CN106256909A - 表达鸭rig-i蛋白的转基因鸡培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达鸭RIG-I蛋白的转基因鸡培育方法，通过慢病毒载体法获得的表达鸭RIG-I蛋白的转基因鸡，该转基因鸡将鸭的RIG-I基因克隆到pGV205慢病毒载体中，构建重组慢病毒载体pGV205-RIG-I，并包装重组慢病毒；采用赤道开窗法，将重组慢病毒通过显微注射针注射到新生受精蛋胚盘下腔，经遗传操作的授精蛋正常条件孵化至出壳，成功制备了转入鸭RIG-I基因的转基因鸡。经鉴定，在获得的F0代转基因鸡体内有RIG-I基因的转录和表达；通过遗传繁育，F0代转基因鸡携带的外源基因能够稳定遗传至F1代；实验表明，在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒复制的作用。

Description

表达鸭RIG-I蛋白的转基因鸡培育方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及表达鸭RIG-I蛋白的转基因鸡培育方法。

背景技术

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33％。禽流感不仅给禽类养殖带来了巨大威胁，而且大规模爆发会严重影响人的生命安全。

先天性免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线，免疫系统的进化使得禽类与哺乳动物的免疫系统具有不同的特点，与人类相比，禽类缺少9种干扰素、13种白介素、7种肿瘤坏死因子。因此，研究有利于提高禽先天性免疫的抗病毒因子具有重要的意义。因此，为了有效地、有针对性的抵抗禽流感，本领域迫切需要开发对禽流感具有抗性的家禽品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达鸭RIG-I蛋白的转基因鸡培育方法。

本发明的第一方面，提供了一种载体，所述载体以pGV205慢病毒载体为骨架，并且所述载体中含有鸭RIG-I基因编码序列。

在另一优选例中，所述鸭RIG-I基因编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述载体中还含有抗生素筛选标记。

本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第一方面所述的的载体。

在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的。

在另一优选例中，所述宿主细胞为家禽受精卵，所述家禽包括但限于：鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟。

本发明的第三方面，提供了一种转基因鸡的培育方法，包括步骤：

(i)提供本发明第一方面所述的载体，并将所述载体包装成重组慢病毒；

(ii)将上一步骤所述的重组慢病毒转入鸡的受精卵中，获得经转染的受精卵；

(iii)孵化上一步骤获得的经转染的受精卵，从而获得所述转基因鸡。

在另一优选例中，所述转基因鸡具有抗流感病毒的能力。

在另一优选例中，所述流感病毒为H5N1、H1N1流感病毒。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(iv)将步骤(iii)中获得的转基因鸡作为F0代，与野生型鸡杂交，繁育F1代，从而获得F1代转基因鸡。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(v)利用步骤(iv)获得的F1代转基因鸡繁育获得F2代转基因鸡。

在另一优选例中，所述步骤(ii)采用赤道开窗法，将所述重组慢病毒通过显微注射针注射到受精卵胚盘下腔，获得经转染的受精卵。

在另一优选例中，所述步骤(i)中所述载体的制备方法包括步骤：

(i-1)以鸭cDNA为模板扩增RIG-I基因，获得RIG-I基因扩增产物。

在另一优选例中，所述步骤(i-1)扩增RIG-I基因的引物对序列如SEQ IDNO.:2和SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述步骤(i)中所述载体的制备方法还包括步骤：

(i-2)回收RIG-I基因扩增产物，并克隆至质粒中构建含RIG-I基因的重组质粒；

(i-3)用限制性内切酶双酶切所述重组质粒和慢病毒毒载体pGV205，通过连接、转化、克隆从而构建重组慢病毒载体pGV205-RIG-I；

(i-4)将构建的重组慢病毒载体pGV205-RIG-I，包装成重组慢病毒。

本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的载体、或本发明第二方面所述的宿主细胞，在制备试剂或试剂盒中的用途，所述试剂用于制备转基因鸡。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pGV205慢病毒载体图谱；

图2显示了pGV205-RIG-I重组质粒以及AgeI和NheI双酶切鉴定结果；

图3显示了F0代RIG-I转基因鸡PCR结果；注：M为DL2000标准分子量；1-15为F0代样品；16为阴性对照；17为阳性对照。

图4显示了F0代RIG-I转基因鸡的Southern blot结果；P：质粒阳性对照；N：野生型阴性对照；1-6分别F0代鸡的组织样品；

图5显示了F0代RIG-I转基因鸡RT-PCR结果；M：DL2000标准分子量，1-15为F0代鸡冠样品；16为阴性对照；17为阳性对照；

图6显示了F0代RIG-I转基因鸡Western blot结果，M：170KDa蛋白marker，1-6：F0代鸡鸡冠蛋白；7：WT鸡冠蛋白；

图7显示了Tail-PCR第三轮PCR扩增的核酸电泳结果，M：DL2000标准分子量，1-12为特异性引物与简并引物组合，依次顺序为F3-AD1、F3-AD2、F3-AD3、F3-AD4、F3-AD5、F3-AD6、R3-AD1、R3-AD2、R3-AD3、R3-AD4、R3-AD5、R3-AD6；

图8显示了RIG-I转基因鸡F1代鸡胚PCR结果，M：DL2000标准分子量；1-9为RIG-I转基因鸡F1代的胚胎组织样品；10为阴性对照；11为阳性对照；

图9显示了RIG-I转基因鸡F1代鸡胚Southern blot结果，P：质粒阳性对照；N：野生型阴性对照；1-4为RIG-I转基因鸡F1代的胚胎组织样品；

图10显示了RIG-I转基因鸡F1代鸡胚RT-PCR结果，M：DL2000标准分子量，1-9为RIG-I转基因鸡F1代的胚胎样品；10为阴性对照；11为阳性对照；

