CN113528572A

CN113528572A - 一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN113528572A
Application number: CN202110842679.9A
Authority: CN
Inventors: 史丽云; 张薇; 沙舟; 冀鹏
Original assignee: Zhejiang Shuren University
Current assignee: Zhejiang Shuren University
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2021-07-26
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-07-26
Also published as: WO2023004847A1; CN113528572B

Abstract

本发明公开了一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用，所述小鼠早衰模型是通过敲除小鼠骨髓来源细胞中的乙肝病毒X蛋白结合蛋白而获得的。该早衰小鼠在4‑8个月龄时出现脱毛、衰老相关基因表达显著上调、血清中衰老相关的分泌表型因子上调、组织器官衰老等典型的早衰表型。本发明通过操控骨髓来源的免疫细胞条件性敲除HBXIP，诱导小鼠早衰具有显著的创新性和良好的应用前景，可用于建立延缓衰老的个性化药物/食材/技术方法等的筛选平台，同时，可用于研究衰老相关疾病，如神经退行性疾病、代谢性疾病、自身免疫及炎症性疾病等发病机制研究，以及相关疾病的预防、诊断和治疗等技术和产品研发。

Description

一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，具体涉及一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用。

背景技术

早衰即过早衰老，是指由于各种内在的或外在的原因使机体过早地出现生理上、体质上和心理上衰弱的现象，且其病理机制尚未明确。因此，衰老相关疾病已成为全球科研领域亟需解决和突破的热点及难点，延缓衰老是保证社会稳定、经济持续性发展的必要条件。

利用小鼠等模式生物衰老模型能更好地认识人类衰老的进程，为临床转化研究提供有效的工具和理论基础。常见的小鼠衰老模型主要包括D-半乳糖小鼠衰老模型、γ射线照射诱导小鼠衰老模型、胸腺摘除诱导小鼠衰老模型。除自然衰老小鼠模型以外，目前常见的小鼠衰老模型主要包括D-半乳糖注射小鼠衰老模型、胸腺摘除诱导小鼠衰老模型、γ射线照射诱导小鼠衰老模型等，这三种常见的小鼠衰老模型的构建方法及存在的缺陷如下所述：1)D-半乳糖注射法小鼠衰老模型：小鼠腹腔注射D-半乳糖生理盐水溶液500毫克/千克/天，连续2个月成模。每天注射D-半乳糖比较繁琐，注射造模时间较长，需要2个月左右，且由于小鼠的个性差异较大，不易控制；2)胸腺摘除小鼠衰老模型：麻醉小鼠，剥离并取出胸腺，缝合切口并滴加青霉素，继续常规饲养6个月成模。该造模方法对试验技术要求较高，在摘除胸腺时容易导致小鼠死亡，有一定的差异性。其耗费时间更长，需要6个月。胸腺摘除小鼠，对于衰老的某些免疫指标无法进行定性或定量的测定，难以判断是否达到理想的衰老状态，影响模型的可信度；3)γ射线照射诱导小鼠衰老模型：小鼠给予3Gy全身照射(照射面积为25cm×25cm，高度为80cm，时间为5min)，每10天一次，共8次，总计24Gy，80天后成模型。但是如果辐射剂量过大，则会使试验动物容易死亡，无法进行试验，因此要掌握好辐射的度和时间。

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B X-interacting protein,HBXIP)，是一种主要存在于哺乳动物的细胞组成型蛋白，分子量约为19kDa。HBXIP能够抑制乙型肝炎病毒的复制，促进肿瘤细胞的增殖和迁移，抑制LPS诱导的急性肺损伤和内毒素血症等。研究表明HBXIP促进细胞周期蛋白上调，抑制细胞周期负调控因子p21、p27表达，从而促进细胞增殖。HBXIP通过MDM2促进肿瘤抑制因子p53的降解，加速乳腺癌的生长。此外，HBXIP是晚期内体/溶酶体适配器以及MAPK和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白LAMTOR复合物的成员之一，参与调控mTORC1的活化，影响细胞的合成代谢、翻译、转录、脂质合成、自噬等过程。因此，HBXIP是参与机体重要生命活动的调节因子。本发明提供了一种基于HBXIP条件敲除的小鼠早衰模型构建及相关应用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种小鼠早衰模型。

