DE60126307T2 - Marker-unterstützte auswahl von rindvieh für verbesserte milchproduktion unter verwendung des diacylglycerin-acyltransferase-gens dgat1 - Google Patents

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Description

  • Erfindungsgebiet
  • Diese Erfindung betrifft die Anwendung einer markierungsunterstützten Auswahl eines Rinds für eine mit der Milchherstellung verbundene, quantitative Wesenszugstelle (QTL), insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, durch Prüfen des Vorhandenseins von mindestens einem Allel, das mit einer erhöhten Milchmenge und auch mit einer verbesserten Milchzusammensetzung verbunden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Gen, das mit der QTL verbunden ist, ferner verschiedene Polymorphismen in der Gensequenz, durch diese Gensequenz kodierte Proteine und auch die Anwendung all dieser Aspekte in der Landwirtschaft.
  • Erfindungshintergrund
  • Die genetische Basis der Kuhmilcherzeugung ist von großer Bedeutung für die Milchindustrie. Die Fähigkeit zur Beeinflussung der Milchmengen und Milchzusammensetzung vermag die landwirtschaftliche Tätigkeit zu ändern und Produkte zu erzeugen, die an eine Reihe von Erfordernissen angepasst sind. Insbesondere ist ein Verfahren erwünscht, das das Rind genetisch bewertet, um solche Rinder auszuwählen, die wünschenswerte Wesenszüge (Merkmale), wie eine erhöhte Milcherzeugung und eine verbesserte Milchzusammensetzung, aufweisen.
  • Die Rindergenealogie wird zur Zeit hinsichtlich solcher Gene wenig verstanden und ist wenig bekannt, die für die Milcherzeugung kritisch sind. Obwohl es Berichte über quantitative Wesenszugstellen (QTLs) auf dem Rinderchromosom 14 gegeben hat, von dem angenommen wird, dass es mit der Milcherzeugung verbunden ist, sind die entsprechenden, spezifischen Gene bisher nicht identifiziert worden (Coppieters et al., 1998).
  • Die markierungsunterstützte Auswahl, die die Fähigkeit vorsieht, einem besonders günstigen, genetischen Allel zu folgen, umfasst die Identifizierung einer molekularen DNA-Markierung oder solcher Markierungen, die mit einem Gen oder einer Gengruppe, die mit einem QTL verbunden ist, abgeschieden wird bzw. werden. Die DNA-Markierungen weisen verschiedene Vorteile auf. Sie sind relativ leicht zu messen und sind unzweideutig und da die DNA-Markierungen kodominant sind, können heterozygote und homozygote Tiere klar identifiziert werden. Wenn ein Markierungssystem aufgestellt ist, können die Auswahlentscheidungen sehr leicht getroffen werden, weil die DNA-Markierungen jederzeit ausgewertet werden, nachdem eine die DNA enthaltende Probe von einem individuellen, nicht erwachsenen oder erwachsenen Tier oder sogar früher abgenommen worden ist, da es möglih ist, Embryonen in vitro zu prüfen, wenn solche Embryonen abgesammelt werden.
  • Die Anmelder haben nun ein Gen, das für die QTL-Wirkung auf dem Rinderchromosom 14 verantwortlich ist, und eine Anzahl von Polymorphismen identifiziert, die mit bestimmten, genetischen Werten der Tiere für die Milchmenge und -zusammensetzung verbunden sind.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Anwendung der markierungsunterstützten Auswahl dieses Rindergens, ins besondere der Polymorphismen im Rindergen, zu schaffen, das mit einer erhöhten Milchmenge und geänderten Milchzusammensetzung verbunden ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, genetische Markierungen für die Verwendung in diesem Verfahren zu schaffen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Nukleinsäuresequenz und eine Aminosäuresequenz dieses Gens und kodierte Polypeptide zu schaffen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ausgewählte Tiere, bei denen das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, und Milch vorzusehen, die durch die ausgewählten Tiere erzeugt wird. Ferner soll der Öffentlichkeit eine nützliche Auswahl geboten werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Entdeckung des Rinder-Diazylglyzerol-o-Akyltransferase-Gens (Rinder-DGAT-Gen) und Polymorphismen im Rinder-DGAT1-Gen, wobei dieses Gen und die Polymorphismen mit einer erhöhten Milchmenge und geänderten Milchzusammensetzung verbunden sind.
  • Genauer gesagt sind mehrere Polymorphismen im Rinder-DGAT1-Gen identifiziert worden, wobei viele DGAT1-Allele in verschiedenen Viehzüchtungen unterschieden werden. Diese Polymorphismen umfassen: K232A (Basen 6829/30 AA-CG-Nukleinsäureabweichung und K-A-Aminosäureabweichung); Nt984+8 (Base 7438 A-G-Nukleinsäureabweichung); Nt984+26 (Base 7456 C-T-Nukleinsäureabweichung); Nt1470+85 (Base 8402 C-T-Nukleinsäureabweichung); Nt191+435 (Base 626 T-G-Nukleinsäureabweichung); Nt191-3321 (Base 3512 T-G-Nukleinsäureabweichung); Nt279+144 (Base 4040 T-C-Nukleinsäureabweichung); Nt279+1067 (Base 4963 A-G-Nukleinsäureabweichung); Nt279+1107 (Base 5003 G-A-Nukleinsäureabweichung); Nt358 (Base 5997 C-T-Nukleinsäureabweichung); Nt754+3 (Base 6892 G-A-Nukleinsäureabweichung); Nt897+32 (Base 7224/5 GG-AC-Nukleinsäureabweichung); Nt1251+42 (Base 7987 G-A-Nukleinsäureabweichung); diese Polymorphismen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Insbesondere sind die durch die K232A-Mutation gekennzeichneten DGAT1-Allele derart identifiziert worden, dass sie mit einer erhöhten Milchmenge und einer geänderten Milchzusammensetzung bei Tieren in Abhängigkeit davon verbunden sind, ob sie homozygot mit oder ohne die Mutation oder ob sie heterozygot sind, wobei sie ein mutiertes Allel aufweisen. Insbesondere ergibt die Anwesenheit der K232A-Mutation eine Abnahme des Milchfettprozentsatzes, des Milchfettertrags, des Festfettgehalts und des Milchproteinprozentsatzes, während die Milchmenge und der Michproteinertrag ansteigen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Polymorphismen bei einem Verfahren zur Identifizierung und Auswahl eines Rinds, das mindestens eines der Polymorphismen aufweist, als auch die Schaffung von Markierungen, die für diese Indentifizierung spezifische sind. Ausrüstungen mit solchen Markierungen für die Verwendung in der Markierungsauswahl bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Insbesondere ist die vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zur Festlegung des Genotyps von Kühen oder Stieren für in Bezug auf einen oder mehrere der hier offenbarten Polymorphismen ausgewählte, so im Genotyp festgelegte Kühe oder Stiere bzw. auf die Milch und den Samen der ausgewählten Kühe und Stiere gerichtet.
  • Gemäß einer weiteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist die Erfindung auf eine isolierte DGAT1-Nukleinsäure und auf allele Nukleinsäuremoleküle gerichtet, die Polymorphismen enthalten, sowie auf die dabei kodierten Proteine und deren Polypeptidsequenzen gerichtet. Antikörper gegen diese Proteine, ebenso die die Nukleinsäuremoleküle enthaltenden Vektoren, die in diesen Vektoren ausgedrückten Proteinmoleküle und die Anwendung all dieser Elemente in der Landwirtschaft sind auch in Betracht gezogen worden.
