JP2001169684A - ウリジンホスホリラーゼ発現不全動物 - Google Patents
ウリジンホスホリラーゼ発現不全動物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 染色体上のウリジンホスホリラーゼ遺伝
子の機能が欠損した非ヒト動物及びその子孫の提供。 【効果】 核酸代謝異常等の病態生理の解明及びピリミ
ジンヌクレオシド系代謝拮抗剤のヒトにおける有用性等
の予測を可能とし、実験用動物として有用。
子の機能が欠損した非ヒト動物及びその子孫の提供。 【効果】 核酸代謝異常等の病態生理の解明及びピリミ
ジンヌクレオシド系代謝拮抗剤のヒトにおける有用性等
の予測を可能とし、実験用動物として有用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウリジンホスホリ
ラーゼ発現不全の非ヒト動物及びその子孫に関する。
ラーゼ発現不全の非ヒト動物及びその子孫に関する。
【０００２】
【従来の技術】ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
は、ピリミジン代謝の生合成と分解に関与している酵素
であり、サルベージ経路におけるピリミジン塩基の分
解、合成を通じて生体内ヌクレオシドプールの調節とい
う重要な働きを担っている。また、哺乳類におけるピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼには、ウリジンホス
ホリラーゼとチミジンホスホリラーゼが知られており、
いずれもピリミジン代謝の生合成と分解に関与してい
る。斯かるピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝
子については、マウス及びヒトでｃＤＮＡが単離されて
おり、発現の違いが遺伝子レベルで解明されつつあるこ
とろである（Uchida et al.,J.Biol.Chem.,270,12191-1
2196(1995)、Uchida et al., Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,216,265-272(1995) ）。
は、ピリミジン代謝の生合成と分解に関与している酵素
であり、サルベージ経路におけるピリミジン塩基の分
解、合成を通じて生体内ヌクレオシドプールの調節とい
う重要な働きを担っている。また、哺乳類におけるピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼには、ウリジンホス
ホリラーゼとチミジンホスホリラーゼが知られており、
いずれもピリミジン代謝の生合成と分解に関与してい
る。斯かるピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝
子については、マウス及びヒトでｃＤＮＡが単離されて
おり、発現の違いが遺伝子レベルで解明されつつあるこ
とろである（Uchida et al.,J.Biol.Chem.,270,12191-1
2196(1995)、Uchida et al., Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,216,265-272(1995) ）。
【０００３】一方、近年癌化学療法の分野で重要な役割
を果たしているヌクレオシド系代謝拮抗剤は、その化学
構造からピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによっ
て不活性化されることが知られている。従って、当該物
質のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによる代謝
様式を正確に把握することが、優れた薬理効果を有し、
且つ副作用の少ない薬剤を開発するために必要とされ
る。
を果たしているヌクレオシド系代謝拮抗剤は、その化学
構造からピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによっ
て不活性化されることが知られている。従って、当該物
質のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによる代謝
様式を正確に把握することが、優れた薬理効果を有し、
且つ副作用の少ない薬剤を開発するために必要とされ
る。
【０００４】しかし、ウリジンホスホリラーゼとチミジ
ンホスホリラーゼは、種によってその分布に大きな差が
見られ、ヒトにおいてはチミジンホスホリラーゼが正常
組織及び腫瘍組織に共に発現しているのに対し、マウス
やラットのげっ歯類においては消化管を中心に主にウリ
ジンホスホリラーゼが発現しており、チミジンホスホリ
ラーゼは肝臓などの一部の組織で発現しているにすぎな
い。従って、ヌクレオシド系抗癌剤のヒトにおける有用
性等の評価は、げっ歯類でのデータからは正確に予測す
ることはできないという問題があった。
ンホスホリラーゼは、種によってその分布に大きな差が
見られ、ヒトにおいてはチミジンホスホリラーゼが正常
組織及び腫瘍組織に共に発現しているのに対し、マウス
やラットのげっ歯類においては消化管を中心に主にウリ
ジンホスホリラーゼが発現しており、チミジンホスホリ
ラーゼは肝臓などの一部の組織で発現しているにすぎな
い。従って、ヌクレオシド系抗癌剤のヒトにおける有用
性等の評価は、げっ歯類でのデータからは正確に予測す
ることはできないという問題があった。
【０００５】他方、チミジンホスホリラーゼは、血管新
生促進因子としての働きを持つことが知られているが、
最近になってミトコンドリア病の一つであるＭＮＧＩＥ
の原因遺伝子として同定されている。
生促進因子としての働きを持つことが知られているが、
最近になってミトコンドリア病の一つであるＭＮＧＩＥ
の原因遺伝子として同定されている。
【０００６】従って、ウリジンホスホリラーゼ発現不全
動物が系統的に得られれば、当該タンパク質の生理機能
の研究や関連疾患の解明及びピリミジンヌクレオシド系
代謝拮抗剤（抗癌剤）の開発研究のための実験動物とし
て有用である。
動物が系統的に得られれば、当該タンパク質の生理機能
の研究や関連疾患の解明及びピリミジンヌクレオシド系
代謝拮抗剤（抗癌剤）の開発研究のための実験動物とし
て有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、実験動物と
して利用可能なウリジンホスホリラーゼ発現不全非ヒト
動物及びその子孫を提供することを目的とする。
して利用可能なウリジンホスホリラーゼ発現不全非ヒト
動物及びその子孫を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、斯かる実
状に鑑み、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の変異及びタ
ーゲティングベクターの設計等について種々研究した結
果、実質的に機能しないウリジンホスホリラーゼ遺伝子
を有する形質転換動物及びその子孫を作製することに成
功し、本発明を完成した。
状に鑑み、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の変異及びタ
ーゲティングベクターの設計等について種々研究した結
果、実質的に機能しないウリジンホスホリラーゼ遺伝子
を有する形質転換動物及びその子孫を作製することに成
功し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち本発明は、染色体上のウリジンホ
スホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物及びそ
の子孫を提供するものである。
スホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物及びそ
の子孫を提供するものである。
【００１０】近年、遺伝子工学の発展に伴い、種々の遺
伝子を人為的に操作することが可能となり、外来性の遺
伝形質を人為的に付加したり、生物が持っている遺伝形
質の発現を抑制した様々な形質転換動物が作り出されて
いる（Nature,Vol.300,pp.611-615, 16 December 1982
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.7688-7692,Octo
ber 1990等）が、染色体上のウリジンホスホリラーゼ遺
伝子の機能が欠損し、且つ遺伝的に安定な動物はこれま
でに知られていない。
伝子を人為的に操作することが可能となり、外来性の遺
伝形質を人為的に付加したり、生物が持っている遺伝形
質の発現を抑制した様々な形質転換動物が作り出されて
いる（Nature,Vol.300,pp.611-615, 16 December 1982
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.7688-7692,Octo
ber 1990等）が、染色体上のウリジンホスホリラーゼ遺
伝子の機能が欠損し、且つ遺伝的に安定な動物はこれま
でに知られていない。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明において、「染色体上のウ
リジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した」とは、
体細胞及び生殖細胞の染色体上のウリジンホスホリラー
ゼ遺伝子が、その塩基配列の一部の欠失又は他の遺伝子
の挿入若しくは置換等により元来の構造とは異なったも
のとなり、ウリジンホスホリラーゼとして機能するタン
パク質を産生することができないか或いは遺伝子産物が
得られてもそのタンパク質がウリジンホスホリラーゼと
して機能しないものであることをいい、具体的には、プ
ロモーター領域又はコード領域の塩基配列の欠失、挿入
又は置換等の遺伝子変異によってその機能が破壊された
もの等が挙げられる。即ち、「染色体上のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物」とは、
ウリジンホスホリラーゼ遺伝子（変異型ウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子）を遺伝子工学的な手法を用い、改変
（操作）して作出されたウリジンホスホリラーゼ発現不
全動物を意味する。
リジンホスホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した」とは、
体細胞及び生殖細胞の染色体上のウリジンホスホリラー
ゼ遺伝子が、その塩基配列の一部の欠失又は他の遺伝子
の挿入若しくは置換等により元来の構造とは異なったも
のとなり、ウリジンホスホリラーゼとして機能するタン
パク質を産生することができないか或いは遺伝子産物が
得られてもそのタンパク質がウリジンホスホリラーゼと
して機能しないものであることをいい、具体的には、プ
ロモーター領域又はコード領域の塩基配列の欠失、挿入
