DE60030539T2

DE60030539T2 - Tiere mit defizienter expression der uridin-phosphorylase

Info

Publication number: DE60030539T2
Application number: DE60030539T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Noda; Hiroaki Tsujimoto; Masakazv Fukushima
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: EP1153543A4; EP1153543A1; EP1153543B1; US6566582B1; WO2001043539A1; JP2001169684A; DE60030539D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Nagetiere, denen es daran mangelt, Uridinphosphorylase zu exprimieren, und ihre Nachkommenschaft.
Stand der Technik
Pyrimidinnucleosidphosphorylasen sind Enzyme, die an der Biosynthese und dem Abbau von Pyridin bei seinem Stoffwechsel beteiligt sind, und spielen eine wichtige Rollen bei der Regulierung des in-vitro-Nucleosid-Pools durch Abbau und Synthese von Pyrimidinbasen im Bergungsweg. Ferner ist es bekannt, dass Pyrimidinnucleosidphosphorylasen in Säugern Pyrimidinphosphorylase und Thymidinphosphorylase umfassen, die beide an der Biosynthese und dem Abbau in ihrem Stoffwechsel teilnehmen. Was solche Pyrimidinnucleosidphosphorylase-Gene betrifft, wurden aus Mäusen und Menschen cDNA's isoliert, und nun findet die Ermittlung ihrer Unterschiede bei der Expression auf dem Gen-Niveau statt [Uchida et al., J. Biol. Chem., 270, 12191–19196 (1995); Uchida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 216, 265–272 (1995)].
Andererseits ist es bekannt, dass Nucleosid-Antimetaboliten, die in jüngster Zeit eine wichtige Rolle auf dem Gebiet der Krebs-Chemotherapie spielen, durch Pyrimidinnucleosidphosphorylase aufgrund ihrer chemischen Strukturen inaktiviert werden. Für die Entwicklung von Arzneimitteln, die hervorragende pharmakologische Wirkungen zeigen und geringe Nebenwirkungen, wird deshalb in Betracht gezogen, dass es erforderlich ist, den Mechanismus des Stoffwechsels dieser Substanzen durch Pyrimidinnucleosidphosphorylase genau zu verstehen.
Es wurde jedoch festgestellt, dass Pyrimidinphosphorylase und Thymidinphosphorylase abhängig von Arten wesentliche Unterschiede in ihrer Verteilung aufweisen. Im Menschen wird die Thymidinphosphorylase sowohl in normalen Geweben als auch in Tumorgeweben exprimiert, während in Nagetieren, z.B. Mäuse und Ratten, Uridinphosphorlase primär um den Verdauungstrakt und Thymidinphosphorylase nur in einigen Geweben, wie z.B. Leber, exprimiert wird. Dies hat zu dem Problem geführt, dass die Brauchbarkeit von Nucleosid-Antikrebsmitteln im Menschen aus Daten bei Nagetieren nicht genau vorhergesagt werden kann.
Andererseits ist es bekannt, dass Thymidinphosphorylase als angiogener Faktor fungiert. Sie wurde kürzlich als verursachendes Gen von MNGIE, einer Mitochondrienerkrankung, identifiziert.
Tiere mit mangelnder Uridinphosphorylase-Expression werden deshalb, wenn sie in phyletischer Abstammung erhältlich sind, als Versuchstiere zur Untersuchung physiologischer Funktionen des Proteins, zur Ermittlung der damit zusammenhängenden Erkrankungen und auch zur Entwicklung und Erforschung von Pyridinnucleosid-Antimetaboliten (Antikrebsmitteln) brauchbar sein.
Neuerdings wurde über die Ausbildung von Klonen von Mäuseembryo-Stammzellen berichtet, worin das Uridinphosphorylase(UP)-Gen durch Einfügen des NEO-Gens in zwei Exons des Mäuse-UP-Gens ausgeschaltet wurde. Diese Zelllinien sind für künftige Untersuchungen der Wirkungen einer partiellen und vollständigen Aufhebung des UP-Gens im Hinblick auf die Zellmorphologie, den Pyridin-Metabolismus und die 5-Fluoruracil-antiproliferative Aktivität ausgestaltet [Cao et al., Proceedings of the American Association for cancer research annual meeting, 40, 8 (März 1999)]. Bis jetzt wurde jedoch kein lebensfähiges brauchbares Tier mit einem Mangel an UP-Expression beschrieben, das eine In-vivo-Untersuchung zur Regulierung der Uridin-Konzentration und der Funktion der Pyrimidinnucleosid-Antikrebsmittel ermöglicht.
Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Nagetiers mit einem Mangel an Uridinphosphorylase-Expression oder dessen Nachkommenschaft, das (die) als Versuchstier verwendet werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Im Hinblick auf die vorstehenden derzeitigen Tatsachen haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung auf verschiedenen Wegen Forschungsarbeiten durchgeführt zur Mutation eines Uridinphosphorylase-Gens, der Konstruktion eines Targeting-Vektors usw. Als Ergebnis waren die Erfinder der vorliegenden Anmeldung erfolgreich bei der Schaffung eines transformierten Nagetiers mit einem Uridinphosphorylase-Gen, das praktisch nicht funktioniert, und dessen Nachkommenschaft, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führte.
Spezifisch ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Nagetier mit einem Mangel in einer Funktion eines Uridinphosphorylase-Gens auf einem Chromosom, oder dessen Nachkommenschaft, bereit.
