CN116042714A - 一种mettl7b基因肺部特异性敲入小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种METTL7B基因肺部特异性敲入小鼠模型的构建方法及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术将METTL7B的表达盒特异性导入受体小鼠ROSA26编码基因中构建获得METTL7B敲入小鼠,再将METTL7B敲入小鼠与肺组织特异性条件性Cre表达小鼠杂交,可获得在小鼠肺部特异性条件性表达METTL7B的工具小鼠模型,该工具小鼠仅在肺组织中且在Cre酶诱导表达条件下表达METTL7B。该工具小鼠可应用于对肺炎、肺癌、肺纤维化等肺部疾病模型的构建、基因表达谱的研究、肺部疾病发病机制研究、药物开发和筛选等领域具有促进作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种METTL7B基因肺部特异性敲入小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,发病率在所有恶性肿瘤中约占20%,死亡率约为27%,五年生存率仅8%~10%左右,随着环境污染以及其他因素恶化,肺癌发生率呈逐年上升趋势。肺癌的发病原因与多种机制相关:1)驱动基因(如EGFR,KRAS)的异常表达和突变激活相应细胞信号通路,诱发并维持肿瘤细胞生长;2)肿瘤干细胞以其自我更新、增殖与分化能力和强致瘤性诱导肿瘤的发生,发展,侵袭,转移,复发和耐药的发生;3)癌症相关基因的表观遗传修饰异常导致癌基因的激活或高表达,而抑癌基因的失活或缺失;4)肿瘤DNA的不稳定性和损伤的积累导致癌基因和染色体畸变,加速肿瘤的发生;5)肿瘤微环境(如细胞外基质、成纤维细胞等)为恶性肿瘤“种子”输入生长繁育的“肥沃土壤”,促进了肿瘤的发生和进展。在治疗上,即使靶向药的出现为肺癌患者带来了全新的希望,但是只有约40%患者携带符合靶向药的基因突变,仍有一半左右的患者需接受传统化疗或其他方法进行治疗。最新研究表明,利用铂类化疗或免疫治疗,非小细胞型肺癌(Non-small-Cell LungCancer,NSCLC)患者5年生存率只有16%-23%。由此可见,肺癌发病机制非常复杂导致其防治形势依然非常严峻。因此,探索NSCLC发生和发展的分子机制,对于深入了解其发病机制,以及疾病的防控和治疗都非常关键,也是提升治疗肺癌效果亟需解决的重大问题。
甲基化转移酶样蛋白(Methyltransferase Like,METTL)是含有S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl methionine,SAM)结合域的蛋白家族,能将甲基化供体的甲基转移到RNA、DNA或蛋白等受体中,从转录后或翻译后水平调控底物的活性、定位和稳定性等重要的生物学特征和功能。METTL家族含有超过30名成员,目前研究只证实少数METTL家族分子能甲基化修饰细胞中的RNA或蛋白,如METTL3、METTL13、METTL14、METTL8和METTL16等。这些蛋白在癌症的发生、个体发育、干细胞多能性等过程中都起着重要的调控作用,但其他成员的甲基化靶点和分子机制依然未知。
甲基化转移酶样蛋白7B是(methyltransferase like 7B,METTL7B)甲基化转移酶样家族成员之一,其蛋白结构包含一个S-腺苷基甲硫氨酸结合域(S-adenosylmethioninebinding site,SAM binding site)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何获得在肺组织特异性条件性表达METTL7B蛋白的工具小鼠模型。
为了解决上述技术问题,本发明首先提供了构建肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型的方法。所述方法可包括将甲基化转移酶样蛋白7B(METTL7B)的基因表达盒导入受体小鼠的ROSA26的编码基因中,得到转基因小鼠,将所述转基因小鼠与肺组织特异性条件性Cre表达小鼠杂交获得所述肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型。所述工具小鼠模型可在诱导Cre酶表达条件下在肺组织中特异性表达甲基化转移酶样蛋白7B。
所述,工具小鼠模型在其他组织中可不表达甲基化转移酶样蛋白7B。所述基因表达盒可含有甲基化转移酶样蛋白7B的编码序列。所述基因表达盒可在启动子序列和甲基化转移酶样蛋白7B的编码核苷酸序列之间含有lox侧翼序列和终止子序列。
所述肺组织特异性条件性Cre表达小鼠在诱导Cre酶表达条件下可在肺组织中特异性表达Cre酶。
所述条件性表达可为在诱导Cre酶表达条件下表达。所述诱导Cre酶表达条件可为使用药物诱导Cre酶表达。所述药物可为他莫昔芬。
上述方法中,所述甲基化转移酶样蛋白7B蛋白可选自下述任一种蛋白质:
A1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质;
