CN117821454A - 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 - Google Patents
神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117821454A CN117821454A CN202311664519.5A CN202311664519A CN117821454A CN 117821454 A CN117821454 A CN 117821454A CN 202311664519 A CN202311664519 A CN 202311664519A CN 117821454 A CN117821454 A CN 117821454A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- guide
- gene
- seq
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 title claims abstract description 35
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 claims description 7
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 claims description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 claims description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004641 brain development Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102100032883 DNA-binding protein SATB2 Human genes 0.000 description 2
- 101000655236 Homo sapiens DNA-binding protein SATB2 Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 101100148763 Mus musculus Satb2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000299 nuclear matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，该方法包括：利用CRISPR/Cas9技术，针对目的基因的基因结构寻找靶序列，并根据靶序列信息设计针对9130024F11Rik的guide‑RNA；经活性检测后，将具有活性的guide‑RNA和Cas9体外转录；最后将guide‑RNA、Cas9mRNA以及含有loxP位点的donor DNA片段注射到受精卵中，从后代中筛选获得目的阳性小鼠。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术设计神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶向RNA，首次构建了神经特异性9130024F11Rik基因的小鼠敲除模型，该模型在神经干细胞以及组细胞分化机理研究方面具有较高的应用价值，可作为研究脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，且特别涉及一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用。
背景技术
Satb2(Special AT-rich sequence-binding protein 2)属于SATB家族，位于小鼠1号染色体，位于人类2号染色体，二者高度同源。Satb2蛋白作为与核基质附着区(MAR)结合的转录因子，其具有5个转录本，可以激活多个基因的转录。同时，Satb2也是几个基因调控网络的高级调控者，在多个发育过程中具有关键作用。近年来的研究表明了Satb2在大脑皮层干细胞、祖细胞的分化和增殖过程中起重要的调控作用。神经系统发育过程中，SATB2蛋白可以使轴突延伸至胼胝体，确保大脑半球间神经冲动信号得以协同传递；同时，SATB2蛋白也影响味觉形成以及长期记忆形成过程，故而研究其调控途径十分重要。
9130024F11Rik(RIKEN cDNA 9130024F11 gene，简称9130024F11Rik)位于小鼠的1号染色体，处于Satb2反方向上游的位置。9130024F11Rik在中枢神经系统的胚胎时期(E11.5,E14和E18)中表达呈上升趋势，在E14.5的全脑和成年的大脑皮层表达水平较高。该基因与Satb2基因呈反向转录，且与Satb2的5’-非翻译区(5’-UTR)部分重叠。
LncRNA-9130024F11Rik在大脑中特异性表达，与Satb2基因呈反向转录且与之部分重叠。9130024F11Rik的这些结构特征暗示其很有可能会参与到Satb2的表达调控。这对研究神经干细胞、祖细胞在大脑中的作用有着一个非常关键的作用。目前，Satb2在大脑发育中的调控机制已有较多研究，但是针对其与LncRNA之间的相互作用的研究较少。在现有的基因敲入小鼠库中也尚未发现有神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠及其与神经性疾病相关的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，利用CRISPR/Cas9技术构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠模型，为神经性疾病的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标RNA(guide-RNA)，所述特异性靶向RNA包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA3、guide-RNA 4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8，所述guide-RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述guide-RNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述guide-RNA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述guide-RNA 4的核苷酸序列如SEQID NO：4所示，所述guide-RNA 5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述guide-RNA 6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述guide-RNA 7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述guide-RNA 8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中，所述guide-RNA 1和所述guide-RNA2作用于9130024F11Rik基因的Intron 1靶序列，所述guide-RNA 3和所述guide-RNA 4作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 2靶序列，所述guide-RNA 5和所述guide-RNA 6作用于9130024F11Rik基因的Intron 3靶序列，所述guide-RNA 7和所述guide-RNA 8作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 4靶序列，所述Intron 1靶序列如SEQ ID NO：9所示，所述Intron 2靶序列如SEQ ID NO：10所示，所述Intron 3靶序列如SEQ ID NO：11所示，所述Intron 4靶序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明提出一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、根据9130024F11Rik基因的结构确定敲除intron 1-4，并针对所述9130024F11Rik基因的intron 1-4设计特异性靶向RNA；
