DE60030165T2

DE60030165T2 - Verfahren zur amplifizierung genetischen materials und dessen anwendungen

Info

Publication number: DE60030165T2
Application number: DE60030165T
Authority: DE
Inventors: William David MELTON
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2000-01-22
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1263985B1; EP1762624A3; AU2001222075A1; EP1263985A2; EP1762624A2; GB0001401D0; WO2001053473A3; US20030167481A1; ATE336592T1; WO2001053473A2; DE60030165D1; CA2436918A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Amplifizieren von genetischem Material und zur Benutzung solcher Verfahren zum Herstellen von transgenen nichtmenschlichen Tieren, die amplifizierte Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, umfassen und von denen man ein hohes Niveau eines Produkts, das von Interesse ist, erhalten kann. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum Erhalten in einem Schritt der Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, in gezüchteten eukaryotischen Zellen.
Die Entdeckung von Verfahren zur Einführung von DNA in lebende Zellen in funktionsfähiger Form bot die Möglichkeit zur Herstellung von transgenen Zelle, die kommerziell verwertbare Proteinprodukte exprimieren. Prokaryotenzellen und die einfacheren Eukaryotenzellen, wie Hefen, sind traditionell in diesen Verfahren verwendet worden. Tierzellen werden jetzt in zunehmendem Maße, besonders wenn das Transgen von einem Tier deriviert ist, benutzt. Tierzellen bieten zahlreiche Vorteile als Wirte für transgene Tier-DNA und je ähnlicher die Tierart ist, von der das Gen deriviert ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit dass ein funktionsfähiges Produkt korrekt exprimiert und bearbeitet wird. Verschiedene Tierarten stellen häufig analoge Proteine her und oft wird eine beträchtliche Homologie von einer Art auf die andere übertragen. Eine Tierzelle kann also leichter als eine Bakterien- oder Hefezelle die posttranslationalen Verarbeitungsschritte ausführen, die dazu erforderlich ist, dass ein genkodiertes Protein biologisch aktiv ist und einfacher ein fremdes Gen, das unterbrochene Kodierungssequenzen hat, korrekt translatiert.
Es sind Techniken zur Einführung von fremdem genetischen Material in das Genom von Tiergewebezellen entwickelt worden. Dazu gehört die Befestigung von fremdem genetischen Material an einem Klonierungsvektor, wie z.B. ein modifizierter Virus oder Cosmid, und die Übertragung des Klonierungsvektors in die Zelle. Das in die Zelle mit Hilfe des Vektors übertragene Material wird häufig in das Genom inkorporiert.
Ein Hindernis bei der Benutzung von tierischen Gewebezellkulturen, insbesondere bei denen höherer Tierarten, bei der der Expression von rekombinanten Genprodukten ist die Tatsache, dass die Gewebezellkulturen allgemein nicht für großmaßstäbliche Herstellungsprozesse geeignet sind. Im Unterschied zu Bakterien- und Hefezellen, die schnell in einer günstigen Umgebung proliferieren, sind tierische Gewebezellen weniger für Massenproduktionstechniken geeignet. Die Zellen, die die Gewebe höherer Tierarten umfassen, reproduzieren sich langsam und reproduzieren sich, wenn sie das Reifestadium erreicht haben, in vielen Fällen gar nicht. Die Teilung von tierischen Gewebezellen wird oft sehr stark von der Nachbarschaft der anderen Zellen beeinflusst. Sogar wenn eine Zellkultur anfänglich über eine allgemein ideale Umgebung verfügt, so ändert die Proliferation der Zellen diese Umgebung, was häufig ungünstig für eine weitere Proliferation ist. Die Gewebekulturen sind also Gegenstand einer Infektion, und eine starke Infektion kann eine beträchtliche Investition an Zeit und Geld zerstören.
Das Aufkommen transgener Techniken, die die Herstellung transgener Tiere ermöglicht, gibt die Möglichkeit, korrekt verarbeitete tierische Genprodukte in im wesentlichen größeren Mengen zu erhalten, als es mit Gewebekulturen möglich war. Ein lebendes transgenes Tier und seine Nachkommenschaft können potentiell eine kontinuierliche Quelle für ein transgenes Produkt darstellen.
Normalerweise werden transgene Tiere durch die Injektion von transgener DNA in den Pronucleus eines befruchteten Eis hergestellt. Versuche, den Ertrag eines transgenen Produkts, das von Interesse ist, zu optimieren, ist auf die optimierte Expression von einzelnen Genen konzentriert worden (26, 27).
Wir haben jedoch argumentiert, dass ein Genamplifizierungssystem, das auf die tierischen Zellarten angewendet werden kann, die zur Herstellung transgener Tiere benutzt werden, einen erhöhten Ertrag eines Genprodukts, das von Interesse ist, in Aussicht stellt.
Die Amplifizierung von chromosomalen Genen ist weitgehend in gezüchteten Säugetierzellen angewendet worden und es ist eine Vielzahl von Prozeduren entwickelt worden, um die Amplifizierung von spezifischen chromosomalen Genen (1) zu wählen.
Wir haben argumentiert, dass die Genamplifizierung verwendet werden kann, um den Ertrag von Genprodukten, das von Interesse sind, in gezüchteten tierischen Zellen zu erhöhen. Typischerweise wird bei einem konventionellen Gentransfer eine Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, in eine tierische Zelle mit einem auswählbaren Markergen kotransformiert. Es werden Zellen mit einer kleinen Anzahl von kointegrierten Kopien beider Gene, und welche den auswählbaren Marker und die Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, exprimieren, erhalten.
Durch eine Kotransformation eines Gens, das für eine Genamplifizierung ausgewählt werden kann, in eine gezüchtete Tierzelle, begleitet von einer in der selben Zelle zu exprimierenden nicht auswählbaren Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, kann man die Genamplifizierung benutzen, um viel größere Mengen von jedem beliebigen Genprodukt als alleine mit einem herkömmlichen Gentransfer herzustellen. Der Grund dafür ist, dass die Anwendung eines selektiven Drucks auf die Amplifizierung des auswählbaren Gens oft die Koamplifizierung des zweiten, nicht auswählbaren Gens zur Folge hat, was zur Synthese einer großen Menge des Produkts, das von Interesse ist, führt.
Genamplifizierungsprotokolle in gezüchteten tierischen Zellen können das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen und DHFR-Inhibitoren, wie Methotrexat benutzen. Normale Zellen mit einer oder mehreren Kopien des DHFR-Gens können nicht bei niedrigen Konzentrationen von Methotrexat überleben. Dadurch wird selektiver Druck auf die Zellen mit amplifizierten Kopien des DHFR-Gens ausgeübt, was die Wirkung des Inhibitors, erhöhte Mengen von DHFR herzustellen, vermeidet. Durch eine progressive Erhöhung der Inhibitorkonzentration können Zellen in einer Reihe von ausgewählten Schritten mit tausenden von Kopien des amplifizierten DHFR-Gens erhalten werden. Das ist ein effizientes Amplifizierungssystem, das benutzt werden kann, um ein in die Zelle zusammen mit dem DHFR-Gen eingeführtes Gen zu koamplifizieren und man kann dieses Verfahren so benutzen, um große Mengen eines Produkts, das von Interesse ist, herzustellen.
Das DHFR-Gen-Amplifizierungssystem leidet unter einer Anzahl von Nachteilen: es erfordert eine große Anzahl von Auswahlzyklen um die höchste Anzahl von amplifizierten Genkopien zu erhalten; es sind hohe Konzentrationen an toxischen Medikamenten wie Methotrexat erforderlich; und die Reinigung des Produkts, das von Interesse ist, kann durch das hohe Niveau an auch vorhandener Dihydrofolatreduktase kompliziert werden. Einige dieser Nachteile ist von anderen Amplifizierungssystemen, wie das die Glutaminsynthase (2) umfassende System, behandelt worden (2).
Es sind einige alternative Verfahren für die Auswahl von kotransformierten Wirtszellen beschrieben worden. Eine Strategie umfasst die Kotransformierung von Wirtszellen mit einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und ein DHFR-Gen, und die Auswahl dieser Zellen, die hohe Niveaus von DHFR exprimieren, indem die Zellen in einem Medium gezüchtet werden, das eine hohe Konzentration von Methotrexat aufweist. Viele der ausgewählten Zellen exprimierten auch das kotransformierte Produktgen auf einem hohen Niveau (18).
Ein anderes Verfahren umfasst die Benutzung von polycistronischen mRNA-Expressions-Vektoren, die am 5'-Ende der transkriptierten Region eine Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und am 3'-Ende ein auswählbares Gen umfasst. Da die Translation des auswählbaren Gens am 3'-Ende der polycistronischen mRNA nicht wirksam ist, zeigen solche Vektoren eine bevorzugte Translation des erwünschten Produktgens und erfordern hohe Niveaus an polycistronischen mRNA, um die Selektion (19, 20, 21) zu überleben. Die hohe Niveaus des gewünschten Produkts (Protein) exprimierende Zellen können also dadurch erhalten werden, indem die Anfangs-Transformanten in einem Medium gezüchtet werden, das einen Auswahlstoff enthält, der geeignet ist, mit dem speziellen auswählbaren Gen benutzt zu werden.
Leider leiden diese Verfahren an gewissen Nachteilen, die ihre Nützlichkeit begrenzen. Stark exprimierende Zellen, die durch eine direkte Züchtung in einem Medium, das ein hohes Niveau an einem Auswahlstoff enthält, erhalten werden, können schwache Wachstums- und Stabilitätseigenschaften zeigen, wodurch ihre Nützlichkeit für Langzeitherstellungsprozesse (18) begrenzt wird. Dank einer solchen Auswahl wegen der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Methotrexat können Zellen mit einem veränderten, methotrexat-resistenten DHFR-Enzym oder Zellen, die veränderte Methotrexat-Transporteigenschaften gegenüber Zellen die amplifizierte Gene aufweisen, hergestellt werden (Haber, et al., J. Biol. Chem. 256: 9501 (1981); Assaraf & Schimke, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 7154 (1987)). Dank der polystronischen Vektoren gibt es bei der Auswahl entsprechend der Expression des auswählbaren 3'-Gens eine starke Auswahl entsprechend der Deletion oder der Neuanordnung der 5'-Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist. Zellen, die Vektoren beherbergen, die solche Mutationen im 5'-Genprodukt aufweisen, neigen dazu andere Zellen in der Population zu überwachsen und so mit der Auswahl von Zellen zu interferieren, die zu diesem Augenblick hohe Niveaus von Nukleinsäuresequenzen, die von Interesse sind, exprimieren (20).
Andere Auswahlprozeduren werden in WO 83/03259 und WO 92/17566 offenbart. Kurz gesagt umfassen die in WO 83/03259 beschriebenen Auswahlprozeduren die Kotransformation einer Eukaryotenzelle mit einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und ein funktionell defizientes Gen, das für ein Auswahl- oder Identifizierungseigenschaft, wie Phosphoribosyltransferase- oder Xanthin-Phosphoribosyltransferaseaktivitiert kodiert. Zellen, die die Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, exprimieren, werden gruppiert und die Zellen, die die Auswahl- oder Identifizierungseigenschaft exprimieren, werden dann ausgewählt. Die Zellen, die Auswahl- oder Identifizierungseigenschaft exprimieren, stellen seltene Varianten von Zellsubklonen dar, die die Expression des funktionell defizienten Gens stark amplifiziert haben, so dass die Expression mit Niveaus auftritt die charakteristisch für ein normales Gen sind. Diese seltenen Subklone enthalten auch Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist.