图11显示了RIG-I转基因鸡F1代鸡胚Western blot结果，M：170KDa蛋白marker，1-4：RIG-I转基因鸡F1代的胚胎样品；5：野生型鸡胚组织蛋白；

图12显示了荧光定量PCR分析TG组(转基因组)CEF细胞中RIG-I基因mRNA含量；

图13显示了间接免疫荧光(IFA)分析F1代CEF细胞中禽流感病毒的复制，其中A图显示了WT(野生型)组CEF细胞、B图显示了NTG(未转基因组)组CEF细胞、C图显示了TG组CEF细胞、D图显示了未感染组CEF细胞；

图14显示了TCID₅₀测定CEF细胞中禽流感病毒的病毒滴度；

图15显示了荧光定量PCR检测鸡IFNβ基因mRNA含量结果；

图16显示了荧光定量PCR检测PB2基因mRNA含量；

图17显示了荧光定量PCR检测RIG-I下游细胞因子mRNA含量结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种具有禽流感抗性的转基因鸡的培育方法，克隆鸭RIG-I基因，利用慢病毒作为基因转移载体，通过赤道开窗法将慢病毒注入授精蛋胚盘下腔，获得表达鸭RIG-I的转基因鸡，经遗传繁育，证明外源基因可稳定遗传，F1代鸡胚成纤维细胞(CEF)具有显著的抑制禽流感病毒复制的活性。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本发明公开了一种通过慢病毒载体获得的表达鸭RIG-I转基因鸡的方法，该转基因鸡是将鸭RIG-I基因克隆到pGV205慢病毒载体中，构建重组慢病毒载体pGV205-RIG-I，并包装重组慢病毒；采用赤道开窗法，将重组慢病毒通过显微注射针注射到新生受精蛋胚盘下腔，经遗传操作的授精蛋正常条件孵化至出壳，成功制备了转入鸭RIG-I基因的转基因鸡。运用分子生物学和免疫学的方法鉴定，在获得的F0代RIG-I转基因鸡体内有鸭RIG-I基因的转录和表达；通过遗传繁育，表达鸭RIG-I的F0代转基因鸡携带的外源基因能够稳定遗传至F1代；分离与培养F1代的CEF细胞，在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒复制的作用。本发明为研究RIG-I在鸡体内参与家禽天然免疫发挥抑制禽流感病毒作用及其机制奠定了基础。