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质;
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述方法中,所述甲基化转移酶样蛋白7B蛋白的编码序列可为、、序列2所示的DNA分子。所述甲基化转移酶样蛋白7B蛋白的编码序列也可为序列表中序列3的第5565-6299位所示的DNA分子。
上述方法中,所述基因表达盒可含有CAG启动子。所述特异性导入可为将所述基因表达盒敲入受体小鼠的METTL7B基因的核苷酸序列。
所述METTL7B基因可为GenBank Accession No.NM_027853.2(Update Date29-May-2022),即序列表中序列2所示的核苷酸。
上述方法中,所述导入可包括采用CRISPR/Cas9系统将所述基因表达盒导入受体小鼠受精卵的ROSA26编码基因中。
上述方法中,所述导入可包括将表达靶向所述ROSA26编码基因的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述基因表达盒通过显微注射导入所述受体小鼠受精卵,得到所述转基因小鼠的步骤。
上述方法中,所述gRNA的靶序列具体可为序列表中序列4所示。
上述方法中,所述lox侧翼序列和终止子序列可为序列表中序列3的第4615-5524位核苷酸。
上述方法中,所述基因表达盒的核苷酸序列可为序列表中序列3。
所述受体小鼠可为C57BL/6小鼠。所述肺组织特异性条件性Cre表达小鼠可为肺组织特异性Cre转基因小鼠Sftpc-CreERT2。
下述任一种应用也属于本发明的保护范围:
B1)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备、开发或研究肺部疾病相关药物中的应用;
B2)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备肺部疾病临床实验用药中的应用;
B3)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在研究甲基化转移酶样蛋白7B调控相关的肺部疾病发明机制中的应用;
B4)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在研究物质在抗肺炎和/或抗肺纤维化和/或抗肺癌评价中的应用。
所述肺部疾病可为肺炎、肺癌、肺纤维化等疾病。所述物质可为药物、基因、微生物、气体、食物、食物添加剂或医疗器械等。
本发明的目的在于提供一种METTL7B肺组织特异性条件性敲入小鼠模型的构建方法、模型的制备及其应用。
本发明提供的METTL7B基因条件性敲入小鼠模型的构建方法,所述方法包括如下步骤:
(1)基于CRISPR/Cas9系统,设计特异性位点导向gRNA,体外转录gRNA和cas9mRNA,所述的gRNA的核苷酸序列可为5’-CTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGG-3’;
(2)构建CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse METTL7B CDS-polyA基因表达盒的基因敲入载体;
(3)将gRNA、cas9 mRNA和基因敲入载体导入小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。
(4)通过Southern blot、PCR扩增鉴定F0代小鼠,获得F0代小鼠。
(5)将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠。提取F1代小鼠尾部组织DNA,经过PCR,测序鉴定,获得METTL7B条件性敲入F1杂合子小鼠。
(6)将F1代杂合子小鼠交配并经过PCR扩增鉴定获得F2代METTL7B条件性敲入的纯合子小鼠。
(7)用肺组织特异性Cre转基因小鼠Sftpc-CreERT2与METTL7B敲入F2纯合子代小鼠进行交配,经过PCR扩增鉴定,获得METTL7B肺部特异性敲入的杂合子小鼠。将METTL7B肺部特异性敲入的杂合子小鼠近交,获得METTL7B肺部特异性敲入的纯合子小鼠METTL7B flox /flox Sftpc-CreERT2。
本发明所提供的构建在肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型的方法及构建的工具小鼠模型,可应用于深入研究METTL7B在肺癌肿瘤中的作用机制,开发新型靶点药物对临床肿瘤治疗提供一种探索性科学理论依据。
本发明相对现有的技术具有如下显著的进步:
本发明首次提供METTL7B基因的条件性敲入小鼠动物模型及其构建方法,通过METTL7B敲入小鼠与不同类型Cre小鼠的杂交,可实现对小鼠特定组织或细胞的敲入,可用于实现METTL7B在不同疾病模型的构建以及药物筛选中,推动肿瘤的诊治、生物学、药物等领域的进步和完善。
