CN113907042B - 一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法 - Google Patents

一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和遗传修饰技术领域，具体涉及一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠Gfi1基因的sgRNA串联表达单元敲入进入小鼠Rosa26位点，然后将此表达sgRNA的基因敲入小鼠纯合子与过表达Cas9蛋白的基因敲入小鼠纯合子进行杂交，即可以获得中性粒细胞缺失小鼠模型。对此小鼠外周血使用流式细胞术进行免疫表型检测，结果表明，此小鼠中性粒细胞的清除效率高达100％，为研究中性粒细胞在疾病中的作用提供了一种全新的遗传模型。

Description

一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法
技术领域
本发明属于基因工程和遗传修饰技术领域，具体涉及一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法。
背景技术
中性粒细胞是机体固有免疫细胞的重要组成部分，其细胞内含有大量的多种类型的溶酶体，当外来病原微生物入侵机体时，其构成了机体抵御外来病原微生物的第一道防线，为保障机体的健康扮演了重要角色。
中性粒细胞对免疫系统的维持和功能行使具有非常重要的作用，由于中性粒细胞在外周循环系统中存在时间短，一旦其从外周血进入组织以后即可以在很短时间内通过骨髓造血干细胞分化和发育进行及时补充，通过注射药物或是特异性抗体不能达到长时间清除中性粒细胞的目的，所以尽管中性粒细胞具有非常重要的功能，但是由于中性粒细胞缺失小鼠遗传模型的缺乏，导致对中性粒细胞在各种疾病中的功能研究一直进展缓慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，具有模型制作程序简单、中性粒细胞清除程度高等优点。
为实现上述目的，本发明的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法的技术方案是：
一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
(1)通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA表达载体敲入进入小鼠Rosa26位点，获得sgGfi1基因敲入小鼠；
(2)将sgGfi1基因敲入小鼠与表达Cas9的小鼠进行杂交，获得中性粒细胞缺失的小鼠模型。
本发明的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠Gfi1基因的sgRNA串联表达单元敲入进入小鼠Rosa26位点，然后将此表达sgRNA的基因敲入小鼠与表达Cas9蛋白的基因敲入小鼠进行杂交，即可以获得中性粒细胞缺失小鼠模型。对此小鼠外周血使用流式细胞术进行免疫表型检测，结果表明，此小鼠中性粒细胞的清除效率高达100％，为研究中性粒细胞在疾病中的作用提供了一种全新的遗传模型。
此外，小鼠可以在SPF饲养条件下正常存活8周以上。
优选的，步骤(1)中，所述sgGfi1基因敲入小鼠采用以下方法构建：
1)针对小鼠Rosa26基因位点设计2个靶序列，分别为Rosa26-sgRNA1、Rosa26-sgRNA2；
2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和Rosa26-sgRNA1/2；
3)合成重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5’和3’同源臂、特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT，所述重组模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其中针对gfi1基因的打靶位点序列为：Guide 1：GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG，如SEQ ID NO:4所示；Guide2：CCAGGTTTAGCTCACCTGTG TGG，如SEQ ID NO:5所示；
4)获得R26-sgGfi1基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、Rosa26-sgRNA1/2和重组模板DNA混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，获得Founder小鼠；
5)对Founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中sgGfi1序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得基因敲入小鼠模型R26-sgGfi1。
进一步优选的，步骤1)中，Rosa26-sgRNA1的核苷酸序列为：5‘-CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT GGG-3’，如SEQ ID NO:1所示；Rosa26-sgRNA2的核苷酸序列为：5‘-CGCCCATCTTCTAGAAAGAC TGG-3’，如SEQ ID NO:2所示。
步骤2)中，通过体外转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB，E2050S)获得Rosa26-sgRNA1/2；使用T7 Ultra Kit(Ambion,AM1345)试剂盒，体外转录获得Cas9mRNA。
步骤3)中，以合成的DNA为模板，通过体外转录和逆转录，获取单链DNA即为重组模板，其中逆转录使用引物序列为：GTAAGCAGTAATCAATACCATG(SEQ ID NO:8)。
优选的，步骤5)采用以下步骤：
A.将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA；
B.以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出在小鼠Rosa26位点正确插入了sgRNA串联表达单元的小鼠；
