CN116875613B - 一种人源化h2-d基因敲入小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人源化H2‑D基因敲入小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：根据HLA‑B*1301基因的外显子2‑3构建同源重组载体。根据鼠H2‑D基因的外显子2‑3构建sgRNA载体并转录为可注射的sgRNA。将Cas9mRNA、同源重组载体和可注射的sgRNA显微注射到小鼠的受精卵中，获得具有活性的受精卵。将受精卵移植到受体鼠内，繁殖获得阳性F0代乳鼠。将F0代乳鼠与野生型小鼠交配，繁殖获得人源化H2‑D基因敲入小鼠模型。本发明构建的小鼠模型能有效表达人鼠嵌合的MHC‑Ⅰ，对HLA‑B*1301限制性表位多肽有强烈的CTL反应，为HLA‑I相关超敏免疫反应疾病研究及药物筛选提供了坚实的技术基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程动物模型领域，具体涉及一种人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
目前已发现多种药物超敏反应与人类的HLA等位基因相关，其中HLA-B*1301与三氯乙烯、氨苯砜、磺胺类抗菌药引起的超敏反应综合征高度相关。HLA-B编码人的I类主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex I, MHC-I）的α链。MHC-I由α链及β链（由B2M基因编码）组成，α链包含负责抗原肽结合的可变区α1、α2 和序列恒定的α3及跨膜、胞内区。MHC-I表达于所有的有核细胞表面，负责抗原提呈，参与CD8+T细胞成熟及CTL识别过程。
为了研究HLA与疾病相关的致病机制，需要构建相应的转基因鼠模型。研究发现，鼠源的MHC-I分子（H2-D/H2-K/H2-L）的存在会抑制转入的人源HLA-I分子的表达和功能，使其抗原递呈功能降低。研究还发现，α3与T淋巴细胞表面的CD8分子的相互作用具有种属特异性，全人源化的HLA-I转基因小鼠CD8+T细胞成熟受损，不具有正确的HLA-I限制性CTL识别，影响小鼠正常的免疫学功能。
发明内容
为了解决上述的技术问题，实现在小鼠体内高效递呈HLA-B*1301结合的抗原肽，并且能够准确地进行HLA-B*1301限制性CTL识别，本发明提供一种利用人HLA-B*13:01分子可变区α1、α2 原位替换鼠H2-D分子α1、α2 区进行人源化改造的方法。该方法构建的小鼠表达人鼠嵌合的MHC-I分子，其抗原肽结合区α1、α2 为人HLA-B*13:01编码，α3及跨膜、胞内区为鼠源H2-D编码。
第一方面，本发明提供一种人源H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：
步骤1，根据鼠H2-D基因的外显子2和外显子3，设计CRISPR/Cas9系统的sgRNA，构建sgRNA载体，然后将所述sgRNA转录为可注射的sgRNA。
步骤2，根据将鼠H2-D基因的外显子2和外显子3替换为人源HLA-B*1301基因的外显子2和外显子3的目的，设计插入目标序列（SEQ ID NO:1），然后构建含有所述插入目标序列的同源重组载体。
步骤3，将Cas9mRNA、所述同源重组载体和所述可注射的sgRNA显微注射到小鼠的受精卵中，经过培养、观察获得具有活性的受精卵。
步骤4，将所述具有活性的受精卵移植到受体鼠内，经过繁殖获得F0代乳鼠，对所述F0代乳鼠进行基因型鉴定获得阳性F0代乳鼠。
步骤5，将所述F0代乳鼠与野生型小鼠交配，经过繁殖获得F1代小鼠，对所述F1代小鼠进行基因型鉴定，获得所述人源化H2-D基因敲入小鼠模型。
其中，人源化H2-D基因敲入小鼠的基因中包含SEQ ID NO:1所示的序列。
在本发明的一个实施方式中，步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，将sgRNA表达载体酶切线性化处理，然后再将合成的所述5S1和所述3S1单链退火复性后插入sgRNA表达载体；