WO/17566 beschreibt die Kotransformation einer Wirtszelle mit einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist und einem auswählbaren Gen, das dadurch modifiziert ist, indem in seine transkriptierte Region ein Intron mit einer solchen Länge eingeführt wird, dass das Intron korrekt von dem entsprechenden mRNA-Precursor mit geringerer Effizienz gebunden wird. Als Konsequenz davon ist die vom intronmodifizierten auswählbaren Gen hergestellte Menge des auswählbaren Genprodukts im Wesentlichen geringer als die Menge, die vom auswählbaren Anfangs-Gen hergestellt wird. Nach der Kotransformation der Zellen ist beobachtet worden, dass die meisten sich ergebenden Transformanten nicht den ausgewählten Phänotyp aufweisen, der als Folge des verhältnismäßig geringen, vom intronmodifizierten auswählbaren Gen in den Transformanten hergestellten auswählbaren Genprodukts kennzeichnend ist für das auswählbare Genprodukt. Ein geringer Teil der Transformanten zeigen den auswählbaren Phänotyp und unter diesen Transformanten exprimiert der größte Teil hohe Niveaus des von der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, kodierten Proteins.
Bis jetzt ist keines dieser Genamplifizierungssysteme weder benutzt noch zur Benutzung in spezialisierten gezüchteten Tierzellen wie embryonalen Stammnzellen (ES) empfohlen worden. Außerdem ist beschrieben worden, dass Genamplifizierung nur in transformierten oder p53-defizienten Zellen möglich ist (z.B. L. R. Livingston et al. (1992) Cell 70: 923–35). Solche Beschreibungen sind jedoch deutlich durch unsere Versuche widerlegt worden, in den gezeigt wird, dass die Genamplifizierung in ES-Zellen möglich ist. Außerdem haben wir gefunden, dass die ES-Zellen Totipotenz zeigen und benutzt werden können, um transgene Tiere herzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt die Benutzung von Genamplifizierungsverfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, die amplifizierte Kopien von einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, bereit, wobei die transgenen Tiere ein Potential zur Synthese grosser Mengen eines Produkts, das von Interesse ist, aufweisen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen nichtmenschlichen Tierzelle bereit, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist, und welche Zelle amplifizierte Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, umfasst. Das Verfahren umfasst das Unterwerfen einer Zelle aus einer nichtmenschlichen Wirtszellpopulation einem Genamplifikationsprotokol zum Erzeugen einer Zelle, die ihre Totipotenz oder Totipotenz für die Kernübertragung beibehält und die amplifizierte Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, umfasst.
Unter „Wirtszellenpopulation „ verstehen wir eine oder mehrere tierische Zellen. Dieser Begriff umfasst auch die Abkömmlinge davon. Die Wirtszellenpopulation umfasst totipotente Zellen oder Zellen, die totipotent für die Kernübertragung sind.
Unter „ Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist " versteht man eine DNA, die ein gewünschtes Protein oder mRNA-Produkt kodiert. Eine Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, kann einen Antikörper, ein virales Antigen, ein Interferon, ein Wachstumshormon, Insulin, einen Blutgerinnungsfaktor, humanes Serumalbumin, ein Enzym, oder ein Antisens-mRNA umfassen.
Bevorzugt umfasst das Genamplifizierungsprotokoll die Transformation von Zellen der Wirtszellpopulation mit der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung, umfasst das Genamplifizierungsprotokoll Folgendes:

(a) Kotransformieren von Zellen der nichtmenschlichen Wirtszellpopulation, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent sind, mit der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und einem teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergen, das ein auswählbares Genprodukt codiert; und
(b) Züchten der kotransformierten Zellen unter Bedingungen, die das Auswählen von Zellen gestatten, die das auswählbare Genprodukt in erheblich höheren Niveaus exprimieren als Zellen ohne wesentliche Expression des auswählbaren Genprodukts.

Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Kotransformation von Genen in tierischen Zellen bekannt. Eine der am häufigsten benutzten Verfahren umfasst einen direkten DNA-Transfer in die Zellen. DNA kann z.B. in tierische Zellen eingeführt werden, indem die Zellen DNA in Gegenwart einer Calciumphosphatausfällung oder DEAE-Dextran (24) unterworfen werden. Andere Verfahren zur Einführung von Genen in tierische Zellen umfassen Elektroporation, Mikroinjektion, oder Infektion durch rekombinante Viren (19, 24, 25).
Vor der Kotransformationsprozedur umfassen oder exprimieren die Zellen der Wirtszellenpopulation bevorzugt kein auswählbares Markergen. Folglich exprimieren die tierischen Zellen vor der Transformation keine Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist.
Unter „auswählbares Markergen" versteht man ein Gen, das ein Protein kodiert, das für das Wachstum oder das Überleben einer Wirtszelle unter besonderen gewählten Zellzüchtungsbedingungen erforderlich ist. Eine Wirtszelle, die mit einem auswählbaren Margergen transformiert worden ist und die auswählbare Eigenschaften erwirbt, ist dementsprechend in der Lage, unter auswählbaren Zellkulturbedingungen zu wachsen oder zu überleben, während eine nicht transformierte Wirtszelle nicht in der Lage ist, zu wachsen oder zu überleben. Typischerweise verleiht ein auswählbares Markergen Resistenz gegenüber einem Medikament oder kompensiert einen metabolischen oder katabolischen Defekt in der Wirtszelle.
Beispiele für auswählbare Markergene sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Auswählbare Gene, die allgemein mit Eukaryotenzellen benutzt werden, umfassen die Gene für die Aminoglycosidphosphotransferase (APH oder neo), Hygromycinphosphotransferase (hyg), Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidinkinase (tk). Es sei jedoch bemerkt, dass einige auswählbare Markergene im allgemeinen kombiniert mit einer Chemikalie benutzt werden, die toxisch ist und die Totipotenz der Zellen beschädigen kann. Es wird deshalb entsprechend vorgezogen, dass auswählbare Markergene benutzt werden, die keine Benutzung von toxischen Chemikalien erfordern, um die Auswahl der gewünschten Zellen auszuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert das auswählbare Markergen eine Purinphosphoribosyltransferase. Bevorzugt ist die Purinphosphoribosyltransferase eine der Folgenden: Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), Adeninphosphoribosyltransferase (APRT), Guaninphosphoribosyltransferase (GPRT) oder Xanthinphosphoribosyltransferase (XPRT). Bevorzugt ist die Purinphosphoribosyltransferase HPRT. Bevorzugt ist die HPRT eine eukaryotische HPRT, bevorzugt eine Säugetier-HPRT, noch bevorzugter eine Nager-HPRT und noch bevorzugter eine murine HPRT.
Der Ausdruck „auswählbares Markergen" kann ein Produkt umfassen, das dem Wirt einen visuell detektierbaren Phänotyp verleiht. Die Benutzung eines Reportergens in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung würde jedoch die physische Trennung von Zellen erfordern, was ermüdend und unwirksam wäre. So wäre es unter den meisten Umständen nicht wünschenswert, ein Reportergen als auswählbares Markergen zu benutzen.
Auswählbare Markergene und Gene, die von Interesse sind, können aus genomischer DNA, aus zellulärer RNA transkribierte cDNA, oder durch in vitro-Synthese erhalten werden.
Unter einem „auswählbaren Genprodukt „ versteht man ein von einem auswählbaren Markergen kodiertes Protein.
Es ist verständlich, dass Zellen die nur eine oder zwei Kopien eines auswählbaren Markergens umfassen, keine ausreichenden Mengen des auswählbaren Genprodukts erzeugen, um unter selektiven Züchtungsbedingungen zu überleben. Daraus folgt entsprechend, dass Zellen mit im Wesentlichen keiner Expression eines auswählbaren Genprodukts bei einigen Amplifizierungsprotokollen erfolgreich benutzt werden können, woraus natürlich folgt, dass die untransformierten Zellen unzureichende Mengen des auswählbaren Genprodukts exprimieren, um im selektiven Medium überleben zu können.
Obgleich die Amplifizierung des nativen Gens eine Möglichkeit ist, die Amplifizierung eines eingeführten Gens viel wahrscheinlicher, da eingeführte Sequenzen dazu neigen, unbeständiger zu sein als native Gene. Dennoch ist es vorzuziehen, dass die tierischen Zellen keine native Kopie des auswählbaren Markergens umfassen. Außerdem arbeiten manche Amplifizierungsprotokolle nicht effizient, oder arbeiten gar nicht, wenn die tierische Zelle eine native Kopie des auswählbaren Markergens umfasst.
Es ist entsprechend vorzuziehen, dass die Zellen der Wirtszellenpopulation keine funktionsfähige oder teilweise untauglich gemachte native Kopie des auswählbaren Markergens umfassen. So umfassen die Zellen vor der Transformation mit einem auswählbaren Markergen keine funktionsfähige oder teilweise untauglich gemachte native Kopie des auswählbaren Markergens.
Das Expressionsniveau einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, oder eines auswählbaren Markergens in einer Wirtszelle können mit verschiedenen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden. Von einem Gen transkribierte mRNA kann z.B. durch Northern-Hybridisierung quantifiziert werden (22). Ein von einem Gen kodiertes Protein kann entweder durch Untersuchung der biologischen Aktivität des Proteins oder durch die Anwendung von Versuchen, die unabhängig von solch einer Aktivität sind, wie Western Blotting oder Radioimmunoassays die Gegenkörper benutzen, die in der Lage sind mit dem Protein zu reagieren (23), quantifiziert werden.
Unter „teilweise untauglich gemachtes auswählbares Gen„ oder einem auswählbaren Markergen, das einen Grad an „Expressionsuntauglichkeit" aufweist, wird ein Gen verstanden, das nicht voll funktionsfähig ist, so dass seine Aktivität gemindert aber nicht untauglich gemacht ist. Entsprechend kann das Gen geringere Mengen eines auswählbaren Genprodukts kodieren und/oder das Gen kann ein auswählbares Genprodukt mit geringerer als die die von einer voll funktionsfähigen Version des Gens Aktivität oder Stabilität kodieren. Ein teilweise untauglich gemachtes auswählbares Markergen kann durch Mutation einer voll funktionsfähigen Version des Gens hergestellt werden.
Die kotransformierten Wirtszellen werden unter Bedingungen gezüchtet die die Auswahl von Zellen erlauben, die deutlich erhöhte Niveaus des auswählbaren Genprodukts exprimierten. Unter „Zellen, die deutlich erhöhte Niveaus des auswählbaren Genprodukts exprimieren „werden Zellen verstanden, die das auswählbare Genprodukt mit einem messbar höheren Niveau als eine untransformierte Wirtszelle exprimieren.
