CN112094869A - 基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法及其应用 - Google Patents

基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物模型构建技术领域，特别涉及一种基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法及其应用，本发明提供了一种il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠和一种基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型，并提供了上述仓鼠和胰腺癌模型制备方法，及其作为人体的病理和生理研究的模型鼠的用途；上述仓鼠的解剖学、生理学和病理学与人类非常相似，其临床症状、肿瘤生物学、代谢异常和分子遗传改变等方面与人类疾病发生方式几乎完全相同，而上述基于ZZU001的胰腺癌动物模型能够更全面观测到人类胰腺癌的主要特征，为胰腺癌等免疫缺陷型疾病的疾病进展和临床干预研究提供了可靠、经济的动物模型，具有深远的科研意义和重要的推广前景。

Description

基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法及其应用。
背景技术
胰腺癌(PaCa)是人类最致命的疾病之一，5年生存率低于7%。人胰腺癌的多转移位点仍然是治疗这种疾病的一个重要障碍。因此，为了更好地了解人胰腺癌肿瘤发生的分子机制、开发早期诊断的实用方法和评估新的治疗药物，需要可靠的动物模型来模拟该病的临床特征。
目前研究者已经开发了几种用于人类胰腺癌研究的模型，如人类胰腺癌细胞系、基于细胞系的异种移植和患者来源的肿瘤异种移植、转基因小鼠模型以及最近开发的胰腺导管状器官、三维培养系统和基于器官的异种移植。在这些模型中，将人类肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内已成为评估肿瘤进展和癌症药物临床前疗效的金标准。然而由于人类肿瘤的异种移植物在免疫缺陷小鼠体内，形成肿瘤细胞的同质团块，间质浸润及远处转移有限，因此始终不能用于预测人类胰腺癌的治疗反应。
叙利亚仓鼠的解剖学、生理学和病理学与人类非常相似，是一种在临床症状、肿瘤形态、肿瘤生物学、代谢异常和分子遗传改变等方面与人类疾病发生方式几乎相同的啮齿动物。il2rg基因，全称白介素2受体γ亚基（Interleukin 2 Receptor Subunit Gamma），参与IL2、IL4、IL7、IL15、IL21等多种受体组成，能够调节细胞表面受体结合、细胞内转运。il2rg突变可引起X-连锁重症联合免疫缺陷病（X-SCID）等免疫相关疾病，而X-连锁重症联合免疫缺陷叙利亚仓鼠表现出极大的免疫缺陷表型。X-SCID叙利亚仓鼠中的皮下胰腺癌Mia-PaCa2细胞系产生高度转移。我们前期研究也表明，人肿瘤细胞可能通过人肿瘤细胞分泌的作用于叙利亚仓鼠细胞的分子与叙利亚仓鼠的宿主细胞进行交流。因此推断，免疫缺陷的叙利亚仓鼠可能是最适合用以制备人类胰腺癌异种移植的动物模型。
发明内容
基于上述考虑，本发明的首要目的在于提供一种il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）；本发明的另一目的在于提供用于基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌动物模型；本发明的再一目的在于提供上述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的制备方法，及其作为人体的病理和生理研究的模型鼠的用途，优选作为免疫缺陷研究的模型鼠的用途；本发明的第四个目的在于提供以上述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌动物模型制备方法，及其作为人体病理和生理的研究的模型鼠的用途，优选作为胰腺癌疾病研究的模型鼠的用途。
本发明所述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001），其特征表现为：存在严重的T细胞、B细胞、NK细胞免疫缺陷，包括：淋巴发育受损；胸腺发育不全；脾脏体积减小，组织更薄更松散，白髓内淋巴细胞明显减少；胸腺和脾脏中淋巴细胞明显减少，CD3+或CD4+阳性T细胞几乎不存在；脾脏内脾细胞和MHC II类阳性细胞显著减少；胸腺内胸腺细胞数量显著减少，无MHC II类表达细胞；感染5型腺病毒后不能产生抗5型腺病毒的中和抗体。
本发明所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌体内模型和皮下异种移植模型，移植人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2、Panc-1、SUIT-2、Patu8988T和Capan-1后均可出现肿瘤的远端器官肺和肾等转移；原位异种移植模型，移植人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2出现局部浸润和远端器官（如肝脏、肺、腹膜后腔、肠系膜、隔膜、胃、肾、和肾上腺等）转移，以及肿瘤负荷体征（如腹水、黄疸、肠梗阻、恶病质等）。
本发明所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001），其特征表现为：能够更全面观测到人类胰腺癌的主要特征，包括并不限于由细胞外基质蛋白，包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、活性成纤维细胞组成的纤溶反应；上皮向间质转化(EMT)。
