CN105779496A - 利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法 - Google Patents

利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，具体步骤包括：(1)构建含有两个同源臂5‑ARM和3‑ARM的乳腺生物反应器表达载体；(2)TALENs载体的构建；(3)CDVF阳性细胞克隆的制备及筛选；和(4)CDVF阳性细胞克隆的核移植，靶克隆阳性个体和目的蛋白表达鉴定。通过上述犬瘟热融合蛋白基因乳腺生物反应器表达载体的构建，并利用TALENs将犬瘟热融合蛋白基因定点敲入至奶山羊成纤维细胞β‑casein中，并通过体细胞核移植技术获得克隆胚，为犬瘟热重组疫苗的生产开辟的新的路径。

Description

利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗 的方法
技术领域
本发明涉及非人哺乳动物制备重组疫苗的领域，特别涉及一种利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白重组疫苗的方法，采用基因编辑技术TALENs结合乳腺生物反应器。
背景技术
犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起一种热性、急性和高度接触性传染病，其自然宿主涵盖了大部分的食肉目动物。本病主要侵害动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统，具有较高的发病率和致死率，其自然感染宿主已不断扩大到多种陆生和水生动物，呈世界性流行，目前无治疗本病的特效药物，疫苗接种是其唯一有效的防控措施。
犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)系副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员之一，由其引起的犬瘟热(Canine distemper,CD)是世界范围内广泛存在的一种急性、高度接触性传染病。该病的临床特征主要表现在双相热、眼鼻粘膜炎症、卡他性肺炎、神经症状及足垫角质化等，并且容易继发感染其他细菌、病毒，死亡率最高可达80％。其宿主包括犬科动物(犬、狐狸、豺、狼、貉)、鼬科动物(貂、黄鼬、白鼬)、浣熊科及猫科等多种动物。近年来，狮、虎等食肉目的8个科、偶蹄目猪科、灵长目猕猴属、鳍足目海豹科也相继出现犬瘟热自然发病的报道，宿主范围有扩大趋势，严重危害养犬业、经济动物养殖业、野生动物保护业等。该病的发病率及感染畜主范围都呈上升趋势。到目前为止该病几乎分布于所有养犬和经济动物的国家。
F基因位于CDV基因组的第四位，起止于4845-7049核苷酸，由2205个 核苷酸组成，F蛋白由662氨基酸残基组成，是CDV囊膜上的Ⅰ型糖蛋白，分子量为62KD，由通过二硫键连接成异种蛋白二聚体的F1和F2两个亚单位组成，其中F1蛋白位于囊膜的外侧，并且形成一个胰蛋白酶的特异酶切位点。F蛋白在CDV囊膜上呈纤突状，主要是协助CDV通过囊膜与细胞膜发生融合后穿过细胞膜侵染细胞，是感染性病毒粒子进入宿主细胞所必需的，并且可能介导病毒感染。F蛋白诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生。在MV属成员中，MV、CDV和RPV有群特异性表位，主要在F蛋白上，F蛋白存在高度的表位同源性，是异型免疫的主要交叉抗原。F蛋白上存在犬抗原提呈细胞最优先识别的辅助性T淋巴细胞表位，可诱导动物机体引起免疫反应，能阻止病毒在细胞内复制复制，从而抑制病毒感染，可用于研制基因工程亚单位疫苗。Sheshberadaran等人证明虽然抗CDV F蛋白的10个单抗均不能中和病毒，但采用亲和层析纯化的F蛋白免疫犬能得到有效保护。此外，F蛋白存在高度的表位同源性，是异型免疫的主要交叉保护抗原。F蛋白上存在着两个重要的辅助性T淋巴细胞表位，其中一个存在于F1的N末端序列上，这个辅助性T细胞表位可能是犬抗原提呈细胞(APCs)最优先识别和提呈的位点，因此，F蛋白对诱导CDV保护性免疫应答具有一定的意义。
通过转基因动物生产蛋白药物已成为现实，传统转基因产品主要是由原核或低等真核生物制备的，原核生物因为不能进行翻译后加工和修饰，所以生产的多数蛋白没有生物活性且不稳定，因此外源基因在转基因动物体内较为理想的表达部位就是乳腺。动物乳腺生物反应器是利用转基因技术获得药物蛋白的动物个体表达系统，其利用乳腺特异性调控元件指导外源基因在乳腺中特异地表达，以转基因动物的乳腺组织生产药用重组蛋白。其基本原理是应用DNA重组技术和转基因技术，将目的基因转移至尚处于原核阶段的受精卵或1-2细胞期的动物胚胎中，经胚胎移植，得到转基因乳腺表达个体，通 过收集乳汁来获得目的基因表达产物。只要获得外源基因整合且稳定表达的转基因个体，就可以通过扩繁获得大量的转基因后代，基本上能满足大规模生产目的蛋白的需求。动物乳腺生物反应器是目前研究最多、应用最为广泛的动物生物反应器，备受各国科学家的关注。乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛、优势明显。首先，动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性；其次，动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序，因此，目的蛋白易分离提纯，成本低廉、部分外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克甚至几十克，产量高，少量转基因大家畜的产量即可满足全世界药用市场的需求。本发明通过基因编辑技术TALENs结合乳腺生物反应器载体生产犬瘟热重组疫苗，并通过体细胞核移植技术移植到同期发情的受体母山羊体内，开辟了安全、可靠、适合推广的生产犬瘟热重组疫苗的新途径。
