CN112094868B - 一种利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163基因编辑猪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用单碱基编辑器SpRY‑BE4制备CD163基因编辑猪的方法。本发明提供了为对猪离体成纤维细胞基因组的CD163基因进行基因编辑，使双等位基因CD163的E3外显子的第228位碱基均由C定点突变为T，且突变后形成TGA终止子使所述E3外显子提前终止表达，得到CD163双等位基因突变细胞；所述E3外显子的核苷酸序列为序列2。本发明获得的CD163双等位基因敲除猪具有抗PRRSV病毒的能力，表明本发明制备CD163双等位基因敲除猪方法可以得到抗PRRSV病毒的猪。

Description

一种利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163基因编辑猪的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163基因编辑猪的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种全球性的、传染性强的、危害性大的猪病毒性疾病，其在所有年龄的猪中临床症状不同，但主要是导致妊娠母猪的晚期堕胎、死胎和木乃伊胎以及仔猪的呼吸道疾病。其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，此病毒主要有两个类型I和II。PRRSV 是一种单股正义RNA 病毒, 是套式病毒目 (Nidovirales) 、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属 (Arterivirus) 的成员,基因组全长15kb，共包含11 个开放阅读框。研究发现PRRSV的唯一天然宿主是猪，可感染猪体内已分化的血液单核细胞和猪肺泡巨噬细胞。Calvert等人通过从猪肺泡巨噬细胞构建的cDNA文库中筛选PRRSV易感的基因而找到了CD163，且CD163只在单核/巨噬细胞系中表达。随后科学家将CD163在一些非易感PRRSV细胞系中进行表达，结果这些细胞系对PRRSV变得易感，而且PPRSV对这些细胞系的感染能力与CD163的表达量呈正相关，表明它是介导PRRSV感染的一种重要受体。

随着最近基因组编辑技术的不断发展（特别是CRISPR/Cas9）及CD163基因在PRRSV感染中重要作用的发现，使基因编辑技术提高大动物品种改良成为可能。最早2014年密苏里大学的Randall S. Prather课题组跟英国Genus公司合作利用CRISPR/Cas9技术结合原核注射或者体细胞克隆技术制备了世界首例CD163基因敲除猪。随后于2016年，他们进行攻毒实验证明CD163基因敲除猪可以抵抗II型PRRSV，相关成果发表在Nature biotechnology杂志上。2017年国内华南农业大学吴珍芳教授课题组也利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞克隆技术成功制备了抵抗国内HF-PRRSV的CD163基因敲除猪。2018年Randall S. Prather课题组跟英国Genus公司又制备CD163基因敲除猪和E7外显子替换猪。同年，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所李奎教授课题组利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞克隆技术成功制备了CD163基因敲除猪。虽然CD163基因敲除可以抵抗不同类型的PRRSV，但是由于CD163蛋白除了介导PRRSV的感染外，还有其他重要的生物学功能例如清除血浆中的血红蛋白、红细胞粘附受体、免疫调节因子等，因此敲除CD163基因可能影响猪的其他功能，如果只删除CD163基因编码蛋白的SRCR5功能域，造成不被PRRSV病毒感染，同时保留CD163基因编码蛋白的其他功能域，这样既可以使基因编辑猪抵抗PRRSV，又可以不影响猪其他生理功能。

2017年Bruce A. Whitelaw课题组跟英国Genus公司合作成功制备了世界第一只CD163基因第7外显子删除猪，阳性猪细胞水平抵抗I型和II型PRRSV病毒，并且保持CD163正常的血红蛋白清除等重要功能。2019年中国农业大学的李宁院士和胡晓湘教授利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术及体细胞克隆技术成功制备了CD163基因E7外显子精确替换和删除的猪。同年中山大学的何祖永副教授利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞克隆技术制备了CD163基因E7外显子部分删除的猪。

CRISPR/Cas9技术决定靶点特异性的只有 20 bp 序列，存在脱靶现象，虽然随后在此技术上升级的nickase版本的dCas9、高保真 Cas9、dCas9-forkI及gRNA修饰等方法，大大降低了脱靶效应。但是这些技术都是利用对宿主基因组 DNA 造成 DSB，然后通过 NHEJ或者 HR进行修复，仍然存在一定缺陷。NHEJ效率远远高于 HR，然而NHEJ的修复其随机性强，往往造成目的基因随机的片段缺失或插入，很难进行精确的点突变制备；HDR 修复虽然精确度高，然而其修复效率极低且局限于有丝分裂细胞，大大地限制了 HDR 修复的应用。还有传统的Cas9敲除，造成两条等位基因片段随机删除，存在不同的未知功能的残余蛋白。而自然界大动物突变往往是点突变，最理想的新技术育种很显然是模拟自然点突变。

精确的点突变技术依然是一大难题。因为自然界存在的突变大多是点突变，因此建立高效的点突变技术进行品质改良意义重大。在此背景下，美国哈佛大学 David R. Liu课题组创新性地开发了基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑器（base editor，BE），有效地解决了上述问题。该研究组将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）的大鼠胞嘧啶核苷脱氨酶rAPOBEC1通过linker序列XTEN连接到催化失活Cas9 (catalytically dead Cas9，dCas9) N端，构建出了第一代单碱基编辑器base editor 1(BE1) (rAPOBEC1–XTEN–dCas9)，随后进一步结构优化加入尿嘧啶糖基化抑制因子UGI构建成BE2，随后恢复一个Cas9的切割功能域(rAPOBEC1–XTEN–nCas9-UGI) 成功制备了第三代单碱基编辑器base editor 3(BE3)，随后又再次基础上通过linker额外加入一个UGI成功制备了第四代单碱基编辑器base editor4(BE4)。该单碱基编辑器base editor 4(BE4)可以高效的在人的细胞中实现C突变为T（或者G-A）的精准点突变。随后此技术在小鼠，斑马鱼，猪和植物中成功应用。但是此技术有一个重要缺陷，就是PAM的限制性，不能随意的在目的基因区域进行C-T（G-A)的精确点突变。

2020年Benjamin P. Kleinstiver课题组针对此技术缺陷进行优化成功制备了无PAM限制的SpRY-BE4技术并且在HEK 293T细胞验证成功，但目前在大动物水平没有研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备CD163双等位基因突变细胞的方法。

本发明提供的方法，为对猪离体成纤维细胞基因组的CD163基因进行基因编辑，使双等位基因CD163的E3外显子的第228位碱基均由C定点突变为T，且突变后形成TGA终止子使所述E3外显子提前终止表达，得到CD163双等位基因突变细胞；

所述E3外显子的核苷酸序列为序列2。

上述方法中，所述基因编辑采用单碱基编辑器SpRY-BE4进行；

所述单碱基编辑器SpRY-BE4包括用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA；

所述sgRNA的靶序列为序列3第1-20位。

上述方法中，所述单碱基编辑器SpRY-BE4为如下1）和2）：

1）rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白或其mRNA或表达该蛋白的重组载体；

2）所述sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中序列3或序列8。

上述方法中，所述用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白mRNA的核苷酸序列为序列表中序列序列6第19-5542的t替换为U得到的序列。

上述方法中，所述基因编辑为将所述rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白mRNA和所述sgRNA导入述离体猪成纤维细胞系中，得到CD163双等位基因突变细胞。

本发明另一个目的是提供一种制备CD163双等位基因突变猪的方法。

本发明提供的方法，为将第一个目的方法制备的所述CD163双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为CD163双等位基因突变猪。

本发明第3个目的是提供一种制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪的方法。

本发明提供的方法为如下1）或2）：

1）将第1个目的制备的所述CD163双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为CD163双等位基因突变猪，即为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪；

2）用所述CD163双等位基因突变猪扩繁，得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪。

本发明还有一个目的是提供一种CD163双等位突变基因。

本发明提供的CD163双等位突变基因，为将CD163双等位基因的E3外显子的第228位碱基由C定点突变为T，且突变后形成TGA终止子使所述E3外显子提前终止表达，其他核苷酸序列不变，得到的片段；

所述E3外显子的核苷酸序列为序列2。

本发明还有一个目的是提供一种用于制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪的生物制品。

本发明提供的生物制品，为使猪基因组中双等位基因CD163的E3外显子的第228位碱基均由C定点突变为T，且突变后形成TGA终止子使所述E3外显子提前终止表达的生物制品；

所述E3外显子的核苷酸序列为序列2。

在本发明的实施例中，所述生物制品为上述方法中所述单碱基编辑器SpRY-BE4。

上述的方法在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪中的应用也是本发明保护的范围；

上述生物制品在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述生物制品在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪育种中的应用也是本发明保护的范围。

上述猪具体可为大白猪。

单碱基编辑器SpRY-BE4包括用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA，该sgRNA包括结合靶序列的结合区和结合rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的结合区。

rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的mRNA为将由序列6中自第19-5542位组成的核苷酸序列转录为RNA，该蛋白为序列6中自第19-5542位组成的核苷酸编码的蛋白。

本发明具有如下优点：

1）CD163基因的E3外显子区域进行突变

针对现有的 SpRY-BE4技术突变的均为CD163基因E7外显子，但是E7外显子的突变会导致CD163基因产生太长的未知功能的截断蛋白，这些蛋白是否对PRRSV病毒还有功能，或者在体内是否对宿主有影响都有潜在风险性，这些都是未知的。本发明的发明人首次利用此技术成功在CD163基因的E3外显子区域进行C-T的精确点突变，造成终止密码子从而进行蛋白翻译提前终止达到基因敲除的目的，成功制备了CD163基因编辑猪。

2）使用mRNA转染

利用SpRY-BE4质粒制备基因编辑动物，会存在外源SpRY-BE4质粒整合到受体基因组上的可能，因此本发明利用SpRY-BE4的mRNA进行转染，避免这种问题，同时避免筛选标记基因造成的生物安全性问题，然后又利用无筛选标记的基因编辑方法，最终获得了无外源DNA整合的CD163双等位基因C-T点突变阳性细胞克隆，C-T的突变造成AA的提前终止从而达到CD163基因敲除目的。将此阳性细胞进行体细胞克隆制备出了精确编辑的CD163基因敲除猪。实验证明此猪的血中不存在CD163蛋白。