S2、将有活性的所述特异性靶向RNA和Cas9质粒体外转录成mRNA，得到sgRNA和Cas9mRNA，然后通过显微镜注射将所述sgRNA、所述Cas9 mRNA以及含有loxP位点的donorDNA片段注射到小鼠受精卵中；
S3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)；
S4、将所述9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)与野生型C57BL/6J小鼠交配、繁殖，得到杂合子敲除鼠(f/+)，然后将所述杂合子敲除鼠(f/+)雌雄同笼进行自交，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，即纯合子基因敲除鼠(f/f)。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述基因型鉴定采用短片段PCR方法，所述短片段PCR方法的引物包括9130024F11Rik-P1、9130024F11Rik-P2和9130024F11Rik-P3，所述9130024F11Rik-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述9130024F11Rik-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述9130024F11Rik-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述短片段PCR方法采用的PCR反应体系为：
0.5uL9130024F11Rik-P1正向引物
0.5uL9130024F11Rik-P2反向引物
0.5uL9130024F11Rik-P3反向引物
7.5uL2×PCR mix
5uLddH2O。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120V、80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为纯合子小鼠(f/f)。当3个引物在同一种体系内扩增时，野生型小鼠(+/+)只能获得长度为359bp的扩增产物。纯合子小鼠(f/f)由于插入序列较长，在控制PCR过程中延伸时间的情况下，只能获得长度为457bp的扩增产物，而杂合子小鼠(f/+)则能同时获得2种产物。
本发明提供了一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，其根据所述的构建方法构建得到。本发明构建的纯合子基因敲除鼠(f/f)在大脑皮层被特异性敲除9130024F11Rik基因，该小鼠可作为研究大脑发育分子机理的动物模型。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在大脑发育分子机理研究中的应用。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病研究中的应用。
本发明提供了所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病药物研发及药效评价中的应用。
本发明实施例的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用的有益效果是：
本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术设计神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶向RNA，并成功构建得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。本发明首次构建了神经特异性9130024F11Rik基因的小鼠敲除模型，该模型在神经干细胞以及组细胞分化机理研究方面具有较高的应用价值，可作为研究脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为9130024F11Rik敲除阳性小鼠的构建流程图；
图2为9130024F11Rik阳性杂合子小鼠(+/-)的繁殖示意图；
图3为9130024F11Rik基因型测定的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用进行具体说明。以下实施例中使用的小鼠为C57BL/6J小鼠，其来源于上海南方模式生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供的一种用于构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶点导向RNA，即guide-RNA，其包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA3、guide-RNA 4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8。该guide-RNA的核苷酸序列如下：
guide-RNA 1：CTTTGGCTGGGCATGTTCGT(SEQ ID NO：1)
guide-RNA 2：ACTTTGCTTTCACGGGCT(SEQ ID NO：2)
guide-RNA 3：TAGGGAGAGGCACTATTAGG(SEQ ID NO：3)
guide-RNA 4：TATAGGGAGAGGCACTATT(SEQ ID NO：4)
guide-RNA 5：CTACCACAGTGCCACCCGT(SEQ ID NO：5)
guide-RNA 6:：AGCTACCACAGTGCCACCCG(SEQ ID NO：6)
guide-RNA 7：GTAAAGCTGCGCGAGCCGAA(SEQ ID NO：7)
guide-RNA 8：CGCGGCCGGCAGCGGGGTTT(SEQ ID NO：8)
实施例2
本实施例提供一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的方法，包括以下步骤：