步骤1-2，在体外进行所述sgRNA表达载体的转录，获得的转录产物为所述可注射的sgRNA。
优选地，sgRNA包括根据鼠H2-D基因外显子2设计的5S1和括根据鼠H2-D基因外显子3设计的3S1；
5S1的序列包含GTACCGGGGCTCCTCGAGGC（SEQ ID NO:4），5S1对应的PAM为CGG；
3S1的序列包含CGACGCAAGTGGGAGCAGAG（SEQ ID NO:5），3S1对应的PAM为TGG。
优选地，步骤1-1中的sgRNA表达载体为pAIO-mCherry、pUC57-T7-gRNA或pX458，进一步优选为pUC57-T7-gRNA。
优选地，步骤1-1中的线性化酶为BSAⅠ。
在本发明的一个实施方式中，步骤2包括以下子步骤：
步骤2-1，合成HLA-B*1301基因的插入片段（SEQ ID NO:1）、左侧同源臂片段（SEQID NO:2）和右侧同源臂片段（SEQ ID NO:3）；
步骤2-2，利用SLIC克隆方法将重组同源臂及HLA-B*1301基因的插入片段顺序连接，构建所述同源重组载体。
优选地，在步骤2-2中，先将pBR322酶切线性化处理，电泳检测、切割回收后与所述插入片段、左侧同源臂片段和右侧同源臂片段重组连接，再将重组产物转化入DH5α感受态细胞，培养、提取后获得含有人源HLA-B*1301外显子2-3序列的同源重组载体。
优选地，pBR322采用EcoRⅠ进行酶切。
优选地，步骤3中的小鼠为C57小鼠。
在本发明的一个实施方式中，步骤4还包括对F0代小鼠测序的步骤。
优选地，步骤4中的受体鼠为ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后见栓的雌鼠。
在本发明的一个实施方式中，步骤5还包括对F1代小鼠测序的步骤。
优选地，步骤4和步骤5中基因型鉴定的PCR引物包括：
5'端的PCR引物F1：CTGTGGAGGATGTCCCTATTGGT（SEQ ID NO:6），R 1：ACATCCTCTGGATGATGTGAGACC（SEQ ID NO:7）；
3'端的PCR引物为F2：ACACAGACTTACCGAGAGAACCTGC（SEQ ID NO:8），R 2：TTAGCAGTCTCCTCTGGCACCTATG（SEQ ID NO:9）；
野生型的PCR引物为F3：ATTCCAGGAGCCAATCAGCGT（SEQ ID NO:10），R3：AAGCGCACGAACTCCTTGTTGT（SEQ ID NO:11）。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤4和步骤5中测序的PCR引物包括：
5'端产物的测序引物：
H2-D1-5tF1：CTGTGGAGGATGTCCCTATTGGT（SEQ ID NO:12），
HLA-B-tR1：AACCTCACGAACTGGGTGTCGT（SEQ ID nO:13），
H2-D1-5seqF1：TTTGGTGAGGAGGTCGGGGT（SEQ ID NO:14）。
3'端产物的测序引物：
H2-D1-3seqF1：GAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCC（SEQ ID NO:15），
H2-D1-3seqF2：AGGCGCGTTTACCCGGTTTCAT（SEQ ID NO:16）。
第二方面，本发明提供一种人源化H2-D基因敲入动物模型，所述动物模型根据第一方面所述构建方法获得。
优选地，所述动物为鼠类，更优选为小鼠，例如：C57小鼠，KM小鼠、ICR小鼠、NIH小鼠。
第三方面，本发明提供根据第一方面所述构建方法获得的小鼠模型的应用。
优选地，所述应用包括与HLA-I相关超敏免疫反应疾病的研究及相关药物的筛选。
优选地，所述小鼠模型（人源化H2-D基因敲入小鼠）的细胞表面HLA-B*1301分子表达量高于定点插入HLA-B*1301全长表达基因的转基因小鼠。
优选地，所述小鼠模型对HLA-B*1301限制性抗原肽的CTL反应能力强于定点插入HLA-B*1301全长表达基因的转基因小鼠。
进一步优选地，所述的定点插入位点为Rosa26或Hipp11，更优选为Hipp11。