总之，本发明建立了一种大动物点突变技术，点突变技术可以进行精确的单碱基突变，通过巧妙设计C-T的突变，该方法模拟自然突变动物，同时与传统基因编辑技术相比，基于SpRY-BE4的点突变技术并不产生基因组双链断裂, 因而极大地避免了随机突变乃至基因组损害，因此更具有安全性，同时又没有PAM的限制，大大提高设计人员对靶基因编辑的可操作性和宽泛性。本发明为提高猪的精确基因编辑及基因敲除设计的自由性和宽泛性研究提供重要技术支持。

本发明获得的CD163双等位基因敲除猪具有抗PRRSV 病毒的能力，表明本发明制备CD163双等位基因敲除猪方法可以得到抗PRRSV 病毒的猪，得到的CD163双等位基因敲除猪可以作为抗病猪进行扩繁，也可以采用该CD163双等位基因敲除猪的耳样的体细胞进行体细胞核移植扩繁抗病猪，也可以采用双等位基因C-T突变型成纤维细胞进行体细胞核移植扩繁抗病猪。

附图说明

图1为本发明技术路线。

图2为CD163特异性SpRY-BE4靶点效率验证。

图3为CD163双等位基因敲除牛DNA测序结果。

图4为CD163双等位基因敲除牛Western blot检测结果。

图5为PRRSV不同攻毒剂量下 PAMs 中病毒 RNA 相对表达量检测。

图6为PRRSV不同攻毒剂量下 PAMs 中病毒滴度检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pCAG-SpRY-BE4载体：Addgene，货号：#139999。

pCAG-SpRY-BE4载体中，由CAG启动子驱动单碱基编辑器SpRY-BE4中的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的表达。

单碱基编辑器SpRY-BE4包括用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA，该sgRNA包括结合靶序列的结合区和结合rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的结合区。

rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的mRNA为将由序列6中自第19-5542位组成的核苷酸序列转录为RNA，该蛋白为序列6中自第19-5542位组成的核苷酸编码的蛋白。

实施例1、利用新型单碱基编辑器制备CD163双等位基因突变细胞系

一、用于CD163双等位基因突变的物质

1、表达载体BE4-gRNA

本研究选择CD163基因的外显子3区域作为打靶位点, CD163基因的序列如序列1所示，外显子3的序列如序列2所示。

设计3个gRNA，其识别序列（sgRNA的靶序列）分别为：gRNA-1:TTGTCGAGGGAATGAGTCAG; gRNA-2：TCCCCATCCATCATGTTTGC; gRNA-3：GCAGTCCCAGAGAGCTGACT。

根据设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：

gRNA-F1: CACCGTTGTCGAGGGAATGAGTCAG

gRNA -R1: AAACCTGACTCATTCCCTCGACAAC

gRNA -F2: CACCGTCCCCATCCATCATGTTTGC

gRNA -R2: AAACGCAAACATGATGGATGGGGAC

gRNA -F3: CACCGGCAGTCCCAGAGAGCTGACT

gRNA -R3: AAACAGTCAGCTCTCTGGGACTGCC

将上述各个gRNA-F与gRNA-R退火获得带粘性末端的双链DNA 片段gRNA1、带粘性末端的双链DNA 片段gRNA2和带粘性末端的双链DNA 片段gRNA3；

将pCAG-SpRY-BE4（购自Addgene，该载体含有rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白编码序列）载体经BbsⅠ酶切回收片段，再将上述带粘性末端的双链DNA 片段gRNA1、带粘性末端的双链DNA 片段gRNA2和带粘性末端的双链DNA 片段gRNA3分别连入该回收片段中，获得SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA1、BE4-sgRNA2、BE4-sgRNA3。

SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA1为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA1插入pCAG-SpRY-BE4载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA1与该载体上的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区融合共同表达sgRNA1，用于靶向目标序列，并结合rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA1编码基因（其序列见序列3，其中第1-20位核苷酸为靶区域结合区，第21-100位核苷酸为与rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区域），表达sgRNA1。

SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA2为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA2插入pCAG-SpRY-BE4载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA2与该载体上的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区共同表达sgRNA2，用于靶向目标序列，并结合rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA2编码基因（其序列见序列4，其中第1-20位核苷酸为靶区域结合区，第21-100位核苷酸为与rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区域），表达sgRNA2。

SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA3为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA3插入pCAG-SpRY-BE4载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA3与该载体上的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区共同表达sgRNA3，用于靶向目标序列，并结合rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA3编码基因（其序列见序列5，其中第1-20位核苷酸为靶区域结合区，第21-100位核苷酸为与rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白结合区域），表达sgRNA3。

单碱基编辑器SpRY-BE4包括用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA，在本实施例中单碱基编辑器SpRY-BE4为表达rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA的载体，具体可以为SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA1、SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA2或SpRY-BE4表达载体BE4-sgRNA3。

2、切割效率验证

单碱基编辑器SpRY-BE4在哺乳动物细胞中介导单碱基突变,这种单碱基基因修饰可以被 T7E1酶切进行检测，其基本过程及原理为：当作用靶点发生突变后, 经过 PCR扩增目标序列后, 由于碱基突变, 不同分子之间经过 PCR再次梯度退火会产生 DNA鼓泡, 而T7E1会特异性识别鼓泡位置并进行切割, 从而可以初步鉴定SpRY-BE4是否能在目的位点介导单碱基突变。

1）针对SpRY-BE4识别及编辑位置位置，设计PCR扩增引物

设计合成PCR扩增引物F: 5’ AACATTTCTCAAATCTGG 3’、 R: 5’TTTCATGTAGAAGTAGAAGGT3’。

2）猪成纤维细胞系的制备

取大白猪的耳部皮肤组织，耳部下缘背侧去毛后以70%（v/v）酒精水溶液清洗干净，再用刀片从耳部下缘背侧剔取面积为1cm²左右的皮肤，置于0℃的DMEM/F12培养基中尽快运回实验室，以PBS缓冲液和70%（v/v）酒精水溶液清洗数遍后剪碎成1mm³左右的小块，DMEM培养基清洗2遍后分批植块于含1mL含10%（v/v）FBS的DMEM培养基培养瓶（规格为25cm²）中，待组织块贴壁牢固后再补加含10%（v/v）FBS的DMEM培养基至6mL，37℃、5%CO₂培养箱培养6-7天，期间每2天换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25%胰蛋白酶消化传代2-3次，分批用含20%（v/v）FBS、10%（v/v）DMSO的DMEM培养基冻存，得到离体猪成纤维细胞系。

3）SpRY-BE4电转猪成纤维细胞

(1) 电转前2d, 将2×10⁵ 个上述2）得到的猪成纤维细胞系复苏于6孔板培养皿内,加4 ml 含10% （体积百分含量）胎牛血清（FBS）的 DMEM培养液（购自Gibco）。置37℃、5%CO₂ 培养箱中培养。

(2) 待6孔板细胞长满后，约1×10⁶个细胞，用1 ml 0.25%胰蛋白酶（购自Gibco）溶液消化细胞。以1000 g 离心5 min 沉淀细胞。将细胞沉淀用PBS缓冲液（购自Gibco） 洗1次。将细胞重新悬浮于100μL电击缓冲液（购自LOZA公司）中，得到细胞悬浮液。

(3) 向100μL上述（2）得到的细胞悬浮液中分别加入上述1制备的3μg 表达载体BE4-sgRNA1、BE4-sgRNA2和BE4-sgRNA3，混合后转入电击杯（购自LOZA公司）中。

(4) 以 1.2KV/cm的电场强度和 1ms的脉冲时间,电击细胞。

(5) 将电击后的细胞转入60mm 的细胞培养皿中；加入4 ml 含10%（体积百分含量）胎牛血清的DMEM 培养液，于CO₂培养箱中培养，细胞生长状态恢复，分别得到转BE4-sgRNA1猪成纤维细胞、转BE4-sgRNA2猪成纤维细胞和转BE4-sgRNA3猪成纤维细胞。

4）PCR扩增

分别提取上述3）得到的电转后48 h的转BE4-sgRNA1猪成纤维细胞、转BE4-sgRNA2猪成纤维细胞、转BE4-sgRNA3猪成纤维细胞和上述2）制备的离体猪成纤维细胞系（WT）的基因组DNA。

以基因组DNA为模板，用上述1）设计合成的F 和R作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物。

5）PCR 产物进行梯度退火

将上述3）得到的PCR产物进行柱纯化回收, 并测定 PCR 产物浓度，对 PCR 产物进行梯度退火, 得到梯度退火的 PCR 产物。

上述梯度退火的体系如下表1所示：

表1为梯度退火的体系

体系	20 μL
		PCR产物	400 ng
Taq Buffer（购自康为世纪）	2.0 μL
		ddH<sub>2</sub>O	补充至 20 μL体系

上述梯度退火程序如表2所示：

表2为PCR产物梯度退火程序

温度	时间	Ramp
			95°C	10min	-2°C
95°C-85°C	1 min	-0.3°C
			85°C-75°C	1 min	-0.3°C
75°C-65°C	1 min	-0.3°C
			65°C-55°C	1 min	-0.3°C
55°C-45°C	1 min	-0.3°C
			45°C-35°C	1 min	-0.3°C
35°C-25°C	1 min	-0.3°C
			4°C	Hold	—

6）对上述5）得到的梯度退火的 PCR 产物进行 T7E1酶切, 酶切体系如下表3所示：

表3为酶切体系

体系	25 μL
		梯度退火的 PCR 产物	20 μL
Buffer 2.1(NEB)	2.5 μL
		T7E1(NEB)	0.5 μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至 25 μL体系

反应程序：将表3所示的酶切反应在 37°C 恒温培养箱中进行, 酶切反应时间 1h，得到酶切产物。

将上述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳检测，采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳结束后, EB对PAGE胶进行染色；通过ImageJ软件对酶切条带进行灰度分析, 初步确定单碱基编辑器SpRY-BE4切割效率。

切割效率为PCR主条带和切割后的条带的强度比值。

切割效率检测结果如图2上图所示，百分数表示切割效率，NC为猪成纤维细胞系（WT），sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3分别对应转BE4-sgRNA1猪成纤维细胞、转BE4-sgRNA2猪成纤维细胞和转BE4-sgRNA3猪成纤维细胞；结果表明，在猪的成纤维细胞中, 针对CD163位点的三个gRNA1、gRNA2、gRNA3对应的SpRY-BE4系统，仅有gRNA1具有识别并发挥单碱基突变的活性, 经生物学灰度分析软件分析, 其切割效率分别为11%。

