CN106381296A - 表达多基因抗流感转基因动物的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达多基因抗流感转基因动物的构建方法。该方法在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，靶向流感病毒基因构建了串联表达的shRNA表达盒，将Mx-RNAis与shRNA表达盒联合构建到表达载体并包装重组慢病毒，制备转基因动物获得表达抗流感基因的转基因动物。实验结果表明转基因动物具有显著抑制猪流感病毒复制的活性。

Description

表达多基因抗流感转基因动物的构建方法

技术领域

本发明属于属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及表达多基因抗流感转基因动物的构建方法。

背景技术

猪流感是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒引起的猪呼吸道疾病。目前，猪流感已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等地，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疾病，给养猪业带来巨大经济损失。猪流感病毒不仅危害猪群，而且可引起禽类流感和人流感的发生。所以，研究猪流感具有重要的公共卫生意义。

A型流感病毒容易发生抗原变异，且主要以两种形式出现：一种是因为病毒基因发生点突变引起的抗原漂移，另一种是由于两种不同流感病毒共同感染一个细胞而发生基因重配，产生新的病毒亚型，从而导致病毒蛋白的抗原性发生变化，后者因为病毒抗原性发生较大改变而称之为抗原转变。抗原漂移与抗原转变都会改变病毒表面蛋白抗原性，主要影响流感病毒血凝素为主，其次是神经氨酸酶(Vijaykrishna D et al.，2011)。在体内和体外的研究中，都表明猪是A型流感病毒进行基因重组的温和宿主，在其体内存在α-2，6唾液酸受体和α-2，3唾液酸受体，能够促进其他流感病毒基因进行重组而进化新病毒株。这些“新”流感毒株产生后能够感染的猪、人类和禽类(Zhang et al.，2009)。通过系统发育和流行病学分析以及分子生物学研究，都证实在猪宿主细胞内有通过不同的父母病毒基因重组而产生的新病毒存在。

本领域技术人员，致力于通过找到一些具有抵抗某种病毒的基因或者蛋白，然后将其或者编码蛋白的基因作为目的基因转入动物体内，获得能够高效表达该基因的转基因动物，从而起到抵抗病毒的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达多基因抗流感转基因动物的构建方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种shRNA构建物，所述shRNA构建物包括第一siRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列包括核苷酸序列：

AAGATCTGTTCCACCATTGAA(SEQ ID NO.:13)。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：

Seq_正向a-Xa-Seq_反向a 式Ia

式中，

Seq_正向a核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示；

Seq_反向a为与Seq_正向a基本上互补的核苷酸序列；

Xa为位于Seq_正向a和Seq_反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向a和Seq_反向a不互补。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列如下所示：

5’-AAGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGACGTTCAATGGTGGAACAGATCTT-3’

(SEQ ID NO.:14)

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。所述hH1启动子序列启动所述式Ia序列的转录。

在另一优选例中，所述hH1启动子序列如SEQ ID NO.:15所示。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第二siRNA编码序列，所述第二siRNA特异性靶向流感病毒PA基因或其片段。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列包括核苷酸序列：AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA(SEQ ID NO.:16)。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列含有式Ib所示的结构：

Seq_正向b-Xb-Seq_反向b 式Ib

式中，

Seq_正向b核苷酸序列如SEQ ID NO.:16所示；

Seq_反向b为与Seq_正向b基本上互补的核苷酸序列；

Xb为位于Seq_正向b和Seq_反向b之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向b和Seq_反向b不互补。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGACGTCAGGCACTCCTCAATTGCTT-3'(SEQ ID NO.:17)

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列还包含与式Ib序列可操作性连接的h7SK启动子序列。所述h7SK启动子序列启动所述式Ib序列的转录。

在另一优选例中，所述h7SK启动子序列如SEQ ID NO.:18所示。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第三siRNA编码序列，所述第三siRNA特异性靶向流感病毒NP基因或其片段。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列包括核苷酸序列：

AAGGATCTTATTTCTTCGGAG(SEQ ID NO.:19)。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列含有式Ic所示的结构：

Seq_正向c-Xc-Seq_反向c 式Ic

式中，

Seq_正向c核苷酸序列如SEQ ID NO.:19所示；

Seq_反向c为与Seq_正向c基本上互补的核苷酸序列；

Xc为位于Seq_正向c和Seq_反向c之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向c和Seq_反向c不互补。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAGGATCTTATTTCTTCGGAGTTCAAGACGCTCCGAAGAAATAAGATCCTT-3'(SEQ ID NO.:20)

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列还包含与式Ic序列可操作性连接的mU6启动子序列。所述mU6启动子序列启动所述式Ic序列的转录。

在另一优选例中，所述mU6启动子序列如SEQ ID NO.:21所示。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第四siRNA编码序列，所述第四siRNA特异性靶向流感病毒PB2基因或其片段。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列包括核苷酸序列：

AAAGCAACTAGAAGGCTGATT(SEQ ID NO.:22)。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列含有式Id所示的结构：

Seq_正向d-Xd-Seq_反向d 式Id

式中，

Seq_正向d核苷酸序列如SEQ ID NO.:22所示；

Seq_反向d为与Seq_正向d基本上互补的核苷酸序列；

Xd为位于Seq_正向d和Seq_反向d之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向d和Seq_反向d不互补。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAAGCAACTAGAAGGCTGATTCTATGGACAAATCAGCCTTCTAGTTGCTTT-3'(SEQ ID NO.:23)

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列还包含与式Id序列可操作性连接的hU6启动子序列。所述hU6启动子序列启动所述式Id序列的转录。

在另一优选例中，所述hU6启动子序列如SEQ ID NO.:24所示。

在另一优选例中，所述所述shRNA构建物包括核苷酸序列SEQ ID NO.:25。

在另一优选例中，所设计的shRNA，分别在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，以DNA序列的形式构建转录shRNA的表达盒。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述shRNA构建物还包括Mx-RNAis序列，优选地，将CMV启动子启动表达的Mx-RNAis基因和由四个不同启动子分别启动表达的shRNA串联，从而构建shRNA-Mx-RNAis构建物。

优选地，上述shRNA-Mx-RNAis构建物的核苷酸序列如SEQIDNO.:26所示。

本发明的第二方面，提供了一种shRNA，所述shRNA由本发明第一方面所述的shRNA构建物转录而来。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的shRNA构建物。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体中含有抗生素筛选标记。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有本发明第一方面所述的shRNA构建物。