C.将sgRNA串联表达单元插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，进行测序验证，挑选出插入目标序列正确的个体，即为R26-sgGfi1基因敲入小鼠。
进一步优选的，步骤B中，先进行第一PCR扩增，初步筛选目标sgRNA串联表达单元序列在基因组中插入的小鼠，然后分别使用引物针对5‘同源臂、3’同源臂和sgRNA串联表达单元部分进行第二PCR扩增，筛选出sgRNA串联表达单元序列插入而且插入位点正确的小鼠。
更优选的，第一PCR扩增所使用的引物为引物527、引物528和引物680，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。PCR反应体系如下：3条引物各0.2μL，2×Taq Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，35个循环；72℃10min。
更优选的，针对5’同源臂的引物为引物529和引物718，核苷酸序列分别如SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15所示；针对3’同源臂的引物为引物681和引物727，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；针对sgRNA串联表达单元部分的引物为引物679和引物682，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。PCR体系如下：引物各0.2μL，2×Taq Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃70sec，35个循环；72℃10min。
优选的，使用毛细管电泳，对中性粒细胞缺失的小鼠模型不同组织和器官的gfi1打靶位点进行切割检测，其中用于PCR扩增的特异性引物序列为：F-TGAAGGAGCGGCACATTTCT，如SEQ ID NO:6所示；R-GCACAGCTGTTGACATAGAGGA，如SEQ ID NO:7所示。
使用流式细胞术，对Cas9:sgGfi1小鼠外周血和骨髓中的中性粒细胞进行检测，发现其中性粒细胞已经完全缺失，表明中性粒细胞缺失的小鼠模型构建成功。
附图说明
图1为R26-sgGfi1基因敲入小鼠构建策略；
图2为R26-sgGfi1基因敲入小鼠测序结果；
图3为Cas9:sgGfi1小鼠不同组织器官(A、鼠尾；B、外周血；C、骨髓；D、肝脏；E、脑)中gfi1基因打靶位点切割检测结果；
图4为Cas9:sgGfi1小鼠外周血(A)和骨髓(B)中中性粒细胞流式细胞术检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种中性粒细胞被完全剔除的小鼠模型构建方法，首次通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元(U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)定点插入小鼠Rosa26位点，获得了一种全新的R26-sgGfi1基因敲入小鼠模型，将R26-sgGfi1基因敲入小鼠与表达Cas9的小鼠(R26-Cas9)进行杂交，对F1代小鼠不同组织器官使用毛细管电泳进行检测，可以发现gfi1打靶位点均发生了切割；进一步使用流式细胞术对F1代小鼠外周血细胞和骨髓细胞进行检测，结果表明中性粒细胞均被完全清除。此外，在繁育过程中，R26-sgGfi1基因敲入小鼠与R26-Cas9基因敲入小鼠均可以纯合子的方式进行保种和繁育，只需要使用这2个家系纯合子小鼠进行交配，F1代所有小鼠无需进行基因型鉴定，全部均为中性粒细胞缺失小鼠，极大简化了小鼠繁育流程，也可以同时大批量获得阳性小鼠进行后续实验。
具体地，对本发明R26-sgGfi1基因敲入小鼠模型的构建思路进行说明。
1.小鼠Rosa26位点的选择。
制作传统转基因小鼠时，外源基因在基因组中的插入是随机的，存在如下缺点：第一是外源基因插入拷贝有时无法确定，导致后代会出现分离，造成转基因表达不稳定；第二是外源基因在基因组中插入的位置是随机的，这有可能破坏内源基因的表达，也有可能导致外源基因无法表达。小鼠Rosa26位点位于小鼠6号染色体，是一个非编码基因，外源基因极易通过同源重组定点插入此位点，而且插入此位点的基因具有非常高效的表达，在Rosa26位点插入外源基因，不会影响内源基因的表达和功能发挥，因而选择Rosa26位点作为外源基因插入的安全位点。
2.制作sgGfi1基因敲入小鼠(Rosa26U6-sgRNA-Gfi1，简写为R26-sgGfi1)。
将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列(U6-Guide1-sgRNAscaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)插入小鼠Rosa26位点后，在U6启动子的驱动下，会启动转录，生成sgRNA，而且由于小鼠Rosa26位点的特殊性，所以R26-sgGfi1小鼠所有组织均会表达sgRNA。
3.购买能表达Cas9的小鼠：R26-Cas9。
能表达Cas9的小鼠购买于美国JAX实验室(Stock No:026179)，其最初由张锋实验室制作成功，并有相关文献表明此小鼠在所有组织器官中均可以正常表达Cas9蛋白，而且此小鼠的免疫表型与野生型小鼠完全相同(CRISPR-Cas9 Knockin Mice for GenomeEditing and Cancer Modeling[J].Cell,2014.)。
4.将R26-sgGfi1小鼠与R26-Cas9小鼠交配后会特异性敲除小鼠Gfi1基因。
根据CRISPR/Cas9基因组编辑系统的原理，当有sgRNA和Cas9蛋白同时存在时，2者会形成复合体，其中sgRNA会将Cas9蛋白引导向打靶位点，然后Cas9蛋白会在打靶位点形成DNA双链的断裂，机体启动自我修复机制，将断裂DNA双链进行修复，过程中会产生缺失或是插入，最终完成基因打靶。所以本发明制作了能表达sgRNA(针对小鼠Gfi1基因特异性打靶)的基因敲入小鼠：R26-sgGfi1，然后将其与表达Cas9的小鼠交配，后代小鼠就会同时表达sgRNA和Cas9蛋白，此小鼠体内就含有了完整的CRISPR/Cas9基因组编辑系统，从而实现对小鼠Gfi1基因的特异性打靶。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。