本发明首次提供METTL7B基因的肺部条件性敲入小鼠动物模型及其构建方法,可实现在小鼠肺部AT2细胞特异性表达METTL7B,对METTL7B在肺炎、肺癌、肺纤维化等肺部疾病模型的构建、基因表达谱的研究、发病机制、药物筛选等领域具有促进作用。
附图说明
图1为CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse Mettl7b CDS-polyA基因盒示意图以及F0代转基因敲入小鼠PCR鉴定结果。A为CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse Mettl7bCDS-polyA基因盒及野生型受体小鼠的基因元件示意图;“1”代表第一个外显子,“2”代表第二个外显子;Rosa26 Wildtype allele代表对照野生型受体小鼠等位基因,Cas9targetingregion代表靶点序列对应的基因位置区域,Targeting vector代表CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse Mettl7b CDS-polyA基因盒,Targeted allele代表F0代METTL7B基因敲入小鼠的等位基因,Constitutive KI allele代表当组织中表达Cre酶后基因发生DNA编辑后的等位基因。B为F0代转基因敲入小鼠使用引物对1(Primers1,包括F1和R1)和引物对2(Primers2,包括F2和R2)PCR鉴定结果;WT代表野生型受体小鼠;MT代表METTL7B基因敲入小鼠,water代表空白对照。
图2为本发明用PCR验证F1代敲入小鼠基因型鉴定电泳图。A为F1代敲入小鼠基因元件示意图;Targeted allele代表F1代METTL7B基因敲入小鼠;B为F1代敲入小鼠使用引物对3(包括F1和R1)和引物对4(包括F2和R2)进行PCR鉴定的电泳图。WT代表对照野生型受体小鼠;5,8,11号泳道代表三个F1代敲入小鼠检测结果,M是DNA marker,water代表空白对照。
图3为本发明Southern blot验证5,8,11号三个敲入F1代敲入小鼠基因型鉴定重组电泳图。A为F1代敲入小鼠基因元件示意图;Targeted allele代表F1代METTL7B基因敲入小鼠;Rosa26 Wildtype allele代表对照野生型受体小鼠,Cas9 targeting region代表靶点序列对应的基因位置区域,“1”代表第一个外显子,“2”代表第二个外显子;Mfel和AvrII代表酶切识别位点位置。B为Southern blot验证5,8,11号三个敲入F1代敲入小鼠基因型鉴定重组电泳图;WT代表野生型受体小鼠;MT代表METTL7B基因敲入小鼠。
图4为METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型PCR鉴定结果。A为小鼠模型基因元件示意图;Targeted allele代表METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型。B为小鼠模型使用引物对1(Primers1)和引物对2(Primers2)PCR鉴定结果;WT代表野生型受体小鼠;MT代表Targeted allele代表METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型,water代表空白对照。
图5为本发明构建的METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型经诱导后,在肺部中METTL7B的表达量。纵坐标为METTL7B基因的相对于GAPDH基因的表达量。WT代表野生型受体小鼠;CKI#1week post-induction代表METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型经诱导1周后,CKI#2week post-induction代表METTL7Bflox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型经诱导2周后。
图6为本发明构建的METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型经诱导后,小鼠肺部的变化图。A为METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2小鼠被他莫昔芬诱导2周后的解剖图。;B为A图局部放大后肺部的情况;C为对照组野生型受体小鼠(WT)及METTL7Bflox/flox Sftpc-CreERT2小鼠模型的肺部比较;D为对照组野生型受体小鼠(WT)的脾脏;E为METTL7B flox/floxSftpc-CreERT2小鼠模型的脾脏。
图7为本发明构建的METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型经诱导后,小鼠脾脏及肝脏的变化图。A为小鼠模型脾脏表型和野生型受体小鼠(WT)脾脏表型比较结果;B为小鼠模型肝脏表型和野生型受体小鼠(WT)肝脏表型比较结果。
