CN117821454A - 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 - Google Patents

神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，该方法包括：利用CRISPR/Cas9技术，针对目的基因的基因结构寻找靶序列，并根据靶序列信息设计针对9130024F11Rik的guide‑RNA；经活性检测后，将具有活性的guide‑RNA和Cas9体外转录；最后将guide‑RNA、Cas9mRNA以及含有loxP位点的donor DNA片段注射到受精卵中，从后代中筛选获得目的阳性小鼠。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术设计神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶向RNA，首次构建了神经特异性9130024F11Rik基因的小鼠敲除模型，该模型在神经干细胞以及组细胞分化机理研究方面具有较高的应用价值，可作为研究脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。

Description

神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其 构建方法、应用
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，且特别涉及一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用。
背景技术
Satb2(Special AT-rich sequence-binding protein 2)属于SATB家族，位于小鼠1号染色体，位于人类2号染色体，二者高度同源。Satb2蛋白作为与核基质附着区(MAR)结合的转录因子，其具有5个转录本，可以激活多个基因的转录。同时，Satb2也是几个基因调控网络的高级调控者，在多个发育过程中具有关键作用。近年来的研究表明了Satb2在大脑皮层干细胞、祖细胞的分化和增殖过程中起重要的调控作用。神经系统发育过程中，SATB2蛋白可以使轴突延伸至胼胝体，确保大脑半球间神经冲动信号得以协同传递；同时，SATB2蛋白也影响味觉形成以及长期记忆形成过程，故而研究其调控途径十分重要。
9130024F11Rik(RIKEN cDNA 9130024F11 gene，简称9130024F11Rik)位于小鼠的1号染色体，处于Satb2反方向上游的位置。9130024F11Rik在中枢神经系统的胚胎时期(E11.5,E14和E18)中表达呈上升趋势，在E14.5的全脑和成年的大脑皮层表达水平较高。该基因与Satb2基因呈反向转录，且与Satb2的5’-非翻译区(5’-UTR)部分重叠。
LncRNA-9130024F11Rik在大脑中特异性表达，与Satb2基因呈反向转录且与之部分重叠。9130024F11Rik的这些结构特征暗示其很有可能会参与到Satb2的表达调控。这对研究神经干细胞、祖细胞在大脑中的作用有着一个非常关键的作用。目前，Satb2在大脑发育中的调控机制已有较多研究，但是针对其与LncRNA之间的相互作用的研究较少。在现有的基因敲入小鼠库中也尚未发现有神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠及其与神经性疾病相关的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，利用CRISPR/Cas9技术构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠模型，为神经性疾病的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标RNA(guide-RNA)，所述特异性靶向RNA包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA3、guide-RNA 4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8，所述guide-RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述guide-RNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述guide-RNA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述guide-RNA 4的核苷酸序列如SEQID NO：4所示，所述guide-RNA 5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述guide-RNA 6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述guide-RNA 7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述guide-RNA 8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中，所述guide-RNA 1和所述guide-RNA2作用于9130024F11Rik基因的Intron 1靶序列，所述guide-RNA 3和所述guide-RNA 4作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 2靶序列，所述guide-RNA 5和所述guide-RNA 6作用于9130024F11Rik基因的Intron 3靶序列，所述guide-RNA 7和所述guide-RNA 8作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 4靶序列，所述Intron 1靶序列如SEQ ID NO：9所示，所述Intron 2靶序列如SEQ ID NO：10所示，所述Intron 3靶序列如SEQ ID NO：11所示，所述Intron 4靶序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明提出一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、根据9130024F11Rik基因的结构确定敲除intron 1-4，并针对所述9130024F11Rik基因的intron 1-4设计特异性靶向RNA；
S2、将有活性的所述特异性靶向RNA和Cas9质粒体外转录成mRNA，得到sgRNA和Cas9mRNA，然后通过显微镜注射将所述sgRNA、所述Cas9 mRNA以及含有loxP位点的donorDNA片段注射到小鼠受精卵中；
S3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)；
