CN117965552A - 含有人hras基因的致瘤性转基因动物模型的制作方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有人HRAS基因的致瘤性转基因动物模型的制作方法及应用，属于动物基因工程领域。本发明所述的人HRAS基因第2718位核苷酸由A突变为G。以小鼠为例，采用本发明所述的人HRAS基因序列更完整(可以含更长的两端非编码区)，制备得到的致瘤性转基因小鼠模型方法更简单，获得的阳性小鼠各重要脏器和组织均表达HRAS，且可用于多种癌症发生发展的机理研究和致瘤性评价试验。

Description

含有人HRAS基因的致瘤性转基因动物模型的制作方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种含有人HRAS基因的致瘤性转基因动物模型的制作方法及应用。

背景技术

转基因动物指转基因工程培育的动物。遗传的基本物质是DNA，基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，储存在生物全套染色体中的全部遗传信息为基因组。由于不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，因此对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，那么这个外源基因就被称为转基因，而这种动物就是转基因动物。转基因动物表达系统，包括外源基因、表达载体和受体细胞等。通常，根据外源基因导入的方法和对象的不同，制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞(ES细胞)法、电脉冲法、精子载体导入法等。

疾病动物模型对医学的发展作出了贡献。但是，许多疾病难以用人工诱发的方法制造动物模型，或许多疾病在实验动物身上不发生或仅仅是高等哺乳类动物才发生，因此难以通过自发或人工定向培育的方法获得动物模型。而转基因技术为人类精确地研究基因与疾病的相关关系提供了可能，且可以在个体发生的每个阶段中使用任何个体进行遗传功能的分析。因此，转基因疾病动物模型的开发成为转基因动物的研究热点。例如，将人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因导入小鼠，可获得转HBsAg基因小鼠，该转基因小鼠的肝中可以产生HBsAg，该转基因小鼠模型可用来研究免疫应答耐受与肝细胞损伤的关系，探讨发病机制、持续带毒状态及其清除、药物筛选实验、HBV DNA在宿主内的复制、表达及调控与乙型肝炎发病的关系等有关HBV病理学和治疗学方面的难题。此外还可通过向小鼠受精卵插入癌基因或原癌基因培育转基因小鼠，可在整体水平上研究癌基因对细胞正常分裂分化的影响，从而可以准确地研究癌基因与肿瘤形成的关系，如SV40T抗原基因是一个在转基因小鼠中得到广泛研究的转化基因。

哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-Ras(HRAS)，K-Ras和N-Ras。已经在多种肿瘤中发现ras基因突变，是肿瘤发生的驱动基因之一。HRAS基因，即人原癌基因c-Ha-ras，其负责编码H-Ras的蛋白，该蛋白属于RAS/MAPK信号通路途径的一部分。H-Ras蛋白可将来自细胞外的信号传导至细胞核内，这些信号可指示细胞生长和分裂(增殖)、成熟并具有特殊功能(分化)。此外，H-Ras蛋白可参与RAS-RAF-MEK-ERK途径，负责控制基因转录活动和细胞循环周期，与细胞增殖相关。研究发现，HRAS基因在真核生物进化中保守，且与肿瘤的发生发展相关。

rasH2转基因鼠是由日本CIEA研制，通过原核注射使小鼠全身过表达人HRAS基因获得，该小鼠模型广泛用于药物安评中的致瘤性评价试验。其自发肿瘤率并不高，在出生的6个月内很少出现肿瘤或癌前细胞增生，但表现出对基因毒性化合物及非基因毒性化合物的致瘤敏感性增强，在受到致癌物诱导时可在较短时间内高发肿瘤。此外，专利CN200810101666.0公开了一种含有人源原癌基因c-Ha-ras(HRAS)的转基因小鼠的制作方法及其用途，其转入的DNA序列含有HRAS基因的4个编码外显子、内含子及调控序列。专利CN202111516512.X则公开了一种致癌性小鼠模型及其建立方法和应用，通过将包含HRAS基因序列片段的载体转入C57BL/6小鼠胚胎干细胞，经过囊胚注射，移植入受体鼠，经过筛选获得。

已有的研究结果表明，基因两端的非编码区和内含子序列是调控基因表达强度的关键调控序列，仅含有cDNA基因的表达比基因组DNA基因要弱的多。目前，随着基因编辑技术的迭代和优化，含有更完整基因序列的人源化小鼠模型正在二次研发。伴随第三次药物研发的浪潮，亟需开发一种可用于多种癌症机理研究、致瘤性评价试验的转基因小鼠模型。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种含有人HRAS基因的致瘤性动物模型的制作方法及应用。本发明所述的人HRAS基因包含HRAS基因的编码片段、内含子以及上下游非编码区的染色体DNA片段，且在最末内含子的序列中引入一个点突变。以小鼠为例，采用本发明所述的人HRAS基因制备得到的致瘤性小鼠模型方法更简单，小鼠各重要脏器和组织均表达HRAS，且可用于多种癌症发生发展的机理研究、致瘤性评价试验。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种突变的核酸。