发明内容
本发明的目的在于利用基因编辑技术TALENs结合山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组蛋白，为生产犬瘟热重组疫苗建立了安全、可靠、适合推广的新方法，对防止犬瘟热具有重要的现实意义。
本发明采用高效基因打靶技术--类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nuclease,TALEN)，在山羊β-casein定点敲入犬瘟热F基因，从而建立重组犬瘟热疫苗奶山羊乳腺生物反应器。
本发明首先根据奶山羊β-casein基因组设计一对同源臂5-ARM和3-ARM，并连接至载体pLexible-DT，构建5-ARM-pLexible-DT-3-ARM，从pVax-rCDV全基因的质粒中扩增出带有His标签的犬瘟热F基因，然后以此为模版扩增带有酶切位点和信号肽的犬瘟热F基因SP-CDVF，为了转录的终止，通过重叠 PCR在SP-CDVF后添加了一段终止序列bGH-PolyA，将SP-CDVF-bGH-ployA基因插入至5-ARM之后，构建5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM打靶载体。针对奶山羊β-casein基因第2号外显子序列设计一对TALENs，采用GoldenGate试剂盒进行组装。分离奶山羊胎儿成纤维细胞，待细胞长至90％密度时，将TALENs和打靶载体5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM同时电转染，后期采用puro进行药物筛选，重而获得CDVF敲入阳性细胞克隆。通过体细胞核移植技术将CDVF敲入阳性细胞移植到去核卵母细胞中，获得克隆胚胎；通过输卵管移植将胚胎移植到同期发情的受体母羊输卵管中，自然妊娠获得打靶克隆羊，利用PCR测序对打靶克隆羊阳性个体进行鉴定。待成熟期，取羊奶，鉴定是目的蛋白表达及活性。
本发明是通过以下措施实现的：
(1)构建含有两个同源臂5-ARM和3-ARM的乳腺生物反应器表达载体
a、根据NCBI(AY834229、LN590815)公布的奶山羊β-casein基因组序列，设计2对特异性引物，分别扩增5-ARM和3-ARM基因序列，引物序列如下：
5-arm-Fwd:5’-CCTGACTTCCTCCTGGGTCCATATG-3’，
5-arm-Rev:5’-GGCTCTCGATTCCTGTGAATGGG-3’，
3-arm-Fwd:5’-GCAAGAGAGGTAAATACAGAAAAAAATG-3’，
3-arm-Rev:5’-CCGGACAGGACCAAGTACAGGCT-3’。
在上游引物5-arm-Fwd的5’端引入Cla I限制性内切酶位点序列，在下游引物5-arm-Rev的5’端引入Pme I-Mlu I-BstB I限制性内切酶位点；在上游引物3-arm-Fwd的5’端引入Not I限制性内切酶位点序列，在下游引物3-arm-Rev的5’端引入Not I限制性内切酶位点；分别扩增5-ARM和3-ARM，并连至载体pLexible-DT，构建5-ARM-pLexible-DT-3-ARM载体，通过酶切和测序进行鉴定。测序引物序列如下(下划线为酶切位点)：
β-casein-5-ARM-Cla1-Fwd：
5’-CCCATCGATCCATCCAACACACATCTCAGCATGA-3’；
β-casein-5-ARM-Pme1-Mlu1-BstB1-Rev：
5’-CTTTGTTTAAACGCATACGCGTAGGCTTCGAAGGCTCTCGATTCCTGTGAATGGG-3’；
β-casein-3-ARM-Not1-Fwd：
5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCAAGAGAGGTAAATACAGAAAAAAATG-3’；
β-casein-3-ARM-Not1-Rev：
5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCCGGACAGGACCAAGTACAGGCT-3’；
b、设计特异性引物对从pVax-rCDV质粒扩增出CDVF基因PCR产物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该特异性引物对序列如下：
CDV-F-Fwd:5’-GTGGCTCTGGCTCTGGCTCATCATCATCATCATCACCACAAGGAAATCCCCAAAAGCT-3’，
CDV-F-Rev:5’-ATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCAGAGTGATCTCACATAGGATT-3’；
c、将扩增的PCR产物进行胶回收得包含SEQ ID NO:1的基因片段，并设计带有酶切位点和信号肽的特异性引物对扩增SP-CDVF，该特异性引物对序列如下：