(1)参照图1所示，将实施例1的guide-RNA与cas9质粒体外转录成mRNA，获得新的有活性的sgRNA和cas9 mRNA；然后将有活性的sgRNA和含有loxP位点的donor DNA片段注射到受精卵中，并将受精卵移植到小鼠中孕育，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)。本发明使用CRISPR-Cas9的方法对9130024F11Rik基因的1、2、3、4号外显子两端进行flox修饰，获得被修饰的片段后将其显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，经过同源重组的方式，获得9130024F11Rik基因flox的小鼠(+/-)。
(2)参照图2所示，在获得9130024F11Rik阳性杂合子(+/-)后，需要进行杂交以得到足够数量的纯合子小鼠。首先将F0杂合子(+/-)与野生型的C57BL/6J小鼠交配，获得大量的杂合子敲除鼠(+/-)。然后将获得的杂合子敲除鼠(+/-)雌雄同笼进行自交，获得纯合子基因敲除鼠(-/-)。本发明所用小鼠均饲养于屏障系统的鼠房(用于清洁级和SPF等级小鼠饲养)，鼠笼壁透明且可透光，给与12小时光照与12小时黑暗循环，光照为7:00-19:00，黑暗为19:00-次日7:00，粮食与饮水供应充足，温度恒定23～25℃。以观察到雌鼠阴道栓的出现为受精0.5天，P0代表出生第一天，小鼠于晚上19:00之后出生则记第二天为P0。
(3)通过PCR对获得的阳性小鼠进行基因型鉴定，以确认敲除成功。
(3.1)快速提取DNA步骤为：
剪小鼠尾尖1～2mm至2mL EP管中，加600μL裂解液salting out和6μL ProteinaseK置于水浴锅55℃消化8h以上(过夜)。待组织块彻底消化后，加入600μL DNA提取液(苯酚氯仿异戊醇，25:24:1)，颠倒混匀5min，接着在12000rpm离心6min后，取上清液至新EP管中，加两倍体积无水乙醇，迅速晃动，可见白色絮状沉淀。然后再12000rpm离心15min，弃上清，晾干。最后加适量双蒸水溶解，置于-20℃冰箱冷冻保存。测定DNA浓度，确认DNA提取成功。
(3.2)通过PCR来检测所获得的小鼠的基因型的步骤为：
根据前述的9130024F11Rik基因片段敲除来构建引物序列,本发明利用短片段PCR方法来鉴定9130024F11Rik-e(loxp-SA-EGFP-3XpA-loxp)1小鼠的基因型，其基本原理是根据PCR产物片段长度的不同，在插入的flox区域前后设计引物，插入后该基因片段会增加457bp，以此来鉴定敲除鼠，其引物序列包括：
9130024F11Rik-P1：GAGAAAGGGTTGCTCCGTG(SEQ ID NO：13)
9130024F11Rik-P2：CGCCACCTTAAACAAGTAAAGC(SEQ ID NO：14)
9130024F11Rik-P3：AAGGCTAGAAAGACTGGAGTTG(SEQ ID NO：15)
9130024F11Rik的PCR反应体系如表1所示。
表1PCR反应体系(15μL)
PCR的反应条件为：①预变性95℃3min；②变性95℃30s；③退火60℃30s(9130024F11Rik的退火温度为58℃)；④延伸72℃30s(步骤②-④重复35个循环)；⑤延伸72℃5min；⑥15℃,15s。
(4)使用1.5％的琼脂糖凝胶,在120V，80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。如图3所示为9130024F11Rik基因型测定的电泳图。其中，野生型C57BL/6小鼠9130024F11Rik+/+的PCR产物大小为359bp；纯合子9130024F11Rikf/f由于插入序列较长，在控制PCR过程中延伸时间的情况下，只能获得长度为457bp的扩增产物；而杂合子9130024F11Rikf/+小鼠则能同时获得2种产物。9130024F11Rik-e(loxp-SA-EGFP-3XpA-loxp)载体包含约5kb 5’同源臂、约2.8kb的loxp-SA-EGFP-3XpolyA-loxp cassette，和约2.4kb 3’同源臂(SEQ ID NO：16)。
本发明成功构建了大脑特异性敲除的9130024F11Rik小鼠模型，其在研究神经干细胞、组细胞分化机理方面具有较高的应用价值，可作为理解脑发育的分子机理、探究神经和精神系统疾病的病因的动物模型。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标RNA，其特征在于，所述特异性靶向RNA包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA 3、guide-RNA4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8，所述guide-RNA 1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述guide-RNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述guide-RNA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述guide-RNA 4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述guide-RNA 5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述guide-RNA 6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述guide-RNA 7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述guide-RNA 8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中，所述guide-RNA 1和所述guide-RNA 2作用于9130024F11Rik基因的Intron 1靶序列，所述guide-RNA 3和所述guide-RNA 4作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 2靶序列，所述guide-RNA 5和所述guide-RNA 6作用于9130024F11Rik基因的Intron 3靶序列，所述guide-RNA 7和所述guide-RNA 8作用于所述9130024F11Rik基因的Intron 4靶序列，所述Intron 1靶序列如SEQ ID NO：9所示，所述Intron 2靶序列如SEQ ID NO：10所示，所述Intron 3靶序列如SEQ ID NO：11所示，所述Intron 4靶序列如SEQ ID NO：12所示。
2.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据9130024F11Rik基因的结构确定敲除intron 1-4，并针对所述9130024F11Rik基因的intron 1-4设计特异性靶向RNA；
S2、将有活性的所述特异性靶向RNA和Cas9质粒体外转录成mRNA，得到sgRNA和Cas9mRNA，然后通过显微镜注射将所述sgRNA、所述Cas9 mRNA以及含有loxP位点的donorDNA片段注射到小鼠受精卵中；
S3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)；