图8为本发明构建的METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2敲入小鼠模型在他莫昔芬诱导2周后,与野生型受体小鼠(WT)相比,肺部切片的HE染色图比较结果。
具体实施方式
动物病毒:公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、肺组织特异性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型的构建
1.构建向小鼠ROSA26基因打靶的RNP注射复合物
1.1gRNA靶序列设计
小鼠基因组中甲基化转移酶样蛋白7B(METTL7B)的氨基酸序列为序列表中序列1所示。METTL7B基因(NCBI:NM_027853.2)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
根据小鼠基因组中METTL7B序列,输入到http://crispr.mit.edu/网址,选定好种属基因组与相应的PAM序列NGG,则可以得出多个gRNA以及对应的特异性、切割效率和潜在脱靶位点,最后选择5’-CTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGG-3’(序列表中序列4)作为最符合的gRNA靶序列。
1.2外源供体载体的制备
合成含有CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse Mettl7b CDS-polyA基因表达盒(序列表中序列3)的质粒打靶载体(赛业生物)(图1)。基因表达盒中即序列表中序列3的第5565-6299位核苷酸为METTL7B基因的编码CDS序列;基因表达盒中含有loxP-Stop-loxP序列(lox侧翼序列和终止子序列),即序列表中序列3的第4615-5524位核苷酸,在没有Cre酶表达的条件下METTL7B基因不表达。基因表达盒中的启动子为CAG启动子(图1中A)。
2.肺组织特异性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠的制备
2.1小鼠受精卵细胞的制备
2.1.1超排卵
筛选3-4周龄雄性C57BL/6J小鼠1只,雌性C57BL/6小鼠3只。雌鼠于第一天14:00腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG(5U/只),第三天14:00腹腔注射人绒毛膜促性腺激素hCG(5U/只),两者注射时间间隔46-48h;然后立即将3只雌鼠与1只雄鼠合笼,第四天8:00-9:00检查雌鼠阴道栓,选取检查到阴栓的雌鼠。
2.1.2受精卵收集及培养
安乐死上述步骤2.1.1中检查到阴栓的雌鼠,无菌采集其输卵管,放入一个35mm皮氏培养皿(用M2培养液和透明质酸酶溶液制作的液滴培养基,37℃预温)中,在体视显微镜下将输卵管壶腹部用镊子撕破,将卵丘细胞包围的合子团释放出来,移入透明质酸酶液滴中放置几分钟,收集受精卵,转移到M2液滴培养基中,挑选形态正常的受精卵,在37℃、5%CO2条件下培养备用。
2.1.3原核显微注射及输卵管内胚胎移植
制备显微注射注射针和固定针(赛业生物);
将步骤1中靶点序列对应的gRNA、cas9 mRNA和CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouseMettl7b CDS-polyA基因表达盒的混合物加样(3~5uL)到显微注射针内;
筛选步骤2中收集得到的形态正常的受精卵置于注射皿内,在200-400×倍的倒置显微镜下,将RNP注射复合物通过显微注射的方式注射到受精卵细胞核内;
将注射完毕的受精卵转移到M16培养基中,并放入37℃恒温5%的CO2培养箱内条件下过夜培养,挑选发育到2细胞期的胚胎植入代孕小鼠。
胚胎移植的具体步骤如下:准备假孕雌鼠:选取适龄(周龄6-8w,体重20-22g)的可育CD-1雌性小鼠(维通利华)与输精管结扎后绝育的CD-1雄性小鼠(维通利华)交配,剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠,作为受精卵转基因后的代孕鼠;
假孕0.5d(当天早晨检查到阴栓)的CD-1雌性小鼠,麻醉后于背部做约1cm切口,暴露卵巢和输卵管,体视显微镜下,将显微注射后培养到2细胞期的胚胎植入输卵管壶腹部,将卵巢和输卵管放回腹腔后缝合,左右两侧输卵管均移植,每只代孕小鼠植入20个2细胞期胚胎后产出获得的小鼠为F0代基因敲入小鼠。
2.1.4阳性F0代小鼠的鉴定
提取F0代基因敲入小鼠尾部组织DNA,经过PCR,琼脂糖凝胶电泳鉴定。
其中小鼠DNA提取为利用QIAamp DNA Mini Kit(51304)进行DNA提取,步骤如下:
剪鼠尾,破碎组织,在组织中加入180μL Buffer ATL,20μL蛋白酶K和10μLRNaseA,混合后56℃孵育3小时;12000rpm离心1min,加200μL Buffer ATL和200μL无水乙醇,充分混合;将混合液转移到QIAamp minispin column中,8000rpm离心1min,丢弃穿流液;离心柱内加500μL Buffer AW1,8000rpm离心1min,丢弃穿流液;加入500μL Buffer AW2,12000rpm离心2min,丢弃穿流液;重复一次;空柱12000rpm离心2min;将QIAamp minispin column放在1.5ml EP管中,在离心柱中加入50-200μL超纯水进行DNA洗脱;12000rpm离心1min,可重复一次。
用于F0代基因敲入小鼠基因PCR鉴定的特异性引物序列如下:
Primers1:(退火温度60.0℃):
F2:5’-AGATCTGCAAGCTAATTCCTGC-3’;
R2:5’-TAGGACCTGGCTGTTAGCATGGC-3;
PCR产物大小:254b。
Primers2:(退火温度60.0℃):
F1:5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’;
R1:5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’;
Internal control PCR primer F:5’-CATGCCAATGGTTCACTCTAAGGT-3’;
Internal control PCR primer R:5’-TCTCTATGTCCCAAAGTGCAGACAC-3’;
Primers2引物对对应的PCR产物大小:453bp;
Internal control引物对对应的PCR产物大小:335bp。
PCR结果鉴定方法为:
F0代基因敲入小鼠(MT):Primers1引物对对应的PCR产物大小为254bp;Primers2引物对对应的PCR产物大小为335bp;
野生型受体小鼠(WT):Primers1引物对对应的PCR产物:无条带;Primers2引物对对应的PCR产物为453bp和335bp两个条带。
PCR条件为:
PCR混合液1见表1,扩增条件见表2。
表1.PCR混合液1
总体积 | 30μL |
鼠尾基因组DNA | 3μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
<![CDATA[2×Hieff<sup>TM</sup>PCR Master Mix]]> | 15μL |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 10μL |
表2.PCR扩增条件
PCR鉴定结果:
PCR结果如图1所示,Primer 1引物对PCR扩增产物中F0代基因敲入小鼠可以看到254bp的目的条带(图1中MT代表)而WT(对照组野生型受体小鼠)和空白对照组(图1中water代表)则无相应条带。Primer 2引物对PCR结果中,F0代基因敲入小鼠(图1中MT代表)可以看到453bp的目的条带,而WT出现453bp及335bp两条带,空白对照组则无条带。表明F0代敲入小鼠基因组成功敲入了METTL7B基因的核苷酸序列(即序列3的第5565-6299位核苷酸)。
2.1.5 F1代基因敲入小鼠的获得及鉴定
F1代基因敲入小鼠的获得:将步骤2.1.4获得的阳性F0代基因敲入小鼠与野生型异性小鼠交配,获得F1代杂合子小鼠(简称F1代小鼠)。
提取F1代小鼠尾部组织DNA,经过PCR,琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用于F1小鼠基因PCR鉴定的特异性引物序列如下:
引物对3:Primer3(阳性PCR产物长度:2.7kb,对照野生型WT小鼠无条带):
F1:5’-TACGCCACAGGGAGTCCAAGAATG-3’;
R1:5’-GCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG-3’;
引物对4:Primer4(阳性PCR产物长度:2.7kb,对照野生型WT小鼠无条带):
F2:5’-GATGGGGAGAGTGAAGCAGAACG-3’;
R2:5’-CTGGAAATCAGGCTGCAAATCTC-3。
PCR条件:
PCR混合液2见表3,扩增条件见表4。
表3 PCR混合液2
总体积 | 30μL |
鼠尾基因组DNA | 3μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
<![CDATA[2×Hieff<sup>TM</sup>PCR Master Mix]]> | 15μL |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 10μL |
表4.PCR扩增条件
PCR鉴定结果显示:
F1代基因敲入小鼠有三只(编号为5、8和11)经过PCR鉴定为阳性(图2中B)。
Southern blot实验分析:
使用PCR及DNA测序进行验证。
Southern blot实验步骤如下:
采用Mfel和Avrll核酸内切酶分别切割F1代基因敲入小鼠的基因组DNA(图3中A)。
Southern Blot杂交检测过程:
1)提取F1代小鼠尾部组织DNA。
2)制备探针,通过PCR方法将Dig-dUTP参入到步骤1)的DNA分子中;
制作探针的PCR引物如下:5’Probe引物:
5’Probe forward primer:5’-AAACGTGGAGTAGGCAATACCCAGG-3’;
5’Probe reverse primer:5’-AAAGAAGGGTCACCTCAGTCTCCCT-3’;
3’Probe引物:
3’Probe forward primer:5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’;
3’Probe reverse primer:5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3。
Southern blot杂交印迹的目标片段大小应为:
5’Probe-Mfel:12.61kb-WT(对照野生型小鼠),4.78kb-MT(F1代小鼠);
3’Probe-Avrll:5.27kb-WT(对照野生型小鼠),9.33kb-MT(F1代小鼠)。
3)琼脂糖凝胶电泳分离DNA。
4)将DNA转到尼龙膜上。
5)探针变性后,与DNA分子进行杂交,利用BCIP/NBT化学显色发显色,显影拍照观察。
Southern blot结果:
F1代基因敲入小鼠有三只(编号为5、8和11)经过southern blot鉴定为阳性(图3中B)。
2.1.6小鼠模型的获得
2.1.6.1METTL7B肺部特异性条件性表达工具Cre小鼠的获得
将步骤2.1.5获得的F1代杂合子基因敲入小鼠进行近亲交配(F1代雄鼠与F1雌鼠交配),获得F2代纯合子基因敲入小鼠。
用肺组织特异性Cre转基因小鼠Sftpc-CreERT2(赛业生物,货号C001034)与F2纯合子代小鼠进行交配,经过PCR扩增鉴定,获得METTL7B肺部特异性敲入的杂合子小鼠。将METTL7B肺部特异性敲入的杂合子小鼠近交(雄鼠与雌鼠交配),获得METTL7B肺部特异性敲入的纯合子小鼠METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2,即METTL7B肺部特异性条件性表达工具小鼠模型。该小鼠模型仅在肺部表达METTL7B(特异性),且在Cre重组酶被激活表达的条件下(条件性)在肺部表达METTL7B。
PCR鉴定引物:
Primer 1引物对1:扩增产物长度为254bp
正向引物F1:5’-AGATCTGCAA GCTAATTCCTGC-3’;
反向引物R1:5’-TAGGACCTGGCTGTTAGCATGGC-3’;
Primer 2引物对(Sftpc通用引物):扩增产物长度为:野生型小鼠(WT)327bp;工具小鼠模型:210bp。
Sftpc-M-F:5’-TGCTTCACAGGGTCGGTAG-3’;
Sftpc-M-R:5’-ACACCGGCCTTATTCCAAG-3’;
Sftpc-W-R:5’-CATTACCTGGGGTAGGACCA-3’。
PCR条件:
PCR混合液3见表5,扩增条件见表6。
表5.PCR混合液3
总体积 | 30μL |
鼠尾基因组DNA | 3μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
<![CDATA[2×Hieff<sup>TM</sup>PCR Master Mix]]> | 15μL |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 10μL |
表6.PCR扩增条件
PCR结果如图4所示,Primer 1引物对PCR扩增产物中工具小鼠模型可以看到254bp的目的条带而WT(对照组小鼠)和BK组(空白对照组)则无相应条带。Primer2引物对中,工具小鼠模型(MT代表)可以看到210bp和327bp的目的条带,而WT可以看到327bp条带,BK组则无(图4中B)。表明工具小鼠模型基因组敲入了METTL7B基因的核苷酸序列(即序列3的第5565-6299位核苷酸)以及含有肺组织特异性Cre转基因,可以在Cre重组酶诱导表达条件下(如使用他莫昔芬诱导表达)特异地在肺部表达METTL7B基因。
实施例2、肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型的表型观察
1.使用他莫昔芬诱导Cre重组酶活性实现工具小鼠模型肺组织特异性条件性表达METTL7B