又は置換等の遺伝子変異によってその機能が破壊された
もの等が挙げられる。即ち、「染色体上のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物」とは、
ウリジンホスホリラーゼ遺伝子（変異型ウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子）を遺伝子工学的な手法を用い、改変
（操作）して作出されたウリジンホスホリラーゼ発現不
全動物を意味する。
【００１２】ここで、「非ヒト動物」としては、ウリジ
ンホスホリラーゼ遺伝子を有するヒト以外の動物あれば
何れでもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺
乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウ
ス、ラットなどが挙げられるが、病体動物モデル系の作
製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、ま
た、繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラッ
トが好ましい。
ンホスホリラーゼ遺伝子を有するヒト以外の動物あれば
何れでもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺
乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウ
ス、ラットなどが挙げられるが、病体動物モデル系の作
製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、ま
た、繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラッ
トが好ましい。
【００１３】染色体上のウリジンホスホリラーゼ遺伝子
の破壊は、通常染色体上の遺伝子を破壊するのに用いら
れている方法を適用することができ、具体的には、ウリ
ジンホスホリラーゼ遺伝子をクローニングし、インビト
ロでその遺伝子の機能を欠損した後に、該欠損遺伝子を
動物に戻すことによりその動物及びその子孫の該遺伝子
の機能を欠損させる方法が用いられる。
の破壊は、通常染色体上の遺伝子を破壊するのに用いら
れている方法を適用することができ、具体的には、ウリ
ジンホスホリラーゼ遺伝子をクローニングし、インビト
ロでその遺伝子の機能を欠損した後に、該欠損遺伝子を
動物に戻すことによりその動物及びその子孫の該遺伝子
の機能を欠損させる方法が用いられる。
【００１４】また、動物に遺伝子を導入する手法として
は、例えば（１）遺伝子ＤＮＡを受精卵の前核期胚に注
入する方法、（２）組換えレトロウイルスを初期胚に感
染させる方法、（３）相同組換えを起こさせた胚性幹細
胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞又は８細胞期胚に注入する方
法、等が挙げられ、本発明の非ヒト動物を得るためには
これらの何れも方法も用いることができるが、このうち
ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、相同組換えによ
り遺伝子を破壊するのに適しており、ＥＳ細胞に遺伝子
を導入する工程とキメラ動物を作出する工程とを分けて
行えるという利点を有している点で好ましい。
は、例えば（１）遺伝子ＤＮＡを受精卵の前核期胚に注
入する方法、（２）組換えレトロウイルスを初期胚に感
染させる方法、（３）相同組換えを起こさせた胚性幹細
胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞又は８細胞期胚に注入する方
法、等が挙げられ、本発明の非ヒト動物を得るためには
これらの何れも方法も用いることができるが、このうち
ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、相同組換えによ
り遺伝子を破壊するのに適しており、ＥＳ細胞に遺伝子
を導入する工程とキメラ動物を作出する工程とを分けて
行えるという利点を有している点で好ましい。
【００１５】従って、本発明の非ヒト動物は、先ず変異
型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子を有する細胞（例えば
ＥＳ細胞）を作出し、該細胞を動物に移植することによ
りキメラ動物を作出することができ、更に斯かるキメラ
動物を他の個体と交配することによりその構成細胞の全
てにおいて当該変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子が
ヘテロ又はホモで欠損している動物を作出することがで
きる。以下に本発明の非ヒト動物及びその子孫の代表的
な作成方法について詳細に説明する。
型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子を有する細胞（例えば
ＥＳ細胞）を作出し、該細胞を動物に移植することによ
りキメラ動物を作出することができ、更に斯かるキメラ
動物を他の個体と交配することによりその構成細胞の全
てにおいて当該変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子が
ヘテロ又はホモで欠損している動物を作出することがで
きる。以下に本発明の非ヒト動物及びその子孫の代表的
な作成方法について詳細に説明する。
【００１６】ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の変異体
（変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子）を得るために
は、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を
欠失又は他の遺伝子の挿入若しくは置換することにより
行われる。欠失、挿入等の部位は、機能する遺伝子産物
が得られなくなる部位であれば特に限定されず、プロモ
ーター領域、イントロン領域、エクソン領域等いずれで
あってもよいが、該遺伝子の発現能を確実に欠損させる
には、プロモーター領域又はコード領域の少なくとも一
部を変異させることが好ましい。また、欠失、置換又は
挿入した部位にレポーター遺伝子など別の遺伝子を挿入
することもできる。例えば、マウスのウリジンホスホリ
ラーゼ遺伝子は、図１及び図２に示すごとく、７個のコ
ーディングエクソンを含んでおり、ウリジンホスホリラ
ーゼタンパクは、７個のコーディングエクソンに渡って
コードされている。従って、ウリジンホスホリラーゼ遺
伝子の発現能の欠損には、個々のエクソンのいずれか又
はこれらの一部を欠失させてもよく、またこれらのいず
れかの部位に他の遺伝子を挿入してもよい。
（変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子）を得るために
は、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を
欠失又は他の遺伝子の挿入若しくは置換することにより
行われる。欠失、挿入等の部位は、機能する遺伝子産物
が得られなくなる部位であれば特に限定されず、プロモ
ーター領域、イントロン領域、エクソン領域等いずれで
あってもよいが、該遺伝子の発現能を確実に欠損させる
には、プロモーター領域又はコード領域の少なくとも一
部を変異させることが好ましい。また、欠失、置換又は
挿入した部位にレポーター遺伝子など別の遺伝子を挿入
することもできる。例えば、マウスのウリジンホスホリ
ラーゼ遺伝子は、図１及び図２に示すごとく、７個のコ
ーディングエクソンを含んでおり、ウリジンホスホリラ
ーゼタンパクは、７個のコーディングエクソンに渡って
コードされている。従って、ウリジンホスホリラーゼ遺
伝子の発現能の欠損には、個々のエクソンのいずれか又
はこれらの一部を欠失させてもよく、またこれらのいず
れかの部位に他の遺伝子を挿入してもよい。
【００１７】ウリジンホスホリラーゼ遺伝子としては、
動物から単離、抽出されたゲノム由来のウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子、或いは遺伝子工学的手法を用いてクロ
ーニングされたｃＤＮＡであってもよい。クローニング
は、例えばマウスの肝からゲノムＤＮＡを抽出し、常法
に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれをすで
にクローニングされているウリジンホスホリラーゼｍＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（マウスにつ
いてはUchida et al., J.Biol.Chem.,270,12191-12196
(1995) ）の部分配列をプローブとして用いてスクリー
ニングすることにより取得することができる。上記のウ
リジンホスホリラーゼ遺伝子に人為的に変異を加える方
法は、インビトロで常用のＤＮＡ組換え技術により行う
ことができる。
動物から単離、抽出されたゲノム由来のウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子、或いは遺伝子工学的手法を用いてクロ
ーニングされたｃＤＮＡであってもよい。クローニング
は、例えばマウスの肝からゲノムＤＮＡを抽出し、常法
に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれをすで
にクローニングされているウリジンホスホリラーゼｍＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（マウスにつ
いてはUchida et al., J.Biol.Chem.,270,12191-12196
(1995) ）の部分配列をプローブとして用いてスクリー
ニングすることにより取得することができる。上記のウ
リジンホスホリラーゼ遺伝子に人為的に変異を加える方
法は、インビトロで常用のＤＮＡ組換え技術により行う
ことができる。
【００１８】尚、レポーター遺伝子を挿入してエクソン
の機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、プロモ
ーターの制御下又は該遺伝子と融合した形で発現するよ
うに挿入することが好ましい。ここで、レポーター遺伝
子とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示
し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺
伝子が利用されることが多く、単に導入される遺伝子が
細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織
で発現したかを調べることができる。具体的には、ｌａ
ｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子）等が用いられる。
