CN101407815A

CN101407815A - 甘氨酸n-甲基转移酶动物模型的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN101407815A
Application number: CNA2008100086736A
Authority: CN
Inventors: 陈宜民; 刘诗平
Original assignee: 陈宜民
Current assignee: Fama Technology Consulting Co., Ltd.
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2009-04-15
Anticipated expiration: 2028-01-29
Also published as: JP4855433B2; US20090035290A1; US20090148428A1; EP2020443A3; JP2011160805A; EP2020443B1; EP2020443A2; TWI345983B; TW200906441A; US7759542B2; US20100279897A1; JP2009034092A; CN101407815B; TW201141525A; EP2471913A1

Abstract

本发明是关于一种甘氨酸N－甲基转移酶(Glycine N－Methy ltransferas；GNMT)的基因剔除小鼠模型的制备方法，以及该小鼠在肝癌、肝糖储积症、肝脏发育不良、脂肪肝或者其它肝脏疾病的药物筛选、治疗方法测试及诊断标记找寻中的应用。

Description

甘氨酸N-甲基转移酶动物模型的制备方法及其用途

技术领域

本发明提供一种有关甘氨酸N-甲基转移酶(Glycine N-Methyltransferas；GNMT)的动物模型的制备方法及其应用。本发明进一步提供一种将GNMT产物应用于预防或治疗癌症的方法，以肝癌效果为佳。

背景技术

癌症又称为恶性肿瘤，是人体内一些不正常的细胞，因为生长速度快，而去影响及侵犯到正常的组织器官，导致出血、疼痛或器官功能丧失等症状。并会随着血液及淋巴转移，影响其它器官组织的疾病。

癌症是目前世界上最常见的、由于细胞异常所造成的人类疾病之一，也是现今人类死亡的主要原因之一。癌症是完全发展的肿瘤(又称恶性肿瘤)，其具有特殊的侵入及破坏基础间叶组织(mesenchyme)能力，例如：局部侵犯(localinvasion)，在某些案例中，侵入的肿瘤细胞可以在新形成的肿瘤内进一步产生淋巴管或者血管，然后可能将该肿瘤细胞运输至其它器官，而形成第二肿瘤(转移；metastasis)。肿瘤通常被认为是那些不再受到正常生长控制机制调控而因此发生异常生长的细胞，而该细胞可源于任何组织。除了癌症之外，肿瘤可以仅在原处发展而不成为恶性肿瘤，例如：良性肿瘤；或者，肿瘤细胞可以仅有癌细胞的形态学上的外表，但是其停留在原来的位置，例如：原位肿瘤，虽然在很多案例中该肿瘤常常发展成原位癌。

目前并没有诊断或者评估肿瘤恶性程度的绝对方法。在各种方法中，显微镜组织检查仍然是常规使用的最可靠的方法。在病理学研究方面，一个肿瘤可以根据其由显微镜检察所得知的组织学或细胞学上结构逆分化的程度(退行分化；anaplasia)来分级。但是，某些细胞可能失去了特定结构的特征，但是仍然保留分化上的生化特征，而其它细胞可能仍然表现结构上分化的样子但已失去其正常功能；另一方面，在同一区域的肿瘤细胞不一定都是同一等级的，因此，一个已发展的肿瘤可能包含多种不同的结构、功能、生长潜力、药物或X光抗性以及不同的侵犯和转移能力。上述两限制都降低了肿瘤组织检查的效力，再者，通过取样样本的检查也不适合大规模的检查。

长期以来，科学家们尝试过许多寻找恶性肿瘤绝对标记的方法，如试图确定肿瘤特定或者肿瘤相关的蛋白，然后直接测量或者用此蛋白发展专一性抗体，不仅提供诊断方法还进一步提供破坏癌细胞的策略，但这些技术都还在发展中。某些有关癌症的报导已经揭露许多物质在活体中与癌症有相关性，如肿瘤胎抗原(Oncofetal Antigen)，像α-胎甲球蛋白(Alpha-fetoprotein)；血清蛋白，像铁蛋白(Ferritin)；酶、多胺体(polyamines)、异构的荷尔蒙、细胞表面标志、受体或者肿瘤相关病毒抗原等，但是，大部分用于诊断癌症的方法主要还是根据前述的组织显微镜检查，目前仍缺乏癌症的绝对标记。

近年来的研究结果提供了寻找与癌化作用有关的物质的一些新想法：癌症的起因与许多基因的不正常表达有关，这些基因造成致癌基因的活化或是肿瘤抑制基因的不活化，此外，这些与致癌基因相关的基因其表现程度与正常细胞的差异性能够由信使RNA(messenger ribonucleic acid；mRNA)的表达量反映，为了从大量mRNA有效率地筛选出变异基因的mRNA，使用差异显示技术(Differential Display)可用来分离出一小部分的基因，其为正常细胞及肿瘤细胞在表现层面上不同的基因(Liang CancerResearch52，6966-6968，1992)。

肝癌(HCC)是世界的最普遍的癌症之一，肝癌通常由化学致癌物引起肝硬化和病毒感染从慢性发炎的肝疾病发展而成(Yu，M.W.et al.，Crit Rev.Oncol.Hematol.17，71-91，1994；Schafer，D.F.et al.，Lancet 353，1253-1257，1999；Williams，J.H.et al.，Am.J.Clin.Nutr.80，1106-1122，2004)。在某些地区(例如：中国和非洲)肝癌的形成主要归因于B型和C型肝炎，或是被黄曲毒素(aflatoxin)污染的食物，以及其它形式的黄曲毒素摄取(Williams，J.H.et al.，Am.J.Clin.Nutr.80，1106-1122，2004；Chen，C.J.，Hepatology 16，1150-1155，1992)。黄曲毒素是由曲菌属黄曲菌(Aspergillus flavus)及曲菌属寄生曲菌(Aspergillusparasiticus)在潮湿的环境下所产生的二级代谢产物，这些菌被发现普遍存在于像米这样的饮食的纤维、谷物、木薯、坚果、花生、辣椒和香料等上(McLean，M.& Dutton，M.F.，Pharmacol.Ther.65，163-192，1995)。

化学制品或者异种生物素(xenobiotics)等，例如黄曲毒素，在生物体内可能会在代谢过程中改变本身的性质，因而产生毒性。举例来说，在解毒路径(detoxification pathway)的第一阶段(phase I)中，细胞色素P450(cytochromeP450；CYP)异构酶(由多环芳香烃和氯化烃所诱发)会将一个氧原子加到受质上；此时生物活化作用(bioactivation)是偶发的并发现象(Hsieh，D.P.H.，ElsevierScientific Publishers，Amsterdam，1986；Hsieh，D.P.H.，Academic，Cambridge，1987；Aoyama，T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87，4790-4793，1990；Swenson，D.H.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.60，1036-1043，1974)，而解毒路径中的中间产物黄曲毒素B18，9-环氧化合物(epoxide)(由CYP异构酶，例如细胞色素P450IA2和P450IIIA4产生)对于很多动物是一种致癌因子；它能够与肝细胞的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)结合，此步骤被证明是在肝细胞癌化(hepatocarcinogenesis)中的关键步骤(Forrester，L.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87，8306-8310，1990；Koser，P.L.et al.，J Biol.Chem263，12584-12595，1988)。在第二阶段(phase II)反应中主要作用的酶是属于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)族，它们负责催化具有潜在毒性的亲电子化合物(electrophiles)与还原型谷胱甘肽(GSH)三胜肽接合，使其不具毒性(Degen，G.H.&Neumann，H.G.，Chem.Biol.Interact.22，239-255，1978；Hayes，J.D.et al.，Pharmacol.Ther.50，443-472，1991)。然而，该反应中的黄曲毒素B18，9-环氧化合物却会损坏DNA，其损坏原因主要是在活体内形成AFB¹-DNA加合物，更精确的来讲，为形成AFB¹-N7鸟嘌呤(guanine)加合物(Croy，R.G.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 75，1745-1749，1978；Kensler，T.W.et al.，Cancer Res.46，3924-3931，1986)。目前有至少两份研究指出AFB¹与DNA共价结合会引起p53第249碱基对G:C到T:A的转换(transversion)，是AFB¹造成变异的发生(mutagenesis)(Bressac，B.et.al.，Nature 350，429-431，1991；Hsu，I.C.et al.，Nature 350，427-428)。

甘氨酸N-甲基转移酶(Glycine N-Methyltransferas；GN MT)是一种细胞内的酶，能够将肝糖代谢为肌氨酸(sarcosine)，其代谢机制为：肝糖可通过GN MT从S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine；SAM)得到一甲基，肝糖就能转变成肌氨酸，肌氨酸能再被肌氨酸脱氢酶(sacrossine dehydrogenase)氧化转换回肝糖。在GNMT将肝糖代谢为肌氨酸的过程中会释放能量，并且SAM会失去一个碳原子成为腺甘高半胱胺酸(S-adenosylhomocysteine；SAH)，因此，GNMT在人体细胞内SAM与SAH的浓度调节中扮演很重要的角色。GNMT在大鼠肝脏中的特性指出它也能调节甲硫氨酸的新陈代谢以及SAM在组织中的浓度(Ogawa，H.et al.，J.Biol.Chem.，257：3447-3452，1982)，例如GNMT的活性随着饮食中甲硫氨酸的量而波动，且易被含有高甲硫氨酸的饮食所诱发。不过，GNMT被发现仅与体内20％的甲硫氨酸新陈代谢有关(Case et al.，J.Nutr.106：1721-1736，1976)，但是GNMT在成年大鼠或成年小鼠的肝脏中表达量非常多，几乎是肝脏中所有蛋白质的1％到3％(Heady et al.，J.Biol.Chem.，248：69-72，1973)。因此，GNMT可能有其它重要的生理功能，其中之一与从大鼠肝脏细胞质中纯化出的叶酸结合(folate-binding)蛋白相似((Cook，R.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3631-3634，1984)，最近，罗发(Raha)等人(J.Biol.Chem.，269：5750-5756)证明了GNMT是一种4S多环芳香碳水化合物结合(4Spolycyclic aromatic hydrocarbon-binding)蛋白，它能够与细胞色素P4501A1基因的5端侧边区域(5’-flanking)作用。

而且，GNMT是在肝脏细胞里的最丰富和有效率的甲基转移酶(methyltransferase)，GNMT的活性可以影响其它的甲基转移酶，例如，转运RNA(transfer ribonucleic acid；tRNA)甲基转移酶的活性可以被GNMT抑制(Kerr et al.，J.Biol.Chem.，247：4248-4252，1972)。来自各个实验室的研究结果指出抗脂肪肝(lipotropic)的化合物，例如SAM和它的前驱物：甲硫氨酸，胆碱及甜菜碱，能防止在大鼠或小鼠模型内各种致癌物引起的肝肿瘤的发展。由于GNMT在肝脏细胞里与SAM表现量高度相关，并且它的酶活性可能可以被SAM活化，因此，GNMT可能与肝癌形成机制有关(Pascale et al.，AnticancerRes.，13：1341-1356，1993)。

已有研究结果显示，在人类肝癌细胞株和肿瘤组织中，GNMT的表现量都有显著的下降(Liu，H.H.et al，J.Biomed.Sci.10，87-97，2003；Chen，Y.M.et al.，Int.J.Cancer 75，787-793，1998)。人类GNMT基因座落于染色体6p12并且有基因多形性(polymorphism)(Chen，Y.M.et al.，Genomics 66，43-47，2000)。人类的基因型分析显示出GNMT基因的基因多形性在肝癌组织中36％～47％的遗传标记(genetic marker)中缺少异型合子性(Tseng，T.L.et al.，Cancer Res.63，647-654，2003)，另外，亦有研究结果指出，GNMT参与苯并蒎(benzo(a)pyrene；BaP)解毒路径以及减少在有GNMT表现的细胞中的苯并芘环氧化合物-DNA加合物(benzo(a)pyrenediol epoxide-DNA；BPDE-DNA)产生(Chen，S.Y.et al.，Cancer Res.64，3617-3623，2004)。

先前的研究结果显示，有许多蛋白质能够与在大鼠肝脏细胞质中的黄曲毒素B¹(AFB¹)结合(Taggart，P.et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.182，68-72，1986)，而那些能够与AFB¹结合的细胞质中的蛋白质很可能作用于传送、代谢甚至活化致癌因子(Dirr，H.W.& Schabort，J.C.，Biochem.Int.14，297-302，1987)。

发明内容

本发明提供一种基因剔除小鼠的制备方法，是用基因重组的方法破坏所述小鼠染色体上GNMT的基因座，其中所述破坏位置位于SEQ NO.8的547-4875，所述基因剔除小鼠相较于野生型具有不正常的肝功能表现型。

其中，优选所述破坏位置位于GNMT基因的外显子1至4及外显子5的部分序列。

其中，所述基因剔除小鼠的表现型缺乏GNMT活性或其GNMT活性低于野生型小鼠。

其中，所述GNMT基因是利用与异源核酸序列重组的方式破坏。

其中，所述的异源核酸序列是抗新霉素的基因序列。

其中，所述的不正常肝脏功能包括SAM、ALT或AST的上升。

本发明还提供一种预测备选化合物对预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的治疗效果的方法，其包括下列步骤：

