CN104419719A - 一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，本发明提供了一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法，利用猪精子特异诱导启动子启动Cre/loxP位点特异重组酶系统，建立的自我剪切元件PCN，正常进行打靶筛选阳性克隆，进行SCNT获得founder阳性转基因猪后，通过配种，自我剪切敲除标记基因。其中剪切元件PCN中：P代表猪精子特异启动子，C代表Cre酶基因，N代表打靶时所需的正筛选标记neo基因。由于Cre酶是在精子成熟时特异启动，因此后代即可获得敲除筛选标记neo基因的猪，因此方便的获得筛选标记基因敲除的猪。

Description

一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法

技术领域

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法。 

背景技术

在生物学发展的过程中，很多方面都有重要的革命性突破。例如：小鼠基因打靶技术、小鼠和人的胚胎干细胞即ES细胞的分离成功、人类基因组计划和小鼠基因组计划的完成，人类的30000多个基因被认为是决定人类命运的“天书”，展现于人类面前。因此以小鼠为模型进行功能的基因研究为了解人类的基因功能奠定重要的基础，但是由于小鼠模型的局限性，不能满足目前的研究。然而大动物，特别是猪，由于其生理特征与人类相似、及其生命周期长等特点，目前被认为是理想的动物模型。因此，对猪的转基因及其基因打靶技术就显得尤为重要，除了对基础研究有重要意义外，对应用也有很大作用。随着我国政府对农业问题的持续关注和大力支持，我国农业发展取得了长足的进步，特别是与动物相关的畜牧类产业的飞速发展，使人民的生活状况及饮食结构获得了极大的改善。但是同时也提出严峻挑战，在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90%，这意味着作为动物农业整个产业链源头的畜牧类品种，严重依赖于国际市场。传统的遗传育种方法对猪进行抗病性、肉品质等性状的改良难以在短期内实现根本性突破，因此，我们迫切需要一种更加快捷、精确以及有针对性的基因打靶育种改良方法。随着转基因技术的快速发展，转基因植物和动物都有重大突破：抗病品种培育、高品质品种培育、各种疾病模型的建立、动植物反应器等等。然而这些成功研究的背后也藏 有重大的隐患：标记基因与目的基因共存。标记基因即选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感。由于转基因效率低，因此必须利用标记基因对阳性克隆进行筛选和富集。但标记基因的存在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响，同时还将带来严重的安全性问题。 

2009年，本课题组利用体外转录mRNA瞬时表达Cre酶，获得标记基因敲除的转基因牛。目前为止，还没有对猪进行marker free的相关研究，由于其重要性，因此标记基因敲除的转基因猪研究显得尤为重要。 

发明内容

为了解决现有技术中存在得问题，本发明的目的是提供一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法。 

为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤： 

1）构建自我剪切元件PCN； 

2）构建带有自我剪切元件的打靶载体； 

3）筛选阳性克隆细胞； 

4）体细胞克隆获得F0代阳性公猪； 

5）配种繁殖获得自动敲除标记基因的F1代个体。 

进一步地，所述自我剪切元件PCN主要包括以下核心元件：P代表猪精子特异启动子，这个启动子在猪精子生成过程中特异表达；C代表Cre重组酶基因，可以介导同向loxp位点之间任何序列的切割；N代表转基因动物常用的neo筛选标记基因。所述自我剪切元件的最大特点，是在精子阶段特异启动Cre酶进行自我剪切，达到自动敲除标 记基因的目的。 

进一步地，所述步骤2）将步骤1）构建的自我剪切元件PCN替换于普通的打靶载体的正筛选基因当中，得到带有自我剪切元件的打靶载体。 

所述自我剪切元件具有通用性和灵活性，可以用于猪的任何打靶载体当中，只要通过简单的分子操作即可将常规的打靶载体改成筛选基因自我剪切的载体。 

进一步地，所述步骤3）将步骤2）得到的带有自我剪切元件的打靶载体，转染猪胎儿成纤维细胞，进行正负筛选获得打靶成功的阳性克隆细胞。 

作为优选，所述打靶载体为MSTN-PCN marker free打靶载体。本发明将以本实验室的MSTN（肌肉生成素抑制基因）的打靶载体作为实施例，用以说明本发明所述方法。 

进一步地，所述步骤4）将步骤3）筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得F0代的阳性公猪。要求阳性公猪，是因为阳性公猪才有精子，才能启动自我剪切元件。 

