DE69433034T2

DE69433034T2 - Expression von heterologen genen nach einem ziel-expressionsprofil

Info

Publication number: DE69433034T2
Application number: DE69433034T
Authority: DE
Inventors: Gerard Austin West Main Road SMITH; Scott Peter MOUNTFORD; Frank Richard West Main Road LATHE
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 1993-04-21
Filing date: 1994-04-21
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2014-04-22
Also published as: SG48698A1; AU6542794A; US6150169A; EP0695361A1; DE69433034D1; WO1994024301A1; JPH09500005A; CA2161088A1; NZ265091A; DK0695361T3; EP1403376A3; US20090241207A1; EP0695361B2; JP2009017889A; AU678234B2; IL109382A; JP4375759B2; EP0695361B1; ATE247171T1; JP2007306942A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf DNS-Konstrukte zum Inserieren heterologer Gensequenzen in ein Wirtsgenom, um die Expression des heterologen Gens zu erzielen, auf Verfahren zum Inserieren heterologer Gensequenzen in ein Wirtsgenom und auf nicht-menschliche Organismen, die modifizierte Wirtsgenome tragen.
Gemäß einem besonderen Aspekt bezieht sich diese Erfindung auf Konstrukte zum Inserieren eines heterologen Gens in ein ein endogenes Gen in einem Wirtsgenom, so dass das heterologe Gen an Stelle oder zusätzlich zu dem endogenen Gen exprimiert wird. In einem zweiten besonderen Aspekt bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren, um eine heterologe Gensequenz (Transgen) funktionell in ein bestimmtes Gen eines Wirtsgenoms zu integrieren, um die Expression des Transgens eng mit den endogenen transkriptorischen und posttranskriptorischen regulatorischen Elementen zu koppeln, auf Konstrukte zur Verwendung bei diesen Verfahren und auf genetisch modifizierte Zellen und transgene nicht-menschliche Tiere, die mit solchen Konstrukten erzeugt werden, und ihre Abkömmlinge.
Gentechnik schließt die Fusion unterschiedlicher Gensequenzen ein. In vielen Fällen wird dieses durchgeführt mit der Absicht, eine heterologe Gensequenz in einer Art zu exprimieren, die identisch ist zu oder zum Teil das Expressionsmuster eines anderen Gens reflektiert. Um die gewünschte Expressionsrate, -verteilung und/oder die zeitliche Abfolge der Expression der Sequenz, die exprimiert wird, zu erzielen, werden regulatorische Sequenzen des Gens, das kopiert wird, mit den Sequenzen des Gens verschmolzen, das exprimiert werden soll, um ein Expressionskonstrukt zu erzeugen. In vielen Anwendungen, die höhere eukaryotische Zellen involvieren, wie zum Beispiel die Auswahl bestimmter Stammzellen oder die Herstellung heterologer Proteine in transgenen Tieren, ist es jedoch außerordentlich schwierig, ein Expressionskonstrukt herzustellen, dessen Muster und Rate der Expression jene des Gens, das kopiert wird, angemessen nachahmt.
Es ist bekannt, heterologe Gene in Säugerzellen, einschließlich Stammzellen, transgenen Tieren und in vitro aufrechterhaltenen Zelllinien einzuführen. Trotz spezifischer Gestaltung stellen vorhandene Expressionskonstrukte, wenn sie in das Wirtsgenom integriert werden, jedoch selten die gewünschte Rate und Verteilung (sowohl räumlich als auch zeitlich) der Genexpression bereit. Von Expressionskonstrukten ist bekannt, dass sie das Expressionsprofil eines endogenen Gens versuchen nachzuahmen, indem sie bekannte regulatorische Elemente des endogenen Gens einschließen. Der Erfolg mit diesen Konstrukten ist jedoch gering, zum Teil wegen dem funktionellen Detail der endogenen Genstruktur, einschließlich der Platzierung und Identität solcher Elemente und dem Beitrag, den jeder Bestandteil zu der Regulation der Genexpression beiträgt, zum größten Teil bleibt die Ursache jedoch unbekannt. Andere Probleme sind verbunden mit zufällig integrierten Expressionskonstrukten, einschließlich Positionswirkungen der Integrationstelle und zufälliger Mutation endogener Genexpression.
Weiterhin, um regulatorische Elemente in endogenen Genen zu positionieren und zu definieren, oftmals mit einigem Abstand zu dem transkribierten Bereich des Gens, verlangt oftmals mühselige Arbeit. Das distale Positionieren dieser Elemente ist oftmals auch wichtig für ihre Funktion und kann in transgenen Expressionskonstrukten schwierig zu reproduzieren sein.
Weiterhin gibt es nach dem Identifizieren und Einbauen der endogenen regulatorischen Elemente in heterologe Genexpressionskonstrukte nur eine geringe Gewissheit, dass irgendein bestimmtes transgenes Expressionskonstrukt korrekt funktionieren wird, wenn es einmal per Zufall in das Genom eingeführt ist.
Frühe Ansätze, heterologe Proteine in transgenen Tieren herzustellen, konzentrierten sich hauptsächlich auf die Verwendung transgener Konstrukte, die Promoterbereiche umfassen, die abgeleitet wurden von einem Gen, das mit cDNS kodierenden Sequenzen eines anderen Gens verschmolzen war. Zum größten Teil funktionieren die Fusionskonstrukte schlecht, wenn überhaupt, und die erhaltene Expressionsrate ist weit geringer als jene des endogenen Gens.
Dies steht im Gegensatz zu intakten Genen, wie z. B. dem Schafmolkeprotein Betalactoglobulin (BLG). Hochexpression des kodierten Proteins wird erhalten in transgenen Mäusen, die ein BLG-Gen der vollen Länge, vollständig mit allen Introns und angemessenen Längen der 5'- und 3'-untranskribierten Bereiche beherbergen (Simons et al., Nature 328, 530–532, 1987).
Versuche wurden unternommen bei verschiedenen Gruppen, die effiziente Expression solcher genomischer Transgene nutzbar zu machen, um die Expression heterologer kodierender Sequenzen in transgenen Tieren zu lenken. Tandemgenkonstrukte werden normalerweise nicht in Säugersystemen exprimiert, da nur die erste (stromaufwärts) kodierende Sequenz translatiert wird. Aus diesem Grund waren die meisten Forscher gezwungen, in den 5'-untranslatierten Bereich (5'UTR) des genomischen Gens eine cDNS, die das heterologe Protein von Interesse kodiert, zu verschmelzen.
Tomasetto et al. (Mol. Endocrinol. 3, 1579–1584, 1989) verschmolzen eine pS2-cDNS in den 5'UTR des Gens des sauren Molkenproteins (WAP). Obwohl eine gewisse Expression beobachtet wurde, war die Produktionsrate extrem niedrig. Ähnlich erzeugten Simons et al. (Bio/Technology 6, 179–183, 1988) Konstrukte, bei denen cDNSs, die den menschlichen Faktor IX oder alpha-1 Antitrypsin kodieren, in den 5'UTR von Schaf-BLG eingeführt worden waren. Sowohl in transgenen Mäusen als auch in transgenen Schafen scheiterten diese Konstrukte, ordentlich zu funktionieren, wobei nur geringe Expressionsraten erhalten wurden (Clark et al., Bio/Technology 7, 487–492, 1989).
Obwohl einige Berichte zeigen, dass die einfache Insertion von Intronsequenzen in Expressionskonstrukte die Expression erhöhen kann (z. B. Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 836–840, 1988), bleibt die Expressionsrate niedrig im Vergleich zu der des endogenen Gens, was nahelegt, dass Intronsequenzen per se nicht ausreichend sind, um eine Genhochexpression in einem transgenen Zusammenhang zu ermöglichen. Dies wird bestätigt durch die Ergebnisse von Whitelaw et al. (Transgenic Res. 1, 3–13, 1991), die die Introns aus dem BLG-Gen entfernten und dann ein einzelnes Intron zurückgaben. Das intronlose Gen war nur schwach aktiv und die Anwesenheit eines einzelnen Introns war nicht ausreichend, die transkriptorische Effizienz des BLG-Gens in transgenen Mäusen wiederherzustellen.
Es wurde argumentiert, dass die Gen-Gesamtstruktur, einschließlich der relativen Positionen der Introns und Exons, kritisch wichtig ist für die Transgenfunktion. Diese Behauptung wird vollständig gestützt durch die Erkenntnis, dass das 5'-Ende des BLG-Gens, wenn es mit einer genomischen Kopie des menschlichen alpha-1 Antitrypsingens verschmolzen ist, zu einer beständigen Hochexpression in transgenen Tieren führt (Archibald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5178–5182, 1990).
In der Praxis ist es jedoch oftmals schwierig, diese genomische Fusionstechnik anzuwenden. Viele Gene, die von besonderem Interesse sind, sind außerordentlich groß (z. B. das menschliche Faktor VIII-Gen ist über 100 Kilobasen lang) und die Erzeugung von Fusionskonstrukten und ihre Einführung in transgene Säuger (einschließlich Vieh) sind außerordentlich schwierig.
Eine Alternative, Expressionskonstrukte in vitro zu bilden (durch Kopplung regulatorischer Elemente eines oder zahlreicher Gens/e mit der zu exprimierenden heterologen Gensequenz) ist, den „Genfallen"-Ansatz zu verwenden. Regulatorische Elemente, die die Expression von Genfallen-Expressionskonstrukten kontrollieren, werden durch Inserieren der heterologen Sequenz, die exprimiert werden soll, in ein Gen in dem Genom des Wirts bereitgestellt. Sequenzen des zu exprimierenden Gens werden dabei eng mit den regulatorischen Elementen des endogenen Gens gekoppelt.
