CN112553079B - 一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，属于基因工程技术领域。表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，针对球虫的目的基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒；构建含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒；将基因编辑质粒和同源重组质粒共同转染球虫的子孢子；将转染后的子孢子感染动物，筛选，得到表达外源荧光蛋白球虫。本发明利用基因编辑技术和同源重组技术相结合在球虫基因组中敲入荧光蛋白mCherry基因和筛选基因，构建的球虫能稳定高效表达荧光信号。所述构建方法不仅能成功构建表达有外源荧光蛋白球虫而且荧光蛋白表达稳定且效率高，适用于球虫的生长、基因工程或药物筛选方面的研究。

Description

一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法。

背景技术

mCherry是一种用于示踪的红色荧光染料，可进行分子标记和细胞组分定位等。mCherry是从珊瑚(Discosoma)中分离出来的蛋白，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm。mCherry因其颜色和单体分子的光稳定性，比其它荧光蛋白标签更具有优势。

mCherry灵敏度高，易于检测，且是用于活体检测，对细胞、细胞器等不具有破坏性；在活体内不受虫体不同发育阶段的限制；不需要任何底物和外源辅助因子参与；在自然光下有时也可观测到颜色的变化。

在对原生动物研究时，为了方便研究某个基因或蛋白的作用，需要向研究对象引入某个基因或给目的基因加上某些标记，这种研究方法称为基因敲入(gene knock in)。而现有技术中通常是采用同源重组技术将荧光报告基因敲入目标基因后，该方法操作简便，但荧光报告基因表达有限，荧光信号较差，荧光标记效果不好。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，构建得到的球虫不仅能高效表达荧光信号，而且具有较高的稳定性。

本发明提供了一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，包括以下步骤：

1)针对球虫的目的基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒；

2)构建含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒；

3)将所述含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒共同转染球虫的子孢子；

4)将转染后的子孢子感染动物，筛选，得到表达外源荧光蛋白球虫；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

优选的，步骤2)中所述同源重组质粒中外源插入片段为5'同源臂-目的基因CDS-筛选基因-mCherry-3'同源臂。

优选的，所述外源插入片段中筛选基因为DHFR。

优选的，所述外源插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；

含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒为pEtA::DHFR-mCherry。

优选的，所述筛选用药物为乙胺嘧啶。

优选的，步骤1)中所述基因编辑质粒包括基因编辑CRISPR/Cas9质粒、基因编辑CRISPR/Cas12a质粒、基因编辑CRISPR/Cas13质粒、基因编辑CRISPR/Cas14质粒。

优选的，步骤1)中当目标基因为EtA蛋白，所述含gRNA的的基因编辑质粒为pCRISPR::EtA质粒，所述含gRNA的的基因编辑质粒含核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的DNA片段。

优选的，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫。

本发明提供了所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在观察球虫不同发育阶段的转化、球虫与感染细胞互作或球虫药物评价中的应用。

本发明提供了所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在探究目标基因或所述目标基因编码的蛋白质的生物学功能中的应用。

本发明提供的表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，利用基因编辑技术和同源重组技术相结合敲入荧光蛋白mCherry基因和筛选基因，具体为在单链gRNA的引导作用下引导基因编辑质粒表达的核酸酶Cas9蛋白对与gRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂(DSB)，同时同源重组质粒利用同源重组机制(HR)修复DNA，使得荧光蛋白基因敲入基因组中，通过检测荧光信号得到表达外源荧光蛋白球虫。实验表明，本发明采用上述方法构建得到的虫株在荧光显微镜下观测稳定发红色荧光的球虫，并且荧光信号较强，可见该球虫为敲入mCherry基因的虫株，并且根据现有技术的报道目标A基因定位在卵囊壁内侧，本发明获得结果与报道的一致，说明该荧光报告基因能够准确定位目标基因的表达及蛋白分布。因此，本发明提供的构建方法为后续研究球虫提供一套标准方法，构建的表达荧光蛋白的球虫也为后续研究球虫不同发育阶段的转化、球虫与感染细胞互作、球虫药物评价以及靶基因的生物学功能提供了材料基础。

附图说明

图1为运用CRISPR-Cas9系统将mCherry敲入柔嫩艾美耳球虫的基因组的示意图；

图2为阳性基因敲入球虫的荧光显微图片，EtA基因后表达有mCherry的柔嫩艾美耳球虫的卵囊在荧光显微镜下观测到明亮的红色荧光(Brightfield和mCherry视野下两者的融合的光)。

具体实施方式

本发明提供了一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，包括以下步骤：

1)针对球虫的目的基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒；

2)构建含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒；

3)将所述含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒共同转染球虫的子孢子；

4)将转染后的子孢子感染动物，筛选，得到表达外源荧光蛋白球虫；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

本发明针对球虫的目的基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒。

本发明提供的构建方法对所述球虫的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的球虫即可，例如柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫。为了举例说明构建方法的具体实施步骤，本发明以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株为例进行说明，但不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明对所述柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的商品购买途径获得的所述虫株即可。

本发明对所述目的基因的种类不做具体限定，采用本领域所熟知或研究者感兴趣的基因均可。为了举例说明本发明构建方法的具体实施步骤，本发明以拟进行亚细胞定位的蛋白的编码基因EtA作为目标基因，确定sgRNA的敲入位置。本发明对所述gRNA的设计方法不做具体限定，采用本领域所熟知的gRNA的设计方法即可。所述基因编辑质粒优选包括基因编辑CRISPR/Cas9质粒、基因编辑CRISPR/Cas12a质粒、基因编辑CRISPR/Cas13质粒、基因编辑CRISPR/Cas14质粒。

在本发明中，所述构建含gRNA的基因编辑质粒的方法，优选包括以下步骤：

A.以CRISPR-EtA-F和CRISPR-R为引物，以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，利用Q5点突变试剂盒进行PCR反应，得到PCR产物；

B.将所述PCR产物进行KLD反应，将获得的KLD混合物转化Stbl3感受态细胞，鉴定阳性克隆，得到含gRNA的基因编辑质粒pSAG::Cas9-U6::sgUPRT::EtA。

本发明对所述pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的质粒即可。在本发明实施例中，所述pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒是在商品质粒(Addgene,catalog number:54467)的基础上添加了DHFR基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：26，其中包括DHFR-5'-UTR、DHFR CDS和DHFR-3'-UTR序列)，DHFR基因添加在Amp⁺基因和SAG5'UTR序列之间。CRISPR-EtA-F引物包含EtA靶点特异性的gRNA序列，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。CRISPR-R引物(GOI-gRNA-Rv)的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述PCR反应的反应程序为98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃2min。所述PCR反应的体系优选25μl。所述扩增使用的体系为25μl，见表1。

表1扩增体系

Q5 hot star high-Fidelity 2x Master Mix	12.5μL
		10μmol/L CRISPR-EtNMT-F引物	1.25μL
10μmol/L CRISPR-R引物	1.25μL
		pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒模板	1μL
Nuclease-free water	9μL

循环条件设定：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃2min，进行35个循环；72℃2min。

在本发明中，所述KLD反应的体系为10μl，具体见表2；所述KLD反应的条件包括：在25～30℃下反应5min。

表2KLD室温条件反应体系

PCR产物	1μL
		2×KLD反应缓冲液	5μL
10×KLD enzyme Mix	1μL
		Nuclease-free water	3μL

KLD酶混合物中含有混合的激酶、连接酶和DpnI酶，并且含有缓冲液，在此缓冲液中所有的酶均保持有活性。在此体系中可进行有效的磷酸化，分子内连接/环化，反应条件为室温环境中作用5min，以进行感受态细胞的转化。

随后取5μL KLD mixture到感受态细胞中，进行转化，采用CRISPR-EtA-F和CRISPR-R进行鉴定，并测序，获EtA特异的gRNA序列替换模板质粒的靶点序列，获得pCRISPR::EtA质粒。

当目标基因为EtA蛋白，构建的含gRNA的的基因编辑质粒为pSAG::Cas9-U6::sgUPRT::EtA质粒，所述含gRNA的的基因编辑质粒含核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的DNA片段。

