DE19946173B4

DE19946173B4 - Expression der bovinen Acetyl-Coenzym A Carboxylase α

Info

Publication number: DE19946173B4
Application number: DE1999146173
Authority: DE
Inventors: Hans Martin Seyfert
Original assignee: FORSCHUNGSINSTITUT fur DIE BIOLOGIE LANDWIRTSCHAFTLICHER NUTZTIERE
Current assignee: FORSCHUNGSINSTITUT fur DIE BIOLOGIE LANDWIRTSCHAFTLICHER NUTZTIERE
Priority date: 1999-09-20
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-09-21
Also published as: DE19946173A1

Abstract

Nukleinsäure, welche eine DNA-Sequenz umfaßt, die
a) die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz;
b) eine allelischen Variante davon; oder
c) eines Fragmentes der Sequenzen nach a) oder b) aufweist, wobei das Fragment mindestens einen der Bereiche von Nukleotid 2188 bis 2219 oder 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1, den Bereich von Nukleotid 1 bis 441 der SEQ ID NO: 2 oder den entsprechenden Bereich einer allelischen Variante umfaßt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die eine DNA Sequenz aufweisen, welche für bovine Acetyl-Coenzym A Carboxylase α kodiert und/oder die Expression dieses Enzyms in der Milchdrüse von Rindern reguliert. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Hemmung der Expression von Accα in der Milchdrüse von nichtmenschlichen Säugern.
Mit zunehmender Bedeutung der Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren und insbesondere der Expression von rekombinanten Proteinen in der Milch von transgenen Tieren gewinnen induzierbare Promotoren, welche die Expression von Genen in der Milchdrüse kontrollieren, ebenfalls an Bedeutung. Beispielsweise ist es wünschenswert, die Expression der Enzyme zu kontrollieren, die die Zusammensetzung der Milch beeinflussen.
Die bovine Acetyl-Coenzym A Carboxylase α ist ein Enzym, das in der Milchdrüse induzierbar exprimiert wird und die Zusammensetzung der Milch wesentlich beeinflußt.
Acetyl-Coenzym A besteht aus Essigsäure, die über eine Thioester-Bindung an die Sulfhydrylgruppe von Coenzym A gebunden ist. Acetyl-Coenzym A besitzt ein hohes Acetyl-Gruppenübertragungspotential und ist deshalb ein wichtiges Zwischenprodukt bei einer Vielzahl von Biosyntheseverfahren der Zelle.
Acetyl-Coenzym A Carboxylase α (E.C. 6.4.1.2; nachfolgend als Accα bezeichnet) ist eines der Enzyme, die für die Synthese langkettiger Fettsäuren im Zytoplasma von Säugetieren benötigt werden. Accα katalysiert die Bildung von Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA durch Anlagerung einer CO₂-Gruppe an den C₂-Körper des Acetyl-CoA, wodurch dieser zu einem C₃-Körper verlängert wird. Bei dieser Reaktion handelt es sich um den Raten-limitierenden Schritt der Fettsäuresynthese (Numa, S. und Tauabe, T., Fatty acid metabolism and its regulation, Herausgeber S. Numa, New York 1984, 1–27).

Eine Vielzahl von Isoformen der Acetyl-Coenzym A Carboxylase wurde inzwischen isoliert. Dabei unterscheidet man zwischen einer Accα mit einem Molekulargewicht von 265 kDa und einer Accβ mit einem Molekulargewicht von 275 bis 280 kDa, sowie zwischen verschiedenen Isoformen der Accα, die durch unterschiedliches Spleißen der mRNA erzeugt werden. Obwohl davon ausgegangen wird, daß Accα primär die Synthese langkettiger Fettsäuren im Zytoplasma von Säugetieren reguliert, während Accβ an der Oxidation der Fettsäuren in den Mitochondrien beteiligt ist, konnte eine klare Aufteilung der verschiedenen Isoformen nach enzymatischer Aktivität experimentell nicht belegt werden (Ki-Han Kim, Annu. Rev. Nutr., Vol. 17 (1997), 77–99). Die Proteinsequenz der Accß unterscheidet sich von der Sequenz der Accα hauptsächlich im Nterminalen Bereich.

Fettsäuren erfüllen im Organismus eine Vielzahl von Funktionen, beispielsweise werden sie als Grundstoff für die Membransynthese, als Reservestoff oder als Nahrungsquelle für Säuglinge eingesetzt. Daher wurden aktive Accα Enzyme in einer Vielzahl von Zellen, darunter Zellen des fettspeichernden Gewebes, der Leber und der Milchdrüse, gefunden (Ki-Han Kim a.a.O.).

Die Aktivität der Accα und die Rate der Fettsäuresynthese einer Zelle schwanken in Abhängigkeit von Umwelteinflüssen, wie Hormonen, der Zusammensetzung der Nährmedien, der Entwicklungsbedingungen und von genetischen Faktoren (Ki-Han Kim a.a.O.). Aufgrund der vielfältigen Verwendung der Fettsäuren erfolgt die Regulation der enzymatischen Aktivität der Accα sowohl auf der Ebene der Transkription und Translation als auch durch Aktivierung und Inaktivierung des Proteins.

Accα und β sind Phosphoproteine, die bis zu 9 Mol Phosphat pro Mol Enzym tragen können. Accα kann durch Phosphorilierung inaktiviert werden. In Versuchen mit Accα, dessen Aminosäuresequenz an bestimmten Positionen verändert worden war, wurde festgestellt, daß die Phosphorilierung von Serin in Position 1200 für die Inaktivierung durch cAMP-abhängige Protein-Kinase und die Phosphorilierung von Serin in Position 79 für die Inaktivierung durch 5'-AMP-abhängige Protein-Kinase notwendig ist (Ha et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, 22162–22168; und Ki-Han a.a.O.).

Eine erste Beschreibung des für Accα kodierenden Genes der Ratte wurde von Lopéz-Casillas et al. durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85 (1988), 5784–5788). Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Gen gewebespezifisch von unterschiedlichen Promotoren 1 und 2 (PI und PII) exprimiert wird (Lopéz-Casillas et al., Gene, Vol. 83 (1998), 311–319). Es wurden jedoch nur die im 5'-Bereich des Gens gelegenen Exons charakterisiert, wobei festgestellt wurde, daß Exon 5 das Startsignal für die Eiweißsynthese des Enzyms trägt.

Inzwischen wurde auch die cDNA des Accα Gens vom Menschen kloniert (Abu-Elheiga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92 (1995), 4011–4015). Das Gen erstreckt sich über etwa 460 Kb.

Ferner konnte das für Accß kodierende Gen des Menschen identifiziert werden (Widmer et al., Biochem. J., (1996), 915–922).

Die Kontrolle der Accα-Aktivität über die Expression des Gens von den Promotoren PI und PII ist im Stand der Technik ausführlich dargestellt worden. Auf der Ebene der Genexpression erfolgt die Kontrolle in zwei Stufen:

(i) Differenzierungs-abhängige und physiologische Aktivierung verschiedener Promotoren; sowie
(ii) Ausbildung verschiedener Spleißvarianten der mRNA, die sich im 5'-nicht-translatierten Bereich unterscheiden

Es konnten fünf verschiedene Formen von Accα mRNA identifiziert werden, die durch Expression von PI oder PII aus und verschiedene Spleißvorgänge der Transkripte erzeugt werden. Über die physiologische Bedeutung dieser Spleißvarianten ist nichts bekannt, obwohl die verschiedenen mRNAs Gewebe-spezifisch, also in Abhängigkeit des Zustands des Gewebes exprimiert werden.

Die Transkription vom Promotor PI führt zu Klasse 1 mRNAs, die Exon 1 an ihrem 5'-Ende aufweisen, während die Transkription vom PII-Promotor zu Klasse 2 mRNAs führt, welche Exon 2 als 5'-Ende aufweisen (Ki-Han a.a.O.).

Von der Ratte weiß man bezüglich der Promoteraktivierung, daß PI in der Leber und in adiposem Gewebe aktiv ist, durch die Stoffwechsellage des Tieres (Fasten/Anfüttern führt zu starker Aktivierung, Laktation praktisch zur Abschaltung in adiposem Gewebe) reguliert wird und in der Milchdrüse zu allen Zeiten inaktiv ist.