进一步优选地，所述HLA-B*1301限制性抗原肽的表位多肽氨基酸序列包括SQFNWTIYL（SEQ ID NO:17），更优选为SQFNWTIYL（SEQ ID NO:18）。
本发明的有益效果：
采用本发明的方法构建的小鼠模型能够有效表达人鼠嵌合的MHC-Ⅰ，对HLA-B*1301限制性表位多肽具有强烈的CTL反应，为HLA-I相关超敏免疫反应疾病的研究及药物的筛选提供了坚实的技术基础。
附图说明
图1所示为本发明中小鼠模型构建方法示意图；
图2所示为本发明中F0代小鼠基因型鉴定示意图，其中箭头表示引物，①表示5'端PCR反应，F1和R1表示相应的上下游引物，②表示3'端PCR反应，F2和R2表示相应的上下游引物，③表示对野生型的PCR反应，F3和R3表示相应的上下游引物，方框表示测序区；
图3所示为本发明中F0代小鼠基因鉴定电泳图，其中泳道对应数字为小鼠编号，WT为C57BL/6JGpt 野生型，N 为negative 空白对照，M 为DNA Marker；
图4所示为本发明中F1代小鼠基因鉴定电泳图，其中泳道对应数字为小鼠编号，①表示5'端PCR反应，②表示3'端PCR反应，③表示对野生型的PCR反应。
图5所示为实施例2中小鼠HLA-B*1301蛋白的表达结果，其中A为westernblotting鉴定结果；B为HLA-B*1301蛋白表达量统计图，*P<0 .05，**P<0 .01；HLA-B13代表定点插入HLA-B*1301全长cDNA的转基因小鼠，H2-D代表本发明中人源化H2-D基因敲入小鼠，WT代表C57BL/6JGpt 野生型鼠。
图6所示为实施例2中小鼠对HLA-B*1301限制性表位的CTL反应结果；A为ELISPOT检测两种小鼠对HHV-6 LTP322-330的CTL反应，HLA-B13(n＝5) ，H2-D(n＝5)，多肽浓度1 μg/mL；B为ELISPOT点数统计柱状图，*P<0 .05，**P<0 .01。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
需要说明的是，本发明中采用的试剂及实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试剂和实验方法。
在长期研究HLA-I相关超敏免疫反应疾病的过程中，发明人发现缺乏有效的实验动物模型。经过大量的实验研究，发明人创造性地构建了人源化H2-D基因敲入小鼠模型。该模型的主要原理（见图1）如下：
人HLA-B基因的转录本HLA-B-249（ENST00000412585.7）包含8个exons，翻译起始位点ATG位于exon1，翻译终止位点TGA位于exon7，编码362aa。HLA-B分子的α1、α2区分别由HLA-B基因的外显子2、3编码。
鼠源H2-D1-202转录本(ENSMUST00000172785.7）包含8个exons，翻译起始位点ATG位于exon1，翻译终止位点TGA位于exon8，编码362aa。鼠H2-D分子的α1、α2区分别由该基因的外显子2、3编码。
将鼠H2-D基因的外显子2-3替换为人HLA-B*1301基因的外显子2-3，能够得到人鼠嵌合H2-D分子的小鼠模型。
实施例1 人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建。
1 制备可注射的sgRNA和Cas9-mRNA
1.1 设计sgRNA
根据鼠H2-D基因序列（NCBI:14964）和转录本序列（ENSMUST00000172785.7）信息，需要在外显子2和3中各设计1条sgRNA用于引导cas9蛋白精准切割DNA双链，用以敲除鼠源H2-D的抗原肽结合区。采用在线设计软件E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)分析H2-D基因外显子2和3的序列信息，从中选取编辑效率评分高，脱靶评分低的sgRNA。委托华大基因公司以化学合成的方式获得sgRNA的全长序列。结果见表1。
1.2 sgRNA表达载体构建