在本发明中，所述同源重组质粒中外源插入片段优选为5'同源臂-目的基因CDS-筛选基因-mCherry-3'同源臂。所述5'同源臂和3'同源臂分别指目标基因的5'-同源臂的基因片段和3'-同源臂的基因片段。当目的基因为EtA基因时，5'-同源臂的基因片段-目标基因CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，3'-同源臂的基因片段SEQ ID NO：24。所述筛选基因优选为DHFR。所述DHFR-TS*为耐药基因：二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)的二氢叶酸还原酶(DHFR)是乙胺嘧啶的靶标位点。DHFR区突变和抗叶酸类药物的抗性有关。由于DHFR内包含2个氨基酸突变的DHFRm2m3-TS(在65位和113位氨基酸)处存在突变。65位(丝氨酸突变为精氨酸)，113位(酪氨酸突变为天冬氨酸)使得其具有高水平的乙胺嘧啶抗性，因此可作为多种转染载体的正选择标记。DHFR是指DHFR调控序列和开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。所述mCherry的开放阅读框序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：12。优选采用搭桥PCR方法扩增DHFR-mCherry片段。所述搭桥PCR方法优选以DHFR-5'-F(SEQ IDNO：7)为上游引物，以mChR2(SEQ ID NO：13)为下游引物，以扩增编码mCherry的开放阅读框序列的PCR产物和扩增DHFR上游调控序列和DHFR的开放阅读框序列的PCR产物作为模板，进行PCR扩增。采用搭桥PCR方法扩增DHFR-mCherry-3UTRDHFR片段。所述搭桥PCR方法扩增DHFR-mCherry-3UTRDHFR片段的方法优选包括以Dhfrmcherry homologue F(SEQ ID NO：19)为上游引物，以Dhfrmcherry homologue R(SEQ ID NO：20)为下游引物，以DHFR-mCherry片段PCR产物和DHFR下游调控序列的PCR产物为模板，获得含有同源臂的EtA-DHFR-mCherry-3UTRDHFR序列片段(SEQ ID NO：21)，其中3UTRDHFR序列优选为SEQ ID NO：17。将下游5'-同源臂的基因片段、含上游5'-同源臂的EtA-DHFR-mCherry-3UTRDHFR同源臂序列、下游3'-同源臂的基因片段和经BamH I和Hind III酶切后的pcDNA 3.1(+)载体序列通过ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit依次连接，获得成功的打靶DHFR抗性质粒pEtA::DHFR-mCherry(SEQ ID NO：25)。

得到含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒后，本发明将所述含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒共同转染球虫的子孢子。

在本发明中，所述含gRNA的基因编辑质粒为pCRISPR::EtA，发挥切割基因组的作用。含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒为pEtA:DHFR-mCherry，发挥将目标基因、DHFR-mCherry基因整合到基因组中。本发明对所述转染的方式不做具体限定，采用本领域所熟知的转染方式即可，例如电转染。所述转染时pCRISPR::EtA质粒和pEtA:DHFR-mCherry质粒的质量比优选为4～6:1，更优选为5:1。在本发明实施例中，所述电转染的参数优选如下：电压2000v，电容25μF、电容∞(无穷大)条件下进行电击2次。

转染后，本发明将转染后的子孢子感染动物，筛选，得到表达外源荧光蛋白球虫。

在本发明中，所述动物优选为鸡。所述感染优选通过泄殖腔感染3日龄雏鸡。当筛选基因为DHFR时，所述筛选用药物优选为乙胺嘧啶。所述筛选的方法优选将所述乙胺嘧啶拌入鸡饲料中。筛选后优选收集6～9天粪便，获得卵囊，将卵囊孢子化再次感染和筛选，如此重复2～3次，收集药物筛选3代的卵囊。将得到的卵囊进行荧光显微镜下观察，能够清楚稳定的观察到红色荧光，表明本发明成功构建得到表达荧光蛋白的球虫。

基于所述构建的球虫能稳定高强度的表达荧光蛋白，本发明提供了所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在观察球虫不同发育阶段的转化、球虫与感染细胞互作或球虫药物评价中的应用，同时本发明还提供了所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在探究目标基因或所述目标基因编码的蛋白质的生物学功能中的应用。本发明通过将外源荧光蛋白mCherry基因插入目标基因下游，表达出红色荧光，可以作为指示剂用于药物筛选，也为研究球虫的基因、蛋白质及其表达分泌提供了基础。

下面结合实施例对本发明提供的一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

含gRNA的基因编辑质粒pCRISPR::EtA质粒的构建方法

1.根据柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)基因序列(ETH_00017055)信息，设计gRNA，构建sgRNA载体，设计的引物为CRISPR-EtA-F(含EtA靶点特异性的gRNA序列)(SEQ ID NO：2)和CRISPR-R(GOI-gRNA-Rv)(SEQ ID NO：3)。

2.以CRISPR-EtA-F和CRISPR-R为引物，pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，利用Q5点突变试剂盒进行PCR反应，随后将PCR产物进行KLD反应，随后将KLD混合物转化Stbl3感受态细胞，随后鉴定阳性克隆，获pCRISPR::EtA质粒。

pCRISPR::EtA质粒的测序结果如SEQ ID NO：4所示，测序结果显示gRNA已整合到质粒中。测序的结果表明得到了合适的pCRISPR::EtA质粒。

实施例2

同源重组质粒的构建方法

1.扩增EtA基因下游5'-同源臂的基因片段

设计引物EtA 5'-ARM-F(SEQ ID NO：5，含有HindIII酶切位点)和EtA5'-ARM-R(SEQ ID NO：6)，以柔嫩艾美耳球虫广东株基因组的DNA为模板，扩增EtA基因5'-ARM序列作为下游同源臂序列。PCR产物经测序后，得到下游EtA 5'-ARM的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.扩增筛选基因和荧光基因

含有上游EtA 5'同源臂的EtA-DHFR-mCherry-3UTRDHFR序列片段的构建

(1)扩增DHFR上游调控序列和DHFR的开放阅读框序列：设计引物DHFR-5'-F(SEQID NO：7)和DHFR-R(SEQ ID NO：8)，并以此为上下游引物，以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，进行PCR扩增程序：98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min，获得PCR产物为包含开放阅读框和上游调控序列的DHFR序列(SEQ ID NO：9)。

(2)扩增编码mCherry的开放阅读框序列：以mCh-F(SEQ ID NO：10)为上游引物，以mCh-R(SEQ ID NO：11)为下游引物，以pCMV-N-mCherry质粒为模板进行PCR扩增程序为98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min，得到PCR产物为mCherry的开放阅读框序列(SEQ ID NO：12)。

(3)搭桥PCR扩增DHFR-mCherry片段：以DHFR-5'-F(SEQ ID NO：7)为上游引物，以mChR2(SEQ ID NO：13)为下游引物，以扩增编码mCherry的开放阅读框序列的PCR产物和扩增DHFR上游调控序列和DHFR的开放阅读框序列的PCR产物作为模板进行PCR扩增(98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min)，随后筛选阳性克隆，获得DHFR-mCherry片段(SEQ ID NO：14)。

(4)扩增DHFR下游调控序列：以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，以DHFR-3'UTR-F(SEQ ID NO：15)和DHFR-3'UTR-R(SEQ ID NO：16)为引物，PCR扩增(98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min)，得到DHFR下游调控序列(SEQ ID NO：17)。

(5)搭桥PCR扩增DHFR-mCherry-3UTRDHFR：以DHFR-5'-F(SEQ ID NO：7)为上游引物，以DHFR-3'UTR-R(SEQ ID NO：16)为引物，以DHFR-mCherry片段PCR产物和DHFR下游调控序列的PCR产物为模板进行搭桥PCR(扩增程序(98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min)，扩增得到DHFR-mCherry-3UTRDHFR片段(SEQ ID NO：18)。

(6)设计携带有上游EtA 5'同源臂(EtA 5'-ARM)的同源臂序列的DHFR-mCherry-3UTRDHFR序列片段：以Dhfrmcherry homologue F(SEQ ID NO：19)为上游引物，以Dhfrmcherry homologue R(SEQ ID NO：20)为下游引物，以DHFR-mCherry-3UTRDHFR序列的PCR产物为模板进行PCR扩增(98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min)，获得含有上游EtA 5'同源臂的EtA-DHFR-mCherry-3UTRDHFR序列片段(SEQ IDNO：21)，其中上游EtA 5'同源臂的作用是与下游5'-同源臂进行连接形成长片段。

