдельные транскрипционные единицы амплифицировали, используя одноэтапную РСК, и полученные фрагменты затем лигировали вместе для получения трансгена МАН (фиг. 2). Затем МАН может экспрессировать 3 отдельных 8ЙРНК из одного трансгена. Эти 3 транскрипционные единицы для МАН 1 представляют собой сИб-4 51ιΝΡ-1496; сИб-З 511МР-592 и сИб-1 5ЙРА-2087. Транскрипционную единицу сИб-4 51ιΝΡ-1496 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ233 и обратный праймер ТЭ21б, транскрипционную единицу сИб-3 Н1МР-592 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ234 и обратный праймер ΤΌ217, и транскрипционную единицу сИб-1 5ЙРА-2087 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ232 и обратный праймер ΤΌ218 (детали праймеров описаны в табл. 4). Каждый из продуктов РСК клонировали в рСЕМ-Τ Еаку, и каждый содержал рестрикционный ферментный сайт 5' 8аП и рестрикционный ферментный сайт 3' БаП. Оба эти рестрикционных сайта имеют совместимые выступающие концы, которые обеспечивали возможность последовательного лигирования вместе отдельных транскрипционных единиц для получения конечного трансгена МАН (фиг. 2).

Таблица 5

Воздействия 8ЙРНК на продукцию вируса в клетках МЭСК

Цифры в скобках представляют величины множественности инфекции (то1)

Эксперимент	Экспрессионная конструкция Й1РНК	Продукция вируса (титр в единицах ГА)
РК8 (0.1)	РК8 (0.01)	РК8 (0.001)	РВ8 (0.0001)	РР8 (0.00001)	Η5Ν1 (0.01)	Η5Ν1 (0.001)	Η5Ν1 (0.0001)
1	Ложная	512	256	64	16
	рсиб-4 3ΚΝΡ-1484	256	128	16	4
	рс73К ЗГ1РВ1-2257	128	16	4	0
	рсиб-4 8Г1РВ1-2257	128	32	4	0
2	Ложная			256	128	128
	рсиб-4 50ΝΡ-1496			64	32	8
	рсие-4 5Й4Р-1484			32	16	2
	рсив-4 5ЙРВ1-2257			0	0	0
	рсив-1 ЗЙРВ2-2240			256	128	128
	рс78КзЬРВ1-129			128	64	32
3	Ложная			64	128	64
	рсив-4 εΙτΝΡ-1496			32	8	2
	рсВ 6-4 βΟΝΡ-1484			0	0	0
	рсиб-4 8Г1РВ1-2257			0	0	0
	рс116-1 зИ РА-2087			128	128	32
	рсиб-3 8ЙМР-592			128	32	32
4	Ложная						64	16	4

- 21 017948

	рсиб-4 είιΝΡ-1484						0	0	0
	рс116-3 δΗΝΡ-1484						0	0	0
	рс116-4 ЗЙРВ1-2257						0	0	0
5	Ложная						64	32	16
	рсйб-4 зЬЫР-1496						2	2	2
	рсЙб-4 ЗЙРВ1-2257						0	0	0
	рс78К ЗЙРВ1-2257						8	16	16
6	Ложная			64	32	8
	РС116-4 δήΝΡ-1496			16	8	2
	рсиб-1 зЬРА-2087			32	16	8
	рс116-3 зйМР-592			32	8	4
	рсйб-4 ЗЙРВ1-2257			0	0	0
7	Ложная						64	64	32
	рсВбЛ 3ΗΝΡ-1496						8	2	0
	рсиб-1 зКРА-2087						64	32	16
	рсйб-3 3Ϊ1ΜΡ-592						32	16	4
	рсиб-4 3ΗΡΒ1-2257				-		0	0	0
	ροϋθ-1 ЗЙРВ2-2240						64	64	32
	рс73К ЗЙРВ1-129						64	64	32
8	Ложная						64	64	32
	МИН 1						32	16	8
	МИН 2						64	64	16
	МИН 3						8	8	4
	МИН 4						4	4	0

b) \1\\Ί 12 - сИ6-4 8ЙРВ1-2257; сИ6-1 8ЙРВ2-2240; с78К 8ЙРВ1-129.