所述核酸上包括人HRAS基因的突变片段；所述的人HRAS基因第2718位核苷酸由野生型A突变为G；所述的人HRAS基因突变片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的核酸上还包括一段非编码序列SEQ ID NO.2。

优选地，所述的核酸中各序列的连接方式为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.1。

另一方面，本发明提供了包含上述核酸的载体。

具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。

又一方面，本发明提供了包含上述核酸或载体的宿主细胞。

具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物细胞或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染等方法。

又一方面，本发明提供了上述核酸、上述载体或宿主细胞在制备致瘤性转基因动物模型中的应用。

具体地，所述的动物包括但不限于小鼠、大鼠、食蟹猴、羊、鱼等，优选为小鼠。

又一方面，本发明提供了一种致瘤性转基因动物模型的制备方法，所述的方法包括：将上述突变的核酸或载体通过显微注射转入动物原核期胚胎的原核中，将注射存活的胚胎移植入受体动物的输卵管中，出生的后代经筛选获得转基因动物模型。

具体地，所述的动物包括但不限于小鼠、食蟹猴、羊、鱼等，优选为小鼠。

在某些实施例中，本发明所述的转基因动物为小鼠。

在某些实施例中，本发明所述的致瘤性转基因小鼠模型的制备方法包括以下步骤：

(1)突变的核酸的获得；

(2)载体构建：通过PCR扩增、酶切、转化手段构建包括上述核酸的载体；

(3)显微注射：将上述步骤(2)制备的载体线性化后显微注射到小鼠受精卵中；

(4)获得首建小鼠：将步骤(3)显微注射后存活的受精卵移植到假孕小鼠输卵管中，待小鼠出生后，筛选鉴定获得PCR检测阳性小鼠；

(5)获得小鼠模型：将上述步骤(4)制备得到的阳性小鼠与C57BL/6小鼠交配，获得F1代阳性小鼠，基因型鉴定后阳性小鼠进行表型分析，表型符合需要的小鼠作为种鼠进行近交系生产，获得基因型均一和表型正确的模型即为所述致癌性小鼠模型。

又一方面，本发明提供了一种致瘤性转基因动物模型，所述的致瘤性转基因动物模型包含上述核酸、上述载体或宿主细胞。

又一方面，本发明提供了上述核酸、载体、宿主细胞或致瘤性转基因动物模型在致癌物筛选或评价、抑癌物的筛选、药物的安全性评价中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明所述的突变的核酸中包含HRAS基因的编码片段，且在最末内含子的序列中引入一个点突变，另外还包括一段非编码片段。以小鼠为例，采用本发明所述的包含人HRAS基因突变的核酸所制备得到的致瘤性小鼠模型方法更简单，各重要脏器和组织均表达HRAS，且可用于多种癌症发生发展的机理研究、致瘤性评价试验，其评价结果与已知的阳性致瘤药结果相一致。

附图说明

图1为人HRAS基因结构示意图。

图2为小鼠基因型鉴定结果图。

图3为Western blot检测小鼠各器官组织转基因表达情况结果图。

图4为小鼠肉瘤及病理切片样本示意图。

图5-图6为小鼠胃部肿瘤病理切片样本示意图。图5中，上图为非腺区鳞状细胞癌10×，下图为非腺区鳞状细胞癌20×。图6中，上图为非腺胃鳞状细胞乳头状瘤10×，下图为非腺胃鳞状细胞乳头状瘤20×。

图7为小鼠胸腺淋巴瘤病理切片样本。其中，上图为胸腺淋巴瘤10×，下图为胸腺淋巴瘤20×。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1人HRAS基因突变片段

本发明所述的人HRAS基因示意图详见图1，包含HRAS基因的编码片段、内含子以及上下游非编码区的染色体DNA片段。所述的人HRAS基因第2718位核苷酸由野生型A突变为G得到突变片段，所述的突变位于人HRAS基因的最末内含子上。

具体地，本发明所述的人HRAS基因突变片段如SEQ ID NO.1所示。

实施例2转基因小鼠模型的构建

构建包含实施例1所述的人HRAS基因的表达载体，载体上包括SEQ ID NO.2-SEQID NO.1。将上述载体注射到C57BL/6N小鼠受精卵原核内，获得转基因阳性首建鼠，分别扩繁建系，进行表型分析，从中筛选符合致瘤性试验要求的第9个系予以保留，命名为rasH小鼠(阳性小鼠)。同时采用内含子未突变的WT的人HRAS基因，构建WT(野生型)小鼠作为对照。