Als Ergebnis von Entwicklungen in der Gentechnik der letzten Jahre wurde es möglich, verschiedene Gene künstlich zu manipulieren und verschiedene transformierte Tiere auszubilden, denen künstlich fremde genetische Eigenschaften zugefügt wurden, oder die in der Expression der genetischen Eigenschaften, die der Organismus inhärent besitzt, gesteuert sind [Nature, 300, 611–615 (16. Dezember 1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7688–7692 (Oktober 1990), etc.]. Nagetiere, die einen Mangel in der Funktion eines Uridinphosphorylase-Gens auf einem Chromosom aufweisen und genetisch stabil sind, sind jedoch bis jetzt nicht bekannt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung eines Mäuse-Uridinphosphorylase-Gens und seiner Targeting-Disruption. In der Darstellung bedeutet neo ein Neomycin-resistentes Gen, DT-A bedeutet ein Gen eines Fragments A von Diphtherie-Toxin, LacZ bedeutet ein β-Galactosidase-Gen, dicke durchgezogene Linien bedeuten Exons und feine durchgezogene Linien bedeuten Introns.
2 ist ein Konstruktionsschema eines Targeting-Vektors für das Mäuse-Uridinphosphorylase-Gen. Im Schema bedeutet neo das Neomycin-resistente Gen, DT-A bedeutet das Gen des Fragments A von Diphtherie-Toxin, LacZ bedeutet das β-Galactosidase-Gen, dicke durchgezogene Linien bedeuten Exons und feine durchgezogene Linien bedeuten Introns.
3 veranschaulicht die Elektrophoresemuster, die die Ergebnisse einer genomischen Southern-Hybridisierung zeigen, die zur Bestätigung eines homologen rekombinanten Embryo-abgeleiteten Stamms (ES-Zellen) durchgeführt wurde.
4 veranschaulicht Elektrophoresemuster, die Ergebnisse einer genomischen Southern-Hybridisierung zeigen, die zur Bestätigung einer homologen rekombinanten Maus durchgeführt wurden. In den Elektrophoresemustern bedeutet +/+ eine normale Maus, +/– bedeutet eine heterozygote Mangelmaus und –/- bedeutet eine homozygote Mangelmaus.
5 veranschaulicht Elektrophoresemuster, die Expressionsniveaus von Uridinphosphorylase durch normale Mäuse und Mäuse mit einem Mangel an Uridinphosphorylase-Expression zeigen. In den Elektrophoresemustern bedeutet +/+ eine normale Maus und –/– bedeutet eine homozygote Mangelmaus.
Beste erfindungsgemäße Ausführungsarten
Der Ausdruck "mit einem Mangel einer Funktion eines Uridinphosphorylase-Gens an einem Chromosom", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass ein Uridinphosphorylase-Gen auf einem Chromosom in einer somatischen Zelle oder einer Keimzelle verschieden ist von seiner ursprünglichen Struktur durch Deletion eines Teils seiner Basensequenz, Insertion von oder Austausch mit einem anderen Gen, und kein Protein, das als Uridinphosphorylase fungiert, erhalten wird, oder, selbst wenn ein Genprodukt erhalten wird, sein Protein nicht als Uridinphosphorylase fungieren kann; und bezeichnet spezifisch die Zerstörung der Funktion durch Genmutation, wie z.B. Deletion, Insertion oder Austausch, der Basensequenz einer Promotorregion oder kodierenden Region.
Der Ausdruck "Nagetier mit einem Mangel einer Funktion eines Uridinphosphorylase-Gens auf einem Chromosom" bedeutet deshalb ein Nagetier mit einem Mangel an einer Uridinphosphorylase-Expression, gebildet durch Modifizieren (Manipulieren) eines Uridinphosphorylase-Gens (mutantes Uridinphosphorylase-Gen) gemäß einem Gentechnik-Verfahren.
Das "Nagetier" kann irgendein Nagetier sein, das ein vom Menschen verschiedenes Uridinphosphorylase-Gen aufweist. Beispiele für das Nagetier können umfassen Kaninchen, Meerschweinchen, Hamster, Mäuse und Ratten. Unter ihnen sind vom Standpunkt der Herstellung einer morbiden Tiermodell-Linie Nager, die relativ kurze(n) Ontogenese und Reproduktionszyklus und eine leichtes Züchten zeigen, insbesondere Mäuse und Ratten, bevorzugt.
Zur Disruption eines Uridinphosphorylase-Gens an einem Chromosom ist es möglich, Methoden anzuwenden, die üblicherweise zur Gen-Disruption an Chromosomen verwendet werden. Spezifisch kann die Funktion des Uridinphosphorylase-Gens in einem Tier und seiner Nachkommenschaft mit einem Mangel (Deletion) behaftet (mutiert) werden, indem man das Uridinphosphorylase-Gen kloniert, um die Funktion des Gens in vitro zu löschen und dann das mangelhafte (defekte) Gen in das Tier zurückführt.
Veranschaulichend für Methoden zur Einführung eines Gens in Tiere sind (1) die Injektion einer genetischen DNA in den Embryo einer Keimzelle in seiner prokaryotischen Stufe, (2) Transfektion eines frühen Embryos mit einem rekombinanten Retrovirus, und (3) die Injektion einer Embryo-abgeleiteten Stammzelle (ES-Zelle), die zu einer homologen Rekombination veranlasst wurde, in einen Blastozysten oder in einen Embryo in seinem achten Zellzustand. Diese Methoden sind alle geeignet, um das erfin dungsgemäße Nagetier bereitzustellen. Nichtsdestoweniger wird die Gen-Einführungsmethode unter Verwendung einer ES-Zelle bevorzugt, weil sie zur Zerstörung eines Gens durch homologe Rekombination geeignet ist und die Einführung der ES-Zelle in das Gen ermöglicht, und Ausbildung eines chimären Tiers als getrennte Stufen.