在本发明的一个优选地实施方式中，克隆鸭RIG-I基因连接到pGV205慢病毒载体中，构建含有CMV启动子的重组慢病毒载体pGV205-RIG-I；

优选地，鸭RIG-I基因多核苷酸序列如下：

ATGACGGCGGACGAGAAGCGGAGCCTGCAGTGCTACCGCCGCTACATCGAGCGGAGCCTCAACCCGGTCTACGTGCTGGGCAACATGACGGACTGGCTGCCCGACGAGCTGCGGGAGAGGATCCGCAAGGAGGAGGAGAGGGGGGTGAGCGGCGCCGCCGCGCTCTTCCTGGACGCCGTGCTGCAGCTGGAGGCCCGGGGGTGGTTCCGAGGGATGCTGGACGCGATGCTGGCCGCAGGTTACACAGGACTGGCAGAAGCAATTGAGAACTGGGACTTCAGCAAACTGGAAAAACTGGAGTTACACAGACAGCTGTTGAAGCGGATAGAGGCAACAATGTTAGAAGTCGACCCAGTAGCGCTCATTCCCTATATAAGCACATGCCTGATAGACAGGGAGTGTGAAGAGATTCAGCAGATTAGTGAAAACAGAAGCAAAGCAGCAGGCATAACTAAACTCATTGAATGTCTCTGTCGGTCGGATAAGGAGCACTGGCCAAAAAGCCTTCAGCTGGCACTAGATACCACAGGATATTACCGTGCAAGTGAACTGTGGGATATAAGAGAAGATAATGCCAAAGATGTTGACAGTGAAATGACAGATGCCTCTGAGGACTGCCTTGAAGCCAGTATGACATATTCTGAAGAAGCAGAACCTGATGATAATCTCAGTGAAAATCTTGGTTCAGCTGCAGAAGGAATTGGCAAACCTCCACCTGTCTATGAAACAAAGAAGGCTCGGAGCTACCAGATTGAACTTGCACAGCCTGCTATCAATGGGAAAAATGCCTTAATATGTGCCCCTACTGGATCTGGAAAAACTTTCGTCTCAATTCTGATTTGCGAACACCATTTCCAAAACATGCCTGCAGGACGAAAGGCGAAAGTTGTCTTTCTTGCAACTAAAGTCCCAGTGTATGAACAGCAGAAAAATGTCTTCAAGCATCATTTTGAAAGACAAGGATACTCTGTTCAAGGAATTAGTGGTGAAAATTTTTCAAATGTCTCTGTAGAAAAAGTTATAGAGGATAGTGACATCATCGTAGTGACACCCCAGATCCTGGTGAATAGCTTCGAGGATGGGACCCTTACCTCGCTCTCCATTTTCACTCTGATGATATTCGATGAGTGCCACAACACTACAGGCAACCACCCTTACAATGTGTTAATGACCAGGTATCTGGAGCAGAAATTTAACTCTGCAAGTCAGCTGCCACAGATTTTAGGTTTGACTGCTTCTGTTGGAGTTGGTAATGCCAAGAACATTGAGGAAACAATAGAGCACATCTGTAGTCTCTGCTCCTACCTTGACATACAGGCCATATCCACTGTCAGAGAGAACATACAAGAACTGCAAAGGTTCATGAACAAGCCAGAAATAGATGTCAGATTGGTTAAGAGGCGAATTCACAATCCCTTTGCAGCCATTATCTCAAATTTGATGTCCGAGACAGAGGCACTGATGAGGACAATTTACTCAGTGGATACTCTCTCCCAAAACAGCAAGAAAGATTTCGGAACACAGAACTATGAACACTGGATAGTTGTCACTCAGAGGAAATGCAGACTGCTGCAACTAGAAGACAAAGAGGAGGAGAGCAGGATATGTAGAGCCCTTTTCATTTGCACTGAACACCTGCGGAAATACAATGATGCCCTCATCATCAGTGAAGATGCCCGCATCATAGATGCTTTATCCTACCTGACCGAGTTTTTCACAAATGTCAAGAATGGACCATACACAGAATTAGAGCAGCACCTGACGGCCAAATTTCAAGAGAAAGAACCAGAACTGATTGCCCTTTCAAAAGACGAAACAAATGAGAATCCTAAACTGGAAGAGCTTGTCTGCATCCTGGATGATGCGTACCGCTATAACCCACAGACTCGCACTCTTCTCTTTGCTAAGACAAGAGCTTTAGTATCCGCTTTGAAGAAGTGTATGGAGGAAAACCCTATTCTTAACTACATAAAGCCAGGTGTTTTGATGGGGCGCGGAAGAAGAGATCAAACAACAGGTATGACCCTCCCAAGCCAGAAGGGTGTGCTGGATGCGTTCAAAACCAGCAAGGACAACAGGCTGCTCATTGCTACATCTGTTGCTGATGAAGGCATTGATATTGTCCAGTGCAACCTTGTTGTGCTCTATGAATACTCCGGTAACGTGACCAAAATGATCCAAGTCAGAGGTCGTGGAAGGGCAGCAGGCAGCAAGTGCATCCTTGTGACAAGCAAAACAGAAGTGGTTGAGAATGAAAAATGCAACCGTTATAAGGAAGAAATGATGAATAAAGCTGTTGAAAAGATCCAGAAATGGGATGAAGAAACATTTGCAAAAAAGATACATAATCTGCAAATGAAGGAAAGGGTGTTACGAGATTCCAGGAGGAAAGAAATAAAACCTAAAGTAGTGGAAGGCCAAAAGAACCTCCTGTGTGGAAAATGCAAAGCATATGCCTGCAGTACAGATGACATCAGGATTATAAAGGACTCCCATCACATTGTCCTAGGAGAAGCATTCAAGGAGCGTTATACAACAAAGCCTCATAAGAAACCAATGCAGTTTGATGGTTTTGAGAAAAAAAGCAAGATGTATTGCCGAAATAATAATTGCCAGCATGATTGGGGAATCACAGTGAAGTACCTGACATTTGACAATCTACCAGTGATCAAAATCAAAAGCTTCGTAATGGAGAGTACTGCAACTGGAACACAAATGGACTTTCAGAAATGGAAAAGCATTAATTCTTCTTTGAAGAATTTTGATGTTGAAGAAATGTCCAACTTGTACCCACCATTTTAG(SEQ ID NO.:1)

在本发明的一个优选地实施方式中，将上述重组慢病毒载体，包装成重组慢病毒；采用赤道开窗法，将符合注射标准滴度的重组慢病毒通过显微注射针注射到受精蛋胚盘下腔，制备F0代转基因鸡。

在本发明的一个优选地实施方式中，利用分子生物学和免疫学方法，对获得的转基因鸡进行鉴定，筛选出表达鸭RIG-I的转基因鸡。

在本发明的一个优选地实施方式中，对上述能够稳定表达外源基因RIG-I的转基因鸡；通过与同品种野生型母鸡杂交繁育F1代转基因鸡，并分离培养RIG-I转基因鸡的F1代CEF细胞。

在本发明的一个优选地实施方式中，对F1代转基因鸡和F1代CEF细胞进行鉴定，从而获得了表达RIG-I的F1代转基因鸡和F1代CEF细胞。

经检测，对于表达RIG-I的F1代CEF细胞，能够稳定表达外源基因RIG-I，流感病毒感染后，在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒复制的作用。

RIG-I基因

视黄酸诱导基因蛋白1(RIG-1)是细胞质内识别病毒双链RNA的一种受体，是先天性免疫系统的重要组成部分，它由N端的两个串联重复的半胱天冬酶激活招募区(Caspase activation and recruitmentdomain，CARD)、中间的DExD/H解旋酶区和C端的抑制区(CTD)组成。

RIG-1基因于2000年首次发现，随后的研究证明RIG-1能够识别细胞质中的病毒RNA，并诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的产生。但是，现有技术表明，鸡体内不含有RIG-1。

模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR)是宿主重要的天然免疫系统，可识别多种微生物成分，如病毒的核酸等，迅速启动多种信号级联反应，合成一系列的细胞因子，包括I型干扰素和炎性细胞因子，在抗病毒先天性免疫中发挥重要的作用。其中，RIG-I样受体(RIG-I like receptor，RLR)为一类存在与胞内的PRR(包括RIG-I，MDA5，LGP2)，主要负责识别RNA病毒，激活信号通路产生I型IFNs以及炎性细胞因子。