本发明还要解决的技术问题是提供上述小鼠早衰模型的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述小鼠早衰模型的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种小鼠早衰模型，其特征在于，敲除小鼠骨髓来源细胞中的乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)。

其中，所述敲除为敲除乙肝病毒X蛋白结合蛋白编码基因中的第二个外显子。

其中，所述乙肝病毒X蛋白结合蛋白编码基因的mRNA序列为Gene Bank中的Accession:NM_026774.2，其基因组序列为Gene Bank中的Accession:NC_000069.7。

其中，所述敲除为通过Cre-loxp系统敲除；优选地，所述敲除为通过骨髓细胞特异性表达Cre重组酶小鼠LysM^cre/+敲除。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述小鼠早衰模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将HBXIP^fl/+小鼠与HBXIP^fl/+小鼠交配，获得HBXIP^fl/fl纯合子小鼠；

(2)将HBXIP^fl/fl小鼠与LysM^cre/+小鼠交配，获得BXIP^fl/+-LysM^cre/+小鼠；

(3)将HBXIP^fl/+-LysM^cre/+小鼠与HBXIP^fl/+-LysM^cre/+小鼠交配，获得HBXIP^fl/fl-LysM^cre/+小鼠(HBXIP^△LysM)。

步骤(1)中，所述HBXIP^fl/+小鼠为将C57BL/6小鼠中乙肝病毒X蛋白结合蛋白基因组(NC_000069.7)的第二个外显子(1013-1074)两侧的内含子区域分别添加loxp1位点和loxp2位点，即在HBXIP基因组序列的第762位核苷酸后插入如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列(loxp1位点)，第1250位核苷酸后插入如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列(loxp2位点)。

其中，所述loxp序列的插入方法可以用多种已知的、被大家公认的方法获得。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述小鼠早衰模型的应用。

其中，所述应用为所述小鼠早衰模型在开发或筛选预防和/或治疗早衰产品中的应用；其中，所述产品包括但不限于药物、食品、保健品、化妆品。

其中，所述应用为所述小鼠早衰模型在开发或筛选预防和/或治疗早衰技术方法中的应用。

其中，所述应用为所述小鼠早衰模型在早衰研究中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明中，所述早衰小鼠在4-8个月龄时出现脱毛、衰老相关基因表达显著上调、血清中衰老相关的分泌表型因子上调、组织器官衰老等典型的早衰表型。

(2)对比自然衰老小鼠(18-24月龄)，本发明所提供的髓系细胞条件性敲除HBXIP小鼠具有饲养周期短(6-8月龄)、个体差异小、干扰因素少、成本低等优势。

(3)对比目前常见的三种小鼠衰老模型，本发明所提供的髓系细胞条件性敲除HBXIP小鼠早衰模型具有1)无需繁杂的造模过程，可稳定繁殖，自发衰老表型；2)对实验技术要求不高且易于控制，可避免造模过程中因操作等原因所导致的小鼠死亡；3)衰老状态易于检测和表征，可准确判断小鼠的衰老状态，模型可信度高；4)基因敲除背景小鼠个体差异小等优势；5)且髓系细胞条件性HBXIP敲除，是指HBXIP的敲除具有细胞特异性，仅在骨髓细胞系中发生，包括单核细胞、成熟的巨噬细胞和粒细胞等。

(4)本发明通过操控骨髓来源的免疫细胞条件性敲除HBXIP，诱导小鼠早衰具有显著的创新性和良好的应用前景，可用于建立延缓衰老的个性化药物/食材/技术方法等的筛选平台，同时，可用于研究衰老相关疾病，如神经退行性疾病、代谢性疾病、自身免疫及炎症性疾病等发病机制研究，以及相关疾病的预防、诊断和治疗等技术和产品研发。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是HBXIP^△LysM鼠的制备方法及基因型鉴定。

图2是HBXIP^△LysM鼠BMDM中HBXIP敲除效果的转录水平验证。

图3是HBXIP^△LysM鼠BMDM中HBXIP敲除效果的蛋白水平验证。

图4是野生型小鼠(WT)与HBXIP^△LysM鼠BMDM中衰老相关基因的表达。

图5是野生型小鼠与HBXI^P△LysM鼠血清中衰老相关的分泌表型因子水平。

图6是野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠肝功能检测。

图7是野生型小鼠与HBXIP^△LysM肾功能检测。

图8是野生型小鼠与HBXIP^△LysM组织切片H&E染色。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：髓系细胞条件性敲除HBXIP小鼠的制备方法及基因型鉴定。

1、实验材料

1.1实验用试剂：SYBR GREEN PCR Master Mix(QPK-201)购于日本TOYOBO公司；主要引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司。抗体HBXIP(#14633)，β-Actin(#3700)，购于CST公司。蛋白酶K(10401ES60)购于翌圣生物科技股份有限公司。鼠尾裂解液(50mL的配方为：1M Tris-Hcl 0.5mL，0.5M EDTA 1mL，10％SDS 2.5mL，5M Nacl 1mL，H₂O 41ml，调PH至8.0)。Case9 mRNA购自于Sigma-Aldrich，货号为CAS9MRNA-1EA。

1.2实验用动物及饲养：野生型小鼠、髓系细胞特异性敲除Cre工具鼠(LysM^cre/+)、HBXIP^fl/+、HBXIP^fl/fl、HBXIP^△LysM鼠。全价营养颗粒饲料：由江苏省协同医药生物技术有限公司提供；饲养条件：室温20±2℃，湿度55-65％，明暗交替，光度适度，通风洁净良好。

2、实验方法

2.1髓系细胞条件性敲除HBXIP小鼠的制备方法。

(1)骨髓细胞特异性表达Cre重组酶小鼠(LysM^cre/+)：英文名B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J，Stock No:004781，购自The Jackson Laboratory。该品系小鼠基因组插入Cre酶基因，并且该基因可以通过骨髓细胞特异性的启动子在骨髓细胞表达Cre重组酶。与loxp转基因小鼠交配，则Cre介导的重组能够将目的基因序列删除，这些序列删除具有细胞特异性，仅在骨髓细胞系中发生，包括单核细胞、成熟的巨噬细胞和粒细胞等。

(2)loxp转基因杂合子(HBXIP^fl/+)小鼠的制备：小鼠品系为C57BL/6，在其乙肝病毒X蛋白结合蛋白基因组(NC_000069.7)的第二个外显子(1013-1074)两侧的内含子区域分别添加loxp1位点和loxp2位点，即在HBXIP基因组序列的第762位核苷酸后插入SEQ IDNo.1核苷酸序列(loxp1位点)，第1250位核苷酸后插入SEQ ID No.2核苷酸序列(loxp2位点)，两个loxp位点的其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1Loxp1插入位置及序列：

GGAGTTGCAGTCCTAGAGCATGCTTCTATACggtccgctgcagATAACTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTATgagccgCAAGGACAGAGCCCTAAAGATAACTGC

SEQ ID No.2Loxp2插入位置及序列：

GGCAGAAATGTTCCTCCCAGTTCTAtccgccATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATggatccgggtcggCTACAACTGTTCCTACTAAAATGGTTTTG。

其中，上述loxp序列的插入方法如下：运用Optimized Cas9/CRISPR System(OCAS)技术，设计了两个gRNA序列，分别是gRNA靶点1:tagagcatgcttctataccaAGG(为基因组的正向序列，gRNA-1，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，gRNA靶点2：GGAACAGTTGTAGAACTGGGAGG(为基因组的反向序列，gRNA-2，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)。通过显微注射，将Case9 mRNA、两个gRNA序列、SSODN同源重组模板(核苷酸序列别如SEQ ID No.5所示)导入小鼠受精卵中，利用DNA修复机制把带有2个loxp的完整序列插入到基因组中去。胚胎体外培养1-2小时后，移植入假孕母鼠的输卵管中，代孕鼠伤口缝合后待产。产仔后，进行F0代验证，小鼠杂交验证等。

(3)交配方法：第一步，将HBXIP^fl/+与HBXIP^fl/+个体交配，可以获得HBXIP^fl/fl纯合子小鼠；第二步，HBXIP^fl/fl与LysM^cre/+个体交配，可以获得既含有loxp位点又表达Cre酶的个体，即(HBXIP^fl/+-LysM^cre/+)个体；第三步，(HBXIP^fl/+-LysM^cre/+)个体再与(HBXIP^fl/+-LysM^cre/+)个体交配，即可获得(HBXIP^fl/fl-LysM^cre/+)个体。研究已经证实，loxp位点与Cre酶结合，就会发生基因删除(Clausen et al.，1999)。因此，(HBXIP^fl/+-LysM^cre/+)个体为骨髓细胞特异性敲除HBXIP基因的杂合子，(HBXIP^fl/fl-LysM^cre/+)个体则为骨髓细胞特异性敲除HBXIP基因的纯合子(简写为HBXIP^△LysM)。

2.2小鼠基因型鉴定。从HBXIP^△LysM小鼠剪取0.5cm左右的尾巴，加入鼠尾裂解液和蛋白酶K(500μl，体积比为100:1)，55℃摇动消化过夜。消化完全后，5000r，离心3min，取200μl上清置于干净EP管中。在上清中加入400μl无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可见絮状DNA沉淀。12000r离心5min，弃去上清。在沉淀中加入400μl 70％乙醇，混匀，12000r离心5min，弃去上清。放在超净台晾干，加入200μl ddH₂O溶解备用。PCR法检测相关基因的表达。

loxp小鼠鼠尾鉴定的引物如下：

F:CACTTTCACGCACATCTTCCCGC

R:CAGGCACCTCTGCTTCACAAAGACAC

HBXIP^fl/+＝296bp和348bp

HBXIP^fl/fl＝348bp

WT＝296bp

Cre小鼠鼠尾鉴定的引物如下：

F:CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC

R1:CCAGAAATGCCAGATTACG

R2:TTACAGTCGGCCAGGCTGAC

Mutant＝750bp

Heterozygote＝300bp和750bp

WT＝300bp

2.3小鼠BMDMs的提取、分离与培养。取野生型小鼠C57BL/6和HBXIP^△LysM小鼠的腿骨，PBS冲出骨髓，裂解红细胞，DMEM培养基(10vt％FBS(胎牛血清)，小鼠M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)25ng/ml)培养3天，待多数细胞贴壁，更换新鲜培养基，再培养3天，约6天左右BMDMs分化为M0型。

2.4实时定量PCR法验证HBXIP^△LysM小鼠BMDM中HBXIP敲除效果。提取小鼠BMDM的总RNA并进行反转录，制备成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix进行实时定量PCR检测，β-actin为内参，用2^-△△Ct法计算mRNA的相对表达水平。

2.5蛋白免疫印迹法验证HBXIP^△LysM小鼠BMDM中HBXIP敲除效果。裂解小鼠BMDM，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度；按40μg的总蛋白上样量，依次进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、曝光。

3、实验结果

3.1 HBXIP^△LysM小鼠鼠尾基因型鉴定结果。通过2.1所述的繁育方式(图1左)，得几种不同基因型的小鼠。根据loxp与Cre重组酶的敲除原理，经鼠尾鉴定，只要在基因组DNA中检测loxp位点和Cre重组酶基因的有无就可判断幼鼠的基因型。如实施例1的2.1和图1右所示，若用loxp引物进行扩增：HBXIP^fl/+＝296bp和348bp；HBXIP^fl/fl＝348bp；WT＝296bp。若用Cre引物进行扩增：Mutant＝750bp；Heterozygote＝300bp和750bp；WT＝300bp。若用loxp小鼠鼠尾鉴定的引物扩增出348bp条带，同时用Cre小鼠鼠尾鉴定的引物扩增出750bp条带的小鼠则为HBXIP^△LysM小鼠。

3.2 HBXIP^△LysM小鼠BMDM中HBXIP敲除效果验证。收取BMDMs细胞，分别进行RNA提取和蛋白提取。结果显示，与野生型小鼠相比，HBXIP^△LysM小鼠BMDM中不表达HBXIP的蛋白(图2)，其转录水平也显著下调(图3)，证明BMDM中HBXIP的敲除效果显著。

实施例2：髓系细胞条件性敲除HBXIP小鼠早衰模型的表型验证。

1、实验材料

1.1实验用试剂：实时定量PCR所需试剂同实施例1中的1.1所述。ELISA检测试剂盒购于联科生物，谷丙转氨酶活性检测试剂盒(BC1555)、谷草转氨酶活性检测试剂盒(BC1565)、Bradford蛋白浓度定量试剂盒购(PC0010)自北京索莱宝科技有限公司。

1.2实验用动物及饲养：野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠，7-8月龄。全价营养颗粒饲料：由江苏省协同医药生物技术有限公司提供；饲养条件：室温20±2℃，湿度55-65％，明暗交替，光度适度，通风洁净良好。

2、实验方法

2.1实时定量PCR法检测野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠BMDM中衰老相关基因的表达。实时定量PCR的检测方法同实施例1中2.2。

2.2 ELISA法检测野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠血清中衰老相关的分泌表型因子水平。根据细胞因子检测试剂盒的说明书，用ELISA的实验方法，测定小鼠血清中衰老相关的分泌表型因子水平。依次进行浸泡酶标板、加标准品、加样本、孵育、洗涤、加酶孵育、洗涤、加底物显色、加终止液、检测读数。检测读数应在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm或630nm的测定值。

2.3小鼠血清中谷丙、谷草转氨酶的活性检测。谷丙转氨酶(ALT)活性检测：首先将丙氨酸标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL，将标准品稀释为1.5,1,0.8,0.6,0.4,0.2,0.1,0.05,0mM等浓度梯度。在标准管、测定管、对照管中分别加入一定体积的丙氨酸(200mM)，α-酮戊二酸溶液(2mM)和2,4-二硝基苯肼溶液。按血清体积计算，ALT活力单位：每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个活力单位。谷草转氨酶(AST)活性检测：首先将丙酮酸钠标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL，将标准品稀释为1.5,1,0.8,0.6,0.4,0.2,0.1,0.05,0mM等浓度梯度。在标准管、测定管、对照管中分别加入一定体积的化α-酮戊二酸(2mM)、天门冬氨酸(200mM)和2,4-二硝基苯肼溶液。按血清体积计算，AST活力单位：每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个活力单位。

2.4Bradford法检测小鼠尿蛋白浓度。完全溶解蛋白标准品，使终浓度为0.2mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。将小鼠尿液样品作适当稀释(2倍、4倍、8倍稀释)，加20微升到96孔板的样品孔中。各孔加入200微升稀释后的1×G250考马斯亮蓝染色液，室温放置3-5分钟。用酶标仪测定A595。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

3、实验结果

3.1野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠BMDM中衰老相关基因的表达。提取小鼠BMDMs(8个月龄)中的RNA，并进行发转录。实时定量方法检测野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠BMDM中衰老相关基因的表达。结果显示，HBXIP^△LysM鼠BMDM中衰老相关基因p16，p21，MCP-1，IL-6，TNF-α，IL-1β的表达水平显著升高(图4)。

3.2野生型小鼠与HBXI^P△LysM鼠血清中衰老相关的分泌表型因子水平。收集野生型小鼠与HBXI^P△LysM鼠(8个月龄)的血清，ELISA法检测血清中衰老相关的分泌表型因子水平。结果显示，HBXIP^△LysM鼠血清中衰老相关的分泌表型因子水平IL-6，TNF-α，IL-1β显著升高(图5)。

3.3野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠肝、肾功能检测。收集野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠(8个月龄)的血清，分别用谷丙转氨酶(ALT)活性和谷草转氨酶(AST)活性检测试剂盒检测小鼠肝脏功能。结果显示，HBXIP^△LysM鼠血清中谷草转氨酶活性显著高于野生型小鼠，其谷丙转氨酶活性与野生型小鼠相比，无显著性差异(图6)。收集野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠的尿液，Bradford法检测尿液中的蛋白浓度。结果显示，HBXIP^△LysM鼠尿液中的蛋白浓度显著高于野生型小鼠(图7)。另外，对野生型小鼠与HBXIP^△LysM鼠的皮肤、肺、肝脏、肾脏的组织切片进行H&E染色，结果显示HBXIP^△LysM鼠毛囊萎缩，肺部有大量炎性细胞浸润，肝肾组织结构改变等(图8)。以上实验结果表明，HBXIP^△LysM鼠出现了衰老小鼠的症状，即肝肾功能损伤。

本发明提供了一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和拓展其应用，这些改进和应用也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 浙江树人大学