(1)以备选化合物对权利要求1制备的基因剔除小鼠给药，并且，

(2观察该基因剔除小鼠的肝功能变化。

本发明进一步提供一种筛选能预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的试剂的方法，其包括以下步骤：

(2)观察该基因剔除小鼠的肝功能变化，并且，

(3)挑选出能预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的试剂。

其中所述的其他肝脏疾病为肝糖储积症、肝脏发育不良或脂肪肝。

本发明还提供一种细胞，其由基因剔除小鼠制备，所述基因剔除小鼠的染色体上GNMT的基因座是用基因重组的方式破坏，其中所述破坏位置位于序列8的547-4875，所述基因剔除小鼠相较于野生型具有不正常的肝功能表现型。

其中，所述细胞为未分化的细胞群，如干细胞，胚胎干细胞或者胚胎细胞。

进一步的，本发明还提供一种预防或治疗黄曲霉素所引发的疾病的试剂，其含有有效剂量的GNMT蛋白质或含有GNMT基因的载体。其中，所述GNMT为双体或四体结构。其中，所述的黄曲霉引起的疾病为肝癌。

本发明在发明过程中发现GNMT基因的表现量是在正常细胞和肿瘤细胞中一个重要的区别。所以，本发明目标的其中之一是通过确定GNMT基因表现的相关水平提供一种异常(癌化)细胞的检测方法；此外，本发明的另一个目标是提供一种通过把GNMT转基因入异常细胞来修复细胞癌化的方法。

本发明提供一种非人类基因转移动物模型，其可用于筛选精神性药物，该基因转移动物已具有从基因层面改变的GNMT基因。对该基因的改变包括删除或者其它功能丧失的突变，或者植入外来基因其具有特定或者随机的突变的核苷酸顺序，或者植入一种其它种类动物的外来基因，或者可为上述各种方法的结合，而且该基因转移动物可以是同型合子或者异型合子。

目前已知，GNMT在经过AFB¹处理之后，会经历核转运现象，根据本发明的试验结果，AFB¹系与SAM竞争GNMT上同一个结合位置，而实验证据也显示增加GNMT的量可降低AFB¹-DNA加合物的形成以对抗AFB¹所引起的细胞毒性，并且可提高经AFB¹处理过的细胞的存活率。此外，由基因转移小鼠模型所显示的实验结果指出：GNMT的过量表现对于AFB¹所引发的肝癌具有预防作用。

本发明提供一种治疗因AFB¹引发之疾病的方法，其为提供病患有效数量的GNMT或者包含GNMT的载体，而此治疗方法以治疗肝癌为佳。目前，此治疗或预防的方法是阻止AFB¹-DNA加合物的形成。然而，对于基因治疗来说，载体可以是当今基因治疗技术直接注入患者体内的质粒疫苗。

本发明提供一种基因剔除小鼠，其染色体上GNMT的基因座已被利用基因重组的方式破坏，其中该破坏位于序列8之547-4875，该破坏造成一相较于野生型具有不正常肝脏功能的性状。

再者，本发明的创造性在于其以基因重组破坏的GNMT核酸序列位于外显子(exon)1-4部分的外显子5。本发明的基因剔除小鼠缺乏GNMT活性的表现型(phenotype)是因为相较于野生型小鼠其有较少的成熟GNMT蛋白质表现数量。在本发明的基因剔除小鼠的制备过程中，GNMT基因通过与外来的核酸序列(例如：新霉素)重组而遭到破坏。此处的专有名词”肝功能异常”(abnormal liverfunction)包含但不限于SAM、ALT或者AST表现量的升高。

转基因动物(TRANSGENIC ANIMALS)

“转基因”(transgene)一词此被用于描述一遗传物质被人工插入一哺乳动物的细胞的染色体中，特别是指一活体哺乳动物的细胞。转基因是用来转化(transform)细胞，利用与外来DNA的结合造成一种永久或者暂时性的遗传(genetic)变化，尽可能一种永久的基因型变化。永久的遗传变化一般是利用注入一种DNA到细胞的染色体而实现。能够稳定携带遗传物质至宿主细胞的载体包括质粒(plasmid)、反转录病毒(retrovirus)和其它动物病毒或是人工酵母菌染色体(yeast artificial choromosome；YAC)等等。目前常用于转基因的哺乳动物包括牛、猪、山羊、马以及最常使用的啮齿类动物如大鼠、小鼠等等。

转基因动物包括一种表现如自身染色体或是稳定融合入该动物所有或是部分细胞，尤其是生殖腺细胞的外来核酸序列。除非另作指出，否则将转基因动物将被认为包含有生殖腺细胞核酸序列的稳定变异。在一开始建立该动物的时候，先制作出”嵌合体”(chimera)，或是称为”嵌合动物”(chimera animal)，其中只有一部份的细胞具有被改变的基因，培育嵌合体的主要目的是为了产生目标的转基因动物，当嵌合体的培育产生一具有异型合子的基因变异的动物时，雄性和雌性异型合子通常被用于繁殖产生同型合子的转基因动物。

转基因动物分成两组，一般称之”基因剔除动物”(knockouts)和”基因楔入动物”(knockins)。本发明所提供的基因剔除动物的GNMT基因在其中一个或两个对偶基因(allele)上有部分或完整功能丧失；基因楔入动物是有加入一已改变序列或功能的内生基因的转基因动物，此两动物模型可以结合以供研究使用，如同病人先天上在基因型具有缺陷或者变异。

在基因剔除的过程中，尽可能使目标基因的表现量降低至无法探测或是无显著意义。GNMT的基因剔除代表GNMT基因的功能已经被实质上减少，因为其表现量已降低至无法探测或是无显著意义。此目的可由多种途径达到，包括加入一个破坏性的序列至目标基因，例如：插入一个或多个的终止码(stopcodon)、插入一DNA片段、删除部分的目标基因序列或是利用终止码代替目标基因的一般密码子等等，而在某些例子中，外来的基因转移序列最终会被删除，留下已被改变的原序列。另外，还有许多不同的方法可以用来达到”基因剔除”的效果，例如一原基因所在的染色体部分或全部的删除，包括非密码(non-coding)区域的删除，尤其是启动子(promotor)区域、3端调节(regulatory)序列、增强子(enhancer)或是删除某些能够活化GNMT表现的基因。

有效的”基因剔除”也可以用给动物。反义(anti-sense)人造核苷酸来阻止目标基因的表现。此外，“基因剔除”也包括”条件式基因剔除”(conditionalknock-out)，例如将动物暴露于可以促使目标基因变异的物质下而发生目标基因变异、加入一个可以促使目标基因重组的酶(例如Cre-lox系统中的Cre)或其它可在动物出生后(postnatal)引导目标基因变异的方法等。

在本发明中，目标基因的“基因楔入”意为：宿主细胞的染色体改变导致GNMT的表现量或是功能发生变异。于动物的染色体额外加入一份(copy)的目标基因可以提升(包括外加的；ectopic)或者降低该目标基因的表现量，或是以人工插入，可提升或降低内生(endogenous)目标基因表现量的调节序列，例如活化子(activitor)与抑制子(represser)，亦可改变目标基因的表现量。而上述变异可以是组成性的(constitutive)或者有条件性的。

通常用于转基因的外来基因是来自于与宿主不同种类的动物，或者以其它方法改变其密码子或非密码子，用于载体构建(construct)的基因可以是一野生型而具有基因多形性(polymorphism)的基因，或者是一人工造成变异的基因，例如在密码子或非密码子区域删除(deletion)、取代(substitution)或者插入(insertion)部分序列，用于载体构建的基因可以是GNMT的基因。此外，当用于载体构建的基因是一个密码子序列时，其通常会以”可操作的连结”(operably linked)接着一个启动子或者其它目标基因表现时需要的调节序列。”可操作的连结”意为：核酸序列或者调节序列以适当的两段序列结合而能使基因表现，例如转录活化蛋白(transcriptional activator protein)与调节序列的连结。

本发明可用于载体构建的目标基因包含但不限于能抑制GNMT表达的反义GNMT基因、GNMT负面显性突变的序列(dominant negative mutation)以及能造成GNMT的过量表达的序列，而上述的序列通常会加入一个可探测的标记(marker)(例如：lac Z)，其过量表达会造成易于探测的表现型改变。

GNMT基因中，不同外显子的功能可以利用一系列的小量序列删除和/或替代来判定，例如制造提供DNA结合的蛋白质的外显子，或是制造转录调节蛋白的外显子等等。另外，提供给平常不表达或是不正常表达GNMT的细胞GNMT蛋白质，可能可以造成该细胞的行为改变，亦可据此来了解完整GNMT或者GNMT部份外显子的功能。

用于载体构建的基因可以包含至少一部分具有预期修饰的GNMT基因片段，与一部分和目标基因座(locus)相同(homology)的区域，以便插入正确区域。而随机插入性的重组DNA建立并不需要包含上述和目标基因座相同的部分来控制插入位置。另外，构建包含有正向和负向筛选标记(selection marker)的载体，能使筛选出含有目标基因的细胞较为方便，是在此技艺中为人熟知的。

对于胚胎干(embryonic stem；ES)细胞来说，单一ES细胞株，或者从活体宿主(例如：小鼠、大鼠、天竺鼠等)身上取得的胚胎细胞都可被应用。上述细胞培养时以适当的纤维母细胞作为喂养细胞，或是以适当的生长因子培养，例如：白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor；LIF)。当ES细胞发生转化(transform)时，便可以用来生产转基因动物。

在形变之后，细胞被培养在一含有适当培养液(medium)的喂养层(feederlayer)上，包含该目标载体的细胞可以过提供依选择性培养液(selection medium)而被探测到。经过足够的培养时间，使该含有目标载体的细胞群落(colony)成长，便可挑出细胞以供分析该目标载体的重组方式或是插入方式，以确认该目标载体是否包含本发明所需的序列，若包含本发明所需的序列，则该载体可用于胚胎处理(embryo manipulation)和囊胚注射(blastocyst injection)，囊胚可由经过超级排卵(superovulate)处理过的4到6周大的母鼠取得，ES细胞经过胰蛋白酶(trypsin)处理过后便注射入囊胚腔(blastocoel)，注射之后，将囊胚送至假孕(pseudopregnant)的代理孕母的的子宫角(uterine horn)，代理孕母便可进入怀孕期，所繁殖出的后代(resulting litter)经过筛选后便可得知是否带有含目标载体的突变细胞，若目标载体能给予囊胚或是ES细胞不同的表现型，该后代便可以很容易的被探测到。

另外，本发明进一步提供一种细胞或者细胞株，其为从本发明的基因剔除小鼠制备而得。在较佳的实施方式中，该细胞或者细胞株是从其细胞群集中挑出的未分化者，例如：干细胞、胚胎干细胞、卵母细胞(oocyte)或者胚胎细胞。

前述的嵌合动物会经过是否表现被修饰的基因及是否由含有被修饰的基因的父母所产生的同型合子的筛选。若该基因变异会在发育过程中造成死亡(lethality)，该动物的组织或者器官仍可作为同种异体(allogeneic)或是同基因型(cogenic)的移植，或是体外培养。

本发明之发明人感兴趣的核酸序列，其介于起始密码子与终止密码子之间，包含所有正常表现于野生型动物染色体的内含子，该序列可能进一步包含在成熟(mature)mRNA中发现的3端到5端未转译区域，或者专一性的转录调控序列(transcriptional regulatory sequence)或转译调控序列(translationalregulatory sequence)(例如：启动子、增强子等等)，或者染色体侧翼区3端或5端(约1Kb或者大于1Kb)的转录区域。然而，该序列可能被孤立为一100Kb或者更小的片段，并且实质上不位于染色体侧翼区。

本发明进一步提供一种筛选预防或治疗肝癌或其它疾病的候选试剂(agent)的方法，其包含：

1.一种基因剔除小鼠；

2.提供给该基因剔除小鼠一种候选试剂；及

3.比较已提供受试药物及未提供候选试剂的基因剔除小鼠的肝脏功能，其中该候选试剂若能改善肝脏功能，则可被筛选出为预防或治疗肝癌或其它疾病的有效试剂。

通过转基因动物或者其细胞的使用，可鉴定与GNMT多肽链接合的配体(ligand)或受质的功能为调节(modulate)、对抗(antagonize)或者促进(agonize)等等。筛选对GNMT多肽链没有影响的试剂也是本方法的应用之一，例如：用于筛选对人类毒性较低的试剂。

目前有许多分析可用于此目的，包括试剂的活体内行为研究、服用后试剂的体内定位、体外的蛋白质-蛋白质结合分析、蛋白质-DNA结合分析、电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay；EMSA)、蛋白质免疫结合分析等等，根据不同的分析方法，可能会用到整只动物体或者只用到其细胞，当需要用到其细胞时，该细胞可从活体内取出，或者从以获得永生(immortalized)生长能力的细胞株取出，其中优选的细胞为从脑组织或神经组织中取出的细胞。