bGH-polyA-Fwd:5’-CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC-3’，
bGH-polyA-Pme1-Rev:5’-AGCTTTGTTTAAACCCATAGAGCCCACCGCATCCC-3’，
CDV-F-Mlu1-Fwd:5’-CAGTACGCGTATGAAGGTCCTGATCCTCGCCTGCCTCGTGGCTCTGGCTCT GGCTCATC-3’，
CDV-F-Rev:5’-ATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCAGAGTGATC TCACATAGGATT-3’。
为了转录的终止通过重叠PCR在SP-CDVF后加了一段bGH-ployA的序列，扩增PCR产物SP-CDVF-bGH-ployA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。将SP-CDVF-bGH-ployA连接至5-ARM后面，从而构建获得山羊乳腺生物反应器表达载体5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM，并通过酶切和测序进行鉴定。
(2)TALENs载体的构建
a、针对奶山羊β-casein基因第2号外显子序列设计一对TALEN靶位点，如下所示。
b、奶山羊β-casein位点特异性TALEN L/R载体的构建，采用本实验改造的GoldenGate TALEN体系。
(3)CDVF阳性细胞克隆的制备及筛选
分离奶山羊胎儿成纤维细胞并用高糖培养基于培养皿中培养，待细胞状态良好、密度达90％时，将TALENs和打靶载体5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM共转染至山羊胎儿成纤维细胞，采用puro药物筛选，最终获得CDVF敲入阳性细胞克隆。
(4)CDVF阳性细胞克隆的核移植，靶克隆阳性个体和目的蛋白表达鉴定
通过体细胞核移植技术，将CDVF敲入阳性细胞移植到山羊去核卵母细胞中，获得克隆胚胎；获得克隆胚后，通过输卵管移植将胚胎移植到同期发情的受体母羊输卵管中，自然妊娠获得打靶克隆羊，利用PCR测序对打靶克隆羊阳性个体进行鉴定。待成熟期，取羊奶，鉴定是目的蛋白表达及活性。
进一步地，步骤(1)a、中5-arm和3-arm PCR反应体系各50μL：上、下游引物各1μL，dNTP Mix 4μL，奶山羊基因组5μL，Long PCR Enzyme Mix酶0.5μL，10×Long PCR Bufferwith 15mM MgCl2 5μL，灭菌去离子水补足至50μL。反应条件：95℃预变性7min；95℃变性10s，68℃退火30s(-0.6℃/Cycle)，72℃1Kb/1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳。验证正确后，以此PCR产物为模版，扩增a中5-ARM和3-ARM PCR反应体系各100μL，上、下游引物各2μL，dNTP Mix 8μL，5-arm和3-arm各3μL，Long PCR EnzymeMix酶1μL，10×Long PCR Buffer with 15mM MgCl210μL，灭菌去离子水补足至100μL。反应条件：95℃预变性7min；95℃变性10s，68℃退火30s(-0.6℃/Cycle)，72℃1Kb/1min，35个循环；72℃延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，酶切并测序鉴定。
进一步地，步骤(1)b、中PCR反应体系100μL：上下游引物各2μL，2×Primer starmixs 50μL，pvax-rCDV模版2μL，加灭菌去离子水补足至100μL。PCR反应条件：95℃3min，{98℃10s，68℃30s，68℃2.5min}，35cycles，72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳回收。
进一步地，步骤(1)c、中PCR反应体系100μL：上下游引物各2μL，2×Primer starmixs 50μL，CDVF模版2μL，加灭菌去离子水补足至100μL。PCR反应条件：95℃3min，{98℃10s，68℃30s，68℃2.5min}，35cycles，72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳回收。bGH-polyA的PCR反应体系100μL：上下游引物各2μL，2×Primer star mixs 50μL，5-ARM-pLexibleDT模版2μL，加灭菌去离子水补足至100μL，PCR反应条件：95℃3min，{98℃10s，68℃30s，68℃0.5min}，20cycles，72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳回收。SP-CDVF-bGH-ployA的PCR反应体系100μL：上下游引物各2μL，2×Primer star mixs 50μL，bGH-polyA/SP-CDVF各2μL，加灭菌去离子水补足至100μL，PCR反应条件：95℃3min，{98℃10s，68℃30s，68℃2.5min}，5cycles， 72℃5min，此程序中不加上下游引物，跑完5个循环之后，加上下游引物继续PCR，95℃3min，{98℃10s，68℃30s，68℃2.5min}，35cycles，72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳回收。