用数字定量PCR法确定，rasH小鼠单位点串联转基因拷贝数4个，用染色体步移法确定转基因串联片段整合于小鼠第6号染色体上。

小鼠基因型鉴定方法如下：

随机选取小鼠，剪10天小鼠尾巴尖约0.5cm放入EP管中，用苯酚法提取DNA基因组，溶于TE溶液用于检测。以DNA基因组作为PCR反应的模板，用下表1所示引物对鉴定野生型和阳性小鼠的HRAS基因。PCR体系详见表2，反应条件详见表3-4。

表1

表2

表3

表4

检测结果如图2所示(部分数据，未全部展示)。

通过基因型鉴定后统计，本申请所述的人HRAS转基因小鼠(阳性小鼠)的制备成功率为68％。

同时利用Western blot检测小鼠各器官组织转基因表达情况，检测结果如图3所示，结果表明HRAS在小鼠前胃和肺脏中具有较高的表达量。

实验例1rasH小鼠的致瘤敏感性

对实施例2中构建成功的转基因rasH小鼠(阳性小鼠，实验组)进行致瘤敏感性测试。rasH小鼠在6月龄前极少自发肿瘤。但在12月龄时约有10％-20％死于自发肿瘤。

采用氨基甲酸乙酯Urethane 50mg/kg ip.tiw诱导，并以实施例2中的WT构建成功的小鼠作为对照实验组，在6个月内，本发明的rasH小鼠70％以上小鼠发现肺部肿瘤，对照实验组仅45％左右小鼠发现肺部肿瘤。

实验组与对照实验组中，也有部分小鼠模型出现肝脏肿瘤、肉瘤等。其肉瘤图片及病理切片样本见图4。

实验例2rasH小鼠应用于MNNG致瘤性实验

本实施例中，MNNG指1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍。

采用实施例2构建成功的转基因rasH小鼠(阳性小鼠，实验组)进行MNNG胃部致瘤性实验，以实施例2中的WT构建成功的小鼠作为对照实验组：

2月龄实验小鼠，50mg/kg体重用量的MNNG灌胃，每周2次，共计5周，其他行常规喂养。实验结束后统计胃部肿瘤发生情况，采用直接观察法进行判定，肉眼可见肿瘤即认定为肿瘤发生。

结果表明，在5周结束时观察到本发明实验组和对照实验组小鼠模型胃部均有实体瘤，其中实验组致瘤率为100％，对照实验组致瘤率为81％。在部分小鼠乳腺观察到肿瘤，实验组和对照实验组乳腺位置的肿瘤发生率相当，约为10％。实验过程未发生小鼠死亡。实验组小鼠胃部肿瘤病理切片样本示例见图5-图6。

实验例3rasH小鼠应用于MNU诱导的胸腺淋巴瘤

本实施例中，MNU指N-甲基-N-亚硝脲。

采用实施例2构建成功的转基因rasH小鼠(阳性小鼠，实验组)进行MNNG胃部致瘤性实验，以实施例2中的WT构建成功的小鼠作为对照实验组：

实验开始，小鼠腹腔注射50mg/kg体重的MNU进行诱导，第2周和第4周分别再次腹腔注射25mg/kg体重的MNU，其他行常规喂养。8周后统计小鼠胸腺淋巴瘤发生情况，采用直接观察法进行判定，肉眼可见肿瘤即认定为肿瘤发生。

结果表明，在8周结束时观察到本发明实验组和对照实验组小鼠模型均发生胸腺淋巴瘤，其中实验组致瘤率为96％，对照实验组致瘤率为67％。实验组小鼠胸腺淋巴瘤病理切片样本示例见图7。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种突变的核酸，其特征在于，包含人HRAS基因的突变片段；所述的人HRAS基因第2718位核苷酸由野生型A突变为G；所述人HRAS基因的突变片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，还包括一段非编码序列SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，连接方式为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.1。

4.包含权利要求1-3任一项所述的核酸的载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体包括质粒、病毒或噬菌体。

6.包含权利要求1-3任一项所述的核酸或权利要求4-5任一项所述的载体的宿主细胞。

7.权利要求1-3任一项所述的核酸、权利要求4-5任一项所述的载体或权利要求6所述的宿主细胞在制备致瘤性转基因动物模型中的应用。

8.一种含有人HRAS基因的致瘤性转基因动物模型的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1-3任一项所述的核酸或权利要求4-5任一项所述的载体通过显微注射转入动物原核期胚胎的原核中，将注射存活的胚胎移植入受体动物的输卵管中，出生的后代经筛选获得转基因动物模型。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的动物包括小鼠、大鼠、食蟹猴、羊或鱼。

10.一种致瘤性转基因动物模型，其特征在于，所述的致瘤性转基因动物模型包含权利要求1-3任一项所述的核酸、权利要求4-5任一项所述的载体或权利要求6所述的宿主细胞。

11.权利要求1-3任一项所述的核酸、权利要求4-5任一项所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求10所述的致瘤性转基因动物模型在致癌物筛选或评价、抑癌物的筛选、药物的安全性评价中的应用。