在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物优选为家畜或啮齿动物，包括但限于：猪、牛、羊、马、驴、鹿、兔、鼠。

在另一优选例中，所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组：胚胎成纤维细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。

本发明的第六方面，提供了一种制备转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤：

(i)提供一含有本发明第一方面所述的shRNA构建物的载体或来自所述载体的含本发明第一方面所述的shRNA构建物的核酸片段；

(ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞；

(iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有本发明第一方面所述的构建物的细胞，从而获得整合的细胞；

(iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞；

(v)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合蛋白的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物；

其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。

在另一优选例中，所述物种为猪、牛、羊、马、驴、鹿、兔、鼠。

在另一优选例中，所述转基因非人哺乳动物具有抗流感的能力。

在另一优选例中，所述流感为H1N1、和/或H5N1流感病毒。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(vi)将步骤(v)中获得的转基因的非人哺乳动物作为F0代，与野生型同品种哺乳动物杂交，繁育F1代，从而获得F1代转基因哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(vi i)利用步骤(vi)获得的F1代转基因哺乳动物繁育获得F2代转基因哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是荧光定量PCR检测流感病毒PB2mRNA的含量图

图2是细胞上清中病毒滴度测定结果图

图3显示了HA试验中特异性miRNA对流感病毒增殖的影响；

图4显示了各转染组流感病毒PB2基因的相对转录本水平；

图5显示重组的pcDNA6.2EmGFP-Mx酶切鉴定结果；

图6质粒载体构建原理

图7是4shRNA质粒结构示意图

图8不同细胞系感染H1N1猪流感病毒上清中病毒滴度检测

图9是pLV-shRNAis-Mx-RNAi慢病毒载体图谱

图10是重组慢病毒载体酶切鉴定图

图11是F0代猪尾组织基因组Southern blot结果图

图12是F0代猪尾组织基因组RT-PCR结果

图13是F0代猪尾组织Mx蛋白免疫印迹杂交结果图

图14是F1代猪尾组织基因组Southern blot结果图

图15是F1代猪尾组织Mx蛋白免疫印迹杂交结果图

图16是F1代转基因猪体细胞感染16h IFA检测结果图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种表达多基因抗流感转基因动物的构建方法，利用体细胞克隆技术与常规育种技术，将具有抗各亚型流感病毒作用的多靶点RNAi、和Mx基因联合，构建与由CMV启动子启动表达Mx-RNAis双基因构建物，在其上游增加了一个由四个不同启动子启动表达的shRNA表达盒，与将该双基因构建物一起构建到重组慢病毒真核表达载体pLV-shRNA-Mx-RNAis，包装重组慢病毒，感染猪胎儿成纤维细胞，获得转基因供体细胞，利用体细胞核移植技术，制备表达抗流感shRNA-Mx-RNAis基因转基因猪。目前已繁育至F1代，且外源基因可稳定遗传至F1代，细胞水平完成的感染评价实验表明，F1代转基因猪成纤维细胞能够抑制流感病毒复制。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种多基因联合表达协同抑制流感病毒复制的转基因猪的制备方法。该方法是通过RNA干扰技术设计靶向A型流感病毒基因的siRNA，与Mx基因通过CMV启动子启动融合表达Mx-RNAis；在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，靶向流感病毒基因构建了串联表达的shRNA表达盒，将shRNA与Mx-RNAis表达盒联合构建到含有嘌呤霉素筛选标记的重组慢病毒真核表达载体pLV-shRNA-Mx-RNAis，包装重组慢病毒，感染猪胎儿成纤维细胞，获得转基因供体细胞，利用体细胞核移植技术制备克隆胚胎后转入猪体内获得表达抗流感shRNA-Mx-RNAis基因转基因猪；利用分子生物学等方法鉴定获得F0代阳性转基因猪，与野生型同品种猪杂交，繁育F1代，结果表明外源基因能够稳定遗传至F1代，猪流感病毒感染F1代转基因猪的尾组织成纤维细胞，结果显示细胞水平上转基因猪具有显著的抑制流感病毒复制的活性。该发明为利用多基因联合表达策略防止猪流感病毒变异，提高猪抑制猪流感病毒复制效率提供了方法。

本发明提供了一种制备表达多基因转基因猪的方法，通过上述构建的含有p3572-4shRNA-Mx-RNAis感染猪胎儿成纤维细胞，以此为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎，通过非手术法移入猪子宫内进行妊娠，获得F0代转基因猪。

本发明利用分子生物学和免疫学的方法，对F0代猪进行了鉴定，筛选出阳性转基因猪后，与同品种野生型猪杂交繁育了F1代转基因猪。

本发明分离培养了F1代转基因猪成纤维细胞，感染猪流感病毒后，在细胞水平评价其抗猪流感病毒活性，结果表明本发明制备的转基因猪成纤维细胞具有显著的抗猪流感的作用。

在本发明的一个优选的实施方式中，首先通过对A型流感病毒不同亚型保守基因序列分析，找到其同源区，靶向该同源区利用RNA干扰技术设计siRNA和shRNA。

NP基因序列、PA基因序列、PB₂基因序列、或其组合。

在另一优选例中，所述NP基因的NCBI的基因登录号为3654618。

在另一优选例中，所述PA基因序的NCBI的基因登录号为3655158。

在另一优选例中，所述PB₂基因序的NCBI的基因登录号为3654615。

在另一优选例中，靶向所述NP基因序列的siRNA编码序列如下：

GCTCCGAAGAAATAAGATCCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGGATCTTTTCTTCGGAG(SEQ ID NO.:4)。

在另一优选例中，靶向所述PA基因序列的siRNA编码序列如下：

GTCAGGCACTCCTCAATTGCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGCAATTGGAGTGCCTGA(SEQ ID NO.:5)。

在另一优选例中，靶向所述PB₂基因序列的siRNA编码序列如下：

GGAATCAGCCTTCTAGTTGCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGCAACTAAGGCTGATTC(SEQ ID NO.:6)。

在本发明的一个优选的实施方式中，将设计的siRNA与鸡Mx基因联合，通过CMV启动子启动融合表达Mx-RNAi s。

优选地，鸡Mx基因NCBI的基因登录号为Z23168。

优选地，CMV启动子序列如下：

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG(SEQ ID NO.:3)。

本发明还提供了能够提高动物(优选为非人哺乳动物，如猪)抗禽流感能力的shRNA构建物，所述shRNA构建物包括第一s iRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段。