Эти 3 транскрипционные единицы для М\УН 2 представляют собой сИ6-4 8ЙРВ1-2257; сИ6-1 511РВ2-2240; и с78К 8ЙРВ1-129. Транскрипционную единицу сИ6-4 8ЙРВ1-2257 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ233 и обратный праймер ΤΌ274, транскрипционную единицу сИ6-1 511РВ22240 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ232 и обратный праймер ΤΌ275, и транскрипционную единицу с78К 511РВ1-129 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ306 и обратный праймер ΤΌ307 (детали праймеров описаны в табл. 4). Каждый из продуктов РСК клонировали в рСЕМ-Τ Еаку и последовательно лигировали для построения конечного трансгена МИН, как описано выше и на фиг. 2.

c) М\\'11.3 - сИ6-4 5ЙЫР-1484; сИ6-1 5ЙРЛ-2087; с78К +РВ1-2257.

Эти 3 транскрипционные единицы для М\УН3 представляют собой: сИ6-4 §йЫР-1484; сИ6-1 511РЛ2087 и с78К 511РВ1-2257. Транскрипционную единицу сИ6-4 §йЫР-1484 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ233 и обратный праймер ΤΌ302, транскрипционную единицу сИ6-1 511РЛ-2087 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ232 и обратный праймер ΤΌ218 и транскрипционную единицу с78К 8ЙРВ1-2257 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ306 и обратный праймер ΤΌ316 (детали праймеров описаны в табл. 4). Каждый из продуктов РСК снова клонировали в рСЕМ-Τ Еаку и последовательно лигировали для построения конечного трансгена МИН, как описано выше и на фиг. 2.

й) \1\\'114 - сИ6-4 8ЙРВ1-2257; сИ6-3 5ЙЫР-1484; сИ6-1 5ЙРЛ-2087.

Эти 3 транскрипционные единицы для М\УН4 представляют собой: сИ6-4 8ЙРВ1-2257; сИ6-3 8ЙЫР1484 и сИ6-1 511РЛ-2087. Транскрипционную единицу сИ6-4 8ЙРВ1-2257 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ233 и обратный праймер ΤΌ274, транскрипционную единицу сИ6-3 §йЫР-1484 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ234 и обратный праймер ΤΌ343, и транскрипционную единицу сИ6-1 5ЙРА-2087 амплифицировали, используя прямой праймер ΤΌ232 и обратный праймер ΤΌ218 (детали праймеров описаны в табл. 4). Каждый из продуктов РСК снова клонировали в рСЕМ-Τ Еаку и последовательно лигировали для построения конечного трансгена МИН, как описано выше и на фиг. 2.

конечных трансгена МИН также тестировали на их способность ингибировать продукцию вируса в анализе ГА с использованием вируса гриппа А Н5Ю (табл. 4, эксперимент 8). МИН 3 и 4 были наиболее эффективными трансгенами. МИН 1 также эффективно ингибировал продукцию вируса Н5Н1, тогда как МИН 2 не был таким эффективным как МИН 1.

Пример 6. Клонирование трансгенов МИН в вектор ρδΙιιίΤίΙ.

Каждый М\УН клонировали в плазмиду ρδΙιιΤΠΐ (фиг. 3). Эта плазмида содействует вставке трансгенов М\УН между фрагментами наполнителя/буфера куриной геномной ДНК для потенциальной защиты последовательностей МИН и от процесса вставки трансгена, и от прочитанной внешней транскрипции. Фрагменты наполнителя МЕ1 и СКМ5 были выбраны из больших интронных последовательностей из куриного генома (т.е. геномные пустыни), и они лишены транскрипционных элементов, которые могли

- 22 017948 бы мешать экспрессии трансгена М№Н. Определенные области, описанные в ОепВапк, представляют собой

МЕ1 1500 (сЬг3) §6|ΆΆΌΝ02002420.1 30995-32489 п.о.;

МЕ1 200 (сЬг 3) §6|ΆΆΌΝ02002420.1 5079-5276 п.о. и

ОВМ5 1500 (сЬг 1) §ΐ>|ΆΆΌΝ02004814.1 13141-13113, 13078-12911, 12848-11638 п.о.;

ОВМ5 200 (сЬг 1) §6|ΆΛΌΝ02004814.1 10126-9927 п.о.

Конструирование плазмиды ρδΙπΓΓίΙ.