In geeigneter Weise werden die Zellen in einem Medium gezüchtet, das das Wachstum von Zellen begünstigt, die deutlich erhöhte Niveaus des auswählbaren Genprodukts exprimieren und das Wachstum von Zellen mit kleiner oder keiner Expression des auswählbaren Genprodukts beeinträchtigen. Geeignete Nährstoffmedia und Zellzüchtungsverfahren sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Siehe z.B. Shermann (1991), Meth. Enzymol. 194: 3; Mather (1990), Meth. Enzymol. 185: 567; Berlin & Bode (1987), in Basic Biotechnology pp. 133–177 (VCH Publishers).
Bevorzugt erfordert oder umfasst das Amplifizierungsprotokoll nur einen Auswahlzyklus (d.h. einen einzigen Auswahlschritt). Man versteht, dass ein einziger Auswahlschritt den Vorteil hat, dass die Zellen nur während kurzer Zeit im Vergleich zu Protokollen, die mehrere Auswahlzyklen erfordern, gezüchtet werden müssen. Allgemein gesagt, je länger sich eine Zelle in einer Zellkultur aufhält, desto größer wird die Wahrscheinlichkeit, dass sie unter genetischen oder epigenetischen Änderungen leidet, was einen Verlust der Totipotenz zur Folge hat.
Bevorzugt wird ein teilweise untauglich gemachtes auswählbares Markergen aus einem von vielen Markergenen ausgewählt wobei die Gene mit einer Vielzahl sich unterscheidende Grade von Expressionsblockierung aufweisen. Folglich wird das teilweise untauglich gemachte auswählbare Gen in Bezug auf die Natur der Wirtszellpopulation und den gewünschten Grad von Genamplifizierung ausgewählt.
Der Fachmann erkennt, dass verschiedene Zelltypen verschiedene Empfindlichkeiten gegenüber dem Auswahlstoff aufweisen. Zellen können deshalb verschiedene Mengen eines auswählbaren Genprodukts aufweisen, um eine gegebene Anzahl von Auswahlbedingungen zu überleben, und entsprechend kann der Grad der Blockierung eines auswählbaren Markergens ausgewählt werden, um diese Erfordernis wiederzuspiegeln. Embryonale Stammzellen von Mäusen haben z.B. eine anspruchsvollere Anforderung gegenüber Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Aktivität als Chinesische Hamsterlungenfibroblasten und aus diesem Grunde ist es angepasst, ein HPRT-Gen zu benutzen, das nur einen geringen Grad an Blockierung in den ES-Zellen aufweist, aber einen höheren Grad an Untauglichkeit in Fibroblasten aufweist.
Es ist also verständlich, dass, wo ein hoher Grad an Genamplifizierung erforderlich ist, es angebracht ist, ein auswählbares Markergen zu benutzen, das einen hohen Grad an Untauglichkeit aufweist, während es geeignet sein kann, wenn nur ein kleiner Grad an Genamplifizierung gefordert wird, ein auswählbares Markergen zu benutzen, das nur einen kleinen Untauglichkeitsgrad aufweist.
Bevorzugt rührt ein Teil oder die gesamte teilweise Untauglichkeit des auswählbaren Markergens aus einem oder mehreren der Folgenden her:

(a) einem Mangel an transkriptioneller Kontrollsequenz, die normalerweise in der Promotorregion oder in einem Intron vorliegt;
(b) einem Mangel an Intron oder einem anderen mRNS-Verarbeitungssignal;
(c) einer Falschsinnmutation oder einer Nichtsinnmutation;
(d) einer Insertion eines Introns.

Bevorzugt ist das teilweise untauglich gemachte auswählbare Markergen ein murines HPRT-Minigen mit einer der folgenden Kennzeichen:

(a) einer Falschsinnmutation oder einer Nichtsinnmutation in einer HPRT-Kodierregion;
(b) einem abgestumpften Intron 1, in dem das Schlüsselkontrollelement vorliegt;
(c) einem abgestumpften Intron 2;
(d) einem abgestumpften oder abwesenden Intron 7 oder 8.

Es ist verständlich, dass murine HPRT in nichtmurinen Transformationssystemen benutzt werden können. Als man die Expressionserfordernisse für humane und Nager-HPRT untersucht hat, ist gefunden worden, dass sie sehr ähnlich sind. Siehe: Jiralerspong S, Patel PI (1996) Proc Soc Exp Biol Med 212: 116–27; und Reid et al. (1990) Proc Natl Acad Science USA 87: 4299–303.
Unter "das Schlüsselsteuerelement" des Introns 1 versteht man das Element in einem Intron 1 das auf eine Positions- und Orientierungsabhängige Weise agiert um die Transkription von einem verbundenen Promoter zu stimulieren.
Bevorzugt weist das murine HPRT-Minigen eine Falschsinnmutation von Asp (GAT) 200-Asn auf.
In geeigneter Weise benutzt der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Plasmid das ein teilweise untauglich gemachtes auswählbares Markergen umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Wirtszellpopulation totipotente Zellen, bevorzugt nichtmenschliche Embryostamm-(ES-)Zellen. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Wirtszellenpopulation Zellen, die für die Kernübertragung totipotent sind, bevorzugt Zellen, die von einem Gewebe eines nichtmenschlichen Embryos, Foetus oder Erwachsenen deriviert sind.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine transgene nicht menschliche tierische Zelle bereit, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist und die Zelle amplifizierte Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und amplifizierte Kopien eines teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens umfasst, welche Zelle durch ein Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung erhalten werden kann.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren für das Herstellen eines transgenen nichtmenschlichen Tiers bereit, das multiple Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, exprimiert und ein nützliches Niveau eines Produkts, das von Interesse ist, erzeugt, welches Verfahren das Verwenden einer Zelle nach dem zweiten Aspekt der Erfindung oder des genetischen Materials derselben zum Bilden eines transgenen nichtmenschlichen Tiers umfasst.
Unter „Produkt, das von Interesse ist" versteht man ein Produkt, das von einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, kodiert wird. Normalerweise ist das Produkt ein Protein.
Es sind verschiedene Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere aus dem Stand der Technik bekannt. Die Hauptmittel durch die transgene Tiere laufend erzeugt werden, sind: pronukleare DNA-Mikroinjektion; Blastocyten-Mikroinjektion oder Morula-Aggregation von embryonalen Stammzellen (ES); und replikationsdefekte virale Vektortransduktion (17).
Das für die Produktion eines speziellen transgenen Tiers gewählte Verfahren wird beeinflusst durch die relativen Vorteile und Grenzen der verschiedenen Verfahren und die bei der Genamplifizierungsprozedur benutzten Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführung umfasst die Wirtszellenpopulation totipotente Zellen, bevorzugt nicht menschliche embryonale Stammzellen (ES). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Wirtszellenpopulation für die Kernübertragung totipotenter Zellen, besonders von einem nicht menschlichen Embryo, Fötus oder erwachsenem Gewebe derivierte Zellen.
Die ES-Zellen können benutzt werden, um mit Hilfe von etablierten Prozeduren (9) ein transgenes Tier herzustellen, das koamplifizierte Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, enthält. Kurz, es werden chimärische Tiere entweder durch Injizieren von ES-Zellen in die Wirts-Blastozyten, oder durch Vereinigen von ES-Zellen mit der Wirts-Morula, hergestellt. In jedem Fall werden die chimärischen Embryos wieder in die Nährmütter eingepflanzt und erlauben die Entwicklung von chimärischen Tieren. Wenn die ES-Zellen zu der Keimlinie der Chimären beigetragen haben, dann werden einige Gameten der Chimären ES-Zellen-deriviert. Durch Kreuzen einer Chimäre mit einem anderen Tier, kann eine Vermehrung mit dem von den Zellen derivierten Genmaterial erhalten werden. Wenn die benutzten ES-Zellen koamplifizierte Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, enthalten, werden einige der Nachkommen das koamplifizierte Gen in allen ihren somatischen Zellen enthalten. Auf diese Weise können transgene Stämme die das koamplizierte Gen enthalten, erzeugt werden.
Während das ES-System in der Maus entwickelt worden ist, können andere Tierarten (z.B. Säugetierarten) zur Erreichung des Erfindungsziels benutzt werden. Isolierung von ES-Zellen ist beschrieben worden in Robertson 1987.
Ein zweites Verfahren zur Herstellung transgener Tiere, das wahrscheinlich besonders nützlich bei größeren Tierarten wie Schafe und Vieh ist, kann auch zur Erzeugung transgener Tiere erfindungsgemäß benutzt werden. Es ist die Basisprozedur für das Klonen von Schafen beschrieben worden (10, 11).
Kurz gesagt, es wurde eine Zelllinie von einer 9 Tage alten Schafs-Embryonalscheibe hergestellt; Die Kernübertragung von diesen Zellen in entkernten Oozyten ergab lebensfähige Lämmer. Die Prozedur wurde dann anschließend unter Benutzung der Kerne fötaler Fibroblasten in einem Fall von erwachsenen Säugetier-Epithelzellkulturen wiederholt. Die Isolierung von Zellen mit wenig oder keiner Expression eines gegebenen auswählbaren Genprodukts von Derivaten solcher Zellen wurde von jungen Tierembryos, -Föten, oder erwachsenem Gewebe deriviert und die Totipotenz für die Kernübertragung behalten, wird eine Benutzung der hier beschriebenen Genamplifizierungsprozedur und die Herstellung, durch Kernübertragung in entkernten Oozyten von transgenen Tieren, die koamplifizierte Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, enthalten, erlauben.
Siehe auch Schnieke AE, et al. (1997) Science 278: 2130–3, WO 97/07669, WO 98/30683 und Sims et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6143–6147 für eine weitere Information über die Herstellung transgener Tiere bei der Benutzung von Kernübertragungsprotokollen.
Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt ein transgenes nichtmenschliches Tier das totipotent oder totipotent für die Kernübertragung ist, bereit und das amplifizierte Kopien der Nukleinsäuresequenzen, die von Interesse sind, enthält, und welches Tier mit Hilfe des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
Ein transgenes Tier der vorliegenden Erfindung kann eine Chimäre sein oder es kann mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, in allen seinen somatischen Zellen exprimieren. Ein transgenes Tier der vorliegenden Erfindung kann auch eine erste Generation eines transgenen Tiers oder irgendein Nachkomme sein, der mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, enthält.
Bevorzugt exprimiert ein transgenes Tier der vorliegenden Erfindung wesentliche Mengen des Produkts, das von Interesse ist, entweder konstitutiv oder auf geregelte Art, über den ganzen Körper oder beschränkt auf ein besonderes Gewebe oder Körperflüssigkeit.
Verfahren zur Erreichung der gewebespezifischen Expression eines Transgens sind weitgehend im Stand der Technik beschrieben. Der Metallothionein-Promoter ist z.B. benutzt worden, um die Expression des Rattenwachstumshormons im Lebergewebe von transgenen Mäusen (Palmiter et al. (1982), Nature 300: 611) zu regeln. Ein anderes Beispiel ist der Elastase-Promoter, für den gezeigt worden ist, dass er die Expression von fremden Genen in der Pankreas regelt (Ornitz et al. (1985), Nature 313: 600). Siehe auch EP 279 582 worin Verfahren zum Lenken von Proteinen zur Säugetier-Drüse und die nachfolgende Sekretion von biologisch wichtigen Molekülen in der Milch beschrieben wird.
