CN110484549B

CN110484549B - 基因组靶向修饰方法

Info

Publication number: CN110484549B
Application number: CN201910316583.1A
Authority: CN
Inventors: 李文渊; 张博; 佟向军; 韩冰舟
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN110484549A

Abstract

本发明涉及一种基因靶向修饰的方法，所述方法基于多元件的正负载体敲入策略，结合利用基因组定点修饰技术，将所述正负载体敲入目的基因。所述载体包含正元件和负元件。正元件中包含能够还原目的基因表达的基因编码序列，因而不会破坏基因的功能，负元件则主要是破坏內源基因功能的元件，同时，可以根据不同的目的设计外源DNA序列，从而达到荧光标记与转换、基因精确突变、基因拯救等多种效果。

Description

基因组靶向修饰方法

本申请要求于2018年4月20日提交中国专利局、申请号为201810357493.2、发明名称为“基因组靶向修饰方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因组修饰领域，更具体涉及一种基因组靶向修饰的方法。

背景技术

近年来，基于TALEN和CRISPR/Cas等人工核酸酶的基因组定点修饰技术正越来越广泛地应用于生命科学基础理论研究，在农业、医疗健康等领域也展现出巨大的应用潜力。目前该类技术在制备indel等简单突变体方面的应用已经较为成熟，但是在制备条件性基因敲除(conditional knockout，或称组织特异性基因敲除)、对基因组进行精确修饰等复杂应用方面仍然存在效率低、周期长等问题，从而严重制约了基因功能的深入与精细研究，以及疾病模型构建与基因治疗等应用。

构建条件性基因敲除和基因标记的经典方法主要是利用同源重组(homologousrecombination，HR)介导的基因敲入将外源DNA序列引入靶基因中。但是HR事件在细胞中发生的概率很低，因而极大地限制了HR介导的基因敲入效率。人工核酸酶诱导DNA发生双链断裂(DSB)后，细胞主要是通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行损伤修复。因此，基于NHEJ进行基因敲入(靶向插入)可以获得比HR更高的效率，但是，该策略无法实现一次性构建条件性敲除的基因。而且现有的技术也无法在同一个胚胎/个体中同时实现条件性敲除和基因/细胞标记。

因此，迫切需要提供一种基因组的定点修饰技术，能够高效实现基因组水平的条件性基因敲除，还可以根据研究者需求，在实现条件性敲除的同时，实现其它更为复杂的基因组靶向修饰与细胞标记。

发明内容

本发明人经过多年的研究，为了实现高效快速的条件性基因敲除，同时实现基因标记，以及进一步实现基因型标记和/或等位基因类型的转换(例如正常等位基因向突变型等位基因的转换)，设计了一种基于多元件的正-负载体(positive-negative donor，PoNedonor；或称正-负供体)敲入策略，结合利用基因组定点修饰技术(如TALEN或CRISPR/Cas系统)，将所述正-负载体敲入目的基因，从而创建出兼有条件性基因敲除与基因标记等效果的双功能等位基因(dual-function allele)。其中，所述载体包含正元件(Positivecassette，Po-cassette)(元件1)和负元件(Negative cassette，Ne-cassette)(元件2)。正元件中包含能够还原目的基因表达的基因编码序列，因而不会破坏基因的功能，并且还可以连接荧光报告基因，从而在保持原有基因表达的同时，标记基因的内源表达情况。同时在正元件中还原基因表达的编码序列的两侧放置两个位点特异性重组酶的识别位点(例如同向排列的loxP序列)，利用位点特异性重组酶(例如Cre重组酶)可以介导loxP之间的序列从基因组中删除，从而实现条件性基因敲除。负元件则主要是破坏内源基因功能的元件。同时，可以根据不同的目的设计外源DNA序列，从而达到荧光标记与转换、基因精确突变、基因拯救等多种效果。

本发明包含如下技术方案：

1.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(1)在待修饰基因的选定位置处制造双链缺口，其中所述选定位置位于待修饰基因的内含子中；

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

其中所述核酸构建体包含串联的元件1和元件2，其中元件1包含可条件性移除的待修饰基因选定位置后的剩余编码序列C1，从而保证待修饰基因的正常表达；

所述元件2包含表达终止信号，其能够在元件1中所述的剩余编码序列C1被移除后，终止待修饰基因的转录和/或翻译，从而缺失待修饰基因的内源表达。

(3)任选的，移除元件1中的所述剩余编码序列。

2.根据实施方案1所述的方法，其中元件1包含位点特异性重组酶的识别位点S1、所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列C1、以及位点特异性重组酶的识别位点S2，其中所述S1和S2能够在位点特异性重组酶的作用下使两位点之间的序列被缺失；

3.根据实施方案1或2所述的方法，其中元件2包含1-50个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个串联的转录终止信号(TTS)，和/或翻译终止信号；例如，所述转录终止信号可以是SV40 polyA和/或BGH polyA等。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中步骤(3)包括如下步骤：将能够识别所述识别位点S1和/或S2的位点特异性重组酶与已连接入所述双链缺口中的所述核酸构建体接触。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中步骤(1)中所述选定位置是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系统的识别位点，具体的，步骤(1)包括下列步骤：将包含待修饰基因的基因组与ZFN、TALEN或Cas以及辅助核酸序列接触，优选的，所述选定位置是CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9或Cas9/gRNA)的识别位点，所述辅助核酸序列为单链向导RNA(sgRNA)，或者crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA)形成的tracrRNA/crRNA核酸复合物。

6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述连接是非同源末端连接(NHEJ)。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述翻译终止信号是一段包含终止密码子的核酸序列，优选是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，其中在所述外显子的全长或部分序列中，通过插入、缺失或者点突变的方法引入终止密码子。

8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述核酸构建体位于载体中，所述载体优选为质粒载体，优选的，所述质粒载体为线性化的质粒载体。

9.根据实施方案8所述的方法，其中所述线性化是体内线性化或者体外线性化。

10.根据实施方案9所述的方法，所述体内线性化包括如下步骤：在所述载体的所述核酸构建体上游引入能够被切割的位点，将载体引入细胞内，将载体与能够识别所述切割位点的酶和/或辅助核酸序列接触。

优选的，所述能够被切割的位点是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas的识别位点，并且所述识别位点的序列不存在于所述细胞的基因组中，相应的，所述酶分别为ZFN、TALEN或Cas，例如，所述Cas优选为Cas9，所述位点是CRISPR/Cas9的识别位点，优选的，所述CRISPR/Cas9的识别位点是hEMX1位点，序列优选为GTCACCTCCAATGACTAGGGTGG，或者lamGolden位点，序列优选为GGGTCAACGACTTCCTGCACGGG。

11.根据实施方案10所述的方法，其中所述剩余编码序列C1包含一个或多个核苷酸位点的替换、插入和/或缺失，从而使由所述剩余编码序列C1恢复表达的待修饰基因的功能与野生型待修饰基因的功能相同或者不同。

12.一种基因组靶向修饰的方法，其包括实施方案1-11中任一项方法中的步骤，其中所述待修饰基因的剩余编码序列还连接有报告基因R1的编码序列，优选的，所述报告基因选自荧光素酶、绿色荧光蛋白、tdTomato、DsRed、tdGFP、mCherry、mStrawberry、mRFP、dsRed、EYFP、EBFP、ECFP、mCerulean、mScarlet、mEmerald、mCitrine、mVenus、YPet、mKO、mKate、mPlum、mTFP1、Dendra2或Kaede、Kakumi、Zebrabow等。

13.根据实施方案12所述的方法，其中所述剩余编码序列和报告基因R1之间通过接头连接，或者直接融合表达。

14.根据实施方案13所述的方法，所述接头是T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段、BmIFV2A肽段、IRES序列等。

15.根据实施方案14所述的方法，所述报告基因R1和识别位点S2之间还包括包含1-50个串联的转录终止信号，例如2个、3个、4个、5个。

16.根据实施方案12-15中任一项所述的方法，所述元件2中的表达终止信号前还包含标记模块，所述标记模块是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，或者所述选定位置之后的多个外显子全长或部分序列的核酸序列，以及与其连接的报告基因R2，优选的，所述报告基因R2和报告基因R1的颜色不同。

17.根据实施方案16所述的方法，其中所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列与报告基因R2之间通过接头连接或者直接融合表达。

18.根据实施方案17所述的方法，所述接头是T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段、BmIFV2A肽段、IRES序列等。

19.一种基因组靶向修饰的方法，其包含实施方案1-11中任一项方法中的步骤，其中在所述元件2的表达终止信号前还包含标记模块，所述标记模块是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，以及与其连接的报告基因R2。

20.根据实施方案19所述的方法，其中所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列与报告基因R2之间通过接头连接或者直接表达。

21.根据实施方案20所述的方法，所述接头是T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段、BmIFV2A肽段、IRES序列等。

22.一种基因组靶向修饰的方法，其包括实施方案1-11中任一项方法中的步骤，其中所述元件2中在表达终止信号前还包含待修饰基因选定位置后的剩余编码序列C2，其具体包含所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列，并且所述剩余编码序列C2包含一个或多个核苷酸位点的替换、插入和/或缺失，任选的，所述元件2中携带与元件1中不同种类的替换、取代和缺失，并且由所述剩余编码序列C2恢复表达的待修饰基因的功能与由元件1中的剩余编码序列C1所恢复表达的待修饰基因的功能相同或不同。

23.一种基因条件性敲除的方法，其包括实施方案1-11中任一项所述的方法。

24.一种同时实现基因标记和基因的条件性敲除的方法，其包括实施方案12-15中任一项所述的步骤。

25.一种基因型标记方法，其包括实施方案16-18中的步骤，经过步骤(3)后，只包含标记基因R1信号的为待修饰基因的野生型基因型；

只包含标记基因R2信号的细胞为待修饰基因的纯合突变型；

同时包含标记基因R1与R2信号的细胞为待修饰基因的杂合型。

26.一种突变纯合体的标记方法，其包括实施方案19-21中的步骤，其中步骤(2)使用两个分别含有两个不同种类的标记基因R2的核酸构建体，经过步骤(3)后，同时表现出两种标记基因R2信号的细胞，就是待修饰基因的突变型纯合体。

27.一种用于实施方案1-26任一项所述方法的核酸构建体。

28.一种包含实施方案27所述核酸构建体的重组载体。

29.根据实施方案28所述的重组载体，其序列如SEQ ID NO：1-4所示。

30.一种包含实施方案27所述的核酸构建体、或实施方案28或29所述重组载体的细胞、组织或器官，所述细胞优选是细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或植物细胞，其中更优选为动物细胞，最优选为哺乳动物细胞或鱼类细胞，例如大鼠、小鼠或斑马鱼细胞；所述组织和/或器官优选为皮肤、角膜、肌腱、骨、血液、血管、神经、心脏瓣膜、软骨组织、神经嵴、朗格罕氏岛和肌肉组织；所述器官优选选自：肾脏、肝脏、心脏、小肠、胃、大肠、脾、骨髓、胸腺、淋巴结、肺和胰腺。

31.一种基因组靶向修饰试剂盒，其包含实施方案27所述的核酸构建体、或实施方案28或29所述的重组载体或者实施方案30所述的细胞、组织或器官。

附图说明

图1显示了CRISPR/Cas9系统诱导斑马鱼tbx5a I2靶位点生成indel的效率检测结果。(a)斑马鱼tbx5a I2(tbx5a基因的第二个内含子)靶点示意图，T5F1和T5R1为用于效率检测的引物，方框圈出的字母为20bp的CRISPR/Cas9靶点序列，PAM序列为CCC，下划线标示的为限制性内切酶BtgI的识别位点序列。(b)通过限制性内切酶BtgI酶切检测靶点效率。CRISPR/Cas系统诱导生成DSB，通过NHEJ修复引入indel，同时还有可能破坏BtgI的识别序列，因此，如果CRISPR/Cas对靶点有切割活性，则会有部分PCR产物无法被BtgI切割(uncut)。结果显示，CRISPR/Cas系统对该位点具有很高的突变效率。(c)将未被切割的DNA片段(“uncut”PCR产物)回收，TA克隆后进行测序，结果显示有不同形式的indel存在。

图2为构建tbx5a条件性敲除+基因标记鱼系的策略示意图。在斑马鱼tbx5a基因的第二内含子中筛选到高效的CRISPR/Cas靶点tbx5a I2。根据该靶点设计了相应的tbx5a正-负载体(PoNe Donor)tbx5a-T2A-tdToamto floxP 2PA-mutExon。通过显微注射实验，在CRISPR/Cas系统的介导下，正-负载体可以定向整合进tbx5a I2靶位点。利用tdTomato荧光可以标记内源tbx5a基因的表达，并便于种系传递筛选。在Cre重组酶作用下，Po-cassette(灰色矩形区域)会被删除，而Ne-cassette(灰色椭圆区域)可以破坏tbx5a的功能，从而实现条件性敲除。

图3(a)、(b)利用Zeiss Axioimager Z1荧光显微镜观察注射过基因敲入体系的F₀斑马鱼胚胎，可以看到部分胚胎的胸鳍表达tdTomato荧光蛋白。由于F₀为嵌合体，因此只看到单侧胸鳍表达tdTomato荧光蛋白(白色箭号)。(c)、(d)对F₀胚胎进行腹侧观察时，可以看到心脏表达tdTomato荧光蛋白(白色箭头)，单侧胸鳍也有表达(白色箭号)。胸鳍和心脏均为内源tbx5a基因的正常表达部位。胚胎发育时期为3dpf，图中标尺为200μm。

图4显示利用接口PCR(Junction PCR)鉴定图3的F₀胚胎中tbx5a PoNe donor发生的基因敲入事件。(a)5’接口PCR凝胶电泳结果及测序分析。从左至右分别为F₀基因组(注射过的胚胎)，tbx5a PoNe donor质粒和来自未经注射胚胎的野生型基因组。黑色箭头指示为发生靶向敲入后，可以扩增出870bp的目的片段。该PCR产物测序结果显示，在5’接口处发生了不同形式的indel。(b)3’接口PCR凝胶电泳结果及测序分析。发生靶向敲入后可以扩增出570bp左右的目的片段。由于tbx5a PoNe donor上也含有这对引物，F₀胚胎基因组中还可以扩增出较大的约730bp的片段。570bp的PCR产物测序结果显示，在3’接口处发生了不同形式的indel。