本发明的目的通过下述技术方案步骤实现：
1. 制备il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠
1.1 制备CRISPR/CAS9 mRNA、sgRNA；
作为一种具体的实施方式，步骤1.1中sgRNA的设计目标是叙利亚仓鼠il2rg基因第一个外显子内的一个位点特异性序列(NW_004801714.1)，其序列为SEQ NO.1，并制备CAS9mRNA及sgRNA；
作为一种具体的实施方式，步骤1.1中CAS9 mRNA通过MinElute PCR PurificationKit纯化试剂盒按说明书回收线性化T7启动子载体质粒，再选用MEGAshort Kit试剂盒按照说明书体外转录；
作为一种具体的实施方式，步骤1.1中sgRNA序列为：GAGCAGCTGAAGGAGTAAGA（SEQNO.2），由金唯智公司合成，使用前用灭菌双蒸水重悬；
1.2 取受孕叙利亚仓鼠受精卵，以矿物油包覆的HECM-9培养基为注射介质，将步骤1.1中获得的Cas9 mRNA (100 ng/μL)和sgRNA (50 ng/μL) 一起注射进受精卵的细胞质，并在37.8℃、10% CO2、5%O2和85% N2环境下培养0.5小时，获得注射后胚胎；
作为一种具体的实施方式，步骤1.2中矿物油包覆的HECM-9培养基是（Nacl 113.8nM,KCl 3nM,NaHCO3 25mM,CaCl2 1mM,MgCl2,2mM, asparagine 0.01mM, cysteine 0.01mM,histidine 0.01mM,lysine 0.01mM，proline 0.01mM，serine 0.01mM, aspartate0.01mM, glycine 0.01mM, glutamate 0.01mM,patothenate 0.003mM,taurine 0.5mM,glutamine 0.2mM,serum albumin 0.02mM，Sigma-Aldrich）；
作为一种具体的实施方式，步骤1.2中受精卵取自SPF级别条件下饲养的受孕雌叙利亚仓鼠；
1.3 注射后胚胎移入假孕雌仓鼠，并繁殖F0代叙利亚仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.3中是将步骤1.2中获得的注射后活胚移入假孕雌鼠的双侧输卵管，每根输卵管15个胚胎；
作为一种具体的实施方式，步骤1.3中的假孕雌鼠是在SPF级别条件下饲养的假孕雌叙利亚仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.3中的F0代叙利亚仓鼠是假孕雌叙利亚仓鼠繁殖的第一代叙利亚仓鼠；
1.4 对于步骤1.3中获得的F0代叙利亚仓鼠，在DNA、mRNA、蛋白水平鉴定il2rg基因敲除效果，获得il2rg基因敲除的叙利亚仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中是从两周龄F0代叙利亚仓鼠幼崽脚趾中提取基因组DNA；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中是采用PCR技术扩增上述基因组DNA中sgRNA靶向位点两侧的DNA区域，PCR引物序列如下（SEQ NO.3）：
正向为5’- GAGAGTGGTTCAGGGTTCTGACA -3’，
反向为5’- TGGGCTGGAGCTCAGAACTG -3’；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中mRNA是采用TRIzol方法提取，并采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒制备cDNA；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中是采用实时定量PCR技术检测il2rg mRNA水平，涉及到的引物序列如下（SEQ NO.4）：
正向为5’- GAACCCTAGATTTTCCTTGCC -3’，
反向为5’- GTATGACTCCCCCAGTGAAC -3’；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中是从5周龄F0代叙利亚仓鼠脾脏中分离到全细胞蛋白。Western blotting检测IL2RG蛋白， GAPDH 表达作为加载对照。
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中所述5周龄F0代叙利亚仓鼠为步骤1.3中获得并饲养于SPF级别条件下的F0代叙利亚仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.4中所述il2rg基因敲除的叙利亚仓鼠为DNA、mRNA、蛋白水平均提示敲除成功的F0代叙利亚仓鼠；
1.5 使用人5型腺病毒感染步骤1.4中获得的il2rg基因敲除叙利亚仓鼠：对il2rg基因敲除的叙利亚仓鼠肌肉注射人5型腺病毒 1×1010 (PFU)/kg，首次免疫后第14天，使用相同的剂量和路径刺激仓鼠，第17天处死仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.5中il2rg基因敲除的叙利亚仓鼠为饲养于SPF级别条件下的5-6周龄，雄性，il2rg基因敲除叙利亚仓鼠；
作为一种具体的实施方式，步骤1.5中是使用CO2处死法处死上述仓鼠；
通过步骤1.5产生感染人5型腺病毒的il2rg基因敲除叙利亚仓鼠并处死后，测定上述仓鼠血清中和性抗体滴度；
作为一种具体的实施方式，步骤1.6中所述仓鼠血清是通过全血离心分离方法获得的；