Der PII-Promotor ist in fast allen Geweben konstitutiv aktiv. Der PII-Promotor der Ratte weist ferner Ansatzstellen für Vermittler extra-zellulärer Signale auf (z.B. Insulin, Glukose-reguliertes Element, cAMP). Das zeigt, daß die Aktivität dieses – an sich konstitutiven – Promotors zusätzlich in Abhängigkeit von der Stoffwechsellage des Tieres reguliert wird. So wurde beispielsweise die Expression der verschiedenen Accα-Isoformen in der Milchdrüse während und nach der Schwangerschaft bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß die Aktivität des PII-Promotors unmittelbar nach der Geburt stark ansteigt, während eine Aktivität des PI-Promotors während dieser Phase nicht nachgewiesen werden konnte. Aus diesen Befunden wurde gefolgert, daß die Aktivität der Accα in der Milchdrüse vom PII Promotor reguliert wird (Ki-Han a.a.O.).

In der Ratte wurden Bindungssequenzen für eine Reihe von Transkriptionsfaktoren im Bereich der Sequenz des PI und PII-Promotors identifiziert (Ki-Han a. a. O.; Tae et al., J.Biol.Chem. 269 (1994) 10475–10488). Bezüglich ihrer entwicklungsspezifischen Aktivierung ist jedoch nichts bekannt.

Bei der Klonierung der Accα cDNA des Schafes wurden Transkripte unterschiedlicher Länge erhalten (Barber et al., Gene, Vol. 154 (1995), 271–275). Dabei wurde festgestellt, daß es sich um die Expression der für Accα kodierenden DNA von unterschiedlichen Promotoren aus handelt. In erweiternden Studien konnte beim Schaf ein bis dahin unbekannter, dritter Promotor (PIII) nachgewiesen werden, der insbesondere während der Laktation die Expression der Accα aktiviert (Barber et al., Biochem. J., Vol. 333 (1998), 17-25). Der PIII-Promotor liegt im Intron 5 des Gens und die Expression von diesem Promotors aus führt zur Bildung einer mRNA, deren Sequenz sich im 5'-Bereich (in den ersten 17 Aminosäuren) von der Sequenz aller anderen Accα mRNA-Sequenzen unterscheidet, da das dem PIII nachgeordnete Exon 5A nur bei Expression von diesem Promotor transkribiert wird. Von Exon 6 ab ist die Sequenz dieser mRNA identisch mit der Sequenz der übrigen Accα mRNA-Moleküle. Expression von dem PIII aus führt ferner zu einem Accα-Enzym, dessen Aminosäuresequenz 58 Aminosäuren kürzer als die übrigen Accα-Isoformen ist (die insgesamt 2347 Aminosäuren enthalten).

Von dem PIII-Promotor des Schafes sind jedoch bislang lediglich 350 bp bekannt, auf denen keine Bindungssequenzen für laktationsspezifische Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden. Über die Sequenzen, welche eine Milchdrüsen-spezifische Expression der Accα bei Nutztieren kontrollieren, ist fast nichts bekannt.

Insbesondere DNA-Sequenzen, die eine Expression der Accα beim wichtigsten Nutztier des Menschen, nämlich beim Rind, steuern, wurden ebenfalls im Stand der Technik noch nicht beschrieben. Die Sequenz könnte als Laktations-spezifischer, induzierbarer Promotor zur Expression von beliebigen Genen in der Milch von transgenen Säugetieren verwendet werden.

Die Verfügbarkeit dieser Sequenzen hätte ferner den Vorteil, daß der Fettgehalt der Milch gezielt verändert werden könnte. Die Reinigung rekombinanter Proteine aus der Milch transgener Kühe kann beispielsweise durch den hohen Fettgehalt der Milch sehr aufwendig sein. Ein weiterer Vorteil von Milch mit verringertem Milchfett-Gehalt wäre, daß sogenannte Magermilch aus entsprechenden Kühen gewonnen werden könnte, ohne daß das Milchfett zuvor entfernt werden müßte.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die DNA-Sequenzen aufweisen, welche für den Milchdrüsen-spezifischen Promotor der Accα und/oder das Strukturgen der Accα des Rindes kodieren.

Diese Aufgabe wurde nunmehr durch Nukleinsäuren gelöst, welche DNA-Sequenzen umfassen, die

a) die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz;
b) eine allelischen Variante davon; oder
c) eines Fragmentes der Sequenzen nach a) oder b)

aufweisen, wobei ein Fragment mindestens einen der Bereiche von Nukleotid 2188 bis 2219 oder 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1, den Bereich von Nukleotid 1 bis 441 der SEQ ID NO: 2 oder den entsprechenden Bereich einer allelischen Variante umfaßt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als "allelische Varianten" natürlicherweise auftretende Variationen der für die bovine Accα kodierende DNA-Sequenz oder der entsprechenden PIII-Promotorsequenz bezeichnet.

Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals Nukleinsäuren mit der Sequenz des Laktations-spezifischen Promotors der bovinen Accα (SEQ ID NO: 1) sowie der entsprechenden cDNA (SEQ 2D NO- 2) zur Verfügung gestellt. Diese Nukleinsäuren sowie bestimmte Fragmente davon können zur Expression von Fremdgenen in der Milchdrüse von Rindern und zur Genotypisierung von Rindern verwendet werden.

Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Erzeugung transgener, nicht-menschlicher Säugetiere, deren Milch einen verringerten Fettgehalt aufweist. Dafür werden die DNA-Sequenzen, die für den Milchdrüsen-spezifischen Promotor der Accα oder für das Accα-Strukturgen kodieren, im Genom von nicht-menschlichen, transgenen Säugetieren mindestens teilweise durch eine Sequenz ersetzt, die durch Deletion oder Substitution von einzelnen oder mehreren Nukleotiden so verändert wurde, daß die Expression der Accα in der Milchdrüse gehemmt wird.

Bei der Sequenzanalyse der SEQ ID NO: 1 wurde festgestellt, daß der PIII Promotor der bovinen Accα eine Hauptbindungssequenz (sogenannte "high affinity binding site") und 10 kooperative DNA-Bindungsdomänen (sogenannte "low affinity binding sites") für den Transkriptionsfaktor STAT5 aufweist (vgl. Übersichtsdarstellung 6A), wobei insbesondere der Bereich der Nukleotide 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 eine Häufung von mehreren STAT5-Bindungs sequenzen aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die STAT5-Bindungssequenzen für die Promotoreigenschaften des PIII der Accα wesentlich sind.

Als STATs ("signal transducers and activators of transcription") werden Transkriptionsfaktoren bezeichnet, die durch Interaktion mit bestimmten Zelloberflächenrezeptoren aktiviert werden und – als Folge dieser Aktivierung – in den Zellkern einwandern und an bestimmte DNA-Sequenzen binden können (James E. Darnell, Science, Vol. 277 (1997), 1630–1635). Die meisten STATs sind etwa 750 bis 795 Aminosäuren lang und benötigen den COOH-terminalen Bereich für die Genaktivierung.

STAT 5A wurde als Wachstumsfaktor der Milchdrüse isoliert, der an den β-Casein-Promotor bindet (Wakao et al., EMBO J., vol. 13 (1994), 2181–2191). STAT 5B weist eine Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 90% zu STAT 5A auf und konnte ebenfalls in der Milchdrüse nachgewiesen werden. Obwohl ein proximales Promotorelement des β-Caseingens der Ratte zum Nachweis von STAT5A-Aktivierung und DNA-Bindung verwendet wurde, war die Synthese von β-Casein in den STAT5A deletierten (sogenannten "knock-out"-) Mäusen möglich. Das saure Molkeprotein ("whey acidic protein") konnte jedoch in diesen Mäusen nicht mehr exprimiert werden. Die Bedeutung der STAT5-Bindungsstellen für die quantitative Regulation Laktations-spezifischer Expression der Gene ist daher von dem jeweiligen Gen abhängig.