该专有名词”试剂”(agent)在本说明书中意指所有分子，例如：蛋白质或其它药物性分子，其具有影响GNMT多肽链在生物体内的任何活动行为的能力的试剂。通常来说，实验者会同时利用许多分析，并且以不同浓度的试剂来测试，并且会有设定一个浓度做为负向控制组，例如：浓度为0或是一个低到无法探测的浓度。

在较佳的实施方式中，该试剂是用于预防或治疗肝癌、肝糖储积症、肝发育不良或者脂肪肝等。

上述的候选试剂包括许多化学制剂，其大部分为有机分子，且较佳为50至2500道尔顿的小分子，候选试剂具有能与蛋白质在结构上交互作用的必要官能团(founction group)，尤其是能形成氢键的官能团，例如：胺基(amine)、羰基(carbonyl)、羟基(hydroxyl)以及羧基(carboxyl)等等，其中以羟基及羧基最易形成氢键。候选试剂也可以从(但不限于)下列生物性分子中寻找：多肽链、糖类、脂肪酸、固醇类、嘌呤、嘧啶等，及生物性分子的衍生物、结构类似物(analog)或其组合物等。

该候选试剂可从许多途径取得，包括各种合成或天然的化合物，例如用各种化学合成方法取得，像是寡核苷酸(oligonucleotide)或寡肽链(oligopeptide)；或是由细菌、真菌、植物，或动物体内萃取得来。此外，化学合成或自然产生的候选试剂可以被化学、物理或生化方法来修饰，例如酰基化(acylation)、烷化(alkylation)、酯化(esterification)以及酰胺化(amidification)等等，可用于产生结构类似物。

通过筛选，可直接了解具药物活性的化合物及其化学类似物，而本发明所提供的方法主要可应用但不限于已知抗肝癌药物或其它具显著保肝(hepatoprotective)效果的药物。

本发明进一步提供一对引物(primer)以用于制造于基因剔除小鼠，其为(1)SEQ ID 1和2或(2)SEQ ID 3和4。

本发明进一步提供一个GNMT基因剔除小鼠的调节基因数据库，包含上调节(up-regulatory)和下调节(down-regulatory)。

本发明进一步提供一个肝癌讯息传递基因数据库，其包含：

1.有关生存及生长(proliferation)的基因：PTEN、PI3K、Akt1、GSK3β或β-连锁蛋白

2.致癌基因：Cyclin D1、C-myc者C-Jun；及

3.肿瘤抑制基因：Rb者p53。

其中PTEN(phosphatase and tensin homolog)为同源性磷酸酶及张力蛋白；PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)为磷脂酰肌醇-3-激酶；GSK3β(glycogen synthase kinase)为肝糖合成酶；Rb(retinoblastoma)为视网膜母细胞瘤蛋白。

本发明进一步提供一组合物，其包含GNMT蛋白质与药物或食物性载体，可用于预防或治疗AFB¹所以起的疾病，在较佳的实施方式中，GNMT是以双体(dimeric)或者四体(tetrameric)的形式使用。

本发明所提供的组合物可应用作为一般食物添加物(例如米、谷物、木薯、坚果、花生、辣椒或香料等)。

本发明的应用不限于上述的任何特定方法、配方、细胞株、实验动物、构建的载体、试剂等等，本领域的技术人员皆可做适当的变化，所作的变化仍属于本发明的保护范围。另外，本说明书中所使用到的专有名词仅为描述特定的实施方式，其并不限制本发明应用范围。

本说明书中所使用到的任何专有名词，除非另行做定义，否则其意义皆与本发明所属技术领域相关的技术人员所理解的专有名词相同。同时，本说明书所记载的实施方式仅揭露实行或测试本发明较佳的方法、器材和材料，但是任何相似或等同于本说明书所所记载的实施方式揭露的方法、器材和材料皆可用于实行或测试本发明。

本说明书所有提及的参考文献皆用于描述或揭露与本发明所属领域相关的知识，例如：细胞株、载体构建及各种方法等，且该参考文献皆于本发明申请日之前单独揭露其所属领域相关的知识，因此本发明的技术及发明成果并非显而易见。

下列的实施方式用于解释和详细介绍本发明，但并不限制本发明的应用范围。本发明的实施方式已尽力使所有实验数据(例如：数量、温度、浓度等)达到最精确，但是仍然具有许多不可抗的因素所产生的误差，该误差是被允许的。另外，除非另作解释，否则本发明所提及的百分比皆为重量百分比、分子量皆为平均分子量、温度皆为摄氏温度以及压力皆为位于大气压力下所计算的压力。

附图说明

图1为目标质粒构建的流程图，10为TK载体；11为λ噬菌体殖株3-2；20为pNeo载体；50为已接合右段(right arm)的TK载体；60为已接合左段(left arm)的pNeo载体；70为完成的目标载体；80为目标载体的直线型。

图2为GNMT基因座重组修饰概要说明图，(90为原内生等位基因；100为目标等位基因)：

(A)目标质粒被设计为以抗新霉素(新霉素)基因置换GNMT外显子1-4及部份外显子5。正向选择(positive selection)指标抗新霉素基因夹于两GNMT同源区域之间，整个GNMT同源区域的3端尾端接着一个负向选择(negativeselection)指标胸苷激酶(Thymidine Kinase；TK)。

(B)胚胎干细胞的Southen杂交分析。由BamHI-BamHI限制酶酶切而得的脱氧核糖核酸(DNA)片段由7.9kb(kilo base pair)减小至5.3kb。

(C)GNMT基因剔除小鼠基因型的聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction；PCR)分析。正常GNMT基因产生一772bp(base pair)的DNA片段，被破坏的GNMT基因产生一个409bp的DNA片段。+/+为野生型；+/-为GNMT异型合子；-/-为GNMT-/-同型合子。

(D)GNMT蛋白质表现量之Western杂交分析。每条泳道含有10微克的肝脏细胞(lysate)。GNMT蛋白质重量为32千道耳吞(KDa)。甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphotate dehydrogenase；GAPDH)为本实验的内部控制变因(internal control)。

图3为参与单碳代谢途径的基因在信使RNA(messenger ribonucleic acid；mRNA)层面表现量的定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)分析柱状图，图中WTM代表野生型雄性小鼠；KOM代表GNMT-/-同型合子雄性小鼠；KOF代表GNMT-/-同型合子雌性小鼠。单星号处(^＊)P值小于0.05。Ahcy为S-腺同半胱胺酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase)；Ms为甲硫胺酸合成酶(methionine synthase)；Cbs为胱硫醚贝塔合成酶(cystathionine beta-synthase)；Mthfr为5，10甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase)；Mthfdl为甲基四氢叶酸去氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase)；Aldh1l1为醛类去氢酶(aldehyde dehydrogenase)家族的L1成员；Atic为5-胺基脒脞-4-羧盐胺核糖核苷酸甲酰基转移酶/肌核苷单磷酸盐环化水解酶(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMPcyclohydrolase)；Shmt2为丝氨酸羟甲基转移酶2(serine hydroxymethyltransferase 2)；Mthfs为5，10甲基四氢叶酸合成酶(5，10-methenyltetrahydrofolate synthetase)；Ftcd为亚氨甲基转移酶环化脱胺酶(formiminotransferase cyclodeaminase)。

图4显示出GNMT-/-同型合子小鼠在肝脏血清中的丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase；ALT)蛋白质表现量有显著增加。(A)肝脏重量与体重的比例(B)野生型小鼠、GNMT+/-异型合子小鼠与GNMT-/-同型合子小鼠的ALT蛋白质表现量。单星号处(^＊)P值小于0.05；双星号处(^＊＊)P值小于0.05。(图中Wild type mice即为野生型小鼠；GNMT+/-mice即为GNMT+/-异型合子小鼠；GNMT-/-mice即为GNMT-/-同型合子小鼠)

图五为野生型小鼠与GNMT-/-同型合子小鼠肝脏切片比较图，肝脏切片来自于(A)野生型雄性小鼠、(B)GNMT+/-异型合子雄性小鼠、(C)GNMT-/-同型合子雄性小鼠及(D)GNMT-/-同型合子雌性小鼠。所有小鼠在牺牲之前都经过节食八小时。肝脏组织切片的苏木紫-伊红染色(H-E Stain)如(E)及(I)为11周大野生型雄性小鼠；(F)及(J)为GNMT+/-异型合子雄性小鼠；(G)及(K)为GNMT-/-异型合子雄性小鼠；(H)及(L)为GNMT-/-同型合子雌性小鼠；以及(Q)9个月大的GNMT-/-同型合子雄性小鼠与(S)9个月大的GNMT-/-同型合子雌性小鼠。肝脏组织切片的过碘酸希夫氏染色(Periodic Acid-Schiff；PAS Stain)如(M)为11周大野生型雄性小鼠；(N)为11周大野生型雌性小鼠；(O)为GNMT-/-同型合子雄性小鼠；以及(R)9个月大的GNMT-/-同型合子雄性小鼠与(T)9个月大的GNMT-/-同型合子雌性小鼠。(P)为无效实验数据，(E)至(H)的放大倍率为100倍；(I)至(T)的放大倍率为400倍。

图6为野生型小鼠与GNMT-/-同型合子小鼠之肝脏血液分析图。

(A)野生型小鼠(实心圆)与GNMT-/-同型合子小鼠(空心圆)的白细胞(whiteblood cell)、嗜中性粒细胞(neutrophils)、嗜酸性粒细胞(Eosinophile)、嗜碱性粒(basophlis)、淋巴细胞(lymphocyte)及单核细胞(monocyte)的细胞数目，水平杆(horizontal bar)为平均数目。

(B)野生型小鼠(实心圆)与GNMT-/-同型合子小鼠(空心圆)的血清中葡萄糖(glucose)、胆固醇(cholesterol)及三酸甘油脂(triglyceride)的浓度，水平杆为平均浓度。单星号处(^＊)P值小于0.05；双星号处(^＊＊)P值小于0.05，两者皆与野生型小鼠比较。(图中GNMT-/-mice即为GNMT-/-同型合子小鼠)

图7为与肝糖储积症(Glycogen Storage Disease；GSD)相关蛋白质的mRNA层面表现量的定量PCR(real-time PCR)分析柱状图。图中的mRNA表现量都将野生型小鼠定为1.0做为基准来比较。

(A)11周龄的大鼠；(B)9个月龄的大鼠。单星号处(^＊)P值小于0.05；双星号处(^＊＊)P值小于0.05。Gys2为肝糖合成酶2(glycogen synthase 2)；G6Pase为6-磷酸葡萄糖磷酸酶(glucose-6-phosphatase)；G6PT为6-磷酸葡萄糖磷酸酶运输蛋白(transporter)；Gaa为α-葡萄糖酶(α-glucosidase)；Agl为淀粉1，6糖甘酶(amylo-1，6-glucosidase)；Gbe1为分支酶1(branching enzyme 1)；Pygl为肝糖磷解酶(glycogen phosphorylase)；Phka2为磷解酶激酶a2(phosphorylase kinase a2)；Fbp1为果糖1，6双磷解酶(fructose 1，6-bisphosphatase)；以及PEPCK为磷酸酰醇丙酮酸羧基激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)。

图8为雄性和雌性GNMT-/-大鼠的超音波、核磁共振摄影(MRI)，H-E Stain和网硬蛋白染色(reticulin stain)分析图。(A)与(G)分别为雄性与雌性GNMT-/-大鼠的肝脏超音波分析结果；(B)、(C)与(H)、(I)分别为雄性与雌性GNMT-/-大鼠的肝脏MRI分析结果；(D)与(J)分别为雄性与雌性GNMT-/-大鼠的肝脏解剖；(E)与(K)分别为雄性与雌性GNMT-/-大鼠的肝脏H-E Stain分析结果；(F)与(I)分别为雄性与雌性GNMT-/-大鼠的肝脏和网硬蛋白染色分析结果。

图9为野生类型和GNMT-/-大鼠早期肝癌诊断标志-聚糖蛋白3(glypican-3)、淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(LYVE1)、凋亡抑制蛋白(survivin)和甲胎蛋白(α-fetoprotein)的定量聚合酶连锁反应分析柱状图。

图10为(A-B)GNMT经过黄曲毒素B1的处理后的核转运现象(nucleartranslocation)。(A)为HA22T细胞经过使用5μg GNMT-Flag质粒的转染并溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide；DMSO)溶液中固定，或者(B)在被固定之前先加入40μM的黄曲毒素随后与R4(兔子抗GNMT之抗体)血清反应。免疫染色法(immunofluorescent)使用与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的山羊抗兔子抗体，细胞核则利用Hoechst H33258染色。Bars为20M。(C至E)为苯并蒎(benzo(a)pyrene；BaP)以及黄曲毒素B1(AFB¹)利用拉马克(Lamarckian)遗传算法推测出与GNMT四级结构的对接(docking)方式。(C)为BaP(绿色)及AFB¹(红色)分子与大鼠的具有与S-腺苷同半胱胺酸(S-adenosylhomocystine)结合的形式的GNMT四级结构(cyan)(PDB代码1D2H)的对接方式。(B)为一单体显示BaP(绿色)及AFB¹(红色)分子。根据GNMT结构(PDB代码1D2H)与GNMT-AFB¹的对接方式模型指出：GNMT中的几个氨基酸残基(Ala64，Val69，Leu136，Gly137和Ser139)与许多AFB¹碳原子位置极为接近。(E)为AFB¹(左)及BaP(右)的结构。