进一步地，所述步骤5）将步骤4）获得F0代的阳性公猪进行配种繁殖，获得自动敲除标记基因的F1代个体。其是利用自我剪切元件特点——精子特异表达，因此只要通过简单的配种即可获得F1代标记基因敲除的基因打靶猪。 

本发明还提供了由前述步骤3）筛选获得的阳性克隆细胞，以及所述阳性克隆细胞在生产基因敲除克隆猪中的应用。 

本发明还提供了前述转基因猪筛选标记基因敲除的方法在生产基因敲除克隆猪中的应用。 

本发明的有益效果在于：本发明提供了简单、高效的去除转基因猪筛选标记基因方法即marker free。其原理是利用猪精子特异诱导启 动子启动Cre/loxP位点特异重组酶系统，建立的自我剪切元件PCN。其中P代表猪精子特异启动子，C代表Cre酶基因，N代表打靶时所需的正筛选标记neo基因。正常进行打靶筛选阳性克隆，进行SCNT获得founder阳性转基因猪后，通过配种由于Cre酶是在精子成熟时特异启动，自我剪切敲除标记基因。因此后代即可获得去除筛选标记neo基因的猪，因此方便的获得敲除标记基因的猪。本发明解决猪标记基因敲除的问题，对于大动物转基因未来的应用及其基础研究打下重要的基础。 

附图说明

图1为自我剪切元件PCN； 

图2为含有PCN元件的MSTN打靶载体； 

图3为打靶阳性克隆PCR鉴定结果； 

图4为打靶阳性F0代公猪PCR检测结果； 

图5为F1代小猪标记基因敲除PCR检测结果。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

以下实施例中载体设计由本课题组完成，猪精子特异启动子由美国犹他大学进行基因合成，序列测定由北京华大基因完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自北京NEB公司，体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。 

实施例1自我剪切元件PCN的构建 

将猪精子特异启动子构建到pUC57克隆载体（由美国犹他大学提供）中，进行基因合成，命名为pGENE1载体（此步骤由美国犹他大学进行），用SalI+AgeI酶双切，体系为50ul：载体2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、无菌水31ul，37度酶切2h，跑胶回收得到931bp的目的片段，测序（核苷酸序列如SEQ ID No.1所示）；再将pACN 载体（由美国犹他大学提供）用SalI+AgeI酶双切，体系为50ul：载体2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、无菌水31ul，37度酶切2h，跑胶回收得到5805bp的目的片段；将上述回收的两个片段连接，体系10ul：回收小片段6ul、大片段2ul、10xbuffer加1ul、T4连接酶1ul，16度过夜连接。转化、摇菌、小体质粒、酶切鉴定阳性的pPCN载体（核苷酸序列如SEQ ID No.2所示），备用。 

实施例2MSTN：marker free打靶载体构建 

2、将上述构建正确的pPCN载体用NheI+NotI酶切双切，体系为50ul：载体2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、无菌水31ul，37度酶切2h，跑胶回收3620bp的目的片段；同时实验室原来的pMSTN打靶载体用NheI+NotI双酶切体系为50ul：载体2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、无菌水31ul，37度酶切2h，跑胶回收目的14580片段获得骨架片段，体系10ul：回收小片段6ul、大片段2ul、10xbuffer加1ul、T4连接酶1ul，16度过夜连接。转化、摇菌、小体质粒、酶且鉴定阳性的最终marker free的打靶载体pMSTN-PCN1载体（核苷酸序列如SEQ ID No.3所示），用于下步实验（载体结构详见图2）。实施例3打靶阳性细胞克隆的获得 

1、长白胎儿成纤维细胞建立 

1）取妊娠30d的长白猪，处死后取输卵管子宫、包扎出口、2h内运回实验室。 

从子宫内取出胎儿，用含抗生素的DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用眼科剪去除胎儿头部、四肢、内脏、用DPBS冲洗。 

2）在直径100mm细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分尽量剪碎。 

3）加入少许血清，将1ml枪头尖端用剪刀剪断，留下直径约为40mm以上部分，接上1ml枪，将组织块转移到3个T25细胞培养瓶的底壁，用弯头吸管将组织块均匀铺开。 

4）将铺有组织块的一面向上，各加入5ml细胞培养液，放入CO2 培养箱，39℃、5%CO2、100%湿度培养。 

5）待培养6-8h后，将铺有组织块的一面翻转，使细胞培养液浸没组织块。 

6）培养5天左右观察组织块周围是否有细胞爬出。 

7）待细胞生长至80%汇合时，进行传代培养或进行冷冻保存。 

2、打靶载体电转化 

将实施例1中构建好的pMSTN-PCN1打靶载体，电转长白胎儿成纤维细胞。根据文献资料以及之前的实验数据，我们设置了从320V-450V电压梯度以及2个不同的脉冲频率：5ms和7ms来检测其对细胞转染率和生长形态的影响。由图2的照片看来，随着电压增大，细胞的转染效率越高，呈现出越高比例的表达绿色荧光的细胞。而与此同时电压越高，对细胞的损伤越大，电激后死亡的细胞越多。综合各种因素，我们决定采用400V，7ms的参数对猪胎儿成纤维细胞进行电激转染。 