Deshalb kann als erfindungsgemäßes Nagetier ein chimäres Tier zuerst durch Ausbilden einer Zelle geschaffen werden, die ein mutantes Uridinphosphorylase-Gen (z.B. eine ES-Zelle) aufweist, und Transplantieren der Zelle in ein Nagetier; und ferner kann ein Nagetier, in dem das mutante Uridinphosphorylase-Gen heterogen oder homogen in allen seinen Zellen deletiert ist, deshalb geschaffen werden, indem man das chimäre Tier mit einem unterschiedlichen Individuum paart.
Eine repräsentative Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen Nagetiers und seiner Nachkommenschaft wird nachstehend detailliert angegeben.
Ein Mutant eines Uridinphosphorylase-Gens (mutantes Uridinphosphorylase-Gen) wird erhalten, indem man einen Teil der Basensequenz des Uridinphosphorylase-Gens einer Deletion unterwirft, ein anderes Gen in die Basensequenz einführt oder einen Teil der Basensequenz mit einem anderen Gen austauscht. Im Hinblick auf die Position, bei der die Deletion, Insertion oder der Austausch durchzuführen ist, besteht keine besondere Beschränkung, sofern es eine solche Position ist, dass die Deletion, Insertion oder der Austausch es unmöglich macht, ein funktionierendes Genprodukt zu erhalten. Die Position kann in irgendeiner Region vorhanden sein, wie z.B. einer Promotorregion, einer Intronregion oder einer Exonregion. Um die Deletion der Expressionsfähigkeit des Gens sicherzustellen, ist es bevorzugt, mindestens einen Teil der Promotorregion oder Kodierregion zu mutieren. Es ist auch möglich, ein anderes Gen, wie z.B. ein Reporter-Gen, in die deletierte, substituierte oder insertierte Position einzuführen. Das Uridinphosphorylase-Gen einer Maus enthält z.B., wie in 1 und 2 veranschaulicht, 7 kodierende Exons und ein Uridinphosphorylase-Protein wird über die 7 kodierenden Exons kodiert. Zur Deletion der Expressionsfähigkeit des Uridinphosphorylase-Gens ist es deshalb möglich, ein oder mehrere dieser Exons zu deletieren oder ein anderes Gen an irgendeiner der Stellungen dieser Exons einzuführen.
Das Uridinphosphorylase-Gen kann entweder ein Genom-abgeleitetes Uridinphosphorylase-Gen sein, das aus einem Nagetier isoliert oder extrahiert wurde, oder eine unter Verwendung eines Gentechnik-Verfahrens klonierte cDNA. Das klonierte Uridinphosphorylase-Gen kann erhalten werden durch Extrahieren von genomischer DNA, z.B. aus der Leber einer Maus, Herstellen einer genomischen DNA-Bibliothek aus der genomischen DNA mittels einer auf diesem Gebiet an sich bekannten Methode, und Screenen der DNA-Bibliothek während man als Sonde eine partielle Sequenz einer präklonierten DNA verwendet, die Uridinphosphorylase-mRNA kodiert, z.B. cDNA [im Fall einer Maus, Uchida et al., J. Biol. Chem., 270, 12191–12196 (1995)].
Die Anwendung einer künstlichen Mutation des vorstehend beschriebenen Uridinphosphorylase-Gens kann in vitro nach einer üblichen DNA-Rekombinationstechnologie durchgeführt werden.
Wenn man die Funktion eines Exons durch Einführen eines Reporter-Gens zerstört, ist es bevorzugt, das Reporter-Gen so einzuführen, dass die Funktion des Exons unter Kontrolle eines Promotors exprimiert werden kann, oder in einer mit dem Gen kombinierten Form. Der Ausdruck "Reporter-Gen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Gruppe von Genen, von denen jedes als Index einer Expression des Gens dienen kann. Im allgemeinen werden Struktur-Gene von Ezymen, die eine photogene Reaktion oder chromogene Reaktion katalysieren, oft verwendet. Das Reporter-Gen macht es möglich, nicht nur zu prüfen, ob das eingeführte Gen in Zellen exprimiert wurde, sondern auch, welches Gewebe es exprimiert hat. Spezifisch wird lacZ (Escherichia coli-β-Galactosidase-Gen) oder cat (Chloramphenicolacetyl-Transferase-Gen) verwendet.
Als nächstes wird der Targeting-Vektor für eine homologe Rekombination hergestellt, um die Funktion des Uridinphosphorylase-Gens zu löschen.
Der Targeting-Vektor kann ausgebildet werden durch Deletion des Chromosom-abgeleiteten Uridinphosphorylase-Gens, entweder teilweise oder in seiner Gesamtheit, Einführen einer anderen Basensequenz in das Uridinphosphorylase-Gen oder Austauschen eines Teils des Uridinphosphorylase-Gens durch eine andere Basensequenz, so, dass die stromaufwärtigen und stromabwärtigen Regionen, die den mutierten Teil flankieren, homologe Basensequenzen, wie das Uridinphosphorylase-Gen, aufweisen.
Der Targeting-Vektor kann auch auf eine solche Weise ausgestaltet werden, dass, wenn ein Reporter-Gen in den Targeting-Vektor eingeführt wird, die Basensequenz des Reporter-Gens in dem nicht-homologen Teil der Basensequenz des Targeting-Vektors enthalten ist.