图11显示GNMT能对抗(antagonize)AFB¹的细胞毒素(cytotoxicity)。(A至C)为GNMT的过量表达(overexpression)降低了AFB¹所引起的细胞毒性。此分析系利用细胞活性测试(MTT Assay)来确定AFB¹处理过的HuH-7细胞的生存百分比。(A)为HuH-7细胞在一系列时间点用不同量的AFB¹处理的存活曲线。50％的抑制性浓度是根据处理时间而定的。AFB¹在HuH-7细胞上作用72小时的50％抑制性浓度(IC50)大约为12M。(B)为利用带有GNMT基因或是控制组绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒感染16小时的HuH-7细胞，经过AFB¹处理72小时后，再由MTT assay测试。HuH-7细胞的存活率随着GNMT重组腺病毒(Ad-GNMT)的剂量的增加而稍微增加；在用8M AFB¹处理的HuH-7细胞中，HuH-7细胞的存活率随着Ad-GNMT的剂量的增加而显著增加。(C)相同的结果在另一个测试系统中亦被发现：HuH-7细胞通过一个慢病毒载体(lentiviral vector；LV)将GNMT基因转入(transduct)。单星号处(^＊)P值小于0.05；双星号处(^＊＊)P值小于0.05。(D至E)为GNMT的过量表达降低了AFB¹DNA加合物(adduct)的形成。(D)SCG2-neg和SCG2-1-1细胞利用DMSO处理或者在萃取DNA显示AFB¹的浓度。AFB¹-DNA加合物以竞争性酶连结免疫吸附分析(enzyme-link immunosorbent assay；ELISA)测量。白色长条和灰色长条分别代表SCG2-neg和SCG2-1-1。数据以平均±标准差表示。单星号处(^＊)P值小于0.05；双星号处(^＊＊)P值小于0.05。(E)为利用附加GFP重组腺病毒(Ad-GFP)和Ad-GNMT感染的GNMTHepG2细胞来执行分析。白色长条指出Ad-GNMT感染的HepG2细胞；灰色长条指出5MOIAd-GNMT感染的HepG2细胞；黑色长条指出50MOI Ad-GNMT的HepG2细胞。单星号处(^＊)为利用单因子变异数分析(One-way ANOVA)。

图12说明GNMT-转基因(transgentic；TG)小鼠和野生型小鼠体内GNMT表达的时间和酶的活性。(A)图中，1(中空菱形)为野生型雄性小鼠体内GNMT蛋白质表现水平；2(实心菱形)为GNMT-TG的雄性小鼠；3(中空正方形)为野生型雌性小鼠及4(实心正方形)为GNMT-TG的雌性小鼠，以上以为Western杂交分析(上排组合)以定量数据(下排组合)来确定表达量。结果显示GNMT-TG的动物比在5周大之前野生类型有更多的GNMT蛋白质表现量。(B)为在1野生型雄性；2GNMT-TG雄性；3野生型雌性和4GNMT-TG雌性之间比较GNMT的酶活性。

图13为4组雄性小鼠肝脏的H-E stain和免疫组织化学染色(Immunohistochemical Stain；IHC stain)以及通过H-E stain染色的致癌物处理过的小鼠肝脏显微照片。(A)为AFB¹处理过的野生型小鼠，倍率为放大200倍；(B)为用AFB¹处理的GNMT-TG小鼠，倍率为放大200倍。GNMT表现在以石蜡油固定的组织内以IHC stain来分析，(C)为AFB¹处理过的野生型小鼠，倍率为放大200倍；(D)为用AFB¹处理的GNMT-TG小鼠，倍率为放大200倍。(E)为从非肿瘤组织(N)以及肿瘤组织(T)中抽提的细胞萃取物Western杂交分析，结果显示在肿瘤组织里的GNMT表达量比在其它三组小鼠的非肿瘤的组织低。

图14为pPEPCKex-flGNMT质粒的构建。(A)pPEPCKex(载体)以及pSK-flGNMT(插入片段)以限制酶Not I及Xho I酶切后再黏合以构建pPEPCKex-flGNMT。(B)野生型小鼠或GNMT-TG小鼠内生(endogenous)的和人类的GNMT mRNA在各种器官内的表达量以Northen杂交分析。(1)GNMT-TG小鼠的肾脏RNA；(2)GNMT-TG的小鼠肝脏RNA；(3)野生型小鼠的大脑RNA。(4)野生型小鼠的肾脏RNA。(5)野生型小鼠的肝脏RNA。结果显示GNMT-TG小鼠在肝脏和肾脏里有表现人类GNMT基因(transgene)。

附图标记说明：

10：TK载体；

11：λ噬菌体殖株3-2；

20：pNeo载体；

50：已接合右段(right arm)的TK载体；

60：已接合左段(left arm)的pNeo载体；

70：目标载体；

80：目标载体的直线型。

90：原内生等位基因

100：目标等位基因

具体实施方式

实施例一

如图1所示，本发明利用λ噬菌体植株(clones)3-2和5-3的DNA片段插入plasmid-pBluescrip II KS中来构建目标载体，左段(left arm)部分为通过限制酶Pst I从λ噬菌体殖株5-3酶切并插入pNeo载体；右段(right arm)部分为通过限制酶Hinc II从λ噬菌体殖株3-2酶切并插入TK载体，再利用限制酶Not I酶切包含右段部分和TK基因的片段插入带有左段部份的pNeo载体，进而产生目标载体。

抗新霉素基因(用于替换小鼠GNMT基因外显子1-4和部份外显子5)在目标载体中被夹于两段DNA片段(3.1kb和3.7kb)之间，胸苷激酶(thymidinekinase；TK)基因被作为负向选择标记(如图2中A图所示)。利用限制酶Ascl将40微克的目标载体线状化(linearize)后利用电穿孔法(electroporation)送入胚胎干细胞(129/Sv-衍生品系)，经过Southen杂交筛选278个胚胎干细胞殖株后(如图2中B图所示)，得到一个目标殖株，该目标殖株被分离后利用显微注射注入囊胚，获得4只雄性嵌合小鼠，并且用其繁殖雌性小鼠(C57BL/6品系)。本实验利用PCR探测刺鼠(Agouti)的第一子代(F1offspring)是否具有该受破坏基因的性腺遗传能力(germline transmission)，将同型合子的F1雄性小鼠与野生型雌性小鼠(C57B/6品系)回交(backcross)后产生品系C57BL/6的小鼠。

PCR技术被用于分辨+/+野生型小鼠、GNMT+/-异型合子小鼠及GNMT-/-同型合子小鼠，并使用下列引物：

对探测GNMT基因使用

GNMT-F(5-′GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC)及

GNMT-R(5′TTGCAGTCTGGCAAGTGAGC)；

对探测抗新霉素基因使用

新霉素-F(5-′GTTCCTTGCGCAGCTGTGCT)及

新霉素-R(5′CGGCCACAGTCGATGAATCC)

利用上述的GNMT引物，正常的GNMT等位基因会产生一772bp的片段；而利用上述的新霉素引物，被破坏的GNMT基因产生一个409bp的片段(如图2中C图所示)。

利用Western杂交分析肝脏中的GNMT蛋白质表现量，相较于野生型小鼠的表现量，GNMT+/-异型合子小鼠的表现量约减少了50％，而GNMT-/-同型合子小鼠的表现量低至无法探测(如图2中D图所示)。

牺牲11周龄大的小鼠用以做表现型分析，其包含雄性和雌性的野生型、GNMT+/-异型合子、GNMT-/-同型合子(每组大于等于6只小鼠)。利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography；HPLC)分析肝脏中SAM和SAH的浓度。相较于相同性别的野生型小鼠，雄性及雌性GNMT-/-同型合子小鼠肝脏中的SAM浓度都有显著的增加(P值小于0.05)；反之，GNMT+/-异型合子小鼠肝脏中的SAM浓度比野生型小鼠低2.8倍，而雄性或雌性GNMT-/-同型合子小鼠肝脏中SAH的浓度与野生型小鼠的差不多。因此，SAM/SAH比值在雄性及雌性GNMT-/-同型合子小鼠的肝脏中分别增加42倍和67倍(如表1所示)。高半胱氨酸的量6组小鼠中都没有显著变化，甲硫胺酸的量则是在GNMT-/-同型合子小鼠中相较于野生型多了1.9至2.4倍。

表1野生型和GNMT基因剔除小鼠肝脏内SAM、SAH、高半胱氨酸和甲硫胺酸的浓度比较。

^＊(注)：浓度为每克肝脏中含有的纳摩尔数(nmol)

^＊＊(注)：浓度为每100毫升含有的毫克数(mg/dl)

为了解在GNMT-/-同型合子小鼠中肝脏肿瘤的自然生成情况，在其12个月大后，本发明利用核磁共振(MRI)及超音波每两周追踪一次其表现型，在7只雌性GNMT-/-同型合子小鼠中，全部都有大于0.5公分的肝脏肿瘤生成(平均生成年龄为16.1个月)，相较之下，在6只我们已追踪观察21个月的雄性GNMT-/-同型合子小鼠中，2只有肝脏肿瘤、2只在13个月大时死亡，因此，在14至15周大的雌性小鼠中，有50％(1/2)的小鼠有肝脏肿瘤生成，在21至22周大时，有100％(6/6)的生成率，而在雄性GNMT-/-同型合子小鼠中，在18至21个月大的小鼠中有75％(3/4)产生肝脏结节。以上结果指出在雌性小鼠中肝脏肿瘤的自然生成比在雄性小鼠中更严重，此外，有37.5％(3/8)的雌性小鼠产生血管瘤，所有的雌性小鼠皆产生脂肪变性但只有1/3的雄性小鼠有产生脂肪变性(结果如表2所示)。

表2GNMT-/-同型合子小鼠在13至21个月大时肝脏肿瘤形成的状况

a.处死小鼠以供实验。

b.在18周大时，有2只雄性小鼠的肿瘤结节小于0.6公分，一只雄性小鼠没有肿瘤结节。

c.此两只小鼠过于瘦弱而无法产生肿瘤结节。

d.此小鼠在进行MRI检查时，因麻醉而死亡。

e.在21周大时，被超声波探测到一个0.5公分大的肝脏结节。

f.在18周大时并没有被探测到任何结节。

g.在18周大时被探测到1个结节。

h.资料不足。

利用微阵列(Microarray)基因分析来观察GNMT基因剔除小鼠与野生型小鼠之间新陈代谢的差别，在雄性GNMT基因剔除小鼠有1896个基因在mRNA层面上较野生型表现的多；而在雌性GNMT基因剔除小鼠有2429个基因在mRNA层面上较野生型表现的多。在这些基因当中，雄性与雌性的分别有543与843个基因表现量差异达到2倍以上，其被选择出做更进一步的测试。上述基因系利用CrossPath程序(http://ibs.sinica.edu.tw/crosspath/)藉由参考KEGG反应路径料库来对其功能进行分类。表格3及表格4依其反应路径分类显示有多少基因表现量差异在2倍以上，根据该表格，在雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠中mRNA表现量增加最显著的为参与PPAR讯息传递路径及细胞周期的反应路径的基因。

另外，细胞素(cytokine)-细胞素受器的作用和MAPK讯息传递路径的基因表现量在雌性和雄性GNMT基因剔除小鼠中都是减少的。表5显示利用real-time RCR分别分析在不同讯息传递路径、不同组织中，GNMT-/-同型合子小鼠与相同年龄的野生型小鼠其基因mRNA表现量的比值。该结果显示：在GNMT-/-同型合子小鼠中，有许多与生存和生长相关的基因mRNA表现量显著的降低，而有三个致癌基因mRNA表现量显著提升。

表3(A)11周大的雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠，在特定分类中，mRNA表现量增加的基因个数。(此表参考KEGG反应途径数据库来对其功能进行分类)

^＊(注)：其个数为GNMT基因剔除小鼠与野生型小鼠mRNA层面表现量差异在2倍以上的基因个数。

表格3(B)14至18周大之雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠的肿瘤和肿瘤邻近组织在特定分类中，mRNA表现量增加的基因个数。(此表参考KEGG反应途径数据库来对其功能进行分类)

^＊(注)：其个数为GNMT基因剔除小鼠与野生型小鼠的肿瘤和肿瘤邻近组织中mRNA层面表现量差异在2倍以上的基因个数。

表格4雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠，在特定分类中，mRNA表现量降低的基因个数。(此表参考KEGG反应途径数据库来对其功能进行分类)