の機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、プロモ
ーターの制御下又は該遺伝子と融合した形で発現するよ
うに挿入することが好ましい。ここで、レポーター遺伝
子とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示
し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺
伝子が利用されることが多く、単に導入される遺伝子が
細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織
で発現したかを調べることができる。具体的には、ｌａ
ｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子）等が用いられる。
【００１９】次に、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の機
能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベク
ターを作製する。ターゲティングベクターの設計は、染
色体由来ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の一部又は全部
を欠失させるか又は別の塩基配列を挿入するか若しくは
別の塩基配列に置き換え、その変異部分を囲む上流及び
下流の領域はウリジンホスホリラーゼ遺伝子と相同な塩
基配列を持つように設計すればよい。
能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベク
ターを作製する。ターゲティングベクターの設計は、染
色体由来ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の一部又は全部
を欠失させるか又は別の塩基配列を挿入するか若しくは
別の塩基配列に置き換え、その変異部分を囲む上流及び
下流の領域はウリジンホスホリラーゼ遺伝子と相同な塩
基配列を持つように設計すればよい。
【００２０】レポーター遺伝子を挿入する場合は、非相
同な配列部分にそのレポーター遺伝子配列が含まれるよ
うに設計すればよい。また、このターゲティングベクタ
ー中には、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相
同組換えの起こっている可能性の高い細胞を選択するた
めのマーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）、ヘルペスウィルスチミジンリン酸化酵素遺
伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリアトキシンＡフラグメ
ント（ＤＴ−Ａ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔ
ｋ）等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が挿入されて
いることが好ましい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子
は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることに
より目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的細胞を
選別除去するためにネガティブ選別に用いるマーカー遺
伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（選別剤
としてガンシクロビル、ＦＩＡＵ等を用い、それに対す
る感受性により非相同組換え体を選別除去する）、ジフ
テリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（Ｄ
Ｔ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同
組換え体を選別除去する）等をネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）等のポジティブ選別用マーカー遺伝子と共に
用いることもできる。
同な配列部分にそのレポーター遺伝子配列が含まれるよ
うに設計すればよい。また、このターゲティングベクタ
ー中には、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相
同組換えの起こっている可能性の高い細胞を選択するた
めのマーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）、ヘルペスウィルスチミジンリン酸化酵素遺
伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリアトキシンＡフラグメ
ント（ＤＴ−Ａ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔ
ｋ）等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が挿入されて
いることが好ましい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子
は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることに
より目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的細胞を
選別除去するためにネガティブ選別に用いるマーカー遺
伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（選別剤
としてガンシクロビル、ＦＩＡＵ等を用い、それに対す
る感受性により非相同組換え体を選別除去する）、ジフ
テリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（Ｄ
Ｔ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同
組換え体を選別除去する）等をネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）等のポジティブ選別用マーカー遺伝子と共に
用いることもできる。
【００２１】斯かるターゲティングベクターの調製は、
通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例え
ば、クローニングしたウリジンホスホリラーゼ遺伝子を
利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断
片、又はＰＣＲ法などにより一部を増幅して調製したＤ
ＮＡ断片などを、ＤＮＡ合成機などにより合成されたリ
ンカーＤＮＡやレポータ遺伝子、薬剤耐性マーカ遺伝子
を含む断片などと、前記のような設計に従って適当な順
序で結合させればよい。
通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例え
ば、クローニングしたウリジンホスホリラーゼ遺伝子を
利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断
片、又はＰＣＲ法などにより一部を増幅して調製したＤ
ＮＡ断片などを、ＤＮＡ合成機などにより合成されたリ
ンカーＤＮＡやレポータ遺伝子、薬剤耐性マーカ遺伝子
を含む断片などと、前記のような設計に従って適当な順
序で結合させればよい。
【００２２】次に、調製した相同組換え用ターゲティン
グベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当
な細胞へ導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞
や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、生体のあら
ゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有し
ている点でＥＳ細胞が好ましい。また、ベクターＤＮＡ
を細胞中に導入する方法は、通常の方法、例えば、エレ
クトロポレーション法、マイクロインジェクション法、
リン酸カルシウム法等によって行うことができる。
グベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当
な細胞へ導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞
や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、生体のあら
ゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有し
ている点でＥＳ細胞が好ましい。また、ベクターＤＮＡ
を細胞中に導入する方法は、通常の方法、例えば、エレ
クトロポレーション法、マイクロインジェクション法、
リン酸カルシウム法等によって行うことができる。
【００２３】ＥＳ細胞は、１２９系マウスの胚盤胞の内
部細胞塊から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・
培養可能な細胞株であり、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入
の方法はマウスについては確立されている（Mansour,
S. L. et al., Nature 336:348 (1988)）。ＥＳ細胞の
培養は、原理的には哺乳動物一般で可能であると考えら
れ、マウスの他にＪラット、ウサギ又はブタ、ウシ等の
家畜についてもＥＳ細胞の樹立を確立すべく研究が進展
している。尚、ＥＳ細胞が培養されていないか、又は培
養されていても生殖細胞にまで分化する細胞系が確立し
ていない動物種については、前記した（１）又は（２）
等の方法により変異遺伝子を導入すればよい。
部細胞塊から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・
培養可能な細胞株であり、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入
の方法はマウスについては確立されている（Mansour,
S. L. et al., Nature 336:348 (1988)）。ＥＳ細胞の
培養は、原理的には哺乳動物一般で可能であると考えら
れ、マウスの他にＪラット、ウサギ又はブタ、ウシ等の
家畜についてもＥＳ細胞の樹立を確立すべく研究が進展
している。尚、ＥＳ細胞が培養されていないか、又は培
養されていても生殖細胞にまで分化する細胞系が確立し
ていない動物種については、前記した（１）又は（２）
等の方法により変異遺伝子を導入すればよい。
【００２４】ターゲティングベクターの変異型ウリジン