Außerdem kann der Targeting-Vektor vorzugsweise mit Marker-Genen eingeführt werden, die eine Selektion von Vektor-eingebauten Zellen oder Zellen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit aufweisen, dass sie einer beabsichtigten homologen Rekombination unterworfen wurden, ermöglichen, z.B. einem Gen, das zur Selektion von Arzneimittlen weit verbreitet verwendet wird, wie z.B. ein Neomycin-resistentes Gen (neo), ein Herpes-simplex-Virus-Thymidinkase-Gen (HSV-tk) oder ein Thymidinkinase-Gen (tk). Das Neomycin-resistente Gen macht es z.B. möglich, ein Target-Gen durch Verwendung von G418, einem Neomycin-Analogon, zu selektieren. Es ist auch möglich, zusammen mit einem positiven Selektionsmarker-Gen, wie z.B. dem Neomycin-resistenten Gen (neo), ein Marker-Gen zu verwenden, das für eine negative Selektion geeignet ist, um eine Target-Zelle selektiv zu entfernen, z.B. ein Thymidinkinase-Gen (tk) (Ganciclovir, FIAU oder dergleichen wird als selektierendes Mittel verwendet, und abhängig von der Empfindlichkeit des selektierenden Mittels wird ein nicht-homologer Rekombinant selektiv entfernt) oder das Diphtherie-Toxin-Fragment A(DT-A)-Gen (ein nicht-homologer Rekombinant wird durch DT-A exprimiertes Diphtherie-Toxin selektiv entfernt).
Die Herstellung eines solchen Targeting-Vektors kann durch konventionelle DNA-Rekombinationstechnologie durchgeführt werden. Es wird z.B. ein kloniertes Uridinphosphorylase-Gen verwendet. Dieses Gen wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym digestiert, um ein Fragment zu erhalten, oder teilweise mittels PCR amplifiziert, um ein DNA-Fragment herzustellen. Das Fragment oder DNA-Fragment kann dann an eine durch einen DNA-Synthesizer synthetisierte Linker-DNA, ein Reporter-Gen enthaltendes Fragment, ein ein Arzneimittel-resistentes Marker-Gen enthaltendes Fragment und dergleichen in einer gewünschten Ordnung gemäß einem wie vorstehend beschriebenen Plan verknüpft werden.
Der wie vorstehend beschriebene homologe rekombinante Targeting-Vektor wird als nächstes in eine geeignete Zelle, die üblicherweise zur Ausbildung eines chimären Tiers verwendet wird, eingeführt.
Beispiele für die hier verwendete Zelle können umfassen eine Ei- und Embryo-abgeleitete Stammzelle (ES-Zelle), obwohl eine ES-Zelle bevorzugt wird, weil sie mit Pluripotenz ausgestattet ist, die ausreicht, um in alle Arten von Zellen in einem Organismus zu differenzieren. Die Einführung der Vektor-DNA in die Zelle kann nach einer konventionellen Methode durchgeführt werden, z.B. durch Elektroporation, Mikroinjektion oder Calciumphosphat-Transfektion.
Eine ES-Zelle wurde hergestellt aus einer inneren Zellmasse eines Mäuse-Plastozysten aus 129-Zellllinie und ist eine Zelllinie, deren Wachstum und Kultur durchführbar ist, während ihr undifferenzierter Zustand aufrechterhalten wird. Im Hinblick auf Mäuse wurde eine Methode zur Einführung eines Gens unter Verwendung einer ES-Zelle etabliert [Mansour, S. L. et al., Nature, 336, 348 (1988)]. Theoretisch wird die Kultivierung einer ES-Zelle in allen Spezien von Säugern als durchführbar erachtet, und zur Zeit sind Forschungen im Gange, um auch ES-Zellen im Hinblick auf J-Ratten, Kaninchen und Vieh, wie z.B. Schweine und Rinder, zusätzlich zu Mäusen herzustellen. Für Tierarten-ES-Zellen, die nicht kultiviert wurden oder kultiviert wurden, aber nicht zu solchen Zelllinien, die zu Keimzellen differenzieren, etabliert wurden, können mutante Gene durch die vorstehend beschriebene Methode (1) oder (2) oder eine ähnliche Methode eingeführt werden.
Das mutante Uridinphosphorylase-Gen des Targeting-Vektors kann in ein Nagetier eingeführt werden durch Austauschen eines Uridinphosphorylase-Gens auf einem Chromosom in einer Zelle (z.B. einer ES-Zelle) des Nagetiers mit der Basensequenz des mutanten Uridinphosphorylase-Gens des Targeting-Vektors gemäß homologer Gen-Rekombination. Dabei werden das in die Targeting-Vektor-DNA eingeführte Marker-Gen und Reporter-Gen in das Uridinphosphorylase-Gen im Genom der ES-Zelle eingeführt.
In der Zelle mit dem eingebauten Targeting-Vektor wurde das Marker-Gen, wie z.B. ein Arzneimittel-resistentes Gen, in die Vektor-DNA ebenfalls zur gleichen Zeit eingeführt, so dass durch Kultivieren der Zelle während einer entsprechenden Periode, z.B. in Gegenwart des Arzneimittels, die Zelle auf der Basis der Expression des Gens selektiert werden kann. Unter so selektierten Zellen können solche, die einer Mutation durch die homologe Rekombination unterworfen wurden, durch eine Analyse bestimmt werden, die von der Southern-Hybridisierung Gebrauch macht, in der die DNA-Sequenz an oder in Nachbarschaft zum Uridinphosphorylase-Gen als Sonde verwendet wird, oder durch eine Analyse, die von PCR Gebrauch macht, worin die DNA-Sequenz am Targeting-Vektor und eine DNA-Sequenz in einer vom im Targeting-Vektor verwendeten Mäuse-abgeleiteten Uridinphosphorylase-Gen benachbarten Region als Primer verwendet werden.