为了进一步确定sgRNA介导的单碱基是在靶区域, 将具有较高活性的转BE4-sgRNA1猪成纤维细胞，提取基因组DNA为模板，用F 和R引物（F: 5’ AACATTTCTCAAATCTGG3’、 R: 5’ TTTCATGTAGAAGTAGAAGGT3’ ）扩增，得到的PCR 产物回收, 进行T-A 克隆测序。

测序结果与野生CD163基因的外显子3（序列2）比对,证实sgRNA1使CD163基因外显子3（序列2）第228位核苷酸由C突变为T，且突变后形成TGA终止子提前终止蛋白功能丧失，发生了预期的单碱基突变（图2下图），因此表达载体BE4-sgRNA1可以成为介导目的基因单碱基突变的有利工具，在后续的实验中选取sgRNA1对应的靶序列作为识别区。

二、利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163双等位基因突变细胞系

本实施例利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163双等位基因突变细胞系。考虑后期的产业化，避免生物安全性问题，本发明不使用筛选标记基因，同时使用SpRY-BE4的mRNA，这样即可制备无外源 DNA 整合的CD163双等位基因突变细胞系，技术路线见图1。

（一）体外转录单碱基编辑器SpRY-BE4中的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白mRNA的制备

1、室温配置体外转录 mRNA体系（表1）

以pCAG-SpRY-BE4载体为模板，用T7-Cas9-F:ttaatacgactcactatagGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC和T7-Cas9-R:GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC为引物扩增，得到PCR产物，即为含有T7启动子的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS编码基因（序列6，其中序列6第19-5542为rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS编码基因）。

再将采用Ahd1酶切PCR产物，得到Ahd1处理PCR产物，按照表4所示，配制体外转录mRNA 体系；再将体外转录 mRNA 体系混合完全后37℃孵育1 h后，向反应体系中加入1μLTURBO DNA 酶，37℃孵育 15min，得到反应产物。

表4为体外转录 mRNA 体系

组分	体积
		<i>Ahd</i>1处理PCR产物	1μL（0.1-1μg）
2×NTP/CAP	10μL
		10×Buffer	2μL
RNA 合成酶	2μL
		ddH2O	补至20μL

上述试剂2×NTP/CAP、10×Buffer、RNA 合成酶均来自MEGAscript™ T7Transcription Kit，Ambion，货号：AM1333。

2、取步骤1的反应产物，配置体外转录 mRNA 加polyA体系（表5），混合完全后37℃孵育1 h，得到反应产物。

表5为加polyA体系

组分	体积
		步骤1的反应产物	20μL
5×E-PAP Buffer	20μL
		MnCl<sub>2</sub>(25mM)	10μL
ATP(10mM)	10μL
		E-PAP	4μL
ddH<sub>2</sub>O	36μL
		总计	100μL

上述试剂均来自Poly(A) Tailing Kit，Ambion，货号：AM1350。

3、体外转录 mRNA过柱纯化

（1）向步骤2得到的反应产物中加入 350μL 结合液（binding buffer），吹吸混匀，将样品转移到柱子中，10000g 室温离心 1min。

（2）弃掉滤液，重新装好柱子，500μL 洗脱液漂洗柱子，10000g 室温离心 1min，完后重复漂洗一次；弃掉滤液，空柱离心 15s。

（3）将柱子放入一个新的离心管中，加入 50μL 洗脱液到柱子中央位置，盖好盖子60℃孵育 10min，10000g 室温离心 1min，收集上清液，得到APOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLSmRNA溶液（浓度为2μg/μL，其中APOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS mRNA的核苷酸序列为序列6第19-5542的t替换为U得到的序列）。

上述试剂均和柱子均来自clear™ Transcription Clean-Up Kit，Ambion，货号：AM1908。

（二）、体外转录sgRNA的制备

1、人工合成sgRNA1体外转录模板

上述一的BE4-sgRNA1载体为模板，用T7-sgRNA-F:ttaatacgactcactatagggcaggactactcacactccg和T7- sgRNA -R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC为引物扩增，得到PCR产物，即为含有sgRNA1编码基因的序列，核苷酸序列为序列7，其中自5’端第1至20位为T7启动子，第19位为转录起始位点，第21至40位为靶序列，第41至120位为单碱基编辑器SpRY-BE4中的APOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的结合区域。

2、取步骤1得到的含有sgRNA1编码基因的序列，配置体外转录体系（表6），37℃孵育 2 h。

表6为体外转录体系

组分	体积
		序列7所示的模板	8 μL(2μg)
2×ATP/CTP/UTP/GTP	2/2/2/2μL
		10×Reaction Buffer	2 μL
Enzyme Mix	2 μL
		总计	20 μL

上述试剂均来自MEGAshortscript™ T7 Transcription Kit，AM1354, Ambion。

3、完成步骤2后，向反应体系中加入1μL TURBO DNA 酶（AM1354，Ambion），37℃孵育 15min。

4、完成步骤3后，加入2倍体积无水乙醇沉淀转录产物，-20℃静置30min，13000rpm 离心 30min，弃去上清液，取沉淀。

5、采用75%（v/v）乙醇水溶液充分洗涤步骤4得到的沉淀，弃去上清液，超净台充分吹干，Nuclease-free 水充分溶解sgRNA1，得到sgRNA1溶液（浓度为5μg/μL，sgRNA1的序列为序列8，将序列7第20-120位核苷酸转录得到序列）。

上述试剂均来自MEGAshortscript™ T7 Transcription Kit，Ambion，货号：AM1354。

（三）、SpRY-BE4 mRNA转染

（1）转染前2天，用胰蛋白酶消化步骤一的2中得到的离体猪成纤维细胞系至单细胞，将1×10⁶个猪成纤维单细胞转接至培养瓶（规格为100mL），加入4mL含10%（v/v）胎猪血清的DMEM培养液（均购自Gibco），37℃、5%CO₂培养至对数生长期。

（2）完成步骤（1）后，取处于对数生长期的猪成纤维细胞，用1 ml 0.25%胰蛋白酶（购自Gibco）消化，然后1000g离心5min，收集沉淀。

（3）完成步骤（2）后，取所述沉淀，用PBS缓冲液（购自Gibco，）洗涤1次，然后用100μL电击液（购自Loza, VPI1002）重悬，得到细胞悬液。

（4）取细胞悬液（含1×10⁶个细胞），在上述细胞悬液中将上述步骤（一）得到的SpRY-BE4 mRNA溶液（使转染体系中的SpRY-BE4 mRNA为4μg）和步骤（二）得到的sgRNA1溶液（使转染体系中的sgRNA1为4μg）充分混匀后共转入电击杯，进行电击（电场强度为1.2KV/cm，脉冲时间为1ms）。

（5）完成步骤（4）后，将电击后的细胞转入培养瓶（规格为100mL），加入4mL含10%（v/v）胎猪血清的DMEM培养液，37℃、5%CO₂培养2天，得到转染后细胞。

（四）、无限稀释法制备单细胞克隆及基因型鉴定

（1）将上述步骤（三）得到的转染后细胞培养至融合率达80%-90%时，用37℃的0.1%胰酶消化，含10%（v/v）FBS的DMEM培养基终止消化后，离心收集细胞。

（2）用含20%（v/v）FBS的DMEM培养基重悬细胞，取部分细胞进行计数，将细胞稀释至100个/mL，得到细胞悬浮液。向20个已添加9mL含20%（v/v）FBS的DMEM培养基的培养皿中各加入1mL细胞悬浮液，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养。

（3）待培养皿中的细胞克隆生长至直径达2mm以上时，去除培养基，DPBS冲洗后，用克隆环罩在克隆团上，向其中滴加约100μL 37℃的0.1%胰酶，消化约3min后，滴加含20%（v/v）FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻吹打后将其转移至48孔板中扩大培养。

（4）48孔板中细胞融合率达90%时，消化后取一半细胞用于细胞克隆基因型鉴定，剩余一半继续在孔板中培养。

（5）用于鉴定基因型的细胞经过1000g离心5min 后，弃上清，依据细胞沉淀量加入10-20μL细胞裂解液（50Mm KCL，2.5mM Mgcl₂，10mM Tris-Hcl，0.45% NP40，0.45% 吐温20和0.2mg/mL 蛋白酶K）。

（6）吸取3μL细胞裂解液为模板进行PCR鉴定，以引物P1和引物P2组成的引物对（根据猪CD163基因设计并合成）进行PCR扩增。

引物P1：5’- AACATTTCTCAAATCTGG-3’；

引物P2：5’- TTTCATGTAGAAGTAGAAGGT-3’。

反应体系为20μL，由1.0μL DNA 模板、0.4μL引物P1（浓度为10μM）、0.4μL引物P2（浓度为10μM）、0.4μL dNTP、0.3μL LA DNA 聚合酶、2.0μL 10× PCR Buffer和15.5μLddH2O组成。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min，4℃保存。

得到714bp大小的条带。

将上述PCR扩增产物进行纯化、测序。将PCR产物连接到pMD-19t质粒载体中，转化大肠杆菌感受态后，挑取多个单菌落（单细胞克隆）进行测序，将测序结果与野生型CD163基因的第3外显子（E3，序列2）进行比对，获得详细的突变信息，即可确定该细胞系是否突变及突变类型。

结果如下：

49个单细胞克隆中，含有单等位基因C-T突变基因且突变后形成TGA终止子提前终止蛋白功能丧失的细胞克隆点16个；含有双等位基因C-T突变基因且突变后形成TGA终止子提前终止蛋白功能丧失的细胞克隆点1个，将该细胞克隆命名为双等位基因C-T突变型成纤维细胞。

双等位基因C-T突变基因为将野生型CD163双等位基因的第三外显子（序列2）的第228位的C突变为T，且该基因上其他核苷酸序列不变，即猪成纤维细胞中2个同源染色体上的野生型CD163基因第三外显子（序列2）第228位核苷酸均由C突变为T且该基因上其他核苷酸序列不变。

实施例2、CD163双等位基因敲除猪的制备

一、CD163双等位基因敲除猪的制备

1、取实施例1中得到的处于对数生长期的双等位基因C-T突变型成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化5min，得到单细胞，后续操作中成为供体细胞。