Плазмиду ρδΐπΓΓίΐ конструировали клонированием четырех областей куриного генома в определенном порядке, продиктованном использованием рестрикционных ферментных сайтов, в вектор клонирования р1С20Н (фиг. 3). Перечисленные в табл. 6 фрагменты сначала амплифицировали РСК, используя праймеры, перечисленные в табл. 7, а затем отдельно клонировали в рОЕМ-Т Еаку (Ιηνίΐτο^η) и определяли последовательности. Затем эти фрагменты подвергали эксцизии из рОЕМ-Т Еаку и последовательно клонировали, используя рестрикционные ферментные сайты, перечисленные в табл. 5. Во-первых, ОРМ5 200 клонировали в р1С20Н, а затем в МЕ1 200, 6КМ5 1500 и МЕ1 1500. На каждой стадии клонирования полученную плазмиду проверяли переваром рестрикционного фермента и определением последовательностей ДНК. Конечная собранная плазмида была обозначена как р8и.1ГГц.

Таблица 6

Конструирование р8и.1ГП1

Обозначения клонированных фрагментов и праймеров, использованных при их амплификации

Название фрагмента	Праймеры	Ферментные сайты
ΘΡΜ5 200	Τϋ277 / Т0278	ЕсоР!) ЕсоНУ
МЕ1 200	ТО281 /Τϋ282	8атН! / ЕсоК!
ΘΗΜ5 1500	ΤΟ279/Τϋ280	ΕοοΚν/ΧΛοΙ
МЕ1 1500	ТО283/ТО284	ЗрЫ /8атН1

Таблица 7

Конструирование р8и.1ГП1

Обозначения и последовательность праймеров РСР. Подчеркнуты рестрикционные ферментные сайты

Название праймера	Последовательность праймера	Фермент клонирования
ТО277	САА ТТС САТ АСС АСТ ОСС АСС СТС ССА АСТ САТ ССС АСТ ΘΑΤ АСТ С (ЗЕО ГО N0:43)	ΕσοΕίΙ
Τϋ278	САТ АТС ТТА АТТ ААС ТОО ААС ОТТ ОСА СТА АС (ЗЕО ГО N0:44)	ЕсоВУ
ТЭ279	САТ АТС ТТС ТСС СТТ ССА ОСА АСА С (ЗЕО Ю N0:45)	ЕсоКУ
ТР280	СТС САС АТТ ТАА АТА САТ ТСС АСС АСА АСС АС (ЗЕО ГО N0:46) :	Χ/?οΙ
Τϋ281	ССА ТСС ТТА АТТ ААС ТСС АДА СТА ОСА СОТ ССА АС (ЗЕО ГО N0:47)	ЗаптН!
ТО282	САА ТТС ССА САС САТ ССА СОТ ССТ ОСТ ТАС ТСС АСС ТАС СТС САА ТС (ЗЕО ГО N0:48)	ЕсоК!
ТР283	ССА ТСС АТТ ТАА АТС АСА ССА ССА ССТ САА АСА С (ЗЕО Ю N0:49)	ЗрЖ
ТО284	ССА ТСС ТСА АСТ ССС ТСС ТСА ССА АС (ЗЕО ГО N0:50)	ВашН!

Вставка трансгенов М№Н в р8и.1ГГц.

Вектор р§1иГП11 имеет необычный рестрикционный сайт ЕсоРб расположенный между последовательностями ОРМ5 200 и МЕ1 200 для обеспечения возможности вставки каждого трансгена М№Н. Каждый трансген М№Н был вставлен в р§1ыГГ11 лигированием в этот рестрикционный сайт ЕсоР1. Были также включены Рас1 и 8^а1 для обеспечения возможности эксцизии конструкции с варьирующимися количествами фланкирующей последовательности (фиг. 3). Рестрикционные ферментные сайты НшбШ вектора р1С20Н могут использоваться для эксцизии всей клонированной последовательности. Поэтому конечные плазмиды р81нГП1. содержащие каждую из вставок М№Н, переваривали рестрикционным ферментом НтйШ для высвобождения конечной вставки для очистки и использования для опосредованного спермой процесса переноса гена (8МОТ).

Пример 7. Основанный на линкере опосредованный спермой перенос гена.