3、打靶阳性克隆PCR鉴定 

通过正负筛选，获得了17个克隆，然后部分细胞冻存、部分细胞细胞提取基因组进行PCR鉴定（PCR分子鉴定图如图3所示），发现其中扩出2.6kb片段的为打靶阳性克隆，其中1、2、3、4、12、13、14号克隆为打靶阳性克隆，用于后续实验。 

实施例4MSTN敲除猪核移植胚胎及克隆猪的制备 

1、猪卵母细胞体外成熟 

从屠宰场取卵巢，放入28℃-35℃，含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h内运回实验室用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50mL离心管中，37℃水浴静置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重悬沉淀，再静置15min，重复一次，将重悬液放入直径60mm的塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选卵丘包裹2层以上，致密，而且胞质均匀的卵丘细胞-卵 母细胞复合体（Cumulus-Oocyte-complexes，COCs），用成熟培养液洗涤3遍转入在培养箱中至少已经平衡4h的培养液滴内（每100μL液滴放25枚）。每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。将COCs先在成熟培养液中培养20±2h，然后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2h。 

2、体细胞准备 

利用血清饥饿法，将实例3中获得的打靶阳性细胞待其生长至80%汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS（Gibco，Life Technologies）浓度从20%降至0.5%继续培养2-5d，按常规方法消化，离心洗涤，最后加1mL显微操作液重悬细胞沉淀备用。 

3、受体卵母细胞去核及供体细胞核移植 

利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，即成熟40-44h猪卵母细胞，脱卵丘后选择胞质均匀，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母细胞放入无Ca²⁺、Mg²⁺、HEPES缓冲NCSU-23备用转移到显微操作液滴内：核移植前1h做好，直径60mm细胞培养皿盖中央（液滴50-80μl，2-3mm宽，8-10mm长，石蜡油覆盖），作用15-30min，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39%、5%CO2、100%湿度平衡15min，安装显微固定管以及去核/注射针，调节好操作系统位置，在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下，40×用固定管（内径25-35μm，外径100-120μm）吸持卵母细胞用内径15-25μm的去核/注射针拨动卵母细胞，使第一极体处于钟表1点钟位置200×下，从钟表3点处将去核/注射针刺过透明带，吸出第一极体及其附近少许细胞质退出去核/注射针，将第一极体以及少许胞质吐出挑选直径15-20μm，折光性强，圆形，光滑的体细胞，200×下用去核/注射针吸取一个供体细胞，从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周隙内用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此紧密接触每批25-30个卵母细胞，构建完成后，结束后将供体细胞-卵胞质构成的细胞对 （重构卵）转移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39℃、5%CO2、100%湿度培养箱中修复1-2h。 

4、融合与激活 

将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行用ECM2001融合仪施加一个30μs，2.0kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中、39℃、5%CO2、100%湿度培养0.5h～1h后取出，在体视显微镜下判定融合。 

5、胚胎培养 

在开始显微操作前至少4h预先做好培养液滴，在超净台内取35mm细菌培养皿，做6-8个30μL大的液滴，小心加入2.5-3ml矿物油覆盖，做好标记后放入CO₂培养箱内平衡将上述融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后转入，每个30μL的液滴培养8-10个重构胚，培养48h和168h时记录卵裂和囊胚形成结果。 