Unter Verwendung der Zelle mit dem darin auftretenden mutierten Uridinphosphorylase-Lokus wird als nächstes ein chimäres Tier gemäß einem Verfahren geschaffen, das im allgemeinen zur Schaffung chimärer Tiere verwendet wird, wie z.B. einer Injektion oder Zellaggregation.
Spezifisch beschrieben kann ein chimäres Tier – das aus Zellen aufgebaut ist, die die normalen Uridinphosphorylase-Loci aufweisen, und Zellen, die die mutierten Uridinphosphorylase-Loci aufweisen – erhalten werden durch Injizieren einer Zelle (z.B. einer ES-Zelle) mit dem darin auftretenden mutierten Locus in ein Nagetier-Embryo oder einen Plastozysten in einem geeigneten frühen Stadium der Embryobildung, z.B. in seiner 8-Zellen-Stufe, und Transplantieren des resultierenden Embryos in den Uterus eines pseudocyetischen Nagetiers. Die Selektion darauf, was für eine Linie eines Nagetiers als Wirtsembryo daraus erhalten wird, sollte so durchgeführt werden, dass von der ES-Zelle abgeleitete Zellen und solche, die vom Wirtsembryo abgeleitet sind, abhängig von einem Phenotyp, wie z.B. Pelzfarben, gemäß der üblichen Methode erfolgreich unterschieden werden können.
Wenn einige der Keimzellen des chimären Tiers die mutanten Uridinphosphorylase-Loci aufweisen, können Individuen, deren Gewebe alle aus Zellen aufgebaut sind, die die mutanten Uridinphosphorylase-Loci aufweisen (Tiere mit defizienter Uridinphosphorylase-Expression), durch eine Unterscheidungsmethode, die auf die Pelzfarbe oder dergleichen verdaut, aus einer Gruppe von Individuen, die durch Paarung eines chimären Individuums mit einem normalen Individuum erhalten wurden, selektiert werden.
Wenn eine unter Verwendung von z.B. einer Mäuse-ES-Zelle des J1-Stamms und eines Wirtsembryos der C57BL/J-Linie erhaltene Maus mit einer C57BL/6J-Linie-Maus gepaart wird, wird die so ausgeworfene Nachkommenschaft die gleiche Wildfarbe (agouti) wie die Maus, aus der die ES-Zelle abgeleitet wurde, aufweisen, wenn Keimzellen der chimären Maus von der rekombinanten ES-Zelle abgeleitet sind, aber die gleiche schwarze Farbe wie die Maus, von der der Wirtsembryo abgeleitet wurde, zeigen, wenn die Keimzellen der chimären Maus vom Wirtsembryo abgeleitet sind. Die deletierte Expression des Uridinphosphorylase-Gens kann bestätigt werden durch Durchführen von Southern-Blot- oder PCR-Analyse der Schwanz-DNA aus neugeborenen und gefütterten Mäusen.
Die Paarung zwischen F1-heterozygoten Expressions-defizienten Nachkommen selbst macht es außerdem möglich, F2-heterozygote Expressions-defiziente Nachkommen und F2-homozygote Expressions-defiziente Nachkommen zu erhalten. Erfindungsgemäße Nagetiere können umfassen chimäre Tiere, F1-heterozygote Expressions-defiziente Tiere und F2-homozygote Expressions-defiziente Tiere. F2-homozygote Expressions-defiziente Tiere sind jedoch vom Standpunkt der Wirkungen der Expressions-defizienz des Uridinphosphorylase-Gens bevorzugt.
Wie vorstehend beschrieben erhaltene transformierte Nagetiere weisen einen Mangel an der Fähigkeit auf, Uridinphosphorylase-Gene an Chromosomen in somatischen Zellen und Keimzellen zu exprimieren, und der Mangel (Defizienz) ist genetisch stabil.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend spezifisch auf der Basis von Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung eines Targeting-Vektors von Mäuse-Uridinphosphorylase-Gen-DNA
Eine rekombinante Phagen-Bibliothek von λ-FIXII mit genomischer DNA einer damit vergleichbaren 129SV-Mäuseleber (Produkt von Stratagene LLC) wurde erhalten und in Escherichia coli LE392 transfektiert. Im Hinblick auf die resultierende Mäuse-Genom-Bibliothek wurde die Hybridisierung unter Verwendung von cDNA des Mäuse-Uridinphosphorylase-Gens als Sonde durchgeführt [Uchida et al., J. Biol. Chem., 270, 12191–12196 (1995)]. Als Ergebnis des Screenens an 1 × 10⁶ Plaques wurden zwei positive Klone erhalten (1: Klon Nr. 7 und Klon Nr. 6). Unter deren Verwendung wurde ein ca. 1,8 kb SacI-SacI-Fragment, enthaltend Intron 1 des Uridinphosphorylase-Gens (1: DNA 1), und ein ca. 7,0 kb XbaI-XbaI-Fragment, enthaltend Exon 3–7 (1: DNA 2), subkloniert.