图5显示了从图3和图4的实验构建的F₀斑马鱼中筛选到的携带可遗传的tbx5aPoNe donor靶向敲入(即含有tbx5a^PoNe等位基因)的F₁胚胎中检测到的tdTomato的表达情况。(a-f)分别为明场下20hpf、30hpf和72hpf的斑马鱼胚胎。(a’-f’)分别对应图a-f的胚胎，在561nm波长的激发光下检测到的tdTomato的表达情况。可以看到在20hpf、30hpf和72hpf时期，在斑马鱼胚胎的心脏(白色箭头)、胸鳍(白色箭号)和眼睛(白色虚线)中均显示了较强的红色荧光信号，如实反映了内源tbx5a基因的表达谱。在20hpf和30hpf时期，tdTomato在神经系统(白色星号)也有较高的表达。图中标尺为200μm。

图6显示了携带tbx5a PoNe donor敲入的斑马鱼胚胎中tdTomato报告基因的表达。(a)明场下48hpf时期斑马鱼胚胎的心脏区域。(b)Tg(cmlc2：EGFP)转基因斑马鱼中，EGFP在心脏的表达情况。(c)tbx5a正-负载体敲入F₁中，tdTomato在心脏中的表达情况。(d)EGFP和tdTomato表达的共定位分析。V：心室；A：心房；AVC：房室间隔；OFT：流出管。图中标尺为50μm。

图7显示了CRISPR/Cas系统诱导tbx5a E3(tbx5a基因的第三个外显子)靶位点生成indel效率的检测结果。(a)tbx5a E3靶点示意图，E3-1F和E3-1R为用于效率检测的引物，方框圈出的字母为20bp的靶点序列，TGG为PAM序列；下划线标示限制性内切酶AluI的识别位点序列。(b)AluI酶切检测靶点效率。CRISPR/Cas系统诱导生成DSB，通过NHEJ修复引入indel的同时有可能破坏AluI的识别序列。因此，如果CRISPR/Cas对靶点有切割活性，则会出现AluI无法切割的PCR产物(uncut)。结果显示，CRISPR/Cas系统对该位点具有很高的突变效率。(c)将未被切割的(DNA片段(“uncut”PCR产物)回收，TA克隆后进行测序，结果显示有不同形式的indel存在。

图8显示了来自图7的tbx5a^Δ5/Δ5突变体的表型分析结果。(a-c)3dpf的tbx5a野生型斑马鱼胚胎，可见胸鳍(黑色箭头)和心脏(黑色箭号)均发育正常。利用Tg(cmlc2：EGFP)转基因鱼系标记心肌细胞，可以看到正常的心脏结构(c，白色虚线)。(d-f)tbx5a^Δ5/Δ5突变体表型。突变体发育至3dpf时，胸鳍缺失(黑色箭头)、围心腔肿大且心脏环化失败(黑色箭号)，EGFP荧光标记显示，突变体心脏环化失败，心管呈线状(f，白色虚线)。图中标尺为200μm。

图9显示了在tbx5a^Δ5/PoNe单细胞期胚胎中注射Cre mRNA模拟tbx5a^Δ5/Δ5突变体表型的结果。(a-d)未注射Cre mRNA的斑马鱼胚胎。可见未经注射的胚胎胸鳍(黑色箭头)、心脏(黑色箭号)均发育正常，并且心脏区域有tdTomato的表达(白色箭号)。(e-h)注射CremRNA后表型正常的斑马鱼胚胎。胸鳍和心脏均发育正常，但心脏区域检测不到tdTomato荧光信号(白色箭号)。(i-l)注射Cre mRNA后发育异常的胚胎。可见胸鳍发育缺失、心脏发育异常、围心腔肿大，心脏区域检测不到tdTomato荧光信号(白色箭号)。V：ventricle(心室)，A：atrium(心房)。图中标尺为200μm。

图10显示了利用PCR及AluI内切酶对来自图8的胚胎进行基因型鉴定的结果。(a)基因型鉴定PCR产物的凝胶电泳结果。1-10号泳道来自表型异常的72hpf胚胎，11-20号泳道为表型正常的胚胎。可以看到，表型异常的胚胎，其基因型均为tbx5a^Δ5/Ne。(b)利用T5F1和SV40R引物对扩增得到的PCR产物的测序结果。方框中为loxP序列，黑色虚下划线为第一个loxP上游的序列，黑色实下划线为第二个loxP下游的序列。

图11显示了CRISPR/Cas系统诱导kctd10 I1靶位点生成indel效率的检测结果。(a)kctd10 I1靶点示意图。K101F和K101R为用于效率检测的引物，方框圈出的字母为20bp的靶点序列，PAM序列为GGG；下划线标示限制性内切酶Hpy188I的识别位点序列。(b)Hpy188I酶切检测靶点效率。CRISPR/Cas系统诱导生成DSB，通过NHEJ修复引入indel，同时有可能破坏Hpy188I的识别序列。因此，如果CRISPR/Cas对靶点有切割活性，则会出现Hpy188I无法切割的PCR产物(Uncut)。结果显示，CRISPR/Cas系统对该位点具有很高的突变效率。(c)将未被切割的PCR产物回收，TA克隆后进行测序，结果显示有不同形式的indel存在。

图12显示了通过NHEJ介导的基因敲入创建kctd10条件性敲除+基因标记鱼系的策略。上图为目的基因的靶位点示意图，kctd10 I1靶点位于第一内含子。中间为kctd10 PoNedonor的结构示意图，与tbx5a PoNe donor结构相似，但是将荧光报告基因替换为tdGFP。下图为发生基因敲入后的kctd10的基因结构(kctd10^PoNe)。k10F1和k10R1是斑马鱼基因组上特有的引物，k10F2和k10R2则是kctd10 PoNe donor上特有的引物。k10F1+k10R2引物对可用于5’接口PCR，k10F2+k10R1引物对可用于3’接口PCR，筛选并鉴定基因敲入事件。当基因敲入发生后，通过PCR可以分别在5’和3’端接口处得到约850bp和1700bp的扩增片段。

图13显示了在F₀胚胎中检测kctd10基因敲入与tdGFP的表达结果。(a-d)荧光显微镜下观察kctd10基因敲入F₀中tdGFP的表达。可以看到，在发育至10hpf的F₀胚胎中，部分细胞具有tdGFP的表达(白色箭号)。标尺为200μm。(e)利用5’和3’接口PCR对F₀胚胎中的基因敲入事件进行检测的结果。

图14为创建斑马鱼tbx5a基因型标记鱼系的策略示意图。沿用此前(图1)的tbx5aI2靶点作为基因敲入位点，对前述的tbx5a正-负载体(图2)进行适当改造而成。利用tdGFP荧光报告基因和两个串联的TSS(PA)构成改进后的Ne-cassette，从而得到基因型标记载体tbx5a-T2A-tdT-2PA floxP tdG-2PA geno-tagging PoNe Donor。通过显微注射实验，在CRISPR/Cas系统的介导下，基因型标记载体可以定向整合进tbx5a I2靶位点。利用tdTomato荧光信号可以标记内源tbx5a的表达，同时便于种系传递筛选。在Cre重组酶作用下，Po-cassette(灰色矩形区域)会被删除，而保留下来的Ne-cassette(灰色椭圆区域)则会破坏tbx5a的功能，同时表达tdGFP荧光，即对被破坏的等位基因进行标记，从而实现对tbx5a基因座的基因型标记。

图15显示了通过NHEJ介导的基因敲入创建tbx5a基因型标记的F₀的实验结果。(a-a”)在注射了tbx5a基因型标记体系的F₀斑马鱼胚胎发育至3dpf时，部分胚胎的胸鳍中可以检测到tdTomato荧光表达(白色箭号)，但检测不到tdGFP荧光信号。(b-b”)在共注射CremRNA的F₀胚胎中，可以在胸鳍中检测到tdGFP荧光表达(白色箭号)，但是检测不到tdTomato荧光信号。(c-c”)在注射了tbx5a基因型标记体系的部分F₀斑马鱼胚胎中，还可以在心脏中检测到tdTomato的表达，但是同样检测不到tdGFP的表达。(d-d”)在某些共注射了Cre mRNA的F₀胚胎中，在心脏中可检测到tdGFP荧光表达，而检测不到tdTomato荧光。

图16显示了注射Cre mRNA诱导tbx5a基因型标记F₁胚胎发生荧光转换的实验结果。(a-a”)是未注射Cre mRNA的tbx5a基因型标记F₁胚胎48hpf时的背侧视图，可以在胸鳍中检测到tdTomato的表达(白色箭号)，而检测不到tdGFP荧光。(b-b”)注射了Cre mRNA的tbx5a基因型标记F₁胚胎48hpf时的背侧视图，可以看到荧光信号发生了转换，即在胸鳍中检测到tdGFP(白色箭号)，而检测不到tdTomato的表达。(c-c”)与(a-a”)对应的F₁胚胎的腹侧视图。可以检测到tdTomato在斑马鱼心脏中表达，同时检测不到tdGFP荧光。(d-d”)与(b-b”)对应的F₁胚胎的腹侧观。注射Cre mRNA后引起了荧光转换，可以在心脏中检测到tdGFP表达，而检测不到tdTomato表达。

图17显示了来自图16、注射了Cre mRNA的胚胎5’和3’接口PCR鉴定Cre/loxP介导的Po-cassette删除的实验结果。(a)以注射了Cre mRNA后的tbx5a基因型标记F₁胚胎的基因组DNA为模板，进行5’和3’接口PCR检测。上图和中图，分别为tbx5a^PoR-NeG和tbx5a^NeG两个等位基因的5’接口PCR结果，下图为两个等位基因共同的3’接口PCR的结果。(b)对应的5’和3’接口PCR产物的测序结果。方框中的序列为发生重组后的loxP序列，黑色虚线为第一个loxP上游的序列，黑色实线为第二个loxP下游的序列。

图18为验证tbx5a基因型标记技术可行性的实验设计示意图。将tbx5a^PoNe杂合子和基因型标记的tbx5a^PoR-NeG杂合子杂交，所获胚胎分两批，分别进行Cre mRNA的注射实验。第一批胚胎从单细胞期开始注射100pg的Cre mRNA，待胚胎发育至48hpf时，进行表型观察并统计数量。第二批胚胎在2-8细胞期之间注射，每个胚胎只注射一个细胞，注射量为25pg，待胚胎发育至48hpf时，同时检测红色和绿色荧光表达情况。

图19显示来自图18的实验的第一批胚胎(在单细胞期注射100pg的Cre mRNA)，待胚胎发育至48hpf时，约27.4％(29/106)的胚胎呈现出与tbx5a突变体相似的表型，即胸鳍缺失、心脏发育异常、围心腔肿大(c-c”，f-f”)。其余72.6％(77/106)的胚胎(b-b”，e-e”)以及未注射Cre mRNA的胚胎(a-a”，d-d”)均发育正常，并且所有注射过Cre mRNA的胚胎均发生了荧光转换。

图20显示了通过荧光标记转换对tbx5a基因同时实现条件性基因敲除和基因型标记的实验结果。(e-h)来自图18的实验的第二批胚胎(在2-8细胞期之间注射Cre mRNA)，注射后48hpf时期，心脏发育正常的斑马鱼胚胎。可以检测到tdTomato和tdGFP两种荧光同时在斑马鱼心脏中表达。但是红绿荧光没有检测到共定位(白色箭头)。(a-d)在2-8细胞期之间注射Cre mRNA后48hpf时期，心脏发育异常的斑马鱼胚胎。可以检测到tdTomato和tdGFP两种荧光同时在斑马鱼心脏中表达，并可以检测到红绿荧光共定位的细胞(白色箭号)。

图21显示了CRISPR/Cas系统诱导sox10 I3靶位点生成indel的效率检测结果。(a)sox10 I3靶点示意图。sox10F和sox10R为用于效率检测的引物，方框圈出的字母为20bp靶点序列，PAM序列为CCA；下划线标示限制性内切酶AciI的识别位点序列。(b)AciI酶切检测靶点效率。CRISPR/Cas系统诱导生成DSB，通过NHEJ修复引入indel，同时有可能破坏AciI的识别序列。因此如果CRISPR/Cas对靶点有切割活性，则会出现AciI无法切割的PCR产物(Uncut)。(c)将未被切割的PCR产物回收，TA克隆后进行测序，结果显示有不同形式的indel存在。

图22为创建斑马鱼sox10基因型标记鱼系的策略示意图。利用sox10 I3靶点作为基因敲入位点，对前述的基因型标记载体进行适当改造，利用8个串联的TSS(PA)替换两个串联的TSS，从而得到基因型标记载体tbx5a-T2A-tdT-8PA floxP tdG-8PA。通过显微注射实验，在CRISPR/Cas系统的介导下，基因型标记载体可以定向整合进sox10 I3靶位点。利用tdTomato荧光可以标记内源sox10的表达，并便于种系传递筛选。在Cre重组酶作用下，Po-cassette(灰色矩形区域)会被删除，而保留下来的Ne-cassette(灰色椭圆区域)则会破坏sox10的功能，同时表达tdGFP荧光，即对被破坏的等位基因进行标记，从而实现对sox10基因座的基因型标记。

图23显示了通过NHEJ介导的基因敲入创建sox10基因型标记的F₀的实验结果。(a)在注射了sox10基因型标记体系的F₀斑马鱼胚胎发育至2dpf时，部分胚胎的神经嵴细胞和耳泡细胞中可以检测到tdTomato荧光表达，但检测不到tdGFP荧光信号。在共注射Cre mRNA的F₀胚胎中，可以在神经嵴细胞和耳泡细胞中同时检测到tdTomato和tdGFP荧光表达。(b)显示了5’和3’接口PCR鉴定Cre/loxP介导的Po-cassette删除的结果。以注射了Cre mRNA后的sox10基因型标记F₀胚胎的基因组DNA为模板，进行5’和3’接口PCR检测。上图和中图，分别为sox10^PoR-NeG和sox10^NeG两个等位基因的5’接口PCR结果，下图为两个等位基因共同的3’接口PCR的结果。