在本发明优选地实施方式中，所述RIG-1基因为鸭的RIG-1基因；优选地，所述鸭的RIG-1基因的多核苷刷序列可以包含与SEQ ID NO.:1所示序列基本相同的序列。

“基本相同”是指一种多肽或核酸序列与参考氨基酸或核酸序列相比表现出至少75％，更好85％或90％以上，最好95％以上的同源性。多肽序列一般至少包含20个氨基酸，更好30-40个以上氨基酸，最好50个以上氨基酸。核酸序列一般至少包含60个核苷酸，更好90个以上核苷酸，最好120个以上核苷酸。在本发明中，“基本相同”的多肽通常可保留或具有≥50％，较佳地≥60％，更佳地≥70％，最佳地≥80％或≥90％或≥100％如100～500％的参考多肽的生物活性。

“重组DNA序列”指的是一种DNA序列以在自然界中不被发现存在的方式排列，该序列可能会存在于孤立的体外DNA，体内额外染色体DNA，或作为体内基因组DNA的部分。

“表达盒”或“构建体(物)”是指一种包括目标核酸序列或基因序列，能表达合适蛋白，与宿主细胞内提供适当转录和翻译的目标核酸序列成分操作连接。所述成分可能包括启动子，分泌信号序列，加尾信号，内含子序列，绝缘子序列及本发明所述的其他成分。“表达盒”或“构建体”还可包括“载体序列”。“载体序列”是指用本发明重组DNA技术构建的核酸序列以利于表达构建体的克隆和表达。代表性的表达载体类型包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，及酵母人工染色体。

“双顺反子结构”是指任何能表达两个独立翻译蛋白产品的构建体。这两种产品可能会从一个单一的基因双顺反子结构或从两个独立的mRNA翻译而来，每个独立的mRNA由同样的双顺反子结构编码。“聚顺反子结构”是指任何能提供两个以上独立翻译蛋白产品表达的构建体。

“操作性连接”是指一个目标核酸序列和一个或多个调控序列(例如，启动子)物体上联系起来，以便能够在宿主细胞内表达目标核酸序列编码的多肽。

“信号序列”是指一段核酸序列，当被引入到编码多肽的核酸序列，能指导表达该多肽的细胞分泌该多肽(如RIG-1蛋白和/或糖基转移酶)。信号序列最好位于核酸编码序列5′端，这样信号序列的多肽位于翻译多肽的N-末端。“信号肽”是指信号序列翻译的多肽序列。

“宿主细胞”是指已经过一个或多个本发明表达构建体转染的细胞，包括家禽体外培养细胞和体内细胞，也包括家禽的卵、或受精卵。

“转染”是指在宿主细胞中引入一个或多个本发明表达构建体的实施过程，包括(但并不限于)：显微注射，电穿孔，脂质体介导转染，磷酸钙介导转染或病毒介导转染等。本发明表达构建体若已转染至宿主细胞，则称其为“已转染的”。“瞬时转染细胞”是指这样的宿主细胞，在该宿主细胞中引入了表达构建体但没有永久整合到宿主细胞或其后代的基因组，因而随时间推移该表达构建体可被宿主细胞或其后代丢失。“稳定的转染细胞”是指引入宿主细胞的表达构建体已整合到宿主细胞及其后代的基因组。

“转基因”是指任何一个已整合至转染宿主细胞基因组的本发明表达构建体的结构。含有这类转基因的宿主细胞称为“转基因细胞”。这种由部分或全部转基因宿主细胞组成的动物是“转基因动物”。首选转基因动物为转基因家禽(如，鸡)。由部分转基因宿主细胞组成的动物称为“嵌合体”或“嵌合体动物”。

表达盒组装

应用于本发明的基因工程方法系标准已知程序(如“分子克隆实验室手册”第二版等)。这些标准的分子生物学技术，可以用来准备该发明的表达盒。表达盒包含一些必要元件以在选择性宿主细胞内开展目标核酸序列的转录和翻译，包括启动子，翻译产物的分泌信号序列和polyA信号。类似的表达盒也可能含有内含子或非编码基因序列，旨在提高转录和翻译效率及mRNA的稳定性。待表达的核酸序列可以具有其内源性的3′端非编码序列和/或polyA信号，或包含一个外源性3′端非编码序列和/或polyA信号。例如酪蛋白启动子，分泌信号序列，3′端非编码序列和polyA信号，可用于在乳腺宿主细胞内表达RIG-1蛋白。密码子的选择及目标核酸序列的构造设计或选择包含所需宿主细胞内优先使用的密码子，可用于尽量减少早期翻译终止，从而最大限度地表达蛋白。

插入的核酸序列也可能编码便于识别和编码多肽的附加表位标签。编码的附加表位标签可以包括用于特异位点蛋白水解或化学裂解以利于蛋白纯化后附加表位标签去除的识别位点。例如凝血酶裂解位点可以掺入重组RIG-1蛋白和其附加表位标签之间。

本发明构建的旨在宿主细胞内表达重组RIG-1表达盒可包括一个或多个以下基本组件。

1).启动子

这些序列对宿主细胞而言可具内源或异源性，可进行修饰，并可提供全能(即表达不受明显外部刺激影响，不属细胞特异)或组织特异性(亦称细胞特异)表达。全能表达启动子序列包括合成的和自然的病毒序列，例如，人巨细胞病毒直接早期启动子(CMV)；猿猴病毒40(SV40)的早期启动子；Rous肉瘤病毒(RSV)；或腺病毒主要晚期启动子。这些启动子赋予与它们操作性连接的核酸分子较高的转录水平。启动子可被修饰，如删除或增加序列，如促进子(巨细胞病毒，SV40，或呼吸道合胞病毒促进子)，或促进子的串联重复序列。包含强壮促进子序列的启动子可增加转录达10-100倍。