进一步地，采用实验室改造的Golden Gate TALEN体系，构建TALEN/L和TALEN/R的具体步骤为：
①根据设计的TALEN靶位点序列，将第1-10碱基对应的RVD模块和pFUS-A依次加入A管中，第11-(N-1)碱基个RVD模块和pFUS-B(N-1)依次加入B管中，连接反应体系20μL：10×T4DNA ligase buffer 2μL，BsaI 1μL，T4DNA ligase 1μL，Each RVD module vector150ng，pFUS-A/pFUS-B 150ng，加灭菌去离子水补足至20μL。连接反应条件：37℃15min，(37℃5min，16℃10min)×15Cycle，16℃15min，37℃15min，50℃10min，80℃5min。
②连接反应结束后，向每个体系中加入1μL Plasmid-Safe nuclease和1μL 10mMATP，37℃消化1小时，目的是将酶切连接反应中未连接成功或未连接完整的线性化DNA片段消化掉，连接产物转化Top10感受态，之后利用Spe/IPTG/X-gal培养皿培养12小时，37℃细菌恒温培养箱培养过夜。
③第二天待培养板出现蓝白菌斑时，每个板分别挑取2-3个白斑至Spectinomycin抗性的LB培养基中，12小时后提取质粒利用PCR进行鉴定。PCR扩增体系为20μL：上下游引物各1μL，2×Premix Ex Taq 10μL，质粒1～10ng，加灭菌去离子水补足至20μL。PCR反应条件：95℃5min，(98℃10s，55℃30s，72℃1.75min)×30Cycles，72℃7min。PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物序列如下：
pCR8-Fwd:5’-ttgatgcctggcagttccct-3’，
pCR8-Rev:5’-cgaaccgaacaggcttatgt-3’
④将PCR鉴定正确的质粒进行下一步连接反应，连接体系为20μL：pTALEN-L/R150ng，pFUS-A 150ng，pFUS-B 150ng，pLR-RVD 150ng，10×T4DNA ligase buffer 2μL，BsmBI 1μL，T4DNA ligase 1μL，加灭菌去离子水补足至20μL。连接反应条件37℃5min，{37℃5min，16℃10min}×10Cycle，16℃15min，80℃5min。⑤反应结束后将PCR产物转化Top10感受态、涂板(AMP、IPTG和X-gal筛选)，37℃细菌恒温培养箱内培养过夜。⑥第四天待培养板出现蓝白斑菌落，每个板分别挑取3个白斑至AMP抗性的LB培养基中，培养12小时后提取质粒并酶切鉴定，酶切反应体系10μL：质粒200ng，10×FastDigest Green Buffer 1μL，BamHI和ClaI各0.5μL，加灭菌去离子水补足至10μL。酶切反应条件：37℃0.5h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳验证。⑦将酶切鉴定正确的质粒送至生物技术有限公司进行测序，双向测序。测序引物序列如下：
TAL-Fwd:5’-TTGGCGTCGGCAAACAGTGG-3’
TAL-Rev:5’-GGCGACGAGGTGGTCGTTGG-3’
将测序正确的TALEN L/R质粒转化至Top10感受态细胞中，次日挑菌进行大摇，并大提质粒，大量提取后，用无水乙醇沉淀的TALEN L/R质粒。首先，加入50μg TALEN L/R质粒，然后加入3倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠(PH＝5.2)，充分混匀后，放置于-80℃冰箱过夜。第二日，将离心管于4℃，12000rpm离心15min。然后加入500μL 75％冰乙醇，清洗两次。最后，在无菌条件下，加入超纯水溶解DNA，测量浓度后即可用于转染。
进一步地，CDV F阳性细胞克隆的筛选步骤为：首先对胎儿成纤维细胞进行性别鉴定，根据NCBI上检索得到山羊SRY基因全序列，运用Primer5引物设计软件设计引物:SRYF，SRYR，预期产物为337bp。根据β-casein基因序列设计设计合成1对内标引物:BLGF，BLGR，预期产物为498bp。引物序列如下：
SRY-Fwd：5’-GAACGAAGACGAAAGGTGGC-3’
SRY-Rev：5’-GGGACTGTGAGCGGCATAAT-3’
BLG-Fwd：5’-CACTTGTTCGCCTAAATCCG-3’
BLG-Rev：5’-AGCCTCACTGTCAACTCTGC-3’