实施例1R26-sgGfi1基因敲入小鼠模型的构建
该实施例提供了对小鼠Rosa26位点进行基因编辑获得特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元(U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)定点插入(knock-in，KI)小鼠模型的方法，具体包括如下步骤：
(1)确定打靶序列：为了将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元(U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)定点插入小鼠Rosa26位点，所以针对小鼠Rosa26位点设计打靶序列。参考前人已发表文献，将小鼠Rosa26位点intron1-2中约1000碱基长度的基因组DNA序列粘贴进入在线设计网站CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)，根据输出结果中特异性得分高低，最终挑选2条sgRNA，序列分别为：
Rosa26-sgRNA1：5‘-CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT GGG-3’(SEQ ID NO:1)
Rosa26-sgRNA2：5‘-CGCCCATCTTCTAGAAAGAC TGG-3’(SEQ ID NO:2)
(2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和Rosa26-sgRNA1/2：通过体外转录试剂盒T7Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB，E2050S)获得Rosa26-sgRNA1/2。使用T7Ultra Kit(Ambion,AM1345)试剂盒，体外转录获得Cas9 mRNA。详细操作步骤参考试剂盒说明书。
(3)合成重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5’和3’同源臂、特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列(U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)，如图1所示。重组模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中，5’端起第1-1000位为5’同源臂序列；5’端起第1001-1015位为CMV启动子增强子序列；5’端起第1016-1019位为载体构件引入的Golden Gate克隆时的接头序列；5’端起第1020-1754位为特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列；5’端起第1755-1760位为载体构件引入的Golden Gate克隆时的接头序列；5’端起第1761-1766位为载体构件引入的酶切位点(NheI)序列；5’端起第1767-2715位为3’同源臂序列。由金斯瑞生物科技股份有限公司合成提供。然后以合成的DNA为模板，通过体外转录获得mRNA，最后以此mRNA作为模板通过逆转录，获取单链DNA即为重组模板，其中逆转录使用引物序列为：GTAAGCAGTAATCAATACCATG(SEQ ID NO:8)。
在特异性Rosa26-sgRNA1/2的指导下，Cas9会在小鼠Rosa26打靶位点切割DNA双链，当有模板DNA存在时，机体会发生同源重组修复(Homology directed repair，HDR)，从而将外源DNA序列(U6-Guide1-sgRNA scaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)精确插入目标位点，实现基因敲入(knock-in，KI)(图1)。
(4)获得R26-sgGfi1基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、Rosa26-sgRNA1/2和重组模板DNA混合(Rosa26-sgRNA1、Rosa26-sgRNA2、Cas9 mRNA、重组模板DNA的终浓度分别为20、20、20、5ng/μL)，然后通过显微注射操作系统(Eppendorf)将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，20天以后即可获得Founder小鼠。
(5)R26-sgGfi1基因敲入小鼠测序验证：
A.获取步骤(4)中的Founder小鼠基因组DNA，步骤如下：
分别剪取小鼠约5毫米鼠尾组织，将其置于500μL组织裂解液中，56℃震荡充分裂解2小时，10000rpm离心5min，吸取上清液350μL，加入2倍体积无水乙醇可以看见白色絮状沉淀，10000rpm离心15min，弃上清保留管底沉淀，加入500μL 75％乙醇，10000rpm离心5min，弃上清，将管底沉淀晾干，加入100μL去离子水，充分溶解，即为基因组DNA溶液。
B.以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出在小鼠Rosa26位点正确插入了sgRNA串联表达单元的小鼠；
该步骤涉及的特异性引物核苷酸序列如下：
527:TAAGGGAGCTGCAGTGGAGTA(SEQ ID NO:9)
528:CCCGACAAAACCGAAAATCTGT(SEQ ID NO:10)
680：CCCTATCCCTGTCAGTACGGT(SEQ ID NO:11)
681：AAAGGACGAAACACCGCCA(SEQ ID NO:12)
727：GCCAGTCCAAGAGAAAGCACT(SEQ ID NO:13)
529：GTGGAGCCGTTCTGTGAGAC(SEQ ID NO:14)
718：GCTCTAAAACGGCCCTATCCC(SEQ ID NO:15)
679：GAGTTCTCTGCTGCCTCCTG(SEQ ID NO:16)
682：ACCTGTTCAATTCCCCTGCAG(SEQ ID NO:17)