ホスホリラーゼ遺伝子配列を遺伝子相同組換えにより、
動物細胞（例えばＥＳ細胞）の染色体上のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子と入れ換えることにより行うことがで
きる。この時、ターゲティングベクターＤＮＡ中に挿入
されていたマーカー遺伝子及びレポーター遺伝子がＥＳ
細胞のゲノムのウリジンホスホリラーゼ遺伝子に挿入さ
れる。
ホスホリラーゼ遺伝子配列を遺伝子相同組換えにより、
動物細胞（例えばＥＳ細胞）の染色体上のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子と入れ換えることにより行うことがで
きる。この時、ターゲティングベクターＤＮＡ中に挿入
されていたマーカー遺伝子及びレポーター遺伝子がＥＳ
細胞のゲノムのウリジンホスホリラーゼ遺伝子に挿入さ
れる。
【００２５】ターゲティングベクターが取り込まれた細
胞は、ベクターＤＮＡ中の薬物耐性遺伝子などのマーカ
ー遺伝子が同時に挿入され、当該遺伝子の発現に基づい
て、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより
選択することができる。選択された細胞のうち、相同組
換えによる変異が生じた細胞の解析は、ウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子上又はその近傍のＤＮＡ配列をプローブ
としたサザンハイブリダイゼーション法による解析又は
ターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッ
ティングベクターに使用したマウス由来のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプラ
イマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。
胞は、ベクターＤＮＡ中の薬物耐性遺伝子などのマーカ
ー遺伝子が同時に挿入され、当該遺伝子の発現に基づい
て、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより
選択することができる。選択された細胞のうち、相同組
換えによる変異が生じた細胞の解析は、ウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子上又はその近傍のＤＮＡ配列をプローブ
としたサザンハイブリダイゼーション法による解析又は
ターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッ
ティングベクターに使用したマウス由来のウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプラ
イマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。
【００２６】次に、この変異型ウリジンホスホリラーゼ
遺伝子座を生じた細胞を用いて、注入法や集合法等の通
常キメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動
物を作製する。具体的には、変異型の遺伝子座を生じた
細胞（例えばＥＳ細胞）を胚形成の初期の適当な時期、
例えば８細胞期の非ヒト動物胚又は胚盤胞に注入し、得
られた胚を偽妊娠動物の子宮内に移植することにより、
正常なウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞と変
異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞とから
構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような
系統の動物から得るかの選択は、常法に従い毛色等の表
現型によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを
区別することができるように行えばよい。
遺伝子座を生じた細胞を用いて、注入法や集合法等の通
常キメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動
物を作製する。具体的には、変異型の遺伝子座を生じた
細胞（例えばＥＳ細胞）を胚形成の初期の適当な時期、
例えば８細胞期の非ヒト動物胚又は胚盤胞に注入し、得
られた胚を偽妊娠動物の子宮内に移植することにより、
正常なウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞と変
異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ細胞とから
構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような
系統の動物から得るかの選択は、常法に従い毛色等の表
現型によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを
区別することができるように行えばよい。
【００２７】このキメラ動物の生殖細胞の一部が変異型
ウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ場合には、キメ
ラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群
より、全ての組織が変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝
子座をもつ細胞で構成された個体（ウリジンホスホリラ
ーゼ発現不全動物）を毛色等の判別法により選別し得る
ことができる。
ウリジンホスホリラーゼ遺伝子座をもつ場合には、キメ
ラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群
より、全ての組織が変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝
子座をもつ細胞で構成された個体（ウリジンホスホリラ
ーゼ発現不全動物）を毛色等の判別法により選別し得る
ことができる。
【００２８】例えば、例えばＪ１株のマウスＥＳ細胞と
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ系の宿主胚を用いて得られたキメラマウ
スをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配する場合は、娩出される
産仔は、キメラマウスの生殖細胞が、相同組換えＥＳ細
胞に由来していれば該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ
野生色( アグーチ) を呈し、宿主胚に由来していれば該
宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。ウリジン
ホスホリラーゼ遺伝子の発現欠損は、離乳に至った後に
尾からＤＮＡを注出後、サザンブロット又はＰＣＲを行
って、確認することができる。
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ系の宿主胚を用いて得られたキメラマウ
スをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配する場合は、娩出される
産仔は、キメラマウスの生殖細胞が、相同組換えＥＳ細
胞に由来していれば該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ
野生色( アグーチ) を呈し、宿主胚に由来していれば該
宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。ウリジン
ホスホリラーゼ遺伝子の発現欠損は、離乳に至った後に
尾からＤＮＡを注出後、サザンブロット又はＰＣＲを行
って、確認することができる。
【００２９】また、Ｆ１ヘテロ型発現不全産仔同士を交
配すれば、Ｆ２ヘテロ型発現不全産仔及びＦ２ホモ型発
現不全産仔を得ることができる。本発明の非ヒト動物
は、キメラ型動物、Ｆ１ヘテロ型発現不全動物及びＦ２
ホモ型発現不全動物を包含するものであるが、ウリジン
ホスホリラーゼ遺伝子の発現欠損の効果の点からＦ２ホ
モ型発現不全動物が好ましい。
配すれば、Ｆ２ヘテロ型発現不全産仔及びＦ２ホモ型発
現不全産仔を得ることができる。本発明の非ヒト動物
は、キメラ型動物、Ｆ１ヘテロ型発現不全動物及びＦ２
ホモ型発現不全動物を包含するものであるが、ウリジン
ホスホリラーゼ遺伝子の発現欠損の効果の点からＦ２ホ
モ型発現不全動物が好ましい。
【００３０】かくして得られた形質転換非ヒト動物は、
体細胞及び生殖細胞の染色体上のウリジンホスホリラー
ゼ遺伝子の発現能が欠損しており、且つ当該欠損は遺伝
的に安定である。
体細胞及び生殖細胞の染色体上のウリジンホスホリラー
ゼ遺伝子の発現能が欠損しており、且つ当該欠損は遺伝
的に安定である。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明する。
明する。
【００３２】実施例１マウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡのターゲテ
ィングベクターの作製 １２９ＳＶマウスの肝のゲノムＤＮＡを、ラムダFIXII
に連結した組換えファージのライブラリーを得（Strata
gene社製）、これを大腸菌ＬＥ３９２に感染させた。こ
うして得られたマウスゲノムライブラリーについて、マ
ウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子のｃＤＮＡ（Uchida
et al., J.Biol.Chem.,270,12191-12196(1995) ）をプ
ローブとしてハイブリダイゼーションを行い、１×１０
6 個のプラークについて検索した結果、２個の陽性クロ
ーンを得た（図１：クローンNo.７及びクローンNo.
６）。これを用いてウリジンホスホリラーゼ遺伝子のイ
ントロン１を含む約１．８ｋｂのSacI-SacI 断片（図
１：ＤＮＡ１）とエクソン３から７までを含む約７．０
ｋｂのXbaI-XbaI 断片（図１：ＤＮＡ２）をサブクロー
ニングした。
ィングベクターの作製 １２９ＳＶマウスの肝のゲノムＤＮＡを、ラムダFIXII
に連結した組換えファージのライブラリーを得（Strata
gene社製）、これを大腸菌ＬＥ３９２に感染させた。こ
うして得られたマウスゲノムライブラリーについて、マ
ウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子のｃＤＮＡ（Uchida
et al., J.Biol.Chem.,270,12191-12196(1995) ）をプ
ローブとしてハイブリダイゼーションを行い、１×１０
6 個のプラークについて検索した結果、２個の陽性クロ
ーンを得た（図１：クローンNo.７及びクローンNo.