  • Insbesondere umfassen diese Anwendungen Verfahren zum Einstellen der Milcherzeugung und/oder der Milchzusammensetzung eines milchabgebenden Rinds durch Beeinflussung der DGAT1-Aktivität und durch Verminderung der DGAT1-Aktivität (beispielsweise durch Verwendung besonderer Ribozymen, Antisequenzen und/oder Antikörper oder durch die transgene Technologie, um ein „Knock-out"-Rind und/oder ein Rind mit eingeführten Transgenen, die diese DGAT1-Gene enthalten, und/oder Variationen dieser Gene zu schaffen, die durch verschiedene Promotoren angeregt werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wird nun anhand der Figuren in den beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
  • 1 eine BAC-Contig (durchgehende DNA-Sequenz), die das BULGE13-BULGE09-Interval umfasst, das sich auf ein schematisches Diagramm des Rinderchromosomens 14 und auf ein schematisches Diagramm bezieht, das die Stelle der genetischen Markierungen zeigt; die wahrscheinlichste Position der QTL ist als Querstrich auf dem herausgezogenen Verbindungsplan in der Nähe von BTA14q gezeigt. Die BACs (Bacterial Artificial Chromosomes = bakterielle, synthetische Chromosomen), aus denen die Contigs zusammengesetzt sind, die das BULGE13-BULGE09-Interval umfassen, sind als Reihe horizontaler Linien gezeigt; die Symbole auf jedem BAC zeigen ihren individuellen STS-Gehalt an: volle Kreise entsprechen den STS (Sequence-Tagged Site = Genomabschnitt), die von den BAC-Enden abgeleitet sind, leere Kästchen entsprechen Mikrosatellitmarkierungen, und volle Dreieke entsprechen genspezifischen „Comparative Anchores Tagged Sequences" (verankerten, angehängten Vergleichssequenzen); die Pfeilspitzen markieren die BACs, von denen die entsprechenden BAC-Enden-STS abgeleitet wurden; die Linienlänge geben nicht die aktuelle Einfügungsgröße der entsprechenden BACs wieder; die BAC-Contig wurde mit der orthologen, menschlichen HSA8q24.3-genomischen „Golden-Path"- Sequenz (Goldwegsequenz) ausgerichtet, die gemäß dem Server für die Gesamtheit der menschlichen Genome („Ensemble Human Gemome Server") (http.//www.ensembl.org/) dargestellt werden; individuelle Sequenz-Contigs sind abwechselnd hell und dunkel gezeigt; eine horizontale Linie zeigt eine Lücke in der Sequenzanordnung an; Genmarkierungen sind unter dem Contigplan angegeben; Linien und -Kästchen über dem Contigplan stellen „geheilte", „vorhergesagt bekannte" oder „vorhergesagt neue" Gene dar;
  • 2a und 2b die Genomsequenz des Rinder-DGAT1-Gens; 2a ist die 31-Basenpaar-Sequenz, die stromaufwärts, aber neben der ATG oder Translationsstartstelle angeordnet ist und 5'UTR ist; 2b ist die Genomsequenz im Rinder-DGAT1-Gen von der ATG-Translationsstartstelle (Basis 1) durch zur Genomsequenz, die an das 3'Ende angrenzt; bedeutsame Merkmale, die Intron- bzw. Exongrenzen, polymophe Stellen, ein Polyadenylationssignal, eine wechselständige Spleißstelle und einige der Primersequenzen umfassen, die in den hier beschriebenen Prüfungen verwendet werden, sind angegeben;
  • 3 die Genomorganisation, vier Polymorphismen und Haplotypen, die im Rinder-DGAT1-Gen gefunden werden; vorn und hinten angeordnete Sequenzen sind in hellem Grau, Kodiersequenzen in dunklem Grau und Intronsequenzen als helle Linie gezeigt; die Positionen von vier der identifizierten Polymorphismen sind wie gezeigt am Gen markiert und in den unterlegten Kästchen detailliert angegeben, die die entsprechenden Sequenzfolgen umfassen; alle Sequenzvariationen sind in der Tabelle 1 zusammengefasst; die vier DGAT1-Haplotypen, die in der Holland-, Neuseeland- und Holstein-Friesen-Population, wie sie durch diese Polymorphismen definiert werden, gefunden wurden, sind gezeigt und werden als „sHQ-D", „sHQ-NZ", „sHQ-III" für die fetterhöhenden Haplotypen und „shq" für den fettvermindernden Haplotyp bezeichnet;
  • 4a in voller Länge die entsprechende Aminosäuresequenz für die DGAT1-Sequenz der 2b, die die Anmerkung des Aminosäureersatzes einschließt;
  • 4b die Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der wechselständigen Spleißung mit dem Exon VIII vorausgesagt wird;
  • 5 die Ausrichtung der multiplen Peptide eines Teils des DGAT1-Proteins, die an den K232A-Ersatz bon Bos taurus, Bison bison, Ovis aries, Sus scrofa, Homo sapiens, Cercopithecus aetiops, Mus musculus domesticus und Rattus norvegicus anschließt, der die evolutionäre Konservierung des im Rinder-K232A-Polymorphismus mutierten Lysins zeigt;
  • 6 A die Frequenzverteilung der betrachteten DGAT1-SNP-Haplotypen in der Holland-, Neuseeland- und Holstein-Friesland-Milchviehpopulation; B-D zeigen die Frequenzverteilung der kombinierten Mikrosatelliten-(BULGE09-BULGE11) und SNP-DGAT1-Haplotypen; ferner sind die HQ-D- und HQ-NZ-Haplotypen gezeigt, und
  • 7 die LOD-Kerbe aufgrund der LD, wenn sie die in 3 gezeigten, vier Polymorphismen in einem Verfahren zur Darstellung eines kombinierten Verbindungs- und LD-Vielfachpunkt-Maximalwahrscheinlichkeitsplans einschließt (+) oder ausschließt (–); die LOD-Kerbe entspricht dem log10 des Verhältnisses der Wahrscheinlichkeit der Daten, die die die LD und die Verbindung zwischen den Markierungen annehmen, zur Wahrscheinlichkeit der Daten, die die Verbindung bei der Abwesenheit der LD annehmen. Die Positionen der Mikrosatelliten und der bei der Analyse verwendeten SNP-Markierungen sind auf der X-Achse gezeigt, während die Position der DGAT1-SNPs durch einen roten Pfeil im Figurenkopf markiert ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Es ist zunächst entdeckt worden, dass das DGAT1-Gen des Rinds mit der QTL auf dem Chromosomen 14 verbunden ist, das mit der verbesserten Milcherzeugungswesenzügen verbunden ist. Genauer gesagt sind eine Anzahl von neuen Polymorphismen auf dem DGAT1-Gen entdeckt worden. Wahrscheinlich sind ein oder mehrere dieser Polymorphismen für diese Wesenszüge verantwortlich.
  • Das Verfahren zur Isolierung der Gene, die spezifische Phänotypen verursachen, ist als positionelles Kandidatenklonen bekannt. Das Verfahren umfasst: (i) die Chromosomenlokalisierung des Gens, das den spezifischen Phänotyp verursacht, wobei Genmarkierungen in einer Verbindungsanalyse verwendet werden, und (ii) das Identifizieren des Gens, das den spezifischen Phänotyp unter denjenigen „Kandidaten"-Genen verursacht, von denen bekannt ist, dass sie sich im entsprechenden Bereich befinden. Meistens werden diese Kandidatengene aus der verfügbaren Planinformation von Menschen und Mäusen ausgewählt.