Eine entwicklungsgemäße Steuerung der Genexpression ist auch in transgenen Tieren erreicht worden, d.h. das fremde Gen ist nur während einer gewissen Zeitdauer und nur in gewissen Geweben transkribiert worden. Magram et al. (1985 Nature 315: 338) zeigen z.B. die entwicklungsgemäße Steuerung der Genexpression unter dem Einfluss eines Globin-Promoters.
Von einem transgenen Tier der vorliegenden Erfindung hergestelltes Protein kann z.B. aus seinem Serum, seiner Milch oder aszitischen Fluiden geerntet werden. Das gewünschte Protein kann dann von anderen Wirtsproteinen durch aus dem Stand der Technik gut bekannte Verfahren gereinigt werden, um Präparationen des gewünschten Proteins, die im wesentlichen homogen sind, zu erhalten.
Während die hier beschriebenen Techniken benutzt werden können, um transgene Tiere zu erzeugen, die kommerziell wichtige Proteine herstellen, wird es auch geplant, dass die Verfahren der Erfindung benutzt werden können, um die Tiere zu erzeugen, die eine höhere Leistungsfähigkeit, z.B. eine höhere Wachstumsrate oder Fleischqualität haben. Tiere der vorliegenden Erfindung können auch in der Forschung benutzt werden. Gebiete der möglichen Forschung umfassen den von der Genamplifizierung herrührenden Krebs, die Konsequenzen der Überproduktion von Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, oder andere Signalmoleküle in der Entwicklung und um Krankheiten zu bekämpfen.
Im Prinzip kann die vorliegende Erfindung potentiell auf alle Tiere, einschließlich Vögel, wie Hausgeflügel, amphibische Spezies, und Fischarten angewandt werden. In der Praxis jedoch sind es nicht-menschliche Tiere, insbesondere (nicht-menschliche) Säugetiere, insbesondere plazentare Säugetiere, für die der größte kommerzielle Nutzen im Augenblick in Aussicht gestellt werden kann. Es handelt sich auch um Huftiere, insbesondere Vieh, Schafe und Schweine für die Erfindung wahrscheinlich besonders nutzvoll ist. Es sollte angemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung auch auf andere wirtschaftlich wichtige Tierarten wie z.B. Nager, z.B. Ratten und Mäuse, oder Kaninchen und Meerschweinchen anwendbar ist.
Die hier vorgestellte Erfindung ist basiert auf der Fähigkeit, unter gewissen Umständen in einem einzigen Schritt die großmaßstäbliche Amplifizierung des HPRT-Gens auszuwählen. Dieses Gen kodiert für ein Enzym (HPRT; EC 2.4.2.8.; alternativ als Hypoxanthine-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPGRT) beschrieben), das am Salvage-Passageway (Reaktionsweg zur Wiederverwertung der Purine) in Säugetierzellen beteiligt ist, wobei es entweder die Purinbase Hypoxanthin oder Guanin phosphoribosylatiert, um jeweils IMP oder GMP zu bilden. Zellen, denen eine HPRT-Aktivität fehlt, können leicht nach ihrer Fähigkeit in der Gegenwart von Purinanalogen so wie 6-Thioguanin gezüchtet werden, die durch HPRT phosphoribosylatiert wurden, um toxische Produkte zu erzeugen, ausgewählt werden. Im Gegensatz dazu, werden Zellen mit HPRT-Aktivität nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, um in einem HAT-Medium (4) gezüchtet zu werden. HAT-Medien enthalten: Aminopepterin, einen Inhibitor der Dihydrofolatreduktase, um de novo die Purin- und Pyrimidin-Synthese zu blockieren und so die Zellen von funktionsfähigen Salvage-Pathways abhängig zu machen; Hypoxanthin, als Substrat für HPRT und den Purin-Salvage-Pathway (Reaktionsweg zur Wiederverwertung der Purine); Thymidin, als Substrat für den Thymidin-Salvage-Pathway (Reaktionsweg zur Wiederverwertung der Thymidine).
Die Amplifizierung des chromosomalen Maus-HPRT-Gens ist kürzlich beschrieben worden (5). Ein 6-Thioguanin-resistentes Derivat (NB–) der Mäuse-Neuroblastoma-Zelllinie (NB+) enthalten in einer HPRT-Falschsinnmutation, Asp (GAT) 200-Asn (AAT). Das mutante Protein hat die katalytische Fähigkeit und die geringe thermische Stabilität reduziert. Die Auswahl der NB-Zellen im HAT-Medium stellte selektiven Druck für die Isolierung von Revertanten (NBR)-Zelllinien mit bis zu 50 amplifizierten Kopien des chromosomalen HPRT-Gens bereit. Die NBR-Zellen haben im HAT-Medium überlebt wobei sie hohe Mengen von mutanten Proteinen hergestellt haben.
Das X-Chromosom-gelinkte Mäuse-HPRT-Gen ist 33 kb lang und enthält neun Exons. Eine Serie abgestumpfter Versionen des HPRT-Gens (Minigene), die auf Plasmidvektoren geklont waren und darin eingeführt werden können, und darin wirksam exprimiert wurden, haben sich gezüchtete Säuretierzellen entwickelt (6). Die Einführung und Expression einer einzigen Kopie einer dieser vollfunktionsfähigen HPRT-Minigene in einer HPRT-defizienten Zelle ist ausreichend, in einer Reihe von gezüchteten Zellarten HAT-Resistenz zu verleihen, (siehe Beispiel 1 und Referenzen 7 & 8). Die Sequenzerfordernisse für eine wirksame Minigenexpression ist untersucht worden (6). Zusätzlich zu der Promoter-Region, gibt es eine Erfordernis für das vorher erwähnte Schlüssel-Steuer-Element im Intron 1. Es gibt es eine nicht spezifische Erfordernis für eine Anzahl von zusätzlichen Introns im Minigen, um die maximale Expression zu erreichen.
Zellen, denen die HPRT-Aktivität fehlt, werden nach ihrer Fähigkeit isoliert, in Anwesenheit von 6-Thioguanin zu wachsen. Eine 6-Thioguanin-Konzentration im Bereich von 5 bis 20 μg/ml ist für die meisten Säugetierzelltypen geeignet. Die Benutzung von teilweise Expressions-untauglichen HPRT-Minigenen erlaubt eine Auswahl in einem Schritt in einem HAT-Medium für Zellen die bis zu Tausende von Kopien der beiden amplifizierten HPRT-Minigene und die koamplifizierten Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, enthalten, wenn die Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, gemäß einem teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigen, in eine HPRT-defizient gezüchtete Säuretierzelle kotransformiert ist. Die Zellen werden dann große Mengen an Produkten, die von Interesse sind, herstellen. Eine Serie von HPRT-Minigenen, mit variierenden Expressionsuntauglichkeitsgraden, erlauben es dem System, in einem einzigen Auswahlschritt benutzt zu werden, um verschiedene Amplifizierungsniveaus des HPRT-Minigens und der kotransformierten Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, in einer Reihe von verschiedenen Säugetierzelltypen zu erreichen. Alle teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigene enthalten die Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation und kodieren so ein HPRT-Protein mit reduzierter katalytischer Aktivität und geringer thermischer Stabilität. Die Vektoren variieren in der Anzahl der anwesenden Introns (1). pDWM131 wird in der Serie zuletzt untauglich gemacht, umfassend einen abgestumpften Intron 1 (mit einem anwesenden Schlüsselsteuerelement), einen abgestumpften Intron 2, und Introns 7 und 8. pDWM129 enthält dasselbe abgestumpfte Intron 1 wie pDWM131, eine abgestumpftere Version des Introns 2, aber es fehlen die Introns 7 und 8. pDWM128 enthält nur das abgestumpfte Intron 1 und ist so das untauglichste Minigen in den Serien. pDWM131 wurde aus pDWM110 konstruiert, pDWM129 wurde aus pDWM127 konstruiert und pDWM128 wurde aus pDWM126 konstruiert, und bei allen fand eine Inkorporierung der Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation statt.
Die Konstruktion von pDWM110, pDWM127 und pDWM126 sind vorher beschrieben worden (6).
Konstruktion von pDWM131 aus pDWM110
Das voll funktionsfähige HPRT-Minigen pDWM110 wurde mit XhoI (Stelle im Exon 3) und NcoI (Stelle im Intron 8) aufgeschnitten und das 7,2 kb Rückgrat (Fragment 1) wurde von dem 1 kb-Fragment vom Exon 3 bis zum Intron 8 gel-gereinigt. Das voll funktionsfähige HPRT-Minigen pBT/PGK-HPRT (RI) (Referenz 6) wurde mit XhoI und ScaI aufgeschnitten und das 0,6 kb Fragment (Fragment 2) wurde von der XhoI-Stelle im Exon 3 bis zur ScaI-Stelle im Exon 8 gel-gereinigt. Die ScaI-Stelle liegt dem Asp (200)-Kodon, das in allen teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigenen ein mutiertes Asp (200)-Asn ist, vorgeschaltet. Das Endfragment (Fragment 3), ein 0,4 kb Fragment von der ScaI-Stelle im Exon 8 bis zur NcoI-Stelle im Intron 8 und das die Falschsinnmutation Asp (200)-Asn enthält, wurde durch PCR erhalten. Die Matrize war genomisches DNA von der NBR4-Linie (Referenz 5), die amplifizierte Kopien des chromosomalen Mäuse-HPRT-Gens mit der Falschsinnmutation aufweist. Es wurden Primer benutzt, um das 3'-Ende des HPRT-Gens der NBR4-Zelle zu amplifizieren. Der Vorwärts-Primer war vom Exon 8, der ScaI-Stelle vorgeschaltet, der Rückwärts-Primer war vom Exon 9. Die Primer waren von der Mäuse-HPRT-cDNA-Sequenz, GenBANK Acc. No. J00423.
25 Zyklen: 94°C: 1 Minute, 67°C: 1 Minute, 72°C: 1 Minute
50 μl-Reaktion mit 100 ng Matrizen-DNA, 300 ng jeder Primer, 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase in 5 mM KCl/0,15 mM MgCl₂/1 mM Tris-HCl/0,045% Triton X-100/0,045% Tween 20/0,4 mM Na₂ EDTA/0,1 mM dNTPs.