Bei weitem die große Mehrheit der Vektoren vom Genfallentyp werden für die zufällige Integration oder das zufällige Einschließen des Wirtsgens verwendet, mit dem Nachteil, dass es dabei keine Kontrolle über die Integrationsstelle oder die Erzeugung endogener Gen/Transgen-Fusionsprodukte gibt. Ein Genfallenvektor, pGT4.5, ist bekannt aus Genes & Development 6: 903–918 von Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992.
Eine Hauptbeschränkung bei der Gestaltung und funkionellen Verwendung aller „Genfallen"- und „genomischen Transgen"-Expressionskonstrukte, die im Stand der Technik bekannt sind, ist der Mechanismus der Translationsinitiation des Transgens. Die Translation der meisten mRNSs wird durch einen Abtastmechanismus initiiert, bei dem ein Ribosomenkomplex (bezeichnet als 43S) an das 5'-Ende von mRNS mit Kappe bindet und sich entlang der mRNS so lange bewegt, bis ein geeignet platziertes AUG-Startcodon entdeckt wird. Anschließend stößt eine zweite Ribosomenuntereinheit (bezeichnet als 60S) zu dem Komplex hinzu und die Proteinsynthese beginnt.
1988 zeigten Pettetier und Sonenberg (Nature, 334: 320–325), dass verschiedene Picornavirus-mRNSs durch einen ungewöhnlichen Mechanismus des „internen Ribosomenbindens" translatiert werden und dass diese besonderen mRNSs spezifische Sequenzen innerhalb der mRNS enthielten, die einem Ribosom ermöglichten, zu binden und die Translation zu initiieren. Diese Sequenzen wurden als „Internal Ribosome Entry Site" (IRES) bezeichnet. Picornaviren infizieren menschliche Zellen, also zeigte diese Arbeit, dass eukaryotische Ribosomen die IRES erkannten und die Translation intern initiieren konnten, und zwar anders, als über einen Kappen-abhängigen Mechanismus.
Ghattas et al., (Molecular & Cellular Biology, Bd. 11 Nr. 12, Dez. 1991, S. 5848–5859) beschreiben die Verwendung einer internen Ribosomeneintrittsstelle beim Erhalten der Coexpression von zwei Genen eines rekombinanten Provirus in kultivierten Zellen und in Hühnchenembryonen.
Wood et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88, Sept. 1991, S. 8006–8010) beschreiben die Verwendung einer internen Ribosomeneintrittsstelle, um die Expression eines selektierbaren Markergens zu erhalten, das das stromabwärts gelegene Gen eines bicistronischen Konstruktes in einer ausdifferenzierten Zelllinie ist, in welcher das Konstrukt durch homologe Rekombination eingeführt worden war.
Es gibt jedoch gegenwärtig kein wirksames Vorgehen, durch welches eine heterologe Gensequenz (Transgen), die in eukaryotischen Zellen, insbesondere in menschlichen Stammzellen, transgenen Tieren oder Zellen in Kultur exprimiert werden soll, in das Genom einer Wirtszelle inseriert werden kann, um die Expression jenes heterologen Gens zu erhalten, mit regulatorischen Elementen, die die Expression eines zum endogenen Zielgens kontrollieren.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein DNS-Konstrukt bereitzustellen und Verfahren für seine Verwendung; die eine verbesserte Effizienz der heterologen Genexpression in einer Wirtszelle ermöglichen. Die Bereitstellung der heterologen Genexpression in einer gewünschten Rate ist ein weiteres Ziel. Noch ein weiteres Ziel ist es, eine Expression bereitzustellen, mit einem gewünschten zeitlichen und/oder räumlichen Profil während des Lebens einer Wirtszelle oder -zellpopulation oder eines transgenen nicht-menschlichen Organismus.
Mit „heterologer Genexpression" ist gemeint, sowohl (1) die Expression eines Gens in einem Wirt, das zuvor in jenem Wirt nicht exprimiert worden war, als auch (2) die Expression eines Gens in einem Wirt gemäß einem bestimmten Expressionsprofil, wobei das Gen zuvor in dem Wirt exprimiert worden war, aber nicht gemäß dem bestimmten Expressionsprofil.
Um Zweifel zu vermeiden, sollten alle Bezugnahmen auf embryonale Stamm(ES)-Zellen, Organismen, transgene Tiere oder Säuger und Embryonen verstanden werden, dass nur jene gemeint sind, die von einer nicht-menschlichen Quelle stammen.
Demgemäß wird in einem ersten Aspekt der Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, eine ein heterologes Gen kodierende Sequenz in ein endogenes Zielgen in ein eukaryotisches zelluläres Wirtszellgenom zu inserieren und diese heterologe Gen kodierende Sequenz zu exprimieren, durch Transformieren der Wirtszelle mit einem Vektor, der ein DNS-Konstrukt enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer nicht-menschlichen embryonalen Stammzelle und einem nicht-menschlichem befruchteten Ei, und dadurch, dass das DNS-Konstrukt die folgende Sequenz umfasst: 5' X-A-P-B-Q-C-Y 3'bei der
X und Y im Wesentlichen homolog zu separaten Sequenzen des endogenen Zielgens sind und eine ausreichende Länge haben, um eine homologe Rekombination mit dem Wirtszellgenom zu durchlaufen, um die A-P-B-Q-C-Sequenz in das Wirtszellgenom zu inserieren;
P eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) ist;
Q die heterologe Gen kodierende Sequenz ist; und
A, B und C getrennt voneinander wahlweise Linkersequenzen sind
worin das Konstrukt die das heterologe Gen kodierende Sequenz in oder an Stelle der endogenen Zielsequenz inseriert, so dass die Transkription der das heterologe Gen kodierenden Sequenz durch die regulatorischen Elemente des Wirts für das endogene Zielgen gelenkt wird.
Es wird bevorzugt, dass X und Y jeweils wenigstens 1000 Basenpaare lang sind. Es wird jedoch geschätzt werden, dass im Allgemeinen, während eine wirksame homologe Rekombination in einigen Fällen mit X und Y erzielt wird, die eher kürzere Sequenzen haben, die Effizienz gesteigert werden wird mit zunehmender Länge der Sequenzen. X und Y sind vorzugsweise wenigstens zu 95%, bevorzugter wenigstens zu 98% und am meisten bevorzugt im Wesentlichen zu 100% mit dem Wirt homolog.
In Ausführungsbeispielen der Erfindung (i) bilden X und Y gemeinsam eine DNS-Sequenz, die im Wesentlichen homolog ist mit einer einzelnen zusammenhängenden DNS-Wirtssequenz, oder (ii) sind X und Y im Wesentlichen homolog zu zwei getrennten Sequenzen desselben endogenen Wirtsgenorts und in derselben jeweiligen Orientierung wie in dem endogenen Genort. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das DNS-Konstrukt Teil eines Vektors, der fähig ist, eine Wirtszelle zu transformieren durch Inserieren des DNS-Konstrukt in die Wirtszell-DNS.
P, die IRES, befindet sich 5' zu dem offenen Leserahmen der heterologen Gensequenz Q. Wo B fehlt, befindet sich die IRES unmittelbar 5' zu dem offenen Leserahmen des heterologen Gens.
Die Linkerbereiche A, B und C sind zusätzliche DNS-Sequenzen, die wahlweise in dem DNS-Konstrukt vorhanden sind. Die Linkerbereiche können in das Konstrukt eingefügt werden oder können als ein Ergebnis der rekombinanten DNS-Techniken entstehen, die verwendet werden, um das Konstrukt herzustellen. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung schließt ein oder besteht der Linkerbereich A aus einem Spleißakzeptor. Die Größe und Art des Linkers B ist besonders ist wichtig, um eine optimale Verbindung zwischen der IRES und dem heterologen Gen bereitzustellen (Cell, Bd. 68, S. 119–131, Januar 1992).
Um erfolgreiche Transformanten auszuwählen, die das heterologe Gen exprimieren, ist es bequem, einen auswählbaren Marker, z. B. ein Antibiotikaresistenzgen oder ein Hypoxanthin-Ribosyl-Transferase-Gen, in das heterologe Gen einzuschließen. Das Einschließen eines selektierbaren Markers erhöht die Wahrscheinlichkeit transfizierte Zellen mit der gewünschten Transgenintegration zu selektieren, da die Expression des selektierbaren Markers abhängig ist von der funktionellen Integration in ein aktives Gen. Transgenintegrationen in nicht transkribierten Bereichen des Genoms sind deswegen leicht eliminiert.
Wenn ein erfindungsgemäßes Konstrukt verwendet wird, um ein Wirtsgenom zu transformieren, resultiert die homologe Rekombination mit der Wirts-DNS in der Insertion des Konstrukts in ein Wirtsgen. Die Transkription des heterologen Gens befindet sich dann unter der Kontrolle der im Zusammenhang mit dem Wirtsgen stehenden regulatorischen Elemente. Die Translation der das heterologe Gen kodierenden Sequenz wird dann durch die Anwesenheit der IRES in 5'-Position zum offenen Leserahmen des heterologen Gens ermöglicht. Dies resultiert in einer regulierten Expression des heterologen Gens mit einer bemerkenswert höheren Effizienz als unter bis jetzt bekannten und verwendeten Techniken, um eine heterologe Genexpression zu erhalten.
Bei der Verwendung werden ein heterologes Gen und ein endogenes Gen mit einem bestimmten Muster und/oder Rate der Expression in einer Wirtszelle ausgewählt. Ein DNS-Konstrukt wird erzeugt, das X und Y enthält, die im Wesentlichen homolog zu Teilen des endogenen Gens oder zu flankierenden Bereichen des endogenen Gens sind. Das DNS-Konstrukt wird dann die Insertion des heterologen Gens plus IRES in jenes endogene Gen (oder an Stelle von jenem endogenen Gen) zum Ziel nehmen, so dass die Transkription des heterologen Gens von den regulatorischen Elementen des Wirts für jenes endogene Gen gelenkt wird. Die Translation des reifen heterologen Genprodukts wird ermöglicht, indem die IRES in das DNS-Konstrukt eingeschlossen ist und neu, gemeinsam mit dem heterologen Gen, inseriert wird.
Die Verwendung der IRES vermittelten Translationinitiation in Zielvektoren vom Genfallentyp gemäß der Erfindung stellt einen bemerkenswerten Vorteil über kürzlich beschriebene Genfallen und auf Genfallen gerichtete Vektoren bereit, dadurch, dass die funktionelle Integration des Transgens in den gewünschten Bereich, in dem das endogene Gen transkribiert wird, kein Fusionsprotein erzeugt und nicht notwendigerweise die endogene Genexpression zu unterbrechen braucht.
Der Octamer bindende Transkriptionsfaktor 4 ist ein Mitglied der PO.U-Transkiptionsfaktorenfamilie (zusammenfassend berichtet von Schöler, 1991). Die Oct4-Transkription wird aktiviert zwischen dem 4- und 8-Zellstadium in dem heranwachsenden Mausembryo und sie wird hochgradig exprimiert in der sich ausdehnenden Blastocyste und dann in den pluripotenten Zellen der inneren Zellmasse. Die Transkription wird herunterreguliert, sobald sich das primitive Ektoderm differenziert, um Mesoderm zu bilden (Schöler et al., 1990), und bis 8,5 d.p.c. (Tage nach dem Koitus) ist sie beschränkt auf wandernde Urkeimzellen. Oct4-Genexpression in hoher Rate wird auch beobachtet in pluripotenten Embryokarzinom- und embryonalen Stammzelllinien, und wird herunterreguliert, wenn diese Zellen induziert werden, um zu differenzieren (Schöler et al., 1989; Okamoto et al., 1990).
Das Oct4-Gen wurde ausgewählt als ein geeignetes Beispiel der Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte, wegen der bekannten mäßigen bis hohen Spiegel an Oct4-mRNS. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz einer Herunterregulation der Transkription des Oct4-Zielallels, übereinstimmend mit dem Entfernen einer möglichen Enhancersequenz im zweiten Intron, das Oct4-Gen mit einer sehr hohen Effizienz zum Ziel genommen werden kann, unter Verwendung der Verfahren und Konstrukte der Erfindung.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erzeugt die Integration eines transgenen Konstruktes, das ein IRES-Element und einen offenen Leserahmen beinhaltet, in einer Position, die sich 3' zu dem Stop-Codon und 5' zu dem Polyadenylierungssignal befindet, eine funktionelle dicistronische mRNS, die in der Lage ist, sowohl das endogene Genprodukt, als auch das Produkt des transgenen offenen Leserahmens zu kodieren. In einem anderen Ausführungsbeispiel stellt die transgene Integration in einer Position, die sich 5' zu oder an Stelle des endogenen Gen-Leserahmens befindet, eine Gelegenheit bereit, das endogene Genprodukt zu „vernichten" (knock out) (oder anderweitig zu modifizieren).
Analysen eukaryotischer Gene in vielen Laboratorien haben gezeigt, dass im Allgemeinen die kodierenden Sequenzen von DNS, die Bereiche, die schließlich zu Aminosäuresequenzen translatiert werden, nicht fortlaufend sind, sondern durch „stumme" DNS unterbrochen sind. Sogar bei Genen ohne Proteinprodukt, wie z. B. die tRNS-Gene von Hefe in Drosophila, enthält das primäre RNS-Transkript innere Bereiche, die während der Reifung ausgeschnitten werden, wodurch die End-tRNS oder -mRNS ein gespleißtes Produkt ist. Die Bereiche, die in dem reifen Boten verloren sein werden, werden als „Introns" (für intragenische Bereiche) bezeichnet und wechseln ab mit Bereiche, die exprimiert werden, bezeichnet als „Exons". Transgene können funktionell in Exon inseriert werden, oder, gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, eine Spleißakzeptorsequenz in 5'-Position zu dem IRES-Element integrieren, um eine funktionelle Integration in ein Intron zu ermöglichen. Die funktionelle Transgenintegration ist deswegen nicht durch die Intron/Exon-Anordnung oder den Leserahmen des endogenen Gens beschränkt. Dies ist ein weiterer Aspekt bei dem die Gestaltung und der Bau der Transgenkonstrukte der Erfindung einfacher ist als der von bis jetzt bekannten Konstrukten.
Die IRES enthaltenden Vektoren der Erfindung ermöglichen das Gen-Targeting mit einer erhöhten Effizienz. Die Erfindung ermöglicht einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz, in dem 3' untranslatierten Bereich eines Gens (3'UTR) inseriert zu werden, wodurch demzufolge die relativen Positionen aller stromaufwärts gelegener Introns und Exons bewahrt werden, und was deswegen zu Hochexpression führt. Das Erfordernis einer genomischen Kopie des heterologen Gens wird vermieden und die erfolgreiche Expression kann erhalten werden durch Inserieren einer cDNS-Kopie stromabwärts des IRES in dem 3'UTR. Da cDNSs sehr viel kürzer sind als die entsprechende genomische Kopie, wird der Zusammenbau von Konstrukten und die Erzeugung von nicht-menschlichen transgenen Säugern bemerkenswert erleichtert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel schließt das heterologe Gen an seinem 3' (stromabwärts)-Ende ein Polyadenylierungssignal ein. Ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels ist, dass das Polyadenylierungssignal in einer wirksamen Verkürzung und Verarbeitung des Transkripts an dem Ende des heterologen Gens resultiert.
In besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen schließt das DNS-Konstrukt auch eine Verkürzungs-/Spaltungs-/Transkriptions-Terminationssequenz 5' (stromaufwärts) der homologen Region X ein. Die Funktion der 5'-Sequenz liegt darin, ein Durch-Lesen der mRNS zu verhindern; geeignete Sequenzen schließen ein Poly(A)-Signal, wie z. B. das SV40-Polyadenylierungssignal, und die Upstream Mouse Sequence (UMS) (Heard et al., 1987) ein. Die 5'-Sequenz kann weiterhin einen Spleißakzeptor einschließen. Es ist bekannt, dass DNS-Konstrukte zufällig in das Wirtsgenom integrieren können, d.h. dass sie nicht immer durch homologe Rekombination mit dem endogenen Zielgen inserieren. Die zufällige Integration in irgendein aktives Gen kann in einer heterologen Genexpression resultieren; dies macht es schwierig, korrekte Insertionsereignisse zu bemerken, was ein Nachteil ist. Die besonders bevorzugten Ausführungsbeispiele überwinden dieses Problem, da dort, wo eine zufällige Integration geschieht, die Transkriptionsterminations- oder -verkürzungs- oder spaltsequenzen auch integrieren, wodurch die Transkription verhindert wird. Es wurde vorteilhafterweise gefunden, dass, wo die homologe Rekombination mit dem endogenen Zielgen geschieht, die die Transkription verhindernde Sequenz nicht integriert, so dass die Transkription des heterologen Gens möglich ist.
In diesen besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung werden Verfahren wirksam etabliert, um die Expression nach zufälligen Genfallen-Integrationsereignissen zu eliminieren und dadurch eine Targeting-Strategie vom Genfallentyp bereitzustellen, die die Selektion spezifisch für das gewünschte Targeting-Ereignis ermöglicht. Dieses Verfahren wird durch die Erfinder bezeichnet als Positive Only Selection (POS) und verwendet Transkriptverkürzungs-/Spaltsequenzen (z. B. Polyadenylierungssequenzen) oder transkriptorische Terminationssequenzen, wie z. B. die UMS, um die Expression des Transgens im Falle der zufälligen Integration in aktiv transkribierte Gene zu verhindern. Homologe Rekombination mit dem Zielgen inseriert funktionell das heterologe Gen und, falls vorhanden, einen selektierbaren Marker, aber nicht die stromaufwärts gelegene transkriptorische Terminationssequenz und ermöglicht deswegen die Transkription des heterologen Gens und, wo vorhanden, des selektierbaren Markers.
Folglich erweitern „POS"-Ausführungsbeispiele der Erfindung das Potential der Genfallen-Expressionstechnik, indem Verfahren bereitgestellt werden mit denen im Wesentlichen die Expression des Transgens an anderen Stellen der Integration als der des gewünschten Zielgens eliminieren. Das POS-System hat eine besondere Anwendung bei der Gentherapie, wo die Beschränkung der Transgenexpression auf den Zielgenort von enormen Wert sein würde.
Unter Verwendung der DNS-Konstrukte des ersten Aspektes ist es möglich, ein heterologes Gen in ein endogenes Wirtsgen zu inserieren, so dass der Startpunkt der heterologen Gensequenz im Wesentlichen bei dem Startpunkt der endogenen Zielgensequenz inseriert wird.
Die Konstrukte der Erfindung sind auch vorteilhaft, um das Problem anzugehen, in einer Zielwirtszelle oder in einem nicht-menschlichen Organismus (die wir zur Klarheit als Zelle „T" bezeichnen) ein Gen („G") zu exprimieren, gemäß einem bestimmten Expressionsprofil („E"), wo endogene Gene mit einem geeigneten Expressionsprofil nicht vorhanden sind oder nicht zugänglich sind. Die Lösung liegt darin, eine Donor-Wirtszelle („D") zu identifizieren, die ein Gen („H") mit einem Expressionsprofil E einschließt, und ein Konstrukt gemäß der Erfindung zu schaffen, bei dem X und Y eine solche Länge haben, dass sie die Elemente der Zelle D einschließen, die die Expression des endogenen Gens in der Zelle D, gemäß dem Profil E, regulieren. Das DNS-Konstrukt schließt folglich (1) die regulatorischen Elemente der Zelle D für ein endogenes Zielgen, dessen Expressionsprofil E gewünscht wird, nachzuahmen, (2) eine IRES und (3) eine heterologe Gensequenz G ein. Dem DNS-Konstrukt wird ermöglicht, zufällig in die DNS der Zelle T zu integrieren.
Die zufällige Integration des Konstruktes in die DNS der Zelle T erzeugt eine modifizierte Zelle T, die das heterologe Gen gemäß annähernd dem Expressionsprofil E der Zelle D exprimiert. Das Ergebnis ist die Expression des Gens in der Zelle T mit einem ähnlichen Muster zu dem von H in der Zelle D.
Nach der zufälligen Integration des DNS-Konstruktes der Erfindung in die Zelle T, ist die modifizierte Zelle T Ziel für DNS-Konstrukte gemäß irgendeinem Ausführungsbeispiel der Erfindung, die im Wege der homologen Rekombination funktionieren.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Inserieren eines heterologen Gens in ein endogenes Zielgen in einem Wirtszellgenom bereitgestellt, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem DNS-Konstrukt gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Die Transformation kann das Einführen der DNS der Erfindung in eine Zelle oder die Herstellung von Zellen durch Transfektion, durch Injektionsballistiken, durch Plasmid- oder Virusvektor oder durch Elektroporation oder durch Fusion einschließen.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, ein heterologes Gen in einer Wirtszelle zu exprimieren, indem ein DNS-Konstrukt gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung hergestellt wird, das das heterologe Gen enthält, indem dem DNS-Konstrukt ermöglicht wird, sich der homologen Rekombination mit dem Wirtsgenom zu unterziehen und indem man eine Kultur an Wirtszellen wachsen lässt, die das heterologe Gen exprimieren.
Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren bereit, promoterlose transgene Konstrukte, die von Bereichen mit Genhomologie flankiert werden, zu verwenden, so dass die homologe Rekombination zwischen der DNS eines transgenen Konstruktes und dem Zielgenort zu einer funktionellen Insertion des Transgens in die gewählte Transkriptionseinheit führt. Die Transkription des Transgens wird durch Elemente reguliert, die verbunden sind mit dem endogenen Gen und/oder zusätzlichen Elementen, die in die Stelle mit dem Transgen eingefügt wurden. Die Translation des transgenen Leserahmens oder der -rahmen wird über eine Kappen-unabhängige Translationsinitiierung durch den Einbau von interne(n) Ribosomeneintrittsstelle(n) (IRES) unmittelbar 5' zu dem/n offenen Leserahmen vermittelt. Dies stellt ein ausgezeichnetes Ausmaß der Transgenregulation bereit und vermeidet viele der Probleme, die mit der Gestaltung und erfolgreichen Nutzung kürzlich beschriebenen Expressionskonstrukte für die Transgenexpression verbunden sind.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Inserieren einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz in ein eukaryotisches zelluläres Wirtszellgenom bereit, das die Schritte umfasst:
(i) zufällige Integration eines ersten DNS-Konstruktes in das Genom; und
(ii) homologe Rekombination eines zweiten DNS-Konstruktes in das Genom, unter Verwendung des homologen Rekombinationsverfahrens der Erfindung, worin der Schritt der zufälligen Integration die Expression dieser kodierenden Sequenz unter der Kontrolle von Elementen, die die Expression eines endogenen Gens in einem Donorzellgenom regulieren, umfasst, wobei diese Donorzelle eine von dieser Wirtszelle unterschiedliche Zelle ist, indem dem ersten DNS-Konstrukt ermöglicht wird, sich einer zufälligen Integration in das Wirtszellgenom zu unterziehen, worin die Wirtszelle ausgewählt wird aus einer nicht-menschlichen embryonalen Stammzelle und einem nicht-menschlichen befruchteten Ei und worin das erste DNS-Konstrukt die Sequenz enthält: 5' X'-A'-P'-Q'-C'-Y' 3'in welcher
X' und Y' im Wesentlichen homolog sind mit gesonderten Sequenzen desselben Donorzellgenoms und die Elemente enthalten, die die Expression des endogenen Gens in der Donorzelle regulieren;
P' eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) ist,
Q' die heterologe Gen kodierende Sequenz ist,
A', B' und C' gesonderte, optionale Linkersequenzen sind.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren der Expression eines heterologen Gens in einer Wirtszelle bereit, indem ein funktionelles Expressionskonstrukt vor dem Einführen des Konstruktes in das Wirtsgenom bearbeitet wird. In einem Ausführungsbeispiel ist ein solches „genomisches Transgen" in vitro bearbeitet durch Inserieren einer IRES, die an ein heterologes Gen gekoppelt ist, das exprimiert werden soll, in eine große genomische Sequenz (zum Beispiel ein Cosmid oder ein künstliches Chromosom, das das zu kopierende Gen einschließt), die die gesamten, wenn nicht alle regulatorischen Elemente des Gens, integriert. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird ein genomisches Transgen in vitro bearbeitet, indem IRES und das zu exprimierende heterologe Gen gezielt in das endogene Wirtsgen eingebaut werden und anschließend von der Zielzelllinie ein großes genomisches Fragment (z. B. ein Cosmid oder ein künstliches Chromosom) isoliert wird, das die IRES und die zu exprimierende Sequenz und die meisten, wenn nicht alle der mit dem Zielgen im Zusammenhang stehenden regulatorischen Elemente einschließt.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung eine transgene Zelle oder einen transgenen nicht-menschlichen Organismus oder ein transgenes nicht-menschliches Tier bereit, in deren Genom ein heterologes Gen inseriert worden war, unter Verwendung eines DNS-Konstruktes, gemäß der Erfindung, entweder durch homologe Rekombination oder durch zufällige Integration. In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung Abkömmlinge des sechsten Aspektes bereit, die die heterologen Gene geerbt haben. Die Erfindung ist auf die heterologe Genexpression sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten anwendbar, obwohl Eukaryoten und noch mehr Tierzellen bevorzugt werden; und auf Säugerzellen im Besonderen.
Offensichtlich ist die Nützlichkeit der Konstrukte und Verfahren der Erfindung beim Selektieren nach dem gewünschten Integrationsereignis beschränkt auf das Einführen von transgenen Konstrukten, die ein selektierbares Markergen in endogene Gene einbauen, die in ausreichenden Raten in den Zellen, die transfiziert werden, exprimiert werden. Um ein nicht selektierbares Gen in ein aktiv transkribiertes Gen für die Expression, unabhängig von einem selektierbaren Marker, einzuführen, würde der Zielgenort zuerst mit einem Konstrukt gemäß der Erfindung, das einen selektierbaren Marker exprimiert, der sowohl selektiert werden kann (primäres Targeting) und gegen den auch selektiert werden kann (sekundäres Targeting), „markiert" werden. Einmal durch ein primäres Targeting-Ereignis markiert, könnten Transgenintegrationen in das „markierte" Gen selektiert werden, durch die Abwesenheit des primären Targeting-Gen-selektierbaren Markers. Diese Art des Ansatzes ist besonders anwendbar, wo wiederholtes Targeting eines bestimmten Gens anvisiert wird, wie z. B. bei der Entwicklung von Zelllinien oder nicht-menschlichen transgenen Tieren für die Überexpression heterologer Gene.
Wenn das gezielt eingebaute Gen nicht ausreichend exprimiert wird für das primäre Genfallen-„Markieren" kann die Promoter vermittelte Expression eines selektierbaren Markers ähnlich verwendet werden in Standard-Targetingvektoren vom Nicht-Genfallentyp, um das Zielgen zu markieren.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wurden Vektoren entwickelt, die die Enzephalomyokarditisvirus (EMCV)-IRES vermittelte Translation eines LacZ/bakteriellen Neomycin-Resistenzfusionsgens (βgeo, Freidrich und Soriano, 1991) für das Gen-Targeting in embryonalen Nagerstamm (ES)-Zellen verwenden. Die Translation des βgeo-Fusionsgens erzeugt ein bifunktionelles Genprodukt, das sowohl eine Reporter- als auch eine selektierbare Markergenaktivität bereitstellt. Vektoren wurden gestaltet, um gezielt einzubauen und anschließend nachzuweisen (a) die normale Differentiation Inhibiting Activity/Leukaemia Inhibitory Activity (DIA/LIF)-Genexpression durch die nicht-unterbrechende Insertion des Transgens 3' zu dem Leseraster des endogenen Gens, und (b) eine geänderte DIA-Genexpression, die von einer definierten Modifikation an dem DIA-Genort resultiert, (c) eine geänderte Expression des Octamer bindenden Transkriptionsfaktors 4 (Oct4), die aus einer definierten Modifikation an dem Genort resultiert.
DIA ist ein pleiotropes Cytokin, das die Differenzierung von ES-Zellen in vitro unterdrückt und das in Zusammenhang gebracht wurde mit einer Reihe an Entwicklungsvorgängen und physiologischen Vorgängen in vivo. Das DIA-Gen wurde als ein geeignetes Beispiel für die Verwendung von Konstrukten der Erfindung ausgewählt, wegen der bekannt niedrigen Spiegel von DIA-mRNS. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz niedriger DIA-mRNS-Gleichgewichtsanteile (<10 Kopien/Zelle) das DIA-Gen mit einer hohen Effizienz zum Ziel genommen werden kann.
Diese Ergebnisse legen folglich nahe, dass die Verwendung von Konstrukten gemäß der Erfindung anwendbar ist, wenigstens in nicht-menschlichen ES-Zellen, auf Gene, die sogar mit geringen Raten exprimiert werden.
Um zu untersuchen, ob die IRES vermittelte Translationseffizienz abhängig ist vom Zelltyp, erzeugten wir einen zufälligen Genfallenvektor gemäß der Erfindung, der die EMCV-IRES verwendet, um die Translation des βgeo-Fusionsgens zu initiieren. Neomycin resistente Zelllinien, die die LacZ-Färbung in einer Reihe von differenzierten Zelltypen anzeigen, wurden ausgewählt für die Blastocysten-Injektion und die anschließende Erzeugung von Chimären. Chimären wurden hervorgebracht, um vollständige nicht-menschliche transgene Tiere für die Analyse des LacZ-Expressionsprofils bereitzustellen. Diese Analyse sollte eine wertvolle Einsicht in die Effizienz der IRES vermittelten Translation in anderen Zelltypen bereitstellen.
Es folgen nun Beschreibungen beispielhafter Ausführungsbeispiele der Erfindung, bei denen:
die 1–3 und 6 die DNS-Konstrukte der Erfindung darstellen,
die 4 und 5 DNS-Konstrukte zur Verwendung bei der Herstellung der Konstrukte zeigen.
Die 7 und 8 zeigen die IRES-βgeo-Targeting Strategie:
7 – schematische Darstellung der internen Initiierung der Translation, die durch die IRES in einem dicistronischen Transkript vermittelt wird.
8 – Anwendungen der IRES-βgeo-Kassette beim Gen-Targeting. Die Konstrukte können entweder gestaltet sein, um das gesamte oder einen Teil eines Gens zu deletieren, während der lacZ-Reporter eingebaut ist, oder gestaltet sein, um den Reporter mit oder ohne Modifikation des intakten Gens anzuhängen, und
9 bis 12 zeigen DNS- und mRNS-Hybridisierungsanalysen gezielt mutierter Klone:
9 – DIA/LIF-Targeting. Genomische DNS, verdaut mit Hind III und Eco RI wurde hybridisiert mit entweder einem Exon 1-spezifischen 163 by langen Xho I-Eae I-Fragment aus pDR100 oder mit einem 700 bp langen Pst I-Eco RI-3'-genomischen Fragment. Spur 1: CGR8-elterliche ES-Zellen; Spuren 2, 5 und 6: Klone, gezielt mutiert mit dem nicht verkürzten Konstrukt; Spuren 3 und 4: Klone gezielt mutiert mit dem gekürzten Konstrukt.
10 – Oct-4-Targeting. Primärer Screen genomischer DNS, zubereitet in Agarosestopfen durch Eco RI-Verdauung und Hybridisierung mit einem 587 by langen Nco I-5'-Fragment, und durch bestätigende Hybridisierung mit einem 600 bp langen Hind III-Sau 3A-3'-Fragment, gefolgt von Cla I-Verdauung Phenol/Chloroform-extrahierter DNS. Cla I ergab reproduzierbar eine teilweise Verdauung der eingefügten Stelle, was andeutend ist für eine variable Methylierung innerhalb der lacZ-Sequenz. Spur 1: elterliche CGR8-ES-Zellen; Spur 2: nicht gezielt mutierter Transfektant; Spuren 3–7: gezielt mutierte Klone.
11 – Detektion von Fusionstranskripten in nicht-menschlichen ES-Zellklonen mit gezielten Integrationen am DIA-Genort. Um die Rate der DIA-Expression zu erhöhen, wurden ES-Zellen induziert, um nach Aussetzen an 10^–6 M Retinsäure zu differenzieren. Poly(A⁺)-reiche RNS wurde nach 4 Tagen zubereitet, aufgetragen auf ein Formaldehydgel und auf eine Nylonmembran übertragen. Das Filter wurde mit einer 650 bp langen, die DIA/LIF-Sequenz kodierende Sonde hybridisiert und für 21 Tage exponiert, dann gestrippt und erneut mit einem 800 bp langen lacZ-Fragment hybridisiert. Spur 1: RNS (1,5 μg) von elterlichen CGR8-Zellen; Spur 2: RNS (3 μg) von Zellen, die mit dem nicht gekürzten Konstrukt gezielt mutiert wurden; Spuren 3 und 4: RNS (3 μg) aus Zellen, die mit dem gekürzten Konstrukt gezielt mutiert wurden.
12 – Nachweis des Fusionstranskriptes in mit Oct-4 gezielt mutierten nicht-menschlichen ES-Zellen. Gesamt-RNS wurde zubereitet aus undifferenzierten nicht-menschlichen ES-Zellen. Die Oct-4-Sonde war ein 408 bp langes Nco I-Pst I-5'-cDNS-Fragment (292), das nur 24 bp des Exon 2 enthält und folglich eine äquivalente Hybridisierung an Wildtyp- und Fusionstranskripte ergeben sollte.
13 zeigt Schritte bei der Herstellung eines Konstruktes der Erfindung, wie beschrieben in Beispiel 3.
BEISPIEL 1
DIA-Gen-Targeting-Konstrukte (1 und 2) wurden entworfen, um Transgene zu integrieren, die das β-geo-Fusionsgenprodukt exprimieren, um eine Genexpression unter der Kontrolle des endogenen DIA-Gen-Genorts bereitzustellen. Ein drittes Konstrukt (3) wurde entworfen, um die durch transkriptorische Blocker gewonnenen Vorteile zu zeigen, die, wenn sie in Genfallen-Targeting-Konstrukte in einer Position 5' zu der DNS-Targeting Homologie eingebaut werden, die Expression zufällig integrierter Transgene stark reduzieren, wenn nicht gar eliminieren.
Nicht-menschliche ES-Zellkultur und -Manipulation
ES-Zellen wurden routinemäßig gehalten, wie beschrieben (durch Smith, A. G. (1991) J. Tiss. Cult. Meth. 13, 89–94) in Abwesenheit von Zellschichten als Wachstumsunterlagen in der Zellkultur im Medium, das ergänzt war mit Nager-DIA/LIF. Die Keimbahn kompetente Zelllinie CGR8 wurde aus Stamm 129-Embryonen durch veröffentlichte Verfahren (Nichols, J., Evans, E. P. & Smith, A. G. (1990) Development 110, 1341–1348) etabliert. Aggregationschimären wurden zwischen ES-Zellen und herausgezüchteten MF1-Embryonen durch eine Modifikation des Verfahrens von Wood et al. (Wood, S. A., Pascoe, W. S., Schmidt, C., Kemler, R., Evans, M. J. & Allen, N. D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4582–4585) hergestellt, bei welcher eine Co-Kultur durchgeführt wird in Hängetropfen. Für die Keimbahn-Übertragung wurden Chimären erzeugt durch Blastocysteninjektion. Für die Isolierung homologer Rekombinanten wurden 10⁸ Zellen mit 150 μg linearisiertem Plasmid bei 0,8 kV und 3 μFd in einer 0,4 cm Küvette elektroperforiert, dann in Anwesenheit von 175 μg/ml G418 selektiert. Genomische DNS wurde in Agarosestopfen zubereitet (Brown, W. R. A. (1988) EMBO J. 7, 2377–2385) von 24-Well-Plattenkulturen, während doppelte Platten gefroren gelagert wurden. (Ure, J. Fiering, S. & Smith, A. G. (1992) Trends. Genet. 8, 6). Um die DIA/LIF-Produktion zu untersuchen, wurden ES-Zellen induziert, um zu differenzieren durch Inkubation mit 6 mM 3-Methoxybenzamid und konditioniertes Medium wurde geerntet und auf die Fähigkeit untersucht, die ES-Zelldifferenzierung zu inhibieren, wie beschrieben. Die Untersuchung wurde spezifisch gemacht für DIA/LIF durch den Einschluss eines neutralisierenden polyklonalen Antiserums, erzeugt gegen Nager-DIA/LIF (AS, unveröffentlicht). Histochemische Färbung für β-Galactosidase wurde durchgeführt unter Verwendung von X-gal (Beddington, R. S. P., Morgenstern, J., Land, H. & Hogan, A. (1989) Development 106, 37–46) und Fluoreszenzfärbung wurde durchgeführt mit DetectaGene Green (Molecular Probes), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Plasmidkonstruktion
DNS-Manipulationen wurden durchgeführt unter Befolgung von Standardverfahren. Die IRES ist eine 594 bp lange Sequenz des 5'-untranslatierten Bereichs (UTR) von EMCV-mRNS, die durch Mutagenese des natürlichen Startcodons modifiziert worden war. Die Translation wird gestartet durch ein ATG, das 9 bp in 3'-Richtung von der normalen Startstelle entfernt liegt und einen Teil der Nco I-Klonierungsstelle bildet.
Kurz, die IRESβgeo-Kassette wurde gebaut durch Ligieren eines 5'-Fragmentes der EMCV-IRES/lacZ-Fusion (Ghattas et al., 1991) an die 3'-lacZ/neo^®-Sequenzen der βgeo-Genfusion (Friedrich, G. & Soriano, P. (1991) Genes Dev. 5, 1513–1523). Das pGTIRESβgeopA-Plasmid wurde dann erzeugt durch 5'-Ligierung des en-2 Spleißakzeptors (Gossler, A., Joyner, A. L., Rossant, J. & Skarnes, W. C. (1989) Science 244, 463–465) und 3'-Ligierung der SV40-Polyadenylierungssequenzen. Targeting-Konstrukte wurden zubereitet aus genomischen Klonen, die aus einer Stamm 129-λ-Bibliothek isoliert worden waren. DIA/LIF-Targeting-Konstrukte wurden innerhalb eines 7 kb langen Fragmentes erzeugt, das sich von einer Sac II-Stelle zwischen den alternativen ersten Exons zu einer Hind III-Stelle 3' des Gens erstreckt. Die DIA-βgeo-Konstruktion wurde zubereitet durch Insertion der IRESβgeo-Kassette in die einzige Xba I-Stelle. Um das DIA-βgeopA-Konstrukt zu erzeugen wurde ein 1,2 kb Bam HI-Fragment, das 3'-βgeo-Sequenzen und SV40-Polyadenylierungssequenzen enthält, aus pGTIRESβgeopA isoliert und in das Bam HI-verdaute DIA-βgeo-Konstrukt ligiert. Dies resultiert in der Insertion der 200 bp SV40-Sequenzen an Stelle eines 400 bp-Fragmentes des DIA/LIF-3'-UTR. Das Oct-4-Targetingkonstrukt enthielt 1,6 kb 5'-Homologie, sich erstreckend von einer Hind III-Stelle innerhalb des ersten Exons bis zu einer Xho I-Stelle in dem ersten Intron, und 4,3 kb 3'-Homologie, die sich von der Nar I-Stelle 3' der Polyadenylierungssequenz bis zu einer Hind III-Stelle erstreckt.
Im Detail, um die DIA-Targetingkonstrukte zu erzeugen, wurde ein vorläufiger Vektor, der die EMCV-IRES an das βgeo-Fusionsgen koppelt, entwickelt. Dies wurde erzeugt durch Ligieren eines 1,2 kb Bam HI-Fragments, das das bakterielle Neomycin-Resistenzgen (neo) und das SV40-Polyadenylierungssignal enthält, in die Bam HI-Stelle des Bluescript II KS (–)-Klonierungsvektors (Stratagene) ligiert wurde, um den Vektor „1" zu erzeugen. Unabhängig davon wurde ein 1,4 kb großes Bg1 II/Cla I-Fragment, das die EMCV-IRES und 5'-LacZ-Sequenzen einschließt, aus pLZIN isoliert (Ghattas et al., 1991) und in pGT1.8βgeo ligiert, um den Vektor zu erzeugen, der pGT1.8IRESβgeo bezeichnet wurde (4). Ein 4,9 kb langes Xba I-Fragment, das das gesamte IRESβgeo-Fusionsgen einschließt, wurde aus pGT1.8IRESβgeo isoliert und in den Xba I-verdauten Vektor „1" ligiert, um IRES-βgeo (zum Targeting) herzustellen (5).
Um den DIA-IRESβgeo-Targetingvektor (1) zu erzeugen, wurde das 4,9 kb lange Xba I-IRESβgeo-Fragment von IRES-βgeo (zum Targeting) (5) in eine einzelne Xba I-Stelle ligiert, wodurch das Translationsstopcodon des Nager-DIA-Gens überlappt wurde. Das Nager-DIA-Genfragment, das bei der Gestaltung des DIA-Genfallen-Targetingvektors verwendet wurde, reichte von einer Sac II-Stelle unmittelbar 3' zu dem abwechselnden ersten Exon (das das „D"-Transkript kodiert) zu einer Hind III-Stelle, annähernd 7 kb 3' von dieser Stelle entfernt.
Der zweite DIA-Gen-Targetingvektor, bezeichnet als DIA IRES βgeo pA, wurde erzeugt durch Inserieren der SV40-Polyadenylierungssequenz unmittelbar 3' zu dem IRES-βgeo-Transgen. Dies wurde erreicht durch Inserieren eines Bam HI-neo/pA-Fragments von IRES-βgeo (zum Targeting) in Bam HI-verdautes 7 kb DIA IRES-βgeo. Das resultierende Konstrukt war identisch mit dem 7 kb langen DIA IRES βgeo-Targetingkonstrukt mit der Ausnahme des Einschlusses des SV40-Polyadenylierungssignals an Stelle von ungefähr 400 bp der DIA-Gen-3'-UTR-Sequenz.
Der „POS"-DIA IRES-βgeo-Targetingvektor wurde hergestellt durch Inserieren eines 1400 bp langen Nco I/Pst I-pSVTKNeob-Fragments, das den β-Globingen-Spleißakzeptor aus Kaninchen und Exonsequenzen und das SV40-Polyadenylierungssignal enthält, in die Sac II-Stelle an das 5' äußerste Ende der DIA-Gen-DNS-Homologie (3).
Das Oct4-neo-Konstrukt (Oct4-tgtvec), gestaltet für die gezielte Integration in das Oct4-Gen, ist in 6 gezeigt. Dieses Konstrukt baut 1,6 kb der 5' Oct4-Gensequenz, 4,3 kb der 3' Oct4-Gensequenz, ein LacZ-neomycin-Fusionsgen (βgeo, kodierend ein bifunktionales Protein, Freidrich and Soriano, 1991) in das erste Intron der Oct4-mRNS ein. Spleißen der Spleiß-Donor-Sequenz der ersten Exon-Intron-Grenze bis zu der integrierten IRES-βgeo-Sequenz wird erleichtert durch den Einschluss einer engrailed-2 Nager-Spleißakzeptorsequenz (Skarnes et al., 1991) unmittelbar 5' zu der IRES-βgeo-Sequenz. Die Translation des βgeo-Cistrons von dem Oct4-βgeo-Fusionstranskript wird erleichtert durch den Einschluss der EMCV-IRES unmittelbar 5' zu der βgeo kodierenden Sequenz.
Nicht-menschliche ES-Zelltransfektion und Kolonieselektion
Maus 129 ES-Zellen (Linie CGR-8) wurden zubereitet und gehalten in Anwesenheit von DIA, wie beschrieben durch Smith (1991). Plasmid-DNS für die Transfektion wurde wurde linearisiert durch Sal I-Verdauung, Ethanol gefällt und resuspendiert in einer Konzentration von 10–14 mg/ml in PBS. Nach 10 Stunden Kultur im frischem Medium wurden annähernd konfluente ES-Zellen dispergiert durch Trypsinierung, anschließend in Kulturmedium und PBS gewaschen und zu 1,4 × 10⁸/ml in PBS für die sofortige Transfektion resuspendiert. Routinemäßig wurden 0,7 ml Zellsuspension mit 0,1 ml DNS enthaltender Lösung vermischt und bei 0,8 kV und 3,0 μFD unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser und 0,4 cm Küvetten elektroperforiert. Transfektionen wurden auf gelatinierten Gewebekulturplatten zu 5–8 × 10⁴/cm² in Wachstumsmedium für 16 Stunden ausplattiert, vor der Zugabe von Selektionsmedium, das 200 μg/ml (aktives) G418 (Sigma) enthält. Einzelne Kolonien wurden 8–10 Tage nach der Transfektion abgeimpft und doppelt in 24-Well-Gewebekulturplatten für die weitere Expansion in Wachstumsmedium, das 200 μg/ml G418 enthält, übertragen.
Wenn sie einmal konfluent waren, wurde eine Reihe an Zellen eingefroren zur Lagerung, während die Verbleibenden durch Southern-Analyse und/oder lacZ-Färbung analysiert wurden.
Weitere Charakterisierung der mit DIA-Gen gezielt mutierten Zelllinien
Ausgewählte Zelllinien wurden untersucht für lacZ-Färbemuster nach dem Wachstum nicht-menschlicher ES-Zellen und Differenzierung in DIA ergänztem Medium, oder nach Retinsäure induzierter Differenzierung in Medium, das nicht DIA-ergänzt war.
Herstellung von Chimären der mit dem DIA-Gen gezielt mutierten Zelllinien
Selektierte Zelllinien wurden kultiviert in Abwesenheit von G418 für 7 Tage vor der Injektion in nicht-menschliche Embryonen, wie kürzlich beschrieben (Nichols et al., 1990). Kurz, Blastocysten für die Injektion wurden gesammelt 4 d.p.c. von C57/B16-Donoren, 10–20 Zellen wurden injiziert und man ließ sie sich in Kultur erneut expandieren vor der Übertragung in die Uteri pseudoschwangerer Empfänger. Chimären wurden identifiziert durch die Anwesenheit von Flecken von sandfarbener Fellfarbe auf dem C57/BL6-Hintergrund. Männliche Chimären können Testzüchtungen für die Übertragung der Transgene sein. Transgene Mäuse können analysiert werden auf lacZ-Färbung.
DNS- und RNS-Hybridisierungsanalysen
Filterhybridisierungen wurden durchgeführt auf Nylon-Membranen, gemäß Standardverfahren, unter Verwendung von zufällig geprimten ³²P-markierten Sonden. Homologe Rekombinanten wurden mit Sonden von sowohl 5'- als auch 3'-flankierenden Sequenzen charakterisiert. In situ-Hybridisierung des Gesamtpräparates mit Digoxigenin-markierter Oct-4 Gegensinn-RNS (Schöler, H., Dressier, G. R., Balling, R., Rohdewold, H. & Gruss, P. (1990) EMBO J. 9, 2185–2195) wurde durchgeführt im Wesentlichen, wie beschrieben (Wilkinson, D. G. (1992) in situ hybridization: a practical approach, Hrsg. Wilkinson, D. G. (IRL Press, Oxford), S. 75–83).
Der Gleichgewichtsanteil von DIA/LIF-mRNS in nicht-menschlichen ES-Zellen ist geringer als 10 Kopien pro Zelle; dies verschaffte einen strengen Test der allgemeinen Nützlichkeit IRES-gerichteter Vektoren der Erfindung. Targeting-Vektoren wurden hergestellt durch Einführen des IRES-βgeo-Moduls an der Xba I-Stelle, die das Stop-Codon überlappt (9). Die gesamte kodierende Sequenz wurde folglich intakt gelassen und Intronsequenzen waren unverändert. Zwei Konstrukte wurden gebildet, DIA-βgeo und DIA-βgeopA, die sich durch den Einschluss des SV40-Polyadenylierungssignals 3' der βgeo-Sequenz unterschieden. Das Fusionstranskript, das hergestellt wurde nach der homologen Rekombination mit dem früheren Konstrukt, verwendet den endogenen 3'-UTR und das Polyadenylierungssignal des DIA/LIF-Gens, wohingegen das DIA-βgeopA-Konstrukt ein verkürztes Transkript hervorruft, dem diese Sequenzen fehlen.
Im Gegensatz zu DIA/LIF, sind sowohl mRNS als auch Protein für den Octamer bindenden Transkriptionsfaktor Oct-4 (auch bekannt als Oct-3) vergleichsweise fehlend in nicht-menschlichen ES-Zellen. Oct-4 wird auch gefunden in Oozyten, pluripotenten frühen embryonalen Zellen und Urkeimzellen. Die Verknüpfung von Oct-4 mit Pluripotenz wird gestärkt durch seine schnelle Herunterregulierung während der Differenzierung. Ein IRES-βgeo-Vektor wurde gestaltet sowohl, um ein Null-Allel zu erzeugen, als auch, um einen Expressionsmarker in den Oct-4-Genort einzuführen (8). Das Letztere könnte den Nachweis bis jetzt unidentifizierter Stellen der Oct-4-Expression erleichtern. Die POU-spezifische Domäne und die die Homäodomäne kodierenden Sequenzen in den Exons 2 und 5 wurden deletiert und durch das IRES-βgeopA-Modul (11) ersetzt. Da der 5'-Arm der Homologie innerhalb des ersten Introns endete, wurde die en-2 Spleißakzeptor-Sequenz 5' zu der IRES eingeschlossen, um produktives Spleißen von Exon 1 nach der homologen Rekombination zu erleichtern.
Nach der Elektroporation und Selektion in G418, wurden einzelne Klone durch Southern-Hybridisierung mit sowohl 5'- als auch 3'-flankierenden Sonden analysiert, um Austausch-Targetingereignisse nachzuweisen (9–12), und mit inneren Sonden, um multiple Integrationen zu überwachen. Die Häufigkeiten homologer Rekombination, die mit den Konstrukten der Erfindung erhalten werden, sind in Tabelle 1 vorgestellt.
Korrekte Austauschereignisse wurden mit sämtlichen Vektoren beobachtet. Eine besonders hohe Frequenz wurde reproduzierbar erhalten am Oct-4-Genort. Dies kann die hohe Expressionsrate dieses Gens in ES-Zellen widerspiegeln, zusätzlich zu den Beiträgen isogener DNS und der Anreicherung, die durch ein promoterloses Konstrukt gewährleistet wird. Das Targeting von DIA/LIF mit dem Poly(A)-Zugabe-Vektor war auch effizient. Die Isolierung korrekt gezielt mutierter Klone am DIA/LIF-Genort weist nach, dass IRES vermittelte Translation anwendbar ist auf Gene, die in sehr geringen Raten in ES-Zellen exprimiert werden.
Northern-Analysen zahlreicher gezielt mutierter Klone bestätigten, dass alle Fusionstranskripte der vorhergesagten Größen (11, 12), die sowohl mit lacZ- als auch mit DIA/LIF- bzw. Oct-4-Sonden hybridisierten, enthielten. Das durch nicht verkürzende Insertion von IRES-βgeo in das DIA/LIF-Gen im Klon D70 hergestellte Transkript wurde in ähnlichen, obgleich im Vergleich zu dem normalen Transkript leicht niedrigeren Mengen, nachgewiesen. Dies zeigt, dass die IRES-βgeo-Sequenz selber nicht irgendeinen großen Einfluss auf entweder die Transkription oder den Nachrichtenumsatz hat. Die verkürzten Fusionsarten, erzeugt nach der Integration von IRES-βgeopA, waren 5-mal häufiger vorhanden beim Phosphoimage-Scanning, als die normale Botschaft. Der erhöhte Anteil des Fusionstranskriptes in diesen Zellen wurde widergespiegelt in der Produktion biologisch aktiven DIA/LIF-Proteins; 3–6 mal mehr DIA/LIF war vorhanden in konditioniertem Medium, zubereitet aus differenzierten Kulturen von Zellen gezielt mutiert mit Verkürzungen als zubereitet aus den elterlichen Zellen oder Zellen, die mit dem nicht verkürzten Konstrukt gezielt mutiert worden waren. Folglich ist das Fusionstranskript eine funktionelle dicistronische mRNS und das Targetingereignis hat die Aktivität des gezielt mutierten Gens modifiziert. Das Oct-4-Fusionstranskript war andererseits 10–20 mal weniger häufig vorhanden als Wildtyp-Oct-4-mRNS. Dies könnte der ineffizienten Nutzung des en-2-Spleißakzeptors zugeschrieben werden, aber könnte auch von einer Deletion von entweder stabilisierenden Elementen innerhalb der mRNS oder einem Enhancer innerhalb des Gens stammen.
Die in vitro-Studien erläutern das Potential der Konstrukte und Verfahren der Erfindung, um eine gezielt mutierte heterologe Genexpression zu erhalten.
BEISPIEL 2
Um die Frage der Gewebespezifität der IRES-Funktion anzugehen, stellten wir eine Reihe zufälliger IRES-Genfallen gemäß der Erfindung durch Elektroporation von pGTIRESβgeopA in ES-Zellen her. Zahlreiche Klone, die eine weit verbreitete Expression von β-Galactosidase in differenzierten Zelltypen in vitro ausübten, wurden verwendet, um Aggregationschimären herzustellen. Nach 7,5 und 8,5 Tagen Entwicklung konnte β-Galactosidase in allen Geweben, die durch die ES-Zellen bewachsen sind, das ist durch den Embryo und in das Amnion und den viszeralen Dottersack, nachgewiesen werden. Diese Genfallen wurden durch die Keimbahn hindurchgeführt, wobei bestätigt wird, dass die Anwesenheit der IRES kompatibel ist mit funktioneller Gametogenese, und vorläufige Analysen an den Heterozygoten zeigen an, dass IRES funktionell ist in einer breiten Reihe an embryonalen und adulten Geweben. Aggregationschimären wurden auch erzeugt mit den mit Oct-4 gezielt mutierten Zellen. Das Färbemuster solcher Embryonen nach 7,5 Tagen zeigt, dass die gewebespezifische Verteilung von Oct-4-mRNS genau widergespiegelt wird durch das β-Galactosidase-Expressionsmuster.
BEISPIEL 3
Anwendung der Erfindung auf die effiziente Expression heterologer Moleküle durch Insertion einer IRES und einer cDNS in den 3'-untranslatierten Bereich eines genomischen Klons eines gewebespezifischen Gens und die Erzeugung transgener Tiere durch Mikroinjektion in befruchtete Eier.
In dem folgenden Beispiel wird eine cDNS (z. B. menschliches alpha-1 Antitrypsin) stromabwärts einer IRES (z. B. von EMCV) in den 3'-untranslatierten Bereich eines genomischen Gens inseriert, das effizient und auf eine gewebespezifische Art und Weise in transgenen Tieren funktioniert (z. B. das Schaf-Betalactoblobulin-Gen, BLG).
Die IRES des Encephalomyocarditisvirus (EMCV) ist erhältlich als ein 600 bp langes EcoRI-NcoI-Fragment, wo die NcoI-Stelle (CCATGG) die Startstelle der Translation definiert; es enthält auch eine Hind III-Stelle, eingefügt einige Nukleotide stromaufwärts der NcoI-Stelle, wobei der Abstand zwischen der IRES und dem ATG geändert wird (Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5848–5859, 1991). Zuerst wird die stromaufwärts liegende EcoRI-Stelle umgewandelt durch Linker-Insertion (Sequenz GAATTGATATCAATT) zu einer EcoRV-Stelle. Zwei Versionen der IRES werden verwendet, eine (IRES-1), bei der die heterologe kodierende Sequenz eingefügt wird an der NcoI-Stelle, eine zweite, bei der die ortsgerichtete Mutagenese verwendet wird, um das ATG innerhalb der NcoI-Stelle 20 Nukleotide stromabwärts von Box A (TTTCC, Pilipenko et al., Cell 68, 119–131, 1992) zu positionieren, wobei die Hind III-Stelle entfernt wird (die DNS-Sequenz in diesem Bereich lautet nun: TTTCCTTTGAAAAACACGATAACCATGG) (13, A). Das modifizierte IRES wird als IRES-2 bezeichnet. IRES-1 und IRES-2 werden beide verwendet als EcoRI-NcoI-Fragmente, für die folgenden Experimente.
Das Schaf-BLG-Gen ist vorhanden auf einem großen SaII-SaII-Fragment (oder, alternativ als ein etwas kleineres SaII-XbaI-Fragment) (Simons et al., Nature 328, 530–532, 1987; Ali und Clark, J. Mol. Biol. 199, 415–426, 1988; Harris et al., Nucl. Acids Res. 16, 10379, 1988) kloniert in pPolyIII-I (Lathe et al., Gene 57, 193–201, 1987). Beide Fragmente exprimieren in einer hohen Rate in der taktierenden Brustdrüse, wenn sie in transgene Tiere eingeführt werden (Simons et al., Nature 328, 530–532, 1987).
Unmittelbar stromabwärts des Translations-Stop-Codons in dem letzten Exon liegt eine einzelne AatII-Stelle (GACGT/C). Diese Stelle wird umgewandelt durch Insertion eines Linkers zu einer EcoRV-Stelle (Endsequenz GACGTGATATCACGTC) (13, D). Obwohl diese Konstruktion auf der Verwendung des gesamten SaII-SaII-Fragmentes beruht, kann das SaII-XbaI-Fragment auch verwendet werden mit geeigneten kleineren Modifikationen des Vorgehens.
Das in diesen Experimente verwendete Reporter-Gen ist menschliche alpha-1 Antitrypsin-cDNS, obwohl der Vorgang wiederholt werden kann mit irgendeiner anderen cDNS. Die cDNS wird bearbeitet durch lokalisierte Mutagenese, dergestalt, dass eine NcoI-Stelle die Startsequenz ATG überlappt (dies kann zu einem einzelnen Basenaustausch in dem zweiten Codon führen, so dass die Art der an dieser Stelle kodierten Aminosäure geändert wird. Da in den meisten Fällen diese Aminosäure nicht zu dem reifen Protein beiträgt, da sie am Anfang der Signalsequenz liegt, hat dies keine gegenteiligen Folgen für Expression, Sekretion oder Aktivität des reifen Proteins). Ähnlich wird eine EcoRV-Stelle am 3'-Terminus der cDNS bearbeitet, so dass der 3'-untranslatierte Bereich entfernt wird (die Sequenz am 3'-Terminus der cDNS heißt TAAGATATC, wo das Stopcodon TAA TAA, TAG oder TGA sein könnte) (13, B). Das NcoI-EcoRV-Fragment (erhalten, wo notwendig, durch teilweise Verdauung in Fällen, wo interne Stellen vorhanden sind) wird in den folgenden Experimenten verwendet.
Als Nächstes wird pPolyIII-I (Lathe et al., Gene 57, 193–201, 1987) modifiziert, so dass ein synthetischer BamHI-SaII-PstI-Polylinker inseriert wird zwischen die BamHI- und PstI-Stellen (Sequenz des Polylinkers – GGATCCGCGTCGACCACTGCAG; Restriktionsstellen sind unterstrichen) (13, C). Das SaII-SaII-Fragment, welches das modifizierte (EcoRV-Stelle an Stelle der AatII-Stelle) genomische Schaf-BLG-Gen enthält, wird in die SaII-Stelle kloniert. Die IRES und die modifizierte cDNS werden aus EcoRV-NcoI- bzw. NcoI-EcoRV-Fragmenten ausgeschnitten, miteinander ligiert und das Fusionsprodukt EcoRV-NcoI-EcoRV wird in die EcoRV-Stelle innerhalb des 3'-untranslatierten Bereichs des BLG-Gens inseriert (13, E).
Das Hybridmolekül , BLG-IRES-AAT-BLG, wird aus dem Plasmid mit SfiI oder einem anderen geeigneten Enzym ausgeschnitten und in befruchtete Eier von Maus oder Schaf mikroinjiziert. Bei transgenen Tieren, die dieses Konstrukt beherbergen, wird zum größten Teil beobachtet, dass sie hohe Anteile an AAT in ihrer Milch exprimieren. Konstrukte der Erfindung könnten auch verwendet werden, um die Expression anderer Proteine von biomedizinischer Wichtigkeit zu erhalten.
Die hierin berichteten Experimente weisen nach, dass die Verwendung von IRES-Targeting gemäß der Erfindung ein starkes Mittel ist, ein gewünschtes Gen in einem Wirtsgenom zu exprimieren. Ferner war die in diesen Studien verwendete IRES-Konfiguration nicht optimal für die Translation des 3'-Cistrons. Es wurde herausgefunden, dass die präzise Örtlichkeit des ATG relativ zu dem 3'-Ende der IRES eine Hauptwirkung auf die translatorische Effizienz hat. Es scheint, dass die Produktion von βgeo mehrfach über die, die in der vorliegenden Studie erzielt wurde, gesteigert werden könnte. Dies sollte die Fähigkeit, Rekombinanten in schwach exprimierten Genen zu isolieren, erhöhen und die Empfindlichkeit des lacZ-Reporters verstärken.
Die IRES-Targeting Strategie der Erfindung ist ein starkes Mittel, die Säugergenexpression nachzuweisen und zu modifizieren. Weiterhin ist es offensichtlich, dass die nicht unterbrechende Integration eines IRES-verknüpften Markers in einen 3'-UTR ein bequemes Mittel zum Einfügen schwieriger Mutationen in ein Gen bereitstellt. Ferner ist die IRES-Strategie nicht beschränkt auf die Modifikation endogener Gene und das Einführen von Reportern, sondern ist auch anwendbar auf die kontrollierte Expression von Transgenen. Die gewünschte Spezifität und Raten der Tansgenexpression könnten durch die Verwendung von IRES vermittelter Translation, entweder in genomischen Konstrukten für die pronukleäre Injektion oder nach homologer Integration in einen geeigneten Genort, sichergestellt werden. Letzteres könnte erreicht werden durch die Konstruktion polycistronischer Vektoren, die zwei IRES-Elemente enthalten. Alternativ könnten aufeinanderfolgende Runden homologen Ersetzens oder Targetings, gefolgt von rekombinatorischer Deletion des selektierbaren Markers, verwendet werden, um eine IRES-Expressionskassette mit minimaler Unterbrechung in irgendwelche Gene einzuführen, die nicht in ES-Zellen exprimiert werden. Im Allgemeinen scheint deswegen wahrscheinlich die Flexibilität und Nützlichkeit der IRES vermittelten Translation, eine weit verbreitete Anwendung bei der Transgenforschung zu finden.
Tabelle 1 Isolationsfrequenz homologer Rekombinanten mit IRES-Vektoren

Claims

Verfahren zum Insertieren einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz in ein endogenes Gen als Ziel in einem eukaryontischen zellulären Wirtszellgenom und Exprimieren der ein heterologes Gen kodierenden Sequenz durch Transformieren der Wirtszelle mit einem Vektor, umfassend ein DNS-Konstrukt, dadurch charakterisiert, dass die Wirtszelle ausgewählt ist unter einer nicht menschlichen embryonalen Stammzelle und einem nicht menschlichen befruchteten Ei, und dadurch, dass das DNS-Konstrukt die Sequenz umfasst: 5' X-A-P-B-Q-C-Y 3'worin X und Y im Wesentlichen homolog zu separaten Sequenzen des endogenen Gens als Ziel sind und von ausreichender Länge sind, so dass sie die homologe Rekombination mit dem Wirtszellgenom durchlaufen, um die Sequenz A-P-B-Q-C in das Wirtszellgenom zu insertieren; P ein IRES-Element ist (IRES = internal ribosome entry site); Q die das heterologe Gen kodierende Sequenz darstellt; und A, B und C getrennt voneinander wahlweise Linkersequenzen darstellen; worin das Konstrukt die das heterologe Gen kodierende Sequenz in oder anstelle des endogenen Gens als Ziel insertiert, so dass die Transkription der das heterologe Gen kodierenden Sequenz über die regulatorischen Elemente des Wirts für das endogene Gen als Ziel dirigiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Konstrukt an das Insertieren der A-P-B-Q-C-Sequenz in eine Position 3' (stromab) des Stopcodons eines endogenen Gens und 5' (stromauf) des Polyadenylierungssignals des endogenen Gens adaptiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, welches ein Konstrukt verwendet, worin X und Y jeweils mindestens 1000 Basenpaare lang sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, das ein Konstrukt verwendet, worin X und Y Wirtselemente umfassen, die die Expression des endogenen Gens als Ziel regulieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Konstrukt zusätzlich ein Polyadenylierungssignal am 3'-Ende (stromab) der das heterologe Gen kodierenden Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Konstrukt zusätzlich einen Spleiß-Akzeptor 5' (stromauf) des IRES-Elements enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Spleiß-Akzeptor die funktionale Integration der das heterologe Gen kodierenden Sequenz in eine Intronsequenz gestattet.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zum Exprimieren einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz in einer nicht menschlichen tierischen Zelle.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche; zusätzlich umfassend das Identifizieren von Zellen, welche die das heterologe Gen kodierende Sequenz exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die das heterologe Gen kodierende Sequenz außerdem für einen selektierbaren Marker kodiert und worin das Verfahren das Selektieren von Zellen umfasst, die den selektierbaren Marker exprimieren.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend das Injizieren des Konstruktes in eine nicht menschliche befruchtete Eizelle.
Verfahren zum Insertieren einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz in ein eukaryontisch zelluläres Wirtszellgenom, umfassend die Schritte: (i) statistische Integration eines ersten DNS-Konstrukts in das Genom; und (ii) homologe Rekombination eines zweiten DNS-Konstrukts in das Genom unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Schritt der statistischen Integration das Exprimieren der kodierenden Sequenz unter Kontrollelementen umfasst, welche die Expression eines endogenen Gens in dem Donor-Zellgenom umfasst, wobei es sich bei der Donorzelle um eine andere Zelle als die Wirtszelle handelt, indem man es dem ersten DNS-Konstrukt gestattet, eine statistische Integration in das Wirtszellgenom zu durchlaufen, worin die Wirtszelle unter einer nicht menschlichen embryonalen Stammzelle und einem nicht menschlichen befruchteten Ei ausgewählt ist, und worin das erste DNS-Konstrukt die Sequenz umfasst: 5' X'-A'-P'-B'-Q'-C'-Y' 3'worin X' und Y' im Wesentlichen homolog zu separaten Sequenzen desselben Donorzellgenoms sind und die Elemente umfassen, welche die Expression des endogenen Gens in der Donorzelle regulieren; P' ein IRES-Element ist (IRES = internal ribosome entry site); Q' die das heterologe Gen kodierende Sequenz darstellt; und A', B' und C' getrennt voneinander wahlweise Linkersequenzen darstellen.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin das erste DNS-Konstrukt zusätzlich ein Polyadenylierungssignal am 3'-Ende (stromab) der das heterologe Gen kodierenden Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–13, worin das erste DNS-Konstrukt zusätzlich einen Spleiß-Akzeptor 5' (stromauf) des IRES-Elements umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–14 zum Exprimieren einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz Q' in einer nicht menschlichen tierischen Zelle.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–15, zusätzlich umfassend jene Zellen, welche die das heterologe Gen kodierende Sequenz Q' exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die das heterologe Gen kodierende Sequenz Q' außerdem einen selektierbaren Marker kodiert und worin das Verfahren das Selektieren von Zellen umfasst, die den selektierbaren Marker exprimieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–17, zusätzlich umfassend das Injizieren des ersten DNS-Konstrukts in eine nicht menschliche befruchtete Eizelle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die Wirtszelle ausgewählt ist unter embryonalen Stammzellen der Maus und befruchteten Eiern der Maus.
Verfahren gemäß Anspruch 18, worin die nicht menschliche befruchtete Eizelle eine befruchtete Eizelle der Maus ist.