在另一优选例中，所述PB1基因的NCBI的基因登录号为3654616。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列包括：

AAGATCTGTTCCACCATTGAA(SEQ ID NO.:13)。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：

Seq_正向a-Xa-Seq_反向a 式Ia

式中，

Seq_正向a核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示；

Seq_反向a为与Seq_正向a基本上互补的核苷酸序列；

Xa为位于Seq_正向a和Seq_反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向a和Seq_反向a不互补。

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGACGTTCAATGGTGGAACAGATCTT-3'(SEQ ID NO.:14)

在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。所述hH1启动子序列启动所述式Ia序列的转录。

在另一优选例中，所述hH1启动子序列如下：

gggaaagagtgatctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcggatcg

(SEQ ID NO.:15)。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第二siRNA编码序列，所述第二siRNA特异性靶向流感病毒PA基因或其片段。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列包括：

AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列含有式Ib所示的结构：

Seq_正向b-Xb-Seq_反向b 式Ib

式中，

Seq_正向b核苷酸序列如SEQ ID NO.:16所示；

Seq_反向b为与Seq_正向b基本上互补的核苷酸序列；

Xb为位于Seq_正向b和Seq_反向b之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向b和Seq_反向b不互补。

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGACGTCAGGCACTCCTCAATTGCTT-3'(SEQ ID NO.:17)

在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列还包含与式Ib序列可操作性连接的h7SK启动子序列。所述h7SK启动子序列启动所述式Ib序列的转录。

在另一优选例中，所述h7SK启动子序列如下：

atgcagtatttagcatgccccacccatctgcaaggcattctggatagtgtcaaaacagccggaaatcaagtccgtttatctcaaactttagcattttgggaataaatgatatttgctatgctggttaaattagattttagttaaatttcctgctgaagctctagtacgataagtaacttgacctaagtgtaaagttgagatttccttcaggtttatatagcttgtgcgccgcctgggtacctc(SEQ ID NO.:18)。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第三siRNA编码序列，所述第三siRNA特异性靶向流感病毒NP基因或其片段。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列包括：

AAGGATCTTATTTCTTCGGAG(SEQ ID NO.:19)。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列含有式Ic所示的结构：

Seq_正向c-Xc-Seq_反向c 式Ic

式中，

Seq_正向c核苷酸序列如SEQ ID NO.:19所示；

Seq_反向c为与Seq_正向c基本上互补的核苷酸序列；

Xc为位于Seq_正向c和Seq_反向c之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向c和Seq_反向c不互补。

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAGGATCTTATTTCTTCGGAGTTCAAGACGCTCCGAAGAAATAAGATCCTT-3'(SEQ ID NO.:20)

在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列还包含与式Ic序列可操作性连接的mU6启动子序列。所述mU6启动子序列启动所述式Ic序列的转录。

在另一优选例中，所述mU6启动子序列如下：

caaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtgctgttttttaaaataataatttagtatttgtatctcttatagaaatccaagcctatcatgtaaaatgtagctagtattaaaaagaacagattatctgtcttttatcgcacattaagcctctatagttactaggaaatattatatgcaaattaaccggggcaggggagtagccgagcttctcccacaagtctgtgcgagggggccggcgcgggcctagagatggcggcgtcggatcgatccgcggtg(SEQ ID NO.:21)。

在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第四siRNA编码序列，所述第四siRNA特异性靶向流感病毒PB2基因或其片段。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列包括：

AAAGCAACTAGAAGGCTGATT(SEQ ID NO.:22)。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列含有式Id所示的结构：

Seq_正向d-Xd-Seq_反向d 式Id

式中，

Seq_正向d核苷酸序列如SEQ ID NO.:22所示；

Seq_反向d为与Seq_正向d基本上互补的核苷酸序列；

Xd为位于Seq_正向d和Seq_反向d之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向d和Seq_反向d不互补。

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列如下所示：

5'-AAAGCAACTAGAAGGCTGATTCTATGGACAAATCAGCCTTCTAGTTGCTTT-3'(SEQ ID NO.:23)

在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列还包含与式Id序列可操作性连接的hU6启动子序列。所述hU6启动子序列启动所述式Id序列的转录。

在另一优选例中，所述hU6启动子序列如下：

atccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc(SEQ ID NO.:24)。

在本发明中，所设计的shRNA，分别在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，以DNA序列的形式构建转录shRNA的表达盒。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述shRNA构建物还包括Mx-RNAis序列，优选地，将CMV启动子启动表达的Mx-RNAis基因和由四个不同启动子分别启动表达的shRNA串联，从而构建shRNA-Mx-RNAis构建物。

优选地，上述shRNA-Mx-RNAis构建物的核苷酸序列如SEQIDNO.:26所示。

在本发明的一个优选的实施方式中，将包含本发明构建物的重组表达载体转入哺乳动物胎儿成纤维细胞，获得能够表达shRNA-Mx-RNAis多基因的转基因细胞，作为核供体细胞。

在本发明的一个优选的实施方式中，利用上述核供体细胞，通过体细胞核移植技术制备获得F0代转基因哺乳动物。

在本发明的一个优选的实施方式中，利用分子生物学和免疫学方法，对获得的转基因哺乳动物进行鉴定，获得F0代阳性转基因哺乳动物。

在本发明的一个优选的实施方式中，将获得的阳性转基因哺乳动物与同品种野生型进行杂交，繁育F1代。

在本发明的一个优选的实施方式中，利用分子生物学和免疫学方法对获得的F1哺乳动物进行鉴定。

在本发明的一个优选的实施方式中，分离培养F1代哺乳动物的成纤维细胞，感染H1N1流感病毒，在细胞水平评价其具有抑制流感病毒的活性。

Mx基因

Mx蛋白是INF诱导的动态蛋白超家族GTP酶，分子量大小在7万～8万，有自装配倾向，有较强的GTP水解特性。Mx蛋白对多种负链RNA病毒有抑制作用，因而具有抗流感病毒的功能。