2).内含子

含有内含子序列(即基因组序列)的核酸序列相比无内含子的序列表达量较高。因此，在转录起始位点和转译起始密码子之间及3′末端和转译终止密码子之间，或RIG-1蛋白编码核酸序列内部插入内含子序列可导致该酶较高表达水平。这样的内含子序列，包括5′端剪接位点(供体位点)和3′端剪接位点(受体位点)，至少被100个非编码序列碱基对分开。这些内含子序列可衍生自其启动子被用来驱动RIG-1蛋白表达的基因，自然RIG-1蛋白基因，或其它合适基因的基因组序列。应选择这样的内含子序列，以尽量减少表达盒内重复序列的存在，因为这样的重复序列可增加重组机会，从而造成结构不稳定。这些内含子最好位于RIG-1蛋白编码核酸序列之内，与自然人RIG-1蛋白基因的内含子/外显子结构类似。

3).信号序列

每个表达盒将另外包括能提供从宿主细胞分泌重组RIG-1蛋白的信号序列。这样的信号序列存在于能分泌其蛋白产物的自然基因。本发明可采用来自于RIG-1蛋白基因，宿主细胞特异性表达基因，或另一个其蛋白产物已知分泌基因，或可合成的信号序列。

4).终止区域

每个表达盒将另外包括核酸序列，该序列包含转录终止和多聚腺苷酸化序列。该序列被链接于RIG-1蛋白编码核酸序列的3′末端。这些序列可包括其5′端区域驱动RIG-1蛋白表达基因的3′末端和多聚腺苷酸化信号(即山羊β-酪蛋白基因的3′末端)。或者，这样的序列来自于该序列已被证明可以调节转录后mRNA稳定性的基因(例如，那些来自于牛生长激素基因，β-珠蛋白基因，或SV40早期启动子区域的序列)。

5).表达盒其他功能

RIG-1蛋白编码核酸序列在其5′端或3′端非翻译区(UTR)内，和/或在编码的RIG-1蛋白N-末端的区域内可任选地被修饰，以提高表达水平。RIG-1蛋白编码核酸序列内的序列可被删除或突变，以增加分泌和/或避免RIG-1蛋白产品停留于细胞内；例如，作为调节，加上内质网滞留信号或其它分类抑制信号。

此外，表达盒可含位于RIG-1蛋白编码核酸序列5′端和/或3′端，从而提高转导宿主细胞集成率的适当序列(即ITR序列，Mol Cell Biol 8：3988-3996，1988)。表达盒还可含具染色质开放或绝缘体活性的核酸序列，从而重复激活链接的转基因组织特异性表达。这样的序列包括基质结合区(MARs)(Mol Repro Dev 44：179-184，1996；Proc Natl Acad Sci USA 89：6943-6947，1992)。另请参见PCT公开号WO95/33841和WO96/04390。

表达盒还包括利于表达结构克隆和繁衍的载体序列。用于本发明并在领域中已知的的标准载体包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，和酵母人工染色体。载体序列可包含在大肠杆菌中繁衍的复制原点；SV40的复制原点；用于宿主细胞选择的青霉素，新霉素，或嘌呤霉素抗性基因；和/或扩增显性选择标记基因(如二氢叶酸还原酶基因)及其他感兴趣的基因。

用于产生转基因动物的表达盒可在引入宿主细胞前通过限制性核酸内切酶消化线性化。或者，在引入宿主细胞前除去多余的载体序列，引入的线性片段只由RIG-1蛋白编码序列，5′端调节序列(即启动子)，和3′端调节序列(即3′端转录终止和多聚腺苷酸化序列)，及任何侧翼绝缘体或MARs。经这些片段转化的细胞将不含用于原核细胞转化的大肠杆菌复制起源，或编码抗生素耐药蛋白(如青霉素耐药蛋白)的核酸分子。

另外，用于转染宿主细胞的表达盒限制性消化酶消化片段可包括RIG-1蛋白编码序列，5′端和3′端调控序列，和任何侧翼绝缘体或MARs，这些序列可与编码抗生素抗性蛋白的核酸序列链接以用于转染真核细胞的抗性选择(如通过新霉素或嘌呤霉素)。

表达盒的评估

使用本发明所述表达盒在产生转基因动物之前，可应用体外细胞培养转染系统确定该表达盒功能。表达盒的遗传稳定性能，重组蛋白的分泌程度和重组蛋白物理和功能属性亦可在转基因动物产生之前评估。含全能启动子的表达盒可转染任何动物细胞系。转染细胞培养物介质可用Western印迹分析或生化活性测定(Ellman活性测定；Biochem Pharmacol 7：88-95，1961)直接测试分泌蛋白的存在，以确定依据本发明所建RIG-1蛋白编码表达盒而转染的细胞系是否生产重组RIG-1蛋白。凡某个细胞系经稳定转染并已被证明生产活性重组蛋白，该细胞系可用于产生转基因动物。