3.扩增下游3'-同源臂的基因片段的方法

设计引物EtA 3'-ARM-F(SEQ ID NO：22)和EtA 3'-ARM-R(SEQ ID NO：23)(含有BamHI酶切位点)，并以此为引物，以广东株的基因组DNA为模板进行PCR扩增(98℃5min；98℃1min，55℃1min，72℃2min，进行35个循环；72℃5min)，获得下游3'-同源臂的基因片段(SEQ ID NO：24)。

实施例3

将实施例2得到的下游5'-同源臂的基因片段、含上游EtA 5'同源臂的EtA-DHFR-mCherry-3'UTRDHFR同源臂序列和下游3'-同源臂的基因片段进行连接，得到的含5'-同源臂-DHFR-mCherry-3'UTRDHFR同源臂序列-3'-同源臂的长片段和经BamHI和Hind III酶切后的pcDNA 3.1(+)载体序列通过ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit依次连接，获得成功的打靶DHFR抗性质粒pEtA::DHFR-mCherry(SEQ ID NO：25)。

采用CRISPR/Cas9介导在特异性位点整合来插入抗性筛选元件和荧光基因，采用EtA基因上游同源臂与抗性筛选元件和拟敲入的荧光基因和EtA基因下游同源臂连接来构建重组质粒，作为打靶质粒。pEtA:DHFR-mCherry和pCRISPR::EtA质粒共同转染打靶基因组，pCRISPR::EtA切割基因组，而将pEtA:DHFR-mCherry整合到基因组中。

实施例4

柔嫩艾美耳球虫广东株子孢子转染及阳性克隆的筛选

取1000万新鲜提取的具有活力的柔嫩艾美耳球虫广东株子孢子悬浮液加入到电转杯中，用电击缓冲液cytomix重悬虫体，在电击缓冲液中加入pEtA:DHFR-mCherry(1μg)和pCRISPR::EtA质粒(5μg)，定容至800μL,充分混匀，将电转杯置于Bio-Rad电穿孔仪中，按电压2000v，电容25μF、电容∞条件下进行电击2次，电转染后将子孢子进行泄殖腔感染3日龄雏鸡，在日粮或饮水中添加乙胺嘧啶，收集6～9天粪便，获卵囊，将卵囊孢子化，随后将柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊进行再次接种雏鸡，在饮水或饲料中加入乙胺嘧啶，重复收集6～9天的粪便，获得的卵囊再进行乙胺嘧啶药物筛选3代，得到筛选后的卵囊。

实施例5

敲入mCherry的球虫虫株的鉴定

在荧光显微镜下在610nm下观测到发红色荧光的球虫即为敲入mCherry基因的虫株，先前针对另一种物种的A基因定位在卵囊壁内侧，本发明获得结果与报道的一致。结果表明，柔嫩艾美耳球虫广东株中成功敲入mCherry基因，获得成功敲入虫株。

本发明首次采用基因组编辑技术和同源重组技术相结合的方法将外源mCherry基因敲入到球虫基因组中，构建的球虫在荧光显微镜下清楚稳定观察红色荧光，说明本发明提供的构建方法不仅能成功构建表达有外源荧光蛋白球虫而且荧光蛋白表达稳定且效率高，适用于球虫的生长、基因工程方面的研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagcgttta aacttaagct ttacgcctct gaaatactaa gcactgactt atttttgttt 60

gcaattagga tcttagtaag cgccatctag gactgcagtc gctagctccc ccatgtcagc 120

ctgaagataa ctttacctga ccagtaagag ttgctgaaaa gcagcttcaa gtacttggtg 180

cttttgtttc gcttcgtaat gactcctgag ttttgcactg agaacgtgct tataggtcag 240

ctccaaatgc aactgacgag aacccaaggg aaacgagcgc aagcaacagt gcagcagagg 300

ggaaaactgc tgaggcaaac tagaaatact tgataatggg ataattcaac aattattggg 360

caaacacaaa gagggtcgga ccccactgag caagctggac gacgcataag tgttcggcgt 420

caaagacttc agacaccgag gctgccttga ctgggaagca ctgtcacgga cagcgattcg 480

tagtggccta cacagaacaa ctcaatacat aagtcctaca taagtcctac ttttcatctg 540

gtaaaggact gtaaatgtgg aaaaggcacc atcctctccc tttgtaaatc cgcagccctt 600

agcaggaagc cttggctcac cacaatgctt cttctcctcc tcatcttgag cttggcgcca 660

cagacattgg aatgttcagg ccagggtacc tcgaaagtag agacagtgtg ctcttctggg 720

ggttcagggt gtacagacag actaattgtt gagcttgatg tggacaacct ggatgtacgg 780

ctgagcagct ccctgaatcg tcaccgattc cagaatcatc ataggcataa aacccctaaa 840

aacatcggta gagtatacag tgggaggctc atctgccgct tcatacaaac agccctgcct 900

gctccgcact tatatccccg taatcaccag cggtactttg tcgctgccct gctgttctcg 960

gggttttctc agaaacttca gtttcagtgg gaagcagggg atattaacaa tcggtccccc 1020

agaaaaagcg atgcaggcaa tgccggagtt gttgtaactg tacaaaaaac cgctgtatct 1080

tactcgtaca atcttactta tgtcaaggta gacttcatgc tttaacgcgt agttcctg 1138

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacaatctt acttatgtca gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacttgacat ccccatttac 20

<210> 4

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgatcgat acctcactaa gggaacaaaa gctggagctc aaaaaagcac cgactcggtg 60

ccacttttca agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatttct agctctaaaa 120

ctgacataag taagattgta caacttgaca tccccattta ccagaaggca aacaccccct 180

tcggggacga ggtgaccctg cgcgacagaa agccccttcg aagagcgcac agggaggaag 240

caggcctctg caggtcgcca tttgaaaatc tgacagaact gatggaaata tgattcttgt 300

cagagaagac attcgagagt tcgaaggttt cccccttggc tctacatatc ccagtgtctc 360

gcgttctgca ggaggcgcgt caggcctagg atgcaatatt ggcgcccaat tcacagtgca 420

gcggcgcagc cgtcgcaaca cttcgcagcg tgaaagactt atcgctctcc gcctctcgat 480

ggttcgggat gttcgcttcg agtgtatgct gcgcaagctt tcgcgcttgg gtacgttaat 540

ttgaaatctt tcgcgtttcc cgtgtgtcct cagtgtctcc aacatgtggc cgcggtgcaa 600

tcgtccccac gacgaaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc 660

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 720

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 780

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 840

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagt 888

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagcgttta aacttaagct ttacgcctct gaaatactaa gcactg 46

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggaactac gcgttaaagc atgaagtcta ccttgacata a 41

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcgtagttc ctgtgtgtca ttcgttgtcg 30

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcccttgctc accatcaaga cagccatctc catctggat 39

<210> 9

<211> 2672

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcgtagttc ctgtgtgtca ttcgttgtcg agacaactct gtcccgcccc ggtgctgttc 60