首先使用引物527+528+680进行扩增，PCR反应体系如下：3条引物各0.2μL，2×TaqMaster Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，35个循环；72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若只有470bp的一条扩增条带，表明sgRNA串联表达单元序列在基因组中插入，而且是KI纯合子；若只有308bp的一条扩增条带，表明sgRNA串联表达单元序列没有在基因组中插入，是野生纯合子；若同时有308+470bp的2条扩增条带，表明sgRNA串联表达单元序列有在基因组中插入，但是是杂合子。
将KI纯合子或是杂合子挑选出来，分别使用引物529+718(针对5’同源臂)、681+727(针对3’同源臂)和679+682(针对sgRNA串联表达单元部分)进行扩增，PCR体系如下：引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃70sec，35个循环；72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若5’同源臂引物有1364bp的扩增条带且3’同源臂引物有1231bp的扩增条带同时679+682引物有941bp的扩增条带，表明sgRNA串联表达单元序列插入而且插入位点正确，最终即可以筛选出在小鼠Rosa26位点正确插入了sgRNA串联表达单元的小鼠。
C.将目标扩增条带PCR产物(如果是单一条带，则直接送测序；如果是2条带，则使用试剂盒进行TA克隆，然后挑取具有目标条带的单克隆送测序)分别送测序(上海百力格生物技术有限公司)，挑选出插入目标序列正确的个体，即为R26-sgGfi1基因敲入模型小鼠。测序结果表明，特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元(U6-Guide1-sgRNAscaffold-pT-U6-Guide2-sgRNA scaffold-pT)插入序列完全正确，而且插入位点与设计位点完全符合(图2)，说明上述方法成功构建R26-sgGfi1基因敲入小鼠模型。
(6)将R26-sgGfi1基因敲入纯合子小鼠与R26-Cas9纯合子小鼠进行杂交，F1代小鼠即为中性粒细胞缺失(同时可以表达sgRNA和Cas9)的小鼠模型-Cas9:sgGfi1。
实验例1Cas9:sgGfi1小鼠不同组织器官中gfi1打靶位点切割检测结果
将实施例1获得的Cas9:sgGfi1小鼠，采集其不同组织器官，抽提基因组DNA(鼠尾、外周血、骨髓、肝脏、脑)(方法同实施例1-(5)-A)，以此基因组DNA作为模板，使用特异性引物(SEQ ID NO:6和7)进行PCR扩增，PCR体系如下：引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃10min；将PCR产物进行毛细管电泳检测。
其中用于PCR扩增的特异性引物序列为：F-TGAAGGAGCGGCACATTTCT(SEQ ID NO:6)；R-GCACAGCTGTTGACATAGAGGA(SEQ ID NO:7)。
结果表明，对照野生型B6小鼠、仅表达sgRNA的R26-sgGfi1基因敲入小鼠和仅表达Cas9的R26-Cas9基因敲入小鼠所有检测组织中在gfi1基因打靶位点均没有发生切割，只有同时表达sgRNA和Cas9的Cas9:sgGfi1小鼠中，才能检测到切割，此结果表明，Cas9:sgGfi1小鼠对gfi1基因打靶位点具有非常高效的切割效率(图3)。
实验例2Cas9:sgGfi1小鼠外周血和骨髓中中性粒细胞检测
(1)外周血中中性粒细胞检测
分别获取野生型B6小鼠、仅表达sgRNA的R26-sgGfi1基因敲入小鼠、仅表达Cas9的R26-Cas9基因敲入小鼠的外周血作为对照组，采取同时表达sgRNA和Cas9的Cas9:sgGfi1小鼠的外周血作为实验组，利用特异性抗体对细胞进行标记，然后利用流式细胞术对外周血中中性粒细胞的百分比进行检测，步骤如下：
取10μL血样加入10μL抗体混合物(抗体包括：anti-CD45 APC-eFluor780，anti-CD5 PE-Cyanine7，anti-CD11b Super Bright 600，anti-CD3e FITC，anti-CD19 PE和anti-Ly6G Alexa Fluor 700)，充分混匀，置于冰上避光孵育30min；然后加入250μL 1×红细胞裂解液(BD FACS Lysing solution，349202)，避光室温静置10min充分裂解红细胞；再加入含有2mM EDTA的130μL FACS buffer终止裂解。通过流式细胞仪BD FACSCantoTM(BD,USA)采集数据，并进一步通过Flowjo 10.0软件完成数据分析。
结果如图4所示，其中CD45+CD5+为T细胞(T cells)，CD45+CD19+为B细胞(Bcells)，CD5-CD19-CD11b+Ly6G+为中性粒细胞(Neutrophils)；结果表明，对照小鼠B6、仅表达sgRNA的R26-sgGfi1基因敲入小鼠和仅表达Cas9的R26-Cas9基因敲入小鼠外周血中，中性粒细胞占比均为40％左右，而在同时表达sgRNA和Cas9的Cas9:sgGfi1小鼠外周血中，中性粒细胞已经完全缺失(图4A)，表明中性粒细胞缺失小鼠遗传模型构建成功。
(2)骨髓中中性粒细胞检测
分别获取野生型B6小鼠、仅表达sgRNA的R26-sgGfi1基因敲入小鼠、仅表达Cas9的R26-Cas9基因敲入小鼠的骨髓细胞作为对照组，获取同时表达sgRNA和Cas9的Cas9:sgGfi1小鼠的骨髓细胞作为实验组，利用特异性抗体对骨髓细胞进行标记，然后利用流式细胞术对骨髓细胞中中性粒细胞的百分比进行检测，步骤如下：
使用二氧化碳安乐死的方法处死小鼠，取出小鼠股骨和胫骨，用液体培养基将其中的骨髓冲洗取出，使用移液器轻轻吹打直至骨髓细胞完全分散，加入1000μL FACSbuffer清洗细胞，4℃，300g，离心5min，弃去上清，加入3000μL 1×RBC红细胞裂解液(00-4300-54，eBioscience)，室温孵育3分钟，然后加入5mL含有2mM EDTA的FACS Buffer，混匀，300g离心5分钟，然后去掉上清，保留底部细胞沉淀，最后加入1000μL FACS buffer重悬细胞即获得骨髓细胞单细胞悬液，取1million骨髓细胞，加入100μL抗体混合物(抗体包括：anti-CD45 APC-eFluor780，anti-CD11b Super Bright 600，anti-CD19 PE和anti-Ly6GAlexa Fluor 700)，充分混匀，置于冰上避光孵育30min；然后加入1000μL FACS buffer清洗细胞，4℃，300g，离心5min，弃去上清，加入500μL FACS buffer(含有Sytox Blue)重悬细胞。通过流式细胞仪BD FACSCantoTM(BD,USA)采集数据，并进一步通过Flowjo 10.0软件完成数据分析。