６）。これを用いてウリジンホスホリラーゼ遺伝子のイ
ントロン１を含む約１．８ｋｂのSacI-SacI 断片（図
１：ＤＮＡ１）とエクソン３から７までを含む約７．０
ｋｂのXbaI-XbaI 断片（図１：ＤＮＡ２）をサブクロー
ニングした。
【００３３】次いで、ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の
構造を破壊するためのターゲティングベクターの作製を
行った。pBluescriptIISK （＋）プラスミドにネオマイ
シン耐性遺伝子(pGK−neo)を挿入し、さらに５’側上流
にはジフテリア毒素Ａ遺伝子（DT−A ）を本来の転写方
向とは逆に挿入し、その間にゲノムＤＮＡとの相同部分
としてウリジンホスホリラーゼ遺伝子のイントロン１を
含む約１．８ｋｂのSacI-SacI 断片（図１，２：ＤＮＡ
１）とpGK −neo の３’側下流にコーディングエクソン
３から７までを含む約７．０ｋｂのXbaI-XbaI 断片（図
１，２：ＤＮＡ２）を挿入しUP-neo（図１，２）を得
た。さらに発現解析用のレポーター遺伝子としてＤＮＡ
１とpGK −neo の間にスプライシングアクセプター(SA)
と核移行シグナルの付加したSA-NLacZ遺伝子を挿入して
UP-LacZ を得た（図１，２）。いずれのコンストラクト
もＥＳ細胞への導入の際に制限酵素NotIで切断して線状
化し、ターゲティングベクターを得た。
構造を破壊するためのターゲティングベクターの作製を
行った。pBluescriptIISK （＋）プラスミドにネオマイ
シン耐性遺伝子(pGK−neo)を挿入し、さらに５’側上流
にはジフテリア毒素Ａ遺伝子（DT−A ）を本来の転写方
向とは逆に挿入し、その間にゲノムＤＮＡとの相同部分
としてウリジンホスホリラーゼ遺伝子のイントロン１を
含む約１．８ｋｂのSacI-SacI 断片（図１，２：ＤＮＡ
１）とpGK −neo の３’側下流にコーディングエクソン
３から７までを含む約７．０ｋｂのXbaI-XbaI 断片（図
１，２：ＤＮＡ２）を挿入しUP-neo（図１，２）を得
た。さらに発現解析用のレポーター遺伝子としてＤＮＡ
１とpGK −neo の間にスプライシングアクセプター(SA)
と核移行シグナルの付加したSA-NLacZ遺伝子を挿入して
UP-LacZ を得た（図１，２）。いずれのコンストラクト
もＥＳ細胞への導入の際に制限酵素NotIで切断して線状
化し、ターゲティングベクターを得た。
【００３４】実施例２相同組換え用ＤＮＡの導入によるＥＳ細胞のウリジンホ
スホリラーゼ遺伝子の欠損 二種類の相同組換え用ＤＮＡ（UP-neoとUP-LacZ ）２５
μｇをそれぞれマウスＥＳ細胞（Ｊ１株）２×１０7 個
を含むエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁させ、電
界強度（Field Strength）４００Ｖ／ｃｍ、静電容量
（Capacitance ）２５μＦの条件で、遺伝子導入を行っ
た。UP-neoは導入後４６時間からUP-LacZは導入後４４
時間から１７５μｇ／ｍｌのＧ４１８（Genetisin,GIBC
O BRL）濃度で選択培養を行った。
スホリラーゼ遺伝子の欠損 二種類の相同組換え用ＤＮＡ（UP-neoとUP-LacZ ）２５
μｇをそれぞれマウスＥＳ細胞（Ｊ１株）２×１０7 個
を含むエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁させ、電
界強度（Field Strength）４００Ｖ／ｃｍ、静電容量
（Capacitance ）２５μＦの条件で、遺伝子導入を行っ
た。UP-neoは導入後４６時間からUP-LacZは導入後４４
時間から１７５μｇ／ｍｌのＧ４１８（Genetisin,GIBC
O BRL）濃度で選択培養を行った。
【００３５】Ｇ４１８耐性コロニーを、それぞれ遺伝子
導入後１８４時間後から、マイクロピペットを用いて４
０μｌの０．０５％トリプシン-HBS-EDTA 溶液を含む９
６穴のマイクロプレートに移し換え、５分間処理した
後、ピペッティングすることによって単一細胞にし、こ
れらを半分に分け９６穴のマイクロプレートに移し換
え、培養を行った。十分に増殖したところで２４穴のマ
イクロプレートに移し、さらに培養を続けた。半分は液
体窒素で保存し、残りの半分をサザンハイブリダイゼー
ションによる組換え体検出のためのＤＮＡ抽出に使用し
た。 ＤＮＡ抽出は常法に従い行ったが、検体数が多い
ため、ProteinaseK 処理、イソプロパノール処理で沈殿
してきたＤＮＡをEcoRI で切断してサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。プローブは図１に示すように、タ
ーゲティングベクターに使用した５’側ホモロジー領域
の更に上流に位置するEcoRI-SacI断片約１．３ｋｂの断
片を使用したこのプローブを用いるとサザンハイブリダ
イゼーションによるバンドは非相同組換えＥＳ細胞では
１０ｋｂとなるがUP-neoで相同組換えを起こしたものに
おいてはネオマイシン耐性遺伝子挿入に伴うEcoRI 切断
部位の導入により５．１ｋｂ、UP-LacZ においては６．
１ｋｂとなることが期待できた。
導入後１８４時間後から、マイクロピペットを用いて４
０μｌの０．０５％トリプシン-HBS-EDTA 溶液を含む９
６穴のマイクロプレートに移し換え、５分間処理した
後、ピペッティングすることによって単一細胞にし、こ
れらを半分に分け９６穴のマイクロプレートに移し換
え、培養を行った。十分に増殖したところで２４穴のマ
イクロプレートに移し、さらに培養を続けた。半分は液
体窒素で保存し、残りの半分をサザンハイブリダイゼー
ションによる組換え体検出のためのＤＮＡ抽出に使用し
た。 ＤＮＡ抽出は常法に従い行ったが、検体数が多い
ため、ProteinaseK 処理、イソプロパノール処理で沈殿
してきたＤＮＡをEcoRI で切断してサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。プローブは図１に示すように、タ
ーゲティングベクターに使用した５’側ホモロジー領域
の更に上流に位置するEcoRI-SacI断片約１．３ｋｂの断
片を使用したこのプローブを用いるとサザンハイブリダ
イゼーションによるバンドは非相同組換えＥＳ細胞では
１０ｋｂとなるがUP-neoで相同組換えを起こしたものに
おいてはネオマイシン耐性遺伝子挿入に伴うEcoRI 切断
部位の導入により５．１ｋｂ、UP-LacZ においては６．
１ｋｂとなることが期待できた。
【００３６】ハイブリダイゼーションの結果は、Bio-Im
age Analyzer BAS2000（Fuji）により解析した。その頻
度はUP-neoが７０クローン中１クローン、UP-LacZ は１
３５クローン中４クローンが相同組換えを起こしていた
（図３）。変異型遺伝子座と野生型遺伝子座のバンドが
ほぼ同じ強さで出る細胞を選択し、それを胚盤胞に導入
した。
age Analyzer BAS2000（Fuji）により解析した。その頻
度はUP-neoが７０クローン中１クローン、UP-LacZ は１
３５クローン中４クローンが相同組換えを起こしていた
（図３）。変異型遺伝子座と野生型遺伝子座のバンドが
ほぼ同じ強さで出る細胞を選択し、それを胚盤胞に導入
した。
【００３７】実施例３キメラマウスの作出とウリジンホスホリラーゼ発現不全
マウスの選別 キメラマウスはBradley らの方法（Bradley, A. (198
7). Production and analysis of chimeric mice in te
ratocarcinomas and embryonic stem cells;A practica
l approach. E. J. Robertoson ed. (Oxford:IRL pres
s), pp113-151）、Gossler の方法（Gossler, A., Doet
schman, T., Korn, R., Serfling, E., andKemler, R.