  • Die erforderlichen Arbeitsmittel zur Durchführung der Anfangslokalisierung, nämlich den obigen Schritt (i), sind Mikrosatelitmarkierungspläne, die für Lebendinventararten verfügbar und im öffentliche Schrifttum vorhanden sind (Bishop et al., 1994; Barendse et al., 1994; Georges et al., 1995; Kappes, 1997). Die erforderlichen Arbeitsmittel für das Positionskandidatenklonen, insbesondere die BAC-Bibliotheken, zur Durchführung des obigen Schritts (ii) sind teilweise aus dem öffentlichen Schrifttum verfügbar. Die Genombibliotheken mit großen Einfügungen, die aus den „bakteriellen, synthetischen Chromosomen" (BAC) aufgebaut sind, sind im öffentlichen Schrifttum für die meisten Lebendinventararten einschließlich des Viehs verfügbar. Die generellen Prinzipien des Positionskandidatenklonens sind von Collins, 1995, und Anderson, 1996, beschrieben worden.
  • Jüngst ist eine quantitative Wesenszugstelle (QTL) mit der Hauptwirkung auf die Milchfeststoffzusammensetzung, wobei die QTL am zentromeren Ende des Rinderchromosomens 14 lokalisiert ist, berichtet worden (Coppie ters et al., 1998). Diese QTL wurde gezeigt, um den Milchfettgehalt und insbesondere den Proteinanteil, die Menge, den Proteinertrag und den Fettertrag der Milch zu beeinflussen. Die Verbindungsstudie und auch die folgenden, markierungsunterstützten Spaltungsanalysen erlaubten das Identifizieren von dreizehn Holstein-Friesland-Säugevatertieren in Bezug auf die Vorhersage, dass sie heterozygot „Qq" für die entsprechende QTL ist (Coppieters et al., 1998; Riquet et al., 1999).
  • Das Verbindungsgleichgewichtsstörungsverfahren wurde angewendet, um die Planposition der QTL auf ein etwa 5cM-Intervall zu verbessern, das durch die Mikrosatellitenmarkierungen BULGE09 und BULGE30 begrenzt ist BULGE = Wulst).
  • Eine Rinder-DGAT1-Nukleotidsequenz wurde von den Anmeldern bestimmt und ist in den 2a und 2b mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen (lange und kurze Formen) gezeigt, die in 4a bzw in 4b dargestellt sind. Die Tabelle 1 gibt alle Polymorphismen wieder, die derart lokalisiert sind, dass sie auf die Sequenzen in 2b zurückgehen. Einige der im Rinder-DGAT1-Gen identifizierten Polymorphismen sind in 3 wiedergegeben. Die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der DGAT1-Allele, die die K232A-Mutation einschließen, sind in den 2a und 2b gezeigt (SEQ-ID-Nrn. 3 und 1), um mit den Erläuterungen alternative Spleißformen zu zeigen. Die cDNA-Sequenz ist ebenfalls in der SEQ-ID- Nr. 4 enthalten.
  • Die Sequenzinformation in den Figuren führt zu zahlreichen, getrennten Aspekten der Erfindung.
  • Gemäß einem Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der genetischen Vorzüge eines Rinds in Bezug auf die Milchzusammensetzung und die Milchmenge, wobei das Verfahren den Schritt der Feststellung der Beschaffenheit des Rinder-DGAT1-Genotyps des genannten Rinds aufweist. Insbesondere ist dieses Verfahren für die Genotypisierung und die Auswahl von Kühen und Stieren nützlich, die die gewünschte Genotypbeschaffenheit aufweisen, so dass Milch und Samen von den genannten Kü hen bzw. Stieren gewonnen werden können. Dieser Samen würde zu Züchtungszwecken nützlich sein, um Rinder zu züchten, die die gewünschte Genotypbeschaffenheit und damit Phänotypbeschaffenheit aufweisen. Ferner sind Kühe, deren Genotyp durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt ist, auch zu Züchtungszwecken nützlich, insbesondere zur Züchtung mit ausgewählten Stieren, und/oder um mit dem Samen von ausgewählten Stieren künstlich besamt zu werden. Die von diesen Kühen abstammenden Embryonen und Nachkommen bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Bei einer Ausführung wird die Genotypbeschaffenheit in Bezug auf die DNA festgestellt, die von diesem Rind stammt.
  • Bei einer weiteren Ausführung wird die Genotypbeschaffenheit in Bezug auf die mRNA festgestellt, die von diesem Rind stammt.
  • Bei einer weiteren Ausführung wird die Genotypbeschaffenheit in Bezug auf die Aminosäuresequenz des ausgedrückten Rinder-DGAT1-Proteins festgestellt, die von diesem Rind stammt.
  • Je nach Wunsch wird bei dem genannten Verfahren die Genotypbeschaffenheit der DNA-kodierten Rinder-DGAT1 direkt oder indirekt festgestellt.
  • Alternativ wird bei dem genannten Verfahren die Genotypbeschaffenheit von mindestens einer Nukleotiddifferenz von der das Rinder-DGAT1 kodierenden Nukleotidsequenz direkt oder indirekt festgestellt.
  • Genauer gesagt wird bei dem genannten Verfahren die Genotypbeschaffenheit des Rinder-DGAT1-Allels bzw. der Rinder-DGAT1-Allele durch einen oder mehrere der in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Polymorphismen direkt oder indirekt gekennzeichnet. Tabelle 1 Tabelle der Polymorphismen im Rinder-DGAT1-Gen
    Figure 00110001
    • Die Nummern sind für die aktuellen Nukleotide oder im Fall von zwei Nukleotidsubstitutionen für das erste Nukleotid in der Variation (Zählweise von 5' nach 3') angegeben.
    • * Weitere Einzelheiten dieser Polymorphismen sind in 2 angegeben.
    • 1 Beispielsweise stellt Nt 191 die Nukleotidnummer 191 von der Startstelle der Kodiersequenz dar; +435 stellt die Nummer der Nukleotide von der Base 192 (einschließlich) in der Genomsequenz (Intron 1) zum polymorphen Nukleotid dar; die polymorphen Nukleotide sind schraffiert.
  • Vorzugsweise ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Feststellung der Genotypbeschaffenheit des Rinder-DGAT1-Allels bzw. der Allele durch direkte oder indirekte Feststellung des Vorhandenseins des K232A-Polymorphismus gerichtet.
  • Es gibt zahlreiche Standardverfahren für die Feststellung, ob eine besondere DNA-Sequenz in einer Probe vorhanden ist. Ein Beispiel ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Eine bevorzugte, weitere Ausbildung des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst einen Schritt, bei dem festgestellt wird, ob ein oder mehrere Polymorphismen in der Sequenz der DGAT1-DNA vorhanden sind; dazu wird die DNA in Gegenwart von Primern, die auf der Nukleotidsequenz des DGAT1-Gens und der flankierenden Sequenz beruhen, und/oder in Gegenwart eines Primers, der mindestens einen Teil eines hier offenbarten Polymorphismus enthält und der bei Vorhandensein eine geänderte, relative Milchlipid- und -protein-Produktion und Milchmenge verursacht, verstärkt.
