CN107047452A - 间充质干细胞中macf1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用 - Google Patents
间充质干细胞中macf1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用,用于弥补骨形成研究领域内MACF1基因在间充质干细胞中条件性敲除动物模型的空缺,以在动物水平研究MACF1对骨形成的作用。技术方案是利用Cre‑Loxp系统,通过MACF1flox/flox小鼠与Cre酶仅在间充质干细胞中特异性表达的Prrx1Cre小鼠交配,最终获得Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠,成功获得间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除的小鼠模型。该模型用于研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中功能、用于研究颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的发病机制,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,特别涉及一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,这种干细胞能够分化成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。而始于间充质干细胞的硬骨形成过程在骨构建、骨重建及骨折愈合中扮演着重要的角色。如果间充质干细胞骨形成能力降低,必然导致相应骨骼疾病的发生,例如骨骼发育延迟、骨不连、骨折愈合延迟、骨质疏松症等骨形成障碍性疾病。然而骨形成障碍是一个比较复杂的过程,其相关的分子机理目前还不十分清楚。
微管微丝交联因子MACF1,又名ACF7,是一种新型的细胞骨架交联分子,在细胞极化、细胞迁移、信号转导以及维持组织的完整性中发挥着重要作用。已有研究发现,MACF1与模拟失重条件下骨形成细胞中的微管微丝交联发生改变相关(Qian AR,et al.[J].Bioelectromagnetics,2009Oct.30(7):545–555);而且,在MACF1稳定低表达的MC3T3-E1前成骨细胞株中,MACF1低表达影响前成骨细胞的形态、抑制前成骨细胞的增殖(Hu LF,etal.[J].BMB Rep.2015Oct.48(10):583-8.)。
可见,MACF1在骨形成中具有重要的作用,只是目前关于MACF1对骨形成作用的研究还非常少,只限于细胞水平。而细胞水平的实验研究仅仅基于离体细胞本身的微小环境,忽视了生命体本身的整体环境及各组织系统间的协调互作。因此,在细胞水平上不能直观全面地研究MACF1在骨形成中的作用。而且,基于现有研究技术,对于MACF1在骨骼中功能的研究,仅构建有在前成骨细胞系MC3T3-E1中使MACF1低表达的稳定细胞株(骞爱荣等.抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用[P].北京:CN 104531700A,20150422.)。
发明内容
为了弥补骨形成研究领域内MACF1基因在间充质干细胞中条件性敲除动物模型的空缺,以在动物水平研究MACF1对骨形成的作用,本发明提供一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用。利用Cre-Loxp系统,通过MACF1flox/flox小鼠与Cre酶仅在间充质干细胞中特异性表达的Prrx1Cre小鼠交配,最终获得Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠,成功获得间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除的小鼠模型。所述动物模型的MACF1基因条件性失活,造成所述动物模型中新生小鼠的颅骨发育延迟、成年小鼠的骨形成能力降低,是一种骨骼发育延迟、骨形成能力降低的小鼠动物模型。该模型可以作为研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中功能的动物模型;同时还可用于研究颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的发病机制,并用于筛选改善或治疗此类疾病的候选物质,具有重要的应用价值。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案:一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法,其特点是包括以下步骤:
(1)选用MACF1flox/+小鼠自交,扩繁获得纯合子MACF1flox/flox小鼠;
(2)选用Prrx1Cre转基因小鼠与SPF级C57BL/6J小鼠交配,扩繁获得Prrx1Cre转基因小鼠;
(3)将获得的MACF1flox/flox小鼠与获得的Prrx1Cre转基因小鼠交配,获得半敲Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠;
(4)将获得的半敲Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠自交,获得间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠模型,即全敲Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠。
(5)对所得到的MACF1flox/flox小鼠、Prrx1Cre小鼠以及Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠利用特异性引物通过PCR方法进行基因型的鉴定。
所述特异性引物为一对时,首选
引物MACF1-AP179:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物MACF1-AP180:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