Die DNA-Bindungsmotive für STAT5 Faktoren wurden kürzlich identifiziert. Eine Hauptbindungssequenz (TTCNNNGAA, die "highaffinity-site") wird von der zentralen DNA-bindenden Domäne der STAT5 Faktoren gebunden (Darnell, JR, J.E. Science 277 (1997) 1630–1635; Becker et al., Nature 394 (1998) 145–151). Halbseiten dieses Palindroms werden von der N-terminalen Domäne gebunden, der sogenannten "kooperativen DNA-Bindungsdomäne" ("low-affinitysites" ; Vinkemeier et al., EMBO J. 15 (1996) 5616–5626 ; Xu et al., Science 273 (1996) 794–797)).

Kurze Beschreibung der Figuren:

1 Sequenz des PIII-Promotors der bovinen Accα.

2 cDNA-Sequenz der von dem PIII-Promotor gebildeten Accα.

3 Aminosäure-Sequenz der von dem PIII-Promotor gebildeten Accα.

4 Vergleich der Aminosäure-Sequenz der von dem PIII-Promotor gebildeten Accα mit der von dem PI-Promotor gebildeten Accα.

5A Nachweis des PIII-Promotors im Genom; Restriktionspaltung von DNA des Klons 91, wobei die folgenden Enzyme verwendet wurden:
B, BamHI; D, DraI; E, EcoRI; Ev, EcoRV; H, HindIII; K, KpnI; P, PvuII; Sc, ScaI; St, StuI; X, XhoI.

5B Southern-Blot des Gels nach 5A, wobei als Sonde Exon 5A aus Klon 357 2 verwendet wurde.

6A Expression vom PIII-Promotor der bovinen Accα; Struktur der verwendeten Deletionsklone.

6B Expression vom PIII-Promotor der bovinen Accα; Expressionsfrequenz der Deletionsklone in stabil transfizierten HC-11 Zellen.

7 Genomische Anordnung der Accα Promotoren beim Rind.

8 Expression der Accα vom PIII- und PII-Promotor in verschiedenen Geweben; die folgenden Gewebe wurden eingesetzt:
M: Marker; 1: Leber; 2: Adipose Gewebe; 3: Niere; 4: Gehirn; 5: Muskel; 6: Lunge; 7: Mischdrüse, nichtlaktierend; 8: laktierende Milchdrüse; K: PCR Kontrolle (identischer Ansatz ohne RNA).

9 Verwendung des Mikrosatelliten zur Genotypisierung.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche DNA-Sequenzen umfassen, die

Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, die entsprechende Nukleinsäuren umfassen. Dabei sind Expressionsvektoren bevorzugt, die Nukleinsäuren umfasen, die den Bereich von Nukleotid 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 oder den Bereich von Nukleotid 1 bis 3445 der SEQ ID NO: 1 umfassen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, in denen die Nukleotide 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 oder 1 bis 3445 der SEQ ID NO: 1 operativ mit einem Strukturgen verknüpft sind. Als Strukturgen wird der Bereich eines Gens bezeichnet, der für ein Polypeptid kodiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können beliebige Strukturgene verwendet werden, wobei eine Verwendung von Fremdgenen (beliebigen Genen, die nicht für die natürliche Accα Sequenz kodieren) bevorzugt ist.

Diese Ausführungsform der Erfindung weist den besonderen Vorteil auf, daß beliebige Fremdgene unter der Kontolle des Laktations-spezifischen und induzierbaren Promotors der Accα exprimiert werden können.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die entsprechende Vektoren enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eukaryotische Zellen, wobei nicht-menschliche Säugetierzellen, insbesondere Milchdrüsenepithelzellen, besonders bevorzugt sind.

Die Vektoren können nach beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren in die Wirtszellen eingebracht werden. Beispielsweise kann die Liposomentechnik verwendet werden, wobei die Verwendung des LIPOFECTAMIN Reagentiensatzes der Firma GIBCO/BRL, entsprechend den Angaben des Herstellers, besonders bevorzugt ist.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner transgene nichtmenschliche Säugetiere, die Zellen aufweisen, die einen entsprechenden Vektor enthalten.

Entsprechende Verfahren zum Austausch von DNA-Sequenzen im Genom von Säugetierzellen sind als "gene targetting" bekannt und erlauben den Einbau von Sequenzen an bestimmte Stellen in das Genom von Säugetieren (Tybulewicz et al., Cell, Vol. 65 (1991), 1153–1163; Liu et al., Genes & Dev., Vol. 11 (1997), 179–186). Dabei ist auch der Genaustausch selektiv in ausgewählten Gewebetypen – und nur in diesem Gewebe – möglich (Kühn et al., Science, Vol. 269 (1995), 1427–1429).

Im wesentlichen beruhen diese Verfahren auf der Beobachtung, daß Gewebekulturzellen extern zugesetzte, gereinigte DNA im Austausch zu einem homologen, im Zellkern vorhandenen Genombereich, in ihr Genom aufnehmen. Dieser Prozess wird homologe Rekombination genannt. Bei Säugern erfolgt er spontan mit geringer Rate (ca. 10^–5 – 10^–6 Austauschereignisse/pro Zelle) in Differenzierungszuständen jenseits der Meiose.

Die Rekombination kann genutzt werden, um z.B. Deletionen oder Substitutionen einzelner oder mehrerer Nukleotide in einem Gen oder einem Promotor zu setzten. Dabei kann man beispielsweise ein größeres Stück (5–10 kbp) des Zielgenes isolieren, eine begrenzte Deletion einführen und dieses Konstrukt in Gewebekulturzellen des gleichen Organismus transfizieren.

Nach Rekombination kann auf Zellen selektiert werden, die das Konstrukt aufgenommen haben. Entsprechende Klone, in denen ein vollständiger Austausch tatsächlich erfolgt ist, werden beispielsweise durch Southern-Blot-Analysen verifiziert. Zellkerne mit verändertem Genom werden isoliert. Durch Klonierung können transgene Nutztiere erzeugt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird aus dem Bereich des PIII-Promoters der Accα ein 3 kbp umfassendes HindIII Fragment isoliert, welches das vollständige Exon 5A beherbergt für entsprechende Austauschklonierungen mit einem "gene-targetting"-Vektor geeignet ist. Die 5'-gelegene HindIII Restriktionsschnittstelle findet sich an Position 2960 der SEQ ID Nr 1. Die in diesem Abschnitt genannten DNA-Abschnitte stellen jedoch lediglich Beispiele dar. Basierend auf der vorliegenden Erfindung ist es ohne weiteres möglich beliebige andere Promotor- oder Genabschnitte zu isolieren, die für einen entsprechenden Austausch geeignet sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäure zur Expression von beliebigen Fremdgenen, wobei die DNA-Sequenz der Nukleinsäure die Nukleotide 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, die operativ mit einem Strukturgen verknüpft sind. Gemäß einer bevorzugten Abwandlung dieser Ausführungsform umfaßt die Nukleinsäure die Nukleotide 1 bis 3445 der SEQ ID NO: 1.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung zur Expression von Fremdgenen kann die Expression in eukaryotischen Zellen erfolgen, wobei die Expression in Zellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, insbesondere in der Milchdrüse, bevorzugt ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verfügung, mit denen transgene Rinder erzeugt werden können, deren Milch einen verringerten Fett-Gehalt aufweist. Bei diesen Verfahren verändert man die Sequenz des Milchdrüsenspezifischen Promotors der Accα oder des Accα-Strukturgens im Genom des transgenen nicht-menschlichen Säugetieres durch Deletion oder Substitution von einzelnen oder mehreren Nukleotiden so, daß die Expression der Accα in der Milchdrüse gehemmt wird, wobei das Verfahren Schritte umfaßt, bei denen man:

a) eine Nukleinsäure erstellt, welche eine DNA-Sequenz umfaßt, die durch Deletion oder Substitution von einzelnen oder mehreren Nukleotiden von der DNA-Sequenz des Milchdrüsen-spezifischen Promotors der Accα oder von der DNA-Sequenz des Accα-Strukturgens abgeleitet wurde;
b) die Zelle eines nicht-menschlichen Säugetiers mit der Nukleinsäure nach Stufe a) transfiziert;
c) Zellen, in denen die natürliche DNA-Sequenz im Genom durch die entsprechende Nukleinsäure nach Stufe a) ausgetauscht wude, auswählt und zu Tieren regeneriert.