catatgcgtg actttcccgc aattttttca gactttcagg aaagacaggc tccggaacga 120

tctcgtccat gactggtaaa tccacgacac cgcaatggcc cgcagcacct ctatctctcg 180

tgccagggga ctaacgttgt atgcgtctgc gtcttgtctt tttgcattcg ctttccaaaa 240

aagagagcca tccgttcccc cgcacattca acgccgcgag tgcggttttt gtcttttttg 300

agtggtagga cgcttttcat gcgcgaacta cgtggacatt aagttccatt ctctttttcg 360

acagcacgaa accttgcatt caaacccgcc cgcggaagat ccgatcttgc tgctgttcgc 420

agtcccagta gcgtcctgtc ggccgcgccg tctctgttgg tgggcagccg ctacacctgt 480

tatctgactg ccgtgcgcga aaatgacgcc atttttggga aaatcgggga acttcattct 540

ttaaaagtat gcggaggttt cctttttctt ctgttcgttt ctttttctcg ggtttgataa 600

ccgtgttcga tgtaagcact ttccgtctct cctccgtgct ttgttcgaca tcgagaccag 660

gtgtgcagat ccttcgcttg tcgatccgga gacgcgtgtc tcgtagaacc ttttcatttt 720

accacacggc agtgcggagc actgctctga gtgcagcagg gacgggtgaa gtttcgcttt 780

agtagtgcgt ttctgctcta cggggcgttg tcgtgtctgg gaagatgcag aaaccggtgt 840

gtctggtcgt cgcgatgacc cccaagaggg gcatcggcat caacaacggc ctcccgtggc 900

cccacttgac cacagatttc aaacactttc gtcgtgtgac aaaaacgacg cccgaagaag 960

ccagtcgcct gaacgggtgg cttcccagga aatttgcaaa gacgggcgac tctggacttc 1020

cctctccatc agtcggcaag agattcaacg ccgttgtcat gggacggaaa aactgggaaa 1080

gcatgcctcg aaagtttaga cccctcgtgg acagattgaa catcgtcgtt tcctcttccc 1140

tcaaagaaga agacattgcg gcggagaagc ctcaagctga aggccagcag cgcgtccgag 1200

tctgtgcttc actcccagca gctctcagcc ttctggagga agagtacaag gattctgtcg 1260

accagatttt tgtcgtggga ggagcgggac tgtacgaggc agcgctgtct ctgggcgttg 1320

cctctcacct gtacatcacg cgtgtagccc gcgagtttcc gtgcgacgtt ttcttccctg 1380

cgttccccgg agatgacatt ctttcaaaca aatcaactgc tgcgcaggct gcagctcctg 1440

ccgagtctgt gttcgttccc ttttgtccgg agctcggaag agagaaggac aatgaagcga 1500

cgtatcgacc catcttcatt tccaagacct tctcagacaa cggggtaccc tacgactttg 1560

tggttctcga gaagagaagg aagactgacg acgcagccac tgcggaaccg agcaacgcaa 1620

tgagctcctt gacgtccacg agggagacaa ctcccgtgca cgggttgcag gctccttctt 1680

cggccgcagc cattgccccg gtgttggcgt ggatggacga agaagaccgg aaaaaacgcg 1740

agcaaaagga actgattcgg gccgttccgc atgttcactt tagaggccat gaagaattcc 1800

agtaccttga tctcattgcc gacattatta acaatggaag gacaatggat gaccgaacgg 1860

gcgttggtgt catctccaaa ttcggctgca ctatgcgcta ctcgctggat caggcctttc 1920

cacttctcac cacaaagcgt gtgttctgga aaggggtcct cgaagagttg ctgtggttca 1980

ttcgcggcga cacgaacgca aaccatcttt ctgagaaggg cgtgaagatc tgggacaaga 2040

atgtgacacg cgagttcctc gattcgcgca atctccccca ccgagaggtc ggagacatcg 2100

gcccgggcta cggcttccag tggagacact tcggcgcggc atacaaagac atgcacacag 2160

actacacagg gcagggcgtc gaccagctga agaatgtgat ccagatgctg agaacgaatc 2220

caacagatcg tcgcatgctc atgactgcct ggaatcctgc agcgctggac gaaatggcgc 2280

tgccgccttg tcacttgttg tgccagttct acgtgaacga ccagaaggag ctgtcgtgca 2340

tcatgtatca gcggtcgtgc gatgtcggcc tcggcgtccc cttcaacatc gcttcctatt 2400

cgcttttgac gctcatggtt gcacacgtct gcaacctaaa acctaaggag ttcattcact 2460

tcatggggaa cacgcatgtc tacacgaacc atgtcgaggc tttaaaagag cagctgcgga 2520

gagaaccgag accgttcccc attgtgaaca tcctcaacaa ggaacgcatc aaggaaatcg 2580

acgatttcac cgccgaggat tttgaggtcg tgggctacgt cccgcacgga cgaatccaga 2640

tggagatggc tgtcttgatg gtgagcaagg gc 2672

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atccagatgg agatggctgt cttgatggtg agcaagggc 39

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttacttgtac agctcgtcca tgccgccggt ggag 34

<210> 12

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccagatgg agatggctgt cttgatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc 60

atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc 120

gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag 180

gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac 240

ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc 300

cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg 360

acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc 420

aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctcctcc 480

gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg 540

aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg 600

cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac 660

tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac 720

gagctgtaca agtaa 735

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagacgggca gcttctgtat ttccgttact tgtacagctc gtccat 46

<210> 14

<211> 3392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcgtagttc ctgtgtgtca ttcgttgtcg agacaactct gtcccgcccc ggtgctgttc 60

catatgcgtg actttcccgc aattttttca gactttcagg aaagacaggc tccggaacga 120

tctcgtccat gactggtaaa tccacgacac cgcaatggcc cgcagcacct ctatctctcg 180

tgccagggga ctaacgttgt atgcgtctgc gtcttgtctt tttgcattcg ctttccaaaa 240

aagagagcca tccgttcccc cgcacattca acgccgcgag tgcggttttt gtcttttttg 300

agtggtagga cgcttttcat gcgcgaacta cgtggacatt aagttccatt ctctttttcg 360

acagcacgaa accttgcatt caaacccgcc cgcggaagat ccgatcttgc tgctgttcgc 420

agtcccagta gcgtcctgtc ggccgcgccg tctctgttgg tgggcagccg ctacacctgt 480

tatctgactg ccgtgcgcga aaatgacgcc atttttggga aaatcgggga acttcattct 540

ttaaaagtat gcggaggttt cctttttctt ctgttcgttt ctttttctcg ggtttgataa 600

ccgtgttcga tgtaagcact ttccgtctct cctccgtgct ttgttcgaca tcgagaccag 660

gtgtgcagat ccttcgcttg tcgatccgga gacgcgtgtc tcgtagaacc ttttcatttt 720

accacacggc agtgcggagc actgctctga gtgcagcagg gacgggtgaa gtttcgcttt 780

agtagtgcgt ttctgctcta cggggcgttg tcgtgtctgg gaagatgcag aaaccggtgt 840

gtctggtcgt cgcgatgacc cccaagaggg gcatcggcat caacaacggc ctcccgtggc 900

cccacttgac cacagatttc aaacactttc gtcgtgtgac aaaaacgacg cccgaagaag 960

ccagtcgcct gaacgggtgg cttcccagga aatttgcaaa gacgggcgac tctggacttc 1020

cctctccatc agtcggcaag agattcaacg ccgttgtcat gggacggaaa aactgggaaa 1080

gcatgcctcg aaagtttaga cccctcgtgg acagattgaa catcgtcgtt tcctcttccc 1140

tcaaagaaga agacattgcg gcggagaagc ctcaagctga aggccagcag cgcgtccgag 1200

tctgtgcttc actcccagca gctctcagcc ttctggagga agagtacaag gattctgtcg 1260

accagatttt tgtcgtggga ggagcgggac tgtacgaggc agcgctgtct ctgggcgttg 1320

cctctcacct gtacatcacg cgtgtagccc gcgagtttcc gtgcgacgtt ttcttccctg 1380

cgttccccgg agatgacatt ctttcaaaca aatcaactgc tgcgcaggct gcagctcctg 1440

ccgagtctgt gttcgttccc ttttgtccgg agctcggaag agagaaggac aatgaagcga 1500

cgtatcgacc catcttcatt tccaagacct tctcagacaa cggggtaccc tacgactttg 1560

tggttctcga gaagagaagg aagactgacg acgcagccac tgcggaaccg agcaacgcaa 1620

tgagctcctt gacgtccacg agggagacaa ctcccgtgca cgggttgcag gctccttctt 1680

cggccgcagc cattgccccg gtgttggcgt ggatggacga agaagaccgg aaaaaacgcg 1740

agcaaaagga actgattcgg gccgttccgc atgttcactt tagaggccat gaagaattcc 1800

agtaccttga tctcattgcc gacattatta acaatggaag gacaatggat gaccgaacgg 1860

gcgttggtgt catctccaaa ttcggctgca ctatgcgcta ctcgctggat caggcctttc 1920

cacttctcac cacaaagcgt gtgttctgga aaggggtcct cgaagagttg ctgtggttca 1980

ttcgcggcga cacgaacgca aaccatcttt ctgagaaggg cgtgaagatc tgggacaaga 2040

atgtgacacg cgagttcctc gattcgcgca atctccccca ccgagaggtc ggagacatcg 2100

gcccgggcta cggcttccag tggagacact tcggcgcggc atacaaagac atgcacacag 2160

actacacagg gcagggcgtc gaccagctga agaatgtgat ccagatgctg agaacgaatc 2220

caacagatcg tcgcatgctc atgactgcct ggaatcctgc agcgctggac gaaatggcgc 2280

tgccgccttg tcacttgttg tgccagttct acgtgaacga ccagaaggag ctgtcgtgca 2340

tcatgtatca gcggtcgtgc gatgtcggcc tcggcgtccc cttcaacatc gcttcctatt 2400

cgcttttgac gctcatggtt gcacacgtct gcaacctaaa acctaaggag ttcattcact 2460

tcatggggaa cacgcatgtc tacacgaacc atgtcgaggc tttaaaagag cagctgcgga 2520

gagaaccgag accgttcccc attgtgaaca tcctcaacaa ggaacgcatc aaggaaatcg 2580

acgatttcac cgccgaggat tttgaggtcg tgggctacgt cccgcacgga cgaatccaga 2640

tggagatggc tgtcttgatg gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg 2700

agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg 2760

agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca 2820

agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca 2880

aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg 2940

gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg 3000

actcctccct gcaggacggc gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc 3060

cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga 3120

tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg 3180

gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc 3240

ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca 3300

tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt 3360

acaagtaacg gaaatacaga agctgcccgt ct 3392

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggacgagc tgtacaagta acggaaatac agaagctgcc cgtctc 46