Mx蛋白是I型(α/β)和III型(λ)干扰素(IFN)诱导产生的具有细胞自身天然抗病毒活性的关键效应分子，是指示I型干扰素及其受体相互关系的标记物。1962年，Lindenmann在研究近交小鼠时发现，用相同致死剂量流感病毒感染近交小鼠品系A2G小鼠和其它随机交配小白鼠，只有A2G小鼠能够耐受存活。进一步研究发现这是因为16号染色体上存在一个显性基因，能够使A2G小鼠抵抗流感病毒攻击，因此就将这一基因命名为Mx(myxovirus resistant)基因(Lindenmann，1962)。Mx1是小鼠体内主要的由IFN介导产生的胞内抗流感病毒和流感病毒样病毒的效应因子，其他种属动物的Mx基因有相似的功能，且Mx基因的表达受I型IFN(α/β)和III型IFN(γ)的严格调控。

Mx蛋白具有广谱的抗病毒活性，并且不同动物种属Mx蛋白有不同的抗病毒特异性，抗病毒机理也不同，这对于人类和动物医学研究有重要意义。Mx蛋白抗病毒特异性也会因为在细胞内定位的不同而不同，细胞核内Mx蛋白可以选择性地抑制在核内复制的正粘病毒如流感病毒(IV)和披膜病毒(THOV)的初始转录，而细胞质内Mx蛋白除可抑制正粘病毒的复制外，还可抑制棒状病毒、副粘病毒及布尼病毒的复制(Kane et al.，2012)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述Mx蛋白为鸡Mx蛋白。优选地，所述鸡Mx蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，其编码核苷酸序列如SEQID NO.:1所示。

siRNA

小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA):是一种小RNA分子(约21-25nt)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象，成为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。

shRNA

短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔，组成发夹结构，将shRNA序列克隆进质粒载体中,在动物体内该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理，形成“小干扰RNA”(siRNA)。

“表达盒”或“构建体”是指一种包括目标核酸序列或基因序列，能表达合适蛋白，与宿主细胞内提供适当转录和翻译的目标核酸序列成分操作连接。所述成分可能包括启动子，分泌信号序列，加尾信号，内含子序列，绝缘子序列及本发明所述的其他成分。“表达盒”或“构建体”还可包括“载体序列”。“载体序列”是指用本发明重组DNA技术构建的核酸序列以利于表达构建体的克隆和表达。代表性的表达载体类型包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，及酵母人工染色体。

“双顺反子结构”是指任何能表达两个独立翻译蛋白产品的构建体。这两种产品可能会从一个单一的基因双顺反子结构或从两个独立的mRNA翻译而来，每个独立的mRNA由同样的双顺反子结构编码。“聚顺反子结构”是指任何能提供两个以上独立翻译蛋白产品表达的构建体。

“操作性连接”是指一个目标核酸序列和一个或多个调控序列(例如，启动子)物体上联系起来，以便能够在宿主细胞内表达目标核酸序列编码的多肽。

“信号序列”是指一段核酸序列，当被引入到编码多肽的核酸序列，能指导表达该多肽的细胞分泌该多肽(如丁酰胆碱酯酶和/或糖基转移酶)。信号序列最好位于核酸编码序列5'端，这样信号序列的多肽位于翻译多肽的N-末端。“信号肽”是指信号序列翻译的多肽序列。

“宿主细胞”是指已经过一个或多个本发明表达构建体转染的细胞，包括哺乳动物体外培养细胞和体内细胞。

“转染”是指在宿主细胞中引入一个或多个本发明表达构建体的实施过程，包括(但并不限于)：显微注射，电穿孔，脂质体介导转染，磷酸钙介导转染或病毒介导转染等。本发明表达构建体若已转染至宿主细胞，则称其为“已转染的”。“瞬时转染细胞”是指这样的宿主细胞，在该宿主细胞中引入了表达构建体但没有永久整合到宿主细胞或其后代的基因组，因而随时间推移该表达构建体可被宿主细胞或其后代丢失。“稳定的转染细胞”是指引入宿主细胞的表达构建体已整合到宿主细胞及其后代的基因组。

“转基因”是指任何一个已整合至转染宿主细胞基因组的本发明表达构建体的结构。含有这类转基因的宿主细胞称为“转基因细胞”。这种由部分或全部转基因宿主细胞组成的动物是“转基因动物”。首选转基因动物为转基因哺乳动物(如啮齿动物或反刍动物、或家畜)。由部分转基因宿主细胞组成的动物称为“嵌合体”或“嵌合体动物”。

本文所用的术语“启动子”或“启动子单元(域)”是指一种有效起始基因转录功能的核酸序列及能够影响该基因转录水平的核酸序列，引导基因核酸序列转录为RNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5'端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子、以及能够调控基因转录水平的相关因子的识别位点。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除核酸序列，进行随机或定点突变等来获得。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的中提供了具体的启动子序列，但本发明还应包括与本发明的启动子序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在细胞中起始基因转录的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

本文所用的“目的基因”或“目的多核苷酸序列”是指任何与所述启动子直接或间接相连，从而能够受所述启动子起始转录的多核苷酸序列。

本发明的启动子可以可操作地与目的基因连接，该目的基因相对于启动子可以是来源于同一个物种，也可以来自不同的物种。本文所述的目的基因没有特别限制，可以是RNA的基因或编码具有特定功能蛋白的基因、或其组合。

所述目的基因的代表性例子包括(但不限于)：代谢、调控功能相关基因，抗性基因，耐受性相关基因，荧光蛋白基因，以及RNA基因。

所述的代谢、调控功能相关基因例如：糖酵解途径，三羧酸循环，天冬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸等氨基酸合成途径，以及多种可能与苏氨酸合成或降解直接和间接相关的途径蛋白及其调控蛋白基因。

所述的抗性基因选自下组：氯霉素、氨苄青霉素、四环素、潮霉素、新霉素等抗生素抗性基因、抗病毒基因等。

耐受性相关基因如：抗高温、高盐等与环境耐受性相关的基因等。

荧光蛋白基因如：红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等荧光蛋白基因。

RNA基因例如：shRNA基因、siRNA基因、RNAi基因、microRNA等。

本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5'-3'包含但不限于下列元件：本发明的启动子和目的基因序列。

本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的启动子和/或基因表达盒。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。

在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用，优选地采用慢病毒载体。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA和/或表达目的蛋白质。宿主细胞优选为哺乳动物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被转录和/或表达。