合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，程序如下：100 μmol/L的sgRNA单链各10 μL，放置于95 ℃，5 min；室温自然冷却后稀释为0.5 μmol/L，4℃保存备用。用BSAⅠ酶切pUC57-T7-gRNA质粒使其线性化，经1%琼脂糖电泳检测，胶回收后稀释为50 mg/L。将sgRNA双链小片段与线性化pUC57-T7-gRNA质粒连接，连接得到的质粒命名为pUC57-T7-sgRNA。连接体系如下：线性化的pUC57-T7-gRNA质粒2 μL，sgRNA寡核苷酸双链6 μL，T4连接酶1 μL，T4缓冲液1 μL，16 ℃连接6 h或过夜。
将连接产物转化入感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含125 μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上进行培养。次日在培养基上挑取有卡那霉素抗性的克隆，接种至LB培养液中，37℃，200 rpm摇菌10 h，取1 mL菌液送公司测序，测序正确的菌液进行质粒小量提取，-20℃保存备用。
1.3 sgRNA表达载体和Cas9表达载体的体外转录
采用DraⅠ酶对pUC57-T7-sgRNA酶切进行线性化处理。采用AgeⅠ酶对Cas9表达载体（pST1374-NLS-flag-linker-Cas9）进行酶切线性化处理，然后分别回收、纯化两种线性化产物，再分别溶于无核酸酶的水中作为模板，利用体外转录试剂盒(Ambion，AM1354)在体外通过T7 RNA聚合酶转录成为可注射的sgRNA（pUC57-T7-gRNA-sgRNA）和Cas9mRNA。
2 构建含有人源HLA-B*1301外显子2-3序列的同源重组载体
2.1 插入目标序列及同源重组臂序列的合成
根据sgRNA靶向位置，及H2-D基因序列，设计同源重组臂，左侧同源重组臂为H2-D基因外显子2向上游500bp，同时在5’端引入与载体pBR322序列重合的20bp，3’端引入与插入目标序列的5’端有重合的20bp。右侧同源重组臂为H2-D基因外显子3向下游500bp，同时在3’端引入与载体pBR322序列重合的20bp。
插入目标序列（SEQ ID NO:1）包含HLA-B*1301的外显子2和外显子3以及两个外显子之间的内含子的序列，3’端引入与右侧同源重组臂的5’端重合的20bp。
上述序列由华大基因合成。
插入基因序列（SEQ ID NO:1）：
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCGCCATGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCACGAGTCCGAGGATGGCGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAACCTGCGCACCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTGAGTGACCCCGGCCCGGGGCGCAGGTCACAACTCCCCATCCCCCACGTACGGCCCGGGTCGCCCCGAGTCTCCGGGTCCGAGATCCGCCTCCCTGAGGCCGCGGGACCCGCCCAGACCCTCGACCGGCGAGAGCCCCAGGCGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTGAGGCCAAAATCCCCGCGGGTTGGTCGGGGCGGGGCGGGGCTCGGGGGACTGGGCTGACCGCGGGGCCGGGGCCAGGGTCTCACATCATCCAGAGGATGTATGGCTGCGACCTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCATAACCAGTTAGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGAGCTCCTGGACCGCGGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCTCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCGAGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCGGGTGCAGGGGCCGCGGGCAGCTCC。
