CN103555759A - 利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，包括以下步骤：将外接信号肽的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件，然后通过显微注射或体细胞移植技术获得转基因家兔，获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。本发明实现了第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达，以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，特别涉及一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法。
背景技术
血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，如辅酶凝血因子八(甲型血友病)，以及第九因子(乙型血友病)。由于血友病是由编码循环血浆蛋白的单个X连锁基因缺失引起，因此治疗血友病的重点是合成或提炼具有正常功能的凝血因子代替这种错误蛋白或缺失蛋白。
血友病的治疗最初采用全血浆，之后采用从血浆中提取的高度纯化第八因子(hFVIII)浓制剂。患者使用后者治疗，较低剂量可达到较好的疗效。这种疗法虽然可以有效控制出血，但可能会产生其它并发症。血液制品的原料一般来源于捐献者，由于检验技术有限这些血液制品可能携带传染病毒，如B型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)，增加了患者感染病毒的风险。
重组人凝血因子(rhFVIII)对凝血因子八缺失或低量分泌所致的遗传性凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。仅2005年此药物的全球销售达到十四亿美元。它还可用于治疗创伤性出血、手术性出血、颅内出血以及其他获得性血液疾病，具有强大的市场潜力。有鉴于此，有必要提供一种高效制备重组人凝血因子的方法。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，包括以下步骤：(1)将外接信号基因的B-domain(结构域)缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；(2)将乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B2培养液和35℃～40℃、3％～7％CO2培养箱中培养10-20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；(3)将乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔；(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。由此，实现第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，然后对乳汁进行分离纯化及检测，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。
在一些实施方式中，步骤(1)中，质粒载体为pBC1质粒载体。由此，pBC1质粒载体更佳适用于构建乳腺表达构件。
在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。由此，调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。
在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋1白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段、CMV增强子。由此，调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。
在一些实施方式中，步骤(1)中，信号基因为bGHployA。由此，bGHployA表达的信号肽起到较好的信号作用。
在一些实施方式中，步骤(2)中，乳腺表达构件在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分；
步骤(3)中，乳腺表达构件在转染至家兔细胞之前，利用Sal I与NotI的限性内切酶释放细菌质粒部分。由此，细菌质粒部分的释放避免乳腺表达构件在基因表达时出现干扰杂质。
在一些实施方式中，步骤(3)中，卵母细胞为滤泡卵母细胞或输卵管卵母细胞，家兔供体细胞为胚胎细胞、成纤维细胞和卵丘细胞中的一种。由此，卵母细胞和家兔供体细胞的选择可增加转基因家兔的成活率。
在一些实施方式中，步骤(4)中，泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期。由此，泌乳期的增加可提高rhFVIII的产量。
在一些实施方式中，步骤(4)中，重组人第八凝血因子为B-domain缺失的重组人第八凝血因子。由此，B-domain缺失的重组人第八凝血因子可实现血友病的辅助治疗及创伤性出血、手术性出血、颅内出血以及其他获得性血液疾病治疗的治疗。
附图说明
图1为B-domain缺失的重组人第八凝血因子rhFVIII cDNA的结构示意图；
图2为B-deleted rhFVIII cDNA克隆的测定结果；
图3为第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVIII的基因图谱；
图4为pBCl-rhFVIII克隆的测定结果；
图5为pBCl-rhFVIII cDNA序列与基因库bank cDNA序列的对比；
图6为pBCl-rhFVIII的信号肽和连接肽；