Процесс доставки конструкции в оплодотворенную куриную яйцеклетку может достигаться основанным на линкере опосредованным спермой переносом гена. Эта процедура проводится, как описано в патенте США № 7067308. Вкратце, свежесобранную куриную сперму промывают и инкубируют с мышиным моноклональным антителом шЛЬС (секретируемым гибридомой с присвоенным номером доступа в АТСС РТА-6723) и затем с конструкцией ДНК. Добавленное моноклональное антитело содействует

- 23 017948 связыванию ДНК со спермой. Затем куры искусственно осеменяются комплексом спермы/ДНК. Процесс повторяют 4 раза с интервалом 72 ч между осеменениями. Яйца собирают ежедневно через интервал два дня после первого осеменения до 3 дней после конечного осеменения.

Пример 8. Вставка трансгенов М\УН в То12 и доставка курам.

Трансгены М\УН 3 (8ЕО ΙΌ N0: 21) и М\УН 4 (8Е0 ГО N0: 61) клонировали в вектор ртшТо12/МС8 (8Е0 ГО N0: 64); Ва1сшпа8 е1 а1., 2006) транспозона То12. Оба трансгена удаляли из вектора рОЕМ-Т Еаку двойным перевариванием 8а11 и Х1юЕ Затем этот фрагмент лигировали в необычный сайт Х1о1 в пределах множественных клонирования вектора транспозона То12.

Процесс доставки конструкции М\УН 3 То12 (8Е0 ГО N0: 62) и конструкции М\УН 4 То12 (8Е0 ГО N0: 63) в куриный эмбрион может быть достигнут использованием примордиальных зародышевых клеток (РОС). Вкратце, РОС собирают из донорских куриных эмбрионов, или из крови, когда возраст эмбриона составляет 2 дня, или из гонад эмбриона в возрасте 5,5 дней. РОС очищают из крови или ткани гонад, используя магнитное антительное разделение клеток (МЛС8). Очищенные РОС затем подвергают электропорации конструкциями То12 и отдельной плазмидой, кодирующей транспозазу То12 (рСМУТо12; 8Е0 ГО N0: 66; Ва1сшпа§ е1 а1., 2006), с использованием прибора Атаха Хис1еоГес1ог. Затем эти клетки инъецируют назад в эмбрион-реципиент в возрасте 2,5 дней. Трансформированные РОС мигрируют для формирования гонад развивающегося эмбриона.

Процесс доставки конструкций То12 в куриный эмбрион может также достигаться прямой электропорацией бластодермы свежеснесенных яиц. Вкратце, свежеснесенное оплодотворенное яйцо вскрывают для обнаружения бластодермы. В бластодерму инъецируют ДНК конструкции То12 вместе с плазмидой, кодирующей транспозазу То12, используя микрокапиллярную пипетку. Затем проводят электропорацию бластодермы ίη оуо, используя устройство для электропорации ВТХ ЕСМ830 Е1ес1го 8с.|иаге РогаЮг. РОС локализуются в центре бластодермы, и если эти клетки трансформированы конструкцией после электропорации, они будут продолжать становиться зародышевыми клетками внутри гонад развивающегося эмбриона.

Пример 9. Скрининг потомства поколения О0 для выявления трансгенов.

Небольшое количество крови берут или из вены крыла или из кончиков перьев однонедельного потомства поколения О0. Геномную ДНК получают из вены крыла, используя мининабор для анализа ДНК в крови 01Атр ЭХА В1ооб М1ш кй (01адеп). ДНК из крови кончиков перьев получают, используя раствор для экстракции ДНК ОшскЕх1гас1™ ЭНА ЕхйасИоп 8о1и1юп (Ерюепйе Вю1ес11по1од1е5). Проводят два теста этих образцов для подтверждения присутствия конструкции.

Саузерн блоттинг.

РСК проводят на геномных образцах, используя прямые и обратные праймеры, перечисленные в табл. 8. Затем смесь РСК наносят на агарозный гель, переносят на мембрану и гибридизируют радиоактивно меченным зондом блокированной нуклеиновой кислоты (табл. 8). После гибридизации и промывания в растворе с высокой строгостью требований к его составу на мембрану воздействуют рентгеновской пленкой. На положительный результат указывает полоса правильного размера, выявляемая на итоговой ауторентгенограмме.

Таблица 8

Олигонуклеотиды, использованные в РСК анализе Саузерн блоттинга

Функция	Обозначение	Последовательность
Прямой праймер	ТО320	ТТО ССС ССА ААС АОС АА (ЗЕО ГО N0:55)
Обратный праймер	ТО321	ОАС САТ ССА СОТ ОСТ ОСТ ТА (8Е<2 Ю N0:56)
Зонд	ТЭ319	САТ ТСО АСО ТАО СТО СА (ЗЕО ГО N0:57)

Количественная РСК в реальном масштабе времени.