将他莫昔芬(Tamoxifen,Sigma-Aldrich,CAS#10540-29-1)以20mg/mL的浓度溶于玉米油(Sigma-Aldrich,CAS#8001-30-7)中得到他莫昔芬溶液。对于成年METTL7B flox/floxSftpc-CreERT2工具小鼠模型(体重20±1g)6只,连续5天,每隔24小时一次通过灌胃200uL他莫昔芬溶液即可有效诱导重组。在灌胃结束后7天及14天,进行组织学分析及其他检测。他莫昔芬的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)可与ERT结合,可使SftpcCre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性,让METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2工具小鼠模型在II型肺泡细胞中实现METTL7B基因的核苷酸序列的特异性敲入。METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2工具小鼠模型的肺组织中含有Cre重组酶基因,可以在其肺组织中特异表达Cre重组酶,在工具小鼠模型的其他组织中不表达Cre重组酶;经他莫昔芬溶液诱导条件后,激活Cre重组酶活性实现重组,工具小鼠模型可在其肺组织中特异表达METTL7B,即可以在肺组织特异性条件性表达METTL7B,而在工具小鼠模型的其他组织中不表达METTL7B。
2.经他莫昔芬诱导后工具小鼠模型肺部表型分析
分别于灌胃结束后7天及14天人道处死小鼠取肺部或肿瘤检测其重量并进行病理切片分析。
2.1METTL7B表达量检测分析
提取野生型小鼠(C57BL/6N)和METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2工具小鼠模型的肺部的RNA,进过逆转录之后利用qPCR检测METTL7B的表达。
RNA提取步骤:
收获肺部组织,剪碎,加入1mL TRIzol,涡旋混匀,室温静置5min。加入0.2mL氯仿,振荡15s,静置2min。4℃离心,12000g×15min,取上清。加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。4℃离心,12000g×10min,弃上清。加入1mL75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。晾干,加入适量的DEPC H2O溶解。
逆转录条件:
按照Primescript RT reagent kit with gDNA eraser(perfect Real Time)说明书进行,步骤如下:
(1)依次加入Anchore oligo(dT)primer(0.5μg/μl),Random primer(0.1μg/μl),2хES reactin mix,easyscrptrtion enzyme mix,gDNA remover,RNA500ng,RNasa-freewater补至20μl;
(2)按照逆转录反应程序进行cDNA合成程序:42℃孵育15分钟,85℃加热5秒,及获得cDNA,4℃保存,备用;
qPCR条件
表5.PCR混合液3
总体积 | 10μL |
cDNA | 3μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
2хSYBR premix ex TaqⅡ | 5μL |
表6.qPCR扩增条件
以GAPDH为内参基因,荧光实验结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法分析METTL7B基因的相对表达。如图5所示的野生型小鼠和METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2工具小鼠模型的肺部的METTL7B表达量:在使用他莫昔芬诱导1周(图5中CKI#1week post-induction代表)和2周(图5中CKI#2week post-induction代表)后METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2工具小鼠模型的肺部的METTL7B表达明显上调,而野生型小鼠(图5中WT代表)的肺部则不表达METTL7B。
2.2表型分析
经他莫昔芬诱导后,取工具小鼠模型肺部组织进行HE染色分析,并取小鼠脾脏及肝脏进行观察。
可以观察到METTL7B flox/flox Sftpc-CreERT2小鼠的肺部有局部发炎的症状(图6中A和B),野生型小鼠(图6和图7中WT代表)则无炎症的表现(图6中C,图7中A)。另外,野生型小鼠(图6中D)和METTL7B SFTPC-Cre CKI工具小鼠模型的脾脏(图6中E)大小具有明显差异:METTL7B SFTPC-Cre CKI工具小鼠模型的脾脏发生肿胀(图6中E,图7中B),METTL7B SFTPC-Cre CKI工具小鼠模型的肝脏也发生肿胀(图7中B)。
HE染色结果显示:
经他莫昔芬诱导2周后,对照组野生型小鼠肺泡结构清晰,肺泡大小均匀(图8中WT);他莫昔芬诱导2周后METTL7B SFTPC-Cre CKI工具小鼠模型肺间质内可见不同程度的炎性细胞浸润,说明METTL7B上调后可以引起肺部炎症反应(图8)。
HE染色步骤
1)脱蜡:
1.将小鼠肺部切片投入二甲苯中脱蜡10min,重复一次。