图7为pBCl-rhFVIII酶切片段电泳检测结果；
图8为第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-CMV-rhFVIII的基因图谱；
图9为去除细菌质粒的pBCl-rhFVIII在乳腺上皮细胞MCF-7中的mRNA转录表达；
图10为乳腺表达构件注入家兔受精卵时受精卵的状态图；
图11为家兔体细胞核移植技术培育转基因家兔的过程。
具体实施方式
下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
实施例1准备B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA(B-deletedrhFVIII cDNA)
重组人全序列第八凝血因子cDNA(rhFVIII cDNA)，含A1，A2，B，A3，C1和C2domain，图1为连接有bGHployA的B-deleted rhFVIII cDNA的结构示意图，图中“S”表示信号基因bGHployA，B-deleted rhFVIII cDNA为人工合成。采用PCR检测方法检测B-deleted rhFVIII cDNA使用的引物为pBClhF8-fs，pBClhF8-Ar，pBClhF8-CF，pBClhF8-r，pBClhF8-fA，图1中箭头所示方向为引物的方向。
将B-deleted rhFVIII cDNA片段感染至Zero Blunt TOPO细菌(来源：Invitrogen，Cat：K2800-20)的感受态细胞中，B-deleted rhFVIII cDNA片段的大小为4355bp，然后使细菌增殖并抽提质粒进行电泳测定，测定结果如图2所示，M为1Kb DNA ladder(1Kb DNA阶梯对照，来源：NEB，Cat.N3232S)标号1，5，7，8，11，12，13，15为质粒(3519bp)，标号2，3，4，6，9，10，14，16为重组质粒(3519bp+4355bp)，因此，标号2，3，4，6，9，10，14，16为阳性克隆，将克隆#2，3，6，9，16进行DNA测序，其中，克隆#3的DNA序列与4355bp的B-deleted rhFVIII cDNA碱基序列100％吻合，达到使B-deleted rhFVIII cDNA大量扩增的目的，便于组装到质粒载体中。
实施例2第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVIII的制备
如图3所示，pBCl质粒连接鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2，在质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入外接信号基因的B-deleted rhFVIII cDNA，再连接-酪蛋白外显子7、8、9，β-酪蛋白内含子7、8，在3′端加载β-酪蛋白基因组片段，形成第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVIII，基因序列长25989bp。pBCl质粒DNA包含细菌(EolEl)起始片段，抗性基因AmpR启动子以及抗性基因AmpR。
其中，鸡β球蛋白绝缘子(Chicken beta-globin insulator)，山羊β-酪蛋白启动子(Goat beta-casein promoter)，TATA盒(TATA box)，β-酪蛋白外显子1(beta-casein exon1)，β-酪蛋白内含子1(beta-casein intron1)，β-酪蛋白外显子2(beta-casein exon2)，β-酪蛋白外显子7、8、9(beta-caseinexon7、8、9)，β-酪蛋白内含子7、8(beta-casein intron7、8)，β-酪蛋白基因组片段(beta-casein3′genomic fragment)为乳腺表达构件的调控元件。
实施例3第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVIII的扩增及检测
将第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVm转入受体菌DH5α的感受态细胞中，将获得的受体菌增值，以实现pBCl-rhFVIII的扩增，采用PCR方法筛选出阳性的克隆，引物为pBClhF8S-SNf：5′-TGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTT-3′，pbCl-sr：5′-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3′，PCR片段大小为197bp。然后进行电泳测定，测定结果如图4所示，筛选的120个克隆中，标号38、47为阳性克隆，其中，M为100bp DNA ladder(来源：NEB，Cat.N0467S)。将克隆#38、47进行DNA测序，克隆#47与基因bank cDNA的序列(NM000132.3)完全吻合，对比结果如图5所示，其中，Seq_1为第八凝血因子的部分cDNA序列，Seq_2是基因库中的序列。
将克隆#47进行DNA测序，经过分析获得pBCl-rhFVIII全序列，如序列表所示，基因全长25989bp，ATG启始密码子在8615，TGA终止密码子在12965。由pBCl-rhFVIII的序列推断出的1455个氨基酸，氨基酸序列与天然的B-domain缺失的序列完全吻合，第八凝血因子B-domain缺失的氨基酸序列，包含信号肽S：1～19，A1：20～391，A2：392～759，连接肽：760～766，A3：767～1140，C1：1141～1294，C2：1295～1455。如图6所示，pBCl-rhFVIII的信号肽为19个氨基酸，在B-domain缺失的部分有7个氨基酸的连接肽。