2、从屠宰厂收集成年大白猪的卵巢，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10%FBS+0.01U/mL bFSH+0.01U/mL bLH+1µg/mL 雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5%CO₂培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1%透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体（去核卵母细胞）。

将带有第一极体的卵母细胞移入由M199+10%（v/v）FBS+7.5µg/mL细胞松驰素B组成的操作液中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20µm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入含20%（v/v）FBS的M199液中洗三遍后，置于培养箱中备用。

3、将步骤1得到的供体细胞移入步骤2得到的去核卵母细胞的透明带内，先置于Zimmerman液（100mL Zimmerman液由蔗糖0.9854g、四水合醋酸镁10.7mg、一水合醋酸钙1.8mg、磷酸氢二钾7.4mg、还原型谷胱甘肽3.1mg、猪血清蛋白1.0mg和水组成）中平衡3min，再置于融合槽内转动卵细胞使供体细胞与步骤2制备的去核卵母细胞接触而与电场垂直，同时在场强为2.5kV/cm的直流脉冲场中，在脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合（融合仪为BTX公司的产品，型号为ECM-2001），迅速移入含10%（v/v）FBS的M199液（Gibco公司的产品），37℃、5%CO2培养30min，得到重构胚。

3、取步骤2得到的重构胚，加入浓度为5μM的钙离子载体A23178的CR1aa培养液（100mL CR1aa培养液由0.67g氯化钠、0.023g氯化钾、0.22g碳酸氢钠、2mg丙酮酸钠、100μl酚红和水组成）处理5min；弃液相，加入含有5μg/mL细胞松驰素B和10μg/mL放线菌酮的CR1aa培养液处理5h（目的为激活重组胚）；弃液相，加入含5%（v/v）FBS的CR1aa培养液，37℃、5%CO2培养48h，观察卵裂率，7-8天观察囊胚发育率（约80%），得到转基因克隆囊胚。

4、将步骤3中培养7天的形态优良的转基因克隆囊胚移入同期的受体母猪的子宫角内（共移植受体母猪5头）。在移植后的第30d对受体母猪进行B超检测以确定受胎情况，妊娠率为60%。

5、对妊娠母猪按常规饲养方法进行饲养，经过90天，妊娠母猪正常分娩，得到体细胞克隆种猪（即为CD163双等位基因敲除猪，其中正常存活的崽猪编号为 #170923、#170917）。

二、CD163双等位基因敲除猪分子水平检测

采用血液和组织基因组试剂盒（QIAGEN公司）提取待测猪（#170923、#170917号猪和野生大白猪）耳组织基因组DNA，并以其作为模板，采用引物P1和引物P2

引物P1：5’- AACATTTCTCAAATCTGG-3’；

引物P2：5’- TTTCATGTAGAAGTAGAAGGT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行纯化、测序。

测序结果表明，野生大白猪（即未转基因猪）中CD163基因的基因型为野生型CD163双等位基因（CD163+/+），CD163双等位基因均为序列1；两头体细胞克隆猪#170923、#170917号猪中CD163基因的基因型为双等位基因C-T突变基因（CD163-/-）。

双等位基因C-T突变基因为将野生型CD163双等位基因两条同源染色体的CD163基因第3外显子（序列2）自5’端第228位核苷酸均由C突变为了T且突变后形成TGA终止子，造成CD163基因mRNA转录翻译提前终止，进而CD163蛋白的功能缺失。

测序比对结果见图3测序图。

#170923、#170917两头猪目前存活正常，正常发育至2年龄，见图3表型图（左边是#170923，右边是#170917）。

三、CD163双等位基因敲除猪的猪血中CD163蛋白表达情况分析

1）、提取待测猪（上述一获得的CD163双等位基因敲除猪或野生大白猪）血中的总蛋白。

2）、分别取步骤1）得到的待测猪的总蛋白，进行Western blot。采用 CD163Antibody（AbD Serotec公司的产品）作为一抗、山羊抗体（中杉金桥公司的产品）作为二抗检测CD163蛋白。

实验结果见图4，CD163双等位基因敲除猪（#170923、#170917）的总蛋白没有检测到CD163蛋白的表达，可见CD163双等位基因敲除猪产的猪血中没有CD163蛋白。

上述结果表明，CD163双等位基因敲除猪的CD163基因被破坏后，产的猪血中不含有CD163蛋白，表明CD163蛋白的功能缺失，提示该猪个体具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的特征。

四、CD163双等位基因敲除猪的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV 感染分析

1、PAMs 系的建立

选择上述一获得的CD163双等位基因敲除猪（#170923）作为CD163Mut/Mut肺泡巨噬细胞系（PAMs）建立的材料来源, 同时选择日龄、性别和品种均相同的野生型大白猪作为WT 肺泡巨噬细胞系建立的材料来源。

原代 PAMs 的制备过程如下：

(1) 将猪麻醉, 颈动脉放血致死, 手术打开胸腔, 用止血钳夹住气管, 使肺内与外界空气隔绝, 从近头端切断气管, 取出整个肺, 用已灭菌的锡箔纸包裹肺, 注意不要染菌；

(2) 将取出的肺转移至超净工作台中, 把 HBSS 缓冲液（Gibco）经气管注入肺中并揉捏肺, 倒出注入的液体, 灌洗 5-8 次；

(3) 将收集的灌洗液分装到 50 mL 离心管中, 300 g, 离心 10 min, 弃上清；

(4) 将收集的细胞沉淀用 HBSS 缓冲液洗一遍, 然后再用 RPMI-1640 培养液（Gibco）洗一遍, 再次离心收集细胞沉淀；

(5) 将细胞用 PAMs 冻存液 (含体积百分含量90% FBS 和体积百分含量10%DMSO) 重悬, 采用梯度降温的方式冻存细胞, 最终在液氮中保存；

(6) 复苏 PAMs 时, 基本按照上述细胞复苏的操作进行, 只需将 DMEM 生长培养基换成 RPMI1640 生长培养基，得到CD163Mut/Mut PAMs （CD163 PAMs）和 WT PAMs。

2、攻毒

上述1获得的各种 PAMs 用含体积百分含量 10 % FBS 和 4 ×双抗的 RPMI1640 培养液进行培养。细胞贴壁后可以观察到细胞形态呈圆形, 部分细胞还可观察到伪足；

本研究选择了国内PRRSV 高致病性毒株HP-PRRSV strain-JXwn06（Gene-editedpigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus）和国外PRRSV 高致病性毒株typeII:NVSL97-7895（Gene-edited pigs are protectedfrom porcine reproductive and respiratory syndrome virus）进行体外感染CD163Mut/Mut PAMs 和 WT PAMs 攻毒试验, 前者称为实验组, 后者称为对照组。两组除了所用的 PAMs 来源不同外, 其它所有条件均相同。分别选择四个不同的攻毒剂量对两组细胞进行攻毒, 分别为 MOI = 0.005, MOI = 0.025, MOI = 0.1, MOI = 0.25。每组细胞在每个攻毒剂量下做三个重复平行实验, 同时也做不添加病毒的阴性对照。实验组和对照组细胞同时解冻，培养 24 h 后同时进行攻毒试验。感染后 36 h, 收集上清病毒液和细胞。

3、检测

上述2获得的细胞用 TRIzol （Invitrogen）裂解后, 用于提取总 RNA (QIAGENRNeasy Mini Kit 试剂盒)。利用Q-PCR 细胞中病毒 RNA 的相对表达量。

将上述获得的RNA反转录（Thermo）得到cDNA作为模板, 利用荧光定量PCR对收集的细胞中病毒 RNA 的相对表达量进行了检测。以 猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV 的ORF7 为检测的目的序列, 上游引物为 ORF7-F (5’AATAACAACGGCAAGCAGCA3’), 下游引物为 ORF7-R (5’ GCACAGTATGATGCGTCGGC3’), 以猪 GAPDH-F (5’GTCGGTTGTGGATCTGACCT3’), GAPDH-R (5’GTCCTCAGTGTAGCCCAGGA3’)为内参引物。Q-PCR反应体系为如下表7所示：

表7为Q-PCR反应体系

体系	20 μL
		cDNA	1.0 μL
Forward primer (10 μM)	1.0 μL
		Reverse primer (10 μM)	1.0 μL
2 × SYBR green master mix（购自Roche）	10.0 μL
		DEPC 水	7.0 μL

反应程序如下：95°C, 10min; 95°C,15s,60°C,1min, 40cycles; 95°C,15s;60°C,15s;

结果如图5所示，国内PRRSV 高致病性毒株 HP-PRRSV strain-JXwn06 (A)和国外PRRSV 高致病性毒株NVSL97-7895 (B) 在四个攻毒剂量下, 两组 PAMs 之间病毒 RNA 相对表达量均差异显著。

4. TCID50 法测定病毒滴度

a. 选择经 24-48 h 培养后生长旺盛的1获得的各种 PAMs, 将其传代铺到 96孔细胞培养板中, 铺板前用细胞计数板计数, 使 96 孔板每个孔中约有细胞 2 × 10⁴个。然后放在细胞培养箱中培养 12-24 h, 待细胞长到 80-90%汇合度时准备接毒；

b. 准备 8 个 1.5 mL 离心管, 每管加入 900 μL DMEM 维持液培养基 (含 2%FBS 和 1%双抗), 分别取 100 μL 病毒原液（国内PRRSV 高致病性毒株HP-PRRSV strain-JXwn06和国外PRRSV 高致病性毒株typeII:NVSL97-7895）作 10 倍梯度稀释 (从 10^-1 稀释到 10^-8 )；

c. 将 96 孔板中的培养液吸弃, 用 PBS 洗一遍, 然后接种。从稀释倍数最高的病毒液开始, 由高到低接种病毒, 每个梯度的病毒接种 8 个孔。同时至少设置 5 个孔的细胞只加维持培养基, 不加病毒液, 作为不感染病毒的阴性对照；

d. 将培养板放在 37°C、5% CO2 培养箱中培养, 每日观察细胞病变状态并做记录, 一般这个过程需要 4-5 天；

e. 4-5 天后统计每个梯度的细胞病变的孔数, 计算 TCID50。

结果如图6所示，国内PRRSV 高致病性毒株 HP-PRRSV strain-JXwn06 (A)和国外PRRSV 高致病性毒株NVSL97-7895 (B)在四个攻毒剂量下, 两组 PAMs 上清液中病毒滴度均达到极显著差异 (P ＜ 0.001)。以上结果说明, CD163 基因改造猪 PAMs 在不同攻毒剂量下均具有很强的抵抗 PRRSV 病毒的能力。