  • Ein beispielsweise bei der PCR verwendeter Primer gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, das ausreichend komplementär zu derjenigen Sequenz, auf die es beruht, und ausreichend lang ist, um den entsprechenden Teil eines Nukleinsäuremoleküls selektiv zu hybridisieren, der verstärkt werden soll und unter in-vitro-Bedingungen, die üblicherweise bei der PCR verwendet werden, synthetisiert wird. In gleicher Weise ist ein Sensor der vorliegenden Erfindung ein Molekül, beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül genügender Länge und genügender Komplementärität zu dem hier interessierenden Nukleinsäuremolekül, wobei das Molekül sich unter hohen oder niedrigen Strengebedingungen an die hier interessierende Nukleinsäuresequenz zur Erkennung dieser in Gegenwart von Nukleinsäuremoleküle bindet, die unterschiedliche Sequenzen aufweisen.
  • Gemäß einer weiteren Ausbildung der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der genetischen Besonderheit des Rinds hinsichtlich der Milchmenge und -zusammensetzung in Bezug auf eine Probe desjenigen Materials vorgesehen, das die vom Rind gewonnene mRNA aufweist. Dieses Verfahren umfasst die Feststellung, ob ein oder mehrere Polymorphismen in der Sequenz der die DGAT1 kodierenden mRNA vorhanden sind. Das Vorhandensein solcher Polymorphismen zeigt wieder eine Verbindung mit einer geänderten, relativen Milchlipid- und -protein-Produktion und Milchmenge an.
  • Wenn wieder ein Verstärkungsverfahren, beispielsweise die PCR, bei der Feststellung verwendet wird, ob ein oder mehrere Polymorphismen in der Sequenz der die DGAT1 kodierenden mRNA vorhanden ist, umfasst das Verfahren das reverse Transskribieren der mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase, um eine cDNA zu erzeugen und dann die cDNA in Gegenwart eines Primerpaars zu verstärken, das komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, das ein Protein kodiert, das die biologische Aktivität einer Wildtyp-DGAT1 aufweist.
  • Gemäß einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird ein Sensor bei den Verfahren zur Genotypisierung verwendet, wobei die Sensor aus fünf oder mehr angrenzenden Nukleotiden der DGAT1-Sequenz ausgewählt ist, wie in 2b gezeigt ist, die damit genügend komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz, die dieses Rinder-DGAT1 kodiert, oder zum Komplement dieser Nukleinsäuresequenz ist, um sich daran unter strengen Bedingungen zu binden. Diagnostikausrüstungen, die einen solchen Sensor enthalten, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Diese Sensoren können aus ForAA (FAM): CGTTGGCCTTCTTA oder DgatADGC (VIC): TTGGCCGCCTTACC (SEQ-ID-Nr. 20 bzw. 21) ausgewählt werden.
  • Die Erfindung umfasst ferner isolierte Nukleinsäuremoleküle, die die DGAT1-Variantenproteine kodieren, nämlich diejenigen Proteine, die durch die SEQ-ID-Nrn. 1 und 4 (2b) kodiert werden, die ein oder mehrere Polymorphismen der SEQ-ID-Nrn. 7-19 (Tabelle 1) oder ein Bruchstück oder eine Variante davon enthaften. Insbesondere unfasst die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein DNA-Molekül aufweist, das ganz oder teilweise aus der in 2b aufgeführten Nukleotidsequenz besteht oder das von der Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes abweicht, oder einen Nukleinsäurestrang aufweist, der mit dem genannten Nukleinsäuremolekül unter strengen Hybridisierungsbedingungen hybridisiert werden kann.
  • Die Erfindung umfasst eine isolierte mRNA, die von einer DNA mit einer Sequenz transkribiert ist, die einem Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung entspricht.
  • Die Erfindung umfasst eine isolierte DNA in einem rekombinanten Klonvektor und eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die die heterologe DNA gemäß der Erfindung enthält und ausdrückt.
  • Die Erfindung umfasst eine transfekte Zelllinie, die ein Protein ausdrückt, das durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung kodiert wird.
  • Die Erfindung umfasst auch eine Primerzusammensetzung, die zur Feststellung der Anwesenheit von einem oder mehreren Polymorphismen, die mit verbesserten Milcherzeugungswesenszügen in der die DGAT1 kodierenden Rinder-DNA verbunden sind, und/oder der Anwesenheit einer DNA nützlich ist, ein Variantenprotein kodiert. Bei einer Form kann die Primerzusammenstellung einen Nukleinsäureprimer aufweisen, der im Wesentlichen komplementär zu einer die Nukleinsäuresequenz kodierenden DGAT1 ist. Die Nukleinsäuresequenz kann ganz oder teilweise die in 2b dargestellte sein. Diagnostikausrüstungen mit einer solchen Primerzusammensetzung sind ebenfalls eingeschlossen.
  • Die Erfindung umfasst ferner eine Diagnostikausrüstung zur Feststellung einer DNA, die ein Varianten-DGAT1-Protein im Rind kodiert, wobei diese Ausrüstung einen ersten Primer und einen zweiten Primer zur Verstärkung der DNA aufweist, die beide komplementär zu Nukleotidsequenzen der DNA in Stromaufwärtsrichtung bzw. Stromabwärtsrichtung von einem Polymorphismus in demjenigen Teil der die DNA kodierenden DGAT1 ist, die ein geändertes, relatives Milchlipid, eine geänderte Festfettgehalt- und Proteinerzeugung und eine geänderte Milchmenge ergibt, wobei mindestens eine der Nukleotidsequenzen aus einem nicht kodierenden Bereich des DGAT1-Gens ausgewählt ist. Die Diagnostikausrüstung kann auch einen dritten Primer aufweisen, der komplementär zu einem hier offenbarten Polymorphismus ist, der sich auf dem DGAT1-Gen befindet.
  • Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins gemäß der Erfindung, wobei dieses Verfahren folgende Schritte aufweist: ein DNA-Bruchstück wird präpariert, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die das Protein kodiert; das DNA-Bruchstück wird in einen Expressionsvektor gebracht, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu gewinnen, das das DNA-Bruchstück enthält und das sich der Replikation unterziehen kann; eine Wirtszelle wird mit dem rekombinanten DNA-Molekül umgewandelt, um ein Umwandlungsmittel zu erzeugen, das das Protein ausdrücken kann; das Umwandlungsmittel wird kultiviert, um das Protein zu erzeugen, und das Protein wird aus der sich ergebenden Kulturmischung wiedergewonnen.
  • In dieser Weise sieht die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ein gereinigtes Protein vor, das durch das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kodiert wird und das die biologische Aktivität der DGAT1 aufweist. Die Begriffe „isoliert" und „gereinigt" werden hier derart benutzt, dass sie sich jeweils auf ein Protein beziehen, das im Wesentlichen frei von Zellmaterial oder Kulturmedium ist, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken oder chemische Vorstufen oder andere Chemikalien, wenn diese chemisch synthetisiert werden, erzeugt wird. Bei bestimmten, bevorzugten Ausführungen enthält das die biologische Aktivität der DGAT1 aufweisende Protein eine Aminosäuresequenz und deren Varianten, die in den 4a und 4b gezeigt sind (SEQ-ID-Nrn. 2, 5 und 6). Ferner werden Proteine von der Erfindung erfasst, die die biologische Aktivität der DGAT1 aufweisen, die von Nukleinsäuren kodiert wird, die unter strengen Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisieren, die eine in 2b (SEQ-ID-Nrn. 1 und 4) gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
  • Eine DGAT1-Aktivität aufweisende Proteine gemäß der Erfindung können durch Expression der Nukleinsäurekodiersequenzen in einer geeigneten Wirtszelle unter Verwendung von bekannten Techniken gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen umfassen prokariontische oder eukaryontische Organismen oder Zelllinien, beispielsweise Hefepilze, E. coli, Insektenzellen und COS1-Zellen. Die rekombinanten Expressionsvektoren gemäß der Erfindung können dazu verwendet werden, ein Protein auszudrücken, das eine DGAT1-Aktivität in einer Wirtszelle aufweist, um das Protein zu isolieren. Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Präparieren eines gereinigten Proteins gemäß der Erfindung vor, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst: eine das Protein kodierende, rekombinante Nukleinsäure wird in eine Wirtszelle eingeführt; dem Protein wird die Expression in der Wirtszelle erlaubt, und das Protein wird isoliert und gereinigt. Vorzugsweise ist die rekombinante Nukleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor. Die Proteine können von einer das Protein ausdrückenden Wirtszelle durch bekannte Standardprozeduren isoliert und gereinigt werden, die eine Ammoniumsulfatausfällung, eine Säulenchromatographie (beispielsweise Ionenaustausch, Gelfilterung, Affinitätschromatographie usw.), eine Eltrophorese und schließlich eine Kristallisation umfassen (s. generell „Enzyme Purification and Related Techniques", Methodes, in Enzymology, 22, 233-577, 1971).