S4、将所述9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)与野生型C57BL/6J小鼠交配、繁殖，得到杂合子敲除鼠(f/+)，然后将所述杂合子敲除鼠(f/+)雌雄同笼进行自交，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，即纯合子基因敲除鼠(f/f)。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述基因型鉴定采用短片段PCR方法，所述短片段PCR方法的引物包括9130024F11Rik-P1、9130024F11Rik-P2和9130024F11Rik-P3，所述9130024F11Rik-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述9130024F11Rik-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述9130024F11Rik-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述短片段PCR方法采用的PCR反应体系为：
0.5uL9130024F11Rik-P1正向引物
0.5uL9130024F11Rik-P2反向引物
0.5uL9130024F11Rik-P3反向引物
7.5uL2×PCR mix
5uLddH2O。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120V、80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为纯合子小鼠(f/f)。当3个引物在同一种体系内扩增时，野生型小鼠(+/+)只能获得长度为359bp的扩增产物。纯合子小鼠(f/f)由于插入序列较长，在控制PCR过程中延伸时间的情况下，只能获得长度为457bp的扩增产物，而杂合子小鼠(f/+)则能同时获得2种产物。
本发明提供了一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，其根据所述的构建方法构建得到。本发明构建的纯合子基因敲除鼠(f/f)在大脑皮层被特异性敲除9130024F11Rik基因，该小鼠可作为研究大脑发育分子机理的动物模型。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在大脑发育分子机理研究中的应用。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病研究中的应用。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病药物研发及药效评价中的应用。
本发明实施例的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用的有益效果是：
本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术设计神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶向RNA，并成功构建得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。本发明首次构建了神经特异性9130024F11Rik基因的小鼠敲除模型，该模型在神经干细胞以及组细胞分化机理研究方面具有较高的应用价值，可作为研究脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为9130024F11Rik敲除阳性小鼠的构建流程图；
图2为9130024F11Rik阳性杂合子小鼠(+/-)的繁殖示意图；
图3为9130024F11Rik基因型测定的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用进行具体说明。以下实施例中使用的小鼠为C57BL/6J小鼠，其来源于上海南方模式生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供的一种用于构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶点导向RNA，即guide-RNA，其包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA3、guide-RNA 4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8。该guide-RNA的核苷酸序列如下：
guide-RNA 1：CTTTGGCTGGGCATGTTCGT(SEQ ID NO：1)
guide-RNA 2：ACTTTGCTTTCACGGGCT(SEQ ID NO：2)
guide-RNA 3：TAGGGAGAGGCACTATTAGG(SEQ ID NO：3)
guide-RNA 4：TATAGGGAGAGGCACTATT(SEQ ID NO：4)
guide-RNA 5：CTACCACAGTGCCACCCGT(SEQ ID NO：5)
guide-RNA 6:：AGCTACCACAGTGCCACCCG(SEQ ID NO：6)
guide-RNA 7：GTAAAGCTGCGCGAGCCGAA(SEQ ID NO：7)
guide-RNA 8：CGCGGCCGGCAGCGGGGTTT(SEQ ID NO：8)
实施例2
本实施例提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的方法，包括以下步骤：
(1)参照图1所示，将实施例1的guide-RNA与cas9质粒体外转录成mRNA，获得新的有活性的sgRNA和cas9 mRNA；然后将有活性的sgRNA和含有loxP位点的donor DNA片段注射到受精卵中，并将受精卵移植到小鼠中孕育，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)。本发明使用CRISPR-Cas9的方法对9130024F11Rik基因的1、2、3、4号外显子两端进行flox修饰，获得被修饰的片段后将其显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，经过同源重组的方式，获得9130024F11Rik基因flox的小鼠(+/-)。
(2)参照图2所示，在获得9130024F11Rik阳性杂合子(+/-)后，需要进行杂交以得到足够数量的纯合子小鼠。首先将F0杂合子(+/-)与野生型的C57BL/6J小鼠交配，获得大量的杂合子敲除鼠(+/-)。然后将获得的杂合子敲除鼠(+/-)雌雄同笼进行自交，获得纯合子基因敲除鼠(-/-)。本发明所用小鼠均饲养于屏障系统的鼠房(用于清洁级和SPF等级小鼠饲养)，鼠笼壁透明且可透光，给与12小时光照与12小时黑暗循环，光照为7:00-19:00，黑暗为19:00-次日7:00，粮食与饮水供应充足，温度恒定23～25℃。以观察到雌鼠阴道栓的出现为受精0.5天，P0代表出生第一天，小鼠于晚上19:00之后出生则记第二天为P0。
(3)通过PCR对获得的阳性小鼠进行基因型鉴定，以确认敲除成功。
(3.1)快速提取DNA步骤为：
剪小鼠尾尖1～2mm至2mL EP管中，加600μL裂解液salting out和6μL ProteinaseK置于水浴锅55℃消化8h以上(过夜)。待组织块彻底消化后，加入600μL DNA提取液(苯酚氯仿异戊醇，25:24:1)，颠倒混匀5min，接着在12000rpm离心6min后，取上清液至新EP管中，加两倍体积无水乙醇，迅速晃动，可见白色絮状沉淀。然后再12000rpm离心15min，弃上清，晾干。最后加适量双蒸水溶解，置于-20℃冰箱冷冻保存。测定DNA浓度，确认DNA提取成功。
(3.2)通过PCR来检测所获得的小鼠的基因型的步骤为：
根据前述的9130024F11Rik基因片段敲除来构建引物序列,本发明利用短片段PCR方法来鉴定9130024F11Rik-e(loxp-SA-EGFP-3XpA-loxp)1小鼠的基因型，其基本原理是根据PCR产物片段长度的不同，在插入的flox区域前后设计引物，插入后该基因片段会增加457bp，以此来鉴定敲除鼠，其引物序列包括：