(1986). Transgenesis by means of blastocyst-derive
d embryonic stem cell lines. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 83, 9065-9069）により作製した。C57BL/6 の
交尾後3.5 日目に卵管より胚盤胞を取得し、その内腔に
約７個の相同組換えES細胞を導入した。それを擬妊娠さ
せたICR マウスの子宮内に戻し、この仮親から生まれた
キメラマウスの中でES細胞の寄与が大きいと考えられる
体毛の黒色が淡くなったマウスをそれぞれ２匹づつを選
び、C57BL/6 と交配を行った。生まれたマウスでアグー
チ色のマウスについて、尻尾よりDNA を抽出し、常法に
よりサザンハイブリダイゼーションを行った。尻尾から
のDNA 抽出は、ProteinaseK 処理後フェノール抽出、ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿行いＴＥ溶液に溶解し
た。組換えを起こした遺伝子座を持つマウスを選び、そ
のマウス同士を交配し、ホモで変異型ウリジンホスホリ
ラーゼ遺伝子座を有するマウスを取得した。
マウスの選別 キメラマウスはBradley らの方法（Bradley, A. (198
7). Production and analysis of chimeric mice in te
ratocarcinomas and embryonic stem cells;A practica
l approach. E. J. Robertoson ed. (Oxford:IRL pres
s), pp113-151）、Gossler の方法（Gossler, A., Doet
schman, T., Korn, R., Serfling, E., andKemler, R.
(1986). Transgenesis by means of blastocyst-derive
d embryonic stem cell lines. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 83, 9065-9069）により作製した。C57BL/6 の
交尾後3.5 日目に卵管より胚盤胞を取得し、その内腔に
約７個の相同組換えES細胞を導入した。それを擬妊娠さ
せたICR マウスの子宮内に戻し、この仮親から生まれた
キメラマウスの中でES細胞の寄与が大きいと考えられる
体毛の黒色が淡くなったマウスをそれぞれ２匹づつを選
び、C57BL/6 と交配を行った。生まれたマウスでアグー
チ色のマウスについて、尻尾よりDNA を抽出し、常法に
よりサザンハイブリダイゼーションを行った。尻尾から
のDNA 抽出は、ProteinaseK 処理後フェノール抽出、ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿行いＴＥ溶液に溶解し
た。組換えを起こした遺伝子座を持つマウスを選び、そ
のマウス同士を交配し、ホモで変異型ウリジンホスホリ
ラーゼ遺伝子座を有するマウスを取得した。
【００３８】次にEcoRI-SacI 1.3kb の断片をプローブ
にしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、
６．１kbと１０kbのバンドを示し、片方の染色体のウリ
ジンホスホリラーゼが破壊されていると判断できた。ア
グーチ色のマウスをUP-neoは２１匹、UP-LacZ は３６匹
取得し、サザンハイブリダイゼーションで解析したとこ
ろUP-neoの１１匹が５．１kbと１０kbのバンドを、UP-L
acZ の１６匹が６．１kbと１０kbのバンドを示した。そ
の後それらのマウスを相互に交配し、最終的にUP-neo
５．１kb、UP-LacZ は６．１kbのバンドだけを示すマウ
ス、すなわちホモで変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝
子座を有するマウスを取得することができた（図４）。
生まれてきたマウスは見かけ上異常が見出されず、全く
健康な状態で生まれてくることがわかった。リッターメ
イト間で、ＵＰ +/+、+/- 、-/- の遺伝子型を持つマウ
スが、ほぼ１：２：１の比率で生まれてくることから、
遺伝子背景に関係なく、ＵＰ-/- も全く健康な状態で生
まれていると判断できた。
にしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、
６．１kbと１０kbのバンドを示し、片方の染色体のウリ
ジンホスホリラーゼが破壊されていると判断できた。ア
グーチ色のマウスをUP-neoは２１匹、UP-LacZ は３６匹
取得し、サザンハイブリダイゼーションで解析したとこ
ろUP-neoの１１匹が５．１kbと１０kbのバンドを、UP-L
acZ の１６匹が６．１kbと１０kbのバンドを示した。そ
の後それらのマウスを相互に交配し、最終的にUP-neo
５．１kb、UP-LacZ は６．１kbのバンドだけを示すマウ
ス、すなわちホモで変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝
子座を有するマウスを取得することができた（図４）。
生まれてきたマウスは見かけ上異常が見出されず、全く
健康な状態で生まれてくることがわかった。リッターメ
イト間で、ＵＰ +/+、+/- 、-/- の遺伝子型を持つマウ
スが、ほぼ１：２：１の比率で生まれてくることから、
遺伝子背景に関係なく、ＵＰ-/- も全く健康な状態で生
まれていると判断できた。
【００３９】実施例４正常及びミュータントマウスにおけるウリジンホスホリ
ラーゼ活性 ホモで変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子を有するマ
ウスについてウリジンホスホリラーゼ活性の有無を調べ
た。即ちウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス及びコ
ントロール（正常）として同じ遺伝子背景の非組換え体
マウスより小腸および肝組織を摘出し、4 倍量の緩衝液
（50mM Tris-HCl，10mM 2-メルカプトエタノール，25
mM KCl ，5mM MgCl 2 ）を加えてホモジナイズし、10
5 ，000gで６０分間遠心分離したのち、その上清を用い
て活性を測定した。ウリジンホスホリラーゼ活性は池中
らの方法（Ikenaka et al., Metabolism of pyrimid
ine nucleotides in various tissues and tumor cells
from rodents. Gann. 1981 Aug; 72(4): 590-7）に従
って[ 3 H]ウリジンからの[ 3 H]ウラシルの生成を測定
した。また同時に、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ群のもう一つの酵素であるチミジンホスホリラーゼ
活性を[ 3 H]チミジンからの[ 3 H]チミンの生成で測定
した。結果を表１に示す。
ラーゼ活性 ホモで変異型ウリジンホスホリラーゼ遺伝子を有するマ
ウスについてウリジンホスホリラーゼ活性の有無を調べ
た。即ちウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス及びコ
ントロール（正常）として同じ遺伝子背景の非組換え体
マウスより小腸および肝組織を摘出し、4 倍量の緩衝液
（50mM Tris-HCl，10mM 2-メルカプトエタノール，25
mM KCl ，5mM MgCl 2 ）を加えてホモジナイズし、10
5 ，000gで６０分間遠心分離したのち、その上清を用い
て活性を測定した。ウリジンホスホリラーゼ活性は池中
らの方法（Ikenaka et al., Metabolism of pyrimid
ine nucleotides in various tissues and tumor cells
from rodents. Gann. 1981 Aug; 72(4): 590-7）に従
って[ 3 H]ウリジンからの[ 3 H]ウラシルの生成を測定
した。また同時に、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ群のもう一つの酵素であるチミジンホスホリラーゼ
活性を[ 3 H]チミジンからの[ 3 H]チミンの生成で測定
した。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】その結果、非組換え体（正常）マウスでは
小腸組織でウリジンホスホリラーゼ活性が高かったが、
ウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスではこの活性が
著明に減少、消失していた。肝ではウリジンホスホリラ
ーゼ活性は低く、チミジンホスホリラーゼが高く発現し
ていた（正常マウス）が、ウリジンホスホリラーゼ発現
不全マウスはそのウリジンホスホリラーゼ活性ほぼ消失
していた。
小腸組織でウリジンホスホリラーゼ活性が高かったが、
ウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスではこの活性が
著明に減少、消失していた。肝ではウリジンホスホリラ
ーゼ活性は低く、チミジンホスホリラーゼが高く発現し