  • Alternativ kann das Protein oder können Proteinteile durch eine chemische Synthese präpariert werden, wobei in der Chemieindustrie bekannte Techniken verwendet werden, oder es können Proteine präpariert werden, indem die Festphasensynthese (Merrifield, 1964) oder die Synthese in einer homogenen Lösung (Houbenwcyl, 1987) verwendet wird.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass eine Vielfalt von Substitutionen der Aminosäuren möglich ist, wobei die Struktur, die für die Aktivität der hier offenbarten DGAT1-Proteine verantwortlich ist, erhalten bleibt. Konservative Substitutionen sind in der Patentliteratur beschrieben, beispielsweise Im US-Patent 5 264 558 oder 5 487 983. Es wird daher beispielsweise erwartet, dass der Austausch zwischen nichtpolaren, alipathischen, neutralen Aminosäuren, Glyzin, Alanin, Prolin, Valin und Isoleuzin möglich ist. In gleicher Weise können möglicherweise Substitutionen zwischen polaren, alipathischen, neutralen Aminosäuren, Serin, Threonin, Methionin, Asparagin und Glutamin erfolgen. Substitutionen zwischen den geladenen, sauren Aminosäuren, Asparinsäure und Glutaminsäure, können wahrscheinlich erfolgen; ebenso können Substitutionen zwischen geladenen, basischen Aminosäuren, Lysin und Arginin, erfolgen. Substitutionen zwischen den aromati schen Aminosäuren, die Phenylanalin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin umfassen, sind wahrscheinlich auch möglich. Diese Substitutions- und Austauscharten sind dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Weitere Substitutionen sind gut möglich. Es wird ferner erwartet, dass, je größer der Prozentsatz der Homologie, d.h. der Sequenzähnlichkeit, eines Variantenproteins mit einem natürlich auftretenden Protein ist, desto größer die Retention der Aktivität ist.
  • Ein weiterer Vorteil kann durch monströse Formen der Proteine erhalten werden, wie an sich bekannt ist. Eine DNA-Sequenz, die jedes ganze Protein kodiert, oder ein Proteinteil kann beispielsweise mit einer Sequenz verbunden werden, die ein C-Anschlussteil der E.-coli-β-Galaktosidase kodiert, um ein Fusionsprotein zu erzeugen.
  • Die Proteine gemäß der Erfindung oder Proteinteile finden wiederum zahlreiche Anwendung. Beispielsweise kann jedes Protein dazu verwende werden, Anikörper zu bilden, die sich an ein bestimmtes Epitop in einem unkonservierten Proteinbereich bindet. Ein unkonservierter Proteinbereich ist ein Bereich, in dem keine wesentliche Sequenzhomologie zu anderen Proteinen besteht.
  • Die Erfindung umfasst ferner einen Antikörper gegen ein Rinder-DGAT1-Variantenprotein, das durch eine Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird, und eine Diagnostikausrüstung mit einem derartigen Antikörper.
  • Übliche Verfahren können für die Bildung der Antikörper verwendet werden. Wenn beispielsweise ein DGAT1-Peptid verwendet wird, können polyklonale Antisera oder monoklonale Antikörper gebildet werden, wobei Standardverfahren verwendet werden. Ein Säugetier (beispielsweise eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen) kann mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden, das eine Antikörperantwort im Säugetier hervorlockt. Techniken, die einem Peptid eine Immunogenizität verleihen, umfassen die Verschmelzung mit den Keimträgern, oder es werden andere, bekannte Verfahren verwendet. Beispielsweise kann das Peptid in Anwesen heit eines Unterstützungsmittels behandelt werden. Der Vorgang der Immunisierung kann durch Feststellen von Antikörpertitern in Plasma oder Serum verfolgt werden. Das Standard-ELISA-Verfahren oder ein anderes Immunbestimmungsverfahren kann verwendet werden, um die Antikörpermengen festzustellen. Nach der Immunisierung können Antisera gewonnen werden, und, falls erwünscht, können polyklonale Antikörper gewonnen werden, die von den Sera isoliert sind.
  • Um monokloale Antikörper zu erzeugen, können die Antikörper erzeugenden Zellen (Lymphozyten) von einem immunisierten Tier abgenommen und mit Myelomzellen mittels somatischer Zellverschmelzungsstandardverfahren vereinigt werden, wobei diese Zellen unsterblich gemacht und Hybridzellen gebildet werden. Diese Techniken sind allgemein bekannt, beispielsweise die Hybridtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (Kohler, 1975) entwickelt wurde, und auch andere Techniken, beispielsweise die menschliche B-Zellen-Hybridtechnik (Kozbor, 1983) und das Durchforschen von kombinatorischen Antikörperverzeichnissen (Huse, 1989). Die Hybridzellen können immunochemisch auf die Erzeugung von Antikörpern, die in besonderer Weise auf die Peptide reagieren, und von isolierten, monoklonalen Antikörpern durchsucht werden.
  • Der hier verwendete Begriff „Antikörper" soll auch Antikörperbruchstücke umfassen, die ebenfalls auf das Zielprotein besonders reagieren. Die Antikörper können in Bruchstücke dadurch zerlegt werden, dass übliche Techniken verwendet und die Bruchstücke auf die Benutzbarkeit in derselben Weise, wie es vorstehend für ganze Antikörper beschrieben wurde, durchsucht werden. Beispielsweise können F(ab')2-Bruchstücke durch Behandlung der Antikörper mit Pepsin erzeugt werden. Die sich ergebenden F(ab)2-Bruchstücke können behandelt werden, um Disulfidbrücken zu vermindern und damit Fab'-Bruchstücke zu erzeugen.
  • Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung besonderer Antikörper oder Antikörperbruchstücke, die auf die Zielproteine reagieren, besteht darin, dass die Expressionsverzeichnisse auf kodierende Immunoglobin-Gene oder deren Teile durchsucht werden, die in Bakterien ausgedrückt sind, mit Peptiden, die aus den Nukleinsäuremolekülen gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Beispielsweise können vollständige Fab-Bruchstücke, VH-Bereiche und FV-Bereiche in Bakterien ausgedrückt werden, wobei Phagenexpressionsverzeichnisse verwendet werden, s. beispielsweise Ward et al., Huse et al. und McCafferty et al. (Ward, 1989), Huse 1989 und McCafferty, 1990. Das Durchsuchen derartiger Verzeichnisse auf beispielsweise ein DGAT1-Protein kann Immunoglobin-Bruchstücke ergeben, die mit dem DGAT1 reagieren. Alternativ kann die von Genpharm entwickelte SCID-hu-Maus verwendet werden, um Antikörper oder Antikörperbruchstücke zu erzeugen.