左侧同源臂序列（SEQ ID NO:2）：
TTGGTTGCCAGGCGGTGAGGTCAGGGGTGGGGAAGCCCAGGGCTGGGGATTCCCCATCTCCTCAGTTTCACTTCTGCACCTAACCTGGGTCAGGTCCTTCTGCCGGGACACTGATGACGCGCTGGCAGGTCTCACTATCATTGGGTGGCGAGATTCCAGGAGCCAATCAGCGTCGCCGCGGACGCTGGTTATAAAGTCCACGCAACCCGCGGGACTCAGACACCCGGGATCCCAGATGGGGGCGATGGCTCCGCGCACGCTGCTCCTGCTGCTGGCGGCCGCCCTGGCCCCGACTCAGACCCGCGCGGGTGAGTGCGGGGTCGGGAGGGAAACGGCCTCTGCGGGGAGAGGGGCGGCACGGGGGAAGCCGCGTCCCCGCGTCGCCCACCGGACCCTCCGCCCCTTCTCCACCTGAGCCCCGCGCCCAGATCCCCTCCCGGCCTGCGCAGCCGCCCGGGGTTTGGTGAGGAGGTCGGGGTCTCACCGCGCGCCGTCCCCAGGCTCCCACTCCATGAGGTATTT。
右侧同源臂序列（SEQ ID NO:3）：
GGTGCAGGGGCCGCGGGCAGCTCCTCCCTCTGCCCTCGGGCTGGGGCTCAGTCCTGGGGAAGAAGAAACCCTCAGCTGGGGTCATGCCCCTGTCTCAGAGGGGAGAGAGTGTCCCTGGGTCTCCTGATGCCTCAGCACAGTGACTGCACTGACTCTCCCAGGGCTCAGCCTTCTCCCTGGACAGTGCCCAGCCTGTCTCAGGAGGGAAGGAGAGAATTTCCCTGAGGTAACAACAGCTGCTCCCTTCAGTTCCCCTGTAGCCTCTGTCAGCCATGGCCTCTCCCAGGCCGGGTTCTCTGCCCACGCCCACTGTCGGTGGACACTGACTCCTGTCCTGCTGAGTGTGTCAACCCTTACACCTCAGGACCGGAAGTCGCCTTACCTGATTGGAAACATGGACTCCTATACACTAGCCTGGTTGCCCCAGCTTCTAGAATTTTCCAGAGAATACATTCTCCCAGATCCCTCCCTGTCTGTGGGGTTTGCACCCCTTCGACA。
2.2 构建同源重组载体
在37℃下采用EcoRⅠ对质粒pBR322酶切4 h，使pBR322线性化，经1%琼脂糖电泳检测，胶割回收后备用。
使用HB-infusionTM无缝克隆试剂盒（汉生生物科技有限公司）进行同源重组载体连接构建。按说明书将50ng的线性化质粒pBR322、左侧同源重组臂20ng、插入基因片段20ng、右侧同源重组臂20ng和HB-infusionMix 10 μL混匀，在50℃下反应30min。
将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含125 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行培养。次日在培养基上挑取有氨苄青霉素抗性的克隆，接种至LB培养液中，37℃，200 rpm摇菌10 h，取1 mL菌液送公司测序，测序正确的菌液进行质粒小量提取，-20℃保存备，获得含有人源HLA-B*1301外显子2-3序列的同源重组载体。
3 显微注射。
3.1选取15只3-4周龄C57雌鼠注射激素进行超排。然后取约150枚受精卵，将Cas9mRNA、含有人源HLA-B*1301外显子2-3序列的同源重组载体和可注射的sgRNA（pUC57-T7-gRNA-sgRNA）显微注射到C57小鼠的受精卵中，经过培养、观察获得具有活性的受精卵。
1.3.2 制作30只8周龄输精管结扎的ICR雄鼠，然后与8-10周龄ICR雌鼠交配，经过培养、观察选取见栓的雌鼠作为受体鼠。