S4、将所述9130024F11Rik阳性杂合子(f/+)与野生型C57BL/6J小鼠交配、繁殖，得到杂合子敲除鼠(f/+)，然后将所述杂合子敲除鼠(f/+)雌雄同笼进行自交，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定采用短片段PCR方法，所述短片段PCR方法的引物包括9130024F11Rik-P1、9130024F11Rik-P2和9130024F11Rik-P3，所述9130024F11Rik-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述9130024F11Rik-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述9130024F11Rik-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述短片段PCR方法采用的PCR反应体系为：
0.5uL9130024F11Rik-P1正向引物
0.5uL9130024F11Rik-P2反向引物
0.5uL9130024F11Rik-P3反向引物
7.5uL2×PCR mix
5uLddH2O。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120V、80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为所述神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。
7.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1～6任意一项所述的构建方法构建得到。
8.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在大脑发育分子机理研究中的应用。
9.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病研究中的应用。
10.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病药物研发及药效评价中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311664519.5A CN117821454A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311664519.5A CN117821454A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117821454A true CN117821454A (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=90504960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311664519.5A Pending CN117821454A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117821454A (zh) |
-
2023
- 2023-12-06 CN CN202311664519.5A patent/CN117821454A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107217075B (zh) | 一种构建epo基因敲除斑马鱼动物模型的方法及引物、质粒与制备方法 | |
| Skryabin et al. | Deletion of the MBII-85 snoRNA gene cluster in mice results in postnatal growth retardation | |
| WO2018177351A1 (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
| O’Doherty et al. | Genomic imprinting effects on complex traits in domesticated animal species | |
| CN110438160B (zh) | 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用 | |
| WO2018045727A1 (zh) | 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用 | |
| CN111926017A (zh) | 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用 | |
| CN110804629A (zh) | PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法 | |
| CN113088521A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法 | |
| CN113957074B (zh) | 一种小脑共济失调疾病模型的构建方法及应用 | |
| CN113801893A (zh) | 一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用 | |
| Monecke et al. | Duper: A mutation that shortens hamster circadian period | |
| CN113897369A (zh) | KRT10定点基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的构建及应用 | |
| JPWO2020183419A5 (zh) | ||
| CN104046644A (zh) | 人源化小鼠模型的构建方法和应用 | |
| CN113234756A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法 | |
| Zhang et al. | Crispr/Cas9‐mediated cleavages facilitate homologous recombination during genetic engineering of a large chromosomal region | |
| CN117821454A (zh) | 神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 | |
| CN107955818B (zh) | 一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途 | |
| CN109694885B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒 | |
| CN114085840A (zh) | Camta2基因缺失型斑马鱼的构建方法 | |
| CN108048463B (zh) | 一种构建rip3基因敲除小鼠的碱基序列、载体、方法及应用 | |
| CN117625620A (zh) | 神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用 | |
| CN115851833B (zh) | Notch2nlc基因ggc重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用 | |
| CN114958908B (zh) | 基于CRISPR/Cas9构建Ets2基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |