CN114982718B - 一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型及其构建方法，以解决目前用于科学研究的基因敲除型肥胖动物模型非常有限，且市场没有具有稳定遗传性的基因敲除型肥胖模型小鼠，都是需要后天培养改造的，建模时间较长，造模成功率低，死亡率高的问题。因此，发明一种肥胖型小鼠模型及其构建方法，来实现造模稳定，成功率高，能稳定遗传的肥胖型小鼠来解决上述问题很有必要。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种基因缺陷导致的小鼠 全身性肥胖模型及其构建方法。
背景技术
近几十年来，肥胖在全球范围内的患病率明显升高。肥胖不仅被认为 是一种独立的慢性代谢性疾病，同时已经成为全球性的公共卫生健康问题 之一。肥胖个体患多种疾病的风险更高，包括2型糖尿病、心血管疾病、 高血压、代谢综合征、某些癌症和睡眠呼吸障碍。此外，肥胖降低了寿命 和一般生活质量。肥胖者体内存在着慢性低度的炎症，炎症因子的表达与 皮下脂肪(SAT)及内脏脂肪(VAT)组织中组蛋白去乙酰化酶(HDACs) 的表达关系密切，进而引起一系列代谢紊乱以及与炎症有关的伴行疾病。 尽管工业化国家在抗肥胖治疗方面已经投入了大量努力，但肥胖比例仍在 持续增加。
目前，用于科学研究的基因敲除型肥胖动物模型非常有限，且市场没 有具有稳定遗传性的基因敲除型肥胖模型小鼠，都是需要后天培养改造的， 建模时间较长，造模成功率低，死亡率高。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模 型，其能够解决现目前基因敲除型肥胖模型小鼠建模时间较长、造模成功 率低以及死亡率高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型 的构建方法，该构建方法操作简单，不仅能够降低操作人员的操作难度， 还能够节省建模时间，从而提升建模效率。
与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：
本发明提供了一种基因敲除型肥胖小鼠模型及其构建方法，以解决目 前用于科学研究的基因敲除型肥胖动物模型非常有限，且市场没有具有稳 定遗传性的基因敲除型肥胖模型小鼠，都是需要后天培养改造的，建模时 间较长，造模成功率低，死亡率高的问题。因此，发明一种肥胖型小鼠模 型及其构建方法，来实现造模稳定，成功率高，能稳定遗传的肥胖型小鼠 来解决上述问题很有必要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需 要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些 实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中胰岛β细胞特异性敲除AC3基因小鼠构建技术 示意图；
图2为本发明实施例中胰岛β细胞特异性敲除AC3小鼠基因型鉴定 PCR结果：其中A为小鼠基因鉴定结果，其中B为取小鼠胰岛DNA验证AC3敲除结果(左边的是Marker，然后选了3个基因鉴定纯和的小鼠，在 胰岛里面进一步验证，Marker从上到下是500bp，400bp，300bp，200bp)；
图3为本发明试验例1中正常饮食条件下对照小鼠(左侧)和胰岛β细胞 AC3敲除小鼠(右侧)外观图；
图4为本发明试验例2中正常饮食条件下对照组小鼠和AC3敲除小鼠 脂肪组织重量图；
图5为本发明试验例3中正常饮食条件(即小鼠喂养在SPF级饲养环 境，每周更换两次垫料，饲喂普通小鼠生长繁殖饲料，饲料和饮水充足) 下对照组和基因敲除组小鼠的体重、血脂、血糖、胰岛素和胰高血糖素的 分泌差异，其中A为体重变化图，其中B为甘油三酯含量变化图，其中C 为葡萄糖含量变化图，其中D为胰高血糖素含量变化图，其中E为胰岛素 分泌量变化图；
图6为本发明试验例4中AC3特异型敲除小鼠正常交配繁殖后的基因 检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件 者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的 特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本发明提供了一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型，为特异性敲 除胰岛β细胞AC3基因的小鼠。
上述AC3基因包含位于AC3外显子两侧的两个LOXP位点。
本发明还提供了一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型的构建方 法，包括如下步骤：将包含同源臂以及AC3基因第3至第5外显子的片段 通过PCR-BAC载体进行克隆并扩增，插入LOXP位点和包含有SDAsite 的neo盒，并顺序组装成靶向载体、重组位点和选择标记，得到条件靶向 载体，将条件靶向载体转染到小鼠胚胎干细胞内，得到转染细胞；验证转 染细胞内的目的基因后构建flox小鼠模型，利用Cre-LOXP杂交技术将flox 小鼠模型与胰岛β细胞特异性启动子Ins2-cre小鼠杂交，即得到基因缺陷导 致的小鼠全身性肥胖模型。在克隆过程中采用高保真Taq技术，该技术使 用了高保真Taq酶。Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中 分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，相对于普通的Taq酶，高保真Taq 酶更能降低错配率。普通Taq酶的错配率在10-5碱基/循环数，而高保真Taq 酶错配率可降到10-6数量级，大大降低了出错的可能性。
实施例
1、所试小鼠为SPF级实验小鼠，以雄鼠为最佳。
2、实验动物均饲养于本部屏障环境内，温度保持在23±2℃，相对湿度在 50％±10％，保证环境清洁和空气流通。12小时昼夜交替。小鼠正常喂养普 通饲料。
3、构建小鼠基因敲除模型流程参照具体操作步骤(参照图1所示)：
步骤一：转染小鼠胚胎干细胞：将包含同源臂以及AC3基因第3至第 5外显子片段通过使用高保真Taq从PCR-BAC载体中克隆并扩增，插入2 个Loxp位点和包含有SDA(self-deletion anchor)site的neo盒，并顺序组 装成靶向载体以及重组位点和选择标记，得到条件靶向载体，通过限制性 内切酶酶切将条件靶向载体线性化，使用电穿孔的办法转染小鼠胚胎干细 胞；
步骤二：胰岛β细胞基因型验证：将上述步骤一中转染小鼠胰岛β细 胞通过PCR基因型鉴定确定目的克隆，包括第一个Loxp位点、AC3外显 子和第二个Loxp位点；
步骤三：构建flox小鼠模型：将上述步骤二中验证准确基因型的胰岛β 细胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中，选择性成熟的转基因小鼠和野生型小鼠 进行交配，得到F1代小鼠，将获得的F1代小鼠进行基因型鉴定。F1代小 鼠中有50％是转基因杂合子小鼠，50％是野生型小鼠。采用PCR从DNA 水平上进行筛选鉴定F1中的阳性后代(选择嵌合率高的嵌合体小鼠和 deleter小鼠杂交，PCR鉴定，获得去掉打靶载体中的Neo基因的F1代(杂 合子)。最后确证F1代雄性与雌性阳性杂合子小鼠(flox/+)自交(挑选F1 代小鼠进行自交，通过PCR鉴定筛选得到去除Neo盒的纯合子的F2代KO 小鼠。)获得的F2代阳性纯合子小鼠(flox/flox)，即loxp小鼠。对F2代小 鼠进行基因鉴定，选择雌性与雄性的既有Loxp位点，又表达产生Cre的小 鼠杂交，逐步淘汰掉杂合鼠，选择其中F3代的纯和型基因敲除小鼠，并通 过跑胶验证是否敲除成功。步骤四：获得胰岛β细胞组织特异性敲除AC3 小鼠：利用Cre-Loxp杂交技术，将上述步骤三中获得的LOXP小鼠与胰岛 β细胞特异性启动子Ins2-cre小鼠杂交，获得胰岛β组织特异性敲除AC3 小鼠。
基因敲除型肥胖小鼠模型优选为雄性成年小鼠，基因敲除型肥胖小鼠 模型在动物房内正常饮食饲养。饲养期间保证动物房内的环境清洁和空气 流通。
4、胰岛β细胞特异性敲除AC3小鼠基因型鉴定：
剪取小鼠尾巴或脚趾，提取DNA。具体操作为：用酒精棉片擦拭剪刀， 剪取小鼠尾巴或脚趾4mm长度于1.5mL EP管，每管加入100ul Buffer L和 2μl Protease Plus混合(DNA提取试剂盒购于bimake公司)，55℃水浴15 min，使DNA充分释放，95℃金属浴5min，使蛋白酶失活。然后在12000 rpm下高速离心5min，取上清待用。
小鼠基因鉴定采用2X Accurate Tap Master Mix(dye plus)(购自 ACCURATEBIOLOGY公司)10ul，RNase free water 8ul，Primer F 0.5ul， Primer R 0.5ul，样本1ul，充分混匀，PCR仪扩增目的基因。将混合扩增后 的目的基因进行DNA凝胶电泳(125V，25min)，凝胶成像，分析荧光条 带位置。
本实验专利技术需通过F1/R1引物来检测小鼠的LOXP位点和其能否 产生Cre酶，以检测是否成功插入，具体引物如下：
①Neo delete阳性杂合子(flox/+)自交获得Neo delete阳性纯合子 (flox/flox)的鉴定(F1/R1引物)：
Adcy3_F1:如SEQ ID NO.1所示。
Adcy3_R1:如SEQ ID NO.2所示。
MT：294bp WT：189bp
②Loxp位点检测所用引物：
Cre-F：如SEQ ID NO.3所示；
Cre-R：如SEQ ID NO.4所示。
MT：203bp
③鉴定携带Cre基因的引物：
Ins2-AC3-F：如SEQ ID NO.5所示
Ins2-AC3-R：如SEQ ID NO.6所示
MT：404bp
其中WT可以表示野生型小鼠。比如在基因鉴定的时候只有在189bp 有一条带，说明小鼠是野生型的。MT是指纯和型的，比如只有404bp那 条带说明它是阳性纯和小鼠。WT和MT两条带都有就是杂合子小鼠。
小鼠基因鉴定检测结果如图二(A)所示，取小鼠组织鉴定纯合 子，其中阳性纯合子(flox/flox)(loxp)小鼠只有一个条带(294bp)； 野生型(wt)小鼠只有一个条带(189bp)；阳性杂合子(flox/+)含有 两个条带(294bp、189bp)。雄性M与雌性F小鼠筛选成功。
图二(B)所示取胰岛DNA进行PCR验证，在404bp只有一条 带，表示AC3敲除成功。
试验例1
取成年Loxp小鼠(左侧)，Ins2-AC3小鼠(右侧)拍照(如图3)，直 观展示小鼠胰岛β细胞敲除AC3对小鼠肥胖的影响，根据图3结果显示， 本实施例所构建的基因缺陷导致的全身性肥胖模型小鼠的大小明显超过普 通小鼠。
试验例2
胰岛β细胞特异性敲除ac3小鼠含脂量鉴定：
取LOXP对照小鼠与Ins2-Ac3小鼠各3只，优选成年雄性小鼠，要求 年龄相同或相近。实验前记录小鼠体重。利用小动物体成分分析仪(仪器 购自BRUKER BIOSPIN GMBH公司)，采用核磁共振原理分析小鼠体内瘦 肉(lean)，液体(fluid)，脂肪(fat)的含量，记录相关数据，并与原始体 重比较，其中，检测的脂肪重量即小鼠体内的脂肪含量。实验重复3次， 统计脂肪含量并做量化图分析，所得结果如图4所示，根据图4结果所示， 本实施例所构建的基因缺陷导致的全身性肥胖模型小鼠的脂肪含量明显高 于普通小鼠，结果所得3只小鼠均造模成功，说明本申请所提供的该方法 具有较高的造模成功率。
试验例3
组织特异性AC3敲除小鼠鉴定体重、血糖、血脂、胰高血糖素分泌以 及胰岛素分泌：
组织特异性AC3敲除小鼠模型构建成功后，每组各选择6只小鼠，从第 四周开始，每隔两周检测一次小鼠的相关指标，所得结果如图5所示，我 们发现WT小鼠、LOXP小鼠、组织特异性AC3敲除杂合子小鼠以及纯合 子小鼠在体重、血糖、血脂、胰高血糖素分泌以及胰岛素分泌是存在差异 的，且本实施例所构建的基因缺陷导致的全身性肥胖模型小鼠的体重、血 糖、血脂、胰高血糖素分泌以及胰岛素分泌等指标均高于其他组小鼠，并 具有统计学差异，因此使用该方法进行造模具更加稳定，能够稳定获得体 重、血糖、血脂、胰高血糖素分泌均高于普通小鼠的组织特异性AC3敲除 小鼠。
试验例4
我们取胰岛β细胞AC3特异型敲除小鼠配笼，雌雄配笼比1：1。在正 常的SPF饲养环境下，保证小鼠正常的饮食和饮水。小鼠正常交配繁殖。 本次小鼠生育7只，其中3只雄性，4只雌性。在小鼠4周龄时对小鼠进行 剪脚趾编号。同时剪下的脚趾收集于1.5ml EP管内，作为小鼠基因型鉴定 的材料。
每管加入100μl Buffer L和2μl Protease Plus混合(DNA提取试剂盒 购于bimake公司)，55℃水浴15min，使DNA充分释放，95℃金属浴5min， 使蛋白酶失活。然后在12000rpm下高速离心5min，取上清待用。
小鼠基因鉴定采用2X Accurate Tap Master Mix(dye plus)(购自 ACCURATEBIOLOGY公司)10ul，RNase free water 8ul，Primer F 0.5ul， Primer R 0.5ul，样本1ul，充分混匀，PCR仪扩增目的基因。将混合扩增后 的目的基因进行DNA凝胶电泳(125V，25min)，凝胶成像，分析荧光条 带位置(图6结果所示)。
由图6实验结果可知，雌雄配笼小鼠，一胎生了7只，3只雄性，4只 雌性。其中，七只小鼠F1/R1引物和LOXP位点引物检测均为纯和型小鼠。 检测小鼠的Cre剪切酶结果显示，由5只小鼠能明显的产生Cre剪切酶，1 只小鼠Cre剪切酶弱或者含量低。结果显示，胰岛β细胞AC3特异型敲除 小鼠能稳定遗传。
综上所述：
本发明实施例提供了一种基因敲除型肥胖小鼠模型及其构建方法，以 解决目前用于科学研究的基因敲除型肥胖动物模型非常有限，且市场没有 具有稳定遗传性的基因敲除型肥胖模型小鼠，都是需要后天培养改造的， 建模时间较长，造模成功率低，死亡率高的问题。因此，发明一种肥胖型 小鼠模型及其构建方法，来实现造模稳定，成功率高，能稳定遗传的肥胖 型小鼠来解决上述问题很有必要。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是 仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
Claims (1)
1.一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将包含同源臂以及AC3基因第3至第5外显子的片段通过PCR-BAC载体进行克隆并扩增，插入LOXP位点和包含有SDAsite的neo盒，并顺序组装成靶向载体、重组位点和选择标记，得到条件靶向载体，将所述条件靶向载体转染到小鼠胚胎干细胞内，得到转染细胞；
验证所述转染细胞内的目的基因后构建flox小鼠模型，利用Cre-LOXP杂交技术将所述flox小鼠模型与胰岛β细胞特异性启动子Ins2-cre小鼠杂交，即得到所述基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型。
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