因此，上述方法证明，本发明获得的CD163双等位基因敲除猪具有抗PRRSV 病毒的能力，表明本发明制备CD163双等位基因敲除猪方法可以得到抗PRRSV 病毒的猪，得到的CD163双等位基因敲除猪可以作为抗病猪进行扩繁，也可以采用该CD163双等位基因敲除猪的耳样的体细胞进行体细胞核移植扩繁抗病猪，也可以采用双等位基因C-T突变型成纤维细胞进行体细胞核移植扩繁抗病猪。

序列表

<110> 北京首农未来生物科技有限公司

<120> 一种利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163基因编辑猪的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32457

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

attcttagtg gttctcttct tcaggagaac atttctaggt aataatacaa gaagatttaa 60

atggcataaa accttggaat ggacaaactc agaatggtgc tacatgaaaa ctctggatct 120

gcaggtaaaa tcttctcatt tattctatat ttacctttta atagagtgta gcaatattcc 180

gacagtcaat caatctgatt taatagtgat tggcatctgg agaagaagta acagggaaaa 240

ggcaataagc ttataagggg aacttttatc ttccatagaa tcaaaattga agacgtgact 300

agaagaagga ttagatttgg catcagtttt gtaaaattgc tgaggtgaaa ttaagtaagg 360

gatgaaaatt aactaaattg tgttgagtat gaaactagta gttgttagaa aagatagaac 420

atgaaggaat gaatattgat tgaaagttga tgacctagag gacatttaga ctaacacctc 480

tgagtgtcaa agtctaattt atgatttaca tcgatgcgtt aaactcattt aacattctta 540

cttttttccc ctcaagcatt taagctgaag tataacattt cacatgaaag cctggattat 600

aaatgcacag ttcagtgacc tatctcagag gagtgactgc catagcattt tttttgtctt 660

tttgccttca gagccacagc aacgcgggat ccgaagccgc gtctgcgacc cacaccacag 720

ctcacggcaa tgccggatct ttaacccact gagcgaggcc ggggatcgaa cccgcagtct 780

catggttcct agtaggattc gttaaccact gcgccacgac gggaactcct accatagcat 840

ttttactttt aagttactgt tggtttagag taagaaggag aaatgagagt gatggagcgt 900

ttgctatatt tggagacaag gtcctatatt ggaggttctc aaatataaat tttgtcgctt 960

tttcctccaa tgtattgttc aactactatt tagcaggcca ctgtgccagg tactggtgaa 1020

actggtgaac atgatagatg taattcattc cctcatggaa ctttccatct aacaatgtgg 1080

atcaggtagg cttggagatg agaatgccag tggttgacta tgactctgtg gctgaaggga 1140

gagctactca cttcgtagtt tcatcaatgt ctttttggtt ttccaggttt taagccctgc 1200

tcttgcaatt cttttccctt ctccaacttt cttctaattt ctcaccccta ggatgcctat 1260

aaacatgagt attttcaaag ctacttcact gaggttatat gatcctcgtg tgaatttttc 1320

ctgcctgcct tgccatttag aaggaagtgt ttcctggaat ttccattgtg gcttggtggt 1380

taaagaccct gcattgtctc tgtgaggatg tgggttcaat ctctggcctc attcagtgag 1440

tgggttaagg atctggtgtc gctgcaagct gtggctaaga tcccacattg ccatggctgt 1500

ggtgtagact ggcacctgga gctctgattt gaccacaatc ctaggaactt cagatgttgc 1560

cataaaaaga aaaaaaaagt taggaagggt tttctgtctt gttttgacct ttgttaatct 1620

caaacctttg gaaccatctc tcctccaaaa cctcctttgg gtaagactgt atgtttgccc 1680

tctctcttct tttcgcagac tttagaagat gttctgccca tttaagttcc ttcacttttg 1740

ctgtagtcgc tgttctcagt gcctgcttgg tcactagttc tcttggtgag tactttgaca 1800

aatttacttg taacctagcc cactgtgaca agaaacactg aaaagcaaat aattctcctg 1860

aagtctagat agcatctaaa aacatgcttc atggtttcaa aggatcagat attaaaaacc 1920

ccaaataggt acagaaccat gtggctctct ccccccaaac aaataaaacg ttagcatggt 1980

tttcaaaaaa ataaaataac cttcacagga aaaatggatt ttacttaaga tttgaaataa 2040

tatctaacta aaaaataggg aataatgcag aagaggagaa acctcagaat tgttgggatg 2100

aaggaatttt tagtaacact aaaaattcaa gtgccaaaat ttgtctaaaa ttgtattcag 2160

ggaagccaga tatatatcag tgaaatcgcc agttcctata ttagctaaaa taatcacaag 2220

gctgtagcag agacagttca gagagaggtg gagatgagat tttttttttt taagtataat 2280

tgatttacaa tgttgtggca atttctgttg tatagcaaga gatagaatta ttttatggtg 2340

gaagataata gaaaaatata tccatatcaa tttccatttg agtagataaa tttcaattag 2400

agttcaacta gcaattagta gttttgcata catggtgaaa tatattcatg gtattttgca 2460

tatatgtgtg aaataggtac taaattcctc ataactgttc tttttagtct caccatcagc 2520

ctctactgat cttaggattt tggagaaaca tacatagttc atccctataa aatgccataa 2580

aatctcattt ttacattaaa ccatccaaga gattatataa attgacctta taaagaatat 2640

cagccataaa ataaaggtat catagtatgg gattatttag ctttattggt tctatgtcac 2700

tgcttaattt gaaacctgtg atattgctgt ttgtttttga actcctatga aataacattc 2760

tcccattgta ccatggatgg gtccagaaac atttctcaaa tctggctttg aaaaataaat 2820

aagtaatcta aagaataata attctctact tgctctttga atcttgacca attgctgcat 2880

ttacctattg ttacaggagg aaaagacaag gagctgaggc taacgggtgg tgaaaacaag 2940

tgctctggaa gagtggaggt gaaagtgcag gaggagtggg gaactgtgtg taataatggc 3000

tgggacatgg atgtggtctc tgttgtttgt aggcagctgg gatgtccaac tgctatcaaa 3060

gccactggat gggctaattt tagtgcaggt tctggacgca tttggatgga tcatgtttct 3120

tgtcgaggga atgagtcagc tctctgggac tgcaaacatg atggatgggg aaagcataac 3180

tgtactcacc aacaggatgc tggagtaacc tgctcaggta agacatacac aaataagtca 3240

agcctataca tgaaatgctt tgtgggaaaa aatgtataga tgagttaaaa acaaaaagga 3300

accagttttc tataagtcat ctagtccatg tataaaatta cccaatccat tactaaaaga 3360

ccacttctgg tattttacac atgacaaagc ccatattaaa aaaaaaaaat tcagaagaga 3420

ttctgaatgc tataataaat gagcaagtga ctagcttcaa ttttatatta ggtcattcta 3480

ccttctactt ctacatgaaa atatcataat gtctaagtta attccttgtc ccctttccca 3540

ataaagcact gctttcatgc actggcctat gaatcatgaa ctttttgccc tttaactgat 3600

gatcaactta ccaaatcaag aaataaatat tcttagcact gatccttttt tgttgttgtt 3660

ggaggaagaa tgttttgcaa agtagaattg cttttttctg tttaacagtg ctattcattt 3720

catttacatg gtcgttttaa tttataaaac atttcataag tttcacctca tatgccctta 3780

caataactca ggaagttata tgttagacct ttctgctgac aaatcccaga gtcatgtttc 3840

tgacccagtt cagattcctt ggcttcccat ttctctttgc tcatgtcatt gacctttatg 3900

cagccctctt acctcccacc tttctattac agaccatctc ctccatagga ctggtgttag 3960

aaagtactaa tctctaccca ggcattgtgg tgcaatgtgg gcagcacagg ctggtatcta 4020

gaaaaatgct gaagtgaatt ccagctcagc tgctcgttaa tactattgtt ttaagtaagc 4080

tgttcaatcc tttgaaattc actttctgag cactcagtga tataataaat gtagagttac 4140

tggtacactg tctggtatgt aataggtgtt aaaaattaac cttagtttcc tcatgggtca 4200

ctgcttctca ttacctagac aactcatttc tctttcttcc tctttctctt tctccattct 4260

cctcctcctt cttcctcttc ttcttgtctt ttattgttat tcattttgct gagaaagtta 4320

agaaataaca actctaacct ctacatcgac cacctagagc aaagttaaaa ataataataa 4380

accttgccag actcttacta taattgttgc tgtctataga gttgactgtt taagttaaga 4440

catcagtata gtatttttaa tttttgtgtt ttttttttca tacttttaca tgaggatcct 4500

ttatataagg atgagttaaa caaacttgat ttttgaagtt tatacccctg aggctcaact 4560

gcataataat agaaagggat ccatagcctc tcaaggactt aactagtttc atgagttttc 4620

agaatctgaa tttctgagat tctccacccc aattaaagct caagcctcag aacatatatc 4680

cttctcttgg taaattctat tcttatcaca tgcgtaataa taaaaaagag agatgttgga 4740

gacagatttt tttcctcaca ttctgtctct actgttttct aggtgtttga ttctgtgtta 4800

tttaacctca gtttgcttat ctgtgaagta gggattatgg taataacata taatgcttaa 4860

tgttgtaaag actaaagaag atagcatatg taacacattt ggaacaggga atgcatattt 4920

tgattgtgag ctcttattat tattaccaat cagccataat aaaaatcttg ttaagtggag 4980

gtctttggat ttcagagctt ttaaaatcta attacttttt caaaaaagag cttcttagtg 5040

tttttttttt ttaaccacaa agtgtttcta ttttttaggt gtcccaaaat ttcattccaa 5100

atatcttttt ctcagatatt ttagtcctca tagaacacct agggatagtg tatagagaaa 5160

attttcttta ttaaaaagct gttctttgct aaaaattgta gcaggtactt ttgggagggg 5220

ggaaaacttt gattcagaaa ctgctaagac atggagtgtt ttgactaatt tttcctcaat 5280

ttttaatgtt ttttatacca tagggtactt ttgcaaacta ttatgcatac ttatatattt 5340

ttactttttt cctgtctttt aacttccaaa ttcaacttca gacaattatt catgcactaa 5400

actgttgtag taagaaagat taaaattaaa aaattaacca ttcaacaaat gactggtttg 5460

ccatttttac tactttgttg tatgaacaat ttttttttct acaaatgaat actttgagtc 5520

tgatttatcc attcctacat aaaagttttt actatatctt agtattggaa ggaaacaaaa 5580

caaaacacaa tgtaaatttt aatctataaa ttttgggggg gggtaaatat acatagatga 5640

aagtcttaac cattaattag agtcaaaaga ttaaaattct ccaatatgtg aacttaggct 5700

gcatccaaaa tgaagcatca tttttaagga cagcatcaaa agtgaccaga ggaattttac 5760

tttctttctt tttttttttt ttttgaattt tagtttctaa actcacttct gaataaatac 5820

aacttctaaa ttctcgtctt ttctctactc tagatggatc tgatttagag atgaggctgg 5880

tgaatggagg aaaccggtgc ttaggaagaa tagaagtcaa atttcaagga cggtggggaa 5940

cagtgtgtga tgataacttc aacataaatc atgcttctgt ggtttgtaaa caacttgaat 6000

gtggaagtgc tgtcagtttc tctggttcag ctaattttgg agaaggttct ggaccaatct 6060

ggtttgatga tcttgtatgc aatggaaatg agtcagctct ctggaactgc aaacatgaag 6120

gatggggaaa gcacaattgc gatcatgctg aggatgctgg agtgatttgc ttaagtaagg 6180

actgacctgg gtttgttctg ttctccatga gagggcaaaa aaaggggagt aaaagtctta 6240

aaagctcaaa ctgttaaaaa cataatgatg attgcttctt ttatcatctt attattatct 6300

aatttcaggt cgaaattcta gtacctgtgc agttttttac cttaactgaa attaagataa 6360