所述特异性引物为两对时,首选
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
所述特异性引物为三对时,首选
引物MACF1-AP179:5'-AAAGAAACGGAAATACTGGCC-3'和
引物MACF1-AP180:5'-GCAGCTTAATTCTGCCAAATTC-3';
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引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
所述间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的用途,其特征在于:
第一方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中的功能;
第二方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在骨形成细胞的骨架结构及在其形态、增殖、迁移、分化和凋亡这些细胞生命活动中的作用;
第三方面,所述小鼠模型作为颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病发病机制研究的动物模型;
第四方面,所述小鼠模型用于筛选改善或治疗颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的候选药物;
第五方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在间充质干细胞成骨、成脂和成软骨多项分化中的作用;
第六方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因对脂肪形成或软骨形成的作用。
本发明的有益效果是:本发明利用Cre-Loxp系统,通过MACF1flox/flox小鼠与Cre酶仅在间充质干细胞中特异性表达的Prrx1Cre小鼠交配,最终获得Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠,成功获得间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除的小鼠模型。所述动物模型的MACF1基因条件性失活,造成所述动物模型中新生小鼠的颅骨发育延迟、成年小鼠的骨形成能力降低,是一种骨骼发育延迟、骨形成能力降低的小鼠动物模型。该模型可以作为研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中功能的动物模型;同时还可用于研究颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的发病机制,并用于筛选改善或治疗此类疾病的候选物质,具有重要的应用价值。
本发明运用所构建的模型首次揭示了MACF1基因促进骨形成的生物学功能,说明可以将微管微丝交联因子MACF1及其上下游生物传导通路作为药物治疗骨骼发育延迟以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的新靶点。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1构建的间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型;
图2是本发明实施例1获得的MACF1flox/+小鼠的PCR基因型鉴定结果照片;
图3是本发明实施例1获得的Prrx1Cre小鼠的PCR基因型鉴定结果照片;
图4是本发明实施例1最终获得的Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠的双重PCR基因型鉴定结果照片;
图5是本发明实施例2对条件性敲除MACF1基因新生乳鼠骨架进行阿尔辛蓝和茜素红染色后骨形成差异明显的颅骨部位照片;
图6是本发明实施例2对条件性敲除MACF1基因成年小鼠股骨进行microCT扫描的结果照片;
图7是本发明实施例3对条件性敲除MACF1基因小鼠的原代间充质干细胞进行成骨分化诱导后的茜素红染色显示的矿化结节照片。
具体实施方式
以下实施例参照图1-7。
实施例1:构建间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型。
1.1实验动物。
MACF1flox/+小鼠与Prrx1Cre转基因小鼠的饲养:
MACF1flox/+小鼠与Prrx1Cre转基因小鼠的饲养按照SPF动物饲养标准执行,经隔离观察未见异常后进入饲养区,严格按照SPF动物管理相关规定进行实验操作。
1.2MACF1flox/+小鼠基因型鉴定。
剪取小鼠脚趾,提取MACF1flox/+小鼠基因组DNA,采用引物进行小鼠基因型鉴定;以小鼠MACF1基因序列为模板,具体设计引物序列如下:
引物MACF1-AP179:5’-AAAGAAACGGAAATACTGGCC-3’和
引物MACF1-AP180:5'-GCAGCTTAATTCTGCCAAATTC-3’。
图2的PCR鉴定结果显示扩增出700bp和750bp两条带,700bp表明MACF1基因未被Loxp位点标记,750bp表明MACF1基因被Loxp位点标记,两条带同时出现,则表明MACF1基因的两条同源染色体有一条被Loxp位点标记,由此证明获得的小鼠为目标杂合子MACF1flox/+小鼠。
1.3Prrx1Cre转基因小鼠基因型鉴定。
剪取小鼠脚趾,提取Prrx1Cre转基因小鼠基因组DNA,采用两对引物,通过双重PCR方法对小鼠进行基因型鉴定;其中,一对引物以Prrx1基因序列为模板,具体设计序列如下:
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
另一对引物分别以Prrx1基因序列、Cre基因序列为模板,具体设计序列分别如下:
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
图3的双重PCR鉴定结果显示分别扩增获得267bp和322bp共两个条带,表明Cre基因存在于间充质干细胞标志基因prrx1的一条同源染色体中,由此证明获得的小鼠为目标杂合子的Prrx1Cre转基因小鼠。