转基因哺乳动物的产生

非人类转基因哺乳动物的产生方法早已在相关领域建立(TransgenesisTechniques.Murphy et al，eds，Human Press，Totowa，New Jersey，1993；Genetic Engineering of Animals.A Puhler，Ed.VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，New York，1993；Transgenic Animals in Agriculture.Murray etal，eds，Oxford University Press,1993)。例如，产生转基因小鼠(Manipulating the Mouse Embryo.2nd Edition，Hogan，et al，Cold SpringHarbor Press，1994；Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach.Jackson and Abbott，eds，Oxford University Press，2000)，转基因奶牛(美国专利号5633076)，转基因猪(美国专利号6271436)，和转基因山羊(美国专利号5907080)的有效方法已建立。这些方法的优选例将在下面段落进行总结。

可用体外稳定转染宿主细胞产生转基因动物。其中所述宿主细胞是多能性或全能性的，可用于桑椹胚聚集或囊胚注射以产生嵌合动物。首选多能性/全能性的稳定转染宿主细胞包括原生生殖细胞，胚胎干细胞，胚胎瘤细胞等。桑椹胚聚集法是将稳定转染宿主细胞与非转基因桑椹胚阶段胚胎聚集。囊胚注射法是将稳定转染宿主细胞引入到非转基因囊胚阶段胚胎的囊胚腔。然后，经聚集或注射的胚胎被转移到一个假孕母性以怀孕和嵌合体分娩。其生殖细胞系含转基因宿主细胞的嵌合动物可用于繁衍全转基因的非嵌合后代。

另外，这样稳定转染的宿主细胞可用作核移植供体转移至卵母细胞受体(Nature 385：810-813，1997)。核移植所用稳定转染宿主细胞，并不需要是多能或全能性。比如，可以使用稳定转染的胚胎成纤维细胞(Science 280：1256-8，1998；Biol Reprod 64：849-856，2001)。卵母细胞受体在核移植前需去核。核移植后，卵母细胞被转移到一个假孕母性以怀孕和分娩。所产后代为全转基因(即非嵌合)。

转基因在动物，组织或相关细胞基因组DNA中的存在，及转基因拷贝数可通过在相关领域中公认的技术包括杂交和PCR技术而确认。

直接通过转基因方法产生，或通过嵌合动物繁衍的全转基因后代可被用于繁殖以维持转基因品系，及特性。

材料和方法概述

本发明中首先靶向流感病毒基因NP、PA和PB2，分别设计合成了单基因和双基因、三基因串联的miRNA，将其克隆到pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR载体(购自Invitrogen公司)，构建miRNA表达载体pcDNA6.2/NP﹑pcDNA6.2/PA、pcDNA6.2/PB、pcDNA6.2/PA+NP和pcDNA6.2/PA+NP+PB，转染MDCK细胞(购自Invitrogen公司)后，感染H5N1禽流感病毒，并优选所述干扰基因。

将优选出的三基因串联序列通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST(购自Invitrogen公司)，命名为pLenti6/PA+NP+PB2，鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT，检测重组慢病毒，评价重组慢病毒的感染效率。

本发明构建重组鸡Mx基因的真核表达质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-Mx，PCR改造扩增得到5’和3’端分别带有SalI和XholI的Mx基因DNA片段，将该片段插入到真核表达质粒pcDNA6.2/EmGFP(购自Invitrogen公司)的多克隆位点中，经酶切、测序证明得到pcDNA6.2/EmGFP-Mx表达载体。

本发明中的4种shRNA分别由RNA聚合酶III型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6在真核细胞中稳定持续表达。每个启动子具有精确的碱基启动位点和终止信号，可以保证shRNA最高效地被启动转录，如表3。

本发明提出的抗H1N1猪流感病毒重组质粒，记为pGenesil–PA-PB1-PB2、pGenesil–PA-PB1-NP、pGenesil–PA-PB2-NP、pGenesil–PB1-PB2-NP与pGenesil–PA-PB1-PB2-NP，它们分别含有三个或四个shRNA表达基因，能同时编码三种或四种猪流感病毒基因组PA、PB1、PB2与NP基因保守区域的特异shRNA；三个或四个shRNA表达基因呈串联状态。

本发明将shRNA表达盒通过酶切构建到慢病毒表达载体，获得复制缺陷性慢病毒，分别命名为pLV-EGFP-shPAPB1PB2、pLV-EGFP-shNPAPB1、pLV-EGFP-shNPAPB2、pLV-EGFP-shNPB1PB2与pLV-EGFP-shNPAPB1PB2。经重组慢病毒滴度检测确定慢病毒滴度。

所述复制缺陷型慢病毒感染MDCK细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染MDCK细胞，2μg/mL嘌呤霉素抗性筛选，建立整合有目的基因的细胞系，分别命名为shPAPB1PB2-MDCK、shNPAPB1-MDCK、shNPAPB2-MDCK、shNPB1PB2-MDCK、shNPAPB1PB2-MDCK与Mock-MDCK。

本发明采取了多基因干扰shRNA基因串联构建到一个质粒载体上的策略，并且对三基因与四基因串联进行比较，首次证明了四基因串联质粒载体对H1N1猪流感病毒的抑制作用高于三基因，多基因干扰shRNA在H1N1猪流感病毒复制周期中发挥更强的抑制作用。

将shRNAi四串联、CMV启动子、MX-RNAi构建到3572慢病毒载体(购自武汉晶赛生物技术公司)上。用Cla1和Xba1双酶切载体3572，用RDNA连接，新载体命名为3572A。用Xba1单切pGenesil-2.1得到3'-CMV-shRNAi-5'，Xba1单切3572A并与3'-CMV-shRNAi-5'连接，用Mlu1单切阳性质粒检测3'-CMV-shRNAi-5'在3572载体上的方向，小片段长度为708bp，构建好的载体命名3572B。扩增Mx-RNAi，上游为Nhe1酶切位点，下游为Xma1。Nhe1和Xma1双酶切3572B和Mx-RNAi基因，连接，鉴定结果表明构建成功。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一种全新的靶向流感病毒PB1基因的siRNA；

(2)本发明提供了包含特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段的shRNA构建物，根据本发明的shRNA构建物能够显著提高动物体对禽流感病毒的抵抗能力。

(3)根据本发明的较佳的shRNA构建物，分别在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，以DNA序列的形式构建转录shRNA的表达盒，不仅具有精确的碱基启动位点而且能够保证shRNA最高效地被启动转录。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1.miRNA串联表达质粒载体的构建