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaattccat cctgcaagtg catagaag 28

<210> 17

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggacgagc tgtacaagta acggaaatac agaagctgcc cgtctctcgt tttcctctct 60

tttcggaggg atcagggaga gtgcctcggg tcggagagag ctgacgaggg ggtgccagag 120

acccctgtgt cctttatcga agaaaaggga tgactcttca tgtggcattt cacacagtct 180

cacctcgcct tgttttcttt ttgtcaatca gaacgaaagc gagttgcggg tgacgcagat 240

gtgcgtgtat ccactcgtga atgcgttatc gttctgtatg ccgctagagt gctggactgt 300

tgctgtctgc ccacgacagc agacaacttt ccttctatgc acttgcagga tggaattcc 359

<210> 18

<211> 3706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgcgtagttc ctgtgtgtca ttcgttgtcg agacaactct gtcccgcccc ggtgctgttc 60

catatgcgtg actttcccgc aattttttca gactttcagg aaagacaggc tccggaacga 120

tctcgtccat gactggtaaa tccacgacac cgcaatggcc cgcagcacct ctatctctcg 180

tgccagggga ctaacgttgt atgcgtctgc gtcttgtctt tttgcattcg ctttccaaaa 240

aagagagcca tccgttcccc cgcacattca acgccgcgag tgcggttttt gtcttttttg 300

agtggtagga cgcttttcat gcgcgaacta cgtggacatt aagttccatt ctctttttcg 360

acagcacgaa accttgcatt caaacccgcc cgcggaagat ccgatcttgc tgctgttcgc 420

agtcccagta gcgtcctgtc ggccgcgccg tctctgttgg tgggcagccg ctacacctgt 480

tatctgactg ccgtgcgcga aaatgacgcc atttttggga aaatcgggga acttcattct 540

ttaaaagtat gcggaggttt cctttttctt ctgttcgttt ctttttctcg ggtttgataa 600

ccgtgttcga tgtaagcact ttccgtctct cctccgtgct ttgttcgaca tcgagaccag 660

gtgtgcagat ccttcgcttg tcgatccgga gacgcgtgtc tcgtagaacc ttttcatttt 720

accacacggc agtgcggagc actgctctga gtgcagcagg gacgggtgaa gtttcgcttt 780

agtagtgcgt ttctgctcta cggggcgttg tcgtgtctgg gaagatgcag aaaccggtgt 840

gtctggtcgt cgcgatgacc cccaagaggg gcatcggcat caacaacggc ctcccgtggc 900

cccacttgac cacagatttc aaacactttc gtcgtgtgac aaaaacgacg cccgaagaag 960

ccagtcgcct gaacgggtgg cttcccagga aatttgcaaa gacgggcgac tctggacttc 1020

cctctccatc agtcggcaag agattcaacg ccgttgtcat gggacggaaa aactgggaaa 1080

gcatgcctcg aaagtttaga cccctcgtgg acagattgaa catcgtcgtt tcctcttccc 1140

tcaaagaaga agacattgcg gcggagaagc ctcaagctga aggccagcag cgcgtccgag 1200

tctgtgcttc actcccagca gctctcagcc ttctggagga agagtacaag gattctgtcg 1260

accagatttt tgtcgtggga ggagcgggac tgtacgaggc agcgctgtct ctgggcgttg 1320

cctctcacct gtacatcacg cgtgtagccc gcgagtttcc gtgcgacgtt ttcttccctg 1380

cgttccccgg agatgacatt ctttcaaaca aatcaactgc tgcgcaggct gcagctcctg 1440

ccgagtctgt gttcgttccc ttttgtccgg agctcggaag agagaaggac aatgaagcga 1500

cgtatcgacc catcttcatt tccaagacct tctcagacaa cggggtaccc tacgactttg 1560

tggttctcga gaagagaagg aagactgacg acgcagccac tgcggaaccg agcaacgcaa 1620

tgagctcctt gacgtccacg agggagacaa ctcccgtgca cgggttgcag gctccttctt 1680

cggccgcagc cattgccccg gtgttggcgt ggatggacga agaagaccgg aaaaaacgcg 1740

agcaaaagga actgattcgg gccgttccgc atgttcactt tagaggccat gaagaattcc 1800

agtaccttga tctcattgcc gacattatta acaatggaag gacaatggat gaccgaacgg 1860

gcgttggtgt catctccaaa ttcggctgca ctatgcgcta ctcgctggat caggcctttc 1920

cacttctcac cacaaagcgt gtgttctgga aaggggtcct cgaagagttg ctgtggttca 1980

ttcgcggcga cacgaacgca aaccatcttt ctgagaaggg cgtgaagatc tgggacaaga 2040

atgtgacacg cgagttcctc gattcgcgca atctccccca ccgagaggtc ggagacatcg 2100

gcccgggcta cggcttccag tggagacact tcggcgcggc atacaaagac atgcacacag 2160

actacacagg gcagggcgtc gaccagctga agaatgtgat ccagatgctg agaacgaatc 2220

caacagatcg tcgcatgctc atgactgcct ggaatcctgc agcgctggac gaaatggcgc 2280

tgccgccttg tcacttgttg tgccagttct acgtgaacga ccagaaggag ctgtcgtgca 2340

tcatgtatca gcggtcgtgc gatgtcggcc tcggcgtccc cttcaacatc gcttcctatt 2400

cgcttttgac gctcatggtt gcacacgtct gcaacctaaa acctaaggag ttcattcact 2460

tcatggggaa cacgcatgtc tacacgaacc atgtcgaggc tttaaaagag cagctgcgga 2520

gagaaccgag accgttcccc attgtgaaca tcctcaacaa ggaacgcatc aaggaaatcg 2580

acgatttcac cgccgaggat tttgaggtcg tgggctacgt cccgcacgga cgaatccaga 2640

tggagatggc tgtcttgatg gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg 2700

agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg 2760

agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca 2820

agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca 2880

aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg 2940

gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg 3000

actcctccct gcaggacggc gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc 3060

cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga 3120

tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg 3180

gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc 3240

ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca 3300

tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt 3360

acaagtaacg gaaatacaga agctgcccgt ctctcgtttt cctctctttt cggagggatc 3420

agggagagtg cctcgggtcg gagagagctg acgagggggt gccagagacc cctgtgtcct 3480

ttatcgaaga aaagggatga ctcttcatgt ggcatttcac acagtctcac ctcgccttgt 3540

tttctttttg tcaatcagaa cgaaagcgag ttgcgggtga cgcagatgtg cgtgtatcca 3600

ctcgtgaatg cgttatcgtt ctgtatgccg ctagagtgct ggactgttgc tgtctgccca 3660

cgacagcaga caactttcct tctatgcact tgcaggatgg aattcc 3706

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctttaacgc gtagttcctg tgtgtcatt 29

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtgggatcg gaattccatc ctgcaagtgc 30