РСК в реальном масштабе времени проводят на геномных образцах, используя праймеры, перечисленные в табл. 9. В анализе используется связывание реагента 8УВК Огееп с двунитевой ДНК и последующий анализ кривой плавления для определения положительного образца.

- 24 017948

Таблица 9

Праймеры, использованные в анализе РСК в реальном масштабе времени

Функция	Обозначение	Последовательность
Прямой праймер	ВС_Р_03	ОСА ОСА СОТ ОСА ТОО ТСТ С (ЗЕО Ю N0:58)
Обратный праймер ( промотор сиб-4)	ΤΏ251	ТСТ ТСС ОСС СТС ССА САА ТТ (ЗЕО Ю N0:59)
Обратный праймер (промотор сиб-3)	ΊΌ252	ОСТ ТАО ААА ОСС ТОА СОТ СТ (ЗЕО 1 ϋ N0:60)

Пример 10. Тестирование для выявления трансгенных птиц.

БВ-8МСТ.

Птица, идентифицированная в качестве трансгенной в популяции поколения С0, сохраняется и содержится до полового созревания. После полового созревания птица используется в экспериментах спаривания для генерирования трансгенного потомства поколения С1, которое имеет копию конструкции в каждой клетке. Саузерн блоттинг и РСК в реальном масштабе времени снова используются для демонстрации трансгенной природы потомства поколения С1.

Более детальный анализ с использованием геномных Саузерн блоттингов и РСК в отношении сайта вставки и числа копий конструкции проводится на этих птицах.

Птицы поколения С1, идентифицированные как обладающие релевантной вставкой конструкции, выращиваются до половой зрелости. Некоторые из потомства поколения С2 от этих птиц используются в испытаниях на животных для верификации их устойчивости к различным штаммам птичьего гриппа. Другие птицы поколения С2 анализируются для выявления экспрессии конструкции в различных тканях и в различные возрасты.

Транспозон То12.

Вылупляться будут эмбрионы поколения С0, которые получили или РСС, трансформированные То12, или были подвергнуты электропорации конструкцией То12. Содержатся и выращиваются до половой зрелости только самцы цыплят поколения С0. Сперму птиц собирают у самцов птиц, и РСК выполняют для подтверждения того, содержат ли птицы релевантную конструкцию. Птиц, которые дают положительный результат в отношении РСК, используют в экспериментах спаривания для генерирования трансгенного потомства поколения С1, которое имеет копию конструкции в каждой клетке. Снова используют Саузерн блоттинг и РСК в реальном масштабе времени для демонстрации трансгенной природы потомства поколения С1.

Пример 11. Модельная система - трансгенная мышь, устойчивая к гриппу А.

Авторы сконструировали 2 кассеты 8ЙРНК трансгена для генерирования трансгенных мышей. Каждая кассета содержала промотор И6 мыши для экспрессии или 511ΝΓ-1496, или кйЕСРР. Затем оба трансгена использовали для генерирования трансгенных мышей с использованием лентивирусной технологии. Вкратце, кассеты 8ЙРНК трансгена 511ΝΓ-1496 и 8ЙЕСРР клонировали в вектор переноса лентивирусного гена (АикСепе, Веп11е1дй, Аийгайа). Затем трансгенные вирусные конструкции упаковывали в лентивирусные частицы. Определяли лентивирусные титры и лентивирусные частицы инъецировали в перивителлиновое пространство ранней стадии мышиных эмбрионов. Эмбрионы повторно имплантировали ложно беременным самкам мышей и проводили скрининг полученного потомства анализом Саузерн блоттинга. Получали трансгенных мышей-основателей, которые имели устойчивую интеграцию любого трансгена. Затем основателей спаривали с мышами дикого типа для генерирования потомства поколения Р1. Затем трансгенных мышей поколения Р1 тестировали в эксперименте с контрольным заражением для определения устойчивости к инфекции вирусом гриппа А.