图24为验证sox10基因型标记技术可行性的实验结果。对sox10基因型标记斑马鱼(sox10^PoR-NeG)内交的后代(F₂)胚胎单细胞期注射100pg的Cre mRNA，同时留存部分不注射Cre mRNA的对照组胚胎。待胚胎发育至48hpf时，进行表型观察并统计数量。结果显示，注射Cre mRNA后，约24.6％(56/228)的F₂的胚胎出现了明显的色素缺失，与以报道的sox10突变体的表型相同，而其余75.4％(172/228)的胚胎和未注射的对照组胚胎均发育正常。

图25显示对来自图24、注射Cre mRNA后的F₂胚胎，分别进行基因型鉴定的结果。(a)为基因型鉴定的策略图，利用不同引物PCR扩增5’接口。按照预期，突变体和野生型胚胎将会得到不同的扩增条带。(b)对PCR产物进行凝胶电泳分析，结果显示，出现突变表型的F₂胚胎在注射Cre mRNA之前均为sox10^{PoR-NeG/PoR-NeG}纯合体，而表型正常的F₂胚胎在注射CremRNA之前的基因型则为sox10^PoR-NeG/+杂合子或sox10^+/+(纯合野生型)。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

定义

术语“靶向修饰”是指利用基因组靶向技术，例如TALEN、ZFN或CRISPR/Cas等基因组编辑工具或基因组定点修饰工具在选定位置进行切割，通过引入外源的修饰性DNA片段，从而实现对基因组中任意选定的基因或位点进行修饰的方法，所述修饰包括但不限于基因(DNA)敲入、基因敲除、基因表达的增强或减弱，基因标记(包括空间和时间上)等。在一个实施方式中，利用基因组编辑技术在特定的位置制造双链缺口，随后在该缺口处导入外源修饰片段。

术语“待修饰基因”是指任何被选定的用作基因组修饰的基因，其具体功能不限，可以是任何发育、代谢过程所涉及的基因。

术语“选定位置”是指基于所使用的基因组靶向修饰技术的序列识别特性而在待修饰基因的序列中预测或筛选获得的能够被基因组靶向技术所识别(如切割获得单链或双链缺口)的位点。

在一个实施方式中，所述选定位置ZFN技术的识别位点。ZFN即人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease)，ZFN的锌指蛋白结构域可以靶向识别DNA序列，包含数个锌指基序(Zinc Finger Motif)，每个锌指基序可以识别特定的3个DNA碱基。每个锌指基序包括一个α螺旋和两个β折叠。其中α螺旋的-1～+6位氨基酸残基起到识别碱基的功能。其中，-1、+3、+6位氨基酸残基直接同三联子DNA序列中的3个碱基相互作用。在这7个氨基酸残基中，第4位是固定不变的亮氨酸，其他六个氨基酸残基可以进行改变，使其能够识别特定的DNA序列(Wolfe，S.A.，Nekludova，L.，and Pabo，C.O.(2000).DNA recognition byCys2His2zinc finger proteins.Annu Rev Biophys Biomol Struct 29，183-212)。ZFN包含3-6个锌指基序串联结构，可以识别9-18bp的DNA序列。FokI内切酶可以对DNA进行切割，FokI是在二聚体的情况下才可以切断双链DNA。因此，ZFN是成对起作用的，需要在切割位点的上下游各设计一个ZFN，分别靶向识别DNA正义链和反义链。一对ZFN识别序列之间需要留出足够的空间便于FokI对DNA进行切割，长度通常为5-7bp，称为间隔区(spacer)。

ZFN已经在细胞和小鼠、大鼠、果蝇、斑马鱼等多种模式生物中实现了基因打靶，可以通过建立锌指蛋白库，利用大规模筛选的方式找到可以靶向识别目的序列的锌指蛋白。

在一个实施方式中，所述选定位置TALEN技术的识别位点。TALE(transcriptionactivator-like effector)蛋白家族是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的一种类似转录激活因子的效应因子。当病原体侵染宿主植物后，TALE蛋白可以结合宿主植物特定的内源基因的启动子，并调节该基因的表达，从而创造出病原体侵染宿主植物的有利条件(Boch，J.，and Bonas，U.(2010).Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors：discovery and function.Annual review of phytopathology 48，419-436；Heuer，H.，Yin，Y.N.，Xue，Q.Y.，Smalla，K.，and Guo，J.H.(2007).Repeat domain diversity ofavrBs3-like genes in Ralstonia solanacearum strains and association with hostpreferences in the field.Applied and environmental microbiology 73，4379-4384)。

TALE可以靶向识别宿主植物DNA序列，是由若干个长度为33-35个氨基酸残基的重复单元串联结构，以及末端一个20个氨基酸残基的半重复单元共同构成。每个重复单元及末端的半重复单元可以特异识别并结合靶序列中的一个核苷酸。在每个TALE重复单元中，第12和13位的氨基酸残基是TALE蛋白能够特异识别DNA碱基的关键位点，被称作RVD(repeat variable di-residue)，除RVD之外的氨基酸残基序列比较保守。相比于锌指蛋白，TALE因为具有RVD可以分别特异的结合A、T、C、G四种碱基。RVD与碱基的对应关系为：NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别A和G(Boch，J.，and Bonas，U.(2010).XanthomonasAvrBs3 family-type III effectors：discovery and function.Annual review ofphytopathology 48，419-436；Moscou，M.J.，and Bogdanove，A.J.(2009).A simplecipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science 326，1501)。

TALEN介导的基因组打靶技术的建立，正是基于一种RVD特异识别一种碱基的特性。与ZFN的策略相同，利用TALE替换掉锌指蛋白而作为靶向识别目的序列的结构域，并与FokI内切酶结构域融合形成TALEN人工核酸内切酶。如前文所述，FokI是通过异源二聚体的形式起作用，因此TALEN的设计也是成对，在切割位点上下游各设计一个TALEN，分别靶向结合DNA的正义链和反义链，通过FokI内切酶对DNA切割生成双链断裂(DSB)，经过NHEJ修复引入indel造成基因发生移码突变。

在一个实施方式中，所述选定位置CRISPER/Cas技术的识别位点。CRISPR/Cas系统是一种以核酸为基础的适应性免疫系统(nucleic-acid-based adaptive immunesystem)，广泛地存在于细菌和古生菌中。很多病毒是以细菌为宿主，在侵染宿主时将自己的核酸注入，并整合到细菌的染色体上来完成的自身的复制增殖，进而瓦解宿主细胞。CRISPR/Cas系统就是存在于细菌中的免疫系统，可以定向识别外来病毒核酸和质粒，并摧毁其寄生的能力(Barrangou，R.，Fremaux，C.，Deveau，H.，Richards，M.，Boyaval，P.，Moineau，S.，Romero，D.A.，and Horvath，P.(2007).CRISPR provides acquiredresistance against viruses in prokaryotes.Science 315，1709-1712；Brouns，S.J.J.，Jore，M.M.，Lundgren，M.，Westra，E.R.，Slijkhuis，R.J.H.，Snijders，A.P.L.，Dickman，M.J.，Makarova，K.S.，Koonin，E.V.，and van der Oost，J.(2008b).SmallCRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.Science 321，960-964；Godde，J.S.，and Bickerton，A.(2006).The repetitive DNA elements called CRISPRs andtheir associated genes：Evidence of horizontal transfer among prokaryotes.JMol Evol 62，718-729；Wiedenheft，B.，Sternberg，S.H.，and Doudna，J.A.(2012).RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 482，331-338)。

CRISPR/Cas系统对入侵的病毒和质粒的免疫反应，主要有三个阶段。首先，是适应期(adaptive phase)，细菌需要先获得一段外源核酸(protospacer)，并将它整合到染色体末端的一个叫做CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat)的回文重复元件中(Bhaya，D.，Davison，M.，and Barrangou，R.(2011).CRISPR-Cassystems in bacteria and archaea：versatile small RNAs for adaptive defense andregulation.Annual review of genetics 45，273-297；Terns，M.P.，and Terns，R.M.(2011).CRISPR-based adaptive immune systems.Current opinion in microbiology14，321-327；Wiedenheft，B.，Sternberg，S.H.，and Doudna，J.A.(2012).RNA-guidedgenetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 482，331-338)。其次，是表达期和干扰期(expression and interference phases)，CRISPR位点会被转录生成初级crRNA(precursor CRISPR-derived RNA)，再经过Cas蛋白或者RNaseIII加工处理，形成由若干成熟的crRNA构成的文库，每个crRNA上都有一段核苷酸序列可以与外源核酸形成碱基互补(Carte，J.，Wang，R.，Li，H.，Terns，R.M.，and Terns，M.P.(2008).Cas6is anendoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense inprokaryotes.Genes&development 22，3489-3496；Deltcheva，E.，Chylinski，K.，Sharma，C.M.，Gonzales，K.，Chao，Y.，Pirzada，Z.A.，Eckert，M.R.，Vogel，J.，and Charpentier，E.(2011).CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNaseIII.Nature 471，602-607；Sashital，D.G.，Jinek，M.，and Doudna，J.A.(2011).An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by theendoribonuclease Cse3.Nature structural&molecular biology 18，680-687)。Cas蛋白是另外一个重要的元件，具有内切酶的活性。相应的Cas蛋白可以与crRNA形成切割复合体，通过crRNA与外源核酸的碱基互补，就可以定向识别和切割外源核酸(Brouns，S.J.，Jore，M.M.，Lundgren，M.，Westra，E.R.，Slijkhuis，R.J.，Snijders，A.P.，Dickman，M.J.，Makarova，K.S.，Koonin，E.V.，and van der Oost，J.(2008a).Small CRISPR RNAs guideantiviral defense in prokaryotes.Science 321，960-964；Marraffini，L.A.，andSontheimer，E.J.(2008).CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer inStaphylococci by Targeting DNA.Science 322，1843-1845；Semenova，E.，Jore，M.M.，Datsenko，K.A.，Semenova，A.，Westra，E.R.，Wanner，B.，van der Oost，J.，Brouns，S.J.，and Severinov，K.(2011).Interference by clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat(CRISPR)RNA is governed by a seed sequence.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 108，10098-10103；Westra，E.R.，van Erp，P.B.，Kunne，T.，Wong，S.P.，Staals，R.H.，Seegers，C.L.，Bollen，S.，Jore，M.M.，Semenova，E.，Severinov，K.，et al.(2012).CRISPR immunityrelies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiledinvader DNA by Cascade and Cas3.Molecular cell 46，595-605；Wiedenheft，B.，Lander，G.C.，Zhou，K.，Jore，M.M.，Brouns，S.J.，van der Oost，J.，Doudna，J.A.，andNogales，E.(2011a).Structures of the RNA-guided surveillance complex from abacterialimmune system.Nature 477，486-489)。

目前，已发现的CRISPR/Cas系统共有三种类型(Makarova，K.S.，Aravind，L.，Wolf，Y.I.，and Koonin，E.V.(2011a).Unification of Cas protein families and asimple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems.Biologydirect 6，38；Makarova，K.S.，Grishin，N.V.，Shabalina，S.A.，Wolf，Y.I.，and Koonin，E.V.(2006).A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes：computational analysis of the predicted enzymatic machinery，functioualanalogies with eukaryotic RNAi，and hypothetical mechanisms of action.Biologydirect 1，7)。I型和III型CRISPR/Cas系统在crRNA的形成上具有相似性，都是具有专门的Cas蛋白加工pre-crRNA，当crRNA成熟后就与多种Cas蛋白的复合体融合，识别并切断可以与crRNA互补的核酸序列。II型CRISPR/Cas系统的crRNA形成比较特殊。需要一段可以与重复回文序列互补配对的反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)，才能启动对前体crRNA的加工。再通过特异切割双链RNA的RNaseIII以及Cas9(Csn1)蛋白的参与，就可形成具有活性的内切酶复合体(Deltcheva，E.，Chylinski，K.，Sharma，C.M.，Gonzales，K.，Chao，Y.，Pirzada，Z.A.，Eckert，M.R.，Vogel，J.，and Charpentier，E.(2011).CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.Nature 471，602-607；Gottesman，S.(2011).Microbiology：Dicing defence in bacteria.Nature471，588-589)。Cas9蛋白是II型CRISPR/Cas系统特有的内切酶。CRISPR/Cas9系统同时需要具有激活作用的tracrRNA和靶向作用的crRNA。除此之外，在与被捕获的外源核酸(protospacer)毗邻的区域有一个重要的元件，叫做PAM(Protospacer Adiacent Motif)。PAM是由NGG三个碱基构成，是CRISPR/Cas系统识别protospacer的必要条件(Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A.，and Charpentier，E.(2012).Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity.Science 337，816-821)。