Als nächstes wurde die Herstellung eines Targeting-Vektors zur Disruption der Struktur des Uridinphosphorylase-Gens durchgeführt. Ein Neomycin-resistentes Gen (pGK-neo) wurde in pBluescrip-tIISK(+) eingeführt, und das Diphtherie-Toxin-Fragment-A-Gen (DT-A) wurde in einer Richtung entgegengesetzt zur normalen Richtung seiner Transkription an der stromaufwärtigen 5'-Endseite eingeführt. Außerdem wurde das ca. 1,8 kb SacI-SacI-Fragment mit darin enthaltenem Intron 1 des Uridinphosphorylase-Gens (1: DNA 1) als Seqment homolog zur genomischen DNA zwischen pGK-neo und DT-A eingeführt, und das ca. 7,0 kb XbaI-XbaI-Fragment mit den darin enthaltenen kodierenden Exons 3 bis 7 (1 und 2: DNA 2) wurde an die stromabwärtige 3'-Seite von pGK-neo eingeführt. Als Ergebnis wurde UP-neo (1 und 2) erhalten. Außerdem wurde ein SA-NlacZ-Gen mit einem dazugefügten Spleißakzeptor (SA) und einem nuklearen Transportsignal als Expressions-analysierendes Reporter-Gen zwischen DNA 1 und pGK-neo eingeführt, um UP-LacZ zu erhalten (1 und 2). Nach Einführung in ES-Zellen wurden die Konstrukte mit einem Restriktionsenzym NotI digestiert und linearisiert, um Targeting-Vektoren zu erhalten.
Beispiel 2
Deletion des Uridinphosphorylase-Gens aus ES-Zellen durch Einführung einer DNA für eine homologe Rekombination
Die zwei Arten von DNA für homologe Rekombination (UP-neo und UP-LacZ; jeweils 25 μm) wurden getrennt in Aliquoten eines Elektroporations-Puffers suspendiert, wobei jeder Anteil 2 × 10⁷ Mäuse-ES-Zellen (J1-Stamm) enthielt, und unter den Bedingungen einer 400 V/cm-Feldstärke und einer 25 μF-Kapazität wurde die Gen-Einführung durchgeführt. Eine selektive Inkubation wurde bei einer G418("Genetisin", Produkt von GIBCO BRL)-Konzentration von 175 μg/ml von der 46. Stunde nach Einführung des UP-neo bzw. von der 44. Stunde nach Einführung von UP-LacZ durchgeführt.
Jede G418-Kolonie wurde auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, von der jede Vertiefung 0,05% Trypsin-HBS-EDTA-Lösung (40 μl) enthielt, mittels einer Mikropipette von der 184. Stunde nach der Einführung des entsprechenden Gens überführt. Nach Behandeln der Kolonie während 5 Minuten wurde sie zur Bereitstellung einzelner Zellen pipettiert. Diese einzelnen Zellen wurden halbiert und dann auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt, gefolgt von einer Inkubation. Nach ausreichender Vermehrung wurden sie auf Mikroplatten mit 24 Vertiefungen übertragen und weiter inkubiert. Eine Hälfte der Zellen wurde in flüssigem Stickstoff gelagert, während die verbleibende Hälfte der Zellen zur Extraktion von DNA zur Verwendung zur Bestimmung eines Rekombinanten durch Southern-Hybridisierung verwendet wurde.
Die DNA-Extraktion wurde nach einer auf diesem Gebiet an sich bekannten Methode durchgeführt. Da viele Proben vorhanden waren, wurde durch ProteinaseK-Behandlung und Isopropanol-Behandlung ausgefällte DNA durch EcoRI digestiert, gefolgt von einer Southern-Hybridisierung. Als Sonde wurde ein ca. 1,3 kb EcoRI-SacI-Fragment weiter stromaufwärts von der als Targeting-Vektor verwendeten 5'-Seiten-homologen Region verwendet, wie in 1 veranschaulicht. Nach Bestimmung durch Southern- Hybridisierung wurde erwartet, dass die Verwendung dieser Sonde das Auftreten einer Bande bei 10 kb im Falle der nicht-homologen rekombinanten ES-Zellen, bei 5,1 kb im Falle von einer homologen Rekombination durch UP-neo unterworfenen ES-Zellen, aufgrund der Einführung von EcoRI-digestierten Stellen bei Einführung des Neomycin-resistenten Gens, oder bei 6,1 kb im Falle von UP-LacZ, ergibt. Die Ergebnisse der Hybridisierung wurden mittels Bio-Image Analyzer BAS2000 (Fuji) analysiert. Als Häufigkeit einer homologen Rekombination unterlagen 1 von 70 Klonen einer homologen Rekombination im Falle von UP-neo, während 4 von 135 Klonen einer homologen Rekombination im Falle von UP-LacZ unterlagen (3). Eine Zelle, deren Banden eines mutanten Locus und eines Wild-Locus mit im wesentlichen der gleichen Intensität erschienen, wurde ausgewählt und in einen Plastozysten eingeführt.
Beispiel 3
Bildung von chimären Mäusen und Selektion einer Uridinphosphorylase-Expression-defizienten Maus
Eine chimäre Maus wurde hergestellt nach der von Bradley et al. berichteten Methode [Bradley, A., Production and analysis of chimeric mice in teratocarcinomas and embryonic stem cells; A practical approach. E. J. Robertson Hg. (Oxford: IRL Press), 113–151 (1987)] oder nach der von Gossler et al. vorgeschlagenen Methode [Gossler, A., Doetschman, T., Korn, R., Serfling, E., und Kemler, R., Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9065–9069 (1986)]. Am 3,5. Tag nach der Kopulation mit C57BL/6 wurde aus dem Ovidukt ein Blastozyst erhalten, und in seine Höhle wurden etwa 7 homologe rekombinante ES-Zellen injiziert. Der Blastozyt mit den darin injizierten ES-Zellen wurde in den Uterus einer scheinschwangeren ICR-Maus zurückgeführt. Von aus der Brutmutter geborenen chimären Mäusen wiesen zwei Mäuse eine gegenüber der inhärenten schwarzen Farbe hellere Fellfarbe auf, wobei diese Fellfarbenerhellung vermutlich einen starken Beitrag von ES-Zellen zuzuschreiben ist, und diese wurden ausgewählt, und die so ausgewählten Mäuse wurden mit C57BL/6 paaren gelassen. Für eine agouti-gefärbte der neu geborenen Mäuse wurde eine Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNA nach der allgemeinen Methode durchgeführt. Nach Behandlung mit Proteinase K wurde die DNA im Schwanzgewebe mit Chloroform extrahiert, in Ethanol gefällt und dann in TE-Lösung gelöst. Mäuse, die Loci aufwiesen, die einer Rekombination unterlagen, wurden selektiert und mit jeder anderen paaren gelassen, um Mäuse zu erhalten, die homozygote rekombinante Uridinphosphorylase-Loci aufweisen.