ていた（正常マウス）が、ウリジンホスホリラーゼ発現
不全マウスはそのウリジンホスホリラーゼ活性ほぼ消失
していた。
【００４２】実施例５正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス小腸に
おけるウリジンホスホリラーゼ蛋白質の発現 正常およびウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス各々
５匹より小腸組織を摘出し、上記の方法に従って蛋白抽
出液を調製し、蛋白質濃度を５mg/ml になるように調製
し、ウェスタンブロッティング法にてウリジンホスホリ
ラーゼ蛋白質の発現を調べた。検出には抗マウスウリジ
ンホスホリラーゼポリクローナル抗体を用いた。図５に
示すようにウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスでは
ウリジンホスホリラーゼのバンドはほとんど検出されな
かった。
おけるウリジンホスホリラーゼ蛋白質の発現 正常およびウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス各々
５匹より小腸組織を摘出し、上記の方法に従って蛋白抽
出液を調製し、蛋白質濃度を５mg/ml になるように調製
し、ウェスタンブロッティング法にてウリジンホスホリ
ラーゼ蛋白質の発現を調べた。検出には抗マウスウリジ
ンホスホリラーゼポリクローナル抗体を用いた。図５に
示すようにウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスでは
ウリジンホスホリラーゼのバンドはほとんど検出されな
かった。
【００４３】実施例６正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全マウス小腸に
おける血中ウリジン濃度 正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスより、
血液を採取し、血清に分離したのち氷冷したメタノール
を9 倍量加え、氷中に30分間放置して蛋白質を十分に沈
殿させた。次にこれを遠心分離し、得られた上清を60℃
で窒素ガス気流下で乾固したのち、残渣に純水200 μl
を加えて、0.45μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ法
にてウリジン、チミジンおよびシチジン濃度を測定し
た。結果を表２に示す。
おける血中ウリジン濃度 正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスより、
血液を採取し、血清に分離したのち氷冷したメタノール
を9 倍量加え、氷中に30分間放置して蛋白質を十分に沈
殿させた。次にこれを遠心分離し、得られた上清を60℃
で窒素ガス気流下で乾固したのち、残渣に純水200 μl
を加えて、0.45μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ法
にてウリジン、チミジンおよびシチジン濃度を測定し
た。結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】表２に示したように、正常マウス血清中の
ウリジン濃度は5.33nmol/ml であったのに対し、ウリジ
ンホスホリラーゼ発現不全マウスでは27.26nmol/mlを示
し、約５倍の上昇が見られた。他の血中ヌクレオシドの
チミジンおよびシチジン濃度は正常に比べてウリジンホ
スホリラーゼ発現不全マウスで妬く倍の上昇が見られた
が、ウリジンホスホリラーゼをノックアウトすることに
よる大幅な変動は認められなかった。
ウリジン濃度は5.33nmol/ml であったのに対し、ウリジ
ンホスホリラーゼ発現不全マウスでは27.26nmol/mlを示
し、約５倍の上昇が見られた。他の血中ヌクレオシドの
チミジンおよびシチジン濃度は正常に比べてウリジンホ
スホリラーゼ発現不全マウスで妬く倍の上昇が見られた
が、ウリジンホスホリラーゼをノックアウトすることに
よる大幅な変動は認められなかった。
【００４６】実施例７正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスにおけ
るヌクレオシド系制癌剤の代謝動態 ウリジンホスホリラーゼ遺伝子をノックアウトしたこと
によるヌクレオシド系抗癌剤の血中動態の変化を５−フ
ルオロウリジン（ＦＵＲ）と５−トリフルオロチミジン
（Ｆ3 ｄＴｈｄ）を用いて調べた。
るヌクレオシド系制癌剤の代謝動態 ウリジンホスホリラーゼ遺伝子をノックアウトしたこと
によるヌクレオシド系抗癌剤の血中動態の変化を５−フ
ルオロウリジン（ＦＵＲ）と５−トリフルオロチミジン
（Ｆ3 ｄＴｈｄ）を用いて調べた。
【００４７】正常及びウリジンホスホリラーゼ発現不全
マウス（各ｎ＝３）に対して５０mg／kgのＦＵＲあるい
は１０mg／kgのＦ3 ｄＴｈｄを経口投与し、経時的に血
液を採取し、血清に分離したのちＦＵＲおよびＦ3 ｄＴ
ｈｄ濃度をＨＰＬＣ法にて測定した。結果を表３に示
す。
マウス（各ｎ＝３）に対して５０mg／kgのＦＵＲあるい
は１０mg／kgのＦ3 ｄＴｈｄを経口投与し、経時的に血
液を採取し、血清に分離したのちＦＵＲおよびＦ3 ｄＴ
ｈｄ濃度をＨＰＬＣ法にて測定した。結果を表３に示
す。
【００４８】
【表３】
【００４９】表３に示したように、ＦＵＲを経口投与し
た時、ウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスでのＦＵ
Ｒ濃度は正常のそれより、約５倍高く（１５〜３０分
値）、ウリジンホスホリラーゼ活性の欠損に伴い、生体
内でのＦＵＲの分解が抑制されていることが証明され
た。また、Ｆ3 ｄＴｈｄの場合も経口投与後３０分から
１２０分にかけてウリジンホスホリラーゼ発現不全マウ
スでのＦ3 ｄＴｈｄ濃度は正常のそれよりも１．６から
１７．８倍高く、Ｆ3 ｄＴｈｄのウリジンホスホリラー
ゼで分解される割合が減少していることが明らかとなっ
た。
た時、ウリジンホスホリラーゼ発現不全マウスでのＦＵ
Ｒ濃度は正常のそれより、約５倍高く（１５〜３０分
値）、ウリジンホスホリラーゼ活性の欠損に伴い、生体
内でのＦＵＲの分解が抑制されていることが証明され
た。また、Ｆ3 ｄＴｈｄの場合も経口投与後３０分から
１２０分にかけてウリジンホスホリラーゼ発現不全マウ
スでのＦ3 ｄＴｈｄ濃度は正常のそれよりも１．６から
１７．８倍高く、Ｆ3 ｄＴｈｄのウリジンホスホリラー
ゼで分解される割合が減少していることが明らかとなっ
た。
【００５０】以上の結果からウリジンホスホリラーゼ遺
伝子の機能を欠損させたマウスは、ヒトに類似したモデ
ルと考えられ、ピリミジンヌクレオシド系抗癌剤におい
ては、当該マウスの代謝動態からヒトでの代謝動態を予
測できるといえる。
伝子の機能を欠損させたマウスは、ヒトに類似したモデ
ルと考えられ、ピリミジンヌクレオシド系抗癌剤におい
ては、当該マウスの代謝動態からヒトでの代謝動態を予
測できるといえる。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、遺伝的に安定なウリジン
ホスホリラーゼ発現不全動物が得られる。斯かる動物
は、核酸代謝異常等の病態生理の解明及びピリミジンヌ
クレオシド系代謝拮抗剤のヒトにおける有用性等の予測
を可能とし、実験用動物として有用である。
ホスホリラーゼ発現不全動物が得られる。斯かる動物
は、核酸代謝異常等の病態生理の解明及びピリミジンヌ
クレオシド系代謝拮抗剤のヒトにおける有用性等の予測
を可能とし、実験用動物として有用である。
【図１】マウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子とそのタ
ーゲティング破壊を示す模式図である。図中、ｎｅｏは
ネオマイシン耐性遺伝子を示し、ＤＴ−Ａはジフテリア
トキシンＡフラグメント遺伝子を、ＬａｃＺはβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を示し、太実線はエクソンを、細実
線はイントロンを示す。
ーゲティング破壊を示す模式図である。図中、ｎｅｏは
ネオマイシン耐性遺伝子を示し、ＤＴ−Ａはジフテリア
トキシンＡフラグメント遺伝子を、ＬａｃＺはβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を示し、太実線はエクソンを、細実
線はイントロンを示す。
【図２】マウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子のターゲ
ティングベクターの構築図である。図中、ｎｅｏはネオ
マイシン耐性遺伝子を示し、ＤＴ−Ａはジフテリアトキ
シンＡフラグメント遺伝子を、ＬａｃＺはβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を示し、太実線はエクソンを、細実線は
イントロンを示す。
ティングベクターの構築図である。図中、ｎｅｏはネオ
マイシン耐性遺伝子を示し、ＤＴ−Ａはジフテリアトキ
シンＡフラグメント遺伝子を、ＬａｃＺはβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を示し、太実線はエクソンを、細実線は
イントロンを示す。
【図３】相同組換体ＥＳ細胞を確認するためのゲノミッ
クサザンハブリダイゼーションの結果を示す図である。
クサザンハブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図４】相同組換体マウスを確認するためのゲノミック
サザンハブリダイゼーションの結果を示す図である。図
中、＋／＋は正常マウスを、＋／−はヘテロ欠損マウス
を、−／−はホモ欠損マウスを示す。
サザンハブリダイゼーションの結果を示す図である。図
中、＋／＋は正常マウスを、＋／−はヘテロ欠損マウス
を、−／−はホモ欠損マウスを示す。
【図５】正常マウス及びウリジンホスホリラーゼ発現不
全マウスについてウリジンホスホリラーゼの発現量を示
した図である。図中、＋／＋は正常マウスを、−／−は
ホモ欠損マウスを示す。
全マウスについてウリジンホスホリラーゼの発現量を示
した図である。図中、＋／＋は正常マウスを、−／−は
ホモ欠損マウスを示す。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA11 AA20 BA80 CA01 DA02 GA18 HA11 HA17 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA90X AA91Y AB01 AB04 AC20 BA03 BA25 BB01 CA43 CA44 CA46
Claims (7)
- 【請求項１】 染色体上のウリジンホスホリラーゼ遺伝
子の機能が欠損した非ヒト動物及びその子孫。 - 【請求項２】 ウリジンホスホリラーゼ遺伝子の一部の
ＤＮＡ配列を欠失させるか、又はいずれかの部位に他の
遺伝子を挿入若しくは置換することによりウリジンホス
ホリラーゼ遺伝子の機能が欠損したものである請求項１
記載の非ヒト動物及びその子孫。 - 【請求項３】 他の遺伝子が、マーカー遺伝子又はレポ
ーター遺伝子である請求項２記載の非ヒト動物及びその
子孫。 - 【請求項４】 マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺
伝子である請求項３記載の非ヒト動物及びその子孫。 - 【請求項５】 マウスウリジンホスホリラーゼ遺伝子の
第２コーディングエクソンの代りにネオマイシン耐性遺
伝子が挿入されたものである請求項１〜４のいずれか１
項記載の非ヒト動物及びその子孫。 - 【請求項６】 動物が、げっ歯動物である請求項１〜５
のいずれか１項に記載の非ヒト動物及びその子孫。 - 【請求項７】 げっ歯動物が、マウスである請求項６記
載の非ヒト動物及びその子孫。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35979699A JP2001169684A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ウリジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
| EP00981751A EP1153543B1 (en) | 1999-12-17 | 2000-12-15 | Animals which are deficient in expressing uridine-phosphorylase |
| US09/890,971 US6566582B1 (en) | 1999-12-17 | 2000-12-15 | Animals with insufficient expression of uridine phosphorylase |
| PCT/JP2000/008898 WO2001043539A1 (fr) | 1999-12-17 | 2000-12-15 | Animaux presentant une expression insuffisante d'uridine phosphorylase |
| DE60030539T DE60030539T2 (de) | 1999-12-17 | 2000-12-15 | Tiere mit defizienter expression der uridin-phosphorylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35979699A JP2001169684A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ウリジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001169684A true JP2001169684A (ja) | 2001-06-26 |
Family
ID=18466340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35979699A Pending JP2001169684A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ウリジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6566582B1 (ja) |
| EP (1) | EP1153543B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001169684A (ja) |
| DE (1) | DE60030539T2 (ja) |
| WO (1) | WO2001043539A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003092956A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | チミジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
| USRE46284E1 (en) | 2005-01-26 | 2017-01-24 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of administrating an anticancer drug containing α, α, α-trifluorothymidine and thymidine phosphorylase inhibitor |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100574041B1 (ko) * | 2003-10-27 | 2006-04-26 | 삼성전자주식회사 | 애드호크 네트워크 무선통신 시스템 및 그 무선통신방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060985A2 (en) * | 2000-02-14 | 2001-08-23 | Yale University | Compositions, methods and kits relating to uridine phosphorylase gene mutations |
-
1999
- 1999-12-17 JP JP35979699A patent/JP2001169684A/ja active Pending
-
2000
- 2000-12-15 US US09/890,971 patent/US6566582B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 WO PCT/JP2000/008898 patent/WO2001043539A1/ja active IP Right Grant
- 2000-12-15 DE DE60030539T patent/DE60030539T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 EP EP00981751A patent/EP1153543B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003092956A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | チミジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
| USRE46284E1 (en) | 2005-01-26 | 2017-01-24 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of administrating an anticancer drug containing α, α, α-trifluorothymidine and thymidine phosphorylase inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001043539A1 (fr) | 2001-06-21 |
| EP1153543A1 (en) | 2001-11-14 |
| EP1153543B1 (en) | 2006-09-06 |
| DE60030539D1 (de) | 2006-10-19 |
| US6566582B1 (en) | 2003-05-20 |
| DE60030539T2 (de) | 2007-08-30 |
| EP1153543A4 (en) | 2002-05-08 |
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