JP2001507577A

JP2001507577A - 哺乳動物の遺伝子に変異を導入するためのベクターおよび方法

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Publication number: JP2001507577A
Application number: JP53024298A
Authority: JP
Inventors: ジョージエイガイタナリス
Original assignee: ジョージエイガイタナリス
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-31
Publication date: 2001-06-12
Also published as: US20050059078A1; AU736267B2; US20020115210A1; US20010056581A1; US6228639B1; EP0951533A1; AU5807998A; WO1998029533A1; CA2276529A1; EP0951533A4; US20020012996A1; US20020083481A1; US8389795B2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物遺伝子に突然変異を誘発する方法であって、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクターを、細胞のゲノム中に該ベクターの組み込みが可能となるような条件下で、哺乳動物細胞に導入することを含む方法を提供する。さらに、これらの方法に使用するためのレトロウイルスベクター、および細胞に変異を誘発するための方法、を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物の遺伝子に変異を導入するためのベクターおよび方法発明の詳細な説明本発明はレトロウイルスベクターおよびそれを用いた哺乳動物遺伝子への変異導入法に関する。真核生物のゲノムには6000から80000個の遺伝子があると見積もられている（C ollins，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:10821-10823(1995)）。最もよく調べられた生物においてさえ、その大部分の遺伝子の機能は不明のままである。また、特定の細胞種、あるいは特定の遺伝子産物が関与する細胞内過程において、ゲノムのどの領域が発現するかについての情報は比較的少ない。遺伝子の機能を解明しようとする試みの中で、その手段として大規模な突然変異スクリーニング系が開発され、以下に示す生物において用いられてきた。ショウジョウバエ(Nussl ein-Volhard and Wieschaus，Nature 287:795-801(1980)、Ballinger and Benze r，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9402-9406(1989)、Kaiser and Goodwin，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1686-1690(1990)、Spradling et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 92:10824-10830(1995))、線虫(Hirsh and Vanderslice，Dev Biol．49:220-235(1976)、Zwaal et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:743 1-7435(1993))、ゼブラフィシュ(Solnica-Krezel et al.，Genetics 136:1401-1 420(1994)、Riley and Grunwald，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:5997-6001(1 995))、シロイナズナ(Jurgens et al.，Development Suppl．1:27-38(1991)、Ma yer et al.，Nature 353:402-407(1991)、Sundaresan et al.，Genes Dev．9:17 97-1810(1995))，トウモロコシ(Scanlon et al.，Genetics 136:281-294(1994) 、Osbome and Baker，Curr．Opin．Cell Biol．7:406-413(1995))、出芽酵母(Bu rns et al.，Genes Dev．8:1087-1105(1994)、Chun and Goebl，Genetics 142:3 0-50(1996))。しかしながら、哺乳動物においては、ゲノムサイズが巨大であることと、胚発生が母親の子宮で起こるために、通常このようなアプローチには制限がある。マウス胚性幹細胞（ES細胞）を用いた技術の発達により、哺乳動物の遺伝子機能の解明がある程度進捗した。この技術のおかげで、遺伝学的な操作の大部分を試験管内で行うことが可能になり、哺乳動物の遺伝学の領域が大きく変わった(E vans and Kaufman，Nature 292:154-156(1981)、Bradley et al.，Nature 309:2 55-256(1984)、Robertson，Trends Genet．2:9-13))。これは、マウスES細胞が、全能性である、すなわち完全にES細胞由来の個体になる能力を持つことから可能になった。結果的に、マウスES細胞で遺伝子を不活化し、続いてノックアウトマウスを作出するというやりかたは、動物個体における遺伝子機能の情報を得るための強力な手段となっている。遺伝子を不活化する遺伝子破壊といった望み通りの遺伝的改変をこの細胞に導入することができ、その効果を動物個体で調べることが可能である(Jaenisch，Science 240:1648-1474(1988)、Rossant and Nagy ，Nat．Med．1:592-594(1995))。現在利用可能なマウスへの突然変異導入法は、遺伝子機能をスクリーニングする系として有用であるとは言い難い。遺伝子ターゲティングは最も広く使われているアプローチであるが、面倒で時間がかかる(Capecchi，Science 244:1288-12 92(1989))。ジーントラップ法や、化学的にあるいは放射線で誘発する変異導入法では、通常そのターゲットが限定される(Gossler et al.，Science 244:463-4 65(1989)、Friedrich and Soriano，Genes Dev．5:1513-1523(1991)、Skarnes e t al.，Genes Dev．6:903-918(1992)、von Melchner et al.，Genes Dev．6:919 -927(1992)、Reddy et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6721-9725(1992) 、Takeuchi et al.，Genes Dev．9:1211-1222(1995)、Takahashi et al.，Scien ce 264:1724-1733(1994))。初期胚段階で発現する特定の遺伝子のサブクラスをターゲティングするために、様々な方法が開発されてはいるものの、ジーントラップ法の使用はES細胞で発現している遺伝子に限定される(Wurst et al.，Genet ics 139:889-899(1995)、Skarnes et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:659 2-6596(1995)、Forre ster et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1677-1682(1996))。化学的にあるいは放射線で突然変異を誘発する技術は、変異したときに優性の表現型を示す遺伝子にその効果が限られる。現在開発されているこれらの方法は、直ちに効率化あるいは自動化することは出来ず、また、これらの方法を用いてマウスのゲノム全域に対して変異を導入することも不可能である。課題を解決するための手段一般的には、本発明は哺乳動物の遺伝子に変異を導入するための方法を特徴とするものであって、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクターと、ベクターが細胞のゲノムに組み込まれるのが可能となるような条件下で実施される導入段階とからなる、レトロウイルスベクターを哺乳動物細胞（例えば胚性幹細胞のような幹細胞）に導入することを含む方法である。好ましい形態としては、レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス由来のパッケージングおよび組み込み配列が含まれる。レトロウイルスベクターはさらに、哺乳動物細胞のプロモーターの制御下で発現するレポーター遺伝子を含み、哺乳動物細胞のゲノムにベクターが組み込まれた状態で、レポーター遺伝子はプロモーターの支配下におかれる。レポーター遺伝子は制御蛋白質をコードし、制御蛋白質は、検出可能な遺伝子の発現を調節する能力を有する。制御蛋白質は、活性化蛋白質（VP16など）に融合されたテトラサイクリンリプレッサーである。レトロウイルスベクターはさらに、構成的に発現されるマーカー遺伝子をコードするDNA配列を含み、マーカー遺伝子は、哺乳動物細胞中で検出可能である。マーカー遺伝子は、緑色蛍光蛋白質（例えば野生型緑色蛍光蛋白質と比較して細胞内蛍光が増強されたもの）である。緑色蛍光蛋白質は、哺乳動物の選択マーカーと融合されたものである。哺乳動物の選択マーカーは、ネオマイシン耐性をコードする。レトロウイルスベクターはさらに、酵母のVDE DNAエンドヌクレアーゼ由来の認識配列を含む。レトロウイルスベクターはさらに、組換え酵素によって認識される配列（例えばloxP配列）を含む。哺乳動物は、マウスである。細胞は胚性幹細胞である。関連した形態としては、本発明は、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクターを特徴とする。より好ましい形態としては、レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス由来のパッケージングおよび組み込み配列が含まれる。レトロウイルスベクターはさらに、哺乳動物細胞のプロモーターの制御下で発現するレポーター遺伝子を含み、哺乳動物細胞のゲノムにベクターが組み込まれた状態で、レポーター遺伝子はプロモーターの支配下におかれる。レポーター遺伝子は制御蛋白質をコードし、制御蛋白質は、検出可能な遺伝子の発現を調節する能力を有する。制御蛋白質は、活性化蛋白質（VP16など）に融合されたテトラサイクリンリプレッサーである。レトロウイルスベクターはさらに、構成的に発現されるマーカー遺伝子をコードするDNA配列を含み、マーカー遺伝子は、哺乳動物細胞中で検出可能である。マーカー遺伝子は、緑色蛍光蛋白質（例えば野生型緑色蛍光蛋白質と比較して細胞内蛍光が増強されたもの）である。緑色蛍光蛋白質は、哺乳動物の選択マーカーと融合されたものである。哺乳動物の選択マーカーは、ネオマイシン耐性をコードする。レトロウイルスベクターはさらに、酵母のVDE DNAエンドヌクレアーゼ由来の認識配列を含む。レトロウイルスベクターはさらに、組換え酵素によって認識される配列（例えばloxP配列）を含む。他の関連した形態としては、本発明には、次のものが含まれる。本発明のレトロウイルスベクターを保持する細胞、本発明のレトロウイルスベクターを保持する、ヒト以外のトランスジェニック動物(例えばマウス)、本発明の方法で作製された、（少なくとも100種類の）変異哺乳動物遺伝子ライブラリー。本発明の方法で作製された変異哺乳動物遺伝子ライブラリーを保持する細胞（例えば幹細胞）である。関連した方法としては、レトロウイルスベクターを含む幹細胞などの細胞の同定方法を特徴とする。その方法は、（a）レトロウイルスベクターを哺乳動物細胞集団に導入する工程と、（b）マーカー遺伝子の発現を検出することによってレトロウイルスベクターを保持する細胞を同定する工程とを含。ここで用いるベクターには、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列、構成的に発現する検出可能なマーカー遺伝子が含まれる。導入操作は、ベクターが細胞のゲノムに組み込まれるのが可能となるような条件下で実施される。好ましい形態としては、マーカー遺伝子は緑色蛍光蛋白質であり、野生型緑色蛍光蛋白質よりも細胞内での蛍光が増強された緑色蛍光蛋白質である。第二に関連した方法として、変異導入した哺乳動物遺伝子の同定法を特徴とする。その方法は、（a）レトロウイルスベクターを哺乳動物細胞（幹細胞など）の集団に導入する工程と、（b）細胞集団からゲノムDNAを単離する工程と、（c ）少なくとも一部分はレトロウイルスの配列をもつ増幅プライマーを用いてゲノムDNAを増幅する工程と、（d）野生型塩基配列との相同性により、変異導入した哺乳動物遺伝子を同定する工程とを含む。ここで用いるベクターには、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列、構成的に発現する検出可能なマーカー遺伝子が含まれる。導入操作は、ベクターが細胞のゲノムに組み込まれるのが可能となるような条件下で実施される。また、好ましい形態としては、配列の相同性はハイブリダイゼーション技術にて決定される。第三に関連した方法として、本発明は、条件的に細胞系譜を除去する方法を特徴とする。その方法は、（a）ある細胞系譜でのみ発現する活性化蛋白質を含む、第一のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（b）前記活性化蛋白質の制御下におかれ、この活性化蛋白質が誘導されたときにのみ該活性化蛋白質が結合し調節される、除去因子をコードする塩基配列を保持する第二のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（c）第一と第二のトランスジェニック動物を掛け合わせ、細胞除去因子が活性化蛋白質の制御下で発現し、細胞除去因子の発現により細胞が破壊され得る子孫を作出する工程と、（d）活性化蛋白質により結合と調節を誘導する工程と、を含む。好ましい形態としては、活性化蛋白質は、ヒト以外のトランスジェニック動物に、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクター上で導入される。活性化蛋白質はVP16に融合したテトラサイクリンリプレッサーで、細胞除去因子をコードする塩基配列の発現は、テトラサイクリンオペレーターに調節される。細胞除去因子は、毒素、チミジンキナーゼ、あるいはアポトーシス蛋白質を構成する群から選択される。条件的な誘導は、テトラサイクリンあるいはその誘導体をトランスジェニック動物に投与することで起こる。動物とはマウスを指す。第四に関連した方法として、本発明は所望の遺伝子の条件的、異所的な発現のための方法を特徴とする。その方法は、（a）内在性遺伝子のプロモーターの制御下で発現する活性化蛋白質をもつ、第一のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程、（b）活性化蛋白質の制御下におかれ、活性化蛋白質が誘導されたときにのみ活性化蛋白質が結合し調節される、所望の遺伝子をコードした塩基配列をもつ第二のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程、（c）第一と第二のトランスジェニック動物を掛け合わせ、所望の遺伝子が活性化蛋白質の制御下で発現する子孫を作出する工程と、（d）活性化蛋白質の発現を誘導する工程を含む。好ましい形態としては、活性化蛋白質はヒト以外のトランスジェニック動物に、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクター上で導入される。活性化蛋白質はVP16に融合したテトラサイクリンリプレッサーで、細胞除去因子をコードする塩基配列の発現はテトラサイクリンオペレーターに調節される。条件的な誘導は、テトラサイクリンあるいはその誘導体をトランスジェニック動物に投与することで起こる。動物とはマウスを指す。第五の関連した方法として、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物に条件的に悪性腫瘍を付与する方法を特徴とする。その方法は、（a）内在性遺伝子のプロモーターの制御下で発現する活性化蛋白質をもつ、第一のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（b）活性化蛋白質の制御下におかれ、前記活性化蛋白質が誘導されたときにのみ結合し調節される、腫瘍性因子をコードする塩基配列をもつ第二のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（c）第一と第二のトランスジェニック動物を掛け合わせ、腫瘍性因子が活性化蛋白質の制御下で発現する子孫を作出する工程と、（d）活性化蛋白質による結合と調節を誘導する工程とを含む。ここで腫瘍性因子は悪性腫瘍への変化を促進する。好ましい形態としては、活性化蛋白質はヒト以外のトランスジェニック動物に、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクター上で導入される。活性化蛋白質はVP16に融合したテトラサイクリンリプレッサーで、細胞除去因子をコードする塩基配列の発現はテトラサイクリンオペレーターに調節される。腫瘍性因子とは癌遺伝子である。条件的な誘導は、テトラサイクリンあるいはその誘導体をトランスジェニック動物に投与することで起こる。動物とはマウスを指す。本発明は、本発明の方法により作出される、ヒト以外のトランスジェニック動物由来の細胞（セル）ライン、ならびにヒト以外のトランスジェニック動物のモザイクをも特徴とする。関連した方法の最後として、本発明は所望の遺伝子を条件的かつ組織特異的に不活化する方法を特徴とする。その方法は、（a）所望の内在性遺伝子のプロモーターの制御下で発現する活性化蛋白質をもつ、第一のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（b）活性化蛋白質の制御下におかれ、誘導されたときに産出され、所望の遺伝子の発現を特異的に阻害するリボザイムをコードしたリボザイム遺伝子をもつ第二のヒト以外のトランスジェニック動物を作出する工程と、（c）第一と第二のトランスジェニック動物を掛け合わせ、リボザイムが活性化蛋白質の制御下で発現する子孫を作出する工程と、（d）活性化蛋白質の発現を誘導する工程と、を含む。これにより、内在性に発現している所望の遺伝子は不活化される。好ましい形態としては、活性化蛋白質はヒト以外のトランスジェニック動物に、スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスのパッージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクター上で導入される。活性化蛋白質はVP16に融合したテトラサイクリンリプレッサーで、リボザイムをコードする塩基配列の発現はテトラサイクリンオペレーターに調節される。条件的な誘導は、テトラサイクリンあるいはその誘導体をトランスジェニック動物に投与することで起こる。動物とはマウスを指す。本発明は様々な利点を提供する。例えば、ES細胞への突然変異導入のための可変性のレトロウイルスベクターと、所望の変異細胞を迅速に同定するための強力な検出法を組み合わせたものである。加えて、この方法では、大量の哺乳動物遺伝子に対し、短期間、低費用にて変異導入を行うことができる。さらに、この方法は直ちに効率化が可能であり、多数の遺伝子を並行して処理することができる。すべての遺伝子が変異導入のターゲットになりうることを考慮すれば、ここで提案するアプローチは哺乳動物の変異遺伝子の大規模なライブラリー化、ならびに変異遺伝子を保持する全能性幹細胞のライブラリー化を容易にする。本発明における他の特色や利点は、発明の詳細な説明、および請求の範囲から明らかになる。発明の詳細な説明まず図の簡単な説明を行う。図1は、MAGEKOプロセスに使用される、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV ）をもとにしたベクターの概略図である。図2は、挿入による変異導入現象の概略図である。図3は、エキソン配列中への、挿入による変異導入におけるMAGEKOプロセスの概略図である。図4は、イントロン配列中への、挿入による変異導入におけるMAGEKOプロセスの概略図である。本発明は、ベクターと「MAGEKO」と名付けたプロセスからなる。MAGEKO（mass ively parallel gene knock out）は、大量の哺乳動物の遺伝子への変異導入、そのような変異遺伝子のライブラリー化、そのライブラリーから所望の変異遺伝子をもつ幹細胞の迅速な選択、を可能にする。このプロセスはどの哺乳動物の系にも応用可能であるが、ここではマウスの系における変異導入とそのライブラリー化について述べる。本発明を説明するために以下の例を示すが、これらに限定されるものではない。MAGEKO プロセス MAGEKOプロセスは、レトロウイルスを用いて、マウスゲノム上に平均1kbごとに挿入的な変異を導入する工程からなり、ノックアウト（KO）胚性幹（ES）細胞のライブラリー化（LOK，library of KO）および、遺伝子ノックアウト同定システム（KIS，KO identification system）の基盤となる。LOKは通常、あらゆるマウス遺伝子の変異を含み、KISは所望の変異ES細胞の迅速な単離を可能にする。L OKとKISにより、あらゆる遺伝子についてのノックアウト細胞を、大規模かつ自動化された方法で容易に検索することができる。いったん適切なES細胞を同定すれば、それを8細胞期胚あるいは桑実胚と凝集させることにより、ES細胞由来の胚を試験管内で作出することができる(例えば、Wood et al.，Nature 365:87-89（1993）に記載の方法による)。このような胚を、仮の母親に移植し、所望の遺伝子がノックアウトされたヘテロ接合体のマウスを作出する。通常の胚盤胞注入法にても行うことができる(例えばRobertson， Trends Genet．2:9-13（1986）を参照)。ヘテロ接合体マウスは掛け合わせることでホモ接合体に変換する。並行して、ヘテロ接合の変異ES細胞は、既知のプロトコル（例えばMortensen et al.，Mol．Cell．Biol．12:2391-2395(1992)）に沿って、試験管内でホモ接合体に変換することも可能であり、上述の技術にてホモ接合体のマウスを作出する。いずれの方法で作出したホモ接合体のマウスも、所望のノックアウト遺伝子の機能を決定するために解析可能である。MAGEKO の構成 MAGEKOプロセスは大きく分けて次の３つから構成される。（i）レトロウイルスベクターを用いた、哺乳動物の遺伝子への突然変異誘発、（ii）変異動物の作出に使用可能な、ノックアウト遺伝子のライブラリー化、（iii）所望の遺伝子に変異を持つ細胞の選択である。これらについて以下に述べる。（I）レトロウイルスベタターの構成レトロウイルスはRNAウイルスで、DNAを中間体として複製し、その生活環の中で、プロウイルスのDNAが宿主の染色体に組み込まれることが必須である(Varmus and Brown，Retroviruses．In Mobile DNA(ed．Berg，D．E．and M．M．Howe) ，pp．53-108．American Society for Microbiology，Washington，D.C．(1989) )。組み込みの後、プロウイルスは感染した細胞とその子孫の細胞中で安定な遺伝因子として維持される。レトロウイルスは、おそらく宿主のあらゆるゲノム領域に組み込まれうる(Withers-Ward et al.，Genes Dev．8:1473-1487(1994))。このような性質により、レトロウイルスは、強力な変異原として、また染色体マーカーとして、貴重な存在となっている。 MAGEKOプロセスでは一つ以上のレトロウイルスベクターを変異原として使用する。基本となるベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（MoHLV）(Varmus a nd Brown，supra)を基盤としたものが望ましい。第二のベクターは、異なるレトロウイルスの起源を持つもの、例えば、レンチウイルス（Varmus and Brown，su pra）トリ白血症肉腫ウイルス（ALV）(Varmus and Brown，supra)を基盤としたベクターを含む。挿入的な変異導入が起こる遺伝子数を増やすために、様々なレトロウイルスの骨格がMAGEKO技術において利用される。これは、レトロウイルスが異なれば、ターゲットとなるゲノム領域の指向性が異なるかもしれないという理論に基づいている。さらに、レンチウイルスベクターの場合、この種のレトロウイルスは非分裂細胞にも形質導入可能であることが知られているので（Naldin i et al.，Science 272:263-267(1996)）、感染細胞のより初期の段階での検出が可能となる。MoMLVを含むベクターの組み込みは、体細胞分裂に依存する(Roe et al.，EMBO J．12:2099-2108(1993))。変異誘発に使用されるいずれのベクターもよく似た構造を持ち、レトロウイルスの骨格の配列のみが大きく異なるだけである。ベクターのその他の領域には、不活化された遺伝子の機能解析に必須な、いくつかの共通の特徴が配されている。後述するように、いずれのベクターも高い変異原性を持ち、感染細胞を迅速に同定することができ、レトロウイルスが挿入された遺伝子が発現している細胞の特異的な検出が可能である。さらに、このベクターは変異遺伝子を発現する細胞を特異的に標識する。これにより、破壊された遺伝子の表現型の時間的空間的な解析、条件的かつ組織特異的な遺伝子の不活化、変異遺伝子を発現する細胞系譜の条件的な除去、所望の組織における遺伝子の条件的かつ異所的な発現、が可能となる。他の重要な性質は、細胞の起源によらず条件的な腫瘍をもつ動物の作出が可能なことや、細胞の起源によらず条件的に不死化したセルラインの確立が可能なことである。図1では、MoMLVを基にしたレトロウイルスベクターと、その様々な特徴を記したものである。転写ユニットの向きを矢印で示す。他のレトロウイルスの起源のベクターは、このMoMLVを基にしたベクターと非常によく似ており、唯一の相違点はレトロウイルスの骨格の配列のみである。各要素の起源と重要性を以下に示す。（a）レトロウイルスの配列。レトロウイルスの配列は、パッケージングと宿主ゲノムへのDNAのランダムな組み込みに必要である。MoMLV配列は、pGen^-ベクター（Soriano et al.，J．Virol．65:2314-2319(1991)）の配列と実質的に似ているが、ウイルスのエンハンサー配列を欠き、バクテリアのsupF遺伝子を3'末端反復配列（LTR）に含むものである。ゲノムへ組み込まれる際には、5'LTRエンハンサー配列も除かれ、supF遺伝子が5'LTRにコピーされる。以下に述べるように、もとのベクター上のウイルスのLTRはloxP配列を持つように改変されている。加えて、レトロウイルスベクター以外の全ての配列の転写の向きは、5'LTRプロモーターの転写の向きとは逆になっている(図1)。このベクターの高力価のストックは、既知の方法によって得られる(例えば、Soneoka et al.，Nucleic Acids Res．23:628-633(1995)、Yee et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9564-9 568(1994)、Mann et al.，Cell 33:153-159(1983))。別のレトロウイルスの配列は、レンチウイルスベクターやALVベクターなどを基にし、一般的な方法でウイルスを増殖させることができる。（b）loxP。loxP配列はバクテリオファージP1のCRE組換え酵素の認識配列で、その使用法はSauer，Meth．Enzymol．225:890（1993）にて述べられている。この配列によって、CRE存在下でレトロウイルスの挿入部位が組換えによって切り出される。複数のプロウイルスを保持する細胞では、転座や欠失といった特定の染色体の再構成が促進される(Ramirez-Solis et al.，Nature 378:720-724(19 95))。そのような細胞は、loxPを付けた、それそれ異なるレトロウイルスが挿入されたマウス同士を掛け合わせることで得ることができる。別の方法として、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのFLP組換え酵素が認識するFRT配列（Dymecki ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:6191-6196(1996)）をこの目的のために使用することができ、FLP蛋白質が組換えによって切り出しを行う。（c）V。ＶまたはVDErsは出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのVDE DNAエキソヌクレアーゼの認識配列である(Bremer et al.，Nucleic Acids Res．20:5484(1 992))。この配列は特異的な染色体マーカーを付与する。他の染色体マーカーもこの目的に使用可能である。（d）スプライスアクセプター。図1に示したように、スプライスアクセプターのコンセンサス配列もレトロウイルスベクターに含まれる。この配列は、レトロウイルスの挿入がイントロンで起きたときに、レトロウイルスの転写物を内在性遺伝子の転写物と融合させるのに必要である。スプライスアクセプター部位は、ゲノム中で偶然にスプライシングされてできるようなレトロウイルスの転写物の生成を阻害し、ベクターの挿入が内在性遺伝子への変異導入になる確率を最大にする(Gossler et al.，Science 244:463-465(1989)、Friedrich and Soriano，G enes Dev．5:1513-1523(1991)、Skarnes et al.，Genes Dev．6:903-918(1992) 、Takeuchi et al.，Genes Dev．9:1211-1222(1995)、Wurst et al.，Genetics 139:889-899(1995)、Forrester et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1677- 1682(1996)、Brenner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5517-5521(1989 ))。スプライスアクセプターのコンセンサス配列は、アデノウイルスの主要後期転写物に由来するものが好ましいが(Robberson et al.，Mol Cell．Biol．10:84 -94(1990))、他のいかなるスプライスアクセプター配列も、本発明のベクターに使用可能である。（e）停止コドン。ナンセンスコドンを3つの読み枠全てに付与することで、レトロウイルスが挿入された遺伝子での翻訳終結が保証される。いかなるナンセンスコドンと、その組み合わせもこの目的に使用することができる。（f）IRES。内部リボソーム侵入部位（IRES）はtag遺伝子（後述）の翻訳開始に寄与する。図示したように、IRESとしては、Encephalomyocarditisウイルス由来のものが好ましい(Morgan et al.，Nuculeic Acid Res．20:1293-1299(1992)) 。（g）rtTA。図１で「rtTA」と記されている配列は、変異型テトラサイクリンリプレッサーとVP16の転写活性化ドメインからなる融合蛋白質であることが好ましい(Gossen et al.，Science 268:1766-1769(1995))。rtTAは、テトラサイクリン誘導体の存在下、テトラサイクリンオペレーターの制御下に置かれた遺伝子の発現を促進する能力を持つ(Gossen et al.，Science 268:1766-1769(1995))。本発明においては、rtTAはレトロウイルスの挿入により変異した、内在性の細胞遺伝子のプロモーターの制御下で発現する(図3および図4)。条件的に発現されるrt TAは、MAGEKO法の鍵となるもので、これにより遺伝子の機能解析が容易になる。（h）pA。図１に示したように、本発明のベクターはポリA付加シグナルを含む。このシグナルはrtTA mRNAのプロセシングと発現に必要である。pA配列としては、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のものが好ましいが(Goodwin and Rottman，J ．Biol．Chem．267:16330-16334(1992))、他のいかなるポリアデニレーションシグナルも使用可能である。他の有用なpA配列としてインスリンやSV40のpA配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。（i）P。Pは構成的に発現するマウスのホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK）のプロモーターである(Adra et al.，Gene 60:65-74(1987))。このプロモーターは、GFO（後述）の発現に必要である。他の、構成的に発現する哺乳動物のプロモーターを、PGK配列の代わりに使用することも可能である。（j）ATL。ATL（adenovirus tripartite leader）配列は(Sheay et al.，BioT echniques 15:856-862(1993))、遺伝子発現においてシスに働く誘導因子としてベクターに含まれる。この配列はGFOの産生を増強する。他のリーダー配列をATL の代わりに使用することもできる。（k）gfo。融合gfo遺伝子がベクターに含まれる。この遺伝子は、5'末端に変異型GFPを、3'末端にネオマイシン（NEO）をコードする配列からなる。GFP変異体はAequorea victoriaのGFPに由来するものである。自己蛍光蛋白質であるGFP は、遺伝子発現のレポーターとして広く用いられている(Chalfie et al.，Scien ce 263:802-805(1994)、Palm et al.，Nature Structural Biology 4:361-365(1 997))。変異体としては、細胞内での蛍光が増強された緑色蛍光蛋白質をコードするものが好ましく、Heimらが報告した配列（Cuurent Biology 6:178-182(1996 )）を基にしたGFPの配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。ただし、次に挙げる変異のうち、少なくとも一つを含む。P4-3(Y66H、Y145F)、W7(Y6 6W、N146I、M153T、V163A、N212K)、SG11(F64L、I167T、K238N)、SG25(F64L、S6 5C、I167T、K238N)、SG50(F64L、Y66H、V163A)。gfo配列は、LOK作製に重要な段階である、感染したES細胞の蛍光標示式細胞分取（FACS）に必要である。neo遺伝子はバクテリアのネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする(South ern and Berg，J．Mol．Appl．Gen．1:327-341(1982))。この配列の発現は、プロウイルスを含むES細胞にG418耐性を付与する。ネオマイシン耐性は、プロウイルスの挿入がホモ接合性となっているES細胞を選択するために、本発明の方法にて使用される。これは従来から知られているように、細胞培養液中のG418濃度を上げることで達成される(Mortensen et al.，Mol．Cell．Biol．12:2391-2395(1 992))。他の検出可能な選択マーカーを本発明に使用することも可能である。（l）SPA。人工ポリA付加シグナルがベクターに含まれる。これはgfom RNAのプロセシングと発現を促進する(Levitt et al.，Genes Dev．3:1019-1025(1989) )。他の人工あるいは天然のポリA配列を使用してもよい。（m）t。転写終結配列はレトロウイルスベクターの重要な特徴である。この配列はPGKプロモーターと細胞性のプロモーターからの転写を共に終結させる。適切な転写終結によって、レトロウイルスの挿入による変異原性が格段に上昇する。また、プロウイルスのそばにある遺伝子の異常な発現が抑制されるので、ノックアウトマウスの表現型の解析において時折見られる複雑さ（Olson et al.，Ce ll 85:1-4(1996)）の潜在的な要因を除くことができる。図1に示したように、転写終結配列としては、ヒト補体遺伝子由来のものが好ましいが(Ashfield et al.，EMBO J．10:4197-4207(1991))、他のいかなる適切な転写終結配列を用いても差し支えない。（II）本発明のレトロウイルスベクターに独特な性質と使用法本発明のベクターは多くの独特な性質を持ち、多様な遺伝子破壊法や解析に有用である。この独特な性質と使用法を以下に示す。レトロウイルスベクターは高い変異原性を持つ。本発明が提供するレトロウイルスベクターの大きな利点は、このベクターが高い変異原性を持つという事実である。この性質は、少なくともその一部は、ベクターがスプライスアクセプターと転写終結のコンセンサス配列を組み合わせてもっていることに起因している。スプライスアクセプターについては過去に述べられているが(Gossler et al.，Sci ence 244:463-465(1989)、Friedrich and Soriano，Genes Dev．5:1513-1523(19 91)、Skarnes et al.，Genes Dev．6:903-918(1992)、Takeuchi et al.，Genes Dev．9:1211-1222(1995)、Wurst et al.，Genetics 139:889-899(1995)、Forres ter et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1677-1682(1996)、Brenner et al .，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5517-5521(1989))、転写終結配列との組み合わせは新規である。この組み合わせは、プロウイルスのそばにある細胞性の配列においてしばしばみられる転写のリードスルー（Swain and Coffin，Science 255:841-845(1992)）をなくすのに重要である。通常でない染色体上のスプライス部位を使用するオルタナティブスプライシング機構によって、レトロウイルスベクターの挿入の効果が無くなる可能性があるが、転写終結配列はこれを阻害することで変異原性を増強する(tにおける転写終結のために、通常でない染色体上のスプライス部位は使用できなくなる)。レトロウイルスベクターが所望の遺伝子へ挿入されることで、例えば、図2から図4において、遺伝子Xが、組み込み部位とは関係なく不活化される。遺伝子X の正常な転写とそれに続く翻訳は破壊されるが(図2)、これはレトロウイルスの挿入がエクソン配列で起きるか(図3)、イントロン配列で起きるか (図4)は問題とならない。この利点は非常に重要である。従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子破壊では、ベクターがエクソンへ組み込まれることが通常期待され、イントロンへ組み込まれた場合の結果は予想できない。このような系では、レトロウイルスの挿入のうちのほんの一部分が、マウスにおいて劣性の表現型を示すにすぎない(Jaenisch，Science 240:1468-1474(1988))。従って、スプライスアクセプター配列と転写終結配列との組み合わせは本発明において重要な特徴であり、本発明のベクターはイントロンの位置に組み込まれた場合でも高い変異原性をもつ。MAGEKO 法は感染細胞を迅速に同定できる。第二の利点は、本発明が感染細胞の迅速な同定を可能にしたことである。上述のように、本発明のベクターは、ベクターを保持する細胞の同定を容易にするマーカーを持っている。一つの形態として、PGKプロモーターによって細胞内の蛍光が増強されたGFP変異体をもつベクターを挙げることができる。このマーカーによって、感染後数時間のうちに感染細胞の同定が可能で、例えばFACS分析によって、迅速に形質導入細胞を分画することができる。このことはLOKの作製に重要な要素である。MAGEKO 法は変異遺伝子を発現する細胞を特異的に検出する。上述のように、融合遺伝子であるrtTAは、レトロウイルスの挿入による変異が起きた遺伝子が発現する細胞でのみ産生する。rtTA合成が条件的であるという性質は、一対のマウスの系のような一対の哺乳動物の系を通じて、挿入変異を保持する細胞に特異的に標識をすることを可能にする。この技術によれば、本発明のレトロウイルスベクターをもつマウスは、rtTAに依存したプロモーターの制御下にあるマーカー遺伝子をもつマウスと掛け合わせることができる。外来遺伝子を共に持つ子孫では、そのようなマーカーは、rtTAを発現する細胞においてのみ、かつテトラサイクリン誘導体の存在下でのみ、産生するであろう。その結果、マーカーを合成する子孫の細胞のみが、プロウイルスによって変異した遺伝子が発現している細胞である。このような細胞は、マーカーの性質に依存するが、一般的な技術で検出可能であり、必要ならば他の細胞と分離することも可能である。マーカーは遺伝子発現のレポーターとして用いられるものならばなんでもよい。そのようなレポーターには、バクテリアのlacZ遺伝子(An et al.，Mol．Cell．Biol．2:1628-1632(1982))、緑色蛍光蛋白質、緑色蛍光蛋白質の波長変異体(Heim et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:12501-12504)、ルシフェラーゼ(de Wet et al.，Mol．Cell．Biol．7:725-7 37(1987))、クロラムフェニコールアセチルトランスフエラーゼ（CAT）(Gorman et al.，Mol．Cell．Biol．2:1044-1051(1982))が挙げられるが、これらに限定されるものではない。MAGEKO 法は変異遺伝子を発現する細胞系譜を条件的に除去することを容易にする。rtTAの使用は、変異遺伝子を発現する細胞系譜を条件的に除去することを容易にする。細胞除去研究は、これまで何度か示されてきているように、全ての細胞系譜に機能を割り当てる際の手段となっている(Breitman et al.，Science 238: 1563-1565(1987)、Behringer et al.，Genes Dev．2:453-461(1988)、Landel et al.，Genes Dev．2:1168-1178(1988)、Breitman et al.，Development 106:457 -463(1989)、Heyman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2698-2702(1989) 、Borrelli et al.，Nature 339:538-540(1989)、Breitman et al.，Mol．Cell ．Biol．10:474-479(1990)、Kunes and Steller，Genes Dev．5:970-983(1991) 、Moffat et al.，Development 114:681-687(1992)、Nirenberg and Cepko，J． Neurosci．13:3238-3251(1993)、Dzierzak et al.，Intern．Immunol．5:975-98 4(1993))。本発明のレトロウイルスベクターはこの強力なアプローチに利用できるよう設計されている。本発明によると、条件的な細胞除去は、一対のトランスジェニックマウスの系を通じて達成される。この系では、休止した状態の「武器」遺伝子を導入したマウスと、その活性化因子を発現するマウスとが掛け合わされる。両方の遺伝子を受け継いだ子孫では、「武器」が活性化され、その活性化蛋白質を発現する細胞においてのみ致死的な効果が現れる。rtTAの系との関係で言えば、内在性マウス遺伝子のプロモーターの制御下でrtTAが発現しているマウスでは、変異遺伝子を発現する細胞においてのみrtTAが合成されている(図3、図4)。このようなマウスを、条件的に産生する「細胞除去因子」をもつマウスと掛け合わせる。「細胞除去因子」は、rtTAとテトラサイクリン誘導体との両方が存在する場合にのみ合成される。両方の導入遺伝子をもつ子孫には、テトラサイクリン誘導体を投与し、それによりレトロウイルスが挿入された遺伝子が発現している細胞を破壊した後、細胞除去研究に供される。このような子孫を調べることで、細胞系譜除去の機能的解析を行うことができる。本発明において有用な、条件的に産生する「細胞除去因子」としては、野生型または変異型毒素(Borrelli et al.，Nature 339:538-540(1989)、Frankel et a l.，Mol．Cell．Biol．9:415-420(1989)、Frankel et al.，Mol．Cell．Biol．1 0:6257-6263(1990))、ヘルペス単純ウイルスの野生型または変異型チミジンキナーゼ（HSV-tk）(Salomon et al.，Mol．Cell．Biol．15:5322-5328(1995)、Blac k et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3525-3529(1996))、Drosophila rea per遺伝子産物のようなアポトーシス蛋白質(White et al.，Science 271:805-80 7(1996))、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。HSV-tk遺伝子が利用可能であれば、テトラサイクリン誘導体に加えてガンシクロビルを投与して細胞死を起こすことができる。別の例としては、条件的に産生されたβ-ガラクトシダーゼは、神経系の様々な細胞種で示されているように(Nirenberg and Cepko，J．Neurosci．13:3238-3251(1993))、細胞除去を容易にしうる。MAGEKO の、破壊された遺伝子の時間的空間的な表現型解析への使用。例えばrtTA を用いた本発明の方法を使用すると、破壊された遺伝子の表現型を時間的、空間的に解析することが容易になる。多くの場合、とりわけホモ接合体の挿入変異が致死になる場合や、詳細な解析を妨げるような表現型を示す場合(Copp，Trends Genet．11:87-93(1995))、所望の遺伝子を、時間的、空間的に不活化することが好ましい。これは、本発明において、ES細胞の混合物から得られるモザイク動物を使用することで達成される。モザイク動物では、所望の遺伝子の変異についてヘテロ接合体とホモ接合体との混合体となっている。このような動物では、すでに広く知られているように(Nagy and Rossant，J．Clin．Invest．97:1360-1365 (1996)、Robb et al.，EMBO J．15:4123-4129(1996))、ヘテロ接合性の細胞はホモ接合性の細胞を救出するので、モザイクとなる。本発明によると、モザイクマウスは、所望の遺伝子がホモ接合性の変異ES細胞と、二つの対立遺伝子のうち一方だけに同じプロウイルスが挿入された変異ES細胞とから作出される。（上述の、条件的な除去技術を用いて作製した動物由来の）ヘテロ接合性の細胞は、条件的に産生する「細胞除去因子」もまた含む。この因子はrtTAとテトラサイクリン誘導体が共に存在したときにのみ合成され、逆に言えば、rtTAはレトロウイルスが挿入された遺伝子を発現する細胞でのみ産生する(図3、図4)。テトラサイクリン誘導体をモザイク動物へ投与すると、変異遺伝子が発現しているヘテロ接合性の細胞が、そのような細胞のみが持つ「除去因子」の存在により、特異的に消失する。結果として、変異遺伝子を発現する動物の細胞集団は、すべてホモ接合性の変異細胞から構成されることになる。この条件下で所望の遺伝子に関連した表現型を調べればよい。このアプローチは、特にマウスをホモ接合体にしたときに致死的である場合、変異体の表現型解析に有用である。条件的かつ組織特異的な遺伝子の不活化におけるMAGEKOプロセスの使用。場合によっては、破壊された遺伝子の時間的、空間的な表現型解析が、遺伝子の機能を調べるのに適切ではないことがある。この問題に取り組むため、別の相補的なアプローチとして、条件的かつ組織特異的な遺伝子の不活化を行うことができる。このアプローチによれば、所望の遺伝子が発現している細胞で、その遺伝子を望むときに不活化することができる。この一般的な技術は、組織特異的な遺伝子ターゲティングの使用を通じた遺伝子の機能解析に用いられてきた(Gu et al.，Sc ience 265:103-106(1994)、Kuhn et al.，Science 269:1427-1429(1995)、Rajew sky et al.，J．Clin．Invest．96:600-603(1996))。条件的かつ組織特異的な遺伝子の不活化は、上述の条件的な細胞系譜の除去と似た原理で、一対のトランスジェニックマウスの系を通じて達成される。ここでは、一方の掛け合わせの相手は、条件的に組織特異的に不活化される遺伝子の対立遺伝子のうち一方に、レトロウイルスの挿入されているヘテロ接合性変異ES細胞由来の「活性化蛋白質」を持つ。このマウスでは、ターゲット遺伝子が発現する細胞でのみrtTAを産生する(図3、図4)。もう一方の掛け合わせの相手としては、例えば、条件的に発現するリボザイムや、条件的に発現する組換え酵素のような、休止した状態の「武器」を持つものが挙げられる。リボザイムは、ターゲットRNAの配列特異的な切断を触媒することができる分子である(Altman，Pcoc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10898-10900(1993))。この系では、リボザイムは、U6核内低分子RNAプロモーターのような、RNAポリメラーゼIII （Pol III）依存のプロモーターを用いて発現されることが望ましい(Das et al. ，EMBO J．7:503-512(1988))。Pol IIIプロモーターは、rtTAとテトラサイクリン誘導体の存在下でのみ適切なリボザイムを合成する。加えて、構成的なPol II Iプロモーターは、転写終結配列によってリボザイム配列とは分断されていることが望ましい。それぞれのリボザイムは、所望の遺伝子をターゲットとし、それを特異的に不活化するように設計される(Altman，Pcoc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10898-10900(1993)、Liu and Altman，Genes Dev．9:471-480（1995）などに記載のプロトコルによる)。転写終結配列はその下流の転写を阻害するので(Das et al.，EMBO J．7:503-512(1988))、リボザイムの合成を妨げる。転写終結配列はFRTまたはloxPの側に置かれる(それぞれ、出芽酵母のFlp組換え酵素（Dymecki ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:6191-6196(1996)）の認識配列、バクテリオファージP1のCRE組換え酵素（Sauer，Methods Enzymol．225:890-900(1993)）の認識配列)。FlpあるいはCREは、rtTAとテトラサイクリン誘導体が存在したときにのみ発現する。両方の外来遺伝子を受け継いだ子孫では、テトラサイクリン誘導体が投与されると、ターゲット遺伝子が発現している細胞でFlpまたはCREが産生する。FlpまたはCREが産生した細胞では、転写終結配列が切り出され、リボザイムの合成が行われるようになる。結果として、ターゲット遺伝子はリボザイムの攻撃を受けるので、条件的かつ組織特異的に遺伝子が不活化されたときの表現型を解析することが可能となる。別のアプローチで条件的かつ組織特異的な遺伝子の不活化を行う場合、マウスの対立遺伝子で、野生型のものと破壊されたものとの間の条件的な相補、あるいは、破壊されたマウスの遺伝子と野生型ヒト相同遺伝子との間の条件的な相補を利用する。これは二段階の工程を経てなされる。第一段階では、ある遺伝子に本発明のレトロウイルスベクターが組み込まれたヘテロ接合性マウスと、その遺伝子の野生型遺伝子がrtTA依存プロモーターの下流に余分に配されたヘテロ接合性マウスとを掛け合わせる。導入遺伝子を共に持つF1世代のマウスは、破壊された遺伝子をホモ接合性に持つと同時に、その野性型遺伝子をrtTA依存性プロモーターの下流にもつ。結果として、F2マウスでは、テトラサイクリン誘導体存在下で、変異遺伝子が発現しているのと同じ細胞で、野生型遺伝子も発現している。野性型遺伝子が存在すると変異型の表現型が相補されるが、逆に、必要なときにテトラサイクリンの投与を中止すれば、変異型の表現型を解析することができる。全く同じアプローチが、破壊されたマウスの遺伝子に対するヒト相同遺伝子による相補によっても可能で、マウスの変異遺伝子が発現している細胞でヒト相同遺伝子を発現させればよい。もしヒトの疾患に関わる遺伝子にこの技術を利用すれば、得られるF2マウスはヒトの疾患のモデルとなりうるので、その疾患の研究や、治療薬の単離、同定などに役立つであろう。所望の組織での条件的かつ異所的な遺伝子発現のためのMAGEKOプロセスの用。狙い通り遺伝子を発現させることは、遺伝子の機能を知る上で強力な方法となっている(Balling et al.，Cell 58:337-347(1989)、Kessel et al.，Cell 61:301-3 08(1990)、Brand and Perrimon，Development 118:401-415(1993)、Halder et a l.，Science 267:1788-1792(1995))。本発明のレトロウイルスベクターは、この強力なアプローチに利用できるように設計されている。本発明によれば、所望の遺伝子を条件的に狙い通り発現させることは、これまでに述べてきた方法によく似た、一対のトランスジェニックマウスを使用する方法で達成される。この系では、一方の掛け合わせの相手は、レトロウイルスが挿入された遺伝子のプロモーターの制御下にあるrtTAを発現し、rtTAは変異遺伝子が発現している細胞でしか合成されない(図3、図4)。もう一方の掛け合わせの相手は、rtTAとテトラサイクリン誘導体の存在下でのみ発現するような、条件的に発現する遺伝子をもつ。両方の導入遺伝子を共に受け継いだ子孫では、その遺伝子は、レトロウイルスが挿入された遺伝子が発現した細胞で、かつテトラサイクリン誘導体の存在下でのみ発現する。この子孫を解析すれば、条件的に狙い通りその遺伝子を発現させることで得られた生理学的な結果を知ることができる。重要なことは、このアプローチには、解析のターゲットとする組織の数に制限がないということである。理論的には、所望の遺伝子の条件的かつ異所的な発現の結果を研究するために、動物のすべての組織を選択することができる。MAGEKO によって所望の細胞種に条件的な腫瘍を持たせた動物を確立することができる。一対のトランスジェニックマウスの系は、条件的に誘導される腫瘍をもった動物の作出にも利用できる。この系では、一方の掛け合わせの相手は、レトロウイルスが挿入された遺伝子のプロモーターの制御下にあるrtTAを発現し、rtTA は変異遺伝子が発現している細胞でしか合成されない(図3、図4)。もう一方の掛け合わせの相手は、癌遺伝子を組み合わせた「腫瘍化因子」を条件的に産生する (Bishop，Cell 64:235-248(1991)、Hunter，Cell 64:249-270（1991）の他、必要ならばテロメレース遺伝子でもよい(deLange，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9 1:2882-2885(1994)、Counter et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2900-29 04(1994)、Sharma et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:12343-12346(1995) )。これらの因子は、rtTAとテトラサイクリン誘導体存在下でのみ合成される。それ故、両方の導入遺伝子をもつ子孫では、テトラサイクリン誘導体の投与によりレトロウイルスが挿入された遺伝子を発現した細胞で、腫瘍が発生する。このアプローチは、腫瘍形成のモデルとなるトランスジェニックマウスの作出において、従来の方法に比べて多くの利点をもつ(Quaife et al.，Cell 48:1023 -1034(1987)、Sinn et al.，Cell 49:465-475(1987)、Jat et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 88:5096-5100(1991)、Sandmoller et al.，Cell Growth and Diff．6:97-103(1995))。第一に、いかなる組織特異的なプロモーターでも利用可能である。第二に、癌遺伝子は構成的ではなく条件的に発現する。つまり、この系では、テトラサイクリン誘導体存在下でのみ正常なマウスの組織の腫瘍化が開始されるので、解析が容易となる。この方法で作出された動物は、特定の細胞種で働く癌遺伝子の型についての情報を提供し、抗癌治療のスクリーニングのモデル動物となりうる。MAGEKO は、条件的に所望の不死化したセルラインの確立を可能にする。（上述の方法にて作出される）所望の細胞を起源とする、成長した腫瘍をもつ動物をいったん入手できれば、これは直ちに、腫瘍セルラインの材料になる。別の方法として、このような動物から、単に所望の細胞を単離し、テトラサイクリン誘導体の存在下で試験管内で培養するだけで、腫瘍発生よりも先に不死化したセルラインを確立することができる。このようなセルラインを用いることで、レトロウイルスが挿入された遺伝子に効果がある化合物を同定するための薬剤スクリーニングを行う際、高い処理能力を得ることができる。特に、このようなセルラインではターゲット遺伝子と共に構成的にGFPも発現しているので、もしβ-GALをレポーター遺伝子として用いていれば、このセルラインはGFP⁺、β-GAL⁺となる。問題の遺伝子に特異的に効果がある薬剤は、すべてGFP⁺、β-GAL^-の細胞を産生する。（III）LOK 上述のレトロウイルスベクターは、内在性遺伝子がノックアウトされたES細胞のライブラリー化（LOK）に使用される。このようなライブラリーを作製するために、ベクターを、平均してゲノム1kbごとに挿入されるようにES細胞に感染させて導入する。LOKは三千万の、それぞれ独立したプロウイルスからなる挿入をもつことが好ましい。ひとつのLOKは十分に複雑であるので、統計的には、ほとんどのマウスの遺伝子に、独立したレトロウイルスの挿入が、少なくとも一回は起こるはずである。レトロウイルスベクターをES細胞に感染させた後、GFPなどの発色マーカーを発現する形質導入細胞をFACS分析にて選択し、マルチウェルプレートにまく。このようにして細胞をプールした後、全体を複製し、レプリカを保存するとともに、それぞれの細胞とウェルとの対応づけが容易になるようなマトリクスを作製する。LOKをスクリーニングするための所望のマトリクスの作製に際しては、いくつかの確立された方法が利用可能である(Zwaal et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:7431-7435(1993)、Evans and Lewis，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 86:5030-5034(1989)、Green and Olson，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 87:1213-1217(1995)、Kwiatkowski et al.，Nucleic Acids Res．18:719 1-7192(1990)、Barillot et al.，Nucleic Acids Res．19:6241-6247（1991）などを参照)。（IV）KIS 本発明は遺伝子ノックアウト同定システム（KIS）を含む。本発明によれば、レトロウイルスベクターが組み込まれたゲノムDNAは、プールされたLOKのES細胞から単離され、断片化される。各断片は環状化され、inverted PCRにより増幅される(Ochman et al.，Genetics 120:621-625(1988))、Triglia et al.，Nucleic Acids Res．16:8186(1988)。このとき、レトロウイルスベクターの配列にハイブリダイズするが、マウスゲノム中には存在しない配列をプライマーとする。この方法はレトロウイルスの挿入の検出にうまく応用されている。例えば、ゼブラフィシュゲノム(Allende，Genes Dev．10:3141-3155(1996))、ショウジョウバエゲノムへのPエレメントの挿入(Dalby et al.，Genetics 139:757-766(1995))、シロイナズナゲノムへのトランスポゾンの挿入(Sundaresan et al.，Genes Dev ．9:1797-1810(1995))。別の方法として、oligo-cassett mediated PCR(Rosenth al and Jones，Nucleic Acids Res．18:3095-3096（1990）などを参照)、ligati on mediated PCR（Mueller and Wold，Science 246:780-786（1989）などを参照）を使用することができる。いったん増幅された染色体DNA断片は、ハイブリダイゼーション支持体に移され、プロウイルスのそばにあるゲノムDNAを規則的に並べたアレイを作成する。標識した所望のDNAを、プールしたゲノムDNAとハイブリダイズさせ、得られた陽性シグナルにより、所望のES細胞クローンが迅速に同定される。別の方法としては、ES細胞から増幅したDNAを直接シークエンシングすることで、レトロウイルスの組み込み部位を検出できる。しかしながら、このアプローチは、ES細胞の単一クローンを単離する必要があるので、作製されたクローンのサブセットついて使用されることが好ましい。さらに別の方法としては、組み込み部位を、ポジショナルオリゴヌクレオチドプロービング（POP）技術を使用して検出することができる。この方法は、限定された配列情報の処理を並行して行うには理想的な方法である。この技術によれば、特定の長さの、全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせが高密度アレイ上に合成され(Affymetrix社のchipなど(Lipshutz et al.，BioThechniques 19:442-447（1995）などを参照) 、ES細胞から増幅したDNAとハイブリダイズされる。POP技術は、既知の配列（すなわちレトロウイルスベクターの一部）のすぐそばにある、未知のDNA領域（すなわちゲノムDNA）の配列情報を得ることを基盤としている。レトロウイルスの組み込みはゲノムDNAへのウイルスのLTRの正確な組み込みの結果であるので、LT R配列はオリゴヌクレオチドプローブの設計の際に好適である。例えば、LTRの先端部に関連した8塩基と、9個のランダムな塩基を含むオリゴヌクレオチドは、4e 9=262,144個の組み合わせのプローブになる。オリゴヌクレオチドアレイを用いてジャンクション配列を決定する戦略は、上述のハイブリダイゼーション技術の代わりに、あるいはそれと並行して使用することができる。マウスゲノムの配列情報が増大するに従って、この配列タグを使用したアプローチは既知の遺伝子への挿入を同定する手段としてますます有用となるだろう。所望の変異を持つES細胞クローンを同定した後、ヘテロ接合体やホモ接合体の変異マウスが、上述の方法で作出される。他の形態ここに挙げた技術は、ヒト以外の、すべての適当な哺乳動物において突然変異を誘発することに応用可能である。この技術は特に、遺伝子変異、ES細胞、トランスジェニック動物のライブラリー化に有用である。ライブラリー化に供される動物とは、疾患モデルとして使用されるあらゆる動物、あるいは家畜化されたあらゆる動物であり、齧歯類(マウス、ラット、モルモットなど)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマを含むが、これらに限定されるものではない。他の形態は続く請求の範囲に記載される。

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の遺伝子に突然変異を誘発する方法であって、前記哺乳動物細胞のゲノム中にレトロウイルスベクターを組み込むことが可能な条件下で該レトロウイルスベクターを導入する導入工程を含み、前記レトロウイルスベクターがスプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含む、突然変異誘発方法。２．前記レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス配列由来のパッケージング配列および組み込み配列を含む、請求の範囲１記載の方法。３．前記レトロウイルスベクターが、哺乳動物細胞のプロモーターの制御下で発現するレポーター遺伝子を含み、前記レポータ遺伝子が、前記哺乳動物細胞のゲノムに前記ベクターが組み込まれた状態で、前記プロモーターと制御可能に連結される請求の範囲１記載の方法。４．前記レポーター遺伝子が制御蛋白質をコードし、前記制御蛋白質が、検出可能な遺伝子の発現を調節する能力を有する、請求の範囲３記載の方法。５．前記制御蛋白質が、活性化蛋白質に融合されたテトラサイクリンリプレッサーである、請求の範囲４記載の方法。６．前記活性化蛋白質がVP16である、請求の範囲５記載の方法。７．前記レトロウイルスベクターが、構成的に発現されるマーカー遺伝子をコードするDNA配列を含み、前記マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞中で検出可能である、請求の範囲１記載の方法。８．前記マーカー遺伝子が、緑色蛍光蛋白質である、請求の範囲７記載の方法。９．前記緑色蛍光蛋白質が、野生型緑色蛍光蛋白質と比較して細胞内蛍光が増強されたものである、請求の範囲８記載の方法。 10．前記緑色蛍光蛋白質が、哺乳動物の選択マーカーと融合されたものである、請求の範囲８記載の方法。 11．前記哺乳動物の選択マーカーが、ネオマイシン耐性をコードする、請求の範囲９記載の方法。 12．前記レトロウイルスベクターが、酵母のVDE DNAエンドヌクレアーゼ由来の認識配列を含む、請求の範囲１記載の方法。 13．前記レトロウイルスベクターが、組換え酵素によって認識される配列を含む、請求の範囲１記載の方法。 14．前記配列が、loxP配列である、請求の範囲13記載の方法。 15．前記哺乳動物が、マウスである、請求の範囲１記載の方法。 16．前記細胞が、幹細胞である、請求の範囲１記載の方法。 17．前記幹細胞が、胚性幹細胞である、請求の範囲16記載の方法。 18．スプライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクター。 19．前記レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス配列由来のパッケージングおよび組み込み配列を含む、請求の範囲18記載のレトロウイルスベクター。 20．前記レトロウイルスベクターが、哺乳動物細胞のプロモーターの制御下で発現するレポーター遺伝子を含み、前記哺乳動物細胞のゲノムに前記ベクターが組み込まれた状態で、前記レポーター遺伝子が前記プロモーターの支配下にある、請求の範囲18記載のレトロウイルスベクター。 21．前記レポーター遺伝子が制御蛋白質をコードし、前記制御蛋白質が、検出可能な遺伝子の発現を調節する能力を有する、請求の範囲20記載のレトロウイルスベクター。 22．前記制御蛋白質が、活性化蛋白質に融合されたテトラサイクリンリプレッサーである、請求の範囲21記載のレトロウイルスベクター。 23．前記活性化蛋白質がVP16である、請求の範囲22記載のレトロウイルスベクター。 24．前記検出可能な遺伝子が、テトラサイクリンオペレーターの調節下にある、請求の範囲22記載のレトロウイルスベクター。 25．構成的に発現されるマーカー遺伝子をコードするDNA配列を含み、前記マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞中で検出可能である、請求の範囲18記載のレトロウイルスベクター。 26．前記マーカー遺伝子が、緑色蛍光蛋白質である、請求の範囲25記載のレトロウイルスベクター。 27．前記緑色蛍光蛋白質が、野生型緑色蛍光蛋白質と比較して細胞内蛍光が増強されたものである、請求の範囲26記載のレトロウイルスベクター。 28．前記緑色蛍光蛋白質が、哺乳動物の選択マーカーと融合されたものである、請求の範囲26記載のレトロウイルスベクター。 29．前記哺乳動物の選択マーカーが、ネオマイシン耐性をコードする、請求の範囲28記載のレトロウイルスベクター。 30．酵母のVDE DNAエンドヌクレアーゼ由来の認識配列を含む、請求の範囲18 記載のレトロウイルスベクター。 31．組換え酵素によって認識される配列を含む、請求の範囲18記載のレトロウイルスベクター。 32．前記配列が、loxP配列である、請求の範囲31記載のレトロウイルスベクター。 33．請求の範囲18記載のレトロウイルスベクターを保持する細胞。 34．請求の範囲18記載のレトロウイルスベクターを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。 35．前記動物がマウスである、請求の範囲34記載のヒト以外のトランスジェニック動物。 36．請求の範囲１記載の方法で作製された、変異哺乳動物遺伝子ライブラリー。 37．請求の範囲１記載の方法で作製された、変異哺乳動物遺伝子ライブラリーを保持する細胞。 38．前記細胞が幹細胞である、請求の範囲37記載の細胞。 39．レトロウイルスベクターを保持する細胞を同定する方法であって、（a）プライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクターを、哺乳動物細胞のゲノム中に前記レトロウイルスベクターが組み込まれることが可能な条件下で、前記細胞集団へ導入する工程、および、（b）前記マーカー遺伝子の発現の検出により、前記レトロウイルスベクターを含有する前記細胞を同定する工程、と含む、細胞同定方法。 40．前記の細胞が幹細胞である、請求の範囲39記載の方法。 41．前記マーカー遺伝子が緑色蛍光蛋白質である、請求の範囲39記載の方法。 42．前記緑色蛍光蛋白質が、野生型緑色蛍光蛋白質と比較して細胞内蛍光が増強されたものである、請求の範囲41記載の方法。 43．変異哺乳動物遺伝子を同定する方法であって、（a）プライスアクセプター配列、転写終結配列、レトロウイルスパッケージングおよび組み込み配列を含むレトロウイルスベクターを、哺乳動物細胞のゲノム中に前記レトロウイルスベクターが組み込まれることが可能な条件下で前記ベクターを前記細胞集団へ導入する工程、（b）前記細胞集団から前記ゲノムDNAを単離する工程、（c）前記レトロウイルス配列の、少なくともその一部を基にしたプライマーを使用し、前記ゲノムDNAを増幅する工程、および、（d）前記変異哺乳動物遺伝子を、野生型塩基配列との相同性によって同定する工程と、を含む、変異哺乳動物遺伝子の同定方法。 44．前記細胞が幹細胞である、請求の範囲43記載の方法。 45．前記配列の相同性が、ハイブリダイゼーション技術によって同定される、請求の範囲43記載の方法。