进行DNA测序的引物是M13质粒载体M13Reverse：caggaaacagctatgac；M13Forward(-20)：gtaaaacgacggcaag；hFVIII重组第八因子cDNA hF VIII-A2f： tgccacaggaaatcagtctattgg；hF VIII-A3f：tccgatttatggcatacacagatg；hF VIII-A4f： ttccaagcctccaacatcatgcac；hF VIII-C2r：atcattggtgccaacagatccac；hFVIII-C3r：tgtactgtcacttgtctcccatgagc。
利用SalI限性内切酶将环状DNA切成线性的DNA(25.98kb)，利用XhoI限性内切酶将插入的4.35kb的B-deleted rhFVIII cDNA片段释放，产生21.63kb的载体片段，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放5.88Kb的细菌质粒部分与20.1kb的线性DNA，释放的线性DNA包含乳腺的表达载体与插入的rhFVIII cDNA，该片段可以用于显微注射到家兔的受精卵，培育第八凝血因子的转基因兔，上述酶切片段的检测结果如图7所示。
实施例4第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-CMV-rhFVIII的制备
如图8所示，pBCl质粒连接鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、CMV增强子序列，在质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入外接信号基因的B-deleted rhFVIII cDNA，再连接酪蛋白外显子7、8、9，β-酪蛋白内含子7、8，在3′端加载β-酪蛋白基因组片段，形成第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-CMV-rhFVIII，基因序列长25989bp。pBCl质粒DNA包含细菌(EolEl)起始片段，抗性基因AmpR启动子以及抗性基因AmpR。
其中，鸡β球蛋白绝缘子(Chicken beta-globin insulator)，山羊β-酪蛋白启动子(Goat beta-casein promoter)，TATA盒(TATA box)，β-酪蛋白外显子(beta-casein exon1)，β-酪蛋白内含子1(beta-casein intron1)，β-酪蛋白外显子2(beta-casein exon2)，CMV增强子序列，β-酪蛋白外显子7、8、9(beta-casein exon7、8、9)，β-酪蛋白内含子7、8(beta-casein intron7、8)，β-酪蛋白基因组片段(beta-casein3′genomic fragment)为乳腺表达构件的调控元件。
pBCl-CMV-rhFVIII的克隆方法与pBCl-rhFVIII相同，将pBCl-CMV-rhFVIII进行DNA测序，经过分析获得pBCl-CMV-rhFVIII进行DNA全序列，如序列表所示，基因全长26582bp，ATG启始密码子在9208，TGA终止密码子在13558，CMV增强子从8609到9201，总长为593bp。
利用XhoI限性内切酶可以将插入的cDNA片段释放，利用SalI与NotI的限性内切酶可以释放5.876Kb的细菌质粒部分，形成线性DNA用于制作转基因家兔
pBCl-CMV-rhFVIII与pBCl-rhFVIII的基因结构相同，但pBCl-CMV-rhFVIII增加了一个增强子CMV。pBCl-CMV-rhFVIII与pBCl-rhFVIII的扩增及检测方法相同。
实施例5第八凝血因子的乳腺表达构件在细胞中的表达
将去除细菌质粒的pBCl-rhFVIII(20108bp)通过电转染的方法感染乳腺上皮细胞MCF-7，培养三天后收集细胞与培养液，检测细胞中表达的mRNA。采用RT-PCR(reversetranscription PCR，反转录PCR)的检测方法，使用引物pBC l-sr：5′-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3′和pBClhF8S-SNf：5′-tgtggtgaactctctagacccaccgtt-3′(片段大小为195bp)进行cDNA的扩增，去除细菌质粒的pBCl-rhFVIII作为阳性的对照，未转染的细胞作为细胞的阴性对照，H2O作为污染对照，在感染的细胞中出现预期的mRNA片段，证实转入的pBCl-rhFVIII基因在MCF-7的细胞中得到了表达，检测结果如图9所示，+RT表示有反转录酶反应后的PCR反应，-RT表示没有反转录酶反应后的PCR反应，作为RT的对照组。196bp的RT-PCR的产物表明扩增的DNA是从mRNA中反转录成cDNA产生的，即pBCl-rhFVIII cDNA的mRNA表达。
pBCl-CMV-rhFVIII cDNA在细胞中表达的检测与pBCl-rhFVIII相同，检测结果证实证实转入的pBCl-CMV-rhFVIII cDNA在MCF-7的细胞中得到了表达。
实施例6将第八凝血因子的乳腺表达构件注入家兔受精卵(原核期胚胎)，培育成转基因家兔
将30只性成熟(6月龄以上)的供体家兔进行超数排卵处理，具体为：连续三天对供体家兔实施颈皮下注射FSH(卵泡刺激素)，每天两次，按剂量递增的方式，三天的剂量分别为3mg，4mg，5mg，FSH处理完毕后，供体家兔与公兔交配两次，并注射100IU hCG/供体(IU国际单位，hCG人绒毛促性腺激素)。hCG处理后18h，从供体家兔的输卵管中冲洗出受精卵。受精卵经15000g的条件离心8分钟，如图10中A和C所示，充分显示雄性与雌性原核，图10为显微注射的过程，明显确立了原核膨胀(如图10中B和D所示)，注射用乳腺表达构件为去除细菌质粒的pBCl-rhFVIIIcDNA(20108bp)。