В эксперимент с контрольным заражением были включены 3 группы, каждая из которых включала 5 мышей. Каждая из групп 1 и 2 включала 5 мышей с 8ЙРНК 511ΝΓ-1496. Группа 3 включала 5 мышей с 8ЙРНК 511ЕСРР. Группы 2 и 3 получали интраназальное контрольное заражение низкопатогенным вирусом гриппа А Η1Ν1 А/РК/8/34 (РК8) в количестве 5х10² ТСШ₅₀. Контрольное заражение группы 1 проводили солевым раствором с фосфатным буфером (РВ8) без вируса. Массу тела контролировали ежедневно в течение 10 дней после контрольного заражения и в конце эксперимента мышей умерщвляли и образцы легких брали для измерения вирусной РНК с использованием цРСК.

Как показано на фиг. 4, у трансгенных мышей с трансгеном 511ΝΓ-1496 были превосходные уровни устойчивости к инфекции по сравнению с мышами с нерелевантным трансгеном 511ЕСРР. Мыши 511ΝΓ1496 не теряли массу тела в ходе эксперимента при сравнении с контрольной группой, получавшей РВ8. Мыши 511ЕСРР проявили статистически значимое снижение массы тела, указывающее на активную инфекцию вирусом гриппа. При измерении содержания вирусной РНК в образцах легких от мышей в группах 2 и 3, у мышей с трансгеном 511ΝΓ-1496 имелось уменьшение вирусной РНК более чем на 90% по сравнению с мышами, содержащими нерелевантный трансген 01ЕСРР. Как правило, эти результаты ука

- 25 017948 зывают на то, что трансгенные мыши, содержащие молекулу кйРНК, которая специфически нацелена на вирус гриппа А, такую как 8ЙЫР-1496, высокоустойчивы к экспериментальному контрольному заражению вирусом гриппа А Н1М А/РВ/8/34 (РВ8).

Специалистам в данной области будет понятно, что в изобретение, показанное в определенных вариантах осуществления, могут быть внесены многочисленные вариации и/или модификации без отхода от сущности или широкоописанного объема изобретения. Поэтому настоящие варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.

Все публикации, обсужденные или указанные в ссылках, полностью включены в настоящее описание.

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент США 60/938315 и заявки на патент Австралии 2007902616, полные содержания которых включены в настоящее описание путем ссылки.

Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий или тому подобного, которое было включено в настоящее описание, предназначено исключительно для цели обеспечения контекста для настоящего изобретения. Это не следует воспринимать как допущение того, что любой или все эти вопросы составляют часть основы предшествующего уровня техники или являются общеизвестными в области, релевантной настоящему изобретению, поскольку они существовали до даты приоритета каждого пункта формулы данной заявки.

Ссылки

Ва1сшиак е! а1. (2006) РЬо8 Сепе! 10:е169.

Вокке1тап е! а1. (1989) 8аепсе, 243:533-534.

СКпп е! а1. (1993) Се11, 74:504-514.

Иге, е! а1. (1998) ЫаШге, 391:806-811.

Рге1ег, е! а1. (1986) Ргос №111 Асаб 8с1 И8А, 83:9373-7.

Н1дакЫЬа1а, е! а1. (2004) I Вопе Мшет Век, 19:78-88.

Нодда!!, е! а1. (2002) С1гс Век, 91:1151-59.

Катакатц е! а1. (2000) Ргос Ыаб Асаб δοΐ И8А, 97:11403-11408.

Ке!!шд, е! а1. (1999) Се11, 99:133-141.

Кода, е! а1. (1996) Наине, 383:30.

Ьауйтапо, е! а1. (1989) Се11, 57:717-723.

Ьоуе е! а1. (1994) Вю/Тесйпо1оду, 12:60-63.

Nа^!ο е! а1. (2006) Кис1е1с Ас1бк Век, бб. 34 (\УеЬ8егуег[5кие):\У448-50.

№еб1етап, 8.В. апб №ипксб, С.1 У (1970) I Мо1 Вю1, 48: 443-453.

№с1ю1коп, е! а1. (2005) Ьапсе!, 362:1733-1745.

Ва!сб££, е! а1. (1999) Р1ап! Се11, 11:1207-1216.

ТаЬага, е! а1. (1999) Се11, 99:123-132.

Тахтап, е! а1. (2006) ВМС Вю!есЬпо1, 1ап 24, 6:7.

Тботауа1 е! а1. (1995) Ттапкдешс Векеатсб 4:369-36.

2атоте, е! а1. (2000) Се11, 101:25-33.

2йапд, е! а1. (2004) Сепоте Век 14:79-89.