研究表明，如果满足上述条件，II型CRISPR/Cas系统在细菌体外仍然具有对双链DNA的定向切割活性(Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A.，andCharpentier，E.(2012).A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity.Science 337，816-821)。此研究报道后不久，CRISPR/Cas9系统在真核细胞及多个模式生物中成功实现基因打靶，并逐步趋于完善(Cong，L.，Ran，F.A.，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，P.D.，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，L.A.，et al.(2013).Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science 339，819-823；Hwang，W.Y.，Fu，Y.，Reyon，D.，Maeder，M.L.，Kaini，P.，Sander，J.D.，Joung，J.K.，Peterson，R.T.，and Yeh，J.R.(2013a).Heritable andprecise zebrafish genome editing using a CRISPR-Cas system.PloS one 8，e68708；Mali，P.，Yang，L.，Esvelt，K.M.，Aach，J.，Guell，M.，DiCarlo，J.E.，Norville，J.E.，andChurch，G.M.(2013b).RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339，823-826；Nekrasov，V.，Staskawicz，B.，Weigel，D.，Jones，J.D.，and Kamoun，S.(2013).Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9RNA-guided endonuclease.Nat Biotechnol 31，691-693)。已报道的研究中，所用到的SpCas9蛋白是克隆自M1型化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes，SF370)，SpCas9蛋白具有两个内切酶活性的功能域，分别与HNH和RuvC内切酶同源，这两个功能域分别可将双链DNA的一条链切断，从而可形成DSB，切点位置是在PAM区上游3bp处，形成平末端的DNA双链断裂(Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A.，and Charpentier，E.(2012).A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterialimmunity，Science 337，816-821)。此后，CRISPR/Cas9系统不断被优化。比如，为了避免物种差异造成的Cas9工作效率降低，对cas9编码序列进行相应物种的密码子优化。同时，需要在Cas9蛋白的N端和C端添加核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，才可以在真核细胞中起到作用(Chang，N.，Sun，C.，Gao，L.，Zhu，D.，Xu，X.，Zhu，X.，Xiong，J.W.，and Xi，J.J.(2013).Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease inzebrafish embryos.Cell Res 23，465-472；Liu，D.，Wang，Z.，Xiao，A.，Zhang，Y.，Li，W.，Zu，Y.，Yao，S.，Lin，S.，and Zhang，B.(2014a).Efficient gene targeting in zebrafishmediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation of off-targetingeffect.J Genet Genomics 41，43-46)。其次，将crRNA的3’端和tracrRNA的5’端，利用一段碱基序列为GAAA的linker融合在一起形成gRNA(guide RNA)(Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A.，and Charpentier，E.(2012).A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337，816-821)。可以通过体外转录直接获得，这样就构成了CRISPR/Cas基因打靶系统。

在本发明一个实施方案中，通过gRNA实现CRISPR/Cas的基因靶向修饰。

在另一个实施方案中，gRNA采用化学合成的方式获得。

在另一个实施方案中，gRNA采用体外转录的方式获得，并且通过纯化得到RNA备用；在一个优选的实施方案中，gRNA的纯化采用LiCl纯化。

在另一个实施方案中，gRNA带有一个或多个核苷酸位点的化学修饰，从而使该分子在细胞内更加稳定，或者对靶点序列的结合能力更强。例如，对gRNA进行甲基(methyl)、硫代(phosphorothioate)、膦酰基(phosphonoacetate)等修饰(Hendel A，Bak RO，ClarkJT，Kennedy AB，Ryan DE，Roy S，Steinfeld I，Lunstad BD，Kaiser RJ，Wilkens AB，Bacchetta R，Tsalenko A，Dellinger D，Bruhn L，Porteus MH.2015.Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primarycells.Nature Biotechnology 33：985-989.Rahdar M，McMahon MA，Prakash TP，SwayzeEE，Bennett CF，Cleveland DW.2015.Synthetic CRISPR RNA-Cas9-guided genomeediting in human cells.PNAS 112：E7110-7117.Lee K，Mackley VA，Rao A，Chong AT，Dewitt MA，Corn JE，Murthy N.Synthetically modified guide RNA and donor DNA area versatile platform for CRISPR-Cas9 engineering.Elife.2017May 2；6.pii：e25312.Ryan DE，Taussig D，Steinfeld I，Phadnis SM，Lunstad BD，Singh M，Vuong X，Okochi KD，McCaffrey R，Olesiak M，Roy S，Yung CW，Curry B，Sampson JR，Bruhn L，Dellinger DJ.Improving CRISPR-Cas specificity with chemical modifications insingle-guide RNAs.Nucleic Acids Res.2018Jan 25；46(2)：792-803.)。

在另一个实施方案中，gRNA包含一个或多个核苷酸位点的替换、插入和/或缺失，从而使该分子活性更高和/或使用更灵活、简便。例如，使用截短的gRNA(FuY，Sander JD，Reyon D，Cascio VM，Joung JK(2014)Improving CRISPR-Cas nuclease specificityusing truncated guide RNAs.Nat Biotechnol 32(3)：279-284.Xu H，Xiao T，Chen CH，Li W，Meyer CA，Wu Q，Wu D，Cong L，ZhangF，Liu JS，Brown M，Liu XS(2015)Sequencedeterminants of improved CRISPR sgRNA design.Genome Res 25(8)：1147-1157.Moreno-Mateos MA，Vejnar CE，Beaudoin JD，Fernandez JP，Mis EK，Khokha MK，Giraldez AJ(2015)CRISPRscan：designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9targeting in vivo.Nat Methods 12(10)：982.)。

在本发明中，选定位置可以位于基因的外显子或者内含子中，优选位于基因的内含子中，此时外源修饰序列的插入并不会直接破坏目标基因的编码序列，从而更有利于实现本发明的目的。

在一个实施方案中，内含子选择靠前的内含子，例如基因的第一、第二或第三内含子，选择靠前的内含子的优点在于修饰序列位点后存在更长的剩余编码序列，一旦修饰序列实现转录和/或翻译的提前终止，可以使被靶向基因缺失更多的编码序列，从而完全或者大部分缺失基因的正常生理功能。但是本领域技术人员可以理解的是，选择靠后的内含子仍然可以实现本发明的目的，因为只要基因的3’端部分包含重要的功能结构域，通过缺失该结构域，仍然可以使得该基因的功能丧失。

术语“双链缺口”，即通过基因组靶向技术在基因组DNA的两条链中切割产生的断裂，其中缺口两端的DNA末端可以是平末端或者是粘性末端，因此也叫做双链断裂或者DSB。

已知在基因组编辑中，利用人工核酸酶技术的主要目的，就是在细胞内定向诱导DNA双链断裂的产生。当细胞内存在DSB时，主要有两种修复机制：同源重组修复(homologydirected repair，HDR)和非同源末端连接修复(nonhomologous end joining，NHEJ)。同源重组是比较精确的修复机制，细胞中一条染色体的DNA受到损伤时，会以另一条同源染色体作为模板进行修复，这种修复不会引入错误。同源重组修复主要在细胞周期的S期和G2期发生。非同源性末端连接修复是在DSB产生时，直接将断裂连接在一起，在这个过程中会对断口处进行一些处理，从而引入若干碱基的删除或插入(indel)。因此，NHEJ是一种非常不精确的修复方式，如果DSB发生在蛋白编码基因的读码框内，那么NHEJ介导DNA修复引入的indel就有可能造成移码突变。NHEJ是发生在整个细胞周期过程中的，并且相对于HDR，NHEJ发生的概率要更高。

双链缺口的存在可以大大的增加同源重组的效率(Urnov，F.D.，Rebar，E.J.，Holmes，M.C.，Zhang，H.S.，and Gregory，P.D.(2010).Genome editing with engineeredzinc finger nucleases.Nature reviews Genetics 11，636-646)。利用TALEN和CRISPR/Cas系统诱导DSB，同时提供人工合成的同源臂，已经在人类细胞和多种模式生物中实现了HDR介导的基因敲入(Byrne，S.M.，Ortiz，L.，Mali，P.，Aach，J.，and Church，G.M.(2015).Multi-kilobasehomozygous targeted gene replacement in human inducedpluripotent stem cells.Nucleic Acids Research 43；Hoshijima，K.，Jurynec，M.J.，and Grunwald，D.J.(2016).Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simpleand Efficient.Developmental Cell 36，654-667；Irion，U.，Krauss，J.，and Nusslein-Volhard，C.(2014).Precise and efficient genome editing in zebrafish using theCRISPR/Cas9 system.Development 141，4827-4830；Li，H.L.，Fujimoto，N.，Sasakawa，N.，Shirai，S.，Ohkame，T.，Sakuma，T.，Tanaka，M.，Amano，N.，Watanabe，A.，Sakurai，H.，etal.(2015a).Precise Correction of the Dystrophin Gene in Duchenne MuscularDystrophy Patient Induced Pluripotent Stem Cells by TALEN and CRISPR-Cas9.Stem Cell Reports 4，143-154；Li，T.，Liu，B.，Chen，C.Y.，and Yang，B.(2016).TALEN-Mediated Homologous Recombination Produces Site-Directed DNA BaseChange and Herbicide-Resistant Rice.Journal of Genetics and Genomics 43，297-305；Ma，Y.W.，Zhang，X.，Shen，B.，Lu，Y.D.，Chen，W.，Ma，J.，Bai，L.，Huang，X.X.，andZhang，L.F.(2014).Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.Cell Research 24，122-125；Menoret，S.，De Cian，A.，Tesson，L.，Remy，S.，Usal，C.，Boule，J.B.，Boix，C.，Fontaniere，S.，Creneguy，A.，Nguyen，T.H.，et al.(2015).Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineeredproteins.Sci Rep-Uk 5；Shin，J.，Chen，J.K.，and Solnica-Krezel，L.(2014).Efficienthomologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALEnucleases.Development 141，3807-3818；Wang，H.，Hu，Y.C.，Markoulaki，S.，Welstead，G.G.，Cheng，A.W.，Shivalila，C.S.，Pyntikova，T.，Dadon，D.B.，Voytas，D.F.，Bogdanove，A.J.，et al.(2013).TALEN-mediated editing of the mouse Y chromosome.NatBiotechnol 31，530-532；Yu，Z.S.，Chen，H.Q.，Liu，J.Y.，Zhang，H.T.，Yan，Y.，Zhu，N.N.，Guo，Y.W.，Yang，B.，Chang，Y.，Dai，F.，et al.(2014).Various applications of TALEN-and CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination to modify the Drosophilagenome.Biology Open 3，271-280；Zhao，P.，Zhang，Z.，Lv，X.，Zhao，X.，Suehiro，Y.，Jiang，Y.，Wang，X.，Mitani，S.，Gong，H.，and Xue，D.(2016).One-step homozygosity inprecise gene editing by an improved CRISPR/Cas9 system.Cell Res 26，633-636；Zu，Y.，Tong，X.，Wang，Z.，Liu，D.，Pan，R.，Li，Z.，Hu，Y.，Luo，Z.，Huang，P.，Wu，Q.，et al.(2013a).TALEN-mediated precise genome modification by homologousrecombination in zebrafish.Nat Methods 10，329-331)。

相比较HDR，NHEJ也同样能够介导基因敲入，并且具有一个最明显的优势就是敲入效率高。特别是在模式生物斑马鱼中，由于同源重组的发生效率极低，因此NHEJ具有明显的优势。

在本发明的一个实施方式中，利用NHEJ将核酸构建体连接入所述双链缺口中。

术语“核酸构建体”，是指外源修饰片段，或携带外源修饰片段的DNA表达盒，在本发明的方法中，通过导入具有不同结构的核酸构建体，可以实现对目标基因的不同形式的修饰。

术语“可条件性移除”是指能够在特定的条件下将核酸构建体中的元件(例如元件1)移除，在一个实施方式中，所述条件性移除的手段是利用位点特异性重组系统，例如Cre/loxP系统。

在一个实施方式中，本发明提供了一种核酸构建体，通过导入至特定的位置可以实现对靶向基因的单功能或双功能修饰，即同时实现条件性敲除和/或选择性标记，在一个具体实施方式中，所述核酸构建体在本发明中也被称为正-负载体(positive-negativedonor，PoNe donor)，所述正-负载体至少包括两个元件：正元件(Po-cassette)和负元件(Ne-cassette)，其中正元件两侧带有条件性去除的序列，例如loxP位点。当正-负载体整合进入目的基因后，Po-cassette可以确保内源基因转录本的完整性，从而还原内源基因的表达和功能，如果同时携带标记基因，即可实现对内源基因进行标记；当Cre/loxP介导Po-cassette从基因组中被删除后，留在基因组中的Ne-cassette可以对内源基因进行破坏。

具体地，在本发明的一个具体实施方案中，核酸构建体插入到待修饰基因(如斑马鱼tbx5a)的内含子中，例如第二内含子(I2)。在一个具体实施方案中，为了实现基因的条件性敲除，核酸构建体具有下述的正-负载体结构。正元件包括：(1)从I2靶点之后开始到第三外显子的最后一个碱基，此部分的存在能够保证pre-mRNA转录出来后，能够通过剪接将正-负载体剪接入成熟的mRNA；(2)从所述基因的cDNA中克隆的除去第一、二、三外显子之外的蛋白编码序列，同时包括终止密码子。此部分与第(1)部分克隆的第三外显子的序列一起构成了剩余编码序列，本发明所述的“剩余编码序列”即表示存在于核酸构建体插入位点后、能够还原待修饰基因内源表达的部分CDS序列；正元件置于一对同向的loxP位点之中，从而可以在Cre重组酶的存在下，条件性的删除正元件。

负元件：(1)一个(一组)或更多个(组)串联的polyA序列，例如SV40polyA和BGHpolyA，从而在转录水平提前终止目标pre-mRNA的生成，使目标基因仅能形成截短的转录本；(2)优选还包含一个或更多个终止密码子序列，所述终止密码子的存在可认为是“第二道保险”，从而保证即使负元件(1)中的polyA没有完全终止转录，还可以在翻译水平提前终止目标基因的翻译。优选的，所述终止密码子两侧可以含有剪接信号，从而使得所述终止密码子可以通过剪接进入待修饰基因的成熟mRNA中，从而提前终止目标基因的翻译。例如从待修饰基因中克隆第三外显子，包括两边一定长度的内含子序列，例如两侧各约长300bp，并对外显子序列进行点突变，使其含有出现在读码框内的提前终止密码子。

在另一个具体实施方案中，为了实现在待修饰基因实现条件性敲除的同时实现基因标记，构建体具有下述结构：正元件：(1)从I2靶点之后开始到第三外显子的最后一个碱基，此部分的存在能够保证pre-mRNA转录出来后，能够通过剪接将正-负载体剪接入成熟的mRNA；(2)从所述基因的cDNA中克隆的除去第一、二、三外显子之外的蛋白编码序列，并且不包括终止密码子，此部分与第(1)部分克隆的第三外显子的序列一起构成了剩余编码序列，(3)标记基因序列，例如可从pCDNA3.1-tdToamto质粒中克隆tdTomato蛋白编码序列，其中带有终止密码子，标记基因可以与剩余编码序列直接融合连接或者通过连接序列如连接肽(例如P2A linker)连接。具有所述结构的正元件可以在恢复内源基因表达的同时用荧光蛋白对基因进行标记。同时正元件被置于一对同向的loxP位点之中，从而可以在Cre重组酶的存在下，条件性的删除正元件。而负元件则与上述用于实现条件性敲除的核酸构建体相同。