Unter Verwendung von 1,3 kb EcoRI-SacI-Fragment als Sonde wurde dann Southern-Hybridisierung durchgeführt. Banden erschienen bei 6,1 kb bzw. 10 kb, wodurch sich zeigte, dass Uridinphosphorylase an einem der Chromosomen zerstört wurde. Einundzwanzig (21) Mäuse mit der Agouti-Farbe wurden im Hinblick auf UP-neo erhalten, während 36 Mäuse der Agouti-Farbe im Hinblick auf UP-LacZ erhalten wurden. Nach Analyse durch Southern-Hybridisierung zeigten 11 UP-neo-mutante Mäuse Banden bei 5,1 kb bzw. 10 kb, und 16 UP-LacZ-mutante Mäuse wiesen Banden bei 6,1 kb bzw. 10 kb auf. Diese Mäuse wurden dann sich gegenseitig paaren gelassen. Gegebenenfalls wurden UP-neo-mutante Mäuse, die nur eine Bande bei 5,1 kb aufwiesen, und UP-LacZ-mutante Mäuse, die nur eine Bande bei 6,1 kb aufwiesen, d.h., Mäuse, die homozygote mutanten Uridinphosphorylase-Loci aufwiesen, erhalten (4). So gebo rene Mäuse zeigten keine ersichtliche Abnormalität. Es wurde deshalb angenommen, dass solche Mäuse absolut gesund geboren werden. Weil unter den Wurfgenossen Mäuse mit Gen-Typen von UP +/+, +/– und –/– in einem Verhältnis von 1:2:1 geboren wurden, wurde auch angenommen, dass UP –/–-Mäuse ebenfalls unabhängig vom genetischen Hintergrund absolut gesund geboren werden.
Beispiel 4
Uridinphosphorlase-Aktivität in normalen und mutanten Mäusen
Mäuse, die homozygote mutante Uridinphosphorylase-Gene aufwiesen, wurden auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Uridinphosphorylase-Aktivität untersucht. Dünndarm- und Lebergewebe aus Uridinphosphorylase-defizienten Mäusen und Elternmäusen (normal) als Kontrolle, die eine vollständige Expression von Uridinphosphorylase-Gen zeigten, wurden isoliert und mit 4 Volumina eines Puffers (50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 25 mM KCl, 5 mM MgCl₂) homogenisiert. Nach Zentrifugieren bei 105.000 g während 60 Minuten wurde die Aktivität unter Verwendung des Überstandes gemessen. Uridinphosphorylase-Aktivität wurde auf der Basis von [³H]-Uridin, gebildet aus [³H]-Uracil, nach der von Ikenaka et al. berichteten Methode [Ikenaka et al., Metabolism of pyrimidine nucleotides in various tissues and tumor cells from rodents. Gann. 72(4), 590–7 (Aug., 1981)] gemessen. Zur gleichen Zeit wurde die Aktivität von Thymidinphosphorylase, dem anderen Enzym der Pyrimidinnucleosidphosphorylase-Gruppe, ebenfalls auf der Basis von aus [³H]-Thymidin gebildeten [³H]-Thymin gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Als Ergebnis zeigte sich, dass die Uridinphosphorylase-Aktivität im Dünndarmgewebe in den nicht-rekombinanten (normalen) Mäusen hoch war, aber in den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen beträchtlich verringert und abhanden gekommen war. In den Lebergeweben der normalen Mäuse war die Uridinphosphorylase-Aktivität niedrig, aber die Thymidinphosphorylase wurde stark exprimiert. In den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen fehlte in den Lebergeweben andererseits die Uridinphosphorylase-Aktivität im wesentlichen.
Beispiel 5
Expression von Uridinphosphorylase-Protein im Dünndarm normaler und Uridinphosphorylase-Expressions-defizienter Mäuse
Von 5 normalen Mäusen und 5 Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen wurden die Dünndarmgewebe entnommen. Von jedem Dünndarmgewebe wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren ein Proteinextrakt hergestellt. Der Proteinextrakt wurde auf einen Proteingehalt von 5 mg/ml eingestellt und wurde auf die Expression von Uridinphosphorylase-Protein durch Western-Blotting untersucht. Zur Bestimmung wurde Anti-Maus-Uridinphosphorylase-polyklonaler Antikörper verwendet. Wie in 5 gezeigt, wurde praktisch keine Bande von Uridinphosphorylase in den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen festgestellt.