结果如图4所示，其中CD45+CD19-CD11b+Ly6G+为中性粒细胞(Neutrophils)；结果表明，对照小鼠B6、仅表达sgRNA的R26-sgGfi1基因敲入小鼠和仅表达Cas9的R26-Cas9基因敲入小鼠骨髓细胞中，中性粒细胞占比均为70％左右，而在同时表达sgRNA和Cas9的Cas9:sgGfi1小鼠骨髓细胞中，中性粒细胞已经完全缺失(图4B)，表明中性粒细胞缺失小鼠遗传模型构建成功。
<110> 新乡医学院
<120> 一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Rosa26-sgRNA1
<400> 1
ctccagtctt tctagaagat ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Rosa26-sgRNA2
<400> 2
cgcccatctt ctagaaagac tgg 23
<210> 3
<211> 2715
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 重组模板DNA序列
<222> (1)..(1000)
<223> 5‘同源臂
<220>
<221> 重组模板DNA序列
<222> (1020)..(1754)
<223> 特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列
<220>
<221> 重组模板DNA序列
<222> (1767)..(2715)
<223> 3'同源臂
<400> 3
caggaatgcg gtccgccctg cagcaaccgg agggggaggg agaagggagc ggaaaagtct 60
ccaccggacg cggccatggc tcgggggggg gggggcagcg gaggagcgct tccggccgac 120
gtctcgtcgc tgattggctt cttttcctcc cgccgtgtgt gaaaacacaa atggcgtgtt 180
ttggttggcg taaggcgcct gtcagttaac ggcagccgga gtgcgcagcc gccggcagcc 240
tcgctctgcc cactgggtgg ggcgggaggt aggtggggtg aggcgagctg gacgtgcggg 300
cgcggtcggc ctctggcggg gcgggggagg ggagggaggg tcagcgaaag tagctcgcgc 360
gcgagcggcc gcccaccctc cccttcctct gggggagtcg ttttacccgc cgccggccgg 420
gcctcgtcgt ctgattggct ctcggggccc agaaaactgg cccttgccat tggctcgtgt 480
tcgtgcaagt tgagtccatc cgccggccag cgggggcggc gaggaggcgc tcccaggttc 540
cggccctccc ctcggccccg cgccgcagag tctggccgcg cgcccctgcg caacgtggca 600
ggaagcgcgc gctgggggcg gggacgggca gtagggctga gcggctgcgg ggcgggtgca 660
agcacgtttc cgacttgagt tgcctcaaga ggggcgtgct gagccagacc tccatcgcgc 720
actccgggga gtggagggaa ggagcgaggg ctcagttggg ctgttttgga ggcaggaagc 780
acttgctctc ccaaagtcgc tctgagttgt tatcagtaag ggagctgcag tggagtaggc 840
ggggagaagg ccgcaccctt ctccggaggg gggaggggag tgttgcaata cctttctggg 900
agttctctgc tgcctcctgg cttctgagga ccgccctggg cctgggagaa tcccttcccc 960
ctcttccctc gtgatctgca actcaagtct ttctagaaga gacattgatt attgactagg 1020
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 1080
taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 1140
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1200
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1260
gaaacaccgt actgacaggg atagggccgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 1320
ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt gttttagagc 1380
tagaggtcga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 1440
ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 1500
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 1560
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 1620