奶山羊胎儿成纤维细胞性别鉴定PCR反应体系25μL：两对上下游引物各1μL，2×ExTaq Primer mixs 12μL，胎儿基因组DNA 1μL，加无菌去离子水补足至25μL。PCR反应条件：95℃5min，{98℃10s，57℃30s，72℃30s}，35cycles，72℃5min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。准备奶山羊胎儿成纤维细胞，待细胞生长至90％汇合度，准备电转。用0.25％胰酶将细胞消化至15mL离心管中，1200rmp离心5min，弃上清，PBS漂洗一次，弃上清。用200μLBuffer R重悬细胞，加5μg TALEN L，5μg TALEN R，5μg5-ARM-SP-CDVF-Bgh-ployA-plexible-DT-3-ARM质粒。在电击座中加入3mL Buffer E并转移到电转仪中，按照说明书的操作步骤对细胞进行电击，电转参数为1350V，30ms，1次。将电击过的细胞迅速转移至预热培养液的10cm培养皿中，前后摇晃均匀放入37℃培养箱培养。细胞电转染24小时后，按照1:10的比例对细胞进行传代，分至10个10cm培养皿中，同时培养液中加入puro(100ng/mL)进行药物筛选，每隔两天换一次液，筛选16天左右出现克隆。
本实验采用克隆环胰酶消化法，将单克隆细胞挑取至24孔板内，待细胞长满后利用NP40裂解液消化部分细胞用于PCR鉴定，每个克隆PCR扩增50μL直接送至生物科技有限公司进行测序，剩余细胞继续传至24孔板以备后续实验。分别设计了5-ARM和CDVF目的基因鉴定引物，引物序列分别如下：
β-casein-5-ARM-鉴定Fwd：5’-CCTGACTTCCTCCTGGGTCCATATG-3’
β-casein-5-ARM-鉴定Rev:5’-CAGAGCCAGAGCCACGAGGCA-3’
CDVF-KI-Fwd:5’-CCTGACTTCCTCCTGGGTCCATATG-3’
CDVF-KI-Rev:5’-GGCTTCACATTCTTGGTCATTAGAG-3’
附图说明
图1：根据设计的特异性引物，从奶山羊基因组中扩增的同源臂3-arm和5-arm的PCR结果图，其中1、2为3-arm，3、4、5、6为5-arm，M为DL15000DNA标准Marker。
图2：根据设计的带有酶切位点的特异性引物，以3-arm和5-arm为模板，扩增的同源臂3-ARM和5-ARM的PCR结果图，其中1、2、3、4、5为3-ARM，6、7、8、9、10为5-ARM，M为DL15000DNA标准Marker。
图3：5-ARM-Plexible-DT载体构建结果，将构建好的5-ARM-Plexible-DT载体用Mlu1和Afl2酶切验证，并测序鉴定，其中1、3为正确的连接结果，2、4为空质粒，M为DL15000DNA标准Marker。
图4、图5：5-ARM-Plexible-DT-3-ARM质粒载体酶切鉴定图，其中1为Hind3、Sal1酶切结果，2为Not1酶切结果，M为DL15000DNA标准Marker。
图6：bGH-ployA PCR结果图，其中1、2为bGH-ployA，M为DL2000DNA标准Marker。
图7：CDVF、SP-CDVF和SP-CDVF-bGH-ployA的PCR结果，其中1为CDVF，2、3为SP-CDVF，4为SP-CDVF-bGH-ployA，M1和M2为DL2000DNA标准Marker，M3为DL15000DNA标准Marker。
图8：5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-Plexible-DT-3-ARM载体的构建结果，其中1为正确的质粒，M1为DL2000DNA标准Marker，M2为DL15000DNA标准Marker。
图9：5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-Plexible-DT-3-ARM载体的线性化结果图，其中1为5-ARM-SP-CDVF-polyA-pLexible-DT-3-ARM质粒，M为 DL15000DNA标准Marker。
图10：位点特异性TALEN构建pFUS载体PCR结果图，根据设计的TALEN靶位点序列，将对应的RVD模块进行酶切连接反应，反应结束后转化到SIX平板，进行蓝白班筛选，挑菌做菌落PCR。鉴定正确的进行摇菌，提质粒。其中1为β-casein-TALEN-LA PCR产物；2为β-casein-TALEN-RA PCR产物；3为β-casein-TALEN-LB PCR产物；4为β-casein-TALEN-RB PCR产物；M为DL2000DNA标准Marker。
图11：位点特异性TALEN构建pTAL载体PCR结果图，将上一步中鉴定正确的菌落摇菌，提质粒，并进行酶切连接反应，连接后转化到AIX平板，次日进行蓝白班筛选，做菌落PCR，并将鉴定正确的提质粒酶切，然后送测序。其中1、2为β-casein-TALEN-L PCR产物，3、4为β-casein-TALEN-R PCR产物，M为DL15000DNA标准Marker。
图12：位点特异性TALEN ClaI+BamHI酶切鉴定结果，其中1、2为TALEN-L酶切产物，3、4为TALEN-R酶切产物，5为TALEN-L质粒，6为TALEN-R质粒，M为DL15000DNA标准Marker。
图13：奶山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果图，其中1为羊胎儿1-1，2为羊胎儿1-2，3为羊胎儿2-1，4为羊胎儿2-2，5为胎儿胎盘，6为空白对照(水)，M为DL2000DNA标准Marker。1-1、1-2、2-1为雄性胎儿，2-2为雌性胎儿。
图14：奶山羊成纤维细胞培养液筛选12天后，显微镜下观察出现单克隆细胞。
图15、16、17、18：挑选的70个细胞克隆的鉴定结果图，是从5-ARM进行敲入鉴定，其中有17个阳性克隆，分别是1、4、5、6、9、11、12、15、19、23、25、27、34、36、46、69、70，M为DL15000DNA标准Marker。