1.1miRNA序列的设计与合成

本发明为实现所选干扰靶点利用的最大化，避免因不同毒株间的序列差异而限制RNAi效应，因此，siRNA的靶序列尽量选择在不同毒株间较为保守的区域。选择针对不同流感病毒亚型保守基因NP、PA、PB2，设计miRNA编码序列，见表1。

1.2miRNA串联表达质粒载体的构建

将退火后的双链DNA片段克隆到pcDNA6.2-EmGFP-miR载体(购自Invitrogen公司)中，，命名为pcDNA6.2/NP﹑pcDNA6.2/PA﹑pcDNA6.2/PB2。送测序。以pcDNA6.2/NP为骨架，经BglⅡ和XhoⅠ酶切，以PA/miRNA编码序列为插入片段将pcDNA-PA经SalⅠ和BglⅡ酶切，构建NP和PA串联表达载体，命名pcDNA6.2/PA+NP，以相同方法构建pcDNA6.2/PA+NP+PB2。将串联重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，正确后送测序。

1.3MDCK细胞水平评价各干扰靶点对载体表达基因抑制效果

将miRNA表达质粒转染至MDCK细胞，10³流感病毒感染，用HA试验和Real-time PCR试验检测抑制效果。实验分7组，miRNA转染组和阴性质粒转染组和空白转染组。实验中，每对miRNA均设3孔，结果取平均值。

上述实验结果表明pcDNA6.2/NP﹑pcDNA6.2/PA﹑pcDNA6.2/PB2和pcDNA6.2/PA+NP组在病毒滴度的高峰时间(72h)，其HA值为48﹑64﹑48﹑32，表明它们在一定程度上能够抑制流感病毒在MDCK细胞中复制，其病毒抑制率分别为62.5％﹑50％﹑62.5％和75％。而pcDNA6.2/PA+NP+PB2组其抑制率为81％。这表明多个miRNA串联起来表达较单个miRNA有较好的抑制效果(图3)。Real-time结果表明pcDNA6.2/NP﹑pcDNA6.2/PA﹑pcDNA6.2/PB2、pcDNA6.2/PA+NP和pcDNA6.2/PA+NP+PB2组病毒拷贝数分别降低3.6﹑3.2﹑4.6﹑6.3和9.1倍(图4)。其中pcDNA/PA+NP的抑制效率较其他单一miRNA表达质粒的抑制效率高，而pcDNA/PA+NP+PB2在各个转染组中抑制效率最高。这表明多个miRNA串联起来表达，较单个miRNA有较好的抑制效果。

实施例2.siRNA表达载体的构建

将优选出的三基因串联序列通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST，命名为pLenti6/PA+NP+PB2，鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT，72h收集细胞上清进行病毒浓缩；采用梯度稀释法和Real-time PCR法测定病毒滴度；酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功；将包装病毒浓缩后梯度稀释法检测滴度为4×10⁷TU/mL，Real-time PCR法检测重组慢病毒滴度为1×10⁸TU/mL。通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞，评价重组慢病毒的感染效率表明：重组慢病毒可以感染MDCK细胞、PEF和CEF细胞，通过GFP比较被感染细胞效率：MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞感染效率约90％；CEF细胞感染效率约20％。

实施例3.重组鸡Mx基因的真核表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-Mx的构建

PCR改造扩增得到5’和3’端分别带有SalI和XholI的Mx基因DNA片段，将该片段插入到真核表达质粒pcDNA6.2/EmGFP的多克隆位点中，转化感受态细胞，挑菌，提取重组质粒，经SalI、XholI酶切，结果出现2条带，1条略大于2kb，与插入的目的条带大小相符；另一条与5.6kb，为pcDNA6.2/EmGFP载体带(图5)。对插入目的基因进行测序，测序结果表明改造后的基因与预期设计序列一致，将其命名为pcDNA6.2/EmGFP-Mx。

实施例4、shRNA表达盒的构建

本发明靶向流感病毒NP、PA、PB2与PB1基因的siRNA，其DNA引物结构为：Sense(正义)+Loop+Antisense(反义)+终止信号+SacI，序列见表2。分别用60μL的annealing buffer(购自NEB公司)溶解单链DNA引物(2OD)，各取PB2-1154、NP-1946、PA-2087和PB1-2257的上下游DNA引物2μL与16μLannealing buffer混匀94℃变性自然冷却至室温。将退火产物100倍稀释，分别与带有不同Ⅲ型启动子的线性化pGenesil-EGFP真核表达载体连接。构建的4个表达shRNA的真核表达载体如表3。

表2表达shRNA的靶位点及引物设计表

注：引物设计为，MluI酶切位点+靶序列+颈环结构+靶序列互补序列+RNA PolyIII聚合酶转录终止位点。

表3表达shRNA的真核表达载体

以pGenesil-PB2为骨架，将pGenesil–NP、pGenesil–PA和pGenesil–PB1上的shRNA表达盒中的两个克隆到pGenesil–PB2上，构建四个表达shRNA的真核表达载体，分别命名为pGenesil–PA-PB1-PB2、pGenesil–PA-PB1-NP、pGenesil–PA-PB2-NP、pGenesil–PB1-PB2-NP；再将三个shRNA表达盒构建到pGenesil–PB2上，构建同时表达靶向流感病毒PB2、NP、PA和PB1基因的shRNA真核表达载体，命名为pGenesil–PA-PB1-PB2-NP(图6)。利用ClaI和XbaI双酶切pLV-EGFP慢病毒载体，胶回收大片段与合成的多克隆位点5’-ClaI-Xmal-XhoI-MluI-XbaI-3’连接，构建的慢病毒表达载体命名为pLV-MCS，用XhoI与XbaI双酶切表达盒载体与慢病毒表达载体，命名为pLV-EGFP-shNPAPB1PB2，三基因表达盒与慢病毒表达载体命名为pLV-EGFP-shPAPB1PB2、pLV-EGFP-shNPAPB1、pLV-EGFP-shNPAPB2、pLV-EGFP-shNPB1PB2，构建原理如图7。