转基因鸡的产生

在本发明中，可以采用赤道开窗法，将含目的基因的重组载体通过显微注射针注射到鸡受精蛋胚盘下腔，制备F0代转基因鸡。

在本发明优选地实施方式中，赤道开窗法的具体操作如下：

(1)新鲜受精蛋经75％酒精表面消毒后，平置于蛋托上标记最高点，室温过夜使胚盘上浮固定。

(2)在标记处用牙科钻开一个边长3mm左右的窗口，在冷光源下寻找胚盘，一旦发现胚盘，用显微注射针吸取2-3μl重组慢病毒浓缩液注射到胚盘下腔，当胚盘中间透明区变红，说明注射成功。

(3)用封口膜将开口处封闭固定。

(4)将注射病毒和开口没注射病毒的受精蛋全部放置于温度37.8℃，湿度50％的孵化器内，18d后将其转移到出雏器中，温度37.5℃，湿度50％孵育至出壳。

转基因在动物，组织或相关细胞基因组DNA中的存在，及转基因拷贝数可通过在相关领域中公认的技术包括杂交和PCR技术而确认。

一些转基因方法会导致嵌合动物的产生。在嵌合动物中，部分转基因宿主细胞中所述表达构建体的启动子处于活动状态，从而表达所需的重组RIG-1蛋白。嵌合动物可被用于特性描述或分离重组RIG-1蛋白。嵌合动物的生殖细胞可用于繁衍并产生全转基因的非嵌合后代。

直接通过转基因方法产生，或通过嵌合动物繁衍的全转基因后代可被用于繁殖以维持转基因品系，及特性描述或分离重组RIG-1蛋白。

本发明的主要优点在于：

(1)首次培育出了能够稳定表达鸭RIG-I基因的转基因鸡；

(2)采用本发明的方法培育的转基因鸡，具有显著的抗禽流感特性。

(3)根据本发明的方法制备的转基因鸡体内能够稳定表达鸭RIG-I，并显著提高鸡的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

(4)使用本发明的方法制备转基因鸡，具有显著较高的转基因阳性率，能够显著降低转基因鸡的培育成本。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1，pGV205-RIG-I重组慢病毒载体的构建

根据GenBank中绿头鸭RIG-I基因(EU363349)使用VectorNTI设计两端含限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ酶切位点的扩增引物：

RIG-1-F：5’-CAGCTAGCATGACGGCGGACGAGAAG-3’；(SEQ ID NO.:2)

RIG-1-R：5’-GCCTCGAGCTAAAATGGTGGGTACAAGTTGG-3’(SEQ ID NO.:3)。

以北京金定鸭的脾脏cDNA为模版，RIG-1-F和RIG-1-R为引物进行鸭脾脏RIG-1基因的PCR扩增，循环参数为：95℃5min；95℃30s、58℃30s、72℃3.5min，35个循环；72℃5min。将PCR扩增产物中的目的基因胶回收，克隆至pMD18-T载体中构建pMD-RIG重组质粒，并由Invitrogen公司测序鉴定。将测序结果与GenBank中绿头鸭RIG-1基因(EU363349)进行序列比对，测序结果表明克隆得到的RIG-1基因全长2802bp(SEQ ID NO.:1)，与GenBank中绿头鸭RIG-1基因(EU363349)的同源性为100％。

将克隆的鸭RIG-I基因和pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)同时用限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ双酶切，然后通过连接、转化、克隆构建pcDNA3.1-RIG-I重组质粒。

将pcDNA3.1-RIG-I重组质粒和慢病毒毒载体pGV205(图1，购自上海吉凯基因化学技术有限公司)同时用限制性内切酶NheⅠ和AgeⅠ双酶切，结果如图2，然后通过连接、转化、克隆构建重组慢病毒载体pGV205-RIG-I。

实施例2，转基因鸡的制作与鉴定

将构建的重组慢病毒载体pGV205-RIG-I，包装成重组慢病毒；采用赤道开窗法，将重组慢病毒通过显微注射针注射到新生受精蛋胚盘下腔，经遗传操作的授精蛋正常条件孵化至出壳，成功制备了转入鸭RIG-I基因的转基因鸡。

经过发明人多次实验，试验出的赤道开窗法最佳条件如下，在该条件下注射的受精蛋可以有较高的孵化率，孵出的转基因鸡阳性率也显著提高。

受精蛋胚盘注射及孵化

(1)新鲜受精蛋经75％酒精表面消毒后，平置于蛋托上标记最高点，室温过夜使胚盘上浮固定。

(2)在标记处用牙科钻开一个边长3mm左右的窗口，在冷光源下寻找胚盘，一旦发现胚盘，用显微注射针吸取2-3μl重组慢病毒浓缩液注射到胚盘下腔，当胚盘中间透明区变红，说明注射成功。

(3)用封口膜将开口处封闭固定。

(4)将注射病毒和开口没注射病毒的受精蛋全部放置于温度37.8℃，湿度50％的孵化器内，18d后将其转移到出雏器中，温度37.5℃，湿度50％孵育至出壳。

RIG-I转基因鸡PCR结果

通过翅静脉采集RIG-I转基因鸡的血液，使用血液基因组试剂盒提取血液DNA作为模板，使用RIG-I鉴定引物进行PCR扩增，扩增条带大小为503bp(503bp是PCR方法检测转基因鸡时扩增的序列，上游引物为鸭RIG-I基因中的序列(下划线标示部分)，下游引物为载体上的序列)，与预期大小一致(图3)。挑选F0代转基因公鸡分别与4只野生型母鸡合笼，其繁育的部分F1代鸡中也确定整合有外源基因RIG-I。