<210> 21

<211> 3713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctttaacgc gtagttcctg tgtgtcattc gttgtcgaga caactctgtc ccgccccggt 60

gctgttccat atgcgtgact ttcccgcaat tttttcagac tttcaggaaa gacaggctcc 120

ggaacgatct cgtccatgac tggtaaatcc acgacaccgc aatggcccgc agcacctcta 180

tctctcgtgc caggggacta acgttgtatg cgtctgcgtc ttgtcttttt gcattcgctt 240

tccaaaaaag agagccatcc gttcccccgc acattcaacg ccgcgagtgc ggtttttgtc 300

ttttttgagt ggtaggacgc ttttcatgcg cgaactacgt ggacattaag ttccattctc 360

tttttcgaca gcacgaaacc ttgcattcaa acccgcccgc ggaagatccg atcttgctgc 420

tgttcgcagt cccagtagcg tcctgtcggc cgcgccgtct ctgttggtgg gcagccgcta 480

cacctgttat ctgactgccg tgcgcgaaaa tgacgccatt tttgggaaaa tcggggaact 540

tcattcttta aaagtatgcg gaggtttcct ttttcttctg ttcgtttctt tttctcgggt 600

ttgataaccg tgttcgatgt aagcactttc cgtctctcct ccgtgctttg ttcgacatcg 660

agaccaggtg tgcagatcct tcgcttgtcg atccggagac gcgtgtctcg tagaaccttt 720

tcattttacc acacggcagt gcggagcact gctctgagtg cagcagggac gggtgaagtt 780

tcgctttagt agtgcgtttc tgctctacgg ggcgttgtcg tgtctgggaa gatgcagaaa 840

ccggtgtgtc tggtcgtcgc gatgaccccc aagaggggca tcggcatcaa caacggcctc 900

ccgtggcccc acttgaccac agatttcaaa cactttcgtc gtgtgacaaa aacgacgccc 960

gaagaagcca gtcgcctgaa cgggtggctt cccaggaaat ttgcaaagac gggcgactct 1020

ggacttccct ctccatcagt cggcaagaga ttcaacgccg ttgtcatggg acggaaaaac 1080

tgggaaagca tgcctcgaaa gtttagaccc ctcgtggaca gattgaacat cgtcgtttcc 1140

tcttccctca aagaagaaga cattgcggcg gagaagcctc aagctgaagg ccagcagcgc 1200

gtccgagtct gtgcttcact cccagcagct ctcagccttc tggaggaaga gtacaaggat 1260

tctgtcgacc agatttttgt cgtgggagga gcgggactgt acgaggcagc gctgtctctg 1320

ggcgttgcct ctcacctgta catcacgcgt gtagcccgcg agtttccgtg cgacgttttc 1380

ttccctgcgt tccccggaga tgacattctt tcaaacaaat caactgctgc gcaggctgca 1440

gctcctgccg agtctgtgtt cgttcccttt tgtccggagc tcggaagaga gaaggacaat 1500

gaagcgacgt atcgacccat cttcatttcc aagaccttct cagacaacgg ggtaccctac 1560

gactttgtgg ttctcgagaa gagaaggaag actgacgacg cagccactgc ggaaccgagc 1620

aacgcaatga gctccttgac gtccacgagg gagacaactc ccgtgcacgg gttgcaggct 1680

ccttcttcgg ccgcagccat tgccccggtg ttggcgtgga tggacgaaga agaccggaaa 1740

aaacgcgagc aaaaggaact gattcgggcc gttccgcatg ttcactttag aggccatgaa 1800

gaattccagt accttgatct cattgccgac attattaaca atggaaggac aatggatgac 1860

cgaacgggcg ttggtgtcat ctccaaattc ggctgcacta tgcgctactc gctggatcag 1920

gcctttccac ttctcaccac aaagcgtgtg ttctggaaag gggtcctcga agagttgctg 1980

tggttcattc gcggcgacac gaacgcaaac catctttctg agaagggcgt gaagatctgg 2040

gacaagaatg tgacacgcga gttcctcgat tcgcgcaatc tcccccaccg agaggtcgga 2100

gacatcggcc cgggctacgg cttccagtgg agacacttcg gcgcggcata caaagacatg 2160

cacacagact acacagggca gggcgtcgac cagctgaaga atgtgatcca gatgctgaga 2220

acgaatccaa cagatcgtcg catgctcatg actgcctgga atcctgcagc gctggacgaa 2280

atggcgctgc cgccttgtca cttgttgtgc cagttctacg tgaacgacca gaaggagctg 2340

tcgtgcatca tgtatcagcg gtcgtgcgat gtcggcctcg gcgtcccctt caacatcgct 2400

tcctattcgc ttttgacgct catggttgca cacgtctgca acctaaaacc taaggagttc 2460

attcacttca tggggaacac gcatgtctac acgaaccatg tcgaggcttt aaaagagcag 2520

ctgcggagag aaccgagacc gttccccatt gtgaacatcc tcaacaagga acgcatcaag 2580

gaaatcgacg atttcaccgc cgaggatttt gaggtcgtgg gctacgtccc gcacggacga 2640

atccagatgg agatggctgt cttgatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc 2700

atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc 2760

gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag 2820

gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac 2880

ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc 2940

cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg 3000

acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc 3060

aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctcctcc 3120

gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg 3180

aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg 3240

cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac 3300

tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac 3360

gagctgtaca agtaacggaa atacagaagc tgcccgtctc tcgttttcct ctcttttcgg 3420

agggatcagg gagagtgcct cgggtcggag agagctgacg agggggtgcc agagacccct 3480

gtgtccttta tcgaagaaaa gggatgactc ttcatgtggc atttcacaca gtctcacctc 3540

gccttgtttt ctttttgtca atcagaacga aagcgagttg cgggtgacgc agatgtgcgt 3600

gtatccactc gtgaatgcgt tatcgttctg tatgccgcta gagtgctgga ctgttgctgt 3660

ctgcccacga cagcagacaa ctttccttct atgcacttgc aggatggaat tcc 3713

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatggaattc cgatcccaca agatttttga attaatg 37

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccacactgga ctagtggatc cgggtggccc tgcgcatgc 39

<210> 24

<211> 1067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gatggaattc cgatcccaca agatttttga attaatgtat taacccaaga atgtgcttgg 60

gattgaccag tcacggcgag ttttgggctt ctgaatagag cgaagcattt gcttcttggt 120

ccaacttacg agtcatttgt gctgaataaa cacatgtgcg ccaatcatta caaaattcct 180

tgtaggagat gctcacacgg gcaatcttcc tgctgagagt taatgaggcg tgtctgcctt 240

gtgaactctc aggcagtgcc attcaactgg atagagtacg cccatcgtgc tctactatgg 300

caggtcaaag atggtgggga aaacttctgt tcgcagacat ggggttccaa gtgccaggat 360

gagcatgggg aaaatggata tcccattagt cctaatacgg gtcttcctgt cgatggagct 420

caggggaaat gttgctggtg tccttccgtc tggcatctct ggctaaacaa ccctaatagg 480

ggcagggagc cgatgctaaa gtgcaacttt tggggtaggc cagtgcggtg gtgaggatac 540

acgtaggcat gtgagtgctt gaaaggggaa gaggtataat ttcgtctgct catttattgt 600

agtggtgatg agcttggtta gacgagcctg gttagtggct gggtatgagg ctcgatacgt 660

ggaactttta aatttgcact gcaccgcacc agcacttcgt gacatagcgg tatctatggc 720

actgccctgt tggtgcaggt aaataacgtt attttgttct gtactgtgag ccttttccta 780

ggattacgat ttggaaaaat ccccgatccc tacctgacga aattttgccc cgttgttgaa 840

tatccgtggt atcgtatgct gaaagtcagc gaaaatagaa catggttctt taagattctc 900

gtcggaatat cttggtggag taagtttatc ccattttcca actgggcatg cctcagtgga 960

tttacccacg cgcctgcagt cggtagaata aacgctagtt gaaacttaaa gagcttggtt 1020

catccactgc atgcgcaggg ccacccggat ccactagtcc agtgtgg 1067

<210> 25

<211> 6045

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggtgggaat aatagagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc 60