实施例5、三基因与四基因细胞系抑制H1N1猪流感病毒复制比较分析

同步传代培养的6代shPAPB1PB2-MDCK、shNPPAPB1-MDCK、shNPPAPB2-MDCK、shNPPB1PB2-MDCK、shNPPAPB1PB2-MDCK、Mock-MDCK(空白慢病毒感染组)和MDCK(未用慢病毒感染组)以1×10⁵个细胞数计种植于12孔细胞培养板中，当细胞融合度达70％-80％时，用感染培养基(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，TPCK-Trypsin 4μg/mL)稀释H1N1猪流感病毒(LM/2004株，1000TCID₅₀)接种细胞，于室温孵育1h，吸去病毒稀释液，每孔加1mL感染培养基，于感染后12、24、36、48、60小时吸取细胞上清做10^-1-10^-8梯度稀释，每个稀释度接种3个9-10日龄的普通鸡胚，72h后(LM/2004)吸取尿囊液检测病毒滴度(图8)。

从图8中可以看出，包含根据本发明的靶向PB1基因的shRNA构建物能够显著抑制H1N1禽流感病毒的复制，而且根据本发明的串联4个不同siRNA编码序列的shRNA构建物(shNPPAPB1PB2-MDCK)，具有更为显著的抑制H1N1禽流感病毒复制的能力，与3串联相比，能够抑制率能够提高(9.92％-15.53％)。与3串联相比，24小时4串联的抑制率提高(5.15-4.35)/5.15＝15.53％。

实施例6.pLV-shRNAs-Mx-RNAi载体的构建

建立共表达抗禽流感病毒(AIV)多靶点miRNAs和鸡Mx基因猪胎儿成纤维细胞系(PEF)，以pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-NP-PA-PB2为模板扩增多靶点miRNAs，产物用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，定向插入慢病毒载体p201，得到重组的慢病毒中间载体P201-miRNAs；然后以pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-Mx为模板扩增鸡Mx基因，PCR产物用NheⅠ和NotⅠ双酶切后插入到p201-miRNAs载体，得到重组的慢病毒中间载体P201-Mx-miRNAs；最后将pCAGGS-FLPe载体上的β-actin启动子用SalⅠ和BglⅡ双酶切后回收纯化插入到P201-Mx-miRNAs替换原CMV启动子，得到P201-β-Mx-miRNAs载体。

将shRNAi四串联、CMV启动子、MX-RNAi构建到3572慢病毒载体上。用Cla1和Xba1双酶切载体3572，用RDNA连接，新载体命名为3572A。用Xba1单切pGenesil-2.1得到3'-CMV-shRNAi-5'，Xba1单切3572A并与3'-CMV-shRNAi-5'连接，用Mlu1单切阳性质粒检测3'-CMV-shRNAi-5'在3572载体上的方向，小片段长度为708bp，构建好的载体命名3572B。扩增Mx-RNAi，上游为Nhe1酶切位点，下游为Xma1。Nhe1和Xma1双酶切3572B和Mx-RNAi基因，连接(定向克隆可避免检测Mx-RNAi的方向)(图9)，进行酶切鉴定及测序鉴定，鉴定结果表明构建成功(图10)。

实施例7.制备供体细胞

重组慢病毒构建的pLV-shRNAs-Mx-RNAi的包装和浓缩是按照Invitrogen慢病毒包装系统和脂质体2000转染说明，将pLV-shRNAs-Mx-RNAi病毒表达载体与ViralPowerTMPacking Mix共转染至融合度达90％的293FT，通过Real-timePCR法测定病毒滴度。结果表明重组慢病毒LV-Mx-miRNAs滴度为：1×2E+8＝2.0E+8TU/mL。

将猪胎儿成纤维细胞传至24孔培养板中并计数，使每孔细胞数约为10⁴个,将重组慢病毒LV-GFP 50倍稀释后并(50倍稀释重组慢病毒LV-GFP后)在病毒液中加入Polyberne使其终浓度为8μg/mL，以MOI＝4感染刚传代细胞，利用FACS评价慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞效率。重组慢病毒LV-Mx-miRNAs以相同MOI感染猪胎儿成纤维细胞，48h-72h进行传代培养，检测重组慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞效率。

结过表明48h后在荧光显微镜下观察，荧光表达细胞比例近100％；流式细胞仪检测显示细胞阳性率为97％，说明制备的慢病毒可以高效感染猪胎儿成纤维细胞。将感染后猪胎儿成纤维细胞继续传代培养，将第五、十代细胞传至96孔培养板中，16h后进行间接免疫荧光观察细胞生长状况。在倒置荧光显微镜下均能观察到特异荧光，表明Mx基因能在猪胎儿成纤维细胞中稳定表达。经PCR和RT-PCR对目的基因检测同样得到上述结论。

实施例8.F0代转基因猪的制备

抗流感转基因猪的制备实验分为以下几个部分，

(a)猪卵母细胞体外成熟培养：从屠宰厂收集卵巢后进行处理，用带有18号针头的10ml一次性注射器采集3-6mm的卵泡。用PVA-TL-HEPES将采集的卵泡进行冲洗。收集形态规则，细胞质均匀，外围有3-5层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COC)。然后在采卵液(PVA-TL-HEPES)中洗两遍，并放入到平衡后的M199洗液中洗两遍。最后将卵母细胞置于38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42-44小时。

(b)卵母细胞孤雌激活：将去卵丘细胞的成熟卵母细胞移入激活液中平衡1min，然后平铺于加满激活液的融合槽中(BTX，槽宽0.5mm或1mm)，电融合仪为BLS(CF-150B)。按照设置的参数将轮母细胞孤雌激活。

(c)细胞的克隆：将上述转有P201-β-Mx-miRNAs慢病毒的猪胎儿成纤维细胞系继续用筛选培养液(G418，400μg/ml)培养，挑取单克隆，进行扩大培养，细胞汇合度90～95％时，收集细胞冰冻保存备用。

(d)融合：将作为受体细胞的卵母细胞细胞核去除，将转有P201-β-Mx-miRNAs慢病毒的猪胎儿成纤维细胞的细胞核取出，将两者进行融合，构建成克隆胚胎。

(f)重构胚胎进行体外培养，将胚胎移植入受体母猪输卵管内。共移植胚胎1361枚，受体9头，获得妊娠受体3头。

实施例9.转基因猪的鉴定

剪取F0代转基因猪和同品种野生型(WT)猪尾组织，提取基因组DNA、RNA、蛋白，进行PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot鉴定，筛选出F0代转基因猪。结果表明3头F0代转基因猪均为阳性转基因猪。选取其中1头与同品种野生型猪杂交，繁育F1代转基因猪，用上述方法筛选出F1代阳性转基因猪，结果表明其中1头为阳性转基因猪(图11-15)。