RIG-I转基因鸡Southern blot结果

用酚氯仿法提取经PCR鉴定阳性的F0代鸡组织基因组，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切，根据试剂盒说明书进行Southern blot检测。杂交条带3Kb左右，与预期条带大小一致，进一步确认了经PCR检测为阳性的转基因鸡整合有外源基因RIG-I(图4)。用酚氯仿法提取经PCR鉴定阳性的F1代鸡组织基因组，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切，根据试剂盒说明书进行Southern blot检测。杂交条带3Kb左右，与预期条带大小一致，进一步确认了经PCR检测为阳性的转基因鸡整合有外源基因RIG-I。

RIG-I转基因鸡RT-PCR结果

采集RIG-I转基因鸡的鸡冠组织，经液氮研磨后使用RNA提取试剂盒提取鸡冠RNA，反转录成cDNA作为模板，使用RIG-I鉴定引物进行PCR扩增，扩增条带大小为503bp，与预期大小一致(图5)；F0代转基因鸡有外源基因RIG-I转录。应用同样的方法，RT-PCR结果显示，部分F1代鸡的鸡冠组织中也确定有外源基因RIG-I转录。

RIG-I转基因鸡Western blot结果

经PCR、southern blot和RT-PCR检测结果一致的转基因鸡，提取这些鸡的鸡冠蛋白，通过免疫印迹检测鸡冠中RIG-I蛋白的表达，结果表明这些鸡中均有RIG-I蛋白的表达(图6)。提取经PCR鉴定阳性的F1代鸡冠组织蛋白，通过免疫印迹检测鸡冠中RIG-I蛋白的表达，结果表明F1代转基因鸡有RIG-I蛋白的表达。

与转基因组同时注射、孵化出雏，但利用分子生物学等方法未能检测到外源基因的整合与表达，被命名为NTG，NTG组中没有检测到外源基因的整合与表达。

实施例3，转基因鸡整合位点分析与验证

F0代整合位点分析

提取0475号F0代RIG-I转基因鸡的DNA作为模板，利用设计的特异性引物分别与六个简并引物组成引物组合，对整合位点的上游和下游侧翼序列进行Tail-PCR扩增，取15μl第三次PCR扩增的产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果(图7)。

胶回收第三轮Tail-PCR扩增在750-2000bp左右的特异性目的片段，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中鸡的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到鸡的2号染色体上，鸡基因组在被测序列的第44-436bp，HIV载体在第437-749bp；0475号转基因鸡外源基因侧翼序列与GenBank数据库中鸡的2号染色体上120582895-120583287bp序列有100％的同源性；经分析发现外源基因插入位点在鸡2号染色体120582894-120582895bp处(约2/5的转基因鸡，10只转基因鸡中有4只鸡的整合位点在同一位置)。

这表明，本发明构建的转基因载体能够整合到转基因鸡的基因组中，且具有一定的倾向性。

F0代整合位点结果验证

根据测序结果序列44-749bp(既要包括鸡基因组又要包括HIV载体)之间设计特异性验证引物，以0475号转基因鸡基因组为模板扩增的条带大小为620bp与预期结果一致。

胶回收目的条带，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中鸡的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到鸡的2号染色体上，HIV载体在第41-285bp，鸡基因组在被测序列的第286-660bp；0475号转基因鸡外源基因侧翼序列与GenBank数据库中鸡的2号染色体上120582895-120583269bp序列有100％的同源性；经分析发现外源基因插入位点在鸡2号染色体120582894-120582895bp处，所得结果与前面一致，表明验证正确。

F1代整合位点验证

用0475号F0代转基因鸡整合位点的验证引物，以0475号转基因鸡的后代作为模板，进行PCR扩增；扩增的条带大小为620bp与预期结果一致。胶回收目的条带，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中鸡的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到鸡的2号染色体上，与F0代的结果一致。

实施例4，表达鸭RIG-I的F1代CEF细胞，对禽流感病毒复制的影响

F1代鸡胚组织的分子生物学结果

PCR结果

取出部分鸡胚组织提取基因组DNA作为模板，用RIG-I检测引物进行PCR扩增，上游引物为鸭RIG-I基因中的序列(SEQ ID NO.:1中下划线所示)，下游引物为载体上的序列，扩增条带大小为503bp，与预期大小一致(图8)；部分F1代鸡胚中整合有外源基因RIG-I。

Southern blot结果

用酚氯仿法提取经PCR鉴定阳性的F1代鸡胚组织基因组DNA，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切，根据试剂盒说明书进行Southern blot检测。杂交条带3Kb左右，与预期条带大小一致(图9)，进一步确认了经PCR检测为阳性的部分F1代鸡胚整合有外源基因RIG-I。

RT-PCR结果

用RNA提取试剂盒提取F1代鸡胚组织RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板利用RIG-I基因的鉴定引物进行PCR扩增，扩增条带大小为503bp，与预期大小一致(图10)；部分F1代鸡胚中确定有外源基因RIG-I转录。

Western blot结果

提取经PCR、southern blot和RT-PCR检测结果一致的F1代鸡胚组织蛋白，通过蛋白免疫印迹检测RIG-I蛋白的表达情况，结果表明部分F1代鸡胚中有RIG-I蛋白的表达(图11)。

荧光定量PCR分析TG组CEF细胞中RIG-I基因mRNA含量结果

经生物学方法鉴定为阳性的胚胎组织制备成的CEF细胞，过夜培养当细胞融合度达到80％-90％，用10×TCID₅₀的禽流感病毒感染，分别在感染后8h、16h和24h提取细胞RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR分析感染与未感染细胞中RIG-I的mRNA水平。结果显示三个时间点感染组细胞中RIG-I的mRNA水平均高于未感染组，其中感染16h后RIG-I的mRNA水平上调2.7倍,实验结果如图12所示，实验结果说明在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，流感病毒感染后，上调RIG-I的表达，能激活信号通路。