Bei den Verfahren zur Erzeugung von transgenen Rindern, deren Milch einen verringerten Milchfett-Gehalt aufweist, sind Verfahren bevorzugt, bei denen die Sequenz des Milchdrüsenspezifischen Promotors der Accα die Sequenz von Nukleotid 1 bis 3054 der SEQ ID NO: 1 umfaßt. Die mindestens eine Substitution oder Deletion kann im Bereich von Nukleotid 2205 bis 2213 der SEQ ID NO: 1 vorgenommen werden, wobei Substitutionen oder Deletionen im Bereich von Nukleotid 2188 bis 2239 der SEQ ID NO: 1 bevorzugt sind. Diese Bereiche des Promotors der Accα weisen eine hohe Dichte an STAT5-Bindungssequenzen auf. Bereits die Deletion oder Substitution einzelner Nukleotide führt zu einer verringerten Laktations-spezifischen Expression der Accα. Aufgrund der konstitutiven Expression dieses Enzyms von dem PII-Promotor aus, erleiden die Tiere durch diese Veränderung des Genoms keine Nachteile.

Gemäß einer weiteren Ausführungsfom der Erfindung werden. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Rindern, deren Milch einen verringerten Milchfett-Gehalt aufweist, zur Verfügung gestellt, bei denen man mindestens eine Substitution oder Deletion im Bereich von Nukleotid 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1 vornimmt. Beispielsweise könnte in dem genannten Bereich ein Stop-Codon eingeführt werden. Alternativ dazu kann man den gesamten Bereich von Nukleotid 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1 deletieren. Bei den hier genannten Bereichen handelt es sich um DNA-Sequenzen, die nur in der von dem PIII-Promotor exprimierten cDNA vorliegen. Durch Veränderungen im Laktationsspezifischen Bereich der cDNA der Accα ist wiederum eine Verringerung der induzierbaren Accα-Expression möglich, die sich nicht negativ auf die Gesundheit und das Wohlbefinden der Tiere auswirkt.

Die Erfindung betrifft dementsprechend auch transgene nichtmenschliche Säugetiere, die nach einem der obigen Verfahren erzeugt wurden und deren Milch einen verringerten Milchfett- Gehalt aufweist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Gewinnung von Milch mit verringertem Milchfett-Gehalt zur Verfügung gestellt, bei dem man die entsprechenden transgenen, nicht-menschlichen Säugetiere verwendet.

Im Bereich der Nukleotide 933 bis 966 der SEQ ID NO: 1 wurde ein polymorpher Mikrosatellit identifiziert, der sich hervorragend zur Genotypisierung von Rindern eignet. Eine Genotypisierung von Rindern unter Verwendung dieser Sequenz weist den besonderen Vorteil auf, daß ein bestimmter Genotyp unmittelbar mit einer bestimmten Expressionsmenge der Accα während der Laktation und daher auch mit einem bestimmten Fettgehalt der Milch korreliert werden kann. Die Gewinnung einer Population von Rindern, die einen besonders hohen oder geringen Fettgehalt in der Milch aufweisen, ist daher auch durch klassische Zuchtverfahren möglich, indem solche Tiere miteinander gekreuzt werden, deren Genotyp auf eine entsprechende Aktivität des PIII-Promotors der Accα hinweist.

Die Analyse der DNA-Sequenz kann eine Amplifikation der DNA mittels PCR umfassen, wobei vorzugsweise Primer eingesetzt werden, die in der PCR Reaktion mit den DNA-Sequenzen des Rindes hybridisieren, welche die Nukleotide 933 bis 966 der SEQ ID NO: 1 flankieren. Gemäß einer beonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Form der Erfindung werden für die PCR die Primer:
AccmsP3f 5'-CATTTATCTGGCTTTGCATCTTAG und
AccmsP3r 5'-CAGGTGGTCACAAAGAGTCTG
verwendet.

Die Analyse der amplifizierten DNA-Sequenz kann nach beliebigen Verfahren aus dem Stand der Technik erfolgen, beispielsweise kann die Analyse der Sequenz mittels Gelelektrophorese des amplifizierten Fragmentes durchführt werden.