Beispiel 6
Bluturidinspiegel im Dünndarm normaler und Uridinphosphorylase-Expressions-defizienter Mäuse
Von normalen und Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäuse wurden Blutproben gesammelt. Von jeder Blutprobe wurde das Serum abgetrennt und dann 9 Volumina eiskaltes Methanol zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 30 Minuten lang in Eis belassen, um die Proteine vollständig auszufällen. Die Mischung wurde dann zentrifugiert und nach Verdampfen lassen des so erhaltenen Überstandes zur Trockne bei 60°C unter einem Stickstoffgasstrom wurde gereinigtes Wasser (200 μl) zum Rückstand zugefügt. Die so hergestellte Mischung wurde durch ein 0,45 μm-Filter filtriert. Die Konzentrationen an Uridin, Thymidin und Cytidin wurden mittels HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, betrug der Serum-Uridin-Spiegel 5,33 nMol/ml bei den normalen Mäusen und 27,26 nMol/ml bei den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen. In den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen wurde deshalb ein Anstieg um das ca. 5-fache beobachtet. Im Hinblick auf die Konzentrationen an Thymidin und Cytidin und die anderen Blut-Nucleoside wurde in den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen im Gegensatz zu den normalen Mäusen nur ein leichter Anstieg beobachtet, und durch das Ausschalten der Uridinphosphorylase-exprimierenden Funktion wurden keine wesentlichen Änderungen festgestellt.
Beispiel 7
Stoffwechsel-Kinetik von Nucleosid-Antikrebsmitteln in normalen und Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen
Veränderungen in der Stoffwechsel-Kinetik von Nucleosid-Antikrebsmitteln durch Ausschalten der Uridinphosphorylase-exprimierenden Funktion wurden unter Verwendung von 5-Fluoruridin (FUR) und 5-Trifluorthymidin (F₃dThd) untersucht.
Normalen und Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen (n = 3 pro Gruppe) wurden oral 50 mg/kg FUR oder 10 mg/kg F₃dThd verabreicht, und im Laufe der Zeit Blutproben gesammelt. Nach Abtrennen von Serum aus jeder Blutprobe wurde die Konzentration an FUR oder F₃dThd im Serum mittels HPLC bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, war, wenn FUR oral verabreicht wurde, die Konzentration an FUR in den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen ca. 5 Mal so hoch wie bei den normalen Mäusen (die Werte bei 15 bis 30 Minuten nach Verabreichung). Es hat sich deshalb erwiesen, dass als Ergebnis der Deletion der Uridinphosphorylase-Aktivität die Zersetzung von FUR im Körper inhibiert wird. Im Falle von F₃dThd war andererseits die Konzentration an F₃dThd in den Uridinphosphorylase-Expressions-defizienten Mäusen ebenfalls 1,6 bis 17,8 Mal so hoch wie der entsprechende Wert bei den normalen Mäusen 30 Minuten bis 120 Minuten nach oraler Verabreichung. Es wurde deshalb festgestellt, dass der Anteil an durch Uridinphosphorylase zersetzter F₃dThd verringert war.
Aus den obigen Ergebnissen wird geschlossen, dass Mäuse, denen es an der Funktion von Uridinphosphorylase-Genen mangelt, dem Menschen ähnliche Modelle sind, und für Pyrimidinnucleosid-Antikrebsmittel ihre Stoffwechsel-Kinetik im Menschen aus ihrer Stoffwechsel-Kinetik in diesen Mäusen vorhersagbar ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß können genetisch stabile Nagetiere mit einem Mangel an Uridinphosphorylase-Expression erhalten werden. Diese Nagetiere machen es möglich, beim Menschen pathologische Funktionen oder Aktivitäten, wie z.B. Nucleinsäure-Dysbolismus, abzuleiten und ebenfalls die Brauchbarkeit von Pyrimidinnucleosid-Antimetaboliten vorherzusagen, und sie sind deshalb als Versuchstiere geeignet.

Claims

Nagetier oder dessen Nachkommenschaft, dem es aufgrund eines mangelhaften Uridinphosphorylase-Gens daran mangelt, Uridinphosphorylase zu exprimieren.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 1, worin das Uridinphosphorylase-Gen durch Deletion eines teils einer DNA-Sequenz dieses Uridinphosphorylase-Gens oder durch Einfügen oder Austauschen eines anderen Gens in oder an einer Position dieser DNA-Sequenz mangelhaft gemacht wurde.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 2, worin das andere Gen ein Markergen oder ein Reportergen ist.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 4, worin das Markergen ein Neomycin-Resistenzgen ist.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 5, worin das Neomycin-Resistenzgen anstelle des zweiten kodierenden Exons des Uridinphosphorylase-Gens eingefügt ist.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 5, worin das Neomycin-Resistenzgen und ein β-Galactosidase-Gen als Reportergen anstelle des zweiten kodierenden Exons des Uridinphosphorylase-Gens eingefügt sind.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Nagetier eine Maus ist.
Nagetier oder dessen Nachkommenschaft nach Anspruch 7, worin die Maus eine Knockout-Maus ist, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ihr das zweite kodierende Exon in einem Uridinphosphorylase-Gen auf einem Chromosom fehlt, sie aber ein Neomycin-Resistenzgen als Markergen und ein β-Galactosidase-Gen als Reportergen an der dem zweiten kodierenden Exon entsprechenden Position eingefügt aufweist.
Methode zum Bestimmen der Kinetik von Nucleosid-Antikrebsmitteln im Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die aufweist das Verabreichen des Antikrebsmittels an das Nagetier, mit der Maßgabe, dass Methoden zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des tierischen Körpers und am tierischen Körper vorgenommene diagnostische Methoden ausgeschlossen sind.
Verfahren zur Herstellung eines Nagetiers mit einem Mangel an einer Uridinphosphorylase-Gen-Funktion, oder dessen Nachkommenschaft mit einem Mangel an dieser Funktion, wobei es dem Nagetier oder dessen Nachkommenschaft daran mangelt, Uridinphosphorylase zu exprimieren, und wobei das Verfahren umfasst das Mangelhaftmachen des Uridinphosphorylase-Gens durch Deletion eines Teils der DNA-Sequenz des Uridinphosphorylase-Gens oder durch Einfügen oder Austauschen eines anderen Gens in oder an einer Position dieser DNA-Sequenz.