Das 0,8 kb-Produkt wurde mit ScaI und NcoI zerschnitten und das Fragment 3 wurde gel-gereinigt. Die Fragmente 1 bis 3 wurden dann über ihre einzigen kohäsiven Enden gebunden, um das Plasmid pDWM131 zu erzeugen. Die Anwesenheit der Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation in pDWM131 und das Fehlen von anderen Veränderungen in der von dem Fragment 3 derivierten Region wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Konstruktion von pDWM128 aus pDWM126
pDWM126 wurde mit XhoI (Stelle im Exon 3) und EcoRI (Stelle am 3'-Ende des Minigens) zerschnitten und das 4,2 kb Plasmid-Rückgrat wurde von dem 1,1 kb-Fragment vom Exon 3 bis zum 3'-Ende des Minigens gel-gereinigt. Das von der NBR4-Zelllinie derivierte und die Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation enthaltende Mäuse-HPRT-cDNA-Klon pHPT5 (Ref. 12) wurde mit PstI (künstliche Stellen an jedem Ende des cDNA-Inserts) zerschnitten, die Enden wurden mit Klenow abgestumpft und mit EcoRI-Linkern befestigt. pHPT5 wurde dann wieder mit XhoI (Stelle im Exon 3) zerschnitten und EcoRI und das, von Exon 3 bis zum 3'-Ende der cDNA gehende und die Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation enthaltende 1,1 kb-XhoI-EcoRI-Fragment wurde gel-gereinigt und mit dem 4,2 kb Plasmid-Rückgrat des pDWM126 gebunden um das pDWM128 zu erzeugen.
Konstruktion von pDWM129 aus pDWM127
pDWM127 wurde mit XhoI (Stelle im Exon 3) und EcoRI (Stelle am 3'-Ende des Minigens) zerschnitten und das 4,5 kb Plasmid-Rückgrad wurde von dem 1,1 kb-Fragment vom Exon 3 bis zum 3'-Ende des Minigens gel-gereinigt. Das von der NBR4-Zelllinie derivierte und Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation enthaltende Mäuse-HPRT-cDNA-Klon pHPT5 (Ref. 12) wurde mit PstI (künstliche Stellen an jedem Ende des cDNA-Inserts) zerschnitten, die Enden wurden mit Klenow abgestumpft und mit EcoRI-Linkern befestigt. pHPT5 wurde dann wieder mit XhoI (Stelle im Exon 3) zerschnitten und EcoRI und das, von Exon 3 bis zum 3'-Ende der cDNA gehende und die Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation enthaltende 1,1 kb-XhoI-EcoRI-Fragment wurde gel-gereinigt und mit dem 4,5 kb Plasmid-Rückgrat des pDWM127 gebunden, um das pDWM129 zu erzeugen.
Die Auswahl des teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigens hängt von der Größe der erforderlichen Genamplifizierung und dem zu benutzenden speziellen HPRT-defizienten Zelltyp ab. Embryonale Stammzellen von Mäusen haben z.B. anspruchsvollere Anforderungen an die Genexpression als Lungenfibroblasten von chinesischen Hamstern (Ref. 6 und Beispiele 1 und 2) und aus diesem Grunde ist die Benutzung von weniger unbrauchbar gemachten Minigenen in ES-Zellen wahrscheinlich geeigneter. Der das teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigen enthaltende Vektor und der das zu koampflizierende Gen enthaltende Vektor werden beide vor der Einführung in die HPRT-defizienten Zellen linearisiert. Es ist nicht erforderlich, für die Koamplifizierung, dass das teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigen und die Nukleinsäure, die von Interesse ist, im selben Vektor-DNA-Molekül vorliegen. 24 Stunden nach dem Gentransfer wird eine HAT-Selektion für die Genamplizierung ausgeführt und es können die HAT-resistenten Kolonien, die amplifizierte Kopien des teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigens und koamplifizierte Nukleinsäuren, die von Interesse sind, isoliert werden. Die zum Isolieren der Kolonien mit amplifizierten Minigenen erforderliche Zeitdauer der HAT-Selektion hängt von dem benutzten Zelltyp ab.
Wenn das Einschritt-Genamplifizierungs-Protokoll in HPRT-defizienten Derivaten von bekannten Tier- oder Säugetierzelllinien, wie Lungenfibroblasten von chinesischen Hamstern, ausgeführt worden ist, können die die Klone enthaltenden amplifizierten Kopien des HPRT-Minigens und die koamplifizierten Nukleinsäuren, die von Interesse sind, expandiert werden und in Abhängigkeit von der Art des hergestellten koamplifizierten Genprodukts können entweder die Zellen oder das Kulturmedium geerntet werden, um das Produkt zu erhalten, das von Interesse ist.
Der in hohem Maße unstabile Charakter des in den HPRT-amplifizierten Zelllinien hergestellten HPRT-Proteins sollte die Reinigung des von der koamplifizierten Nukleinsäure kodierten Produkts, das von Interesse ist, vereinfachen. Es wurde vorher angemerkt, dass wenn die Zellen als Konsequenz einer erfolgreichen Amplifizierung große Mengen von zwei Proteinen herstellen (das von der Nukleinsäure, die von Interesse ist, kodierte Protein und das von auswählbaren Genmarker kodierte Protein), die biochemische Reinigung des Proteins aus der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, wegen der großen Menge des anderen anwesenden Proteins sehr kompliziert ist. Falls das vom auswählbaren Genmarker kodierte Protein jedoch unstabil ist, so wird es schnell zerfallen und die Reinigung des Proteins aus der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, nicht stören.
Wenn es die Absicht ist, transgene Tiere mit amplifizierten Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, herzustellen, dann wird die Genamplifizierungs-Prozedur entweder in HPRT-defizienten Stammzellen (ES) oder in HPRT-defizienten Derivaten der aus Embryos, Föten oder Geweben von Erwachsenen isolierten Primärkulturen ausgeführt. Wenn die transgenen Tiere hergestellt werden sollen, sollte der Vektor, der das teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigen trägt und der Vektor, der die Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, trägt, beide in solcher Weise zerschnitten werden, dass das HPRT-Minigen und die Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, aus den Vektorsequenzen vor dem Gentransfer entlassen werden. Das wird das Risiko der Inkorporierung von Vektorsequenzen in die amplifizierten Einheiten des HPRT-Minigens und der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, vermindern, was einen nachteiligen Effekt auf die Expression haben könnte.
Obgleich diese Erfindung beispielhaft teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigene von Mäusen benutzt hat, so kann diese Erfindung auch mit jeder beliebigen Nukleinsäuresequenz funktionieren, die eine teilweise untauglich gemachte HPRT-Aktivität kodiert. Durch Änderung des selektiven Mediums kann sie auch mit jeder beliebigen Nukleinsäuresequenz funktionieren, die jede beliebige teilweise untauglich gemachte Purin-Phosphoribosyltransferase Aktivität, wie – Adenin-Phosphoribosyltransferase –, Guanin-Phosphoribosyltransferase oder Xanthinin-Phosphoribosyltransferase kodiert. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Benutzung anderer Nukleinsäuresequenzen, die für andere Markergene kodieren, vorausgesetzt, dass geeignete Auswahlverfahren existieren, eine Einschritt-Amplifizierung des Markergens in gezüchteten Tierzellen existieren und dass die benutzten Auswahlverfahren nicht die Totipotenz der spezialisierten, zur Herstellung transgener Tiere mit amplifizierten Kopien der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, benutzten Tierzelllinien nachteilig beeinflusst.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden bei der Herstellung vieler verschiedener Proteine auf den industriellen, landwirtschaftlichen und pharmazeutischen Gebieten und insbesondere bei der Herstellung von Proteinen, die in begrenzten Mengen aus natürlichen Quellen, einschließlich solcher Proteine wie Wachstumshormone, Interferone, neurotrophische Faktoren, DNAs, Erythropoietin, Inhibin, Insulin, Relaxin, und Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren zur Verfügung stehen.
Im folgenden wird die Erfindung nur beispielhaft ausführlicher an Hand der im Anhang befindlichen Figuren beschrieben:
1: Struktur der HPRT-Minigene. Die Struktur des voll funktionsfähigen HPRT-Minigens pBT/PGK-HPRT (RI) und die teilweise untauglich gemachten Minigene pDWM128, 129 und 131 werden schematisch gezeigt. pBT/PGK-HPRT (RI) und pDWM131 werden in pBluescript II SK (+) geklont, während pDWM128 und 129 in pUC8 geklont werden. In pBT/PGK-HPRT (RI) ist das Minigen unter Kontrolle des Mäuse-Phosphoglycerat-Kinase-Gen-Promoters, während in den drei teilweise untauglich gemachten Minigenen der natürliche Mäuse-HPRT-Gen-Promoter benutzt wird. Es werden die Positionen in jedem Minigen der neun Kodierblöcke des chromosomalen HPRT-Gens angegeben. Die Position der Asp (200)-Asn-Falschsinnmutation im Exon 8 der teilweise untauglich gemachten Minigene ist mit einem Sternchen angegeben. Es sei bemerkt, dass bei pDWM128 und 129 der Ort des internen 270 bp-HindIII-Restriktions-Fragments benutzt wird, um das Niveau der Minigenamplifizierung durch Southern-Blotting zu bestimmen. Für pBT/PGK-HPRT (RI) und pDWM131, ist der äquivalente Teil der Kodierungsregion zur Kopienummerbestimmung auf einem internen 1,1 kb-HindIII-Fragment gelegen.
2: Struktur des menschlichen Wachstumshormon-Plasmids. pBT/MT-HGH wird in pBluescript II KS (+) geklont. Die menschliche HGH-Kodierungs-Region ist unter Kontrolle des MT-I-Gen-Promoters, wobei die Polyadenylierungssignale von der 3'-nicht-translatierten Region des menschlichen HGH-Gens bereitgestellt werden. Es sei auf den für die Bestimmung des Niveaus der Genamplifizierung durch Southern-Blotting benutzten Ort des internen 270 bp PstI-BgIII-Restriktionsfragments hingewiesen.
3: Bestimmung der Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien in HAT-resistenten RJK 88 Zellen nach der Einzelschritt-Genamplifizierungs-Prozedur: Das genomische DNA (3 μg) von HAT-resistenten Lungenfibroblastklonen von chinesischen Hamstern (CHL), kotransformiert mit pBT/MT-HGH und pBT/PGK-HPRT (RI), pDWM128 oder 129, wurde mit EcoRI/HindIII aufgeschnitten, elektrophoresiert und mit dem Mäuse-HPRT-cDNA-Klon-pHPT5 (12) untersucht. Parallel dazu wurde die RJK88-DNA (3 μg) mit verschiedenen Mengen von pDWM128-Plasmid-DNA versetzt, was der angegebenen Anzahl von genomische Äquivalenten entspricht, mit EcoRI/HindIII aufgeschnitten, auf dem gleichen Gel elektrophoresiert und untersucht, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten, gegen die die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien in den HAT-resistenten Klonen bestimmt werden kann. Das wurde durchgeführt, indem die Intensität des angegebenen internen 270 bp HindIII-Fragments (siehe 1) verglichen wurde. Es sei bemerkt, dass die vom Blot bestimmte Kopienanzahl dann für jede unregelmäßige DNA-Ladung korrigiert wird, um die in der Tabelle 3 gezeigten Amplifizierungsniveaus zu erhalten.