Beispiel 1
Materialien und Verfahren:
1.1 Klonierungen:
Alle Klonierungen wurden in handelsüblichen Vektoren vorgenommen. PCR Produkte wurden in den Vektor pKS+ (Stragene, LaJolla; USA) oder in den Vektor "pGEM Teasy" (Promega) kloniert. Expressionssequenzen für die Überprüfung der Promotoreigenschaften wurden in dem promotorlosen Vektor "pGL3 basic" (Promega) kloniert, der für das Reporter-Enzym Luciferase kodiert.
1.2 Sequenzierung:
Die Sequenzierungen wurden mit den Sequenzierungsanlagen 310 (Perkin-Elmer, ABI) oder Licor 4200 (MWG) durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden mit Reagetiensätzen durchgeführt, die von den Anbietern der Sequenzierungsanlagen empfohlen werden.
1.3 PCR-Amplifikationen:
Generell wurden "touch-down" Programme eingesetzt, entsprechen den Angaben von Don et al., 1991 (Nucl. Acids Res. vol. 19, 4008). Oligonukleotidprimer wurden grundsätzlich so gestaltet, daß ihre optimale Anlagerungstemperatur (AT) 60 °C betrug, abgeleitet entsprechend der Faustformel: 2°C für jede A oder T Base und 4°C für G oder C. Oligonukleotidprimer wurden von der Firma ARK (Darmstadt) synthetisiert.
In einem typischen Programmablauf wurde, ausgehend von 70°C Anlagerungstemperatur (AT), in jedem der ersten 20 Zyklen, die AT um 0,5°C je Zyklus abgesenkt. Sodann wurden 30 weitere Zyklen mit jeweils 60°C AT angeschlossen. Ein Programmzyklus beinhaltete: Denaturierung bei 94°C, 1 min, gefolgt von 0.5 min bei AT zur Primer-Anlagerung, sowie eine Elongationsdauer von 3 min bei 70°C.
1.4 RT-PCR:
Amplifikationen von mRNA Abschnitten wurden nach Überschreibung der RNA durch das Enzym "Reverse Transkriptase" (SuperScript, von GIBCO BRL) entsprechend den Angaben des Herstellers für diesen Reagentiensatz durchgeführt. Als Startermoleküle für die cDNA-Synthese wurden typischerweise 25 pM des Sequenz-spezifischen Primeroligonukleotids eingesetzt, für einen 25 μ1 Reaktionsansatz. Als Matrizen dienten gesamt RNA Proben der entsprechenden Gewebe, die mit Reagentiensätzen von QIAGEN zur RNA-Extraktion gewonnen wurden.
1.5 Expression von Reportergen-Konstrukten in Gewebekulturzellen:
Zur Überprüfung der Promotoreigenschaft von DNA-Fragmenten wurden Zellkulturen der murinen Milchdrüsenepithelzellinie HC-11 (Ball et al., EMBO J, Vol. 7 (1988), 2089–2095) stabil mit entsprechenden Reportergen-Konstrukten transfiziert. Von dieser permanenten Zellinie ist bekannt, daß sie auf die Gabe des Laktationshormons Prolaktin unter geeigneten Kulturbedingungen mit einer Steigerung der β-Caseinsynthese reagieren kann (Ball et al., 1988, am angegebenen Ort).
Die Zellen wurden entsprechend den Angaben von Welte et al. (Mol. Endo., Vol. 8, 1091–1102) in RPMI-1640 Medium gehalten, welchem 10% fötalem Kälberserum, 10 ng/ml EGF und 5μg/ml Insulin zugesetzt wurden. Für die stabile Transfektion dieser Zellen mit den entsprechenden Reportergen-Konstrukten wurde ein übliches Transfektionsverfahren verwendet, welches auf der Liposomentechnik basiert. Zur Transfektion wurde der LIPOFECTAMIN Reagentiensatz entsprechend den Angaben des Herstellers (GIBCO BRL) verwendet.
Typischerweise wurden zur Transfektion der Zellen einer Kulturschale mit 9 cm Durchmesser 4 μg des linearisierten Reportergen-Konstruktes mit 1 μg des linearisierten Plasmides pSV2neo als Selektionsmarker für das Antibiotikum G418 vermischt.
Die Technik der Kotransfektion von unabhängigen Reportergen-Konstrukten und diesem Selektionsmarker wurde von Southern & Berg beschrieben (J. Mol. Appl. Genet. vol. 1 (1982), 327-341).
Als Ergebnis einer solchen Transfektion wurden für jedes Reportergen-Kkonstrukt etwa 60–200 resistente Klone je transfizierter Kulturschale erhalten, die als Gruppe ("pool") gemeinsam aufgezogen wurden. Diese Gruppen wurden später auf die Expression der Reportergen-Konstrukte hin analysiert.
In Anlehnung an die Angaben von Welte et al. (a.a.O.) erfolgte die Analyse der Induzierbarkeit der Promotoren mittels Prolaktin durch einen Vergleich der Reportergen-Aktivität von Kulturen, die für zwei Tage konfluent im Wachstumsmedium gehalten wurden, mit der Aktivität von Kulturen, die für zwei Tage konfluent in einem Medium mit lediglich 5% FKS und ohne EGF, jedoch angreichert mit 0,1 μM Dexamethason und 5 μg/ml ovinem Prolaktin (SIGMA), gezogen worden waren.
Die Reportergen-Aktivität (Luciferase-Aktivität) wurde mit dem DUAL-LIGHT Reagentiensatz von Perkin-Elmer entsprechend den Angaben des Herstellers gemessen. Für die Bestimmung der Enzymaktivität wurde ein handelsübliches Luminometer (Firma BERTHOLD) eingesetzt. Die Enzymaktivität wird als Relative-Light-Units (RLU). angegeben. Die RLUs werden angegeben als 1000 RLUs je 10000 Zellen (vgl. 6A und B).
Beispiel 2
Isolierung der Milchdrüsen-Isoform der bovinen Accα cDNA:
A) Erstellung der Accα cDNA-Sequenz entsprechend der vom Promotor PI gebildeten mRNA:
Zur Erlangung von Informationen zur Gengstruktur der bovinen Accα wurde in Vorversuchen die von dem PI-Promotor aus gebildete cDNA-Sequenz isoliert.
Zunächst wurde durch den Sequenzvergleich der publizierten humanen und Hühnchen cDNA-Sequenzen konservierte Primersequenzen abgeleitet:
Acclf: 5'-GGTTATTTCAGTGTTGCTGCTG und
Acclr: 5'-AGCAGTCCACCGTCGCTCA.
Die Amplifikation eines 530bp langen cDNA Stückes der Accα des Rindes erfolgte in RT-PCR Amplifikationen unter Verwendung dieser Primer und von Gesamt-RNA aus Milchdrüsengewebe.
Das erhaltene cDNA Stück wurde subkloniert und sequenziert sowie als Hybridisierungssonde zur Isolation von genomischen Klonen aus einer- Rinder-Genbank eingesetzt. Diese Genbank war in dem Bakteriophagen λ-EMBL3 angelegt worden und bereits mehrfach zur Isolation von bovinen Genen eingesetzt worden (Kozcan et al., Nucl. Acids Res. Vol. 19, (1991), 5591–5596; Seyfert et al., Gene, Vol. 143 (1994), 265–269).
Mittels dieser Sonde wurden dann aus der genannten Genbank zwei λ-Phagen isoliert, die Teilstücke des bovinen Accα Genes trugen (Laborbezeichnung λ-Ac2 und λ-Ac3). Sie wurden genutzt, um erste Exons dieses Gens festzulegen. Wie sich später herausstellte, wurde hiermit Exon 9, das am weitesten im 5'-Bereich gelegene Exon des Gens isoliert. Von diesem Exon wurde nun ein nach 5'- gerichteter Primer abgeleitet und in Kombination mit einem, von der mittlerweile publizierten, ovinen cDNR-Sequenz der Accα abgeleiteten Primer von Exon 5 zur Isolation eines weiteren Teilstückes des bovinen Accα Genes eingesetzt. Unter Verwendung bovinen genomischer DNA als Matrize entstand in "long-span" PCR Experimenten ein 14 kbp Amplifikat, von dem nach Subklonierung und Sequenzierung die Sequenzen der Exons 6 –8 abgeleitet werden konnten.
B) Identifizierung der im 3'-Bereich gelegenen cDNA-Sequenzen:
Die Identifizierung der im 3'-Bereich gelegenen cDNA-Sequenzen erfolgte in RT-PCR Experimenten, wobei die Primer unter Rückgriff auf die cDNA-Sequenz des Schafes abgeleitet wurden.
Mit diesen Verfahren konnte der größte Teil der bovinen cDNA Sequenz der Accα wurde ermittelt werden. Durch Kenntnis der Exon/Intron-Segmentierung des Genes war es ferner möglich, zwei Primer abzuleiten, die das Exon 5 des Genes (253 bp) als singuläre Bande amplifizieren:
Acex5f 5'-CTCTGAGGGCTCGTTTZGAAG;
Acex5r: 5'-CTCATGTGTAAGGCCARACCAT).
Diese Primersequenzen wurden dazu verwendet, um aus einer bovinen genomischen BAC-Genbank (BAC, "bacterial artificial chromosome"; Beschreibung der Bank in Cai et al., Genomics, vol. 29 (1995), 413–425) einen BAC-Klon zu isolieren, der den 5'-Bereich des bovinen Accα Genes enthält. Dieser Klon erhielt die Laborbezeichnung "BRC91" und diente als Ausgangsmaterial zur Isolation des Promotors PIII, wie im folgenden dargestellt wird.
Durch Kenntnis der Exon /Intron Segmentierung im Bereich des Genanfanges konnten hochspezifische Primer ermittelt werden, die für aussagekräftige RT-PCR Experimente sehr hilfreich waren, basierend auf RNA Proben aus der Milchdrüse. Hierfür wurde nach 5'- gerichtete Primer:
Acex6–7r 5' -TGGCGATGAGAACCTTCTCAATC
verwendet, dessen eine Hälfte an Exon7 bindet (kursiv), während der restliche Bereich von Exon 6 kodiert wird. Dieser Primer bindet unter üblicher Stringenz der PCR-Reaktion nicht an genomische DNA. Die Verwendung dieses Primers in RT-PCR Experimenten verhindert die unbeabsichtigte Bindung an genomische DNA, was zu falschen Ergebnissen führen könnte.
C) Erstellung der Accα cDNA Sequenz entsprechend der von PIII synthetisierten mRNA (SEQ ID NO: 2; 2):
Zur Erstellung der cDNA-Sequenz ausgehend von Accα mRNA-Molekülen aus der laktierenden Milchdrüse, wurde eine Gesamt-RNA-Probe dieses Gewebes eingesetzt, um mit dem "MARATHON" 5'-RACE Kit (Reagentiensatz) der Firma CLONETECH cDNA Kopien in klonierter From zu erhalten. Der Reagentiensatz wurde entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet.
Dabei wurde ausgehend von 4 μg gesamt RNA aus Milchdrüsengewebe einer laktierenden Kuh und dem Accα spezifischen Primer Acex6–7r (Position 587–565 der cDNA-Sequenz; siehe oben) eine cDNA erstellt, mit dem genannten Reagentiensatz von CLONTECH doppelsträngig gemacht und an das 5'Ende der mitgelieferten "Adaptor"-Sequenz ligiert.
Anschließend wurde der 5'-Bereich der Accα cDNA in zwei PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primer Acex6–7r, als Accα spezifischem, nach 5'- gerichtetem Primer, sowie zunächst dem Adaptor-Primer 1, in einer ersten PCR-Amplifikationsrunde amplifiziert. Mit dem Adaptor-Primer 2 wurde in einer zweiten, "nested" PCR Amplifikationsrunde nochmals amplifiziert. Beide Adaptor-Primer sind in dem Reagentiensatz von CLONETECH enthalten.
Das knapp 600 bp lange PCR-Fragment dieser Amplifikationsrunde wurde gelelektrophoretisch auf gereinigt und mit dem Gen-spezifischen Primer Acex6–7r direkt sequenziert (ABI310). Von dieser Sequenz wurde ein weiter innenliegender, nach 5'- gerichteteter, "nested"-Primer abgeleitet:
bAc 5Ar1_5'-TCTCTTCAGCTGTCGTCGGCCTTG,
(entsprechend cDNA-Position 358–340). Dieser Primer wurde eingesetzt, um von 1 μ1-Restmenge des Reaktionsproduktes der ersten PCR-Runde und unter Verwendung des Adaptor-Primers 1 ein klonierbares PCR-Produkt zu erzeugen. Dies erbrachte Klone mit etwas unterschiedlicher Einsatzlänge.
Sequenzierung des Klones mit dem längsten cDNA Einsatz (357_2) erbrachte eine neue Sequenz von 358 bp, die nicht zur Leber-spezifischen Variante der bovinen Accα-cDNA gehörte. Den Beweis über die Zugehörigkeit der cDNA-Sequenz von Klon 357_2 zur bovinen Accα erbrachte eine RT-PCR, in der RNA aus der laktierenden Milchdrüse des Rindes zur cDNA-Synthese mit dem genannten Primer Acex6–7r amplifiziert wurde. In der nachfolgenden RT-PCR Reaktion wurde das Oligonukleotid:
bAc 5Af2_5'-AGGCGGAAGCTGCTGAGATCTAC,
(Position 34–56 der cDNA Sequenz, abgeleitet von der Sequenz des Klons 357_2) mit dem auf Exon 6 gelegenen Oligonukleotid:
bAc_Ex6rn 5'-CAAATTCTGCTGGAGAGGCTACA,
(Position 539–517 der cDNA-Sequenz, bekannt aus den Vorversuchen von der leberspezifischen Accα–cDNA Sequenz) kombiniert und zur Amplifikation eines 506 bp langen Fragmentes genutzt. Dieses Fragment wurde als Klon 392 kloniert und sequenziert.
Die Sequenzierungen von Klon 357_2 und 392 ergeben die beigefügte cDNA-Sequenz der bovinen Acetyl-CoA-Carboxylasea, wie sie in der Milchdrüse vorliegt (SEQ ID NO: 2; 2).
Die Sequenz der Reste 1–441 weicht deutlich von der Leberspezifischen Isoenzymform ab. Erst ab Position 442 der SEQ ID NO: 2 sind die Sequenzen identisch (entspricht Position 568 der Leber-spezifischen Isoenzymform). Translation dieser cDNA Sequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins wird in SEQ ID NO: 3 gezeigt (3; siehe auch vergleichende die Darstellung in 4).
Durch Vergleich dieser Sequenz mit den in den Vorversuchen ermittelten Teilsequenzen und der Accα-Genstruktur zeigt, daß der 5'-terminale, zur Leber-spezifischen cDNA divergierende Sequenzabschnitt ein eigenes Exon darstellt, welches an Exon 6 des den Strukturbereich des Genes kodierenden Abschnitt angespleißt wird.
Beispiel 3:
Isolatierung des Promotors III (PIII) der bovinen Accα:
3.1 Die Isolation des bovinen PIII der Accα wurde ausgehend von:

– zwei Oligonukleotidprimern die von der oben dargestellten cDNA-Sequenz abgeleitet wurden (bAc_5Ar1, siehe oben; bAc_5Ar2 [5'-CCACACAGC-ATCAGCTGATTTC, Position 132–111 der cDNA);
– dem in den Vorversuchen erwähnten Klon BAC91; und
– dem "Genome-Walker" Reagentiensatz von CLONETECH (entsprechend den Angaben des Herstellers eingesetzt); vorgenommen. Im Prinzip umfaßt das Isolationsverfahren die folgenden Schritte:
(i) der Zerschneidung der DNA des Gesamtgenoms oder von einem bereits isolierten Teilabschnitt des Genoms mit stumpf schneidenden Restriktionsendonukleasen;
(ii) Ligation von Adaptoren bekannter Sequenz an die doppelsträngigen DNA-Enden; sowie
(iii) der nachfolgenden PCR-Amplifikation des gesuchten Genomabschnittes, durch den Einsatz eines Genspezifischen Oligonukleotides, in Kombination mit einem an den Adaptor bindenden Oligonukleotid.

3.2 Detaillierter dargestellt, wurde der Promotor III in folgender Weise isolierte:
Die DNA des Klons BAC91 wurde vollständig mit dem Restiktionsenzym EcoRV gespalten. Die Adaptor-Oligonukletide aus dem Reagentiensatz wurden anligiert. In zwei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationsrunden wurde mit den Primerkombinationen (i) bAc_5Ar1 (Gen-spezifisch) und Adaptor-Primer 1 (Reagentiensatz) sowie (ii) bAc_5Ar2 (Gen-spezifischer "nested" Primer)/Adaptor-Primer 2 (Reagentiensatz, innenliegend im Vergleich zu Adaptor-Primer 1) ein 3.2 kbp langes PCR-Amplifikat erhalten.
Die Enden des PCR-Produktes wurden mit dem Klenow-Enzym vollständig aufgefüllt, das Produkt mit SalI gespalten (Schnittstelle im Adaptor-Primer 2), und in den SalI, kombiniert mit SmaI, gespaltenen Vektor pKS+ (STRATAGENE) einkloniert. So wurde Klon 364 erhalten.
Grundsätzlich könnte die Isolation des in Klon 364 enthaltenen bovinen Genombereiches mit diesem Verfahren auch unter Verwendung von einem DNA-Präparat des Geamtgenoms an Stelle von Klon BAC91 durchgeführt werden. Der Einsatz von BAC91 erhöht jedoch die Konzentration der Accα-spezifischen Genabschnitte um den Faktor 1000. Dies erleichterte die Vermehrung des gesuchten Genomabschnittes in den PCR-Reaktionen und vermied eine Analyse falscher Amplifikate.
Die vollständige Sequenzierung des Klons 364, basierend auf segmentweiser Subklonierung und unter Einsatz weiterer, anhand der Sequenzierungsergebnisse abgeleiteter Oligonukleotid-Primer führte zu der PIII-Promotorsequenz der Accα (Position 1-3186, SEQ ID NO: 1; 1). Das Sequenzende, von Postion 3187–3690, wurde durch Direktsequenzierung des BAC91 Klones erhalten, unter Verwendung des von der cDNA abgeleiteten Oligonukleotidprimers bAc_5Af2 (siehe oben).
Der Vergleich der Promoter- mit der cDNA-Sequenz zeigt, daß das Transkript, welches zu cDNA Klon 357_2 geführt hat, bei Position 3055 dieser Sequenz beginnt. Damit ist diese Position als +1 eines Exons ausgewiesen. Das Exon endet mit Position 3495, wie durch den Vergleich mit der cDNA-Sequenz ersichtlich und in Kombination mit der Tatsache, daß das nachfolgend stehende "GT"-Dinukleotid in aller Regel den 5'-Spleißdonor eines Introns darstellt. Das Startkodon "ATG" für die Eiweißsynthese des Enzymes Accα findet sich an Position 3443–3445.
3.3 Charakteristika der Sequenz:
Die Sequenz stellt einen Promotor ohne "TATA-Box" dar, weist jedoch eine Vielzahl von DNA-Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren auf.
Bei Position 2205 beginnt das Sequenzmotif TTCGTGGAA, welches eine Hauptbindungsstelle für den Transkriptionsfaktor STAT5 darstellt (vgl. 1).
Zwischen Position 932 und 967 liegt ein Mikrosatellit mit 18 Wiederholungen des Dinukleotids "TG". Dieser Mikrosatellit ist in unterschiedlichen Tieren polymorph, kann mit den Oligonukleotidprimern AccmsP3f(5'-CATTTATCTGGCTTTGCATCTTAG, Position 801–824) in Kombination mit AccmsP3r (5'-CAGGTGGT-CACAAAGAGTCTG, Position 998–978) zur Typisierung von in der Natur vorkommenden, allelischen Varianten dieses Promotors genutzt werden (vgl. Beispiel 6).
Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen zur Erstellung der Expressionsklone (siehe Beispiel 4):