1.3.3将具有活性的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部，然后饲养、观察受体鼠的繁殖。
4 F0代基因型鉴定。
受体鼠繁殖的F0代乳鼠出生后，饲养7-10天，剪取乳鼠的脚趾和尾尖进行编号及取材。提取基因组DNA，根据表2和表3序列信息设计PCR引物，然后按照表4和表5进行PCR反应，根据图2中的PCR鉴定结果的判定标准对F0代乳鼠进行基因型鉴定和测序，结果见图3。
图2中PCR鉴定结果的判定标准如下：
野生型：①② PCR 反应未获得Target 条带； ③PCR 反应可以获得单一的WT 条带。
杂合子：①② PCR 反应可以获得Target 条带； ③PCR 反应可以获得单一的WT条带
纯合子：①② PCR 反应可以获得Target 条带； ③PCR 反应未获得单一的WT 条带。
由图3可以看出，57、59、61号小鼠①5'arm和②3'armPCR 反应可以获得目的条带，且③WT PCR 反应可以获得单一的条带，为F0代杂合子小鼠，即F0代阳性小鼠。
5 F1代基因型鉴定。
F0代阳性小鼠性成熟后，与野生型背景小鼠进行交配。待F1代小鼠出生后饲养，在5-7天对F1代小鼠剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA 进行PCR 和测序鉴定，确认F1代小鼠基因型，结果见图4。
由图4可以看出，80、82、84、86号小鼠①5'arm和②3'arm PCR反应均获得目的条带，③WT PCR反应获得单一条带，说明80、82、84、86号小鼠均为F1代杂合子小鼠。
图3和图4的结果表明本发明成功构建了一种人源HLA-B*1301抗原肽结合区（α1、α2）原位替代鼠源H2-D抗原肽结合区的基因敲入小鼠模型。
实施例2 人源化H2-D基因敲入小鼠对HLA-B*1301限制性表位的递呈和识别。
实验中的HLA-B13转基因小鼠为Hipp11位点插入HLA-B*1301全长表达基因的转基因小鼠，表达人源HLA-B*1301全长分子，委托中国医学科学院实验动物研究所构建。
1.1 HLA-B13转基因小鼠和人源化H2-D基因敲入小鼠脾细胞表面HLA-B*1301蛋白的表达
具体实验过程如下：
分别取HLA-B13转基因小鼠、人源化H2-D基因敲入小鼠和野生型C57BL/6JGpt小鼠（对照）3-5只，解剖取脾脏，应用跨膜蛋白提取试剂盒（购自贝博生物，BB-3114-50T）提取膜蛋白，经BCA法蛋白定量之后，加入含SDS的上样缓冲液煮沸使蛋白变性，针对HLA-B*1301蛋白进行western blotting检测,结果见图5。
实验中所用一抗为抗HLA-ABC抗体（兔源，购自abcam，货号ab225636）；二抗为山羊抗兔IgG抗体（购自abcam，货号ab205718）。
实验过程中，以Na+/K+-ATPase为内参，一抗为Na+/K+-ATPaseα1多克隆抗体（兔源，购自Abbkine，货号ABP0160），二抗为山羊抗兔IgG抗体（购自abcam，货号ab205718）。
由图5中的A可以看出，野生型小鼠没有人HLA-B*1301分子的表达，HLA-B13转基因小鼠、人源化H2-D基因敲入小鼠有HLA-B*1301分子的表达。
由图5中的B可以看出，人源化H2-D基因敲入小鼠HLA-B*1301分子的相对表达量高于HLA-B13转基因小鼠的，且差异极显著（P<0 .01）。
图5结果说明相较于HLA-B13转基因小鼠，人源化H2-D基因敲入小鼠细胞表面HLA-B*1301分子的表达量显著升高。
1.2人源化H2-D基因敲入小鼠对HLA-B*1301限制性表位的CTL反应
具体实验过程如下：
1.2.1骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养和肽脉冲
取6-10周龄的HLA-B13转基因小鼠和人源化H2-D基因敲入小鼠脱颈椎处死，获得股骨和胫骨骨髓，在重组小鼠GM-CSF和IL-4存在下，利用改良Inaba法培养BMDC，并用LPS诱导BMDC成熟。
收集成熟的BMDC重悬于含10%FBS RPMI-1640培养基，并添加HLA-B*1301限制性表位HHV-6 LTP322-330 1 μg/mL，在37℃，5% CO2培养箱2 h，离心，用PBS洗涤细胞2次后重悬于RPMI-1640培养基中，细胞浓度1×106/mL。