ggaaaggacg aaacaccgcc aggtttagct cacctgtggt tttagagcta gaaatagcaa 1680
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 1740
gttttagagc tagacgcgcc gctagcggcg ggagtcttct aggcaggctt aaaggctaac 1800
ctggtgtgtg ggcgttgtcc tgcaggggaa ttgaacaggt gtaaaattgg agggacaaga 1860
cttcccacag attttcggtt ttgtcgggaa gttttttaat aggggcaaat aaggaaaatg 1920
ggaggatagg tagtcatctg gggttttatg cagcaaaact acaggttatt attgcttgtg 1980
atccgcctcg gagtattttc catcgaggta gattaaagac atgctcaccc gagttttata 2040
ctctcctgct tgagatcctt actacagtat gaaattacag tgtcgcgagt tagactatgt 2100
aagcagaatt ttaatcattt ttaaagagcc cagtacttca tatccatttc tcccgctcct 2160
tctgcagcct tatcaaaagg tattttagaa cactcatttt agccccattt tcatttatta 2220
tactggctta tccaacccct agacagagca ttggcatttt ccctttcctg atcttagaag 2280
tctgatgact catgaaacca gacagattag ttacatacac cacaaatcga ggctgtagct 2340
ggggcctcaa cactgcagtt cttttataac tccttagtac actttttgtt gatcctttgc 2400
cttgatcctt aattttcagt gtctatcacc tctcccgtca ggtggtgttc cacatttggg 2460
cctattctca gtccagggag ttttacaaca atagatgtat tgagaatcca acctaaagct 2520
taactttcca ctcccatgaa tgcctctctc ctttttctcc atttataaac tgagctatta 2580
accattaatg gtttccaggt ggatgtctcc tcccccaata ttacctgatg tatcttacat 2640
attgccaggc tgatatttta agacattaaa aggtatattt cattattgag ccacatggta 2700
ttgattactg cttac 2715
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 针对gfi1基因的打靶位点序列-Guide 1
<400> 4
gtactgacag ggatagggcc ggg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 针对gfi1基因的打靶位点序列- Guide 2
<400> 5
ccaggtttag ctcacctgtg tgg 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> gfi1打靶位点切割检测引物-F
<400> 6
tgaaggagcg gcacatttct 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> gfi1打靶位点切割检测引物-R
<400> 7
gcacagctgt tgacatagag ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 逆转录引物
<400> 8
gtaagcagta atcaatacca tg 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物527
<400> 9
taagggagct gcagtggagt a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物528
<400> 10
cccgacaaaa ccgaaaatct gt 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物680
<400> 11
ccctatccct gtcagtacgg t 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物681
<400> 12
aaaggacgaa acaccgcca 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物727
<400> 13
gccagtccaa gagaaagcac t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物529
<400> 14
gtggagccgt tctgtgagac 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物718
<400> 15
gctctaaaac ggccctatcc c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物679
<400> 16
gagttctctg ctgcctcctg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物682
<400> 17
acctgttcaa ttcccctgca g 21

Claims (10)

1.一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA表达载体敲入进入小鼠Rosa26位点，获得sgGfi1基因敲入小鼠；
（2）将sgGfi1基因敲入的纯合子小鼠与表达Cas9的纯合子小鼠进行杂交，获得中性粒细胞缺失的小鼠模型。