  • Die polyklonalen, monoklonalen oder unausführbaren, monoklonalen Antikörper können verwendet werden, um die Proteine gemäß der Erfindung, die Proteinteile oder nah verwandte Isoformen in verschiedenen, biologischen Mateialien festzustellen. Beispielsweise können sie bei ELISA-Prüfungen, radioimmunologischen Versuchen oder histochemischen Prüfungen verwendet werden. Daher können die Antikörper dazu verwendet werden, die Menge und den Ort eines DGAT1-Proteins gemäß der Erfindung, Teile davon oder nah verwandte Isoformen in einer Probe quantitativ zu erfassen, um die Rolle der DGAT1-Proteine festzustellen. Wenn die vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden, können die polyklonalen, monoklonalen Antikörper oder die unausführbaren monoklonalen Antikörper in nicht konservierte Bereiche der DGAT1 gelangen und dazu verwendet werden, ein besonderes DGAT1 von anderen Proteinen zu unterscheiden.
  • Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper können mit einer feststellbaren Substanz oder einem Mitteilungssystem gekoppelt werden. Der Begriff „gekoppelt" soll derart verstanden werden, dass die feststellbare Substanz mit dem Antikörper physikalisch verbunden ist. Geeignete, feststellbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende, lumineszierende und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme sind Meerrettichperoxidase, Alkaliphosphatase, β-Galaktosidase und Azetylcholinesterase; Beispiele geeigneter, prosthetischer Gruppenkomplexe sind Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele geeigneter, fluoreszierender Materialien sind Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiozyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszin, Dansylchlorid und Phykoerythrin; ein Beispiel eines Lumineszenzmaterials ist Luminol; Beispiele für geeignete, radioaktive Materialen sind 125I, 131I, 35S und 3H. Bei einer bevorzugten Ausführung erlaubt das Mitteilungssystem eine Quantisierung der Menge des vorhandenen Proteins (Antigens).
  • Ein derartiges mit dem Antikörper verbundenes Mitteilungssystem kann bei einem Verfahren zur Feststellung verwendet werden, ob eine Fluid- oder Gewebeprobe eines Rinds eine ungenügende Menge oder eine exzessive Menge des relevanten DGAT1-Proteins aufweist. Wenn eine normale Schwellwertkonzentration eines solchen Proteins vorgegeben ist, können Prüfausrüstungen entwickelt werden.
  • Die Verfügbarkeit solcher Antikörper gibt für weitere Anwendungen Anlass. Eine Anwendung besteht in einer Diagnostikausrüstung zum Identifizieren von Zellen, wobei diese Ausrüstung einen Antikörper (beispielsweise einen monoklonalen Antikörper), der sich an ein Protein bindet, das eine in den 4a und 4b gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, ferner Feststellmittel zur Feststellung des an das Protein gebundenen Antikörpers, des nicht reaktiven Ptroteins oder des nicht gebundenen Proteins und schließlich Vergleichsmittel zum Vergleichen der Proteinmenge in der Probe mit einer Standardmenge umfasst. Bei einigen Ausführungen der Erfindung wird die Feststellfähigkeit des Antikörpers, das sich an ein besonderes DGAT1-Protein bindet, durch die Bindung aktiviert (beispielsweise durch die Änderung des Fluoreszenzspektrums, den Verlust des Radioisotopenetiketts). Die Diagnostikausrüstung kann auch eine Bedienungsanleitung zur Bedienung der Ausrüstung enthalten.
  • Auf Antikörper basierende Diagnostiken sind jedoch nicht die einzige Möglichkeit. Eine weitere Diagnostikausrüstung weist einen Nukleotidsensor, der zu der in den 2a und 2b gezeigten Sequenz oder einem oligonukleotiden Bruchstück dieser Sequenz beispielsweise zur Hybridisierung mit der mRNA einer Zellprobe komplementär ist, und Feststellmittel zur Feststellung des an die mRNA in der Probe gebundenen Nukleotidsensors gegenüber einem Standard auf. Gemäß einer besonderen Ausbildung weist die Ausrüstung gemäß der Erfindung einen Sensor auf, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das genügend komplementär zu einer in den 2a und 2b gezeigten Sequenz oder deren Komplement ist, so dass dieses Molekül an diese Sequenz unter strengen Bedingungen gebunden wird. Der Begriff „strenge Hybridisierungsbedingungen" hat für den Fachmann die allgemein bekannte Bedeutung. Geeignete Strengebedingungen, die die Nukleinsäurehybridisierung fördern, beispielsweise 6x-Natriumchlorid/Natriumzitrat (SSC) bei etwa 45°C, sind dem Fachmann allgemein bekannt und in den „Current Protocols" in „Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY, 1989, veröffentlicht worden. Geeignete Waschstrengebedingungen hängen vom Homologiegrad und der Sensorlänge ab. Wenn die Homologie 100% beträgt, kann eine hohe Temperatur (65-75°C) verwendet werden. Wenn die Homologie niedrig ist, müssen niedrigere Waschtemperaturen verwendet werden. Wenn der Sensor jedoch sehr kurz (< 100bp) ist, muss die Waschtemperatur sogar bei einer Homologie von 100% niedriger sein. Im Allgemeinen wird das Waschen bei einer niedrigen Temperatur (37-40°C) begonnen, und dann wird die Temperatur um 3-5°C-Intervalle erhöht, bis der Hintergrund niedrig genug ist, dass er keinen Hauptfaktor bei der Autoradiografie bildet. Die Diagnostikausrüstung kann auch eine Bedienungsanleitung zur Bedienung der Ausrüstung enthalten.
  • Eine der Hauptanwendungen der vorliegenden Erfindung ist in der markierungsunterstützten Auswahl der Rinder zu sehen, die einen Polymorphismus im DGAT1-Gen aufweisen und die mit verbesserten Milcherzeugungswesenszügen verbunden sind. Die Erfindung sieht deshalb eine Diagnostikausrüstung vor, die dazu verwendet werden kann, den DGAT1-Genotyp des genetischen Materials des Rinds beispielsweise festzustellen. Eine Ausrüstung weist einen Satz aus Primern auf, der zur Verstärkung des Genmaterials verwendet wird. Eine Ausrüstung kann einen Primer aufweisen, der eine Nukleotidsequenz zur Verstärkung eines Bereichs des Genmaterials umfasst, der einen der hier beschriebenen Polymorphismen enthält. Eine derartige Ausrüstung kann auch einen Primer zur Verstärkung des entsprechenden Bereichs des normalen DGAT1-Gens, d.h. die Sequenz ohne die Polymorphismen, aufweisen. Üblicherweise umfasst eine derartige Ausrüs tung auch einen weiteren Primer in Stromaufwärtsrichtung oder Stromabwärtsrichtung vom interessierenden Bereich, der zu einem kodierenden und/oder nicht kodierenden Teil des Gens komplementär ist. Diese Primer werden dazu verwendet, das die interessierende Mutation, d.h. den Polymorphismus, enthaltende Segment zu verstärken.