其中，HHV-6 LTP322-330的氨基酸序列为SQFNWTIYL（SEQ ID NO:17）。
1.2.2免疫小鼠
分别取8周龄的HLA-B13转基因小鼠和人源化H2-D基因敲入小鼠各5-7只，用各自来源的负载HLA-B*1301限制性表位的BMDC腹腔注射免疫，每只小鼠注射1 mL。连续注射3次，每次注射间隔10天。
1.2.3两种小鼠对HLA-B*1301限制性表位的CTL反应检测
第三次注射免疫后7天，检测两种小鼠针对HLA-B*1301限制性表位LTP322-330（序列SQFNWTIYL）的CTL反应。具体方法如下：
1.2.3.1脾细胞的获取
脱颈椎处死小鼠，解剖获取脾脏。在盛有1 mL 含10%FBS的DMEM培养基的6孔板中研磨，细胞悬液过铁筛网后转移至15 mL离心管中。4℃1500 rpm水平离心5 min，弃上清。加入2 mL 红细胞裂解液，重悬细胞，室温孵育3-5 min， 加入10 mL PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 离心5min，弃上清。PBS洗1遍后，RPMI-1640培养基重悬，调整细胞浓度为5×106/mL。
1.2.3.2 IFN-γELISPOT检测
小鼠预包被IFN-γELISPOT检测试剂盒来自达科为公司（货号2210002），具体操作步骤按试剂盒说明书操作。具体过程包括：第一步，用RPMI-1640 培养基活化预包被板。第二步，接种脾细胞，每孔100 μL，样本孔和阴性对照孔每孔中加5×105个待测脾细胞，阳性对照孔加5×104个脾细胞。第三步加入刺激物，样本孔中加入不同浓度的HLA-B*1301限制性表位肽10 μL，阴性对照孔中加10 μL培养基，阳性对照孔中加PHA 10 μL，终浓度5 μg/mL。加好后不再震动ELISPOT板，让细胞均匀地铺在平板底部，放入CO2培养箱培养20个小时。第四步，裂解细胞，洗板5次，加入生物素标记的抗IFN-γ抗体，37℃孵育1小时。第五步，洗板5次，加入酶标亲和素，37℃孵育1小时。第六步，洗板，在吸水纸上扣干，加入ACE显色液，室温显色20-30min后终止显色。第七步，待板晾干后进行斑点记数。分泌IFN-γ的位置将形成一定大小的红色斑点，1个斑点代表一个特异性的抗原特异性CD8+T细胞，斑点的多少体现了CTL免疫反应的强度，结果见图6。
由图6中的A可以看出，在多肽浓度1 μg/mL条件下，人源化H2-D基因敲入小鼠对限制性表位HHV-6 LTP322-330的ELISPOT检测斑点明显多于HLA-B13转基因小鼠。
由图6中的B可以看出，随着HHV-6 LTP322-330浓度的升高，CTL的反应强度加大，且在相同浓度下，人源化H2-D基因敲入小鼠的反应强度要显著高于HLA-B13转基因小鼠。
图6结果说明人源化H2-D基因敲入小鼠中的CTL反应强度明显大于HLA-B13转基因小鼠，并且差异显著。
图5和图6的结果表明人源化H2-D基因敲入小鼠不仅HLA-B*1301分子表达水平明显增高，同时也增强了HLA-B*1301对限制性表位的提呈，促进了体内的CTL反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：
步骤1，根据鼠H2-D基因的外显子2和外显子3，设计CRISPR/Cas9系统的sgRNA，构建sgRNA载体，然后将所述sgRNA转录为可注射的sgRNA；
步骤2，根据人源HLA-B*1301基因的外显子2和外显子3，设计插入目标序列SEQ ID NO:1，然后构建含有所述插入目标序列的同源重组载体；
步骤3，将Cas9 mRNA、所述同源重组载体和所述可注射的sgRNA显微注射到小鼠的受精卵中，经过培养、观察获得具有活性的受精卵；
步骤4，将所述具有活性的受精卵移植到受体鼠内，经过繁殖获得F0代乳鼠，对所述F0代乳鼠进行基因型鉴定获得阳性F0代乳鼠；
步骤5，将所述阳性F0代乳鼠与野生型小鼠交配，经过繁殖获得F1代小鼠，对所述F1代小鼠进行基因型鉴定，获得所述人源化H2-D基因敲入小鼠模型；