6、胚胎移植 

用公猪试情或者观察压背反应，挑选自然发情母猪，一般在构建克隆胚的当天将在CO₂培养箱中培养12-30h的1-2细胞克隆胚取出，装入2.5ml细管内。用灭菌的锡箔纸包装好，做好标记，放到恒温运输箱中运到猪移植地点，用40-60ml（1mg/100kg体重）生理盐水溶解1-1.5mg硫喷妥钠和地西泮，耳静脉注射20ml，待受体猪初步麻倒后，将其抬到手术架上仰卧（青年后备母猪）或者侧卧（经产母猪）保定对后备母猪：在腹部下面第1对和第2对乳头之间，腹中线局部15×10cm²面积内清洁刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脱碘（对经产母猪：在腹部肷窝部15×10cm2的范围内清洁，刮毛碘酒消毒后酒精脱碘）在准备动刀切开腹中线之前，把前面余下的麻醉药再酌情注射 20-30ml，沿腹中线切开一个长约8-10cm的口，打开腹腔，探进去一只手，取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上（而对经产母猪：沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约10cm的切口）在手术人员即将取出卵巢，调整好输卵管伞之际，将装在吸管内的胚胎取出放在热台上，体视显微镜下将胚胎装入移植管内，手术人员和胚胎移植人员相互协调，将移植管从输卵管伞部探入输卵管至少5cm大致到了壶腹-峡部结合处，一边推动注射器，以便外撤移植管移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内，确认没有后，开始卵巢回位，术口缝合胚胎移植后第10d肌肉注射800IU hCG，13d注射500IU PMSG。 

7、囊胚细胞计数 

取出重构胚囊胚，在含3.7%多聚甲醛的DPBS中洗涤3遍后再固定10min将固定后的囊胚转移到含10μg/ml Hoechst33342（bisbenzimide）的DPBS中避光的暗盒中室温孵育10min染色结束后，将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，尽快用9∶1的凡士林/石蜡油在其四角点四个柱，盖上盖玻片，在实体显微镜下小心按压盖玻片，使卵受压后稍微膨大但不至于破碎为宜，用指甲油封片，Nikon E800显微镜，紫外光激发下观察、照相、计数。 

实施例5F0代公猪阳性鉴定 

F0代猪组织基因组DNA的提取： 

将猪场出生的公猪（来源于实例3中的阳性细胞克隆）取少量尾巴组织块，剪碎或细胞沉淀放入1.5ml离心管中，加700μl DNA抽提缓冲液，20μl蛋白酶K（20mg/ml），混匀56℃水浴消化18h以上，直至组织块或细胞沉淀完全消失，间歇摇动以获得更好的效果，加入700μl Tris-饱和酚，温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，重复上一步骤，将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μl酚∶仿（1∶1），温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μl氯仿， 温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加2倍体积无水乙醇，颠倒混匀后，12000rpm离心10min。弃上清，用70％乙醇洗沉淀和管壁，倾弃乙醇，沥尽残液，室温下敞口放置20～30min，使乙醇完全挥发，加适量（约100μl）TE缓冲液，于56℃水浴中溶解DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度，测量260/280nm波长下检测基因组DNA的浓度和纯度，将其调整至适当浓度，-20℃保存，同时进行PCR鉴定打靶阳性公猪。进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，假如扩出2.6kb条带的既为阳性。检测结果如图4所示，其中其中3，4，6，8，9，11，12，14，15，16，17，18，19，20号F0代公猪为阳性。用于后面实验。 

实施例6F1代猪阳性鉴定 

将实施例5中的F0代阳性公猪与野生型母猪配种然后获得F1代小猪，然后提取基因组和PCR鉴定。如果标记基因被敲除，会扩出600bp条带，检测结果如图5所示（检测方法同实施例5）。F1代个体为标记基因敲除，及证明本设计可以方便，通用的获得标记基因敲除的基因打靶猪。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (10)

1.一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）构建自我剪切元件PCN；

2）构建带有自我剪切元件的打靶载体；

3）筛选阳性克隆细胞；

4）体细胞克隆获得F0代阳性公猪；

5）配种繁殖获得自动敲除标记基因的F1代个体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自我剪切元件PCN包括猪精子特异启动子、Cre重组酶基因和转基因动物常用的neo筛选标记基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）将步骤1）构建的自我剪切元件PCN替换于普通的打靶载体的正筛选基因当中，得到带有自我剪切元件的打靶载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）将步骤2）得到的带有自我剪切元件的打靶载体，转染猪胎儿成纤维细胞，进行正负筛选获得打靶成功的阳性克隆细胞。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述打靶载体为MSTN-PCN marker free打靶载体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4）将步骤3）筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得F0代的阳性公猪。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）将步骤4）获得F0代的阳性公猪进行配种繁殖，获得自动敲除标记基因的F1代个体。

8.由权利要求1或4所述的步骤3）筛选获得的阳性克隆细胞。

9.权利要求1-7任一项所述的方法在生产基因敲除克隆猪中的应用。

10.权利要求8所述的阳性克隆细胞在生产基因敲除克隆猪中的应用。