<120> 一种小鼠早衰模型及其构建方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> loxp1

<400> 1

ggagttgcag tcctagagca tgcttctata cggtccgctg cagataactt cgtataatgt 60

atgctatacg aagttatgag ccgcaaggac agagccctaa agataactgc 110

<210> 2

<211> 107

<212> DNA

<213> loxp2

<400> 2

ggcagaaatg ttcctcccag ttctatccgc cataacttcg tataatgtat gctatacgaa 60

gttatggatc cgggtcggct acaactgttc ctactaaaat ggttttg 107

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> gRNA-1

<400> 3

tagagcatgc ttctatacca agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> gRNA-2

<400> 4

ggaacagttg tagaactggg agg 23

<210> 5

<211> 3401

<212> DNA

<213> SSODN

<400> 5

gaaaaggaga aggagaccaa aatgtctgga ttctatagaa aggagcccta tagaaaggga 60

agggcagccc agcccctggg ctggaaagtt cagggttggg ggcaaggtat gccaggtggg 120

aactgaggga tgcagaacct ggaggccagt tctgctttga taggtaaagt atacacctca 180

gcctcttgac ctagggtcag aaactgagca ctgtcttctt agcgattggc ctattgcata 240

gatgagacca tgccagacct gctggttact ttaaaattta aaccaggtct acgtctggtt 300

aggactggaa attgcttgaa ccaaatccaa aggttaaaaa tcactaagtc caagtgctag 360

gtcaggaaaa ggccctgagg cccgactaca gattgctttg aaggcccagc acccccaatc 420

gaaagccagc catcactggt cctgtggtag tagctatgcc ttttcgtaaa gagcgcggac 480

gcggcgccgc gctgaatttc gtccctctgg agacgccgtc caggcgcccg cctcggtcaa 540

gtcacgtgat cgaggtttgc ggtgaaggag gaagtgtttt gctgcggggt cctggcctgg 600

ggcggacagc ctgcgggatg gaggcgactt tggagcagca tttggaggac acgtgagtag 660

tgcgtgcggc cggtcctggg ctccggacag gggagctgga atgggacagc ggcatggacc 720

gcgagtgtct gcggaagcgt ttggggcact cggggcggcg agcgggtgac ttctgcctac 780

ggccgggccg ctcgttactg ggtagtaaag tttcgttagg cgtgttcgca gaatcgagta 840

gctcttgaga agtttgggaa acggattaag tttggggaag gatgccccgg gtgtgctaaa 900

tcgagccccc gcagtgccaa agcactttca cgcacatctt cccgcgtttg tggcccgtca 960

gttgctcagc gcttgtgaag taaatatatc cgtaaagttt ttcagctatc tctgtaaaat 1020

ttaaaattgg gaggtgtaaa gtggcttaca agaagacacc tcctccttga gcttcttaat 1080

cccctccagg agcaattccc gttactgaga tttaacagtt gtcttcagga gttgcagtcc 1140

tagagcatgc ttctatacgg tccgctgcag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 1200

ttatgagccg caaggacaga gccctaaaga taactgcctt gtttgtgtct ttgtgaagca 1260

gaggtgcctg agaaaatggt ttgggttttg ttttgtttat ttaaacaact cacagtttgt 1320

cctctgaaag ggggcgaaaa aatttaaggg ctgatttgaa gtgcttaata ctcggtgcat 1380

agaaaatctg ttttactaca gtaatttgaa atattttctt cacatcatct ggttcatctt 1440

tcttgtgctc ccaaaattag aatgaagaat ccatccattg ttggagtcct atgcacagat 1500

tcacaaggac ttaatctggg ctgtaagtgt ctcctaccag cctccctttg aagttctgag 1560

agccttaact tacactgcta ctattttcta gcttttattc ctgttacctt tagggcatag 1620

agactatctc caagtaagag tagatggttg aagcctttca gttgcatttt aaaggcagaa 1680

atgttcctcc cagttctatc cgccataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgg 1740