^＊(注)：GNMT基因剔除小鼠与野生型小鼠的mRNA层面表现量差异在2倍以上的基因个数。

表5利用real-time RCR分别分析在不同讯息传递路径、不同组织中，GNMT-/-同型合子小鼠与相同年龄的野生型小鼠其基因mRNA表现量的比值

PTEN(phosphatase and tensin homolog)为同源性磷酸酶及张力蛋白；PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)为磷脂酰肌醇-3-激酶；GSK3β(glycogensynthase kinase)为肝糖合成酶；Rb(retinoblastoma)为视网膜母细胞瘤蛋白；T代表肿瘤组织；TA代表肿瘤邻近组织；KO代表GNMT-/-小鼠；WT代表野生型小鼠。a代表GNMT-/-小鼠及野生型小鼠在11周大时基因表现量的比值，原始数据以内生的3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceral-dehyde-3-phosphatedehyrogenase；GAPD)为比较标准。

b代表在肿瘤邻近组织及野生型小鼠肝脏组织的基因表现量的比值，原始数据以内生的GAPD为比较标准。

c代表在肿瘤组织及野生型小鼠肝脏组织的基因表现量的比值，原始数据以内生的GAPD为比较标准。

为了证实本发明的GNMT-/-小鼠模型较一般野生型小鼠对致癌物质更为敏感，本发明利用供给AFB¹来作为测试，AFB¹以下列剂量做两次腹膜内注射：在小鼠7天大时，以体重计算，每公克注射10微克；在小鼠9周大时，每公克注射40微克。实验结果显示，在被注射ABF1的GNMT-/-小鼠中，所有的(5/5)雌性小鼠及57.1％(4/7)的雄性小鼠被探测到有肝脏结节，然而在被注射ABF1的野生型小鼠及其它只注射溶液(三辛酸甘油酯；tricaprylin)的小鼠中，在13至14周大时皆没有出现肝脏肿瘤(如表6所示)。

表6在两种不同基因型，13周大的小鼠中，分别注射溶剂(控制组)及AFB¹后，其肝脏肿瘤的形成状况

利用H-E stain分析小鼠肝脏后，发现野生型小鼠在注射AFB¹过后并没有任何不正常现象，但是，在注射过AFB¹的雄性GNMT-/-小鼠肝脏内却发现发育不良的结节、早期肝癌症状及脂肪结节(图九A，B)；而在雌性GNMT-/-小鼠肝脏内发现Sclenosing肝癌及局部脂肪变性的发育不良的结节(图九C，D)。

实施例二

肝癌细胞株[HA22T/VGH]的制备是参考Waxman，D.J.& O′Connor，C.Growth Hormone Regulation of Sex-Dependent Liver Gene Expression.Molecular Endocrinology 20，2613(2006)；从人类肝母细胞瘤(hepatoblastoma)取出的稳定表现的细胞株HepG2的的制备方法是参考Mode，A.&Gustafsson，J.A.Sex and the Liver-A Journey Through Five Decades.DrugMetabolism Reviews 38，197-207(2006)；论文Chen，S.Y.et al.GlycineN-methyltransferase tumor susceptibility gene in thebenzo(a)pyrene-detoxification pathway.Cancer Res.64，3617-3623(2004)中的[SCG2]在本发明的实施方式中有被使用到。本发明所使用到的细胞皆以含有10％胎牛血清蛋白(Hyclone)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(GIBCO BRL，Grand Island，NY)培养，另外，ABF1保存于DMSO中，欲处理细胞时则溶于培养液中。

免疫荧光染色法和共轭焦显微镜技术：HA22T/VGH细胞被放置于盖玻片上并以20μM的ABF1或0.1％的DMSO处理3小时，随后利用pH值7.4含有4％三聚甲醛(paraformaldehyde)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline；PBS)(溶液1)在室温下固定20分钟。在利用透化(permeablization)溶液(溶液1加上0.5％Triton X-100)于室温中培养5分钟后，将盖玻片培养于阻缓溶液(block buffer)(含有5％BSA的PBS)室温中一小时，随后再加入兔子的抗GNMT抗体(1∶200)培养一小时，再加入第二抗体---连接FITC的山羊抗兔子免疫球蛋白G(FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG)(Chemicon，Temecula，CA，USA)。复染细胞核是利用Hoechst H33258(Sigma-Aldrich)。共轭焦显微镜则是使用一装配Olympus Flowview氩/氪描激光系统和Fluoview图像分析软件(Olympus，Melville，NY)的Olympus IX70倒置荧光显微镜。

LGA对接方式推测：LGA用来阐明在GNMT与AFB¹在各种形式间的相互作用位置。Autodock 3.0软件用来鉴定最适的配体连结作用。因为大鼠GNMT与人类GNMT在氨基酸序列上有91％相似，所以，大鼠GNMT的X光晶体绕射数据被用于推测对接位置(Pakhomova，S.et al.，Proteins Structure Functionand Bioinformatics 57，331-337，2004)。实验数据包含10run、大小50的population以及a run termination criterion of 27,000generations or 2.5x 10⁵energy evaluations(无论何者先)。构型丛集的均方根偏差值容许范围0.5埃是从配体的晶体坐标计算而得，过程的细节可从之前报告得知(Morris GM et al.JComput Chem 19，1639-1662，1998)。

细胞毒性分析：细胞活性测试(MTT Assay)被用来测试AFB¹的细胞毒性。细胞被培养在96孔培养盘中，在进行分析时，每孔培养液换成含有10微升MTT保存溶液(5毫克/毫升)的100微升新鲜培养液，四小时后，细胞已被MTT标记，将上述培养液再换成100微升的DMSO并在摄氏37度下培养10分钟，随后混合均匀测其540纳米的吸光值。根据半数细胞会死亡的浓度(half lethalconcentration；LC50)，96孔盘培养7000个HuH-7细胞18小时。细胞分别以不同浓度的AFB¹及取一系列时间点来测试，并且每组实验重复三次，每次以AFB¹处理72小时。生存百分比是以实验组的吸光值除以只加溶液的控制组织吸光值来计算。为了进行此细胞毒性测试，利用不同量带有GNMT cDNA的腺病毒或者慢病毒感染5000个HuH-7细胞8小时，随后将培养液换成新鲜培养液再培养10小时。

根据竞争性的酶联免疫吸附分析(enzyme-link immunosorbent assay；ELISA)来对AFB¹-DNA加合物定量：为了评估GNMT对细胞的保护能力，本发明利用培养在10公分培养盘的稳定细胞株SCG2-1-1或是受GNMT重组腺病毒(Ad-GNMT)感染的HepG2细胞，以AFB¹或是0.1％DMSO处理16小时后，萃取其DNA。所有的样本皆以15mM碳酸钠及30mM碳酸氢钠(pH9.6)于摄氏37度处理2小时，用以中和所有开环(ring-opened form)的加合物，所有ELISA测试都重复三次，并且测其490纳米的吸光值。在本发明应用的ELISA中，以6A10抗体来测量AFB¹-DNA加合物的量，如同论文Hsieh，L.L.et al.，Immunological detection of aflatoxin B1-DNA adducts formed in vivo.CancerRes.48，6328-6331(1988)所述。

pPEPCKex-flGNMT-TG转殖基因载体构建：使用一个特定在肝脏表现的基因转移载体，pPEPCKex，其包含小鼠的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase；PEPCK)启动子(Valera，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91，9151-9154，1994)、一0.3kb的合成内含子以及一0.6kb的人类生长荷尔蒙多腺嘌呤讯号(polyA signal)。pPEPCKex-flGNMT基因转移质粒是经过插入1.2kb人类GNMT cDNA(源自于9-1-2plasmid；Chen，Y.M.et al.，Int.J.Cancer75，787-793，1998)至pPEPCKex载体的Notl与Xhol限制酶作用位置之间构建而成。随后，pPEPCKex-flGNMT基因转移质粒将以限制酶Ascl作用后成为4.3kb直线状片段，并应用于显微注射。

产生GNMT转基因小鼠：GNMT转基因小鼠是对FVB小鼠的受精卵进行配子和显微注射而产生的，该小鼠被饲养在特殊处理的无菌设备里，并在其3周大断奶时剪下一部分的尾巴，随后利用蛋白酶K/SDS(Promaga)处理与酚/氯仿萃取出小鼠的DNA，并以PCR鉴定其基因型。该PCR为利用引物GNMT-F5’-GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC-3’与GNMT-R 5’-GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTCTTGAGCAC-3’反应摄氏94度30秒、摄氏60度30秒、摄氏72度60秒30循环，随后侦侧小鼠是否带有668bp的人类GNMT DNA片段。

AFB¹测试：本发明使用的AFB¹(Sigma Co，St Louis，MO)溶于0.2毫克/毫升的三辛酸甘油酯(Sigma)。对每组至少6只7天大的小鼠，施以AFB¹腹膜内注射(每公斤体重注射10毫克)，且两个月后再次注射，此注射剂量是根据论文Ghebranious，N.&Sell，S.Hepatology 27，383-391，1998。待小鼠九个月大后进行病理实验，五分之二的器官(包括肝脏、肺脏及肾脏)利用10％福玛林固定以供组织病理实验，剩下的器官则存于摄氏负80度以供之后实验使用(如DNA、RNA、蛋白质分析)。

RNA分析：本发明利用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从冷冻封存的组织中萃取全RNA，并以分光光度计定量，随后利用Northen杂交分析RNA。cDNA探针(probe)是从质粒9-1-2的人类GNMT基因制作而成，互补DNA是利用SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen)从肝脏RNA制作而成。GNMT的引物为

F1：GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC及

R1：GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTCTTGAGCAC，

β肌动蛋白的引物为

F2：GTGGGGCGCCCCAGGCACCA及

R2：CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。

PCR步骤则是摄氏94度5分钟的预先变性(pre-denaturation)，紧接着30循环的扩增(amplication)---摄氏94度30秒、摄氏60度30秒的、摄氏72度60秒，最后是摄氏72度10分钟的延伸(extension)。

Westem杂交分析：进行Western杂交时，样本为10微克之肝脏蛋白萃取，利用10％SDS-PAGE分开后，转印到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，其步骤详细叙述于Waxman，D.J.&O′Connor，C.Growth Hormone Regulation of Sex-DependentLiver Gene Expression.Molecular Endocrinology 20，2613(2006)。另外，在本发明所应用的Westem杂交是使用小鼠抗GNMT单株抗体(mAB)14-1来探测GNMT。

GNMT的酶活性分析：GNMT的酶活性分析方法是根据论文Cook，R.J.&Wagner，C.Glycine N-methyltransferase is a folate binding protein of rat livercytosol.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81，3631-3634(1984)的步骤略作修改而应用于本发明，该方法被用来测试GNMT转殖基因鼠肝脏组织内的GNMT酶活性。其分析步骤如下：部分肝脏利用三倍体积含有0.25M蔗糖、1mM EDTA、1mM 叠氮化钠(sodium azide)及0.1mM苯甲基磺氟(phenymethylsulfonylflouride)的冰磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)均质化，再离心20,000G 30分钟后，除去上清液并加入2-硫氢乙醇(2-mercaptoethanol)至最终浓度为10mM。测量过蛋白质的浓度后，取250微克蛋白质加入至包含100mMTris缓冲液(pH 7.4)、50mM甘氨酸、0.23mM SAM及2.16uM S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-[methyl-3H]-methionine)(甲基以氚标定)(76.4Ci/微摩尔)的100微升反应混合剂，随后培养在摄氏37度30分钟，接着以含有10％三氯乙酸(trichloroacetic acid)与5％的活性碳的50微升混合剂终止反应，每个反应都重复三次以求数据精准。

免疫组织化学染色法：本发明所应用的免疫组织化学染色法是利用一单株抗体(mAB)14-1(稀释200倍)来探测GNMT蛋白质的表现。被石蜡油嵌入的部分(4微米)肝脏与抗GN MT抗体培养后以DAB kit(DakoCytomation)探测。实施例3

AFB¹所引发的GNMT核转运现象：用ABF1或是DMSO(纯溶液对照组)处理已以GNMT cDNA转染的HA22T/VGH细胞16小时(图10中，图A和图B所示)。如同图10所示，GNMT的分布一开始被限制在细胞质里(图10中A图所示)，但是在AFB¹处理过后，有部分的GNMT转移至细胞核中(图10中B图所示)，此实验结果显示AFB¹与BaP一样能引起GNMT的核转运现象。该实验结果证明在被AFB¹处理过的细胞中，GNMT会发生核转运现象(图10)，也显示GNMT能够减少AFB¹-DNA加合物的形成及增加被AFB¹处理过的细胞的存活率。有研究证据指出：AFB¹-DNA加合物的形成与肝脏的化学致癌作用(carcinogeneesis)有关(Bressac，B.et al.，Nature 350，429-431，1991；Hsu，I.C.et al.，Nature 350，427-428，1991)；亦有研究证实，当肝脏中的GNMT减少时，肝脏对致癌物质的敏感度会提升。因此，GNMT可能参与在细胞防环境中的防御致癌物质的机制中。