IFA分析F1代CEF细胞中禽流感病毒的复制

禽流感病毒感染F1代CEF细胞，16h后通过IFA检测病毒血清的表达；感染病毒的CEF细胞中均观察到绿色荧光，但TG组与NTG/WT相比荧光强度弱，荧光细胞数量少，说明流感病毒在TG组细胞中的增殖量比NTG/WT组中的低(图13)。IFA结果表明TG组的CEF细胞具有抑制禽流感病毒复制的能力。

TCID50测定禽流感病毒的病毒滴度

用禽流感病毒感染TG组，NTG组，WT组CEF细胞，感染后8h，16h，or 24h收集TG/NTG/WT组CEF细胞上清，检测禽流感病毒的TCID₅₀；结果显示三个时间点TG组病毒TCID₅₀均低于NTG/WT组，其中感染后8h TG组与WT组相比TCID50降低了2.9倍(p<0.05)，感染后16h TG组与WT组相比TCID₅₀降低了6.8倍(p<0.01)，感染后24h TG组与WT组相比TCID₅₀降低了2.5倍(p<0.05)(图14)，表明本发明的转基因鸡具有显著较强的对禽流感病毒的抵抗能力。

荧光定量PCR检测鸡IFNβ和PB2基因mRNA含量结果

用禽流感病毒感染TG组，NTG组，WT组CEF细胞，感染后8h，16h，or 24h提取F1代CEF细胞的RNA，通过qRT-PCR检测TG组，NTG组和WT组CEF细胞中鸡IFNβ和流感病毒PB2基因的mRNA拷贝数。结果显示三个时间点TG组IFN-β的表达量均高于NTG/WT组，其中感染16h后TG组IFN-β的表达量达到WT组的2.4倍(图15)；三个时间点TG组PB2的mRNA拷贝数均低于NTG/WT组，其中感染16h后TG组PB2的mRNA拷贝数是WT组的0.34倍(图16)。

本实验结果证明了，流感病毒感染后的表达RIG-I的转基因细胞中，上调IFN-β的表达，说明激活了RIG-I信号通路。

荧光定量PCR检测RIG-I下游细胞因子mRNA含量结果

用禽流感病毒感染TG组，WT组CEF细胞，感染后16h提取F1代CEF细胞的RNA，通过qRT-PCR检测IFN-β，IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1的mRNA水平。结果显示禽流感病毒感染后TG组CEF细胞与WT组CEF细胞相比，RIG-I下游的IFN-β，抗病毒分子(PKR，OASL，MX1)，促炎症细胞因子(IRF7，IFIT5)的mRNA水平都有所上调，IFN-β上调2.4倍，其他细胞因子IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1分别上调了2.1倍，1.5倍，1.9倍，2倍，1.9倍，实验结果如图17所示。本实验结果证明了，流感病毒感染后的表达RIG-I的转基因细胞中，上调抗病毒分子和促炎症因子的表达，进一步说明激活RIG-I信号通路，发挥抑制病毒的作用。

总结：

本发明中克隆了北京金定鸭的RIG-I基因连接到pGV205慢病毒载体(上海吉凯公司)中，构建了重组慢病毒载体pGV205-RIG-I。

然后通过赤道开窗法，将构建的pGV205-RIG-I重组慢病毒载体包装成的慢病毒注射到受精蛋胚盘下腔，成功获得了表达鸭RIG-I的海兰白转基因鸡，并能将外源基因稳定遗传至F1代。

通过转基因鸡整合位点分析，证明了本发明的慢病毒载体法制备的转基因鸡的整合位点具有一定的倾向性，能够比较特异地插入于鸡2号染色体的120582894-120582895bp处。

分离培养了表达鸭RIG-I的F1代CEF细胞。经禽流感病毒感染后，在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒复制的作用。

实验结果表明，根据本发明的表达RIG-I的F1代转基因鸡，能够稳定表达外源基因RIG-I，并能显著提高鸡的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种转基因鸡的培育方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供一载体，并将所述载体包装成重组慢病毒；

其中，所述载体以pGV205慢病毒载体为骨架，并且所述载体中含有鸭RIG-I基因编码序列；

(ii)将上一步骤所述的重组慢病毒转入鸡的受精卵中，获得经转染的受精卵；

(iii)孵化上一步骤获得的经转染的受精卵，从而获得所述转基因鸡。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(iv)将步骤(iii)中获得的转基因鸡作为F0代，与野生型鸡杂交，繁育F1代，从而获得F1代转基因鸡。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(v)利用步骤(iv)获得的F1代转基因鸡繁育获得F2代转基因鸡。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)采用赤道开窗法，将所述重组慢病毒通过显微注射针注射到受精卵胚盘下腔，获得经转染的受精卵。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中所述载体的制备方法包括步骤：

(i-1)以鸭cDNA为模板扩增RIG-I基因，获得RIG-I基因扩增产物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(i-1)扩增RIG-I基因的引物对序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。

7.一种载体，其特征在于，所述载体以pGV205慢病毒载体为骨架，并且所述载体中含有鸭RIG-I基因编码序列。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述鸭RIG-I基因编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的载体。

10.权利要求7所述的载体、或权利要求9所述的宿主细胞，在制备试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂用于制备转基因鸡。