4: Bestimmung der Anzahl der MT-HGH-Minigen-Kopien in HAT-resistenten RJK 88 Zellen nach der Einzelschritt-Genamplfizierungs-Prozedur: Diese wurde so durchgeführt, wie es in der Legende der 3 beschrieben ist, außer dass die DNA mit PstI/BgIII aufgeschnitten und mit dem HGH-cDNA-Klon untersucht wurde. Die Kalibrierungskurve wurde bestimmt, indem das Plasmid pBT/MT-HGH aufgeschnitten wurde, wobei das angegebene interne 270 bp HindIII-Fragment benutzt wurde, um die Kopienanzahl zu bestimmen. Es sei bemerkt, dass die vom Blot bestimmte Kopienanzahl dann für jede unregelmäßige DNA-Ladung korrigiert wird, um die in der Tabelle 3 gezeigten Amplifizierungsniveaus zu erhalten.
5: Bestimmung der Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien in embryonalen Stammzellen von Mäusen und in transgenen Mäusen nach der Einzelschritt-Genamplifizierungs-Prozedur: HM-1-Zellen wurden mit pDWM131 transformiert. Genomische DNA (3 μg) von Klonen, die die Selektionsprozedur überlebt haben, wurden mit EcoRI/HindIII aufgeschnitten, elektrophoresiert und mit dem Mäuse-HPRT-cDNA-Klon-pHPT5 untersucht. Parallel dazu wurde die HM-1-DNA (3 μg) mit verschiedenen Mengen von pDWM131-Plasmid-DNA versetzt, was der angegebenen Anzahl von genomische Äquivalenten entspricht, mit EcoRI/HindIII aufgeschnitten, auf dem gleichen Gel elektrophoresiert und untersucht um eine Kalibrierungskurve zu erhalten, gegen die die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien in den überlebenden HM-1-Klonen bestimmt werden kann. Das wurde durchgeführt, indem die Intensität des angegebenen internen 1,1 kb HindIII-Fragments verglichen wurde. Zwei Proben von jedem ES-Zellen-Klon (pDWM131 #2 und 3) werden gezeigt. Die vier transgenen Mäuse sind alle Nachkommen einer aus dem ES-Zellen-Klon-pDWM131#2 hergestellten Chimäre.
Beispiel 1: Erzeugung von Lungenfibroblast-Zelllinien eines chinesischen Hamsters mit amplifizierten Kopien des menschlichen Wachstumshormon-Gens, das menschliches Wachstumshormon in das Medium ausscheidet.
Das Einzelschritt-HPRT-Gen-Amplifizierungs-System wurde in RJK88-Zellen – einem nicht devertierenden HPRT-defizienten Derivat der Lungenfibroblasten-Zelllinie von chinesischen Hamstern V 79 (13) getestet. Das Gen für das menschliche Wachstumshormon (HGH) wurde wegen seiner medizinischen und wirtschaftlichen Wichtigkeit und weil es geeignete immunoradiometrische Assays gibt, um die Niveaus des Wachstumshormons im Zellkulturmedium zu messen, als Gentest für die Koamplifizierung ausgewählt. Der benutzte HGH-Vektor war pBT/MT-HGH (2), der eine 670 bp-HGH-cDNA vom 770 bp-Fragment des Mäuse-Metallothionein-(MT)-I-Genpromoter exprimiert, wobei die nicht translatierte Region und das von einem 620 bp Fragment des HGH-Gens zur Verfügung gestellte Polyadenylierungssignal bereitgestellt werden. Die Translations-Initiierungs-Region der HGH-cDNA wurde modifiziert, um einen starken Kozak-Konsensus zu erhalten (14), aber der Vektor wurde auf keine andere Weise modifiziert, um hohe HGH-Expression-Niveaus zu erreichen. Es wird insbesondere angemerkt, dass das benutzte MT-I-Promoter-Fragment kein starker Promoter ist. So stellt dieser Vektor einen guten Test für die Fähigkeit des HPRT-Gen-Amplifizierungssystems dar, hohe HGH-Niveaus zu exprimieren.
Ein voll funktionsfähiges (pBT/PGK-HPRT (RI)) und zwei teilweise untauglich gemachte (pDWM128 und 129)-HPRT-Minigene wurden in diesem Test benutzt (siehe 1). Die HPRT-Minigene wurden vor der Kotransformation in RJK88 Zellen durch Calciumphosphat-vermittelte Transformation mit pBT/MT-HGH, mit BamHI linearisiert. Jede Kotransformation benutzte 20 μg des HPRT-Minigen-DNA plus 20 μg HGH-Vektor. Eine HAT-Selektion (4) wurde während 24 Stunden nach der Transformation angewendet und die überlebenden HAT-resistenten (HAT^R)-Kolonien wurden nach 7 bis 14 Tage gezählt (siehe Tabelle 1). Wie erwartet, ergaben die zwei teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigene eine niedrigere Häufigkeit der HAT^R-Kolonien als das voll funktionsfähige Minigen, wobei das am meisten untauglich gemachte Minigen (pDWM128) die niedrigste Transformationshäufigkeit von allen ergab.
Individuelle HAT^R-Kolonien wurden aus jeder der drei Kotransformationen entnommen und in dem HAT-Medium expandiert. Für jeden Klon wurde das Niveau des in das Züchtungsmedium extrudierte HGH mit Hilfe eines immunoradiographischen Assays bestimmt. Dies wurde dadurch erreicht, indem die Kulturen so gezüchtet werden, dass sie sich der Konfluenz in den 90 mm-Schalen nähern. Dieses Medium wurde dann aufgesaugt und durch 10 ml frisches Medium ersetzt. 24 Stunden später wurde das Medium kollektiert und es wurde eine Probe für den HGH-Assay genommen. Die einschichtige Zellschicht wurde gelyst und es wurde ein Proteinextrakt hergestellt, um die Menge Zellen/Schale unter Benutzung der Lowry-Methode zu bestimmen. So konnte die Konzentration von HGH im Kulturmedium (in ng/ml) pro mg Zellprotein exprimiert werden (siehe Tabelle 2). Das mittlere Niveau des in das Medium für Klone abgeschiedene HGHs, das mit dem voll funktionsfähigen HPRT-Minigen (pBT/PGK-HPRT) (RI)) kotransformiert worden ist, belief sich auf 12,1 ng/ml/mg Zellprotein. Der Mittelwert war siebenmal höher für das teilweise untauglich gemachte Minigen pDWM129, und achtzehn mal höher für das am untauglichsten gemachte pDWM128, wo ein selektiver Druck für das höchste Niveau der HPRT-Minigen-Amplifizierung existieren sollte. Bezeichnenderweise kommen alle vier Einzelklone mit den höchsten HPRT-Niveaus (pDWM128# 5, 8, 13 und 31) von den pDWM128-Kotransformationen. Das höchste erhaltenen HGH-Niveau (pDWM128# 8) lag über 50 mal über dem in den Klonen gefundenen mittleren Niveau, die in Klonen gefunden wurde, die mit dem voll funktionsfähigen HPRT-Minigen kotransformiert worden waren. Die höchsten, von einigen Klonen, die mit teilweise untauglich gemachten Minigene kotransformiert worden waren, erzeugten HGH-Niveaus gaben an, dass es dort eine Koamplifizierung des MT-HGH-Gens gab.
Das Ausmaß der HPRT-Minigen-Amplifizierung und der Coamplifizierung des MT-HGH-Gens in ausgewählten HAT-resistenten RJK88-Klonen wurde durch eine Southern-Analyse bestimmt. Das aus individuellen Klonen hergestellte genomische DNA wurde aufgeschnitten, um ein internes Fragment von jedem der zwei Gene anzuzeigen und wurde dann entweder für HPRT- oder MT-HGH-Sequenzen analysiert. Die Genkopienanzahl wurde durch Vergleich des vom internen Genfragment erhaltenen Hybridisationssignal mit einer Kalibrierungskurve einer bekannten Anzahl von genomischen Äquivalenten des Plasmid-DNAs bestimmt, mit RJK88-DNA versetzt und auf die gleiche Weise wie die genomischen DNAs aufgeschnitten. Die Anzahl der Genkopien wird in der Tabelle 3 gezeigt und die Southern-Blots werden auf den 3 und 4 gezeigt. Es gibt keinen Hinweis für eine HPRT-Minigen-Amplifizierung, oder Koamplifizierung des MT-HGH Gens, in den drei analysierten Klonen, die mit dem voll funktionsfähigen pBT/PGK-HPRT (RI)-HPRT-Minigen kotransformiert waren. Alle analysierten Klone von den Kotransformationen mit des teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigenen zeigten beträchtliche HPRT-Minigen-Amplifizierungen und Coamplifizierungen des MT-HGH-Gens. Im allgemeinen, wurden die höchsten Niveaus von HPRT-Minigen-Amplifizierung und MT-HGH-Gen-Coamplifizierung mit dem am meisten untauglich gemachten Minigen pDWM128 beobachtet. Die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien reichte von 1.400 bis > 10.000 während die Anzahl der MT-HGH-Genkopien etwas niedriger war, sie reichte von 500 bis 3.000. Im allgemeinen war die Anzahl der HPRT-Minigene und der MT-HGH-Genkopien in individuellen Klonen sehr ähnlich, was nahe legte, dass die Gene zusammen als Teil der gleichen Einheit amplifiziert worden waren, aber es gab Ausnahmen. Es gab keine gute Korrelation zwischen der Anzahl der MT-HGH-Genkopien und dem Niveau der HGH-Produktion im Medium. Das könnte vom Expressionsmangel einiger amplifizierter Gene kommen oder daher rühren, dass einige der amplifizierten Einheiten keine intakten MT-HGH-Gene enthalten (nur das interne 270 bp-PstI-BgIII-Fragment ist nach Southern-Blot analysiert worden).
Als Schlussfolgerung können teilweise untauglich gemachte HPRT-Minigene in HPRT-defizienten Lungenfibroblasten von chinesischen Hamstern benutzt werden, um eine Einzelschritt-HPRT-Minigen-Amplifizierung, mit Kopienanzahlen von über 10.000 und eine Koamplifizierung des menschlichen Wachstumshormongens mit Kopienanzahlen bis zu 3.000 durchzuführen und um hohe Mengen von HGH in dem Kulturmedium zu erzeugen.