将注射过的受精卵移入2.5％FBS B2(胎牛血清)培养液中，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养14～15h以确定胚胎的成活率和分裂的状况。将15～20个分裂成2-4细胞的胚胎移植到经过同期发情处理的受体家兔的输卵管中。结果显示，妊娠率为70％(n＝20)，在受孕的受体家兔中，15.2％的注射卵子发育成功并产下80只幼体。
对幼体进行基因鉴定，每只幼体取下直径0.5cm的耳组织，从耳组织中提取DNA，采用常规的PCR以及Southern blot方法，鉴定其整合外源性rhFVIII基因在注射兔的整合情况。经鉴定80只幼体中有14转基因家兔，为6只公兔和5只母兔，rhFVIII基因的整合率为17.5％，成活9个阳性的幼体，为4只公兔和5只母兔。表1为培育转基因家兔试验数据。
表1
| 项目 | 第八凝血因子转基因结果 |
| 乳腺表达构件 | pBCl-rhFVIII |
| 乳腺表达构件浓度 | 1.5ng/ul |
| 供体家兔数量 | 30 |
| 受体家兔数量 | 20 |
| 收集胚胎数 | 1052 |
| 供体家兔平均排卵数 | 35 |
| 未受精卵子 | 273 |
| 注射数 | 579 |
| 卵子受精率(％) | 74 |
| 移植数 | 528 |
| 注射率(％) | 55 |
| 移植率(％) | 91.2 |
| 受精卵利用率 | 0.502 |
| 移植胚胎总数 | 527 |
| 受体家兔平均移植胚胎数 | 26.4 |
| 受体家兔产仔数 | 80 |
| 产仔率(％) | 15.2 |
| 阳性数 | 14 |
| 阳性存活数 | 9 |
| 幼体阳性率(％) | 11.25 |
需要说明的是，pBCl-CMV-rhFVIII与使用pBCl-rhFVIIIcDNA培育转基因家兔的试验方法相同。
实施例7细胞核移植的方法培育转基因家兔
将去除细菌质粒的pBCl-rhFVIII cDNA转染至家兔细胞中，然后将经过转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的家兔卵子细胞的细胞质中。
如图11所示，A图为采用显微注射的方法去除家兔卵子细胞中的极体和附近带核的胞质，箭头指示处为极体，B图中箭头指示处为去除的卵母细胞核，C图为移入透明带下的供核细胞，箭头指示处为阳性细胞核，D图为发育到4个细胞的克隆胚胎，E图为发育到囊胚的克隆胚胎，F图为发育到囊胚的克隆胚DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色。受体家兔妊娠14天B超检查到孕囊，G图中箭头指示处为卵黄囊，H图为出生的死胎，I图为出生的获得克隆兔。表2为家兔细胞核移植的效率，括号内为百分比，如表2所示，细胞核移植培育克隆兔的效率较低。
表2
本发明的第八凝血因子的乳腺表达构件还可以通过胚胎干细胞技术培育转基因家兔。步骤为：将第八凝血因子的乳腺表达构件转染家兔的胚胎干细胞，通过同源重组的技术，将外源的第八凝血因子的乳腺表达构件整合到干细胞特定的基因组中，然后通过分子生物学方法筛选出阳性的干细胞群，再将干细胞注射到正常的家兔受体胚胎中，胚胎干细胞与正常的胚胎细胞之间可形成嵌合体，嵌合体动物出生以后，如果阳性胚胎干细胞传递到生殖细胞系，其后代的基因组就能携带第八凝血因子的乳腺表达构件，从此培育成转基因家兔，并能在转基因后代母兔的泌乳期分泌第八凝血因子。
实施例8转基因家兔分泌蛋白的检测
转基因家兔乳汁表达rhFVIII提纯以及蛋白翻译后修饰(PTM)的检测提纯：将采集的转基因兔奶通过离心和超微过滤提取净化的rhFVIII。净化的转基因兔奶经过羟基磷灰石色谱处理，其洗脱液经切向流式过滤(tangentialflow filtration，TFF)除去小分子蛋白。TFF洗脱液经过三种阴离子交换色谱(anion exchange chromatography，Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱)，用高钙、低钙和高钠缓冲液，连续洗脱，在洗脱过程中，单链非活化的rhFVIII变成完全激活的rhFVIII，将提取物进行病毒过滤，得到的rhFVIII纯度为99％，将上步骤得到的rhFVIII在安装有RPUptisphere10WC4-25QS柱的AKTA蛋白纯化系统中进行除盐处理，去除干扰分析的盐份，得到99.99％纯度的rhFVIII。
实施例9rhFVIII动物试验
FVIII基因缺失小鼠(KO)由美国The Jackson Laboratory提供，对每只KO小鼠静脉注射2.5IU纯化的rhFVIII，注射后5分钟、2、4、8、16、24、48小时从腔静脉取血，血浆快速冻干并保存与-80℃，拜科其产品作为阳性对照(4只小鼠/时间点，共七组)，进行APTT测试，测试结果如表4所示，本方法制备的rhFVIII具有较高的生物活性。
表4：
按照0、12IU/kg、18IU/kg、27IU/kg、36IU/kg的比例对KO小鼠静脉注射rhFVIII(10只/组，共五组)，5分钟后实施鼠尾静脉切断术，收集失血量数据，试验数据如表5所示，随着注射rhFVIII剂量增加KO小鼠是失血量明显减少。
表5：
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 用量(IU/kg) | 0 | 12 | 18 | 27 | 36 |
| 失血量(ml) | 7.23 | 1.68 | 1.22 | 0.97 | 0.53 |
实施例10转基因公兔的子代培育
阳性的原代F0公兔经过饲养到性成熟，然后与正常的母兔配种，在F1代中筛选出阳性的母兔，再从乳汁中检测rhFVIII的表达。转基因公兔的优点是可以进行快速的种群扩繁，检测子代母兔乳汁中rhFVIII的基因表达，从而在很大程度上降低了rhFVIII的生产成本。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>兰诺生物技术无锡有限公司