在一个实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，通过导入至特定的位置可以实现基因型标记。

本发明中“基因型标记(geno-tagging)”是指通过特定的标记方法指示出一对等位基因中每一个等位基因的表达或修饰状态，例如可区分出如果待修饰基因的两个等位基因未被修饰、其中一个等位基因被修饰和两个等位基因均被修饰的情形，而目前尚未有任何可以实现上述标记目的方法的报道。

本发明的方法则在本领域第一次实现了基因型标记，此时核酸构建体具有下面的结构：在此前所描述的正-负载体基础上，在Ne-cassette中引入一个与Po-cassette不同的荧光蛋白报告基因(标记基因)，就可以在Po-cassette被Cre/loxP系统删除之后，Ne-cassette在破坏内源基因表达的同时，同时还表达其自身携带的荧光蛋白报告基因，从而产生荧光信号的转换。这样就可以用两个不同的荧光蛋白报告基因分别标记带有Po-cassette的功能正常的等位基因和Po-cassette被删除之后、功能被破坏的等位基因。

利用经过这样改进的geno-tagging正-负载体创建基因敲入的斑马鱼，只要在这样的鱼系中适当控制Cre重组酶的表达量，控制Cre注射量的方法是本领域技术人员熟知的，例如可在常规的注射量基础上适当降低，或者利用常规的方法设立一个注射梯度从而获得合适的注射量。合适的注射量例如5pg、10pg、15pg、20pg、25pg等依次增加，就能实现在同一胚胎的部分细胞或组织中发生条件性基因敲除事件，在同一个等位基因上，同时实现条件性基因敲除和基因标记转换，此时出现三种基因型不同的细胞或组织：只表达Po-cassette标记的(未发生标记转换，即两个等位基因均具有正常功能，相当于野生型)、出现两种荧光标记的(一个等位基因发生荧光标记转换，从而功能出现异常或者功能缺陷，另一个等位基因则为发生转换，保持功能正常，该细胞为杂合子)、仅表达Ne-cassette标记的(两个等位基因均发生标记转换，从而均出现功能缺陷，该细胞为突变纯合型)。从而实现了用两种不同的荧光信号标记两种不同的等位基因，也就实现了仅用两种荧光信号即可将三种不同的基因型区分开，从而也就可以实现通过不同的荧光信号对细胞进行示踪，观察不同基因型的细胞在胚胎发育中的行为和命运。

在另一些实施方案中，正元件和负元件分别或同时进行修改，例如引进精确突变、基因替换等，或者调换相对位置，如正-正载体、负-负载体和负-正载体，从而实现条件性拯救，基因修正等目的。

在一个实施方案中，核酸构建体被首先连接入载体(vector)中引入目标细胞，优选质粒载体。此时优选对载体进行线性化的操作，从而提高NHEJ的效率。质粒线性化包括“体外线性化”和“体内线性化”，体外线性化是指在环状质粒导入目标细胞之前，在体外进行线性化，例如利用在质粒上存在的或者引入的单一限制性内切酶位点，在体外进行酶切消化并纯化，从而获得线性化质粒。

在一个具体实施方式中，所述细胞为动物细胞；优选地，所述动物为大鼠、小鼠或斑马鱼。

体内线性化是指将环状质粒导入细胞之后，在细胞内完成线性化的步骤。已知如果用于基因导入的模板使用环状质粒，并在细胞内进行线性化可以大大提高同源重组或NHEJ介导基因敲入的效率(Hoshijima，K.，Jurynec，M.J.，and Grunwald，D.J.(2016).Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple andEfficient.Developmental Cell 36，654-667；Irion，U.，Krauss，J.，and Nusslein-Volhard，C.(2014).Precise and efficient genome editing in zebrafish using theCRISPR/Cas9 system.Development 141，4827-4830；Shin，J.，Chen，J.K.，and Solnica-Krezel，L.(2014).Efficient homologous recombination-mediated genomeengineering in zebrafish using TALE nucleases.Development 141，3807-3818)，因此本发明优选的技术方案中，采用体内线性化。

在一个具体方案中，线性化位点是待修饰基因序列中基因组编辑工具的切割靶点，该靶点序列被克隆出来并连接进入供体质粒载体，例如将线性化位点序列放置在引物序列中；在另一个具体方案中，利用已经报道过的人类基因EMX1的高效靶点(hEMX1 site)(Lin，S.，Staahl，B.，Alla，R.K.，and Doudna，J.A.(2014).Enhanced homology-directedhuman genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.Elife3)，其序列如SEQ ID NO：66所示，或者已经报道过的七鳃鳗基因Golden的高效靶点(lamGolden site)(Zu Y，Zhang X，Ren J，Dong X，Zhu Z，Jia L，Zhang Q，Li W.(2016)Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system.Sci Rep 6：23496.)，其序列如SEQ ID NO：67所示。由于使用外源靶点hEMX1 site和lamGolden site可以避免使用内源靶点时，载体线性化位点与靶基因位点潜在发生的竞争，降低对内源靶点的切割效率，因此可以实现更好的切割和重组效率。

实施例

材料与方法

1.斑马鱼系

1.1 野生型斑马鱼

实验中所用野生型斑马鱼均为Tu野生型斑马鱼(德国图宾根大学，University ofTübingen)。并通过测序，筛选出敲入位点处无SNP干扰的Tu野生型作为主要材料。

1.2 Tg(cmlc2：EGFP)转基因鱼系

Tg(cmlc2：EGFP)转基因鱼系，为心肌肌球蛋白轻链(Cardiac Myosin LightChain 2，cmlc2)启动子驱动绿色荧光蛋白EGFP的表达，可以特异标记心肌细胞。该鱼系主要用于对斑马鱼胚胎的心脏形态进行观察。

2.CRISPR/Cas靶点设计及RNA合成

2.1 CRISPR/Cas靶点设计

目前有一些常用的CRISPR/Cas设计网站，例如美国麻省理工学院的CRISPRDesign http：//crispr.mit.edu/，以及德国癌症研究中心的E-CRISP http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/。该网站可以根据实验需求进行靶点设计，该设计工具比较方便且信息较全面，但设计所需时间往往比较长。因此，也可以人工寻找靶点序列。对需要基因敲入的DNA序列进行分析，首先找到所有正义链和反义链上的PAM序列。然后，将靶序列及PAM序列在斑马鱼基因组中进行BLAST分析，可以使用NCBI或者Ensembl。若所选择的靶点在斑马鱼基因组中有多个拷贝或者多个相似度高的序列，则放弃选择。而特异性高的序列作为候选靶点。利用限制性内切酶分析工具NEBcutter V2.0 http：//nc2.neb.com/NEBcutter2/，可以分析靶序列是否可以通过单一限制性酶切进行效率检测。

2.2 PCR扩增gRNA模板及纯化

制备gRNA模板通用引物如下：gRNA oligo：

其中，下划线区域为T7启动子核心序列，方框标出为靶点序列，要求第一个碱基为G，便于T7启动子识别。阴影区域为gRNA骨架部分序列，用于PCR扩增gRNA模板。反向引物为Tracr Reverse：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ ID NO：7)。

gRNA骨架模板为pMD9-T-gRNA scaffold(Chang，N.，Sun，C.，Gao，L.，Zhu，D.，Xu，X.，Zhu，X.，Xiong，J.W.，and Xi，J.J.(2013).Genome editing with RNA-guided Cas9nuclease in zebrafish embryos.Cell Res 23，465-472)。

反应体系如下：

/>

程序：94℃ 30s；56℃ 30s；72℃ 30s；40个cycle。

反应结束后，体系中取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否PCR得到单一条带。检测后使用超薄DNA产物纯化试剂盒(Tiangen公司)回收剩余DNA，溶于25μL RNase freeddH₂O中，使用Nanodrop定量。

2.3 体外转录合成gRNA及纯化

利用T7RNA polymerase(TAKARA公司)进行体外转录，37℃反应2.5-3小时，体系如下：

从转录体系中取0.5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测gRNA合成质量。然后，在反应体系中加入30.0μL RNase free ddH₂O和30.0μL7.5mM LiCl溶液。放置于-20℃环境中2h以上。之后，4℃离心30min，转速为14,000rpm。弃去上清液，利用75％的乙醇溶液清洗沉淀，然后4℃离心15min，转速为14,000rpm。弃去上清液，待乙醇全部挥发之后，溶于30μL RNasefree ddH₂O中，并进行Nanodrop定量以及1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4 体外转录zCas9 mRNA及纯化

使用XbaI内切酶(NEB)对pGH-T7-zCas9质粒进行线性化，zCas9为本实验室报道的斑马鱼密码子优化的Cas9(Liu，D.，Wang，Z.，Xiao，A.，Zhang，Y.，Li，W.，Zu，Y.，Yao，S.，Lin，S.，and Zhang，B.(2014a).Efficient gene targeting in zebrafish mediated bya zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation of off-targeting effect.JGenet Genomics 41，43-46.)。在10.0μg质粒中加入1.0μL XbaI内切酶，总体系为50.0μL，在37℃恒温孵育3h，凝胶电泳检测线性化是否完全。之后，利用超薄DNA产物纯化试剂盒(Tiangen公司)对pGH-T7-zCas9(XbaI)线性化产物进行纯化，溶于30.0μL RNase freeddH2O，并进行Nanodrop定量。

使用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒(Ambion公司)进行体外转录，37℃反应2h，体系如下：

从转录体系中取0.5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测mRNA。然后，在反应体系中加入30.0μL RNase free ddH₂O和30.0μL 7.5mM LiCl溶液。放置于-20℃环境中2h以上。之后，4℃离心30min，转速为14,000rpm。弃去上清液，利用75％的乙醇溶液清洗沉淀，然后4℃离心15min，转速为14,000rpm。弃去上清液，待乙醇全部挥发之后，溶于40.0μLRNase freeddH₂O中，并进行Nanodrop定量以及1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 实施例中所使用的CRISPR/Cas靶点序列与效率检测引物

表1a

表1b

3.载体质粒构建

3.1 构建tbx5a正-负载体(用于条件性敲除+基因标记)

克隆从tbx5a I2靶点之后开始到第三外显子的最后一个碱基，称为T5 Donor1st，hEMX1 site包含在正向引物中。从tbx5a cDNA中克隆除去第一、二、三外显子之外的蛋白编码序列，不包括终止密码子，为T5 Donor 2nd。从pCDNA3.1-tdToamto质粒中克隆2A-tdTomato蛋白编码序列(包括终止密码子)，为T5 Donor 3rd。并PCR扩增SV40 ployA和BGHployA，分别克隆自pEGFP-N1和pCDNA3.1质粒。从tbx5a基因中克隆第三外显子，包括两侧的内含子序列，各约长300bp，并对外显子序列进行点突变，使其含有出现在读码框内的提前终止密码子，命名为T5-3rd exon PTC。首先，利用无缝克隆体系pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit(TRANSGEN biotech)将上述T5 Donor 1st、2nd和3rd三个DNA片段连在一起，所有的CDS序列在一个读码框内形成融合蛋白，并且将这3个元件置于一对同向的loxP位点之内。利用第二次无缝克隆将上述扩增的ployA序列和带有提前终止密码子的第三外显子序列T5-3rd exon PTC依次连接到下游loxP位点之后，载体骨架为pMD18-T(TAKARA公司)。

构建得到的tbx5a正-负载体(图2中的tbx5a-T2A-tdToamto floxP 2PA-mutExon)序列为如SEQ ID NO：1所示。

构建tbx5a正-负载体PCR扩增所用引物序列如下表：

表2

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3.2 构建kctd10正-负载体(用于条件性敲除+基因标记)

构建kctd10条件性敲除+基因标记的正-负载体与tbx5a的策略类似。由于kctd10敲入位点设计在第一内含子，因此K10 Donor 1st片段为靶点之后到第二外显子的最后一个碱基。K10 Donor 2nd为除第一、第二外显子之外的kctd10 CDS序列(不包含终止密码子)。K10 Donor 3rd为2A-tdGFP CDS序列(包含终止密码子)。同时，扩增kctd10第三外显子与两侧各约300bp的内含子，并通过突变产生提前终止密码子。其他片段扩增序列均不变，载体骨架为pMD18-T(TAKARA公司)。

kctd10正-负载体(图12中的kctd10-T2A-tdGFP floxP 2PA-mutExon)的序列如SEQ ID NO：2所示。

构建kctd10正-负载体PCR扩增所用引物序列如下表所示：

表3

3.3 构建tbx5a基因型标记载体

构建tbx5a基因型标记载体，主要是在tbx5a正-负载体的基础上进行改造。首先，利用限制性内切酶BsrGI和SalI将tbx5a正-负载体中的负元件(Ne-cassette)切除，利用DNA凝胶电泳回收载体骨架。然后，克隆tbx5a第三外显子的剪接受体位点，其中包含第三外显子87bp的蛋白编码序列，命名为tbx5a tdT-tdG 1st。从kctd10正-负载体中克隆2A-tdGFP序列(包含终止密码子)，为tbx5a tdT-tdG 2nd。从tbx5a正-负载体中克隆串联的转录终止信号SV40 polyA和BGH polyA，为tbx5a tdT-tdG 3rd。最后，利用无缝克隆体系pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(TRANSGEN biotech)将上述三个片段连入之前回收的载体骨架中。最后，使用限制性内切酶NotI将载体线性化，利用DNA凝胶电泳回收载体骨架。然后，利用无缝克隆体系pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(TRANSGEN biotech)将串联的转录终止信号SV40 polyA和BGH polyA连入上述回收的载体中，将构成完整的tbx5a基因型标记载体。

tbx5a基因型标记载体的序列如SEQ ID NO：3所示。

构建tbx5a基因型标记载体PCR扩增所用引物序列如下：

表4

3.4 构建sox10基因型标记载体

构建sox10基因型标记载体，主要是在tbx5a基因型标记载体的基础上进行改造。首先，利用酶切、连接构建串联的8个SV40 polyA，并替换原有的串联poly A结构。其次，利用限制性内切酶EcoRI和AvrII将tbx5a基因型标记载体正元件中的tbx5a相关序列切除，利用DNA凝胶电泳回收载体骨架。然后，PCR扩增tbx5a基因型标记载体中自hEMX1 site之后至XhoI切割位点之间的序列，其中正向引物中包含lamGolden site，将扩增片段命名为sox10tdT-tdG 1st。克隆自sox10 I3 site位点至第三外显子最后一个碱基的序列，命名为sox10tdT-tdG 2nd。从cDNA中克隆剩余的sox10 CDS序列，命名为sox10 tdT-tdG 3rd，利用无缝克隆体系pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(TRANSGEN biotech)将上述三个片段连入之前回收的载体骨架中。其次，利用限制性内切酶SalI和NheI将上述步骤完成载体的负元件中的tbx5a剪接位点序列全部切除，并利用DNA凝胶电泳回收载体骨架。克隆sox10 I3剪接位点的序列，其中包括98bp的第三外显子序列，命名为sox10 tdT-tdG 4^th，利用无缝克隆体系pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(TRANSGEN biotech)将上述片段连入之前回收的载体骨架中。则构成完整的sox10基因型标记载体。

sox10基因型标记载体的序列如SEQ ID NO：4所示。

构建sox10基因型标记载体PCR扩增所用引物序列如下：

表5

4.显微注射

4.1 显微注射相关器材及试剂

利用型号为MODELP-2000的拉针仪(SUTTERINSTRUMENT CO.)，将Harvard 1.0D×0.58ID×100L mm毛细管拉制成注射针，参数为HEAT 400、FIL 4、VEL 20、DEL 130、PUL100。制备注射皿，30mL 3％琼脂糖煮沸后倒入直径9cm塑料培养皿中，用注射皿模具排出气泡悬浮于凝胶上，待凝固后移开模具，在注射皿表面加入少许蒸馏水4℃保存。