实施例10.转基因猪整合位点分析与验证

提取F0代表达Mx-RNAis基因转基因猪尾组织的DNA作为模板，利用设计的特异性引物分别与六个简并引物组成引物组合，对整合位点的上游和下游侧翼序列进行Tail-PCR扩增，取15μl第三次PCR扩增的产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果。

胶回收第三轮Tail-PCR扩增在750-2000bp左右的特异性目的片段，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中猪的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到猪的9号染色体上。

这表明，本发明构建的转基因载体能够整合到转基因猪的基因组中，且具有一定的倾向性。

F0代整合位点结果验证

根据测序结果序列(既要包括猪基因组又要包括HIV载体)设计特异性验证引物，以转基因猪基因组为模板扩增的条带大小为650bp，与预期结果一致，胶回收目的条带，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中猪的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到猪的9号染色体上，所得结果与前面一致，表明验证正确。

F1代整合位点验证

用F0代转基因猪整合位点的验证引物，对F1代转基因猪的基因组作为模板，进行PCR扩增；扩增的条带大小与预期结果一致。胶回收目的条带，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中猪的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到猪的9号染色体上，与F0代的结果一致。

实施例11.转基因猪成纤维细胞抑制流感病毒复制活性研究

对生产的F0代转基因猪，在不超过1日龄时分别取其尾组织，进行分离培养成纤维细胞系。

分别对所培养的猪尾成纤维细胞系进行感染实验，100TCID₅₀H1N1流感病毒感染第2代猪尾成纤维细胞。于感染后16小时进行间接免疫荧光观察病毒增值情况。结果显示阳性对照荧光比例接近90％，阴性对照没有感染流感病毒，非转基因猪的荧光比例接近90％，转基因猪的荧光比例比对照少，约50％左右(图16)。表明基因组中整合了流感病毒抗性基因的转基因猪尾成纤维细胞能够有效抑制流感病毒基因的表达，从而抑制病毒增殖。

病毒感染后于8h、16h、24h、48h收集细胞，提取总RNA后应用荧光定量PCR检测病毒PB2基因mRNA拷贝数。结果如图所示：将WT(野生型)猪成纤维细胞内病毒拷贝数设为1，TG(转基因)猪成纤维细胞内流感病毒基因拷贝数在各时间点都降低，其中感染病毒16h时，TG猪成纤维细胞内流感病毒基因拷贝数降低倍数最高，且差异极显著(P<0.01)，为WT猪的2倍，在8、24、48h时，流感病毒基因拷贝数也有降低且差异显著(P<0.05)。表明转基因猪成纤维细胞基因组中整合的流感病毒抗性基因能有效抑制流感病毒基因组的复制(图1)。

猪尾组织成纤维细胞接种猪流感病毒后，于8h、16h、24h、48h收集细胞上清，测定病毒的感染滴度，以TCID₅₀计。接种流感病毒后不同时间点，将TG猪的病毒感染滴度与对照进行统计学分析。结果如图2所示，与WT猪和NTG猪相比，在各时间点TG猪成纤维细胞上清中病毒滴度都降低，在16h时TG猪成纤维细胞上清中病毒滴度达到最低，为1×10^-2.8，差异显著(P<0.05)，在8、24和48h时，细胞上清中病毒滴度也降低，差异不明显。结果表明TG猪成纤维细胞基因组中整合的流感病毒抗性基因能有效抑制流感病毒的增殖(图2)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物包括第一siRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段；优选地，所述第一siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQ ID NO.:13；更优选地，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：

Seq_正向a-Xa-Seq_反向a 式Ia

式中，

Seq_正向a核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示；

Seq_反向a为与Seq_正向a基本上互补的核苷酸序列；

Xa为位于Seq_正向a和Seq_反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向a和Seq_反向a不互补；

最优选地，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。

2.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物还包括第二siRNA编码序列，所述第二siRNA特异性靶向流感病毒PA基因或其片段；优选地，所述第二siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQ ID NO.:16；更优选地，所述第二siRNA的编码序列含有式Ib所示的结构：

Seq_正向b-Xb-Seq_反向b 式Ib

式中，

Seq_正向b核苷酸序列如SEQ ID NO.:16所示；

Seq_反向b为与Seq_正向b基本上互补的核苷酸序列；

Xb为位于Seq_正向b和Seq_反向b之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向b和Seq_反向b不互补；

最优选地，所述第二siRNA的编码序列还包含与式Ib序列可操作性连接的h7SK启动子序列。

3.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物还包括第三siRNA编码序列，所述第三siRNA特异性靶向流感病毒NP基因或其片段；优选地，所述第三siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQ ID NO.:19；更优选地，所述第三siRNA的编码序列含有式Ic所示的结构：

Seq_正向c-Xc-Seq_反向c 式Ic

式中，

Seq_正向c核苷酸序列如SEQ ID NO.:19所示；

Seq_反向c为与Seq_正向c基本上互补的核苷酸序列；

Xc为位于Seq_正向c和Seq_反向c之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向c和Seq_反向c不互补；

最优选地，所述第三siRNA的编码序列还包含与式Ic序列可操作性连接的mU6启动子序列。

4.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物还包括第四siRNA编码序列，所述第四siRNA特异性靶向流感病毒PB2基因或其片段；优选地，所述第四siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQ ID NO.:22；更优选地，所述第四siRNA的编码序列含有式Id所示的结构：

Seq_正向d-Xd-Seq_反向d 式Id

式中，

Seq_正向d核苷酸序列如SEQ ID NO.:22所示；

Seq_反向d为与Seq_正向d基本上互补的核苷酸序列；

Xd为位于Seq_正向d和Seq_反向d之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向d和Seq_反向d不互补；最优选地，所述第四siRNA的编码序列还包含与式Id序列可操作性连接的hU6启动子序列。

5.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述所述shRNA构建物包括SEQ ID NO.:25所示的核苷酸序列。

6.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA由权利要求1所述的shRNA构建物转录而来。

7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的shRNA构建物。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求7所述的载体或染色体中整合有权利要求1所述的shRNA构建物。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物优选为家畜或啮齿动物，包括但限于：猪、牛、羊、马、驴、鹿、兔、鼠。

10.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供一含有权利要求1所述shRNA构建物的载体或来自所述载体的含权利要求1所述shRNA构建物的核酸片段；

(ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞；

(iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有权利要求1所述构建物的细胞，从而获得整合的细胞；

(iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞；

(v)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合蛋白的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物；

其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。