Beispiel 2: Erzeugung von embryonalen Mäusestammzelllinien mit amplifizierten Kopien eines teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigens
Eine Elektroporation der HPRT-defizienten Mäusestammzelllinie, HM-1 (15), mit den teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigenen pDWM128 und 129 verhinderte jedwede Erzeugung von HAT-resistenten Überlebenden. Da bekannt ist, dass die Anforderungen für die HPRT-Expression anspruchsvoller in ES-Zellen als in Lungenfibroblasten von chinesischen Hamstern (Ref. 6) sein, wurde das Experiment unter Benutzung des am wenigsten untauglich gemachten HPRT-Minigens, dem pDWM131, und einer modifizierten Einzelschritt Auswahl-Prozedur wiederholt. 5 × 10⁶ HM-1-Zellen wurden mit 25 μg Gel-gereinigter HPRT-Minigen-DNA elektroporiert und von pDWM131 durch Aufschneiden mit SmaI/KpnI (siehe 1) freigegeben. Die Elektroporationsbedingungen waren 850 V, 3 μFd, unter Benutzung unserer früher beschriebenen Prozedur (16). 24 Stunden nach der Elektroporation wurde eine HAT-Selektion hinzugefügt. Nach 16 Stunden wurde die HAT-Selektion wieder entfernt und durch das HAT-Medium ersetzt. Das HT-Medium ist mit dem HAT-Medium identisch, außer dass Aminopterin fehlt und es nicht so selektiv für die HPRT-Expression ist. Es war vernünftig, die Strenge des Auswahlschemas zu reduzieren und es so einfacher für alle Klone, die amplifizierte Kopien des HPRT-Minigens enthalten, zu machen, zu überleben. Eine Gesamtheit von 8, die Prozedur überlebenden Kolonien wurden in dem HAT-Medium expandiert, damit die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien bestimmt wird. In einem parallelen, unter normalen HAT-Selektions-Bedingungen ablaufenden Experiment, das das voll funktionsfähige pBT/PGK-HPRT (RI)-Minigen benutzt, wurde ein Total von 350 Kolonien erreicht.
Die Anzahl der pDWM131-Minigen-Kopien in den HM-1-Klonen wurde so bestimmt, wie es im Beispiel 1 beschrieben wird, außer dass ein internes Fragment des pDWM131 zum Vergleich mit der Plasmid-Kalibrierung benutzt wurde. Das Klon pDWM131#1 enthielt ungefähr 10 Minigenkopien, das Klon #2 enthielt ungefähr 20 Kopien und das Klon #3 enthielt ungefähr 150 Kopien des amplifizierten Minigens (siehe 5). Die verbleibenden fünf der acht geprüften Klone zeigten keinen Hinweis für eine pDWM131-Minigen-Amplifizierung.
So kann das Einzelschritt-Genamplifizierungssystem, unter Benutzung eines weniger untauglich gemachten HPRT-Minigens, in embryonalen Stammzellen benutzt werden, um eine HPRT-Minigen- Amplifizierung zu erreichen, obgleich das beobachtete Niveau beträchtlich niedriger als bei den Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters war.
Beispiel 3: Herstellung von transgenen Mäusen, die amplifizierte Kopien eines teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigens enthalten
Es wurden Blastocyten-Injektionen mit einem HM-1-Klon pDWM131#2 ausgeführt. Es wurden drei Chimären hergestellt, zwei männliche und eine weibliche. Das Testzüchten von beiden männlichen Chimären resultierte in einer Transmission der Nachkommenschaft der ES-Zellen-derivierten Fellfarbenmarkern. Ein schimärisches Männchen war ein 100%iger Transmitter, der die ES-Zellen-derivierten Fellfarbenmarker an alle 36 Nachkommen weitergab. Das zweite schimärische Männchen übertrug die ES-Zellen-derivierten Fellfarbenmarker auf 9/37 der Nachkommenschaft. Die weibliche Chimäre hat die ES-Zellen-derivierten Fellfarbenmarker nicht übertragen. Wie erwartet wurde mit Hilfe eines PCR-Assays, der spezifisch ist für Minigene und auf einer DNA ausgeführt wird, die aus Schwanzbiopsien hergestellt wurde, gefunden, dass ungefähr die Hälfte der Nachkommenschaft, die die ES-Zellen-derivierten Fellfarbenmarker trägt, pDWM131-Minigen-Sequenzen sind.
Die PCR benutzte Primer von der Mäuse-HPRT-cDNA-Sequenz, GEnBANK ACC No J0423. Die Primer waren folgende:
Die PCR umfasst 35 Zyklen (94°C: 1 Minute, 67°C: 1 Minute, 72°C: 1,5 Minuten 50 μl-Reaktion mit 100 ng Matrizen-DNA, 300 ng jeder Primer, 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase in 5 mM KCl/0,15 mM MgCl₂/1 mM Tris-HCl/0,045% Triton X-100/0,045% Tween 20/0,4 mM Na₂ EDTA/0,1 mM dNTPs. Die sich ergebende Produktgröße ist 1,3 kb.
Die Southern-Analyse auf der DNA der Schwanzbiopsie von vier der transgenen Tiere, die pDWM131-Minigen-Sequenzen enthalten, gab an, dass diese Mäuse dieselbe Anzahl von Kopien (ca 20) des amplifizierten pDWM131-Minigens enthielten, das beim Start-ES-Zellklon vorlag, wobei angegeben wurde, dass die amplifizierten HPRT-Minigene auf einer einzigen chromosomalen Integrationsstelle anwesend waren. (siehe 5).
So behalten die embryonalen Stammzellen, die das Einzelschritt-HPRT-Gen-Amplifizierungssystem durchquert haben das Potential für eine Keimlinienübertragung in schimärischen Tieren und es können transgene Mäuse mit amplifizierten HPRT-Minigenen hergestellt werden, die offenkundig Stabilität geerbt haben.
Beispiel 4: Herstellung von transgenen Mäusen, die erhöhte Niveaus eines menschlichen Blutgerinnungsregelungsproteins exprimieren
Als Nächstes haben wir untersucht, ob das Einzelschritt-HPRT-Genamplifizierungs-System benutzt werden kann, um transgene Tiere herzustellen, die große Mengen eines nützlichen Proteins einer koamplifizierten Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, exprimiert. Das gewählte Gen kodierte für ein an der Blutgerinnung beteiligtem menschlichen Regelungsprotein. Es standen ein Konstrukt (pBloodProtein) für dieses Gen und Vergleichsexpressionsdaten der Milch einer Reihe von bekannten eine variable Anzahl von zufällig integrierten Transgenen enthaltenden transgenen Mäusen zur Verfügung. pBloodProtein enthält einen vom Schafs-β-Laktoglobulin-Genpromoter kontrolliertes menschliches Protein C cDNA (Carver, A. S. et al. (1993), Biotechnology 11, 1263–1270) mit vom 3'-Ende des Schafs-β-Laktoglobulin-Gens herkommenden RNA-Verarbeitungssignalen. pBloodProtein ist nicht manipuliert worden, um die Expression zu maximieren.
In zwei separaten Elektroporationen wurden 10⁷ HM-1-Zellen mit 70 μg pBloodProtein DNA mit NotI aufgeschnitten, um das Insert vom pBluescript-Vektor zu befreien) und 50 μg DNA vom untauglich gemachten HPRT-Minigen koelektroporiert (900 V, 3 μFd), pDWM131 (mit KpnI/NotI aufgeschnitten, um das Insert vom Vektor zu befreien) und die Zellen wurden auf eine Platte mit 2,5 × 10⁶ Zellen/90 mm Schale aufgetragen. In beiden Experimenten wurde 24 Stunden nach der Elektroporation eine HAT-Selektion hinzugefügt, während 8 Stunden gelassen und dann durch ein HT-Medium ersetzt. Im ersten Experiment gab es während der zwei Wochen zwischen der Elektroporation und dem Colony-Picking zwei weitere 8 Stunden HT-Selektions-Perioden, die vom Wachstum im HAT-Medium getrennt waren. Im zweiten Experiment gab es drei weitere HAT-Selektions-Perioden vor dem Colony-Picking. In beiden Experimenten wurden die geernteten Kolonien während 24 Stunden im HAT-Medium getestet bevor die DNA von den überlebenden Kolonien isoliert wurde. Es wurden 12 Kolonien in dem ersten Experiment geerntet (Klone #1 bis 12) von denen 8 das End-Test überlebten; 24 Kolonien wurden im zweiten Experiment (Klone #101 bis 124) geerntet, von denen 10 den End-Test überlebten. Die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien in den überlebenden Klonen wurde so bestimmt, wie es vorher beschrieben und in der Tabelle 4 dargestellt worden ist. Die Anzahl der HPRT-Minigen-Kopien lag zwischen 0 und 25, wobei im allgemeinen eine größere Anzahl mit dem zweiten Experiment erhalten wurde, bei dem die HAT-Selektion strenger war. Die Anzahl der Kopien des Gens für das Protein des menschlichen Bluts wurde dann für ausgewählte Klone bestimmt. Die Koamplifizierung wurde beobachtet, wobei die Anzahl der Kopien sich zwischen 0 und 50 belief und es oft eine gute Korrelation zwischen der Anzahl der Kopien von HPRT und von pBloodprotein in einzelnen Klonen gab, was die Vermutung nahe legte, dass zwei Sequenzen zu der amplifizierten Einheit gehörten. Zwei der Klone mit der größten Anzahl von amplifizierten Genkopien (#10 und 117) wurden dann einer kontinuierlichen Züchtung im HAT-Medium während 3 Wochen ausgesetzt, um zu sehen, ob eine weitere Amplifizierung erreicht werden konnte. Die Anzahl der Kopien von HPRT-Minigenen und von pBloodprotein blieb in #10 unverändert, während im Klon #117 die Anzahl der Kopien von HPRT-Minigenen um 20 bis 75 Kopien und die Anzahl der Kopien von pBloodprotein um 20 bis 100 Kopien anstieg.
Um zu sehen, ob amplifizierte Kopien des menschlichen Blutprotein-Gens enthaltende transgene Tiere erhalten werden konnten, wurden dann drei Klone mit der größten Anzahl von pBloodprotein-Kopien (#10, 117, 123) für eine Blastozyten-Injektion benutzt. Es wurden zwei Chimäre aus einer einzigen Injektions-Sitzung mit dem Klon #10, zwei vom Klon #123 und keine vom Klon #117 hergestellt. Jede der Chimären wurden durch Kreuzen mit einer Balb/C-Maus auf Keimbahnübertragung der ES-Zellen-derivierten Fellfarbe getestet. Beide Chimäre des Klons #10 haben die ES-Zellen-derivierte Fellfarbe (7% für eine Chimäre und 19% für die andere, siehe Tabelle 4) übertragen. Eine des Chimären des Klons #123 war ein Transmitter mit geringer Häufigkeit (nur ein Jungtier, das nicht die amplifizierten Sequenzen aufwies). Wie erwartet, enthielt nur die Hälfte den Zell-derivierten Nachkommen der Chimären des Klons #10 die amplifizierten HPRT-Minigen- und pBloodprotein-Sequenzen mit Bestimmung der Anzahl der Kopien in der ersten und in den nachfolgenden Generationen, wann andeutet, dass die amplifizierten Sequenzen stabil als Einzeleinheiten mit derselben Anzahl von Kopien HPRT und pBloodprotein wie im Ursprungs ES-Zell-Klon vererbt wurden.