ataggatagg gaggaaggat gagcagtgac atttaggtcc aagtcatgag gttagaagga 6420

aatgttcaga gaatagccca ttccctcagc cctcaaagaa agaaagaaag aaaaagaaaa 6480

aaaaaaagaa agcttaacta gaaaattttg ttctctggat gttttagagg caaaccatcc 6540

cttttatcat tccttaccta caaagccctt ctctttaatc acattgaccc accctttcct 6600

aaactattag ttcaaattca cataattgaa tgcttttaaa acttggtttc ctcttataat 6660

tatatttatg ttgtaaggag gcactgtgtc ttgtctagag actttcatgt tctatgcttg 6720

attatgggac agggacatgg ctttgtctgc tccaggatgt cactctcctt ttttcacttg 6780

agctcctagt ttgaagaaga cctagtaagt cttgaactcc agggagtctt taggaaacta 6840

tccctagagc aaaactgtcc ctgaattcac ccagtgtctt tttttttttt ttcaaatgaa 6900

ggaactttag ttcaaactaa atttaaaata agggaattct aattcagaat actgggaaat 6960

ccaggagatt acaattggct tcatgtgtga ttggattcag cacttcacca atgtcatcag 7020

ggttctggtt ctttttttat ttcttgaatt ggcttttttt tttttttcct tgttgaacaa 7080

tatgactatc tatactttga accacaaaga aagtgattcc tacagaaaag acagaatgtg 7140

ttagctgaag gaagggaatg ggacttgggg tagaaaaaaa caccttccgt attccttaac 7200

ctatcaaaaa tttctaggta cccctaacta aaatcctaat tcaagcatat tggaggaact 7260

tgacaaatcc aggaataata ttatccgtta tcaaatacat gcacatcatt tacatttctc 7320

catgtctctg ctcatgcagt tcccggccct aactctacca aagtattact ctccatctcc 7380

ctcttttttt ttttaatgat ttttattttt tctgttatga ctggtttaca gtgttctgtc 7440

aattttctac tgtacagcaa agtgacccag tcacacattc atatatacat tctttttctc 7500

acattatcct ccatcaggct ccatcacaag tgactagaca tagttcccag agctatgcag 7560

caggatctca ttgctgctcc attccaaagg caacagttca catctattaa ccccagattc 7620

ccagtccacc ccactccctt cccctccctc ttggcaacca caagtctgtt ctccaagttc 7680

atgagtttat tttctgtgga aagttttatt tgtgcagtat gttagattcc agatataagt 7740

gctatcatat ggtatttgtc cttctctttc tgactgactt cacaaagtat gagagtctct 7800

agttccatcc atgttactgc aaatggcatt attaatctcc atcttttttt gttcatgtat 7860

atgttaccca gattccttga cttttctaca tcatcaagat attgttgatc acttctttgt 7920

agtgatttct gcccttctct gatgtcctgt gacactagtc tggattattc atttacctga 7980

aaccacatgt ctcttataat gtgtatccca aattaaatat gtctattgta atgtgtatcc 8040

caaattaaat atttatcttt ctaaaaaaaa aaatttctag gcccccaatc agcatgtttc 8100

ttctcagtgt gttttataca tgctgcagaa tcataataga cagcataata gacagcataa 8160

caaaaactaa aaatgccagg ggaaaaaagc aatttactga ttacaacata ttactcagaa 8220

tcaagttctg ttctttgagg aatattgatt gggggaaaat gaaaataatg atggggaggt 8280

cccttttctc tttgctttgc ttttaaacta cggaagtagt cagaaagggg tcaggaatgt 8340

aatataaacc aggtagtcct ggtaggtaac gcagccggag gcaaaagtga gtgttgagta 8400

ttgaggcaaa ctggagggca tggataccac ctagacagat gcaaatatat atttaacagg 8460

gaaaaaagaa ccaaacaatt tcaacaaaaa accaaacaat tccaacaaaa ttggtccaat 8520

aagcaaacct ctagataaat ttcagtccct ggatgttttg ttaggaactc ttcctacaat 8580

gcgtgctttc cattctgaaa agtcctatct acttgcctga tccacttctc cttccatcct 8640

aaacgatttt cagtggtagt atattactgt tgtctctgtc tctacttata tatcttcccc 8700

ttttcactca ctcctctcag gtacagctct tcagtttgcc cttattcttg tttccttgtc 8760

aatgacttgt tttgtgtccc tcttacagat ggagcagacc tgaaactgag agtggtagat 8820

ggagtcactg aatgttcagg aagattggaa gtgaaattcc aaggagaatg gggaacaatc 8880

tgtgatgatg gctgggatag tgatgatgcc gctgtggcat gtaagcaact gggatgtcca 8940

actgctgtca ctgccattgg tcgagttaac gccagtgagg gaactggaca catttggctt 9000

gacagtgttt cttgccatgg acacgagtct gctctctggc agtgtagaca ccatgaatgg 9060

ggaaagcatt attgcaatca taatgaagat gctggtgtga catgttctgg taagtgaaaa 9120

caaaacaccg gaaggacctg tgttcttcag gattaggaat ggatatgaga taggagaaaa 9180

attgtatcta atattttctt tgttgggaat tcttttacag ttgtgacaaa tctttaacat 9240

attcttcatt tgagtagttt ggagggttgt ctgactgttt tctataataa atgtcccaag 9300

tgctatgagg taccacattt caaattctaa ttctacctga agctccaaaa agacaaaatg 9360

ttataggtct tttctttata tctaatttgc ttatggtttt tagccattga caattttttt 9420

tttcttaact cttgaaacta taatcctatt tctaaccaaa ttcatgttct atactggctc 9480

ttcaaaaacc caggagatgg gaaagccaga atctccagtg tttcagcttc tgggaaggag 9540

caagttttta aatgtgggag ctaaattcca catgtatcta tggcctaagt gtatgtttat 9600

tttgcagatg gatcagatct ggaactgaga cttaaaggtg gaggcagcca ctgtgctggg 9660

acagtggagg tggaaattca gaaactggta ggaaaagtgt gtgatagaag ctggggactg 9720

aaagaagctg atgtggtttg caggcagctg ggatgtggat ctgcactcaa aacatcatat 9780

caagtttatt ccaaaaccaa ggcaacaaac acatggctgt ttgtaagcag ctgtaatgga 9840

aatgaaactt ctctttggga ctgcaagaat tggcagtggg gtggacttag ttgtgatcac 9900

tatgacgaag ccaaaattac ctgctcaggt aagaatttca atcaatgtgt taggaaattg 9960

cattctactt tcttttacat gtagctgtcc agttttccca gcaccacttg ttgaagagac 10020

tgtcttttct tcatcatata gtcctacatc ctttgtcata aattaattga ccataggtgt 10080

gtgggtttat atctgggctc tctattctgt tcctttgatc tatgtgtctg tttttatgcc 10140

agcaccatgc tgttttgatt actatagctt tgtagtatca tctgaagtca ggaaacatga 10200

ttcctccagc tttgttcttc tttctcaaga ttgttttgtc tattcagagt tttatgttcc 10260

tatgcagatt ttatttttat ttttatttta tttttatttt ttttattttc ccactgtacg 10320

gcaagggggt caggttatcc ttacatgtat acattacaat tacagttttt cccccaccct 10380

ttcttctgtt gcaacatcaa gggcagggac cgaacccgca acctcatggt tcctagtcgg 10440

attcgttaac cactgcgcca tgacgggaac tccctattat ttttattttc taatttgttc 10500

atgtggtgta tcacactgat ttatttgcag atgtgcatcc attcatgtat cccacttgat 10560

cgtggtgtgt aatcttttta gtgtattagt gaatttggtt gctagtattt tgtttgagga 10620

tttttgcata tacattcatc agcggtattg gattttaaat cttttgtatg tgtcttgttt 10680

tggtatcagg gtatcctcta gggtatcctc ctagaatgag ttcagaaggg tacatttctt 10740

tggggaatat atttggtaga attcactttt gaagctgtct ggtcctgttc ttttgtttgt 10800

cgggaagttc tttttaaatt attattatta ctgattcaat ttcattactg gtaattggac 10860

catttatatt ttcttttttt tcctggttca atcttgggag attgtatgtt ttaaaaattt 10920

gtccagttct tctaggttgt tcattttatt ggaatgtaat tgtttgttta tctttttttt 10980

tgcattttct agggccgcac ccatggcata tggaagttcc caggctaggg gtctaatcgg 11040

aactgtagcc actggcctac cccagagcca cagcaacgtg ggatctgagc cgcatcttcg 11100

acctatacca cagctcacaa caatgcggga tccttaaccc actgagcaag gccagggatt 11160

gaacctgcaa cctcatggtt cctagttgga ttagttaacc actgagccac gacgggaact 11220

ccaatggtat gtaattgttt atagtgatct cttatgagtc tttatttttc tgtagtaatc 11280

ataacttctc ttatttcatt ttgatcttat tgacttgagc cctctgtttt tttcttagtg 11340

actctagcta aaggtttatc aattttgttc atttttttca aggatctggc tcttaatttc 11400

attcaacttt tctatttatt ttagtctcta tttcatttac ttctgttcag atttttatga 11460

tttctttctt tctactaagt tcagttttgg tttgttcttt tctatttcct ttaagtgtaa 11520

ggttatgttg tttatttgag atttttgttt cttgaggaaa caggcttgca tatttgtaaa 11580

cttccctctt agaatagttt ttcttaagtt ccatagtttt ttttttttat tttgtggttt 11640

ttatttttcc attatagttc atttacagtg ttctgccaat tcctactata tagcaaagtg 11700

acccagtcat atatatatat atatatatat atatatatat atgtatatat gtatatatac 11760

acatacatat acacattatc ctccatcatg ttccatcaca agtgactgga tacagttccc 11820

tgtgctatat agcaggatct cattgcttat ccactccaaa tgtaatagtt tgcatctatt 11880

aaccccagat gtcccataga tttggaattg tgtttttgtt ttcattcgta ttcaggtttt 11940

ttttaatttc ctctttgatt tcttcagtaa tccatttgtt gcttagtaat atattgttta 12000

gcctctgcgt gtttgtggtt tgttgcaatt ttcttcttgt agttgatttc tagtctcttt 12060

gtgttgtagt tggaaaagat gtatgatatg atttcaactt tcctaaattt accaaggctt 12120

gttttgtggc ctagcatgtg atatatcctg aagaatgttc catgtgcaca tgaaaaaaat 12180

gaatattctg ctgctttcaa atggaatgct ctctctattt caattatgtc catctctaat 12240

gttttgggaa catgttcttt tgctacctca ttttgcctaa tttgctgttt tgggttctaa 12300

atatctggta ggttggttac attttccaac cttggacaaa taaccttttg ttgaaacatc 12360

ctgtgcttcc cagcagcact ctcctctctg gtcaccagag ctatatgttc caggggtgcc 12420

cccctatgct gactttgtga gaacttcttt tgcagttggc tgactactgt aggtggtctt 12480

gtaggcatgg ctggccccca gtctggttgt ttgcaagaag ctgccttgta caaaggctgc 12540

cagtcacttg ttggtgggac tgggtcatgg ggtggctggc tatagagacc agggttgtct 12600

caggggtagt gctgtctcat ttgtgggttt agccacgttt tgcagtgggt gattgtggtt 12660

ccagggttcc tagatctagt gtcagcttgt gggtactggg gtccccagct gcagggccta 12720

ggagcttcag agctagagct aacctcctgg tgggtagact gtgtcctgac aaggcaggtt 12780

gtagtgttac agtgatcctg gggctagtat ctatccactg gggggtaaga cttgtcccag 12840

ggctagcacc agctctctgg tgggtagatc taggtcctgg aggttctggc tgcagggcca 12900

gggatccagg agctggtgtt gactggttgg tggacagggc caaggcccag agtgtcccca 12960

ggctagatct acttcagtga tgggtggatc taggtcctgt atttctggct acagggctct 13020