gaaattaata cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cttaagcttt 120

acgcctctga aatactaagc actgacttat ttttgtttgc aattaggatc ttagtaagcg 180

ccatctagga ctgcagtcgc tagctccccc atgtcagcct gaagataact ttacctgacc 240

agtaagagtt gctgaaaagc agcttcaagt acttggtgct tttgtttcgc ttcgtaatga 300

ctcctgagtt ttgcactgag aacgtgctta taggtcagct ccaaatgcaa ctgacgagaa 360

cccaagggaa acgagcgcaa gcaacagtgc agcagagggg aaaactgctg aggcaaacta 420

gaaatacttg ataatgggat aattcaacaa ttattgggca aacacaaaga gggtcggacc 480

ccactgagca agctggacga cgcataagtg ttcggcgtca aagacttcag acaccgaggc 540

tgccttgact gggaagcact gtcacggaca gcgattcgta gtggcctaca cagaacaact 600

caatacataa gtcctacata agtcctactt ttcatctggt aaaggactgt aaatgtggaa 660

aaggcaccat cctctccctt tgtaaatccg cagcccttag caggaagcct tggctcacca 720

caatgcttct tctcctcctc atcttgagct tggcgccaca gacattggaa tgttcaggcc 780

agggtacctc gaaagtagag acagtgtgct cttctggggg ttcagggtgt acagacagac 840

taattgttga gcttgatgtg gacaacctgg atgtacggct gagcagctcc ctgaatcgtc 900

accgattcca gaatcatcat aggcataaaa cccctaaaaa catcggtaga gtatacagtg 960

ggaggctcat ctgccgcttc atacaaacag ccctgcctgc tccgcactta tatccccgta 1020

atcaccagcg gtactttgtc gctgccctgc tgttctcggg gttttctcag aaacttcagt 1080

ttcagtggga agcaggggat attaacaatc ggtcccccag aaaaagcgat gcaggcaatg 1140

ccggagttgt tgtaactgta caaaaaaccg ctgtatctta ctcgtacaat cttacttatg 1200

tcaaggtaga cttcatgctt taacgcgtag ttcctgtgtg tcattcgttg tcgagacaac 1260

tctgtcccgc cccggtgctg ttccatatgc gtgactttcc cgcaattttt tcagactttc 1320

aggaaagaca ggctccggaa cgatctcgtc catgactggt aaatccacga caccgcaatg 1380

gcccgcagca cctctatctc tcgtgccagg ggactaacgt tgtatgcgtc tgcgtcttgt 1440

ctttttgcat tcgctttcca aaaaagagag ccatccgttc ccccgcacat tcaacgccgc 1500

gagtgcggtt tttgtctttt ttgagtggta ggacgctttt catgcgcgaa ctacgtggac 1560

attaagttcc attctctttt tcgacagcac gaaaccttgc attcaaaccc gcccgcggaa 1620

gatccgatct tgctgctgtt cgcagtccca gtagcgtcct gtcggccgcg ccgtctctgt 1680

tggtgggcag ccgctacacc tgttatctga ctgccgtgcg cgaaaatgac gccatttttg 1740

ggaaaatcgg ggaacttcat tctttaaaag tatgcggagg tttccttttt cttctgttcg 1800

tttctttttc tcgggtttga taaccgtgtt cgatgtaagc actttccgtc tctcctccgt 1860

gctttgttcg acatcgagac caggtgtgca gatccttcgc ttgtcgatcc ggagacgcgt 1920

gtctcgtaga accttttcat tttaccacac ggcagtgcgg agcactgctc tgagtgcagc 1980

agggacgggt gaagtttcgc tttagtagtg cgtttctgct ctacggggcg ttgtcgtgtc 2040

tgggaagatg cagaaaccgg tgtgtctggt cgtcgcgatg acccccaaga ggggcatcgg 2100

catcaacaac ggcctcccgt ggccccactt gaccacagat ttcaaacact ttcgtcgtgt 2160

gacaaaaacg acgcccgaag aagccagtcg cctgaacggg tggcttccca ggaaatttgc 2220

aaagacgggc gactctggac ttccctctcc atcagtcggc aagagattca acgccgttgt 2280

catgggacgg aaaaactggg aaagcatgcc tcgaaagttt agacccctcg tggacagatt 2340

gaacatcgtc gtttcctctt ccctcaaaga agaagacatt gcggcggaga agcctcaagc 2400

tgaaggccag cagcgcgtcc gagtctgtgc ttcactccca gcagctctca gccttctgga 2460

ggaagagtac aaggattctg tcgaccagat ttttgtcgtg ggaggagcgg gactgtacga 2520

ggcagcgctg tctctgggcg ttgcctctca cctgtacatc acgcgtgtag cccgcgagtt 2580

tccgtgcgac gttttcttcc ctgcgttccc cggagatgac attctttcaa acaaatcaac 2640

tgctgcgcag gctgcagctc ctgccgagtc tgtgttcgtt cccttttgtc cggagctcgg 2700

aagagagaag gacaatgaag cgacgtatcg acccatcttc atttccaaga ccttctcaga 2760

caacggggta ccctacgact ttgtggttct cgagaagaga aggaagactg acgacgcagc 2820

cactgcggaa ccgagcaacg caatgagctc cttgacgtcc acgagggaga caactcccgt 2880

gcacgggttg caggctcctt cttcggccgc agccattgcc ccggtgttgg cgtggatgga 2940

cgaagaagac cggaaaaaac gcgagcaaaa ggaactgatt cgggccgttc cgcatgttca 3000

ctttagaggc catgaagaat tccagtacct tgatctcatt gccgacatta ttaacaatgg 3060

aaggacaatg gatgaccgaa cgggcgttgg tgtcatctcc aaattcggct gcactatgcg 3120

ctactcgctg gatcaggcct ttccacttct caccacaaag cgtgtgttct ggaaaggggt 3180

cctcgaagag ttgctgtggt tcattcgcgg cgacacgaac gcaaaccatc tttctgagaa 3240

gggcgtgaag atctgggaca agaatgtgac acgcgagttc ctcgattcgc gcaatctccc 3300

ccaccgagag gtcggagaca tcggcccggg ctacggcttc cagtggagac acttcggcgc 3360

ggcatacaaa gacatgcaca cagactacac agggcagggc gtcgaccagc tgaagaatgt 3420

gatccagatg ctgagaacga atccaacaga tcgtcgcatg ctcatgactg cctggaatcc 3480

tgcagcgctg gacgaaatgg cgctgccgcc ttgtcacttg ttgtgccagt tctacgtgaa 3540

cgaccagaag gagctgtcgt gcatcatgta tcagcggtcg tgcgatgtcg gcctcggcgt 3600

ccccttcaac atcgcttcct attcgctttt gacgctcatg gttgcacacg tctgcaacct 3660

aaaacctaag gagttcattc acttcatggg gaacacgcat gtctacacga accatgtcga 3720

ggctttaaaa gagcagctgc ggagagaacc gagaccgttc cccattgtga acatcctcaa 3780

caaggaacgc atcaaggaaa tcgacgattt caccgccgag gattttgagg tcgtgggcta 3840

cgtcccgcac ggacgaatcc agatggagat ggctgtcttg atggtgagca agggcgagga 3900

ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg agggctccgt 3960

gaacggccac aagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca 4020

gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc 4080

ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta 4140

cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg 4200

cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt 4260

gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg 4320

ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa 4380

gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa 4440

ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac 4500

ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc 4560

caccagcggc atggacgagc tgtacaagta acggaaatac agaagctgcc cgtctctcgt 4620

tttcttctct tttcggaggg atcagggaga gtgcctcggg tcggagagag ctgacgaggg 4680

ggtgccagag acccctgtgt cctttatcga agaaaaggga tgactcttca tgtggcattt 4740

cacacagtct cacctcgcct tgttttcttt ttgtcaatca gaacgaaagc gagttgcggg 4800

tgacgcagat gtgcgtgtat ccactcgtga atgcgttatc gttctgtatg ccgctagagt 4860

gctggactgt tgctgtctgc ccacgacagc agacaacttt ccttctatgc acttgcagga 4920

tggaattccg atcccacaag atttttgaat taatgtatta acccaagaat gtgcttggga 4980

ttgaccagtc acggcgagtt ttgggcttct gaatagagcg aagcatttgc ttcttggtcc 5040