Um zu sehen, ob hohe Niveaus von menschlichem Blutprotein in der Milch von Tieren die amplifizierte bBloodprotein-Sequenzen enthalten, anwesend waren, hat man einen männlichen ES-Zellen-derivierten Nachkommen von einem der Chimären des Klons #10 gepaart und vier der sich ergebenden transgenen Weibchen (Tiere D–G) und drei der nicht transgenen weiblichen gezeugten Kontrollen (Tiere A–C) wurden selber gepaart und Milch wurde manuell während sieben Stilltagen nach einer Oxytocin-Injektion gesammelt. Die Niveaus des menschlichen Blutproteins in der Milch wurden durch einen im Handel (DAKO Ltd.) erhältlichen ELISA-Assay bei Benutzung eines antihumanen Kaninchen-Protein C-Antikörpers bestimmt. Die ELISA-Assay-Daten werden in der Tabelle 5 gezeigt. Die nichttransgenen Abkömmlinge enthielten alle nicht detektierbare Niveaus des menschlichen Proteins, während höhere Niveaus in allen vier transgenen Tieren gefunden wurden. Die Mittelwerte lagen im Bereich zwischen 256 und 325 μg/ml. Zum Vergleich erstreckte sich der Bereich des in der Milch einer Reihe von unabhängigen normalen transgenen Tieren, das gleiche pBloodprotein enthaltende, gefundenen menschlichen Blutproteins von 1 bis 11 μg/ml.
So kann das Einzelschritt-HPRT-Gen-Amplifizierungs-System benutzt werden, um ES-Zellen mit koamplifizierten Kopien (~50) von einer Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, herzustellen. Andere Amplifizierungen (~100 Kopien) konnten in einigen Klonen anschließend an eine erweiterte Züchtung in einem selektiven Medium vorgenommen werden. ES-Zellen mit koamplizierten Sequenzen behalten ihre Totipotenz und transgene Tiere, die die amplifizierten Sequenzen die stabil vererbt werden, enthalten, konnten hergestellt werden. Die Tiere können benutzt werden, um große Mengen eines nützlichen Proteins in der Milch herzustellen. In diesem Beispiel waren die Niveaus eines humanen Blutgerinnungsregelungsproteins 30 mal höher als die bei herkömmlichen transgenen Tieren erreichten Niveaus.
TABELLE 1: HÄUFIGKEIT VON HAT-RESISTENTEN KOLONIEN NACH EINER KOTRANSFORMATION VON HPRT-MINIGENEN UND PBT/MT-HGH IN RJK88-ZELLEN
Es wurden Calciumphosphat-Transformationen auf doppelten Schalen von RJK88-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/90 mm Schale für die teilweise untauglich gemachten HPRT-Minigene, 2 × 10⁴ Zellen/90 mm Schale für pBT/PGKHPRT (RI)) ausgeführt. 20 μg linearisiertes Minigen und 20 μg aufgeschnittenes pBT/MT-HGH wurden pro Kotransformation benutzt.

(*) mittlere Häufigkeit von HAT-resistenten Kolonien/doppelte Schalen aufgetragene RJK88-Zellen.

(*) ND, nicht bestimmt

TABELLE 5: KONZENTRATION DES GERINNUNGSREGELUNGSPROTEINS FÜR DAS MENSCHLICHE BLUT IN DER MILCH DER TRANSGENEN, AMPLIFIZIERTE KOPIEN DER NUKLEINSÄURESEQUENZ, DIE VON INTERESSE IST, ENTHALTENDEN TIERE
Die Konzentration in der Milch herkömmlicher, dasselbe Konstrukt enthaltender transgener Tiere belief sich auf 1 bis 11 μg/ml.
REFERENZEN

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Claims

Verfahren zum Herstellen einer transgenen nichtmenschlichen Tierzelle, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist, und welche Zelle amplifizierte Kopien einer Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, umfasst, wobei das Verfahren das Unterwerfen einer Zelle aus einer nichtmenschlichen Wirtszellpopulation einem Genamplifikationsprotokol zum Erzeugen einer Zelle umfasst, die ihre Totipotenz oder Totipotenz für die Kernübertragung beibehält und die amplifizierte Kopien der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, umfasst, wobei das Genamplifikationsprotokoll Folgendes umfasst: (a) Cotransformieren von Zellen der nichtmenschlichen Wirtszellpopulation, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent sind, mit der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und einem teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergen, das ein auswählbares Genprodukt codiert; und (b) Züchten der cotransformierten Zellen unter Bedingungen, die das Auswählen von Zellen gestatten, die das auswählbare Genprodukt in erheblich höheren Niveaus exprimieren als Zellen ohne wesentliche Expression des auswählbaren Genprodukts, wobei die Zellen kein natives funktionelles auswählbares Markergen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Genamplifikationsprotokoll das Züchten von Zellen unter selektiven Kulturmedien umfasst, derart, dass nur diejenigen Zellen, die amplifizierte Kopien eines auswählbaren Markergens exprimieren, in der Lage sind, in dem selektiven Kulturmedium zu wachsen oder zu überleben.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das auswählbare Markergen ein Produkt codiert, das Arzneimittelresistenz verleiht, oder ein Produkt, das in der Lage ist, einen Stoffwechsel- oder katabolen Defekt in der Wirtszelle zu kompensieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Genamplifikationsprotokoll nur eine Selektionsrunde erfordert oder umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Genamplifikationsprotokoll folgende Schritte umfasst: (a) das Bereitstellen einer Vielzahl von teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergenen und wobei die auswählbaren Markergene innerhalb der Vielzahl verschiedene Grade an Expressionsunfähigkeit besitzen; (b) das Auswählen eines Gens unter einer Vielzahl teilweise untauglich gemachter auswählbarer Markergene mit Bezug auf die Natur einer Wirtszellenpopulation, die transformiert werden soll, und den erwünschten Grad an Genamplifikation; (c) das Cotransformieren einer Zelle aus der Wirtszellpopulation, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist, mit einer Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und dem ausgewählten teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergen; und (d) Züchten der transformierten Zellen der Wirtszellpopulation unter selektiven Züchtungsbedingungen unter Bereitstellen eines selektiven Drucks für die Amplifikation des teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens und dadurch Erreichen der Coamplifikation der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und dadurch Bilden einer Zelle, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist, die amplifizierte Kopien der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, aufweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 5, wobei das teilweise untauglich gemachte auswählbare Markergen eine Purinphosphoribosyltransferase ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Purinphosphoribosyltransferase eine der Folgenden ist: Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), Adeninphosphoribosyltransferase (APRT), Guaninphosphoribosyltransferase (GPRT) oder Xanthinphosphoribosyltransferase (XPRT).
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das teilweise untauglich gemachte auswählbare Markergen HPRT ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 bis 8, wobei vor dem Transformieren von Zellen der Wirtszellpopulation mit dem auswählbaren Markergen die Zellen keine funktionelle oder teilweise untauglich gemachte Kopie des auswählbaren Markergens umfassten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 bis 9, wobei ein Teil oder die gesamte teilweise Untauglichkeit des auswählbaren Markergens aus einem oder mehreren der Folgenden herrührt: (a) einem Mangel an transkriptioneller Kontrollsequenz, die normalerweise in der Promotorregion oder in einem Intron vorliegt; (b) einem Mangel an Intron oder einem anderen mRNA-Verarbeitungssignal; (c) einer Falschsinnmutation oder einer Nichtsinnmutation; (d) einer Insertion eines Introns.
Verfahren nach Anspruch 1 oder irgendeinem der Ansprüche 5 bis 10, wobei das auswählbare Markergen HPRT ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das auswählbare Markergen eine Säuger-HPRT ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das auswählbare Markergen eine Nagetier-HPRT, bevorzugt eine murine HPRT ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das auswählbare Markergen ein murines HPRT-Minigen mit einer oder mehreren der folgenden charakteristischen Eigenschaften ist: (a) einer Falschsinnmutation oder einer Nichtsinnmutation in einer HPRT-Codierregion; (b) einem abgestumpften Intron 1, in dem das Schlüsselkontrollelement vorliegt; (c) einem abgestumpften Intron 2; (d) einem abgestumpften oder abwesenden Intron 7 oder 8.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das murine HPRT-Minigen eine Falschsinnmutation von Asp (GAT) 200-Asn aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszellpopulation totipotente Zellen, bevorzugt nichtmenschliche Embryostamm-(ES-)Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszellpopulation Zellen umfasst, die für die Kernübertragung totipotent sind, bevorzugt Zellen, die von einem Gewebe eines nichtmenschlichen Embryos, Foetus oder Erwachsenen deriviert sind.
Transgene nichtmenschliche Tierzelle, die totipotent oder für die Kernübertragung totipotent ist und die Zelle amplifizierte Kopien einer Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und amplifizierte Kopien eines teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens umfasst, das ein auswählbares Genprodukt codiert; welche Zelle durch irgendeinen der vorhergehenden Ansprüche erhalten wird.
Verfahren für das Herstellen eines transgenen nichtmenschlichen Tiers, das multiple Kopien einer Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, exprimiert und ein nützliches Niveau eines Produkts, das von Interesse ist, erzeugt und amplifizierte Kopien eines teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens umfasst, das ein auswählbares Genprodukt codiert, welches Verfahren das Verwenden einer Zelle nach Anspruch 18 oder des genetischen Materials derselben zum Bilden eines transgenen nichtmenschlichen Tiers umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Bildung des transgenen nichtmenschlichen Tiers das Injizieren einer nichtmenschlichen ES-Zelle umfasst, die amplifizierte Kopien der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und amplifizierte Kopien des teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens umfasst, das ein auswählbares Genprodukt codiert, in einen nichtmenschlichern Wirtsblastozyten oder das Aggregieren einer nichtmenschlichen ES-Zelle mit einer nichtmenschlichen Wirtsmorula umfasst und wobei ein dadurch erhaltener chimärer nichtmenschlicher Embryo in eine nichtmenschliche Pflegemutter implantiert wird und es ihm gestattet wird, sich zu einem chimären nichtmenschlichen Tier zu entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Bildung des transgenen nichtmenschlichen Tiers die Schritte des Übertragens des Kerns einer nichtmenschlichen Tierzelle mit amplifizierten Kopien der Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und amplifizierten Kopien eines teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens, das ein auswählbares Genprodukt codiert, in eine nichtmenschliche Empfängerzelle, bevorzugt einen enucleierten nichtmenschlichen Oozyten, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das transgene nichtmenschliche Tier wesentliche Mengen des Produkts, das von Interesse ist, entweder konstitutiv oder auf regulierte Art und Weise durch den gesamten Körper hindurch oder auf ein spezifisches Gewebe oder Körperfluid beschränkt, exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das spezifische Gewebe eine Säugerdrüse und das Körperfluid Milch ist.
Transgenes nichtmenschliches Tier, das amplifizierte Kopien einer Nucleinsäuresequenz, die von Interesse ist, und amplifizierte Kopien eines teilweise untauglich gemachten auswählbaren Markergens, das ein auswählbares Genprodukt codiert, umfasst, welches Tier durch irgendeinen der Ansprüche 19 bis 22 erhalten wird, oder ein transgener Abkömmling eines Tiers ist, das durch irgendeinen der Ansprüche 19 bis 22 erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, nichtmenschliche Tierzelle nach Anspruch 18 oder nichtmenschliches Tier nach Anspruch 24, wobei das nichtmenschliche Tier ein Säuger ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, nichtmenschliche Tierzelle nach Anspruch 18 oder nichtmenschliches Tier nach Anspruch 24, wenn er von Anspruch 25 abhängt, wobei der Säuger ein plazentales Tier, bevorzugt ein Huftier, Nagetier oder Kaninchen ist.