2.移入无水酒精(100%)中,约2min,重复一次。
3.移入90%酒精中,约2min,重复一次。
4.移入80%酒精中,约2min,重复一次。
5.移入70%酒精中,约2min。
6.移入水中,洗去酒精,约2~3min。
7.移入蒸馏水中,约2min。
2)染色:
1.移入苏木素中,浸染3min。
2.自来洗约1min。
3.移入分化液(1%盐酸酒精)中,分化30秒钟。
4.移入流水中,洗涤5min。
5.移入伊红液中,浸染2min。
6.移入水中,洗去伊红,并擦净玻片上的多余染料。
(三)脱水:
1.玻片移入80%酒精中,脱水,约3min。
2.移入90%酒精中脱水,约2min。
3.移入无水酒精(100%酒精)彻底脱水,2min。
(四)透明
1.移入二甲苯Ⅰ中透明3min。
2.移入二甲苯Ⅱ中透明3min。
(五)封固:
用树胶封固,先从二甲苯Ⅱ中取出切片,滴树胶于组织片上,然后取干净的盖玻片,仔细加在封固剂上。切片封固后凉干。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.构建肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7B的工具小鼠模型的方法,包括将甲基化转移酶样蛋白7B的基因表达盒导入受体小鼠的ROSA26编码基因中,得到转基因小鼠,将所述转基因小鼠与肺组织特异性条件性Cre表达小鼠杂交获得所述肺组织特异性表达甲基化转移酶样蛋白7B基因的工具小鼠模型;所述工具小鼠模型在诱导Cre酶表达条件下在肺组织中特异性表达甲基化转移酶样蛋白7B;
所述基因表达盒含有甲基化转移酶样蛋白7B的编码序列,所述基因表达盒在启动子和甲基化转移酶样蛋白7B的编码序列之间含有lox侧翼序列和终止子;
所述肺组织特异性条件性Cre表达小鼠在诱导Cre酶表达条件下在肺组织中特异性表达Cre酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述甲基化转移酶样蛋白7B蛋白选自下述任一种蛋白质:
A1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质;
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质;
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述甲基化转移酶样蛋白7B蛋白的编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法,其特征在于:所述基因表达盒含有CAG启动子。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的方法,其特征在于:所述导入包括采用CRISPR/Cas9系统将所述基因表达盒导入受体小鼠受精卵的ROSA26编码基因中。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法,其特征在于:所述导入包括将表达靶向所述ROSA26编码基因中的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述基因表达盒通过显微注射导入所述受体小鼠受精卵,得到所述转基因小鼠的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述gRNA的靶序列为序列表中序列4。
8.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的方法,其特征在于:所述lox侧翼序列和终止子的核苷酸序列为序列表中序列3的第4615-5524位。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述基因表达盒的核苷酸序列是序列表中序列3。
10.下述任一种应用:
B1)权利要求1-9中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-9中任一权利要求中所述的小鼠模型在制备、开发或研究肺部疾病相关药物中的应用;
B2)权利要求1-9中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-9中任一权利要求中所述的小鼠模型在制备肺部疾病临床实验用药中的应用;
B3)权利要求1-9中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-9中任一权利要求中所述的小鼠模型在研究甲基化转移酶样蛋白7B调控相关的肺部疾病发明机制中的应用;
B4)权利要求1-9中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-9中任一权利要求中所述的小鼠模型在研究物质在抗肺炎和/或抗肺纤维化和/或抗肺癌评价中的应用。
Priority Applications (1)
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