EcoRV Schnittstelle (Position 1–6, Sequenz GATATC, Spaltung in GAT-3'/5'-ATC): Die ersten drei Nukleotide dieser Schnittstelle wurden ergänzt, denn die zur Erstellung von Klon 364 verwendete DNA des BAC91 war vollständig mit diesem Enzym gespalten worden. Genomisch ist eine Schnittstelle an dieser Position vorhanden, es werden jedoch die ersten drei Nukleotide durch den Schnitt der Restriktionsendonuklease verloren. Daher befindet sich diese Schnittstelle nicht mehr in Klon 364.
PvuII: An Position 3173 findet sich eine PvuII-Schnittstelle. Diese wurde genutzt, um aus Klon 364 den Promotorbereich bis Position 3172 auszuschneiden, in Kombination mit KpnI (5'-gelegene KpnI Schnittstelle in dem Klonierungsbereich des Vektors pKS+), und Einklonierung in den KpnI/SmaI gespaltenen Expressionsvektor pGL3 basic (PROMEGA). Dies erbrachte den in 6A dargestellten Expressionsklon 1 (Labornummer 397).
EcoRI: Bei Position 677 findet sich eine Schnittstelle für dieses Enzym. Zur Deletion der 5'gelegenen Promotoranteile wurde Klon 397 mit KpnI/EcoRI vollständig gespalten, die Überhänge mit Klenow-Enzym geglättet und der Vektor stumpf religiert. Dies erbrachte den dargestellten Expressionsklon 2 (vgl. 6A; Labornummer 422).
MstII. Die singuläre MstII Schnittstelle bei 2345 wurde zur Deletion der 5'-gelegenen Promotorabschnitte genutzt: Klon 397 wurde mit KpnI und MstII vollständig gespalten, die Überhänge mit Klenow-Enzym aufgefüllt und der Vektor stumpf religiert. Dies erbrachte den Expressionsklon 3 (vgl. 6A; Labornummer 423).

Genomische Anordnung des PIII in Relation zu anderen Exons der bovinen Accα:

"Long-span" PCR Amplifikationen (mit dem Reagentiensatz von ROCHE/BOEHRINGER, Primer AccEx5f und bAc 5Ar1 und BAC91 als Matrize) zeigten, daß PIII etwa 15 kbp 3'von Exon 5 gelegen ist. Der Promotorbereich liegt etwa 5,8 kbp 5' vor Exon 6, wie ebenfalls mittels "long-span" PCR Amplifikationen mit den Primern bAc-5Af2 und bAc_Ex6rn zeigten. In 6A ist die ungefähre genomische Anordnung der übrigen Promotoren der bovinen Accα dargestellt, sowie die Kenntnis bezüglich der anderen Exons in diesem Genabschnitt zusammengefaßt.

Beispiel 4:
Nachweis der Promotoreigenschaft von PIII:
Die Erstellung von Expressionskonstrukten mit dem Promotor PIII und zwei Deletionsvarianten (Expressionsklon 2 und 3; vgl. 6A;) wurde in Beispiel 3 dagestellt.
Diese Konstrukte wurden stabil in die murine Milchdrüsenepithelzellinie HC-11 transfiziert und jeweils als Gruppen von 60–100 Klonen aufgezogen. Jede dieser drei verschiedenen Gruppen stabil transfizierter Zellen wurde in sechs Kulturschalen ausgebracht (übliche Kulturplatten mit 6 Vertiefungen). Alle Zellkulturen wurden nach der Aussaat bis zur Konfluenz gezogen. Sodann wurde von jedem Konstrukt die Hälfte der Subkulturen (drei Schalen) für weitere sechs Tage in Wachstumsmedium (10% fötales Kälberserum) belassen. Die andere Hälfte wurde nach dem Erreichen der Konfluenz für zwei Tage in Hungermedium gehalten (ohne EGF, nur 5% fötales Kälberserum). Anschließend wurde ihnen für vier Tage Induktionsmedium (Hungermedium, mit Prolaktin (5μg/ml) und Dexamethason (0,1 μM) angereichert) gegeben. Die Expression des Reportergens in Abhängigkeit des verwendeten Expressionskonstruktes und des Mediums wird in 6B dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß

– das als PIII bezeichnete Genomfragment ein Promotor ist, weil seine Verwendung als Promotor die Bildung des Reporter-Enzymes in Milchdrüsenepithelzellen antreibt;
– das Laktationshormon Prolaktin die Aktivität dieses Promotors in diesen Milchdrüsenepithelzellen reguliert; und
– eine Deletion des 5'- Bereiches (bis zu der MstII Restriktionsschnittstelle) zu einem massiven Verlust der Promotoraktivität führt, was von einem Verlust der regulierenden Wirkung des Prolaktins begleitet ist.

Zur Einordnung und zum Vergleich der Ergebnisse der in 6B dargestellten Ergebnisse wurden diese Reportergen-Konstrukte auch transient in verschiedenen anderen Zellen geprüft und mit Reportergen-Konstrukten verglichen, die von PI angetrieben wurden. Es zeigte sich, daß

– PIII (Klon 397) in humanen Milchdrüsenepithelzellen (MCF7) etwa die 10-fache Stärke eines 2.9 kbp großen PI Promotorstückes hat (PIII Expression 25-fach über der des leeren Vektrors pGL3-Basic, in diesem Vergleich);
– PIII in humanen Leberzellen (HepRI) ebenfalls etwa die 10 fach Stärke von PI aufweist, in diesen Zellen – im Gegensatz zu den Milchdrüsenepithelzellen – jedoch: (i) weder eine Prolaktinwirkung nachweisbar ist und (ii) die Deletion des 5'-gelegenen Promotorbereiches (bis zur MstII Schnittstelle, was die STATS-Bindungsstelle einschließt) zu einer Steigerung der Expression führt (1,5-fach gegenüber dem langen Promotorfragment).

Auch die Beobachtung, daß die Deletion der STAT5 Ansatzstelle in Leberzellen zu einer Steigerung der Expression des Reportergen-Konstruktes führt, bestätigt daß STAT5, je nach Promotortyp, auch als Repressor der Transkription wirken kann (vgl. auch Luo, G. & Yu-Lee, L.-Y., J.Biol.Chem. Vol. 272 (1997), 26841–26849). Somit konnte gezeigt werden, daß in unterschiedlichen Zellzypen die gleiche STAT5 Bindungsstelle in Abhängigkeit von dem übrigen, zelltypspezifischen Besatz des Promotors mit anderen Transkriptionsfaktoren unterschiedlich wirken kann.
Beispiel 5
Nachweis der Gewebespezifität des Promotors:
Zur Untersuchung der gewebespezifischen Aktivitierung von PIII wurde RNA von unterschiedlichen Geweben des Rindes isoliert und in RT-PCR Experimenten vergleichend Accα Transkripte von zwei verschiedenen Promotoren, PII und PIII, dargestellt (8).
Zunächst wird die genomische Anordnung der unterschiedlichen Promotoren der Accα anhand von 7 erläutert. Der Leberspezifische Promotor PI liegt am weitesten im 5'-Bereich (d.h. am "Genanfang"). Die Aktivität dieses Promotors wird stark in Abhängigkeit von der Stoffwechsellage des Tieres reguliert.
In etwa 11 kbp Abstand findet sich beim Rind der konstitutiv exprimierte PII. Es besteht gegenwärtig noch eine gewisse Unsicherheit bezüglich der genauen Anordnung und Sequenz. Bisher wurde beim Rind sicher Exon 3 identifiziert, kloniert und sequenziert. Es umfaßt 47 bp. Im 5'angrenzenden Bereich von Exon 3 in etwa 1 kbp Entfernung befindet sich ein Sequenzmotif von 6 bp, welches in 5 unterschiedlichen 5'-RACE Klonen der bovinen Accα als 5'-terminale cDNA Basen gefunden wurden, -die mit einem nach 5'-gerichteten Oligonukleotid angeprimt wurden, dessen Sequenz von Exon 3 abgeleitet worden war. Es ist anzunehmen, daß diese 6 bp von dem vermutlich sehr kurzen Exon 2 herrühren. Jedoch ist ein Sequenzmotiv von sechs bp kein ausreichender Nachweis für ein Exon. Um diese Unsicherheit darzulegen, wird Exon2 in 7 besonders gekennzeichnet (*) und der Abstand zu Exon 3 als nicht gesichert bezeichnet. Aus dieser Unsicherheit heraus wurde dem von Exon 3 abgeleitete Oligonukleotid die Laborbezeichnung bAc_xf (5'-TCCTCGGAGATGCTTAGTGAC) gegeben, dessen Bezeichnung der Nachvollziehbarkeit wegen hier beibehalten wird. Bezüglich der Anordung und Sequenzen der übrigen Exons bestehen keine Unsicherheiten.
Die Bedeutung des PII und der Darstellung des Exons 3 liegt darin, daß sich der Nachweis der Transkripte, die von diesem konstitutiv aktiven Promotor gebildet werden, als aussagekräftige positiv-Kontrollen zum Nachweis von Accα-Transkripten eignen.
Für das in 8 dargestellte Experiment wurde RNA aus 8 unterschiedlichen Geweben entnommen und jeweils eine einzelsträngige Accα cDNA mit dem Primer bAc_Ex6rn erzeugt. von diesen Proben wurden jeweils zwei identische PCR-Ansätze erstellt, wobei zur PCR Amplifikation entweder der nach 3'gerichteten Primer bAc_5Af2 (8) oder der von Exon 3 abgeleiteten Primer bAc_xf verwendet wurde. PCR-Produkte wurden mit dem "Touch-down" Standardprogramm erzeugt und Gel-elektrophoretisch aufgetrennt.
Die in 8 verwendeten Abkürzungen weisen auf die folgenden Gewebe hin, die für die PCR eingesetzt wurden:
1: Leber; 2: Adipose Gewebe; 3: Niere; 4: Gehirn; 5: Muskel;
6: Lunge; 7: Mischdrüse, nicht-laktierend; 8: laktierende Milchdrüse; K: PCR Kontrolle (identischer Ansatz ohne RNA).
Im Ergebnis zeigt sich:

1. Der Promotor PIII treibt die Bildung eines einheitlichen Transkriptes an, während von PII 2 Typen von Transkripten gebildet werden. Klonierung und Sequenzierung zeigte, daß sich diese beiden Transkripte durch Gegenwart oder Abwesenheit von Exon 4 unterscheiden. Die durch Sequenzierung gefundene Exon-Zusammensetzung der Transkripte ist angegeben.
2. Die PIII-Aktivität ist gewebespezifisch. Reine Transkripte finden sich in Gehirn und Muskel. Bedingt durch die Durchführung der Experimente mittels RT-PCR lassen die in 8 dargestellten Experimente keine Aussage über unterschiedliche Transkriptmengen zu. Sofern auch nur Spuren von Transkriptmengen vorhanden sind, werden sie mit dieser Technik und unter den gewählten Bedingungen als kräftige Bande in der Gelelktrophorese dargestellt.
3. In allen Geweben wird durch die Aktivität des Promotors PII Accα gebildet. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Befunden von der Ratte.

Diese Ergebnisse belegen, daß die Aktivität des PIII Promotors ganz oder teilweise gehemmt werden kann, ohne daß solche Tiere dadurch lebensunfähig werden, weil diese aufgrund der Aktivität von PII zur Accα Bildung befähigt sind. Die lebensnotwendige Grundausstattung der Zellen mit diesem Enzyme ist somit gewährleistet.
Beispiel 6
Einsatz des TG18-Mikrosatelliten im Bereich des PIII zur Genotypisierung:
Der in der Sequenz des PIII im Beispiel 3 (1; SEQ ID NO: 1) identifizierte Mikrosatellit ist polymorph und kann daher zur Genotypisierung eingesetzt werden.
Die DNA von acht Zuchtbullen wurde mit den Primern AccMSP3f und AccMSP3r in PCR Reaktionen amplifiziert. Dabei zeigten sich wenigstens drei unterschiedliche Allele (vgl. 9).
Basierend auf der in Beispiel 3 gezeigten DNA-Sequenz des PIII-Promotors lassen sich somit Oligonukleotidprimer ableiten, durch deren Einsatz allelische Varianten von PIII in der Zuchtpopulation von Rindern nachgewiesen werden können. Durch Korrelation verschiedener Allele mit Leistungsparametern im Milchfettgehalt können natürlich vorkommende Leistungsvarianten des Promtors aufgedeckt und züchterisch nutzbar gemacht werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäure, welche eine DNA-Sequenz umfaßt, die a) die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz; b) eine allelischen Variante davon; oder c) eines Fragmentes der Sequenzen nach a) oder b) aufweist, wobei das Fragment mindestens einen der Bereiche von Nukleotid 2188 bis 2219 oder 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1, den Bereich von Nukleotid 1 bis 441 der SEQ ID NO: 2 oder den entsprechenden Bereich einer allelischen Variante umfaßt.
Vektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfaßt.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure umfaßt, die den Bereich von Nukleotid 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure den Bereich von Nukleotid 1 bis 3445 der SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotide der SEQ ID NO: 1 in dem Vektor operativ mit einem Strukturgen verknüpft sind.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen ein Fremdgen ist.
Wirtszelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 6 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zelle eines nicht-menschlichen Säugetiers handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Milchdrüsenepithelzelle handelt.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß es Zellen nach Anspruch 9 aufweist.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Rind handelt.
Verwendung einer Nukleinsäure zur Expression von Fremdgenen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz der Nukleinsäure die Nukleotide 2188 bis 2219 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, die operativ mit einem Strukturgen verknüpft sind.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure die Nukleotide 1 bis 3445 der SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression in eukaryotischen Zellen erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression in Zellen eines nicht-menschlichen Säugetiers erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet daß die Expression in der Milchdrüse eine nicht-menschlichen Säugetiers erfolgt.
Verfahren zur Erzeugung von transgenen Rindern, deren Milch einen verringerten Milchfett-Gehalt aufweist, bei dem man die DNA-Sequenz des Milchdrüsen-spezifischen Promotors der Accα oder die DNA-Sequenz des Accα-Strukturgens im Genom der nichtmenschlichen transgenen Säugetiere mindestens teilweise durch eine Sequenz ersetzt, die durch Deletion oder Substitution von einzelnen oder mehreren Nukleotiden so verändert wurde, daß die Expression der Accα in der Milchdrüse gehemmt wird, wobei das Verfahren Schritte umfaßt, bei dem man a) eine Nukleinsäure erstellt, welche eine DNA-Sequenz umfaßt, die durch Deletion oder Substitution von einzelnen oder mehreren Nukleotiden von der DNA-Sequenz des Milchdrüsen-spezifischen Promotors der Accα oder von der DNA-Sequenz des Accα-Strukturgens abgeleitet wurde; b) die Zelle eines nicht-menschlichen Säugetiers mit der Nukleinsäure nach Stufe a) transfiziert; c) Zellen, in denen die natürliche DNA-Sequenz im Genom durch die entsprechende Nukleinsäure nach Stufe a) ausgetauscht wude, auswählt und zu Tieren regeneriert.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die Sequenz des Milchdrüsen-spezifischen Promotors der Accα die Sequenz von Nukleotid 1 bis 3054 der SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem man mindestens eine Substitution oder Deletion im Bereich Nukleotid 2205 bis 2213 der SEQ ID NO: 1 vornimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem man mindestens eine Substitution oder Deletion im Bereich von Nukleotid 2188 bis 2239 der SEQ ID NO: 1 vornimmt.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem man mindestens eine Substitution oder Deletion im Bereich Nukleotid 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1 vornimmt.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem man den gesamten Bereich von Nukleotid 3055 bis 3495 der SEQ ID NO: 1 deletiert.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, dadurch gekennzeichnet daß es nach einem Verfahren der Ansprüche 18 bis 23 erzeugt wurde.
Verfahren zur Gewinnung von Milch mit verringertem Milchfett-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, daß dabei transgene nichtmenschliche Säugetiere nach Anspruch 24 verwendet werden.