其中，人源化H2-D基因敲入小鼠的基因中包含SEQ ID NO:1所示的序列；
步骤1中的sgRNA包括根据鼠H2-D基因外显子2设计的5S1和根据鼠H2-D基因外显子3设计的3S1；
5S1的序列为GTACCGGGGCTCCTCGAGGC（SEQ ID NO:4），5S1对应的PAM为CGG；
3S1的序列为CGACGCAAGTGGGAGCAGAG（SEQ ID NO:5），3S1对应的PAM为TGG。
2.根据权利要求1所述的人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，将sgRNA表达载体酶切线性化处理，然后再将合成的所述5S1和所述3S1单链退火复性后插入sgRNA表达载体；
步骤1-2，在体外进行所述sgRNA表达载体的转录，获得的转录产物为所述可注射的sgRNA。
3.根据权利要求1所述的人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2包括以下子步骤：
步骤2-1，合成HLA-B*1301基因的插入片段SEQ ID NO:1、左侧同源臂片段SEQ ID NO:2和右侧同源臂片段SEQ ID NO:3；
步骤2-2，利用SLIC克隆方法将重组同源臂及HLA-B*1301基因的插入片段顺序连接，构建所述同源重组载体。
4.根据权利要求1所述的人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于：步骤4和步骤5中基因型鉴定的PCR引物包括：
5'端的PCR引物F1：CTGTGGAGGATGTCCCTATTGGT（SEQ ID NO:6），R 1：ACATCCTCTGGATGATGTGAGACC（SEQ ID NO:7）；
3'端的PCR引物为F 2：ACACAGACTTACCGAGAGAACCTGC（SEQ ID NO:8），R 2：TTAGCAGTCTCCTCTGGCACCTATG（SEQ ID NO:9）；
WT的PCR引物为F3：ATTCCAGGAGCCAATCAGCGT（SEQ ID NO:10），R3：AAGCGCACGAACTCCTTGTTGT（SEQ ID NO:11）。
5.根据权利要求4所述的人源化H2-D基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于：
5'端产物的测序引物为H2-D1-5tF1：CTGTGGAGGATGTCCCTATTGGT（SEQ ID NO:12），HLA-B-tR1：AACCTCACGAACTGGGTGTCGT（SEQ ID nO:13），H2-D1-5seqF1：TTTGGTGAGGAGGTCGGGGT（SEQ ID NO:14）；
3'端产物的测序引物为H2-D1-3seqF1：GAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCC（SEQ ID NO:15），H2-D1-3seqF2：AGGCGCGTTTACCCGGTTTCAT（SEQ ID NO:16）。
6.一种人源化H2-D基因敲入小鼠模型的应用，其特征在于：所述小鼠模型根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法获得，所述应用包括与HLA-I相关超敏免疫反应疾病的研究及相关药物的筛选。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述小鼠模型的细胞表面HLA-B*1301分子表达量高于HLA-B*1301全长表达基因的转基因小鼠。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述小鼠模型对HLA-B*1301限制性抗原肽的CTL反应能力强于HLA-B*1301全长表达基因的转基因小鼠。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述HLA-B*1301限制性抗原肽的表位氨基酸序列包含SQFNWTIYL（SEQ ID NO:17）。
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