作为一种具体的实施方式，步骤1.6中所述中和性抗体滴度是采用体外细胞中和抗体测定方法；
1.6 采用Benchling软件分析潜在脱靶效应；使用Benchling软件确定了6个潜在的脱靶位点，il2rg验证10bp缺失未发生脱靶事件，说明本研究使用的sgRNA是特异的。上述il2rg基因敲除叙利亚仓鼠所有特征都是由于il2rg基因的缺陷，而不是其他基因的改变。
作为一种具体的实施方式，步骤（1）中是使用Benchling软件确定了6个潜在的脱靶位点，其序列分别为：
Sequence 1：TAGCAGCTGAAGCAGTAAGA；
Sequence 2：GAAGAGCTGCAGGAGTAAGA；
Sequence 3：CACCAGGTGAAGGAGTAAGA；
Sequence 4：GACCAGCCAAAGGAGTAAGA；
Sequence 5：GATAAGCTGAGGGAGTAAGA；
Sequence 6：GGGCCGCTGAATGAGTAAGA；
作为一种具体的实施方式，通过步骤1.4产生，并经步骤1.5、1.6验证后的il2rg基因敲除的叙利亚仓鼠，又称为il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）；
2. 成功制备上述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）后，通过皮下异种移植、原位异种移植技术将人胰腺癌细胞系移植至il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）体内，制备基于il2rg基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌模型。
2.1 通过皮下异种移植技术制作基于il2rg基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌模型：在5周龄il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）右上腹壁皮下注射人胰腺癌细胞系。使用卡尺每周两次测量肿瘤大小，直到肿瘤达到3,500mm3或发生肿瘤溃疡，处死小鼠，分离肿瘤组织进行石蜡包埋，并进行苏木精和伊红(HE)、Masson三色染色、免疫组化(IHC)分析；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）是由步骤1获得并饲养于SPF级别条件下的5周龄，雄性，il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中所述人胰腺癌细胞系为MIA-PaCa-2、Panc-1、SUIT-2、Patu8988T和Capan-1，计量为5×106 细胞；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中所述肿瘤体积(V)计算使用公式为V =(长度×宽度2×π)/ 6)；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中所述苏木精和伊红(HE)采用索莱宝苏木精-伊红染色试剂盒完成；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中所述Masson三色染色采用索莱宝Masson三色染色试剂盒完成；
作为一种具体的实施方式，步骤2.1中所述免疫组化(IHC)分析采用Vimentin和SMA抗体检测完成；
2.2 通过原位异种移植技术制作基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型：使用1.2%的阿弗丁溶液(45mg/kg)麻醉il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）后暴露胰脏，使用基底膜基质胶悬浮1×106 MIA-PaCa2细胞，使用29号针头将细胞悬液垂直注射到胰腺尾部，将胰腺放回原位并关闭腹腔，10周后用CO2处死上述仓鼠。如仓鼠出现腹水形成、黄疸、恶病质，须提前处死动物。
作为一种具体的实施方式，步骤2.2中所述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）是由步骤1获得并饲养于SPF级别条件下的F0代5周龄，雄性，il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中所述基底膜基质胶为康宁公司，所用量为50μL；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中所述人胰腺癌细胞系为MIA-PaCa-2；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中使用到的器械包括29号注射针；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中通过腹胀与测量腹部长度变大判断是否有腹水形成；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中通过肝脏颜色发黄是否有黄疸；
作为一种具体的实施方式，步骤（2）中通过仓鼠极度消瘦体重极度下降和精神不振判断是否有恶病质。
采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的解剖学、生理学和病理学与人类非常相似，其临床症状、肿瘤形态、肿瘤生物学、代谢异常和分子遗传改变等方面与人类疾病发生方式几乎完全相同；
2.本发明所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌动物模型能够更全面观测到人类胰腺癌的主要特征，包括并不限于肿瘤的局部浸润和远端器官（如肝脏、肺、腹膜后腔、肠系膜、隔膜、胃、肾、和肾上腺等）转移，以及肿瘤负荷体征（如腹水、黄疸、肠梗阻、恶病质等）。