酚红(SIGMA公司)，货号P0290。

4.2 显微注射操作

首先，根据实验具体要求配置注射样品，体系中添加10×酚红指示剂。选取合适的注射针，利用无齿镊断开针尖，使断口呈斜切面。使用微量上样枪头吸取注射样品，从注射针尾端上样，尽量不要碰到注射针外壁，以免沾染固体杂质堵塞注射针，上样需连续，中间不能有气柱。然后，使用定量毛细管进行定量(CAMAG公司)，在毛细管内注射33次，液柱长度为1mm时，可保证每次注射量为1nL。最后，收集受精卵，排列在注射皿上进行注射。

5.利用CRISPR/Cas系统创建indel突变体及种系传递筛选

(1)根据具体的基因序列信息设计CRISPR/Cas靶点，并利用T7体外转录体系合成gRNA。

(2)通过显微注射，将CRISPR/Cas体系(zCas9 mRNA+gRNA)注射进斑马鱼一细胞期胚胎中，得到F₀.注射体系终浓度配比为：zCas9 mRNA400ng/μL、gRNA 100ng/μL。每枚受精卵注射量为1-2nL。

(3)待F₀发育至24hpf，选取15枚胚胎分三组，同时选取5枚未注射的同胞野生型胚胎做对照组。利用NaOH碱裂解法快速提取基因组DNA。选用表1b中对应的引物，以上述基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

(4)根据靶点设计时所选的用于效率检测的单一限制性内切酶，对PCR产物进行酶切消化。反应体系根据限制性内切酶的特性进行配制(可查阅公司的实验手册)，之后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并评估靶点效率。

(5)对有效率的靶点，切胶回收未被内切酶消化的DNA片段，通过TA克隆并进行测序，分析indel的形式。同时，将该靶点对应的剩余F₀胚胎饲养至性成熟，F₀数量最好不要少于50条。

(6)通过检测F₁胚胎筛选具有种系传递(germline transmission)的indel突变鱼系：用性成熟的F₀与野生型斑马鱼外交，得到F₁胚胎。根据靶点效率选取用于检测种系传递效率的胚胎数量，一般选20枚，分四个实验组，并挑选5枚野生型作为对照组。采用步骤(3)-(5)的方法检测indel突变的种系传递效率。选取带有所需的indel形式(例如可造成移码突变的indel)的F₀，将其剩余的Fl饲养至性成熟。F₁剪尾提取基因组DNA，PCR扩增后采用步骤(4)和(5)的方法筛选携带所需indel突变的F₁。

(7)将鉴定得到的F₁突变杂合子内交，进行表型等后续分析。

6.利用CRISPR/Cas创建基因敲入鱼系

6.1 通过显微注射创建基因敲入F₀

将zCas9 mRNA、hEMX1 gRNA或lamGolden gRNA、靶基因(Target gene)gRNA和对应的PoNe donor，按照一定比例混合，注射入单细胞期斑马鱼受精卵中，得到F₀。体系浓度配比如下：

将F₀胚胎置于28.5℃恒温培养箱中，待发育至一定时期(根据基因表达谱选择)，利用Zeiss Axioimager Z1显微镜对F₀进行荧光筛查。挑选出带有荧光报告基因表达的F₀胚胎，并进行数量统计，粗略估算基因敲入的效率。挑选出阳性的F₀胚胎，利用lysis buffer提取基因组DNA，并利用5’和3’接口PCR与测序检测敲入情况。PCR扩增所用引物如下：

表6

6.2 筛选携带基因敲入的F₁

将注射过基因敲入体系的F₀饲养至性成熟，与野生型斑马鱼外交，得到F₁胚胎。利用Zeiss Axioimager Z1显微镜对胚胎进行荧光筛查，并利用AxioCam MRc5(Zeiss)进行图片拍摄及图像处理。统计并挑选出带有预期荧光表达图谱的F₁胚胎，并计算种系传递效率和嵌合率(mosaicism)。利用lysis buffer提取单枚F₁胚胎的基因组，通过5’和3’接口PCR检测敲入情况，并进行测序鉴定。将剩余的阳性F₁胚胎饲养至性成熟，经剪尾鉴定筛选出携带基因敲入的F₁鱼系。

实施例1通过基于NHEJ的基因敲入创建tbx5a条件性敲除和基因/细胞标记鱼系

1.tbx5a基因敲入载体构建

tbx5a是斑马鱼心脏发育的重要调控基因。基于NCBI网站中的核酸数据库(Nucleotide，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)和Ensembl中斑马鱼基因组数据库(版本Zv9，http：//asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)对tbx5a的基因结构和序列进行了分析。tbx5a共有4个转录本，其中转录本tbx5a-001和tbx5a-202编码同一蛋白，氨基酸残基数为492aa。转录本tbx5a-201编码485aa的蛋白，但是这一转录本在NCBI数据库中被除去。转录本tbx5a-002是非编码RNA。在本实验中，我们选择以转录本tbx5a-202为主要参考序列，其序列如SEQ ID NO：5所示。在tbx5a第一、二、三内含子中进行了CRISPR/Cas靶点设计以及效率评估。

在斑马鱼基因tbx5a的第二个内含子中设计了CRISPR/Cas靶点，命名为tbx5a I2，其序列如SEQ ID NO：8所示。同时设计了一对效率检测引物T5F1和T5R1，可以通过PCR扩增出长度为335bp的DNA片段，其中含有单一限制性内切酶BtgI的识别位点，该酶的识别位点序列为CCRYGG，在tbx5a I2靶序列中为CCGTGG。随后对tbx5a I2位点进行了效率评估。结果显示，tbx5a I2位点的CRISPR/Cas突变效率约为98％(图1)，非常适宜作为基因敲入的位点。

随后，根据tbx5a的基因序列信息和tbx5a I2的靶点位置，设计并构建了tbx5a正-负载体(图2，tbx5a-T2A-tdToamato floxP 2PA-mutExon PoNe Donor，后文均简称为tbx5aPoNe donor)，其序列如SEQ ID NO：1所示。其中，Po-cassette包括tbx5a I2位点至第三外显子的最后一个碱基，并连接了第三外显子之后的tbx5a其余蛋白编码序列(不包含终止密码子)，其中克隆用正向引物中包含载体线性化位点(hEMX1 site)。然后，利用T2A肽段连接tdTomato荧光报告基因(包含终止密码子)。Ne-cassette包含两个串联的TTS，分别为SV40polyA和BGH polyA。之后，连接带有提前终止密码子突变的tbx5a第三外显子(PTC-E3)。Po-cassette两侧各带有一个同向的loxP序列，在Cre重组酶作用下可以从基因组中被切除，而留在基因组中的Ne-cassette可以破坏tbx5a的功能(图2)。

2、载体线性化方案与基因敲入鱼系创建

设计并比较了两种载体体内线性化的位点，第一种采用的是已经报道过的人类基因EMX1的高效靶点(hEMX1 site)(Lin，S.，Staahl，B.，Alla，R.K.，and Doudna，J.A.(2014).Enhanced homology-directed human genome engineering by controlledtiming of CRISPR/Cas9 delivery.Elife 3.)，第二种是将tbx5a I2靶点的反向互补序列作为载体的线性化位点。

首先利用hEMX1线性化位点通过显微注射构建斑马鱼tbx5a的基因敲入F₀。注射体系为：zCas9 mRNA 300-400ng/μL、tbx5a I2 gRNA 100ng/μL、hEMX1 gRNA 100ng/μL、tbx5aPoNe donor(hEMX1)15ng/μL。向单细胞期斑马鱼受精卵中注射1-2nL上述注射体系。如果在F₀胚胎中发生了基因敲入事件，则利用荧光显微镜应可观察到tdTomato在tbx5a所表达的区域(心脏、胸鳍和眼睛等)特异表达。结果显示，待F₀发育至3dpf左右，利用ZeissAxioimager Z1荧光显微镜对F₀进行观察时，在波长为561nm激发光下，可以看到部分F₀胚胎显示tdTomato表达的红色荧光信号，并且主要表达在心脏和胸鳍中(图3)，初步证明F₀胚胎中发生了基因敲入事件。由于F₀是嵌合体，所以tdTomato的荧光信号分布并不均匀。

为了探究使用同一个内源靶点作为载体线性化的位点是否会降低基因敲入效率，我们合成了利用tbx5a I2反向互补序列作为线性化位点的正-负载体，随后在斑马鱼胚胎中进行了基因敲入实验。显微注射体系为：zCas9 mRNA 300-400ng/μL、tbx5a I2 gRNA200ng/μL、tbx5a PoNe donor(tbx5a I2)15ng/μL，注射量为1-2nL。结果显示，利用tbx5aI2内源靶点作为载体线性化位点所创建的F₀胚胎中，同样可以检测到tdTomato在胸鳍和心脏中的预期表达。

将上述F₀胚胎进行了数量统计，结果显示，两次注射的F₀中发生基因敲入事件的效率分别为15.1％和18.9％(表7)。

表7 tbx5a PoNe donor基因敲入效率统计

基因	Indel效率	载体线性化靶点	F₀荧光表达效率
				tbx5a	98.9％	hEMX1 gRNA	18/119(15.1％)
tbx5a	98.9％	tbx5a I2 gRNA	25/132(18.9％)

为了进一步确认基因敲入事件的真实性，我们提取了以hEMX1 site作为载体线性化位点所创建的tdTomato阳性的F₀胚胎的基因组DNA，并进行了5’和3’接口PCR实验。结果显示，利用基因组上特有的引物T5F1和tbx5a PoNe donor上的引物T5R2可以扩增5’端接口，PCR产物大小为870bp左右；利用tbx5a PoNe donor上特有的引物T5F2与基因组引物T5R1可以扩增出3’端接口，PCR产物大小为570bp左右。由于T5R1在第二内含子靠近剪接位点附近，所以构建tbx5a PoNe donor时也引入了一个拷贝的T5R1。因此，当有tbx5a PoNedonor存在时，T5F2和T5R1还可以扩增出一段大小为730bp的PCR产物。同时，以tbx5a PoNedonor和野生型斑马鱼基因组DNA为模板，则无法扩增出DNA片段。对扩增出的目的DNA片段进行测序，结果显示在5’和3’接口处均可以检测到不同形式的indel(图4)。

上述结果证明在斑马鱼胚胎tbx5a基因中成功发生了由NHEJ介导的基因敲入事件。检测tdTomato荧光在F₀胚胎中的表达，以及利用5’和3’接口PCR实验和测序分析结果，均表明tbx5a PoNe donor在CRISPR/Cas系统的介导下定向整合进入了tbx5a I2靶位点中。

在斑马鱼单细胞期受精卵中注射基因敲入体系所产生的F₀均为嵌合体胚胎，为了保证所有细胞均发生基因敲入事件，将上述经鉴定存在tdTomato表达的F₀进行饲养和外交，最终获得能够稳定遗传tdTomato(即稳定遗传tbx5a基因敲入)的F₁代斑马鱼。

3、利用tbx5a基因敲入鱼系分析tbx5a基因的精细表达

由于目前尚未报道过携带荧光报告基因的tbx5a转基因斑马鱼，而原位杂交技术又受限于如探针质量、杂交温度、显色时间和观测手段等多种因素，导致灵敏度往往不够高，因此本实施例构建的tbx5a敲入的转基因鱼系可以实现tbx5a的精细分析。在携带tbx5a正-负载体敲入的F₁胚胎中，可以检测到tdTomato在心脏、胸鳍和眼睛具有较高的表达。除此之外，在48hpf之前的F₁胚胎中，还观察到tdTomato在胚胎神经系统具有明显的表达(图5)。已有报道，tbx5a在小鼠中的同源基因Tbx5在小鼠神经系统具有较高的表达(Diez-Roux，G.，Banfi，S.，Sultan，M.，Geffers，L.，Anand，S.，Rozado，D.，Magen，A.，Canidio，E.，Pagani，M.，Peluso，I.，et al.(2011).A high-resolution anatomical atlas of thetranscriptome in the mouse embryo.Plos Biol 9，e1000582)。在斑马鱼中也有原位杂交实验结果显示，在24hpf时期检测到tbx5a在神经系统中有表达，而在48hpf以后则检测不到(He，X.，Yan，Y.L.，Eberhart，J.K.，Herpin，A.，Wagner，T.U.，Schartl，M.，andPostlethwait，J.H.(2011).miR-196regulates axial patterning and pectoralappendage initiation.Dev Biol 357，463-477)。