图19：部分阳性克隆的CDVF敲入鉴定结果图，M为DL15000DNA标准Marker。
图20：打靶载体构建图。
图21：克隆羊乳腺产乳中CDVF蛋白western-blot检测，M为116kDa蛋白Marker，为约74kDa特异性目的条带。
具体实施例方式：
一种利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，包括以下具体实施步骤：
1.同源臂5-ARM和3-ARM的PCR扩增
1.1根据NCBI中山羊β-casein的基因序列设计引物，扩增5-arm和3-arm，然后以此为模版，重新设计带有酶切位点的引物扩增5-ARM和3-ARM，并连至载体pLexible-DT。通过酶切与测序鉴定，结果与预期相符。PCR和酶切图如图3。
1.2根据CDVF全基因的序列设计引物，并添加了His标签，扩增CDVF基因，PCR结果如图。以此PCR产物为模板，重新设计引物，添加酶切位点以及信号肽序列，扩增SP-CDVF基因，为了转录的终止，添加了一段bGH-ployA序列，通过重叠PCR进行扩增。结果如图7。
2.TALENs载体的构建
采用Golden Gate试剂盒进行TALEN L和TALEN R的组装，通过一系列的酶切连接反应完成。结果如图11、12。
3.CDVF敲入阳性细胞克隆的筛选
将TALEN L，TALEN R，5-ARM-SP-CDVF/CDVH-plexible-DT-3-ARM按照1：1：1比例电转染至羊胎儿成纤维细胞，电转染24小时后，按照1:10的比例对细胞进行传代，同时培养液中加入puro进行药物筛选，利用PCR对打靶位点进行克隆，测序，鉴定正确的打靶克隆。
4.CDVF敲入阳性细胞克隆的核移植。通过体细胞核移植技术将CDVF敲入阳性细胞移植到去核卵母细胞中，获得克隆胚胎；获得克隆胚后，通过 输卵管移植将胚胎移植到同期发情的受体母羊输卵管中，自然妊娠获得打靶克隆羊。
5.受孕母羊自然分娩后，取羊羔耳标提取基因组RNA，并以CDVF特异性引物检测，获得目的条带，验证为阳性个体。克隆羊羔性成熟，体重达到成年母羊体重70％后人工受精配种后，经孕期进入哺乳期。以CDVF单克隆抗体对所产乳汁进行western-blot检测，获得大小约为74kDa的特异性蛋白条带，如图21所示。
有益效果
(1)本研究选用的TALENs基因编辑技术具有很高的打靶效率，且不容易出现脱靶现象，设计简单，易于实施。
(2)动物乳腺生物反应器是目前研究最多、应用最为广泛的动物生物反应器，备受各国科学家的关注。动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性；动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序，因此，目的蛋白易分离提纯，成本低廉、部分外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克甚至几十克，产量高，少量转基因大家畜的产量即可满足全世界药用市场的需求。
(3)将获得的乳腺生物反应器载体以及TALENs共同电转染至奶山羊胎儿成纤维细胞，对CDVF敲入阳性克隆进行筛选。
(4)通过体细胞核移植技术在大动物上进行核移植，将CDVF敲入阳性克隆移植到健康的同期发情的供体母羊中，获得转基因敲入羊，为CDVF重组疫苗的生产奠定基础。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改， 以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

Claims (5)

1.一种利用山羊乳腺生物反应器制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，具体步骤包括：(1)构建含有两个同源臂5-ARM和3-ARM的乳腺生物反应器表达载体；(2)TALENs载体的构建；(3)CDVF阳性细胞克隆的制备及筛选；和(4)CDVF阳性细胞克隆的核移植，靶克隆阳性个体和目的蛋白表达鉴定。
2.根据权利要求1所述的制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，其特征在于所述构建含有两个同源臂5-ARM和3-ARM的乳腺生物反应器表达载体的具体步骤为：
a、根据NCBI(AY834229、LN590815)公布的奶山羊β-casein基因组序列，设计2对特异性引物，分别扩增5-ARM和3-ARM基因序列，引物序列如下：
5-arm-Fwd:5’-CCTGACTTCCTCCTGGGTCCATATG-3’，
5-arm-Rev:5’-GGCTCTCGATTCCTGTGAATGGG-3’，
3-arm-Fwd:5’-GCAAGAGAGGTAAATACAGAAAAAAATG-3’，
3-arm-Rev:5’-CCGGACAGGACCAAGTACAGGCT-3’；
在上游引物5-arm-Fwd的5’端引入Cla I限制性内切酶位点序列，在下游引物5-arm-Rev的5’端引入Pme I-Mlu I-BstB I限制性内切酶位点；在上游引物3-arm-Fwd的5’端引入Not I限制性内切酶位点序列，在下游引物3-arm-Rev的5’端引入Not I限制性内切酶位点；分别扩增5-ARM和3-ARM，并连至载体pLexible-DT，构建5-ARM-pLexible-DT-3-ARM载体，通过酶切和测序进行鉴定；