2.如权利要求1所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述sgGfi1基因敲入小鼠采用以下方法构建：
1）针对小鼠Rosa26基因位点设计2个靶序列，分别为Rosa26-sgRNA1、Rosa26-sgRNA2；
2）通过体外转录获得Cas9 mRNA和Rosa26-sgRNA1/2；
3）合成重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5’ 和3’同源臂、特异性打靶小鼠gfi1基因的sgRNA串联表达单元序列U6- Guide 1-sgRNA scaffold-pT-U6- Guide2-sgRNA scaffold-pT，所述重组模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其中针对gfi1基因的打靶位点序列为：Guide 1：GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG，如SEQ ID NO:4所示；Guide2 ：CCAGGTTTAGCTCACCTGTG TGG，如SEQ ID NO:5所示；
4）获得R26-sgGfi1基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、Rosa26-sgRNA1/2和重组模板DNA混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，获得Founder小鼠；
5）对Founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中sgGfi1序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得R26-sgGfi1基因敲入小鼠模型。
3.如权利要求2所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤1）中，Rosa26-sgRNA1的核苷酸序列为：5’ - CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT GGG -3’，如SEQ ID NO:1所示；Rosa26-sgRNA2的核苷酸序列为：5’ - CGCCCATCTTCTAGAAAGAC TGG -3’，如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求2或3所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤5）采用以下步骤：
A．将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA；
B．以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出在小鼠Rosa26位点正确插入了sgRNA串联表达单元的小鼠；
C．将sgRNA串联表达单元插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，进行测序验证，挑选出插入目标序列正确的个体，即为R26-sgGfi1基因敲入小鼠。
5.如权利要求4所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤B中，先进行第一PCR扩增，初步筛选目标sgRNA串联表达单元序列在基因组中插入的小鼠，然后分别使用引物针对5’ 同源臂、3’同源臂和sgRNA串联表达单元部分进行第二PCR扩增，筛选出sgRNA串联表达单元序列插入而且插入位点正确的小鼠。
6.如权利要求5所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，第一PCR扩增所使用的引物为引物527、引物528和引物680，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
7.如权利要求6所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，PCR反应体系如下：3条引物各 0.2 μL，2×Taq Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10 μL； PCR反应程序如下：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃10min。
8.如权利要求5所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，针对5’同源臂的引物为引物529和引物718，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；针对3’同源臂的引物为引物681和引物727，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；针对sgRNA串联表达单元部分的引物为引物679和引物682，核苷酸序列分别如SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17所示。
9.如权利要求8所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，PCR体系如下：引物各 0.2 μL，2×Taq Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10 μL；PCR反应程序如下：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 70sec，35个循环；72℃ 10min。
10.如权利要求1~3中任一项所述的中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法，其特征在于，使用毛细管电泳，对中性粒细胞缺失的小鼠模型不同组织和器官的gfi1打靶位点进行切割检测，其中用于PCR扩增的特异性引物序列为：F-TGAAGGAGCGGCACATTTCT，如SEQ ID NO:6所示; R-GCACAGCTGTTGACATAGAGGA，如SEQ ID NO:7所示。
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