Claims (18)

1. Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере три молекулы РНК, содержащие двунитевую область, где молекулы РНК снижают репликацию вируса гриппа А в клетке животного по сравнению с изогенной клеткой животного, инфицированной вирусом гриппа А, не имеющей молекул РНК, где двунитевые области содержат нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 95% идентичны нуклеотидной последовательности, выбранной из (1) №С) ГО N0: 7, 5ЕО ГО N0: 9 и 5ЕО ГО N0: 12, (б) №С) ГО N0: 9, 5ЕО ГО N0: 13 и 5ЕО ГО N0: 15 и (ηί) 5ЕС) Ю N0: 6, 5ЕО Ю N0: 7 и 5ЕО Ю N0: 8.

2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где двунитевые области содержат нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 95% идентичны 8Е0 Ш N0: 7, 8Е0 Ш N0: 9 и 8Е0 Ш N0: 12.

3. Композиция, содержащая три выделенных и/или экзогенных молекул нуклеиновой кислоты, где двунитевые области содержат последовательности нуклеотидов, которые по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям, выбранным из (1) №С) ГО N0: 7, 5ЕО ГО N0: 9 и 5ЕО ГО N0: 12, (б) №С) ГО N0: 9, 5ЕО ГО N0: 13 и 5ЕО ГО N0: 15 и (ηί) 5ЕС) Ю N0: 6, 5ЕО Ю N0: 7 и 5ЕО Ю N0: 8.

4. Композиция по п.3, где двунитевые области содержат последовательности нуклеотидов, которые по меньшей мере на 95% идентичны 8Е0 Ш N0: 7, 8Е0 Ш N0: 9 и 8Е0 Ш N0: 12.

5. Вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2.

- 26 017948

6. Клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, композицию по п.З или 4 и/или вектор по п.5.

7. Трансгенный организм, не являющийся организмом человека, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, композицию по п.З или 4, вектор по п.5 и/или клетку по п.6.

8. Трансгенный организм по п.7, который представляет собой курицу, индюшку или утку.

9. Композиция, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, вектор по п.5 и/или клетку по п.6.

10. Способ лечения и/или профилактики инфекции индивидуума вирусом гриппа А, причем способ включает введение индивидууму конструкции нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, композиции по п.З или 4, вектора по п.5 и/или клетки по п.6.

11. Способ снижения экспрессии одного или нескольких генов вируса гриппа А в клетке, включающий введение в клетку композиции по п.З или 4.

12. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, композиции по п.З или 4, вектора по п.5 и/или клетки по п.6 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики инфекции вирусом гриппа А.

13. Способ идентификации животного, содержащего конструкцию нуклеиновой кислоты по п.1 или 2 или композицию по п.З или 4, включающий определение присутствия или отсутствия конструкции по п.1 или 2 и/или композиции по п.З или 4 в образце, полученном у животного.

14. Способ выведения устойчивого к гриппу трансгенного животного, отличного от человека, включающий:

(ί) введение конструкции нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2 в клетку животного, (ίί) отбор трансгенной клетки, не являющейся клеткой человека, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, (ш) регенерацию трансгенного животного, отличного от человека, из трансгенной клетки, не являющейся клеткой человека, (ίν) выведение трансгенного животного, отличного от человека, для получения трансгенного потомства и (ν) отбор трансгенного потомства, которое устойчиво к гриппу.

15. Способ получения пищевого продукта, причем способ включает:

(ί) введение конструкции нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2 в клетку животного, (ίί) выбор трансгенной клетки, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, (ίίί) регенерацию трансгенного животного из трансгенной клетки, (ίν) выведение трансгенного животного для получения трансгенного потомства и (ν) получение пищевого продукта из трансгенного потомства.

16. Способ получения трансгенного животного, отличного от человека, включающий:

(ί) введение в клетку первой нуклеиновой кислоты, содержащей транспозон, где нуклеиновая кислота содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, (ίί) введение в клетку второй нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, (ίίί) выбор трансгенной клетки, содержащей первую нуклеиновую кислоту в геноме клетки, (ίν) регенерацию трансгенного животного, отличного от человека, из клетки и (ν) выведение трансгенного животного.

17. Трансгенное животное, отличное от человека, устойчивое к гриппу, где указанное трансгенное животное содержит конструкцию нуклеиновой кислоты по п.1 или 2.

18. Применение трансгенного организма по пп.7, 8 или 17 для выведения и/или для производства пищевых продуктов.