9130024F11Rik-P1：GAGAAAGGGTTGCTCCGTG(SEQ ID NO：13)
9130024F11Rik-P2：CGCCACCTTAAACAAGTAAAGC(SEQ ID NO：14)
9130024F11Rik-P3：AAGGCTAGAAAGACTGGAGTTG(SEQ ID NO：15)
9130024F11Rik的PCR反应体系如表1所示。
表1PCR反应体系(15μL)
PCR的反应条件为：①预变性95℃3min；②变性95℃30s；③退火60℃30s(9130024F11Rik的退火温度为58℃)；④延伸72℃30s(步骤②-④重复35个循环)；⑤延伸72℃5min；⑥15℃,15s。
(4)使用1.5％的琼脂糖凝胶,在120V，80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。如图3所示为9130024F11Rik基因型测定的电泳图。其中，野生型C57BL/6小鼠9130024F11Rik+/+的PCR产物大小为359bp；纯合子9130024F11Rikf/f由于插入序列较长，在控制PCR过程中延伸时间的情况下，只能获得长度为457bp的扩增产物；而杂合子9130024F11Rikf/+小鼠则能同时获得2种产物。9130024F11Rik-e(loxp-SA-EGFP-3XpA-loxp)载体包含约5kb 5’同源臂、约2.8kb的loxp-SA-EGFP-3XpolyA-loxp cassette，和约2.4kb 3’同源臂(SEQ ID NO：16)。
本发明成功构建了大脑特异性敲除的9130024F11Rik小鼠模型，其在研究神经干细胞、组细胞分化机理方面具有较高的应用价值，可作为理解脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标RNA，其特征在于，所述特异性靶向RNA包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA 3、guide-RNA4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8，所述guide-RNA 1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述guide-RNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述guide-RNA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述guide-RNA 4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述guide-RNA 5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述guide-RNA 6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述guide-RNA 7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述guide-RNA 8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中，所述guide-RNA 1和所述guide-RNA 2作用于9130024F11Rik基因的Intron 1靶序列，所述guide-RNA 3和所述guide-RNA 4作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 2靶序列，所述guide-RNA 5和所述guide-RNA 6作用于9130024F11Rik基因的Intron 3靶序列，所述guide-RNA 7和所述guide-RNA 8作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 4靶序列，所述Intron 1靶序列如SEQ ID NO：9所示，所述Intron 2靶序列如SEQ ID NO：10所示，所述Intron 3靶序列如SEQ ID NO：11所示，所述Intron 4靶序列如SEQ ID NO：12所示。
2.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据9130024F11Rik基因的结构确定敲除intron 1-4，并针对所述9130024F11Rik基因的intron 1-4设计特异性靶向RNA；
S2、将有活性的所述特异性靶向RNA和Cas9质粒体外转录成mRNA，得到sgRNA和Cas9mRNA，然后通过显微镜注射将所述sgRNA、所述Cas9 mRNA以及含有loxP位点的donorDNA片段注射到小鼠受精卵中；
S3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)；
S4、将所述9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)与野生型C57BL/6J小鼠交配、繁殖，得到杂合子敲除鼠(f/+)，然后将所述杂合子敲除鼠(f/+)雌雄同笼进行自交，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定采用短片段PCR方法，所述短片段PCR方法的引物包括9130024F11Rik-P1、9130024F11Rik-P2和9130024F11Rik-P3，所述9130024F11Rik-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述9130024F11Rik-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述9130024F11Rik-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述短片段PCR方法采用的PCR反应体系为：
0.5uL9130024F11Rik-P1正向引物
0.5uL9130024F11Rik-P2反向引物
0.5uL9130024F11Rik-P3反向引物
7.5uL2×PCR mix
5uLddH2O。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120V、80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为所述神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。
7.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1～6任意一项所述的构建方法构建得到。
8.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在大脑发育分子机理研究中的应用。
9.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病研究中的应用。
10.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病药物研发及药效评价中的应用。
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