  • Insbesondere ist die Erfindung auf die Verwendung der Polymorphismen im DGAT1-Gen beim Genotypisieren von Kühen und Stieren als auch auf Kühe und Stiere selbst gerichtet, die durch dieses Genotypisieren ausgewählt werden und einen oder mehrere der genannten Polymorphismen im DGAT1-Gen aufweisen. Die derart ausgewählten Stiere sind wertvolles Zuchtgut, und die Erfindung ist auch auf den Samen gerichtet, der von diesen ausgewählten Stieren für Zuchtzwecke erzeugt werden. Die derart ausgewählten Kühe und deren Abkömmlinge sind als Zuchtgut ebenfalls wertvoll. Ferner können diese Kühe wertvolle Milchkuhherden erzeugen, da die durch diese Kühe erzeugte Milch in größeren Mengen als bei äquivalenten, nicht ausgewählten Kühen erzeugt wird und/oder eine geänderte Zusammensetzung insoweit aufweist, als sie weniger Milchfett und mehr Milchprotein enthält. Es sei auch darauf hingewiesen, dass die Milch dieser ausgewählten Kühe insofern wertvoll ist, als der Fettgehalt nicht nur vermindert, sondern auch milder ist. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, wird geglaubt, dass diese erhöhte Fettmilderung auf der Fettsäurezusammensetzung beruht, die derart beschaffen ist, dass es weniger gesättigte und mehr ungesättigte Fettsäuren in der Milch der ausgewählten Kühe gibt. Damit ist zu erwarten, dass aus dieser Milch hergestellte Produkte Herstellungsvorteile, beispielsweise in Bezug auf die Erzeugung von besser streichbarer Butter, und auch einen Gesundheitsvorteil für die Verbraucher aufweisen, weil generell ungesättigte Fettsäuren für gesünder als gesättigte Fettsäuren gehalten werden. Die Proteinzusammensetzung der durch die ausgewählten Kühe erzeugten Milch wird ebenfalls geändert. Insbesondere weist diese Milch im Vergleich zu nicht ausgewählten Kühen einen geänderten Proteinertrag auf, und das Kasein-Molke-Verhältnis wird ebenfalls geändert, wodurch diese Milch für die Käseherstellung wertvoll ist.
  • Damit umfasst die vorliegende Erfindung das Genotypisieren von Rindern, sowohl von Kühen als auch von Stieren, in Bezug auf die hier offenbarten DGAT1-Polymorphismen.
  • Das aktuelle Genotypisieren wird dadurch ausgeführt, dass Primer verwendet werden, die auf die besonderen, hier beschriebenen Polymorphismen zielen und die als allelspezifische Oligonukleotide bei der üblichen Hybridisierung, bei der Taqman-Analyse, der OLA-Analyse usw., arbeiten. Alternativ können die Primer derart ausgebildet sein, dass sie das Genotypisieren mittels einer Ablaufsteuerung erlauben.
  • Eine Ausrüstung der Primer kann einen ersten Primer (a), einen zweiten Primer (b) und einen dritten Primer (c) enthalten. Der Primer (a) beruht auf einem Bereich, der eine DGAT1-Mutation enthält, wie sie oben beschrieben ist. Der Primer (b) kodiert einen Bereich in Aufwärtsrichtung oder in Abwärtsrichtung von dem durch den Primer (a) zu verstärkenden Bereich, so dass das die Mutation enthaltende, genetische Material, beispielsweise durch die PCR, in Gegenwart der beiden Primer verstärkt wird. Der Primer (c) beruht auf dem Bereich, der demjenigen entspricht, auf dem der Primer (a) basiert, dem aber die Mutation fehlt. So wird das genetische Material, das den nicht mutierten Bereich enthält, in Gegenwart der Primer (b) und (c) verstärkt. Dasjenige genetische Material, das homozygot für das mutierte Gen ist, sieht damit verstärkte Produkte in Gegenwart der Primer (a) und (b) vor. Das heterozygote, genetische Material schafft in beiden Fällen verstärkte Produkte.
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt auch die Modulierung der Milcherzeugung und des Milchgehalts in nicht menschlichen Tieren durch Modulierung der DGAT1-Proteinaktivität. Insbesondere weist dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Modulieren der Milcherzeugung und/oder des Milchgehalts in einem milchgebenden Rind auf, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: dem Rind wird eine wirksame Menge eines Nukleinsäuremoleküls zugeführt, das im Wesentlichen zu mindestens einem Teil der mRNA komplementär ist, die die Rinder-DGAT1-Variantenproteine kodiert und die eine genügende Länge aufweisen, um die Expression der ge nannten DGAT1, d.h. durch Verwendung von Gegensinn-Nukleinsäuren, genügend zu vermindern.
  • Gegensinn-Nukleinsäuren oder Oligonukleotide (RNA oder vorzugsweise DNA) können dazu verwendet werden, die DGAT1-Produktion in einem Rind zu verhindern, wenn dies als wünschenswert gehalten wird, beispielsweise um ein Rind mit verbesserter Milchproduktion, d.h. mit erhöhter Milchmenge und vermindertem Milchfettgehalt, zu produzieren. Gegensinn-Oligonukleotide, die typischerweise 15-20 Basen lang sind, binden sich an den Direktsinn-mRNA- oder Prä-mRNA-Bereich, der das interessierende Protein kodiert und der die Translation der gebundenen mRNA zum Protein verhindern kann. Die die DGAT1 kodierende cDNA-Sequenz kann daher dazu verwendet werden, ein Reihe von Oligonukleotiden zu entwerfen, die einen großen Teil der cDNA oder sogar die ganze cDNA zusammenfasst. Diese Oligonukleotide können auf die Feststellung geprüft werden, welches die größte Verhinderungswirkung in Bezug auf die Expression des Proteins ausübt (Stewart, 1996). Die geeignetesten mRNA-Zielorte umfassen den nicht der Translation unterworfenen 5'-Bereich und 3'-Bereich und auch das Anfangskodon. Weitere Bereiche können sich als mehr oder weniger wirksam erweisen.
  • Alternativ kann sich eine Gegensinn-Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid an die DGAT1-kodierenden Sequenzen binden.
  • Bei einer weiteren Ausführung sieht die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren der Milcherzeugung und/oder des Milchgehalts in einem milchabgebenden Rind vor, wobei das Verfahren folgenden Schritt aufweist: dem Rind wird eine wirksame Menge eines Nukleinsäuremoleküls zugeführt, das eine Ribozymaktivität und eine Nukleotidsequenz aufweist, die im Wesentlichen zu mindestens einem Teil der mRNA komplementär ist, die eine Rinder-DGAT1 kodiert und genügend lang ist, um sich daran zu binden und die Expression der genannten DGAT1 genügend zu vermindern.
  • Eher noch, als die DGAT1-Aktivität im Rind durch das Verhindern der Genexpression am Nukleinsäurepegel zu vermindern, kann die Aktivität des relevanten DGAT1-Proteins durch Bindung an einen Wirkstoff, beispielsweise an ein geeignetes, kleines Molekül oder an einen monoklonalen Antikörper, direkt verhindert werden.
  • So umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Verhindern der Aktivität des Rinder-DGAT1 in einem milchgebenden Rind, so dass die Milcherzeugung und/oder die Milchfestbestandteile moduliert werden, wobei das Verfahren den Schritt der Zuführung einer wirksamen Menge eines Antikörpers zur relevanten DGAT1 aufweist.
  • Die Erfindung weist ferner ein Verfahren zum Modulieren der Milcherzeugung und/oder der Milchfestbestandteile auf, wobei ein Autoantikörper einer Rinder-DGAT1 im Rind zugeführt wird. Die Zuführung des Autoantikörpers kann die Zuführung eines Proteins mit einer DGAT1-Aktivität zum Rind umfassen.