此外，Tbx5在小鼠胚胎中主要表达于左心室，在右心室和心脏流出管(outflowtrack，OFT)中并不表达(Bruneau，B.G.，Logan，M.，Davis，N.，Levi，T.，Tabin，C.J.，Seidman，J.G.，and Seidman，C.E.(1999).Chamber-specific cardiac expression ofTbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.Dev Biol 211，100-108)；而且其表达受到严格的调控，如果发生Tbx5的异位表达则会造成严重的心脏发育异常(Liberatore，C.M.，Searcy-Schrick，R.D.，and Yutzey，K.E.(2000).Ventricular expression of tbx5inhibits normal heart chamber development.Dev Biol 223，169-180)。并且Tbx5在小鼠心脏沿着前后轴方向，具有从低到高的梯度表达(Niederreither，K.，Vermot，J.，Messaddeq，N.，Schuhbaur，B.，Chambon，P.，and Dolle，P.(2001).Embryonic retinoicacid synthesis is essential for heart morphogenesis in the mouse.Development128，1019-1031；Rosenthal，N.，and Xavier-Neto，J.(2000).From the bottom of theheart：anteroposterior decisions in cardiac muscle differentiation.Curr OpinCell Biol 12，742-746；Takeuchi，J.K.，Ohgi，M.，Koshiba-Takeuchi，K.，Shiratori，H.，Sakaki，I.，Ogura，K.，Saijoh，Y.，and Ogura，T.(2003).Tbx5 specifies the left/rightventricles and ventricular septum position during cardiogenesis.Development130，5953-5964)。由于斑马鱼心脏尺寸较小，传统的基因表达检测手段如原位杂交难以揭示基因的精细表达谱，本实施例尝试了利用tbx5a正-负载体敲入的F₁对tbx5a在斑马鱼心脏中的表达进行精细分析。为了更好地分析tbx5a的表达，我们将Tg(cmlc2：EGFP)转基因斑马鱼(特异标记心肌细胞)与携带tbx5a正-负载体敲入的F₀进行杂交，然后通过激光共聚焦显微镜对48hpf的斑马鱼胚胎心脏中tdTomato和EGFP的表达情况进行了精细观察。结果显示，tbx5a在斑马鱼心脏OFT中没有表达，并且从OFT到房室间隔显示出从低到高的梯度表达(图6)。这一结果跟Tbx5在小鼠心脏中的表达情况相吻合。尽管斑马鱼只有一个心室，但是tbx5a的表达仍然存在与小鼠类似的组织特异性和精细的梯度表达。

4.注射Cre mRNA进行tbx5a基因的条件性敲除

创建基因条件性敲除的最终目的，是利用Cre/loxP系统使目的基因在特定的时间和空间(特定组织器官)发生突变。为了通过表型验证我们所创建的tbx5a基因敲入鱼系能够实现tbx5a的条件性敲除，我们创建了一个tbx5a基因的indel突变鱼系，将其跟上述基因敲入鱼系杂交，在后代胚胎中注射Cre重组酶mRNA，以检测条件性突变的发生。

为此，我们首先在tbx5a基因的第三外显子中筛选到一个CRISPR/Cas的高效靶点tbx5a E3(图7)。在斑马鱼胚胎中注射该位点的CRISPR/Cas系统，成功筛选到一个在靶点处发生了5bp碱基缺失的indel突变，将该突变等位基因命名为tbx5a^Δ5。通过F₁内交获得tbx5a^Δ5F₂纯合突变体并对其进行表型分析，可以观察到突变体胚胎在发育至2-3dpf时出现严重的发育异常，主要表现为：心脏环化失败，心管被拉成线状、无法完成泵血功能，血液在静脉窦淤积，围心腔肿大；此外，胸鳍的发育也出现异常，大部分突变体胸鳍完全缺失(图8)。上述表型与前人报道的斑马鱼tbx5a突变体的表型完全一致(Garrity，D.M.，Childs，S.，andFishman，M.C.(2002).The heartstrings mutation in zebrafish causes heart/finTbx5 deficiency syndrome.Development 129，4635-4645)。因此，我们所得到的tbx5a^Δ5是所需的功能失活突变。

为了与tbx5a^Δ5等位基因进行区分，我们将前述通过正-负载体策略创建的条件性等位基因命名为tbx5a^PoNe。相应地，将Po-cassette被Cre重组酶诱导删除后的等位基因命名为tbx5a^Ne(图2)。按照预期，如果tbx5a^PoNe具备条件性敲除的功能，则基因型为tbx5a^Δ5/PoNe的胚胎经Cre重组酶诱导后，部分细胞的基因型会转变为tbx5a^Δ5/Ne；如果Cre重组酶具有较高的诱导效率，则会产生较多的tbx5a^Δ5/Ne细胞，从而有可能导致相应的胚胎出现与tbx5a^Δ5/Δ5纯合突变体类似的表型。

我们选用嵌合率为43.8％的tbx5a基因敲入F₀与tbx5a^+/Δ5杂合子杂交，向受精卵中注射编码Cre重组酶的mRNA。Cre mRNA经翻译生成Cre重组酶蛋白，在带有基因敲入的胚胎中可以介导loxP之间的Po-cassette删除，而Ne-cassette仍留在基因组中，从而使功能正常的tbx5a^PoNe等位基因转变为功能失活的tbx5a^Ne等位基因，同时还会失去tdTomato的表达。在上述杂交后代中有一部分胚胎的基因型为tbx5^aΔ5/PoNe，如果基于正-负载体的条件性敲除策略可行并且Cre重组酶的活性足够高，那么就会有一些胚胎中的大部分甚至全部细胞由于Po-cassette被删除而转变为tbx5a^Δ5/Ne的基因型，从而使该胚胎失去tdTomato的表达，并模拟出类似tbx5a^Δ5/Δ5纯合突变体的表型。结果显示，在注射后的78枚发育至72hpf的胚胎中，有58枚发育正常，另外20枚胚胎出现发育异常，主要包括心脏环化程度低、围心腔有水肿、胸鳍缺失。利用Tg(cmlc2：EGFP)对心脏进行标记，可以更清楚地观察到心脏发育的异常(图9)。

在荧光显微镜下仔细观察，发现所有注射过Cre mRNA的胚胎中均检测不到tdTomato的表达，说明Cre重组酶诱导loxP发生重组的效率很高，Po-cassette均被切除。而31枚未注射过Cre mRNA的胚胎表型均正常，其中有13枚胚胎中可以检测到tdTomato的红色荧光信号，跟预期相符。

随后选取部分注射过Cre mRNA并发育至72hpf的胚胎，单胚胎提取基因组DNA，通过PCR的方法进行基因型鉴定。其中，在两个loxP位点外侧设计了一对引物T5F1和SV40R，如果发生了Cre/loxP介导的Po-cassette删除，则利用这对引物能够扩增出一段628bp的产物，否则会由于两个loxP之间的DNA序列太长，而无法通过PCR扩增出产物(图2)。E3-1F和E3-1R引物对以及AluI酶切用来区分tbx5a⁺和tbx5a^Δ5等位基因。结果显示，从表型异常的胚胎中均可以通过PCR扩增得到两个loxP之间的序列删除后所产生的目的片段，说明这些胚胎中均带有tbx5a^Ne等位基因；PCR产物测序结果也证明发生了Po-cassette的删除。E3-1F和E3-1R引物对PCR扩增和AluI酶切分析结果显示，表型异常的胚胎均携带tbx5a^Δ5等位基因，而均未携带野生型等位基因。也就是说，所有表型异常的胚胎的基因型均为tbx5a^Δ5/Ne(图10)。而表型正常的胚胎中则至少携带一个野生型等位基因tbx5a⁺。

综合上述结果，我们的基因敲入策略能够通过一次实验有效地同时实现条件性基因敲除和基因标记等位基因的创建。

实施例2通过基于NHEJ的基因敲入创建kctd10条件性敲除和基因/细胞标记鱼系

在kctd10第一内含子中设计了一个CRISPR/Cas靶位点，命名为kctd10 I1，其序列如SEQ ID NO：10所示。利用与靶点对应的单一限制性内切酶Hpy188I进行了效率评估，结果显示，kctd10 I1位点具有很高的切割活性，效率接近97％，并且通过测序可以在靶点序列中检测到不同形式的indel。因此选择kctd10 I1靶点作为后续实验的基因敲入位点(图11)。

基于与实施例1类似的策略，设计并构建了用于kctd10基因敲入的正-负载体kctd10-T2A-tdGFP floxP 2PA-mutExon PoNe donor(图12，后简称kctd10 PoNe donor)，其序列如SEQ ID NO：2所示。随后通过显微注射向单细胞期斑马鱼胚胎注射了kctd10的基因敲入体系：zCas9 mRNA 300-400ng/μL、kctd10 I1 gRNA 100ng/μL、hEMX1 gRNA 100ng/μL、kctd10 PoNe donor 15ng/μL。我们以前的研究表明，kctd10的表达时期很早，并且具有较强的母源表达。因此，为了便于检测，待F₀胚胎发育至10hpf时，利用Zeiss AxioimagerZ1荧光显微镜进行了荧光筛查，结果成功地检测到了tdGFP的表达(图13)。一共得到了107枚发育至10hpf的F₀，其中有22枚带有tdGFP荧光，敲入效率估算为20.6％。

在斑马鱼单细胞期受精卵中注射基因敲入体系所产生的F₀均为嵌合体胚胎，为了保证所有细胞均发生基因敲入事件，将上述经鉴定存在tdGFP表达的F₀进行饲养和外交，最终获得了能够稳定遗传tdGFP(即稳定遗传kctd10基因敲入)的F₁代斑马鱼。进一步通过注射Cre mRNA进行条件性敲除实验，结果表明敲入载体能够实现kctd10基因的条件性敲除(结果略)。

实施例3制备tbx5a的基因型标记鱼系

首先，同样利用实施例1中的tbx5a I2靶点作为基因敲入位点(图1)，构建了tbx5a的基因型标记载体tbx5a-T2A-tdT-2PA floxP tdG-2PA geno-tagging PoNe Donor(图14，后简称tbx5a geno-tagging donor)，其序列如SEQ ID NO：3所示。

通过显微注射向单细胞期斑马鱼胚胎中注射基因敲入体系：zCas9 mRNA 300-400ng/μL、tbx5a I2 gRNA 100ng/μL、hEMX1 gRNA 100ng/μL、tbx5a geno-tagging donor(hEMX1)15ng/μL，得到了基因型标记载体敲入的F₀斑马鱼胚胎。

为了在F₀阶段尽快地验证基因型标记的有效性，在另一次类似的实验中我们在上述基因敲入体系中还同时加入了Cre mRNA，共注射斑马鱼单细胞期胚胎。此时，如果仅发生了基因敲入事件，则正元件(Po-cassette)中的tdTomato会产生红色荧光信号，而负元件(Ne-cassette)中的tdGFP则不会表达；但是，当Cre重组酶发生作用后，Po-cassette会被删除，从而导致tdTomato的红色荧光表达丧失，而Ne-cassette中的tdGFP将会表达并产生绿色荧光信号，从而发生荧光标记的转换。

实验结果显示，待F₀发育至3dpf时，在单独注射基因型标记体系的F₀中，部分胚胎的心脏和胸鳍中可以检测到tdTomato的荧光信号，但是检测不到tdGFP的表达，跟预期相符；而在共注射了Cre mRNA的F₀中，在部分胚胎的心脏和胸鳍中可以检测到tdGFP的表达，但是检测不到tdTomato的表达，说明Cre重组酶已经有效地切除了Po-cassette(图15)。

数量统计结果显示，在124枚注射了tbx5a基因型标记体系的F₀胚胎中，有16枚可以检测到tdTomato荧光在心脏或者胸鳍中呈现不同程度的表达，粗略估计基因敲入事件在F₀中所占比例为12.9％。在共注射Cre mRNA的96枚F₀胚胎中，有11枚胚胎在心脏或者胸鳍中可以检测到tdGFP的表达，粗略估计基因敲入事件的效率为11.4％。

将单独注射了基因型标记体系的F₀饲养至成鱼，通过筛选得到了tbx5a基因型标记鱼系。

注射Cre mRNA使tbx5a基因型标记鱼系发生荧光转换

挑选上述基因型标记种系嵌合率较高的F₀与野生型斑马鱼进行外交，随后向每个F₁受精卵在单细胞时期注射10pgCre mRNA，待胚胎发育至48hpf时观察荧光表达情况(图16)，结果显示，在所有注射过Cre mRNA的131枚F₁胚胎中均检测不到tdTomato的表达，有52枚可以观察到tdGFP的荧光表达于心脏、胸鳍和眼睛，比例为39.7％。而未注射Cre mRNA的56枚F₁胚胎中，有20枚可以检测到tdTomato特异表达于斑马鱼胚胎的心脏、胸鳍和眼睛，比例为35.7％；这些胚胎均检测不到tdGFP的表达(表8)。

表8 tbx5a基因型标记F₁荧光转换统计

从表达tdGFP的F₁胚胎中随机挑选出4枚胚胎，利用NaOH碱裂解法提取单胚胎基因组DNA进行5’和3’接口PCR，对Cre重组酶介导的Po-cassette的删除进行鉴定(图17)。为了便于区分，将Cre诱导Po-cassette删除前的等位基因命名为tbx5a^PoR-NeG，诱导删除后的等位基因命名为tbx5a^NeG。结果显示，表达tdGFP荧光的F₁基因组中均可扩增出预期的PCR产物，测序结果也证明发生了基因敲入和Cre重组酶介导的Po-cassette切除事件。以上结果说明，本实施例所构建的tbx5a基因型标记斑马鱼能够在Cre重组酶的作用下有效地发生荧光转换，并且通过荧光信号能够对不同基因型的细胞进行标记。