gggatcccag agttggtatg tcagtcaact gacatacagg gctggaggca gagagtcctg 13080

aggctggtgc ctgcccactg gtgggtggag ctgggattca gggtctctga ctgaagtgcc 13140

ctggggatcc ctgggctagt gctggcccac tggtgtgtgt ttggttgggt cctggccatt 13200

ctggtagaca gggccatatt cccatattcc agggtggctg taggctcagg gaatctcaag 13260

gcaacctact gctggttaga ggagtgtgtg gggaggtgct atgtccctgt ccagtttgtt 13320

gcttggcatg aagcatccca gtactggtgc caacaggcta attagtgggt ctgggtcctg 13380

gtgctaataa gctagaggga agattcaaaa atgacatttt tttaacacca gtgtccttgt 13440

ggtaaaatga actccccaga atggctacca ccagtgtcta tgtccccatg gtgaattcta 13500

attgctcctg tctcttgaag tggctctcca agatcaacag gtgggtctga tctaagctcc 13560

tttcaaatta ctgcttctgc cctgggtccc agaacatgtg agattttgtg tgtcctttaa 13620

gagtggagtc tctatttccc actgctctct ggttctcccc aaagtaagcc ctgctggctt 13680

tcaaaacttc tgggagcttg ccttcttggt ataggactcc tgggctaggg agtctaatgt 13740

ttggcttaga ccccttactg cttgggaaga atctctgcaa ctgtaatgaa ttatcttcct 13800

atttgtgggt tgctgaggat atggtcttaa ctgttctgtg ttctacccct cctatccatc 13860

ttgttgtggt tccttcttta tatctttagt tgtagaaaag tttttcttat caacagttgc 13920

tctgtaaatt gtaacttggg tgtacaccta gtaggaggtg agctcagggt cttcctactc 13980

tgccatcttg gccatgtcct ctaaacattt tggtgtattt cactgcaacc tttttaaaaa 14040

tctcaaaagt gagctgtgat tggctagtct tgtggataat ctctagcatt tgatgctaat 14100

catatttata caaatacttt gttgaaaagt gatgcctttt taactattat taaaaaacgt 14160

attgacataa ctattgctat tatactgaaa agaaagacct tagagaaaat agcataagag 14220

caaaaccatt aaacatggag acatctagtc atagggtgga aattttatgt ggtgcatatc 14280

ccctaaccag tggctttaca ccaggcacat cctaactaag atctgctccc aagtgtcttc 14340

cctgatgctt taaattgtgt tacatggaaa ctatcctttg atgaagaaat gcaacctttt 14400

aaaatacaac attgaaactt ttgtgcttta attttgcttt tcaacatttt ttctttttaa 14460

aagaagaaat ttatttgttt ttttaaattt taatggccac ggcatatgga agttctcagg 14520

ccagggatag aattcaagcc acaggtgcga cccatgccac aactgctgca acaccagatc 14580

ctttaaccca ctgcaccagg ccagggattg aagccttgcc ttactgacaa tctgagccac 14640

ttcagtcaga taaagaaatt tcttcattaa gcagagtatt cacatggttt aaacttcaaa 14700

atattaaagt gtaaactctt tccccaccac tgtccccagc tcaccaactc tacttaccac 14760

agacaactga tgtggttagg gtatttaaat agtaaatcca agaaaatata aacaaatccg 14820

tatatatagg tttcacccca ttttattatc ctaatgttgc atatcatata aactatactg 14880

tcccttgggt attcacttag taaaatattt tgatcataat ttcctatcag tatttaaaga 14940

gctttctgaa attatttctg tataacattt cttttctcat catctattat gtgcatttat 15000

ttatatttta acttctttta ttagatgaaa ttatcttctg cttcagcttt tttttttttt 15060

taagaacaca cagttgggtt ttttaaggtt aataccacct ttgttttcta agtcattaaa 15120

tttgtttttc tattaattca cttctgattc tttgaagttt gatttctttt tagcttttaa 15180

cttcttgagt tgtatgctta attaattttg attctttcct atttattaat atacatattt 15240

gaagctatag gttttccact gagtatacca gtagctatat cgtataattg atgaactgat 15300

cctctgtgag tctgggacat aaacgtccta tgactgttat gtggtagctg tgaattgctc 15360

tttttagatt ataaagttct catcttttat agttgaacaa tttttgtcct gaatcaaatt 15420

tgttggatat taatatcaca tctattgctt tatttatttt ctattctcac ttttaacctc 15480

tgtgaataat ttcactctag gtgcctcact tttttcataa tagaattggg atttattttt 15540

aaaaggactc tgattaagta attttctttt tctgatatgg gagatatatt tgaccttaac 15600

ttagtcacat tatgcattgt tctcttgtca tgttatgtat acataacatt tattgtcatt 15660

atggtacaac taaaaacata tttcactctg tgacctttat ggggactcag catttgttta 15720

ggaatgtgga agtatatttg tatatctgat aatttccttc caaatttaaa aaggtttgta 15780

tattttcata ttaacatatt tcatattaat tagcatgaat ttcagctgca ttaaaaggaa 15840

aaccacctga gtggtaaaga aaaagttttt ttttctcttt tttttttttt tttttttaat 15900

ggccacatct gtggcatgtg aagttcccag gctaggggtc gaataggagc tacagctgcc 15960

agcttgcacc acagccacaa caatgccaga gccaagcctc atctgcgacc tataccacaa 16020

ctcatggcaa tgctggttcc ttaaccccct gagtgaggcc tggggtcaaa cccacatcct 16080

catggatact aaccggcttt gttaccgctg agccatgagg gaaactccct ttttctcatt 16140

gaaaataagt caaatagata agcagcttaa ggctgtttgg gtgattctgt ggtccagtaa 16200

ttatcaaatc ctactggaca agaatagaga atgtgcaaat gagggaacgt gttggtgaga 16260

tcaggctctg cccactgagc tatcctctgt catgggccct gtgctgttct cagagctgta 16320

cttcctaggg cattgttctc atttcaattc tgagttcagt gtggagagta tacgtgtgtg 16380

ggggctgcac gcttttcaca acccactttc tgctgatact gatttaggga tccttggatt 16440

gctttacagt tgagtcatca ttaactagtg tcacttgcct tcaaagtcag caaaataatt 16500

gtctccaaac tagtaggctt ctagtgtatt tgctttaatc caatgccatg tgaaagtaac 16560

atggtcaaag aataagttat ataccttgac ctaccctgtg accaggctct tcctcttaat 16620

ttattgacca ctgccttaag gtcatttgaa accatgggtt tgggaggaag gcaaggccta 16680

aatcccgtct ttgttggaag gctcactgtc cttgtcttta gagcatcatt tttttttaaa 16740

ctggggtaca gtttatttac agtgttgtgt caatttctgc tgtacagcat agtgacccag 16800

tcatacacat acatacattc tttttctcat actatcttca attttatttt gtgctaagtc 16860

tgccatttta tcatcacctc agtttgaagg acaggatatt tagagtttgt tttttttttc 16920

cccccaatcc tgcaatttct aaattataag actctcaatt agccgtatat aacagctgca 16980

ggcacaggat gtctccctca caaaattggt atttttcctt ccatttcttc ttgcagtttg 17040

gctatttctt gtctgagttc atctctcttt ttaagtgtta aaaagggcaa ggaggattca 17100

tgctatgtca acattatgat tttttctttt ctatacttga taagagtata cttttcccaa 17160

atgtcatcca acttttcagc atcagtttgg acatggtttt cttttcaagg tggtatttct 17220

ctaatgtcac ttgaataaca agactcgtta gttctccagg ctacaatatc ctagtctgag 17280

tatattctgc atgttaattc tattcagcca catccataat ttaggtttta ttcctggaac 17340

acctcacttt tttttttttt tttggtcttt ttatagccat aaccatggca tatggaggtt 17400

cccaggctag gggtctaatc tgagctttag ccactggccc atgccacagc cacagccatg 17460

ccacatctga gccacatctg tgaccttttc cacagctcac agaaacacca gatccctaac 17520

ccactgagtg aggccagggg tcaaacctgt aacctcatgg ttcctagtca gattcgtttc 17580

ctctgtacca cgatgggaat tcctaatacc tcacttatga taacacattc tgaattattt 17640

aggattctat tatactgcat gtaatagaaa tcccaaatag caaaatttgc aacttaaggc 17700

aggttcctgt ctttacaaaa tcatgttttc ctttgctata tgtgcacttt gctttcctct 17760

gtgaattccc ttttttgtta tatttctata gcttttggaa acacttttac ttatttgggg 17820

gggcctagat ttttaaccct ctccttgttt ttctagaaat agagtttata attttatttc 17880

ttcatttact tgatactttc aagagatttc caggaaaaaa attatggaaa tactgtctct 17940

gtgcctgcca agttcaaact aagaattgta taatctgttt taattcttaa gcatttatag 18000

atgacaaggc tttgtgtctg ataggggcca gcgaactcag taaagaggga agatgagaaa 18060

gataatggca agaatttatc cctgaagtgt agttttgaca aaccagtcac aaagaggtct 18120

aagaaatttt ggtcacaaag ttgttttgaa tcccaggcat tttatttgca atgattgcat 18180

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attaattatt tcttatattt gttcttcata tattcatttc tatagaaaga aataaataca 18720

gattcagtta atgatggcag gtaaaagctt aacttattaa tcaaaggagt taatccaggc 18780

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gagagtatat atatatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 19020

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caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 19680

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cactaaatct gcctctagga acatacctct gctaggttgc aagaaatatc ccattcccca 28800

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tctaaagata ttacaggaag ttcctgctgc ggctcagtgg gttaaggact tgatgtcttt 29520

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gaaaaggtag tggagttcct gttgtggctc agtggttaat gaaccctgct aggaaccatg 30360

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atctcaaaca tatggatact attctgatgt aataaataat gattaaattt tttccctaaa 31980

gagtaatcac tactgaatcg ttgcctcaga atcatatgga ggtgctttta aaaaaggcat 32040

ttctgcactg atgttctctg gaatagaagt aattcttatg tacactgaag tttgaaaatc 32100

attgcattta agtgttctgt tcaggaaagt agtgtgcttt ttaatatttg tgagtgaatg 32160

agtaacacaa tacattatat cacattttaa tgtaattcta cacatgtgca tatgaagaga 32220

aaagtaacat ttttttctat ttatgtcttt agttcagcct ttaagatacc ttgatgaaga 32280

cctggactat tgaatgagca agaatctgcc tcttacactg aagattacaa tacagtcctc 32340

tgtctcctgg tattccaaag actgctgctg aatttctaaa gaatagattg gtgaatgtga 32400

ctactcaaag ttgtatgtaa gactttcaag ggcattaaat aaaaaagaat attgctg 32457

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaggaaaaga caaggagctg aggctaacgg gtggtgaaaa caagtgctct ggaagagtgg 60

aggtgaaagt gcaggaggag tggggaactg tgtgtaataa tggctgggac atggatgtgg 120