atccgggtcg gctacaactg ttcctactaa aatggttttg aataaatttt aagtggtcta 1800

gaaaagggct ttagataagg acatctttac tgaatgcatt ccctgtgcag gcacagtcag 1860

gctacactat ttccttaatt gcctcaataa ccctgaaaat ggatgatgct ggctgctagt 1920

ccagccactc tcaacagtaa gttattgtca gtaaaaatag ggatttccta gttagacacg 1980

tctgacttca accccattct ccgatgctgt ctgctagcaa catgagtgcc gaacagaagg 2040

agcctcttgg ggcttcagtt tcttcattgg gttattttat ttcatacata cattatgtgt 2100

gtgttgtctt aagacatttt tttttaaaaa cttattctac gtggccctgg ctgtcctgga 2160

acaaactttg tagaccatgc tggcctgtaa ctcacagaga tctgcctgcc tctatccctt 2220

gaatgctggg aacaaaggtg tgcatcacca tgcccagcca ggcactattc ttagtgtttt 2280

cattataaaa cgtacataac cccccttcct gccccccccc ccccaccaaa gccctttatg 2340

gtcaagaaat ttagcaagct taaaagtacc ttgcccaggg tcaaacacct aatgaatggt 2400

tgagatagga tgtttttaaa gctggctcca aagcttaaaa cacccagtac agaaccaaga 2460

tgtgtttgtg tggtgttcaa taaattgtag caattacaga taaggaacta agtccagaaa 2520

ggtaaatagc taaagttaat taatgtcaga aactagtaaa cccaagaatc cttataactg 2580

atgcaggttt tttagagctc tgatcttttg ctggtatgat acctgacaaa agtaatatag 2640

ttatgtctta tacaaaaagc agccatttgg aacaaaggta aatttttttg aagcatttgc 2700

caagttacta atgaaaactc tttaaatgca aatgtggagg aaaaaaaaaa actaagtaaa 2760

accttcaagg tgcgaagttg ctatttccaa tagatttccg ggctgcactt tggcctacgg 2820

attttttatg tagtaatagt caatccagaa tttctgccag gttatattgt ctactacctt 2880

agttttaggt gtaagtaaac ccctttattt cagggatcta taataagctt ggtggttacc 2940

ttttgtgcct agagcctgtt agttaataca agtcaaagta atagtaaaga ctcgggggac 3000

atttgaaagg agcccagcta gcttctgcta gcagaaatag ttgctcacag gtcttcacat 3060

atgctggcaa ggtgatctta caactggact tctgagtaat ggctgcttct ttgagattga 3120

gcataggaag agaaactcag atttcccata aggaattaat tagcatcaac aagcccctta 3180

tccatactga atgctttttg tcactctcgc ctttgaattt cttggtttca gcaaggttcc 3240

tataaaatag ttactaccat cagatgactt gaattacagc ttccttatat gcttgagaag 3300

gtgtttagag atagtgaggg gaataactct gaaaactaca tgtcgtttac gactttgctg 3360

atttaagaac aattgccagg ctttctcact aatggactca g 3401

Claims

1.一种小鼠早衰模型，其特征在于，敲除小鼠骨髓来源细胞中的乙肝病毒X蛋白结合蛋白。

2.根据权利要求1所述小鼠早衰模型，其特征在于，所述敲除为敲除乙肝病毒X蛋白结合蛋白编码基因中的第二个外显子。

3.根据权利要求2所述小鼠早衰模型，其特征在于，所述乙肝病毒X蛋白结合蛋白编码基因的mRNA序列为Gene Bank中的Accession:NM_026774.2，其基因组序列为Gene Bank中的Accession:NC_000069.7。

4.根据权利要求1所述小鼠早衰模型，其特征在于，所述敲除为通过Cre-loxp系统敲除。

5.根据权利要求1所述小鼠早衰模型，其特征在于，所述敲除为通过骨髓细胞特异性表达Cre重组酶小鼠LysM^cre/+敲除。

6.权利要求1-5中任意一项所述小鼠早衰模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将HBXIP^fl/+-LysM^cre/+小鼠与HBXIP^fl/+-LysM^cre/+小鼠交配，获得HBXIP^fl/fl-LysM^cre/+小鼠。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述HBXIP^fl/+小鼠为将C57BL/6小鼠中乙肝病毒X蛋白结合蛋白基因组序列的第762位核苷酸后插入如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，第1250位核苷酸后插入如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

8.权利要求1-5中任意一项所述小鼠早衰模型在开发或筛选预防和/或治疗早衰产品中的应用。

9.权利要求1-5中任意一项所述小鼠早衰模型在开发或筛选预防和/或治疗早衰技术方法中的应用。

10.权利要求1-5中任意一项所述小鼠早衰模型在早衰研究中的应用。