实施例4

推测GNMT-AFB¹的交互作用：利用拉马克(Lamarckian)遗传算法结合X光晶体绕射的数据，预测出GNMT与AFB¹的物理性交互作用。由于大鼠GNMT蛋白质与人类GNMT蛋白质在氨基酸序列上有91％的相似度，所以本发明的实施方式为利用大鼠GNMT蛋白质的X逛晶体绕射数据来进行AFB¹对接位置的实验。根据表格七所示的数据，AFB¹在低结合能(bing energy)时，分别会与双体结构(Protein Data Bank编码1D2C)(接合能-9.41千卡/摩尔)及四体结构(1D2G)(接合能-10.06千卡/摩尔)的GNMT结合。

表7利用拉马克遗传算法评估的GNMT蛋白质与AFB¹的对接关系

比较在没有SAM(-9.85千卡/摩尔)的情况下与GNMT双体已和SAM结合(53.25千卡/摩尔)的情况下，AFB¹与GNMT双体(1XVA)的结合能，结果显示AFB¹会竞争掉SAM而与GNMT结合，由于分子取向(molecular orientation)只有轻微的不同，AFB¹与BaP同是坐落于GNMT双体或四体的分子筐(molecular basket)内，GNMT氨基酸残基与AFB¹氨基酸残基(Ala64，Leu36，Gly137和Ser139)非常接近(如图十一B所示)。

该实验结果证实：(a)在GNMT之SAM结合位置亦有一个AFB¹的结合位置，以及(b)AFB¹会与GNMT的双体或四体结构结合。本发明的实施方式为利用GNMT四体(1D2G)的突变体R175K证实在结合位置的附近(大约5埃)的R/K残基对于GNMT-AFB¹加合物的产生是没有影响的(表7)，此结果符合GNMT是一个分子筐的论点，此独特的结构亦与GNMT除了和SAM结合亦可与多环芳香族碳氢化合物(polycyclic aromatic.Hydrocarbons；PAHs)分子(例如：BaP)结合的事实相符。根据GNMT的晶体结构显示：GNMT有许多酪氨酸残基(33，44，177，194，220，242，283)座落活化位置的内表面，该残基与其它残基可能提供一个与致癌物质交互作用的场所，如此一来，GNMT能与AFB¹结合亦是合理的。

实施例5

GNMT对抗AFB¹所引起的细胞毒性：MTT分析可被用来确认细胞的存活率，为了使细胞毒性分析更精确，本发明之实施方式为以不同浓度的AFB¹分别取一系列的时间点来处理HuH-7细胞，如图11中图A所示，LC50是根据处理时间而定的。以高达16μM AFB¹处理所产生的细胞毒性，在24小时内无显著影响，但是若处理时间超过48小时，即使该组细胞只用4μM，HuH-7细胞的存活率就会有显著的下降，而处理72小时的LC50AFB¹的浓度大约是12μM。为了确定GNMT对于以AFB¹处理过的细胞的影响，本发明利用带有GNMTcDNA的腺病毒感染HuH-7细胞，使其能够表现GNMT蛋白质，随后与被带有GFP的腺病毒感染的HuH-7细胞(对照组)比较，在相同都被AFB¹处理过的情况下，其存活率稍微增加(如图11中图B所示)。利用慢病毒载体系统使细胞能表现GNMT蛋白质也有相同的实验结果(如图十一C)，该结果证实GNMT能够对抗AFB¹所引起的细胞毒性。

实施例6

抑制GNMT对AFB¹-DNA加合物的影响：为了确定GNMT对AFB¹-DNA加合物的影响，本发明的实施方式为以竞争性酶免疫分析法(competitiveenzyme immunoassay；EIA)(其使用抗体6A10、从HepG2细胞SCG2-1-1株及SCG2-neg得到的稳定细胞株及被带有GNMT重组DNA的腺病毒感染的HepG2细胞)测量AFB¹-DNA加合物形成的量。利用DMSO及不同浓度的AFB¹于DNA萃取前处理细胞16小时，然而并没有观察到细胞毒性。SCG2-neg细胞中AFB¹-DNA加合物的量减少大约50％(图11中图D所示)，此外，被带有GNMT cDNA的腺病毒(Ad-GNMT)感染的细胞所产生的GNMT过量表现也减少AFB¹-DNZ加合物的形成(图11中图E所示)，相较于被Ad-GFP感染的细胞，被5MOI Ad-GNMT感染的HepG2细胞在两个AFB¹浓度下，AFB¹-DNA加合物的形成都减少40％，另外，在50MOI感染的HepG2细胞则减少约70％。该实验结果是以抑制百分比来计算AFB¹-DNA加合物形成的量，其指出：相较于控制组的细胞(SCG2-neg细胞与被Ad-GFP感染的细胞)，AFB¹-DNA加合物形成的量在能表现GNMT的细胞中有显著的下降，其进一步证明GNMT借着渐少AFB¹-DNA加合物形成的量来保护受到AFB¹处理的细胞。

实施例7

产生GNMT转基因小鼠：为了确定GNMT在活体内对于AFB¹所引起的癌化作用的影响，本发明建立一种转基因小鼠模型，其使用图14中A图的pPEPCKex-flGNMT质粒建立，该质粒能以PEPCK启动子(Valera，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91，9151-9154，1994)表现人类的GNMT蛋白质，该GNMT转基因小鼠是利用FVB小鼠的受精卵进行配子合显微注射而产生的。Northen杂交的分析证实该小鼠的肝脏及肾脏内会表现人类的GNMT蛋白质(如图14中图B所示)。

本发明利用RT-PCR及Western杂交分析GNMT转基因小鼠如何表现GNMT蛋白质。如图12中图A所示，野生型小鼠的GNMT mRNA表现随着年龄而增加，而在7周大时达到一高峰，而GNMT转基因小鼠的GNMT mRNA表现量比野生型高，尤其是在1至3周大的阶段。此外，根据Western杂交的分析，雄性野生型小鼠在1至3周大时，其GNMT蛋白质表现量极低(低至无法探测)，然而雌性野生型在1周大时有可探测到的低表现量；相较之下，雄性与雌性的GNMT转基因小鼠在1周大时即有高GNMT蛋白质表现量(如图12中图A所示)。这些结果显示：GNMT转基因小鼠在1至3周大时，GNMT的表现程度高于野生型小鼠。再者，本发明同时也测量了GNMT的酶活性，GNMT转基因小鼠在9至11周大时，GNMT的酶活性显著地高于野生型小鼠(P值小于0.05)(除了9周大的雄性)(如图12中图B所示)。

在这次试验过程中，并没有供给GNMT转基因小鼠特殊的饮食，GNMT转基因小鼠肝脏中的GNMT的基因表现程度高于野生型小鼠，尤其是1至3周大时(如图12中图A所示)，然而其在7周大时达到一高峰。

实施例8

AFB¹引起的肝脏肿瘤在GNMT转基因小鼠体内被抑制：GNMT转基因小鼠与野生型小鼠在腹膜内注射AFB¹后，于11个月大时牺牲以做病理实验，其与肝脏肿瘤相关之实验结果显示于表8。

表8以溶液及AFB1处理两种表现型的小鼠，其肝脏肿瘤形成的状况

不论在被AFB¹处理的雄性或雌性GNMT转基因小鼠体内，都没有肝脏肿瘤形成；而6只被AFB¹处理的雄性野生型小鼠中有4(67％)只发展出肝脏肿瘤，另外，被溶液(三辛酸甘油酯)处理(对照组)的小鼠体内皆没有肿瘤产生。

本发明以测量ALT的量来监控GNMT转基因小鼠与野生型小鼠在11个月大时的肝脏功能，在被处理AFB¹的组别中，雄性野生型小鼠血清内的ALT量高于雄性GNMT转基因小鼠；但在雌性GNMT转基因小鼠与雌性野生型小鼠中则没有差别。病理实验结果显示：被处理AFB¹的雄性野生型小鼠出现肝脏发育不良及肝癌的症状(如图13中图A所示)，然而被处理AFB¹的GNMT转基因小鼠却是正常的(如图13中图B所示)。免疫组织化学染色法证实在正常肝脏细胞的细胞质内有大量的GNMT蛋白质表现(如图13中图D所示)，然而其在肿瘤细胞中表现量降低(如图13中图C所示)，此现象亦由Western杂交证实(如图13中图E所示)，其亦被发现于人类肝癌之中。

在以AFB¹处理的实验中，在被注射AFB¹的小鼠之中，GNMT转基因小鼠的GNMT表现量高于野生型小鼠，该结果显示GNMT转基因小鼠不论雄性或雌性体内，都没有肝脏肿瘤形成；而6只雄性野生型小鼠中有4(67％)只发展出肝脏肿瘤(如表8所示)，在该实验中，肝脏肿瘤形成的机率在雄性野生型从10％增加到67％，而同样的实验中GNMT转基因小鼠没有肝脏肿瘤形成。而且，虽然表现量低，但是GNMT蛋白质在1周大的母小鼠肝脏内是可藉由Western杂交发现的，这些GNMT蛋白质能够在雌性野生型小鼠体内预防AFB¹引发肝脏肿瘤形成(没有被AFB¹处理的雌性小鼠发展出肝脏肿瘤)，此结果亦证实GNMT能够在雄性GNMT转基因小鼠体内预防AFB1引发肝脏肿瘤形成。

病理实验更进一步地确认该被AFB1处理的野生型小鼠形成的肝脏肿瘤是肝癌(如图13中图A所示)，而免疫组织化学染色与Western杂交的结果显示在肿瘤组织中的GNMT表现量降低(如图13中图C和图E所示)，此结果与目前在人类肝癌的研究结果相同，其进一步解释人类与小鼠在GNMT调控癌化作用所扮演的角色非常相似，因此，GNMT可以有效的预防癌化作用。

序列表

<110>陈宜民

<120>甘氨酸N-甲基转移酶动物模型的制备方法及其用途

<160>8

<170>PatentIn 3.4版

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcggcggccg catgctggtg gaagagggc 29

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttgcagtctg gcaagtgagc 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gttccttgcg cagctgtgct 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cggccacagt cgatgaatcc 20

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcgctcgagt cagtctgtcc tcttgagcac 30

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gtggggcgcc ccaggcacca 20

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctccttaatg tcacgcacga tttc 24

<210>8

<211>14777

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<220>

<221>misc_feature

<222>(5953，13551)