附图说明
图1 是本发明所述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）建立及其鉴定结果，其中：A图为本发明所涉及sgRNA针对的基因组DNA （il2rg基因第一外显子）位置及其序列；B图为本发明所涉及的sgRNA序列；C图为il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）与野生型叙利亚仓鼠基因组DNA序列的对比；D图为il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）与野生型叙利亚仓鼠il2rg mRNA水平的对比；E图为il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）与野生型叙利亚仓鼠IL2RG 蛋白水平的对比；
图2 是本发明所述使用Benchling软件确定的6个潜在的脱靶位点，利用PCR技术扩增相应序列，与野生型仓鼠进行比较后未见明显脱靶效应，其中：A图提示目的序列大小与野生型无差异；B图提示目的序列测序结果显示无突变；
图3 是本发明所述建立il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）表型鉴定结果，其中：A图为；B图为；C图为；D图为；E图为il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）与野生型叙利亚仓鼠胸腺或脾脏内T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞数量的对比；F图为感染5型腺病毒后，il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）与野生型叙利亚仓鼠血清内抗5型腺病毒的中和抗体数量的对比；
图4 是本发明所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌模型与传统胰腺癌模型（B-NDG模型）的对比，其中：上表为皮下或原位移植5×106 MIA-PaCa2细胞后，基于ZZU001的胰腺癌模型与B-NDG模型的肿瘤远处转移对比；下表为皮下注射移植Panc-1、SUIT-2、Patu8988T和Capan-1细胞后，基于ZZU001的胰腺癌模型的肿瘤远处转移对比；
图5 是本发明所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠（ZZU001）的胰腺癌模型与传统胰腺癌模型（B-NDG模型）的肿瘤组织对比，分别为基于ZZU001的胰腺癌模型与B-NDG模型的病理切片分别行苏木精和伊红(HE)染色、Masson三色染色、免疫组化（检测Vimentin和SMA蛋白表达）分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠建立及其鉴定
1. 设计并制备Cas9 mRNA、sgRNA
作为一种具体的实施方式，步骤（1）中Cas9 mRNA通过MinElute PCR PurificationKit纯化试剂盒按说明书回收线性化T7启动子载体质粒，再选用MEGAshort Kit试剂盒按照说明书体外转录；sgRNA的设计目标是il2rg基因第一个外显子内的一个位点特异性序列(NW_004801714.1)。SgRNA序列采用在线软件Benchling（https://benchling.com/）设计，并预测其预测打靶效率和脱靶效率。本实验例采用的序列为：GAGCAGCTGAAGGAGTAAGA；
2. 显微注射及胚胎移植
以矿物油包覆的HECM-9培养基为注射介质，将Cas9 mRNA (100 ng /μL)和sgRNA (50ng /μL) 一起注射进受精卵的细胞质；将注射后的活胚移入假孕母鼠的每根输卵管，每根输卵管15个胚胎。
3. 饲养及繁殖
本项目使用的野生型叙利亚仓鼠来自北京维通利华实验动物技术公司，按清洁级标准饲养。温度22-24℃，湿度40-60%，光照周期为6:00-20:00光照；20:00-6:00黑暗。单笼饲养孕鼠，鼠笼内保持卫生清洁。在笼内垫料上放置饲料、瓜子，高压灭菌水。根据叙利亚仓鼠特性，在 10-12天时，孕鼠开始做窝，为分娩做准备。仔鼠出生3周后断奶，雌、雄分笼单独饲养。
4. 分子生物学层面鉴定目的基因敲除效果
DNA水平上，从两周龄幼崽脚趾中提取基因组DNA对微注射胚胎产生的幼崽进行基因测序分型分析，采用PCR技术扩增CRISPR靶向位点两侧的基因组区域，并使用PCR产物直接测序引物序列如下：正向为5’-GAGAGTGGTTCAGGGTTCTGACA-3’，反向为5’-TGGGCTGGAGCTCAGAACTG-3’。
mRNA和蛋白水平上，从5周龄il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠胸腺提取RNA和脾脏分离到全细胞蛋白。RT-qPCR检测il2rg mRNA表达。Western blotting检测IL2RG蛋白，GAPDH 蛋白水平作为加载对照，抗体分别购于Santa Cruz和Proteintech。
5. 脱靶效应检测
使用Benchling软件确定了6个潜在的脱靶位点，il2rg验证10bp缺失未发生脱靶事件，说明本研究使用的sgRNA是特异性的，上述il2rg基因敲除叙利亚仓鼠所有特征都是由于il2rg基因的缺陷，而不是其他基因的改变。同时采用PCR方法扩增扩增脱靶靶点周围大约300至500bp长度的PCR片段，PCR产物送测序。
6. il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠表型鉴定