b、设计特异性引物对从pVax-rCDV质粒扩增出CDVF基因PCR产物，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，该特异性引物对序列如下：
CDV-F-Fwd:5’-GTGGCTCTGGCTCTGGCTCATCATCATCATCATCACCACAAGGAAATCCCCAAAAGCT-3’，
CDV-F-Rev:5’-ATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCAGAGTGATC TCACATAGGATT-3’；
c、将扩增的PCR产物进行胶回收得包含SEQ ID NO:1的基因片段，并设计带有酶切位点和信号肽的特异性引物对扩增SP-CDVF，并通过重叠PCR在SP-CDVF后加了一段bGH-ployA的序列，扩增PCR产物SP-CDVF-bGH-ployA SEQ ID NO:2，将SP-CDVF-bGH-ployA连接至5-ARM后面，构建获得山羊乳腺生物反应器表达载体5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，其特征在于所述TALENs载体的构建的具体步骤为：①根据设计的TALEN靶位点序列，将第1-10碱基对应的RVD模块和pFUS-A依次加入A管中，第11-(N-1)碱基个RVD模块和pFUS-B(N-1)依次加入B管中，连接反应体系20μL：10×T4DNA ligase buffer 2μL，BsaI 1μL，T4DNA ligase 1μL，Each RVD module vector 150ng，pFUS-A/pFUS-B 150ng，加灭菌去离子水补足至20μL；连接反应条件：37℃ 15min，(37℃ 5min，16℃ 10min)×15Cycle，16℃ 15min，37℃15min，50℃ 10min，80℃ 5min；
②连接反应结束后，向每个体系中加入1μL Plasmid-Safe nuclease和1μL 10mM ATP，37℃消化1小时，目的是将酶切连接反应中未连接成功或未连接完整的线性化DNA片段消化掉，连接产物转化Top10感受态，之后利用Spe/IPTG/X-gal培养皿培养12小时，37℃细菌恒温培养箱培养过夜；
③第二天待培养板出现蓝白菌斑时，每个板分别挑取2-3个白斑至Spectinomycin抗性的LB培养基中，12小时后提取质粒利用PCR进行鉴定。PCR扩增体系为20μL：上下游引物各1μL，2×Premix Ex Taq 10μL，质粒1～10ng，加灭菌去离子水补足至20μL。PCR反应条件：95℃5min，(98 ℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1.75min)×30Cycles，72℃ 7min，PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定；
④将PCR鉴定正确的质粒进行下一步连接反应，连接体系为20μL：pTALEN-L/R 150ng，pFUS-A 150ng，pFUS-B 150ng，pLR-RVD 150ng，10×T4DNA ligase buffer 2μL，BsmBI 1μL，T4DNA ligase 1μL，加灭菌去离子水补足至20μL。连接反应条件37℃ 5min，{37℃ 5min，16℃ 10min}×10Cycle，16℃ 15min，80℃ 5min；
⑤反应结束后将PCR产物转化Top10感受态、涂板(AMP、IPTG和X-gal筛选)，37℃细菌恒温培养箱内培养过夜；
⑥第四天待培养板出现蓝白斑菌落，每个板分别挑取3个白斑至AMP抗性的LB培养基中，培养12小时后提取质粒并酶切鉴定，酶切反应体系10μL：质粒200ng，10×FastDigestGreen Buffer 1μL，BamHI和ClaI各0.5μL，加灭菌去离子水补足至10μL；酶切反应条件：37℃ 0.5h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳验证；
⑦将酶切鉴定正确的质粒双向测序鉴定，将测序正确的TALEN L/R质粒转化至Top10感受态细胞中，提取TALEN L/R质粒备用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，其特征在于所述CDVF阳性细胞克隆的制备及筛选步骤为：分离奶山羊胎儿成纤维细胞并用高糖培养基于培养皿中培养，待细胞状态良好、密度达90％时，将TALENs和打靶载体5-ARM-SP-CDVF-bGH-ployA-pLexible-DT-3-ARM共转染至山羊胎儿成纤维细胞，采用puro药物筛选，最终获得CDVF敲入阳性细胞克隆。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备犬瘟热融合蛋白基因重组疫苗的方法，其特征在于所述CDVF阳性细胞克隆的核移植，靶克隆阳性个体和目的蛋白表达鉴定的具体步骤为：通过体细胞核移植技术，将CDVF敲入阳性细胞移 植到山羊去核卵母细胞中，获得克隆胚胎；获得克隆胚后，通过输卵管移植将胚胎移植到同期发情的受体母羊输卵管中，自然妊娠获得打靶克隆羊，利用PCR测序对打靶克隆羊阳性个体进行鉴定，产乳后对乳汁内CDVF蛋白检测获得约为74kDa目的蛋白条带，说明F蛋白已在乳腺中表达并分泌至乳汁中。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944645A (zh) * 2006-10-17 2007-04-11 青岛森淼生物技术研究所 利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法