<223>n＝c或t

<400>8

tctctgtgag ttcaaggcca gccaagacta tacagagaaa ccttgtctca aaaaacaaac 60

aaacaaacaa acaaaatgca ccaccatgcc tggttcccca gttttaaaaa ccctaagtaa 120

ataaaagata ccacttaaga tgctgagatg agatttgaaa aaagtctagg attgataggt 180

ttacccccca aatgctttga tatgtggcat tggatttact tgaaattccc aaatacagtt 240

tctcctctct gctttgtctc cacagggact gatgtagccc agatttgcct tgaagtctat 300

gtaccctaga atatctttga actccagctt ttctgttctc agctgccaag tacaggactt 360

acaggcacac accatcacac tcagcctcga gaatctttct gagcatagtg tcagaggcct 420

gtgtgtaggg acattgagtc cccaagactg agcctggtca gaaccatttg agattggcgc 480

tgtgctaaca aaagtttaaa aatgtgggct ggagagatag gtcagccatt aaaagcccta 540

tctgcagcta gggtcgtagc gcacactttt agccctagcc cttgggaggc agaggcagtt 600

ggatctctga gttcgaggcc agcctggttt acagagtgaa ttctaggaca gccagagaaa 660

ccctttctca caaaaaccaa accaaaccaa acaaaccact tggtcctctg tggggttcag 720

tgtcctcagc accacccagt ggctccccac tgtctacaac tgcaggttca gggtatctga 780

agctctcgat tctgggctcc atgggcgtca gacacatact gacatctatg aagtcaaaac 840

agccataccc actataagaa ggttaagtca cacaactgtg ggcctccttc catctccagg 900

gttcaccctg cattgggaag gcgaagggcg ggcgggcggg cgggatgctc cctgtcttct 960

ctcttctttc cacgtaacga gtgttcacag agttggaagt gtgtgggcag gcggggcagg 1020

cggggcaggc ttctcgttgc tcacacgcat cttccagagc cgactttagc ccggctggga 1080

tcttgtcctt ggtggggtaa aaagggtgag cgggtaacac gaaacggacc ctcaggttat 1140

acagtgacgc tagcccgagc gggcgccatg agcaccttcc ctgccgaccc ccaactttcc 1200

tctctgaagg tgctcccatg gaaagcagat ggaaggcttg ctatgtctcc cacattgttc 1260

actaattcat tgagcactaa taatcctcct gtctcacctt actacaccca gcctttaaga 1320

gattgcagag tataaagccc atggattgga aggcccaggc taccttagga ggctcctggc 1380

tggtatgggg gaggggaaga gagacacgcc tatctccagg tgtactcttg tacttggatg 1440

agcatctttc tcaaagactg ttcataatgt cccgacacag tggctctctt tagcggagtg 1500

ttccctccac taaatgataa gcagtgttgt gtagacacgt tgctgggctg ggcatgtaat 1560

aattctgttt tgggtggatt tcaggcttct tccccttcct ccttgggtag gggtggagtg 1620

atctctcatt gctttacttt gtgagttcct cccggccacc ctggcgagtc ctatctgacc 1680

tgtcttacta agccaggtcc aggattgctg tgctgagcca tcctcaaggc agaggcagca 1740

agcctggctc tgggcccagg gcccagcagg ggcgtgtccc tgctctcacc tgccattggc 1800

caggtgggac tgccttgcca gaggattata agtgcggatc gcgtggcctg agagccaggc 1860

gccggtcagg atggtggaca gcgtgtaccg tacccgctcc ctgggggtgg cggccgaagg 1920

gctcccggac cagtatgcag atggggaggc cgcacgtgtg tggcagctgt acatcgggga 1980

cacccgcagc cgtaccgcag agtacaaggc gtggttgctt gggctgttgc gccagcacgg 2040

gtgccacagg gtgctggacg tagcctgtgg cacagggtga gtccaaacgg gccggcctgc 2100

ttaggccagt ctgggcagcc tctgcgggct ggagcctggc aggcagtact agggggtcaa 2160

gagcccttgc tcatcagggt agtatgggca tgggagagca tctgccgaga aacagtgcgg 2220

gaaggggcca gggtgtgcgc agagaagtat tcatgggaca gagcaaaatc cgagctttgg 2280

gtcaaggtgg atccttggct ccggcgctgt tcctcctgcg attggcctct ggcagtgtga 2340

acagaacatt tgtagcacgt ttgcacagcc aagtgctgtg ccaggagttt gggtacgtgt 2400

gttgcaagct gtaacaaaac cccacgaggt gagcagcgct tttctccaac cagtagtact 2460

aaagaaaaag tcatttccaa gaggtaaaag gcccccattt ggtggagagg atacagacca 2520

ggatagtgtc tggcccacac tcccgactca gcccagaact cacggacacc tctgattgag 2580

ttatttccag gagcaccagt atgccaggtt ctcaagtgca cttttgtaga atgcctgact 2640

atgatttaaa aacaaaaaca acaacaaaaa gccattgagc cggtgagatg gtccgactac 2700

taagagcccc ttaggctctg gcagaagaca ggctctcagt gcctagcatc tgcatcaggt 2760

ggctcataat cgcctggaat tccgttccag ggggaggtta gcgctccctt ctggccgtgg 2820

agggcactgt actcacatgt actacacata cagacataat taaaaataaa aaaatgtgtt 2880

gatgtcagga gtagtggcac atatatttaa tcccagcact cagggactcc taaataggtg 2940

gctctctgtg agttccaggc cctgcagggc tacattagga gaccctgttt ctaataagag 3000

gcagctgggg agatggcaca tgttcttaca gaggacccaa atttggtgcc cagcaccctc 3060

tctggggtct gcagacacaa ggtatgcaca tgatgcacat attcaggcac gacacatgaa 3120

attaaatttt gaaaaaaaat ttttttgaaa cagaatctct ctttgtagcc ccagctgtct 3180

tggaactcac tgtttaaacc aggctaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa ctctcaaaaa 3240