<120>利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法
<160>3
<210>1
<211>25989
<212>DNA
<213>人工序列pBCl-rhFVIII
<400>1
Claims (9)
1.利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将外接信号基因的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；
(2)将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B2培养液和35℃～40℃、3％～7％CO2培养箱中培养10-20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；
(3)将所述乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔。
(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质粒载体为pBC1质粒载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺表达构件包括调控元件，所述调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺表达构件包括调控元件，所述调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段、CMV增强子。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述信号基因为bGHployA。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乳腺表达构件在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分；
步骤(3)中，所述乳腺表达构件在转染至家兔细胞之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述卵母细胞为滤泡卵母细胞或输卵管卵母细胞，所述家兔供体细胞为胚胎细胞、成纤维细胞和卵丘细胞中的一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述重组人第八凝血因子为B-domain缺失的重组人第八凝血因子。
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| CN201310297925.2A CN103555759A (zh) | 2013-07-05 | 2013-07-05 | 利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法 |
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|---|---|---|---|
| CN201310297925.2A CN103555759A (zh) | 2013-07-05 | 2013-07-05 | 利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法 |
Publications (1)
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|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105779496A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-07-20 | 青岛农业大学 | 利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法 |
| CN107384966A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-24 | 苏州湖桥生物科技有限公司 | 一种转基因家兔模型的制造方法 |
| WO2020020364A1 (zh) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 | 一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法 |
| CN110938653A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 扬州大学 | 运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法 |
-
2013
- 2013-07-05 CN CN201310297925.2A patent/CN103555759A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 马秋玲: "凝血因子ⅩⅢ基因表达的调控及功能研究进展", 《国外医学输血及血液学分册》 * |
| 龚文: "重组人凝血因子Ⅷ转基因兔的建立及初步检测", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 * |
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| CN110938653A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 扬州大学 | 运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法 |
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