CN100342020C (zh) * 2000-05-22 2007-10-10 上海杰隆生物工程股份有限公司 一种大片段dna制备乳腺生物反应器新方法
CN101265483A (zh) * 2008-04-25 2008-09-17 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 乳腺特异性表达载体及其构建方法
CN100503832C (zh) * 2004-10-11 2009-06-24 中国人民解放军第四军医大学 关中奶山羊酪蛋白基因启动子表达载体
CN103266122A (zh) * 2013-05-31 2013-08-28 云南农业大学 一种利用talen技术的高效定点转基因方法
CN103555759A (zh) * 2013-07-05 2014-02-05 兰诺生物技术无锡有限公司 利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法
US20140087426A1 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (talens)
CN104293833A (zh) * 2014-10-09 2015-01-21 西北农林科技大学 一种基于TALEN 介导的Sp110 巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞
CN104497146A (zh) * 2014-12-01 2015-04-08 广州古藤兰生物科技有限公司 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用
CN104862318A (zh) * 2014-02-25 2015-08-26 南京杰蒙生物技术有限公司 利用转基因动物乳腺生物反应器生产单克隆抗体的方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100342020C (zh) * 2000-05-22 2007-10-10 上海杰隆生物工程股份有限公司 一种大片段dna制备乳腺生物反应器新方法
CN100503832C (zh) * 2004-10-11 2009-06-24 中国人民解放军第四军医大学 关中奶山羊酪蛋白基因启动子表达载体
CN1944645A (zh) * 2006-10-17 2007-04-11 青岛森淼生物技术研究所 利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法
CN101265483A (zh) * 2008-04-25 2008-09-17 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 乳腺特异性表达载体及其构建方法
US20140087426A1 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (talens)
CN103266122A (zh) * 2013-05-31 2013-08-28 云南农业大学 一种利用talen技术的高效定点转基因方法
CN103555759A (zh) * 2013-07-05 2014-02-05 兰诺生物技术无锡有限公司 利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法
CN104862318A (zh) * 2014-02-25 2015-08-26 南京杰蒙生物技术有限公司 利用转基因动物乳腺生物反应器生产单克隆抗体的方法
CN104293833A (zh) * 2014-10-09 2015-01-21 西北农林科技大学 一种基于TALEN 介导的Sp110 巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞
CN104497146A (zh) * 2014-12-01 2015-04-08 广州古藤兰生物科技有限公司 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENCHEN CUI ET AL.: "Gene targeting by TALEN-induced homologous recombination in goats directs production of β-lactoglobulin-free, high-human lactoferrin milk", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
徐莎琼，等: "犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定", 《上海交通大学学报（农业科学版）》 *
靳玉珠，等: "TALEN靶向基因修饰新技术研究进展", 《广东农业科学》 *

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