aattttttgc tacctgataa ggaaaattct tttttttttt taaagattta tttattatta 3300

tatgtaagta cactgtagct gtcttcagac acaccagaag agggagtcag atcttgttac 3360

ggatggttgt gagccaccat gtggttgctg ggatttgaac tctggacctt cagaagagca 3420

gtcgggtgct cttacccact gagccatctc accagccccc aggaaaattc ttaatgggtc 3480

acttgagacc agtagagatg gcctgggaca ggaagcagag gaacggactc tggaatgtta 3540

tgtctgggga aatgtcacac acatttggcc tcccaggctc ctctgactgg tcctctagtc 3600

ccccgtttct gacctcatcc agagtggact ccatcatgct ggtggaagag ggcttcagcg 3660

tgatgagcgt ggacgccagc gacaagatgc tgaaatatgc gcttaaggag cgctggaacc 3720

ggaggaaaga gccatccttt gacaattggg gtaaatctgt ctgtccaggc cccccagaca 3780

tgcacctcca gggtcactct ctgccctggc tctctcttgc tgtggagctg aatggttttt 3840

cctcagtgca cggtacagtc cctgtcaact tcctaaaaag gaaggctttg gcatcagagt 3900

aggattccgg ctggtaagag caagtttgtt gtatttatgg tgctaggcat tgaacttggg 3960

catgccaagt agacccttga tcactgggct gcattaccag cggtttttat gcttttcccg 4020

tgttgcctgg cttggctaag ctagatttaa gtgatgctcc tgtctaacag agtctagagg 4080

tgtacgtcaa gtcactgggc cctacagagc tacttttaac tgtcttatca catcctgtct 4140

ctcctcccta caaaagcccc taagtggagg gctggctttg ccaactgtgg ctctctccat 4200

ccctaatgag tccccatgtg tctctgggag gaggtggttg cttctgtgct gtgctataat 4260

tctcgactcc ccccccccaa cccctgccct ggcctccagt cattgaagaa gccaactggt 4320

tgacgctgga caaagatgtg ctttcaggag atggctttga tgctgtcatc tgtcttggga 4380

acagttttgc tcacttgcca gactgcaaag gtaagctggt ggccttggct gtggctcttg 4440

ccttgagctt tcccacgtcc gaagatggct ggcctgctgc cctgataagg cagacctgca 4500

ttttgcctgt cttctttagt gctggcactt gggagggaga caggggcggg aggtggtgct 4560

ggaggcctaa gcagatggtg tctgtggccc tgccgggaac ccaggtgacc agagcgagca 4620

ccggctggca ctaaagaaca ttgcaagcat ggtgcggccc gggggcctgc tggtgatcga 4680

ccaccgcaac tacgactata tcctcagcac aggctgtgcg cccccgggga agaacatcta 4740

ctataaggtt gggctgcccc ccaatgggaa gcgggagctg gagggccaga agccccgtgg 4800

tggctcaggg aatgacgcaa cccatgccct cagagtgacc tgaccaagga cattacgacg 4860

tcagtactga cagtcaacaa caaagcccac atggtaaccc tggactacac agtgcaggtg 4920

ccaggcactg gcagagatgg ctctcctggc ttcaggtatg acgtggtttg gcaggagaga 4980

ggtggtggtg gtggggagac ctgaggccag cagccctcat atctggctgg gggccctgtt 5040

gcagtaagtt ccggctctct tactacccac actgtttggc gtctttcacg gagttggtgc 5100

gagcagcctt tgggggcagg tgccagcaca gcgtcctggg tgacttcaag ccctacaagc 5160

ctggccaggc ctacgttccc tgctacttca tccatgtgct caagaagaca gactgagttt 5220

ctccggctcc cagaagccca tgctcaggca atggccccta ccctaagacc atcccctaat 5280

gcagatattg catttgggtg cagatgtggg ggtcgggcaa acggagtaaa caatacagtc 5340

tgcattctcc aagcctgtgc ctggtgtttc ttcagaagta acgtgttttt atggtgtccc 5400

ccccccccaa tcccccctca agacctcagc ctcccataac cttgcctttt gcaccgcaac 5460

ctctcacaag accagtagga ggcagtatac actttatttt ctactccaga actagtgtct 5520

ccgcacaggt cacaggctgc caagccccta gctgccagcc ctgcctctcc tcctgagcac 5580

taggggcccc cactagggct cacaagggat ctctgggagg aggcagcctt caggcgacag 5640

gcgggaggta ccttcagtca gggggcatag gcagacggca ggcaggcagg caggcaggca 5700

gctcctagca ggctgcaaac ttgcgttgga tgcgcttgta tcgcaacagc tcctgctcac 5760

tgactgaggg ctgcagccgg gctgcggcct gcaacaggtc ctccatggtg agcagcagtg 5820

ctgagctccg cagctctagc cctaaggggt ggaaaggaag actaaggcca gagccccagc 5880

cctagctgaa gtacagaggc tgcagtctat gcctaggtag gagagccact ccgggggggg 5940

gggggggggg acngcacggg acgacgacga acgacacccc ctgctcagcc attcctctgg 6000

aattcagggc caggactgtc tccctagctt tatggttccc atccagggct ggcaggtggg 6060

ctcaccttcc tctaggtctc gaaccctgcg tttgagggca gtcatcatgg cgtcagagca 6120

gagagaatag agatctgcac cagtcagctg tgggtgggca gcaatccagc acgtttgcca 6180

ggctcacaga gggctccagc ttgaacctat cacacccaca ccagggatgt taaagctggc 6240

ctcacctcct ccctcagaag tcatgatgac tcgcacacat cccctaactg tctaagcccc 6300

caccccagct ctctgactac gcatacttcc gtgtgatggc gctcagcaca cgcagctggg 6360

aggcccggtc ctcactcgcc cctacaaaca ccagcttgtc aaatcttcag agagacagag 6420

acaggaagtg ttagggctgc caaccatgag aggtgaagga tgcccaggat agaggttaag 6480

gcgcaaagga gccttgtgga ggggagaggt ccagggtccc tacctgccag gccgcagaag 6540

ggcagggtcc aggaggtctg gtctgttggt ggctccgatc acaaacacat cctgggtgct 6600

gtggagccca tccagctcgg ctaggagctg agacacaact ctgtacggga ggaaggcggc 6660

aaaggttgca gagtccttgc tgtgccctca ggccagctgc gcttctcttg aagactgctt 6720

cagcaaggtc ccttgctaag ctctgcccca tgtccctgcc acactggtga gcctcctcaa 6780

agttccccac tcctttttag cttcccttct agctctgaac tagaagggca ggaacctctg 6840

tcttagaggc ctgggctgga gactgatgtg actcaagata tatacacaga catatataca 6900

tatacgcata tatacatatg tatatgtgtg tgcatataca cacacacaca catacacaca 6960

cacacatatc tcacatccct ccccagactc cagaacccct gacctgtcca tcacccctcc 7020

agaatctcca ctccgtccgc ggcttggagc taaggaatcc agttcatcaa agaagatgat 7080

acagggagca gcagccctgg ccctggcaaa cactgagaaa gaggctcgca ggagagtggt 7140

gtcaaggagc ttcaagtcag gggagaagga tggcacatgt gcccgacagt tcctccccgg 7200

ccattgccca ctgagctgac caggagcagc cactggggaa gatggtgttg gggaagggcc 7260

cgagactcgc tcgctctccc cgctcactca ctcaccttcc cggacattct cctcgctttg 7320

gcccacatac atgttgatga gctccggtcc ctttacactg agcagtggga tggacggaca 7380

aatgagaccc atcagacgtg ctgtcctccc ctcccctccc accacctgcg acaactcccc 7440

tccccctttc tgcaccggct acagctccca gcctcccaca tttctcccca gccctgccaa 7500

cctgaggaag gtgaggctgc actcagtggc tacggccttg gccagcaggg tcttgccagt 7560

gcctgggggc ccatggagca gaaggcctga tcgtcttagg cccaggctga gcagctcagg 7620

gtgttccaga ggcagctgga tggtttctag gatctccttc ttcacatcct gcagcccgcc 7680

cacgtcgtgc caggacactg aagggatcta gaagacggac cagtggtcag ggacgtgtca 7740

gcagagagag cccttgcccc cccccccccc cacggaccag gattctcacc ctgggtgctc 7800

ccacagcttg ggagtgagct gtctgcagtt gatctaatgc ctgcccgaag tcctcagcca 7860

gcaaaggaaa gccagccaca cacaggtccc cctcatcctc ctcactcaaa ccacctgccg 7920

agctgcaaag aaacacgatg ggggggaggg ggtaggctta cagctgtacc ctcagcatct 7980

gggaccagca ctcatggggc agaggcaggt gatctctatg agtccaagac tagcttggtc 8040

tccacagtga gtccaggcca gccaaagact acatagtgag tccctgcctt aaggataaaa 8100

aaggaccggg ccaatcaggg tatggattaa ggctctaaca aacgagagac agagagagag 8160

agagagagag agagagagag agagagacag agacagagag agagagacag agacagagag 8220

agagagagag agagagaccc cctctctagc agggtcccat tgccttccca gccacctggg 8280

atgagtctgt cttaccccga ggctctgatc ctggtgcagg ctgcccggca ggtatgggtc 8340

agaagggcat agaggtcccc caccacaaag ccctagggag ttacacaaaa ggacacatgg 8400

gtagggcagg gcacaggagg cagaggccaa gtctggcttc cagctggagc agaggctttc 8460

gtggtttcca gtctcacggg gcagcagaaa cgaggccctg tgtgacaggg accctgtgac 8520

ggcatagtgt caaggcccct gtgcagacac tcaccgcaca gcgccgtgcc agctggggca 8580

ggttaacctc ctggcctaag ggaaggtggg cagtgagggc ctgcaggata ctgagccgtt 8640

gagcctcaga cagcactggc acctctagct catgaggaaa tgccgtctgc acatcggtgg 8700

gcaggtcctg gacacggctt gtggtagcca ccaccatgag aggagggcac ctgcagacag 8760

ggacgtgggc aaggtctggc atggctggca gctcctgcct ttggtgtgca ggaatgggga 8820

gggttggtgt caggactggg tagggatggg catcatccag agtccattat cccctgatgg 8880

tggggacacc atgaagggag accctgcttc acacgggggg ggggggtgct cactggggac 8940

aaaagcttca accttgtgtt cccttcaaaa tgttcaacct tgtgttccct tcaaaatgct 9000

agaccgcacc ctcctacctc tggacactgt aaattggccc caaggacagg taggtgagag 9060

ttctgagaag ctagcagggt gtgaggaatt gagggctgaa taggggggtt cccttcataa 9120

cctgcctgct ctatacatac ctgctgagag cgtcctcatc aaggaggaga tgacggagtg 9180

tggccgcaac acgggcatcc tcacccagtc cgtctcggtc ccggcccagg aggtccacag 9240

ctgtcaagag gaggactgca ggcctgcagc ggtgggcccg ggagaaggtg gcctgcagct 9300

ttgtctccac ggccctactg ctgtctgcac agaggctgga gcagggcacc tggggaagag 9360

accagatggg tcagcatgaa gggagaaggg tgactaggcc atctttgtga gtagggacag 9420

gtgaaggagg gaccctggcc aggtgggagc tttggttcac cctatccttt gcctggagtg 9480

tgcagccttg aaacccctcc ttcctgagag gagctctgag tagctgagca tcaaggggct 9540

gtatactggc ctgaccactg ggcgagctct gagtagctgg gcatcaaggg actgtacact 9600

ggcctaacta ctgggctgaa gcattagggc tgccaaatgg taatgaggga acccaggaga 9660

agagagagca aggcagagtc tgagctcagt ggaagcggct ggggctcgtg ccagaggcct 9720

tcaccttcag caaatggagc ccaaggcggc tgcatgcagc cgtgacggct gtggtcttcc 9780

cgctgcctgg gggaccctgc agaagcacac agctggttcc tgtgagcaat gttcctctgc 9840

aattagagaa tagatattgt ctcccatttt tctgcccaaa tgttaagacc ctagtaagac 9900

agggacccct ggatttcata agtgtcccat ctctccttgt gcctccctaa cccccatcca 9960

ggcagtgtcc acagtccgag gccttgtgtc atgccatctc tggtgcccgg gcagaagcac 10020

tgagaacatt ttgcagccgc agaccagtta gccttcagtg aagcccagct ggataggtct 10080

ggatctagac ttgggccact ggagtggggc actctgctct ttgggagatg tagtgggaaa 10140

ggccaggacg gatctcgggc tccccaagca gaaaagcagc tttaggatca gctgctgggg 10200

agtctgcttg tgtaagtggg tagcctgtgg cctggactgg gggcctggct tgtggatccc 10260

cgacttgggg tagactactg gaagtaattt ccccggatgc tgctctacag agatgctctg 10320

agcaggcccc tctcacggcc cgaattcaca cctcccggcg tggcctcact cacccgggct 10380

gcaggtgagg cttcaggata gcacacagct catttaccaa ggcctccagg cctggaggag 10440

acaagctgtc ccagggtggg gaccttcctg aaggcagcga tggcacatga ctcagggcgg 10500

tgccagcctg tgaaagcagg aagcccagca aggttctaca gggtccctac ccctttgacg 10560

ctctcctccc aggaacccac ggccttacca ggtataaaga ggtgtgggtg gtatcagcca 10620

gaaaggcact ggctggcccc tctggggctt ctccaaccgt tttcttcact ttgaaaaaca 10680

tctcccgcca cctgtaagaa aggagggtca gggaaccagg accgagcgtc cacatgtgca 10740

cctcttgggg agtgggtagc tttctcacag aggaccaact taggagccct gagactgatg 10800

aggcaaggcg gggcccccag agggctgggc agggaggaag tgggggatac agaagggcag 10860

ccccctcatt acagccatca aatagcccag gaagggcatc tctctggcca tatagcctag 10920

ccacctactc taaaaggtga agccaccatc attacacaca gcaacctggg gccgtttccc 10980

tcagtttctg aacagtctct ccctcctaca gatcttcacc caccagggtc ccagatctca 11040

gacacaagtg tcccttcatt tttattcaac aattcaacta attctaacta aagttagagt 11100

ctttaatcat ggtgtctaac tctagtcctg gggagttgag gcaggcggga aggtcttaag 11160

acagaccagg ctgggctacg aagtgagagt gattctctgt tccagaatta cctgtgaagc 11220

ttgcttaatt aattaattaa ttgtatacga gtcttcagac acactagaag agggtaccag 11280

acctcattac agatggttgt gagccaccat gtggttgctg agaattattg aactcaggac 11340

ctctggaaga gcagtcaggt attttgtttt tgttttccgt ttttttgaga cagggcttct 11400

ctgtatagcc ctggctgtcc tggaactcac tctgtagact aggctggcct cgaactcaga 11460

aatccacctg cctctgcttc ccaagtgctg ggattaaagg tgtgtgccac ccccgcccgg 11520

cttgagcagt cagtgcttaa ccactgagcc atttctccag ctcccttgtg aaactttaaa 11580

aataagtata tttcatgcat tctgtgagtc cactcaacag gctggtgagt gccaggatca 11640

ggggacaagg caagaatgag ggagtgactg ttagtgccca tggtttgtgt ggctaggaga 11700

gctaaagaac cagagctatc tgcaccctcc tgtacccacg gcaaaccctc tgagccgtgc 11760

cactcctgta cccacggcaa accctctgag ccgtgccact cctgtaccca tggcaaaccc 11820

tctgagccgt gccactcctg tacccatggc aaaccctctg agccgtgcgt acacttgttc 11880

attctggaag atgtacactt gttcattata ggagacattt aatgtctcct agaatagact 11940

caaactcata acctcaaaag tttagaagag gctcaagtgg tggtgtaaac cctgaatctc 12000

aacactctgg aggcagaggc aggaggatct ccgtgaatcc gaggccagcc tggtttacac 12060

agcaagttcc aggaaagcaa ggactacata gaaagaccct gtctcagccg ggcagtggtg 12120

gcgcacgcct ttaatcctag cacttgggag gcagaggcag gtggatttct gagtttgagg 12180

ccagcctggt ctacagagtg agttctagga cagccagggc tacacagaga aaccctgtct 12240

cagaaaaaag aaaaaggaaa gaaaaaagaa aaaagaaaag aaagaaaaaa gaaagacctt 12300

atctcaaatt ctcccacccc caaaaaagtc taagaggctg aatcatcatc acacacacac 12360

acacacacac acacacacac acacacacac acacttactt caaacattaa tgctggggcc 12420

acccagatgg ctcagtaggt aaaggcactc gctagcaggc ctgactacct gagttcagtc 12480

ctgagaattc atagggtagg agcgaaccga cgcttacagc tcgccttctg acctctgtaa 12540

gctgctgata cacatttttt tcattcaaga taggtatttc tctgtgtagc cctggctgtc 12600

ctaatacttg ctttgtagac cagactggct tcaaattcat agacatccac ctgcctgtac 12660

ctccagagtg ttggaattaa aggtgtgtgc caccatgcct gtcccaatac acattttata 12720

aattaaatgc aatttttagc aaaataagct ggatggtagt ggcatatgcc ttttcccccc 12780

acattaactt atttattcac tttacattct gataacaggc caccttctcc acccagtccc 12840

ctctcataca gcttctccac tcaaccccct ccccttctcc tctgaaaagg aggaggtccc 12900

ccttgggttc caatccaccc tgacatatca agtcactggg tggcgcacac ctttaatcac 12960

agcactcagg aggcagaggc aggtgaatct ctgagttcaa gactagattg gtctgcagag 13020

tgagttccag gacagctagg gctacacaag caaaccctgt cccaaaataa aaaaatagaa 13080

tataagtaat aataataata atgatgataa tattaaatac tacatcatcc tttgaaagga 13140

aaagatggca caagccctag tttcatctcg attctatcta actggtgtgg ggtgtgactc 13200

tgtattacat gcagtctgga agcacagcca gctgagcggt tattaaccag cagcacggag 13260

actcagagat atttacgcta ctcactcgga agacggtaag tgcatgtagc agccagtaac 13320

ttaatctcct agagacatca ctagatagag ctcctttaac tcctcggcag ggagacacca 13380

tggaacagag cacactgtag gcctctctaa gacccaccag gccgggcagc acgcctttaa 13440

ttccagcact tgggaggcag aggcaggtgg atttctgagt tcgagtccag cctggtctat 13500

agagtgagtt ctaggtcagc cagggttata gagaggaacc ttgtttggga naccccaaaa 13560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaccca ccaggatgca aactctttta cttaaaatgt 13620

tttagttgcc attggcagca acagtggctt caaagtagac aaaggttttt gttacaaaat 13680

tcttgtaagt tgggctgggg agatggctca gctggtgaag tactacccaa acaagtatga 13740

agagcagtgt tcagcatcct agaaccacag aaaagatgcc tgtatgacag cctgcccatc 13800

atcccagcaa gcacggaagg agacagggaa tgaccagggc aagctgtcca cagagtgaga 13860

gaccctgctt caaaatgcag tcagagtgca gttgaaggca ctgatatcca ccaccatggg 13920

gcctccaggt gtgcatctgc acacccatgc actcacgctc acaaacccaa aatggatttc 13980

ctctgagtta ttccagttgg cagtggctgt ggttaaaaac taaaatgtaa ggagaaagat 14040

gcacagtgca tgaagcctag agcttggtgc gcaacagggg aaagatgcct gtgagctgtg 14100

ctctagctca gaaaaccacc tcattgtggc ttaggtaggg tacagcctcg tgcctctatc 14160

aagcatcctg tcggaacatt ctggaagcac tgcataggga agcaatgagg cgcagctctg 14220

agggaagtta cgaaggaacc accttcttca gtaggggatt ggtgctccac ttcagagagc 14280

agaaaggcca gtaatctaga ccctaccaca gccctgctga gggagcaggg gccagagccc 14340

ggtggggcac acagaagagt tgtgactgtc tgcaaagtag ctttggtttg tgaagcagag 14400

tacagaggac gctgaagagg gtccaaccat gatgaaactc ctttctaggg aatataagat 14460

ctctgggttt cccttatcaa gtctgagtgg actcagcggt ttacggtacc gagcctgcta 14520

ggcacccaga ggtgggcagg tttcaggagc tgggtcagca gcagtgctga aaatggcctg 14580

ctgtgtctca gaatgcctga tcacctgttt ttctttgtgg gcactaagtg tgggaggtct 14640

gcaggtcttc tacagaaaac aaagtgaggg actgttggta gaatgactgc ccagctccta 14700

aaagtcttag gactcagatg gtaggtagaa gcaggaaggt cagaagttca aggccatcac 14760

tcacacagat tttgagt 14777

Claims

1、一种基因剔除小鼠的制备方法，其特征在于，是用基因重组的方法破坏所述小鼠染色体上GNMT的基因座，其中所述破坏位置位于SEQ NO.8的547-4875，所述基因剔除小鼠相较于野生型具有不正常的肝功能表现型。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述破坏位置位于GNMT基因的外显子1至4及外显子5的部分序列。

3、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基因剔除小鼠的表现型缺乏GNMT活性或其GNMT活性低于野生型小鼠。

4、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述GNMT基因是利用与异源核酸序列重组的方式破坏。

5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的异源核酸序列为抗新霉素的基因序列。

6、权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述不正常的肝功能包括SAM、ALT或AST的上升。

7、预测备选化合物对预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的治疗效果的方法，其包括下列步骤：

(2观察该基因剔除小鼠的肝功能变化。

8、一种筛选能预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的试剂的方法，其包括以下步骤：

(2)观察该基因剔除小鼠的肝功能变化，并且，

(3)挑选出能预防或治疗肝癌或其它肝脏疾病的试剂。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的其他肝脏疾病为肝糖储积症、肝脏发育不良或脂肪肝。

10、一种细胞，其特征在于，其由基因剔除小鼠制备，所述基因剔除小鼠的染色体上GNMT的基因座是用基因重组的方式破坏，其中所述破坏位置位于SEQNO.8的547-4875，所述基因剔除小鼠相较于野生型具有不正常的肝功能表现型。

11、权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞为未分化的细胞群。

12、一种预防或治疗黄曲霉素所引发的疾病的试剂，其特征在于，其含有有效剂量的GNMT蛋白质或含有GNMT基因的载体。

13、如权利要求12所述的试剂，其特征在于，所述GNMT为双体或四体结构。

14、如权利要求12所述的试剂，其特征在于，所述的黄曲霉引起的疾病为肝癌。