aacttacgag tcatttgtgc tgaataaaca catgtgcgcc aatcattaca aaattccttg 5100

taggagatgc tcacacgggc aatcttcctg ctgagagtta atgaggcgtg tctgccttgt 5160

gaactctcag gcagtgccat tcaactggat agagtacgcc catcgtgctc tactatggca 5220

ggtcaaagat ggtggggaaa acttctgttc gcagacatgg ggttccaagt gccaggatga 5280

gcatggggaa aatggatatc ccattagtcc taatacgggt cttcctgtcg atggagctca 5340

ggggaaatgt tgctggtgtc cttccgtctg gcatctctgg ctaaacaacc ctaatagggg 5400

cagggagccg atgctaaagt gcaacttttg gggtaggcca gtgcggtggt gaggatacac 5460

gtaggcatgt gagtgcttga aaggggaaga ggtataattt cgtctgctca tttattgtag 5520

tggtgatgag cttggttaga cgagcctggt tagtggctgg gtatgaggct cgatacgtgg 5580

aacttttaaa tttgcactgc accgcaccag cacttcgtga catagcggta tctatggcac 5640

tgccctgttg gtgcaggtaa ataacgttat tttgttctgt actgtgagcc ttttcctagg 5700

attacgattt ggaaaaatcc ccgatcccta cctgacgaaa ttttgccccg ttgttgaata 5760

tccgtggtat cgtatgctga aagtcagcga aaatagaaca tggttcttta agattctcgt 5820

cggaatatct tggtggagta agtttatccc attttccaac tgggcatgcc tcagtggatt 5880

tacccacgcg cctgcagtcg gtagaataaa cgctagttga aacttaaaga gcttggttca 5940

tccactgcat gcgcagggcc acccggatcc actagtccag tgtggtggaa ttctgcagat 6000

atccagcaca gtggcggccg ctcgagtcta gagcccgaaa aaacc 6045

<210> 26

<211> 2995

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgcgtagttc ctgtgtgtca ttcgttgtcg agacaactct gtcccgcccc ggtgctgttc 60

catatgcgtg actttcccgc aattttttca gactttcagg aaagacaggc tccggaacga 120

tctcgtccat gactggtaaa tccacgacac cgcaatggcc cgcagcacct ctatctctcg 180

tgccagggga ctaacgttgt atgcgtctgc gtcttgtctt tttgcattcg ctttccaaaa 240

aagagagcca tccgttcccc cgcacattca acgccgcgag tgcggttttt gtcttttttg 300

agtggtagga cgcttttcat gcgcgaacta cgtggacatt aagttccatt ctctttttcg 360

acagcacgaa accttgcatt caaacccgcc cgcggaagat ccgatcttgc tgctgttcgc 420

agtcccagta gcgtcctgtc ggccgcgccg tctctgttgg tgggcagccg ctacacctgt 480

tatctgactg ccgtgcgcga aaatgacgcc atttttggga aaatcgggga acttcattct 540

ttaaaagtat gcggaggttt cctttttctt ctgttcgttt ctttttctcg ggtttgataa 600

ccgtgttcga tgtaagcact ttccgtctct cctccgtgct ttgttcgaca tcgagaccag 660

gtgtgcagat ccttcgcttg tcgatccgga gacgcgtgtc tcgtagaacc ttttcatttt 720

accacacggc agtgcggagc actgctctga gtgcagcagg gacgggtgaa gtttcgcttt 780

agtagtgcgt ttctgctcta cggggcgttg tcgtgtctgg gaagatgcag aaaccggtgt 840

gtctggtcgt cgcgatgacc cccaagaggg gcatcggcat caacaacggc ctcccgtggc 900

cccacttgac cacagatttc aaacactttc gtcgtgtgac aaaaacgacg cccgaagaag 960

ccagtcgcct gaacgggtgg cttcccagga aatttgcaaa gacgggcgac tctggacttc 1020

cctctccatc agtcggcaag agattcaacg ccgttgtcat gggacggaaa aactgggaaa 1080

gcatgcctcg aaagtttaga cccctcgtgg acagattgaa catcgtcgtt tcctcttccc 1140

tcaaagaaga agacattgcg gcggagaagc ctcaagctga aggccagcag cgcgtccgag 1200

tctgtgcttc actcccagca gctctcagcc ttctggagga agagtacaag gattctgtcg 1260

accagatttt tgtcgtggga ggagcgggac tgtacgaggc agcgctgtct ctgggcgttg 1320

cctctcacct gtacatcacg cgtgtagccc gcgagtttcc gtgcgacgtt ttcttccctg 1380

cgttccccgg agatgacatt ctttcaaaca aatcaactgc tgcgcaggct gcagctcctg 1440

ccgagtctgt gttcgttccc ttttgtccgg agctcggaag agagaaggac aatgaagcga 1500

cgtatcgacc catcttcatt tccaagacct tctcagacaa cggggtaccc tacgactttg 1560

tggttctcga gaagagaagg aagactgacg acgcagccac tgcggaaccg agcaacgcaa 1620

tgagctcctt gacgtccacg agggagacaa ctcccgtgca cgggttgcag gctccttctt 1680

cggccgcagc cattgccccg gtgttggcgt ggatggacga agaagaccgg aaaaaacgcg 1740

agcaaaagga actgattcgg gccgttccgc atgttcactt tagaggccat gaagaattcc 1800

agtaccttga tctcattgcc gacattatta acaatggaag gacaatggat gaccgaacgg 1860

gcgttggtgt catctccaaa ttcggctgca ctatgcgcta ctcgctggat caggcctttc 1920

cacttctcac cacaaagcgt gtgttctgga aaggggtcct cgaagagttg ctgtggttca 1980

ttcgcggcga cacgaacgca aaccatcttt ctgagaaggg cgtgaagatc tgggacaaga 2040

atgtgacacg cgagttcctc gattcgcgca atctccccca ccgagaggtc ggagacatcg 2100

gcccgggcta cggcttccag tggagacact tcggcgcggc atacaaagac atgcacacag 2160

actacacagg gcagggcgtc gaccagctga agaatgtgat ccagatgctg agaacgaatc 2220

caacagatcg tcgcatgctc atgactgcct ggaatcctgc agcgctggac gaaatggcgc 2280

tgccgccttg tcacttgttg tgccagttct acgtgaacga ccagaaggag ctgtcgtgca 2340

tcatgtatca gcggtcgtgc gatgtcggcc tcggcgtccc cttcaacatc gcttcctatt 2400

cgcttttgac gctcatggtt gcacacgtct gcaacctaaa acctaaggag ttcattcact 2460

tcatggggaa cacgcatgtc tacacgaacc atgtcgaggc tttaaaagag cagctgcgga 2520

gagaaccgag accgttcccc attgtgaaca tcctcaacaa ggaacgcatc aaggaaatcg 2580

acgatttcac cgccgaggat tttgaggtcg tgggctacgt cccgcacgga cgaatccaga 2640

tggagatggc tgtctagcgg aaatacagaa gctgcccgtc tctcgttttc ctctcttttc 2700

ggagggatca gggagagtgc ctcgggtcgg agagagctga cgagggggtg ccagagaccc 2760

ctgtgtcctt tatcgaagaa aagggatgac tcttcatgtg gcatttcaca cagtctcacc 2820

tcgccttgtt ttctttttgt caatcagaac gaaagcgagt tgcgggtgac gcagatgtgc 2880

gtgtatccac tcgtgaatgc gttatcgttc tgtatgccgc tagagtgctg gactgttgct 2940

gtctgcccac gacagcagac aactttcctt ctatgcactt gcaggatgga attcc 2995

Claims (5)

1.一种表达外源荧光蛋白球虫的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)针对球虫的目的基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒；当目标基因为EtA蛋白，所述含gRNA的基因编辑质粒为pCRISPR::EtA质粒；所述含gRNA的基因编辑质粒含核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的DNA片段；

2)构建含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒；所述同源重组质粒中外源插入片段为5'同源臂-目的基因CDS-筛选基因-mCherry-3'同源臂；

所述外源插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；

含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒为pEtA::DHFR-mCherry；

所述筛选基因为DHFR；

3)将所述含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和mCherry基因的同源重组质粒共同转染球虫的子孢子；

4)将转染后的子孢子感染动物，筛选，得到表达外源荧光蛋白球虫；所述筛选用药物为乙胺嘧啶；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述基因编辑质粒包括基因编辑CRISPR/Cas9质粒、基因编辑CRISPR/Cas12a质粒、基因编辑CRISPR/Cas13质粒、基因编辑CRISPR/Cas14质粒。

3.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫。

4.权利要求1～3任意一项所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在观察球虫不同发育阶段的转化、球虫与感染细胞互作或球虫药物评价中的应用。

5.权利要求1～3任意一项所述构建方法制备的表达外源荧光蛋白球虫在探究目标基因或所述目标基因编码的蛋白质的生物学功能中的应用。

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