1.4间充质干细胞中条件性敲除MACF1基因小鼠模型的构建。
(1)选用MACF1flox/+小鼠与MACF1flox/+小鼠交配,用引物MACF1-AP179、MACF1-AP180对其子代进行基因型鉴定,获得纯合子MACF1flox/flox小鼠。
(2)选用Prrx1Cre转基因小鼠与SPF级C57BL/6J小鼠交配,用引物Prrx1-iCre-WT-F、iCre-Mut-R2对其子代进行基因型鉴定,获得Prrx1Cre转基因小鼠。
(3)根据Cre-Loxp系统构建条件性敲除动物的原理,将获得的MACF1flox/flox小鼠与Prrx1Cre转基因小鼠交配,获得间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1杂合子小鼠,即半敲Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠;再利用Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠进行自交,获得间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠,即全敲Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠,繁育过程中所得子代小鼠的基因型皆经三重PCR方法筛选鉴定。
该三重PCR方法进行基因型鉴定所用的三对引物分别为:
引物MACF1-AP179:5'-AAAGAAACGGAAATACTGGCC-3’和
引物MACF1-AP180:5'-GCAGCTTAATTCTGCCAAATTC-3’;
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
图4的三重PCR鉴定结果显示分别获得750bp、267bp和322bp共3个条带。
由此表明构建成功了间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠,即全敲Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠。
将获得的Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠与MACF1flox/flox小鼠交配,以获得较多的Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠(实验组小鼠)与MACF1flox/flox小鼠(对照组小鼠),然后对7-9天子代小鼠剪脚趾提取基因组DNA,通过引物MACF1-AP179、MACF1-AP180和引物Prrx1-iCre-WT-F、iCre-Mut-R2经双重PCR方法筛选鉴定子代小鼠基因型,理论上产生的后代有1/2的MACF1flox/flox子鼠和1/2的Prrx1Cre;MACF1flox/flox子鼠。子鼠基因型确定后,用于间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠模型的表型鉴定。
实施例2:间充质干细胞中条件性敲除MACF1基因小鼠表型的鉴定。
发现间充质干细胞中条件性敲除MACF1小鼠的颅骨发育延迟,股骨骨小梁结构稀疏、骨形成能力降低。
2.1条件性敲除MACF1基因对新生小鼠颅骨发育的影响。
选取出生后一天的Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠和MACF1flox/flox小鼠,解剖获得全身骨架,并对其进行茜素红-阿尔辛蓝染色,具体步骤如下:
1. 1.5%戊巴比妥钠麻醉乳鼠使其安乐死。
2.按以下步骤小心地剔除乳鼠的软组织:
(1)用手术直剪在乳鼠腹部的中央横向剪开一个口子,然后用镊子夹住开口的皮肤,绕着乳鼠的腹部顺时针横向撕扯一圈;
(2)然后像脱上衣一样向着头部方向剥离上身、前肢及头部的皮肤,再像脱裤子一样剥离下身及后肢的皮肤,切勿脱臼四肢或头部,趾骨及鼻子周围的皮肤不用剥干净,以免损伤骨组织;
(3)之后清除胸腔、腹腔内的脏器,剥除颈部的甲状腺及身体上的脂肪(尤其是肩胛骨部位)和多余软组织;
(4)最后剥去眼睛,用镊子将两侧瞳孔穿通,并与脑组织穿通,切勿损伤颅骨。
3. 95%酒精固定样品24h。
4.将样品转移至丙酮中,室温下浸泡过夜(10-12h)以清除样品的脂肪。
5.去离子水简单清洗样品3次后,0.03%阿尔新蓝(300mg Alcian Blue,800ml98%ethanol,200ml acetic acid)中完全浸泡24h以染色样品的软骨。
Note:因季节温度差异,具体染色时间可依软骨的染色程度来调整。
6. 95%酒精中浸泡样品3次,每次1h。
7. 2%KOH浸泡24h。
Note:期间分别在2h、6h及13h时更换2%KOH;因季节温度差异,2%KOH中浸泡时间最好根据小鼠骨架的情况调整,以免消化过度。
8. 0.005%茜素红(50mg/l Alizarin Red in 2%KOH)中浸泡24h以复染样品的成骨部分。
9. 1%KOH中浸泡直至骨架清洁。
10.将样品转移至自来水中等待拍照记录,但浸泡时间不宜超过3天。
11.拍照记录,观察分析。
从图5可以发现,与对照组的MACF1flox/flox乳鼠相比,出生后1天的Prrx1Cre;MACF1flox/flox乳鼠的颅骨矢状缝稍大,人字缝明显扩大,颅骨钙化区域明显减少,表现出明显的颅骨发育延迟及其骨形成能力降低的症状。
2.2条件性敲除MACF1基因对小鼠股骨骨形成能力的影响。
选取16W的Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠和MACF1flox/flox小鼠,解剖获得其股骨,进行小动物microCT扫描。
从图6可以发现,与对照组的MACF1flox/flox小鼠相比,Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠股骨的骨小梁结构稀疏,松质骨区域明显减少,表现出明显骨形成能力降低症状。
实施例3:条件性敲除MACF1基因对间充质干细胞成骨分化能力的影响。
从小鼠四肢骨的皮质骨中提取原代间充质干细胞,成骨分化诱导后,通过茜素红染色检测条件性敲除MACF1基因对间充质干细胞成骨分化能力的影响,具体步骤如下:
将Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠和MACF1flox/flox小鼠的原代间充质干细胞接种于24孔板中,1.0X105个/孔,各4个复孔;待24h后细胞长满,加成骨分化诱导剂(1%L-谷氨酰胺+1%双抗+1%Vc+1%β-甘油+10%BI血清+86%α-MEM培养基)诱导,每隔一天换次诱导剂,待矿化结节明显时,进行茜素红染色:
1.吸去细胞培养基,用PBS清洗细胞2次;
2.加10%甲醛固定细胞,室温15min;
3.PBS清洗细胞1次,加入0.5%茜素红S染液(pH 4.2),室温染色15min;
4.使用自来水对细胞震荡清洗4次,5min/次;
5.用扫描仪对着色矿化结节进行扫描;
6.保存扫描照片,观察分析。
从图7可以发现,相同条件下,与对照组MACF1flox/flox小鼠的原代间充质干细胞相比,Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠的原代间充质干细胞诱导成骨后形成的矿化结节明显减少,表明其成骨分化能力明显降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北工业大学
<120> 间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用
<130> 说明书,权利要求书
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
aaagaaacgg aaatactggc c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
ggcttgcagg tacaggaggt ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
agcgtttggt gttgattcga gc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
agtcccggtg actccagcag 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
ggcttgcagg tacaggaggt ag 22
序 列 表
1
Claims (5)
1.一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)选用MACF1flox/+小鼠自交,扩繁获得纯合子MACF1flox/flox小鼠;
(2)选用Prrx1Cre转基因小鼠与SPF级C57BL/6J小鼠交配,扩繁获得Prrx1Cre转基因小鼠;
(3)将获得的MACF1flox/flox小鼠与获得的Prrx1Cre转基因小鼠交配,获得半敲Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠;
(4)将获得的半敲Prrx1Cre;MACF1flox/+小鼠自交,获得间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠模型,即全敲Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠;
(5)对所得到的MACF1flox/flox小鼠、Prrx1Cre小鼠以及Prrx1Cre;MACF1flox/flox小鼠利用特异性引物通过PCR方法进行基因型的鉴定。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法,其特征在于:所述特异性引物为一对时,首选
引物MACF1-AP179:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物MACF1-AP180:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法,其特征在于:所述特异性引物为两对时,首选
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法,其特征在于:所述特异性引物为三对时,首选
引物MACF1-AP179:5'-AAAGAAACGGAAATACTGGCC-3'和
引物MACF1-AP180:5'-GCAGCTTAATTCTGCCAAATTC-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物Prrx1-iCre-WT-R:5'-AGTCCCGGTGACTCCAGCAG-3';
引物Prrx1-iCre-WT-F:5'-AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC-3'和
引物iCre-Mut-R2:5'-GGCTTGCAGGTACAGGAGGTAG-3'。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法所建立小鼠模型的用途,其特征在于:
第一方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中的功能;
第二方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在骨形成细胞的骨架结构及在其形态、增殖、迁移、分化和凋亡这些细胞生命活动中的作用;
第三方面,所述小鼠模型作为颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病发病机制研究的动物模型;
第四方面,所述小鼠模型用于筛选改善或治疗颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的候选药物;
第五方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因在间充质干细胞成骨、成脂和成软骨多项分化中的作用;
第六方面,所述小鼠模型用于研究MACF1基因对脂肪形成或软骨形成的作用。
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