对il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠麻醉后处死，收集il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠组织，石蜡包埋，分别进行苏木精和伊红(HE)染色分析，组织病理学结果由两位独立的病理学家进行评估。
对il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠肌肉注射5型腺病毒 1×1010 (PFU)/kg。首次免疫后第14天，使用相同的剂量和路径刺激仓鼠，第17天处死仓鼠，测定样品的Nab滴度测定。
实施例2 基于il2rg基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌模型建立
1.在5周龄，雄性，il2rg基因敲除叙利亚仓鼠右上侧皮下注射5×106 MIA-PaCa2或其他细胞。使用卡尺每周两次测量肿瘤大小，直到肿瘤达到3,500mm3或发生肿瘤溃疡。肿瘤体积(V)计算使用公式V =(长度×宽度2×π)/ 6)。
2. 作为一种具体的实施方式，步骤（2）中是用1.2%的阿弗丁溶液(45mg/kg)麻醉il2rg基因敲除叙利亚仓鼠后暴露胰脏，使用基底膜基质胶悬浮1×106 MIA-PaCa2细胞，使用29号针头将细胞悬液垂直注射到胰腺尾部，将胰腺放回原位并关闭腹腔，10周后用CO2处死上述仓鼠。如仓鼠出现腹水形成、黄疸、恶病质或两者均与动物的临床症状显著恶化有关，须提前处死动物。
本实施例并非对本发明的形状、材料、结构等作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法，其特征在于：所述制备方法采用 CRISPR/CAS9技术敲除叙利亚仓鼠il2rg基因。
2.根据权利要求1所述的基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法，其特征在于：所述叙利亚仓鼠il2rg基因的核苷酸靶点序列为 SEQ ID NO. l 所示，所述CRISPR/CAS9技术使用的sgRNA序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求2所述的基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法，其特征在于：所述制备叙利亚仓鼠il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠是通过胚胎注射针对il2rg基因的CRISPR/CAS9 mRNA、sgRNA制成的。
4.根据权利要求1-3所述的任意一项基于基因敲除叙利亚仓鼠的胰腺癌动物模型制备方法，其特征在于：所述的il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠，存在严重的T细胞、B细胞和NK细胞免疫缺陷，包括：淋巴发育受损；胸腺发育不全；脾脏体积减小，组织更薄更松散，白髓内淋巴细胞明显减少；胸腺和脾脏中淋巴细胞明显减少，CD3+或CD4+阳性T细胞几乎不存在；脾脏内脾细胞和MHC II类阳性细胞显著减少；胸腺内胸腺细胞数量显著减少，无MHCII类表达细胞；感染5型腺病毒后不能产生抗5型腺病毒的中和抗体。
5.权利要求4中所述il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠，及其作为人体的病理和生理研究的模型鼠的用途，优选作为免疫缺陷研究的模型鼠的用途。
6.一种基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型，其特征在于，获得权利要求4中所述的il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠后，将人胰腺癌细胞系移植至il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠体内，制备的基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型。
7.根据权利要求6所述的一种基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型，其特征在于，所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型是通过皮下异种移植、原位异种移植技术将人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2、Panc-1、SUIT-2、Patu8988T和Capan-1分别移植入免疫缺陷叙利亚仓鼠体内制备的。
8.所述基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌体内模型和皮下异种移植模型，其特征在于，移植人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2、Panc-1、SUIT-2、Patu8988T和Capan-1后均可出现肿瘤的远端器官肺和肾等转移；原位异种移植模型，移植人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2出现局部浸润和远端器官转移，以及肿瘤负荷体征。
9.所述的基于il2rg基因敲除的免疫缺陷叙利亚仓鼠的胰腺癌模型，作为人体病理和生理的研究的模型鼠的用途，优选作为胰腺癌疾病研究的模型鼠的用途。
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