tctctgttgt ttgtaggcag ctgggatgtc caactgctat caaagccact ggatgggcta 180

attttagtgc aggttctgga cgcatttgga tggatcatgt ttcttgtcga gggaatgagt 240

cagctctctg ggactgcaaa catgatggat ggggaaagca taactgtact caccaacagg 300

atgctggagt aacctgctca g 321

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ttgtcgaggg aatgagtcag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tccccatcca tcatgtttgc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gcagtcccag agagctgact gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

<210> 6

<211> 5542

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ttaatacgac tcactatagc caaagaagaa gcggaaagtc tcctcagaga ctgggcctgt 60

cgccgtcgat ccaaccctgc gccgccggat tgaacctcac gagtttgaag tgttctttga 120

cccccgggag ctgagaaagg agacatgcct gctgtacgag atcaactggg gaggcaggca 180

ctccatctgg aggcacacct ctcagaacac aaataagcac gtggaggtga acttcatcga 240

gaagtttacc acagagcggt acttctgccc caataccaga tgtagcatca catggtttct 300

gagctggtcc ccttgcggag agtgtagcag ggccatcacc gagttcctgt ccagatatcc 360

acacgtgaca ctgtttatct acatcgccag gctgtatcac cacgcagacc caaggaatag 420

gcagggcctg cgcgatctga tcagctccgg cgtgaccatc cagatcatga cagagcagga 480

gtccggctac tgctggcgga acttcgtgaa ttattctcct agcaacgagg cccactggcc 540

taggtaccca cacctgtggg tgcgcctgta cgtgctggag ctgtattgca tcatcctggg 600

cctgccccct tgtctgaata tcctgcggag aaagcagccc cagctgacct tctttacaat 660

cgccctgcag tcttgtcact atcagaggct gccaccccac atcctgtggg ccacaggcct 720

gaagtctgga ggatctagcg gaggatcctc tggcagcgag acaccaggaa caagcgagtc 780

agcaacacca gagagcagtg gcggcagcag cggcggcagc gacaagaagt acagcatcgg 840

cctggccatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 900

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 960

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgagaga acccggctga agagaaccgc 1020

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1080

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1140

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1200

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1260

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1320

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1380

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1440

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1500

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1560

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1620

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1680

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1740

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 1800

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 1860

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 1920

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 1980

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2040

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2100

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2160

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2220

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2280

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2340

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2400

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2460

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2520

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2580

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2640

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2700

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 2760

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 2820

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 2880

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 2940

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3000

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3060

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3120

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3180

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3240

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3300

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3360

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3420

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3480

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3540

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3600

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3660

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3720

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 3780

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 3840

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 3900

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 3960

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4020

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4080

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4140

gtctatcaga cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4200

taagaagtac ggcggcttcc tgtggcccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4260

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4320

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4380

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4440

cggccggaag agaatgctgg cctctgccaa gcagctgcag aagggaaacg aactggccct 4500

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4560

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4620

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4680

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4740

tatcatccac ctgtttaccc tgaccagact gggagcccct agagccttca agtactttga 4800

caccaccatc gaccccaagc agtacagaag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 4860

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggtga 4920

cagcggcggg agcggcggga gcggggggag cactaatctg agcgacatca ttgagaagga 4980

gactgggaaa cagctggtca ttcaggagtc catcctgatg ctgcctgagg aggtggagga 5040

agtgatcggc aacaagccag agtctgacat cctggtgcac accgcctacg acgagtccac 5100

agatgagaat gtgatgctgc tgacctctga cgcccccgag tataagcctt gggccctggt 5160

catccaggat tctaacggcg agaataagat caagatgctg agcggaggat ccggaggatc 5220

tggaggcagc accaacctgt ctgacatcat cgagaaggag acaggcaagc agctggtcat 5280

ccaggagagc atcctgatgc tgcccgaaga agtcgaagaa gtgatcggaa acaagcctga 5340

gagcgatatc ctggtccata ccgcctacga cgagagtacc gacgaaaatg tgatgctgct 5400

gacatccgac gccccagagt ataagccctg ggctctggtc atccaggatt ccaacggaga 5460

gaacaaaatc aaaatgctgt ctggcggctc aaaaagaacc gccgacggca gcgaattcga 5520

gcccaagaag aagaggaaag tc 5542

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ttaatacgac tcactatagg ttgtcgaggg aatgagtcag gttttagagc tagaaatagc 60

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 120

<210> 8

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

guugucgagg gaaugaguca gguuuuagag cuagaaauag caaguuuaaa auaaggcuag 60

uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102

Claims (6)

1.一种制备CD163双等位基因突变细胞的方法，为对猪离体成纤维细胞基因组的CD163基因进行基因编辑，使双等位基因CD163的E3外显子的第228位碱基均由C定点突变为T，且突变后形成TGA终止子使所述E3外显子提前终止表达，得到CD163双等位基因突变细胞；

所述E3外显子的核苷酸序列为序列2；

所述基因编辑采用单碱基编辑器SpRY-BE4进行；

所述单碱基编辑器SpRY-BE4包括用于点突变的rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白和sgRNA；

所述sgRNA的靶序列为序列3第1-20位；

所述rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白为序列6中自第19-5542位组成的核苷酸编码的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA为序列表中序列3或序列8编码的RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因编辑为将所述rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS蛋白的mRNA和所述sgRNA导入述离体猪成纤维细胞系中，得到CD163双等位基因突变细胞。

4.一种制备CD163双等位基因突变猪的方法，为将权利要求1-3任一所述方法制备的所述CD163双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为CD163双等位基因突变猪。

5.一种制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪的方法，为如下1）或2）：

1）将权利要求1-3任一所述方法制备的所述CD163双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为CD163双等位基因突变猪，即为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪；

2）用所述CD163双等位基因突变猪扩繁，得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪。

6.权利要求1-3任一所述的方法在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪中的应用。

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