同时实现条件性基因敲除和基因型标记

首先，利用前述的tbx5a基因敲入杂合子斑马鱼(tbx5a^PoNe)和上述的tbx5a基因型标记杂合子斑马鱼(tbx5a^PoR-NeG)进行杂交。然后，将后代胚胎分为两批分别注射Cre mRNA。第一批胚胎从单细胞期开始注射，并且Cre mRNA注射量相对较高，具体为100pg。第二批胚胎在2-8细胞期之间注射，每个胚胎只注射其中一个细胞，并且Crre mRNA注射量相对较低，具体为25pg(图18)。最后，待胚胎发育至48hpf时，对这些胚胎进行荧光与表型观察并统计数量(图19、图20和表9)。

表9单细胞期注射Cre mRNA的tbx5a基因型标记F₂表型统计

胚胎表型	胚胎数量	期望比例	实际比例
				正常	77	75％	72.6％
异常	29	25％	27.4％

结果显示，在单细胞期注射Cre mRNA，有27.4％的胚胎呈现出tbx5a的突变表型，主要表现为胸鳍缺失和心脏发育异常，说明利用上述基因型标记鱼系也能够有效地实现条件性基因敲除。在2-8细胞期之间注射Cre mRNA时，可以同时在斑马鱼心脏中检测到tdTomato和tdGFP两种荧光表达，说明这一鱼系还能够实现利用荧光标记转换对不同基因型的细胞进行标记。

实施例4制备sox10的基因型标记鱼系

本实施例进一步选择了斑马鱼sox10基因作为目的基因验证基因型标记的可行性和有效性。sox10主要在斑马鱼头部和躯干神经嵴细胞和耳泡中表达，对于黑色素细胞的发育具有重要作用，该基因无义突变后导致斑马鱼黑色素缺失(Dutton K，Dutton JR，Pauliny A，Kelsh RN.2001a.A morpholino phenocopy of the colourlessmutant.Genesis 30：188-189；Dutton KA，Pauliny A，Lopes SS，Elworthy S，Carney TJ，Rauch J，Geisler R，Haffter P，Kelsh RN.2001b.Zebrafish colourless encodes sox10and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates.Development 128：4113-4125.)。为构建sox10的基因型标记斑马鱼，我们首先在sox10第三内含子设计了一个CRISPR/Cas靶位点，命名为sox10 I3，其序列如SEQ ID NO：1l所示。利用与靶点对应的单一限制性内切酶AciI进行了效率评估，结果显示，sox10 I3位点具有很高的切割活性，效率接近85％，通过测序可以在靶点序列中检测到不同形式的indel。因此选择sox10 I3靶点作为后续实验的基因敲入位点(图21)。

基于与实施例3类似的策略，设计构建了用于sox10的基因型标记载体sox10-T2A-tdT-8PA floxP tdG-8PA geno-tagging PoNe Donor(图22，后简称为sox10 geno-taggingdonor)，其序列如SEQ ID NO：4所示。该载体使用已报道的靶向敲除七鳃鳗(lamprey)golden基因的高效率Cas9/gRNA位点lamGolden site作为载体线性化位点(Zu Y，ZhangXS，Ren JF，Dong XH，Zhu Z，Jia L，Zhang QH，Li WM.2016.Biallelic editing of alamprey genome using the CRISPR/Cas9 system.Sci Rep 6：23496.)，同时将转录终止元件替换为8个串联的SV40 polyA，简称8PA。

通过显微注射向单细胞期斑马鱼胚胎中注射基因敲入体系：zCas9 mRNA 300-400ng/μL、sox10 I2 gRNA 100ng/μL、lamGolden gRNA 100ng/μL、sox10 geno-taggingdonor(lamGolden)15ng/μL，得到了基因型标记的F₀斑马鱼胚胎。

为了在F₀阶段尽快地验证基因型标记的有效性，在另一次类似的实验中我们在上述基因敲入体系中还同时加入了Cre mRNA，共注射斑马鱼单细胞期胚胎。此时，如果发生基因敲入事件，则正元件(Po-cassette)中的tdTomato会产生红色荧光信号，同时负元件(Ne-cassette)中的tdGFP不会表达；当Cre重组酶发生作用后，Po-cassette会被删除，从而导致tdTomato的红色荧光表达丧失，而Ne-cassette中的tdGFP将会表达并产生绿色荧光信号，从而发生荧光标记的转换。

结果显示，待F₀发育至2dpf时，在单独注射基因型标记体系的F₀中，部分胚胎的头部及躯干神经嵴和耳泡中可以检测到tdTomato的荧光信号，但是检测不到tdGFP的表达；而共注射了Cre mRNA的F₀中，在部分胚胎的头部及躯干神经嵴和耳泡中可以检测到tdGFP的表达，但是检测不到tdTomato的表达。5’和3’接口PCR实验结果显示，在F₀中确实发生了基因敲入事件和Cre诱导的Po-cassette删除事件，说明Cre重组酶能够有效地切除Po-cassette(图23)。

数量统计结果显示，在152枚注射了sox10基因型标记体系的F₀胚胎中，有103枚可以检测到tdTomato荧光在头部及躯干神经嵴和耳泡中呈现不同程度的表达，粗略估计基因敲入事件在F₀中所占比例为67.8％。在共注射Cre mRNA的126枚F₀胚胎中，有29枚胚胎在头部及躯干神经嵴和耳泡中可以检测到tdGFP的表达，粗略估计基因敲入事件的效率为23.0％。

将检测到tdTomato表达的F₀饲养至性成熟，并进行种系传递筛选，在21个F₀中，筛选到10个基因敲入事件发生种系传递的F₀，嵌合率从8.2％到50.0％不等(表10)。将来自6#F₀、有tdTomato表达的F₁胚胎饲养至性成熟后用于后续实验，将该鱼系的sox10基因型标记等位基因命名为sox10^PoR-NeG，Cre诱导Po-cassette删除后的等位基因命名为sox10^NeG。

表10 sox10基因型标记载体敲入种系传递效率统计

F₀(性别)	tdTomato表达F₀	F₁总数	F₀嵌合率	等位基因名
					#1(雄)	16	167	9.6％
#2(雌)	11	91	12.1％
					#4(雌)	11	134	8.2％
#5(雄)	24	103	23.3％
					#6(雄)	42	84	50.0％	sox10^PoR-NeG
#7(雄)	2	22	9.1％
					#9(雄)	39	107	36.5％
#10(雄)	33	131	25.2％
					#11(雄)	57	137	41.6％
#12(雄)	6	44	13.6％

sox10基因型标记可以同时实现条件性基因敲除和基因型标记

将基因型为sox10^PoR-NeG/+的F₁成鱼内交获得F₂胚胎。将F₂胚胎分为两组，第一组在胚胎一细胞期时注射100pg Cre mRNA，第二组不做处理。待胚胎发育至2dpf时期，可以看到注射Cre mRNA后，部分F₂胚胎出现了明显的色素缺失，与已报道的sox10突变体colourless的表型一致，并且所占比例为24.6％(56/228)，其余的胚胎发育正常(图24)。未做处理的一组F₂均发育正常。

表11 sox10基因型标记F₂表型统计

胚胎表型	胚胎数量	期望比例	实际比例
				正常	172	75％	75.4％
异常	56	25％	24.6％

利用5’接口PCR可以区分sox10^PoR-NeG等位基因与sox10⁺，藉此进一步验证了F₂突变表型与基因型的对应性。为此，分别从表型正常和异常(色素缺失)的F₂胚胎中挑选了16枚胚胎提取基因组DNA并进行5’接口处PCR实验。结果显示，表型异常的F₂胚胎在注射CremRNA前均为sox10^{PoR-NeG/PoR-NeG}纯合体，而表型正常的胚胎则为sox10^PoR-NeG/+杂合体或者sox10^+/+野生型(图25)。以上实验结果均表明，利用本发明的方法可以在sox10^PoR-NeG等位基因中同时实现条件性基因敲除和基因标记转换。

Claims

1.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

其中所述核酸构建体包含串联的元件1和元件2，元件1包含可条件性移除的待修饰基因选定位置后的剩余编码序列C1，从而保证待修饰基因的正常表达，所述“剩余编码序列”是指存在于核酸构建体插入位点后，能够还原待修饰基因内源表达的部分CDS序列；

其中，元件1包含位点特异性重组酶的识别位点S1、所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列C1、以及位点特异性重组酶的识别位点S2，其中所述S1和S2能够在位点特异性重组酶的作用下使两位点之间的序列被缺失；

所述元件2包含表达终止信号，其能够在元件1中所述的剩余编码序列C1被移除后，终止待修饰基因的转录和/或翻译，从而缺失待修饰基因的内源表达；所述表达终止信号为1-50个串联的转录终止信号，和/或翻译终止信号；

(3)移除元件1中的所述剩余编码序列，具体包括如下步骤：将能够识别所述识别位点S1和S2的位点特异性重组酶与已连接入所述双链缺口中的所述核酸构建体接触。

2.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

其中，元件1包含位点特异性重组酶的识别位点S1、所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列C1、以及位点特异性重组酶的识别位点S2，其中所述S1和S2能够在位点特异性重组酶的作用下使两位点之间的序列被缺失；所述待修饰基因的剩余编码序列C1还连接有报告基因R1的编码序列；

3.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

其中，元件1包含位点特异性重组酶的识别位点S1、所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列C1、以及位点特异性重组酶的识别位点S2，其中所述S1和S2能够在位点特异性重组酶的作用下使两位点之间的序列被缺失；其中所述待修饰基因的剩余编码序列还连接有报告基因R1的编码序列；

所述元件2包含表达终止信号，其能够在元件1中所述的剩余编码序列C1被移除后，终止待修饰基因的转录和/或翻译，从而缺失待修饰基因的内源表达；

元件2的表达终止信号为1-50个串联的转录终止信号，和/或翻译终止信号；并且所述表达终止信号前还包含标记模块，所述标记模块是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，或者所述选定位置之后的多个外显子全长或部分序列的核酸序列，以及与其连接的报告基因R2，并且所述报告基因R2和报告基因R1的颜色不同；

4.一种突变纯合体的标记方法，其包括如下步骤：

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

元件2的表达终止信号为1-50个串联的转录终止信号，和/或翻译终止信号；并且所述表达终止信号前还包含标记模块，所述标记模块是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，以及与其连接的报告基因R2；

(3)移除元件1中的所述剩余编码序列，具体包括如下步骤：将能够识别所述识别位点S1和S2的位点特异性重组酶与已连接入所述双链缺口中的所述核酸构建体接触；

其中步骤(2)使用两个分别含有两个不同种类的标记基因R2的核酸构建体，经过步骤(3)后，同时表现出两种标记基因R2信号的细胞，就是待修饰基因的突变型纯合体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述转录终止信号是SV40 polyA和/或BGH polyA。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(1)中所述选定位置是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系统的识别位点。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述选定位置是CRISPR/Cas的识别位点，并且步骤(1)包括下列步骤：将包含待修饰基因的基因组与Cas以及辅助核酸序列接触；所述辅助核酸序列为单链向导RNA(sgRNA)，或者crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA)形成的tracrRNA/crRNA核酸复合物。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述连接是非同源末端连接(NHEJ)。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述翻译终止信号是一段包含终止密码子的核酸序列，所述核酸序列包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列，并且其中在所述外显子的全长或部分序列中，通过插入、缺失或者点突变的方法引入终止密码子。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述核酸构建体位于质粒载体中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述质粒载体为线性化的质粒载体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述线性化是体内线性化或者体外线性化。

13.根据权利要求12所述的方法，所述体内线性化包括如下步骤：在所述载体的所述核酸构建体上游引入能够被切割的位点，将载体引入细胞内，将载体与能够识别所述切割位点的酶和/或辅助核酸序列接触。

14.根据权利要求13所述的方法，其中能够被切割的位点是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9的识别位点，并且所述识别位点的序列不存在于所述细胞的基因组中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9的识别位点是hEMX1位点，序列为GTCACCTCCAATGACTAGGGTGG；或者lamGolden位点，序列为GGGTCAACGACTTCCTGCACGGG。

16.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述报告基因R1选自荧光素酶、绿色荧光蛋白、tdTomato、DsRed、tdGFP、mCherry、mStrawberry、mRFP、dsRed、EYFP、EBFP、ECFP、mCerulean、mScarlet、mEmerald、mCitrine、mVenus、YPet、mKO、mKate、mPlum、mTFP1、 Dendra2、Kaede、Kakumi或Zebrabow。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述剩余编码序列和报告基因R1之间通过接头连接，或者直接融合表达。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述接头是T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段、BmIFV2A肽段或者IRES序列。

19.根据权利要求18所述的方法，所述报告基因R1和识别位点S2之间还包括包含1-50个串联的转录终止信号。

20.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列与报告基因R2之间通过接头连接或者直接融合表达。

21.根据权利要求20所述的方法，所述接头是T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段、BmIFV2A肽段或者IRES序列。

22.一种用于权利要求1-21任一项所述方法的核酸构建体。

23.一种包含权利要求22所述核酸构建体的重组载体。

24.根据权利要求23所述的重组载体，其序列如SEQ ID NO：1-4中任一所示。

25.一种包含权利要求22所述的核酸构建体、或权利要求23或24所述重组载体的细胞、组织或器官，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞或者动物细胞。

26.根据权利要求25所述的细胞、组织或器官，其中所述动物细胞为大鼠、小鼠或斑马鱼细胞。

27.根据权利要求25所述的细胞、组织或器官，所述组织选自皮肤、角膜、肌腱、骨、血液、血管、神经、心脏瓣膜、软骨组织、神经嵴、朗格罕氏岛和肌肉组织；所述器官选自：肾脏、肝脏、心脏、小肠、胃、大肠、脾、骨髓、胸腺、淋巴结、肺和胰腺。

28.一种基因组靶向修饰试剂盒，其包含权利要求22所述的核酸构建体、权利要求23或24所述的重组载体或者权利要求25所述的细胞、组织或器官。