  • Bei einer weiteren Ausführung können die Nukleinsäuren, die die DGAT1-Proteine kodieren, dazu verwendet werden, nicht menschliche, transgene Tiere zu erzeugen. Ein nicht menschliches, transgenes Tier (beispielsweise eine Maus) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, das in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einer pränatalen, beispielsweise embryonalen, Stufe eingeführt ist. Ein Transgen ist eine DNA, die im Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein trangenes Tier entwickelt. Bei einer Ausführung kann eine Rinder-cDNA, die die in der 2b gezeigte Nukleotidsequenz oder eine geeignete Variante oder Subsequenz dieser Nukleotidsequenz aufweist, dazu verwendet werden, transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen aufweisen, die die relevante DGAT1 ausdrücken. In gleicher Weise können die Varianten dazu verwendet werden, transgene Tiere zu erzeugen. „Knock-out"-Tiere können ebenfalls erzeugt werden.
  • Die Verfahren zum Erzeugen von nicht menschlichen, transgenen Tieren, insbesondere solchen Tieren wie Mäusen, sind für den Fachmann üblich geworden und in den US-Patenten 4 736 866 und 4 870 009 beschrieben. Bei diesen Verfahren werden rekombinante Moleküle enthaltende Plasmide in Mausembryonen mikroinjiziert. Insbesondere können die Plasmide in die männlichen Pronukleine von befruchteten, einzelligen Mauseiern mikroinjiziert werden; die injizierten Eier werden in pseudoträchtige Brutweibchen übertragen. Die Eier in den Brutweibchen können sich in der Schwangerschaftszeit entwickeln (Hogan, 1986). Alternativ kann eine embryonale Stammzelle mit einem Expressionsfaktor ausgestattet werden, der die ein DGAT1-Protein kodierende Nukleinsäure enthält, und die die Nukleinsäure enthaltenden Zellen können dazu verwendet werden, Aggregationsmonstren mit Embryonen eines geeigneten Empfängermausstamms zu bilden. Die Monsterembryonen können dann in ein geeignetes, pseudoträchtiges Mausweibchen eines geeigneten Stamms implantiert werden, und der Embryo wird ausgetragen. Der Nachwuchs, der in der übertragenen DNA in den Keimzellen verborgen ist, kann dazu verwendet werden, gleichartige, transgene Mäuse auszutragen.
  • Solche Tiere können dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob eine auf ein intaktes DGAT1-Gen bezogene Sequenz die biologische Aktivität der kodierten DGAT1 behält. So können beispielsweise Mäuse, in denen das murine DGAT1-Gen entfernt ist und die die Nukleinsäuresequenz, die in 2b angegeben ist, oder Bruchstücke oder Varianten davon aufweisen, erzeugt werden. Die Tiere können in Bezug auf die Milcherzeugung und den Milchgehalt geprüft werden.
  • Das Muster und das Ausmaß der Expression eines rekombinanten Moleküls der Erfindung in einer transgenen Maus wird dadurch erleichtert, dass ein Mitteilungsgen mit dem rekombinanten Molekül derart verschmolzen wird, dass beide Gene kotranskribiert werden und damit eine polyzistronische mRNA bilden. Das Mitteilungsgen kann in das rekombinante Molekül unter Verwendung von üblichen Verfahren eingeführt werden, beispielsweise von solchen Verfahren, die von Sambrook et al. (Sambrook, 1989) beschrieben wurden. Eine wirksame Expression bei der Zistrone der polyzistronen mRNA, die das Protein gemäß der Erfindung kodiert, und des Mitteilungsproteins kann dadurch erreicht werden, dass eine bekannte, innere, übertragende Anfangssequenz, beispielsweise die in einer Polyvirus-mRNA vorhandene, vorgesehen wird. Das Mitteilungsgen sollte unter der Kontrolle der regulären Sequenz des rekombinanten Moleküls gemäß der Erfindung ste hen, und das Muster und das Ausmaß der Expression des ein Protein gemäß der Erfindung kodierenden Gens können demgemäß dadurch bestimmt werden, dass der Phänotyp des Mitteilungsgens geprüft wird. Vorzugsweise kodiert das Mitteilungsgen einen Phänotyp, der durch die Wirtszelle nicht gezeigt wird, und der Phänotyp kann quantitativ geprüft werden. Beispiele für geeignete Mitteilungsgene umfassen lacZ (β-Galaktosidase), neo (Neomyzinphosphotransferase), CAT (Chloramphenikolazetyltransferase), dhfr (Dihydrofolatreduktase), aphIV (Hydromyzinphosphotransferase), lux (Luziferase) und uidA (β-Glukoronidase). Vorzugsweise ist das Mitteilungsgen lacZ, das für die β-Galaktosidase kodiert. Die β-Galaktosidase kann dadurch geprüft werden, dass eine Laktose analog dem X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid) verwendet wird, das durch die β-Galaktosidase in ein Produkt aufgegliedert wird, das eine blaue Farbe aufweist.
  • Noch weitere transgene Anwendungen der Erfindung ergeben sich durch das Entfernen von endogenen, die DGAT1 kodierenden Gene in nicht menschlichen Säugetieren und durch den Ersatz dieses Gens durch ein Rindertransgen, um die gewünschte Wirkung zu erreichen. Dies ist insbesondere für die Erhöhung der Milcherzeugung bei Vieh richtig. Beispielsweise können zusätzliche Kopien des die DGAT1 kodierenden Rindergens als Transgen eingefügt werden, oder das endogene, mit einem Hochpegelexpressionspromotor verbundene Gen kann in ein Transgen eingefügt werden. Es kann sich auch als vorteilhaft erweisen, wenn ein defektes Gen ersetzt wird, anstatt die ganze Sequenz der DNA zu ersetzen, die für ein Protein mit der DGAT1-Aktivität kodiert. Ein Verfahren zum Erzeugen eines transgenen Rinds oder transgenen Rinderembryos ist beispielsweise im US-Patent 5 633 076, veröffentlicht am 27. Mai, 1997, beschrieben.
  • Diese nicht menschlichen, transgenen Tiere gemäß der Erfindung können wieder dazu verwendet werden, die molekulare Basis der DGAT1-Wirkung zu erforschen. Beispielsweise weisen die Mutanten, in denen ein oder mehrere der konservierten Zysteinreste gelöscht worden sind, vermutlich eine verminderte Aktivität in Bezug auf ein DGAT1-Protein auf, in dem alle diese Reste noch vorhanden sind. Ferner ergibt das Löschen einer proteolyti schen Spaltenstelle vermutlich eine Mutante, der die biologische Aktivität der DGAT1 fehlt.
  • Nicht menschliche, transgene Tiere gemäß der Erfindung können auch dazu verwendet werden, Substanzen auf die Fähigkeit zu prüfen, eine langsame oder vergrößerte DGAT1-Aktivität zu verhindern. Ein transgenes Tier kann mit der Substanz behandelt werden, wobei gleichzeitig ein nicht behandeltes, transgenes Kontrolltier zur Kontrolle mitläuft. Die in dieser Weise geprüften Substanzen weisen Proteine auf, die aus vom Tier eingenommenen Futtermitteln stammen. Beispielsweise können die von Weidegras und anderem Futter stammenden Proteine auf ihre Wirkung auf die DGAT1-Aktivität geprüft werden, wobei auch bestimmt werden kann, ob zuchtspezifische Wirkungen vorhanden sein können.
  • Daher sieht die Erfindung gemäß weiteren Aspekten transgene, nicht menschliche Tiere vor. Diese Tiere weisen beispielsweise nur ein transgenes Rind auf, das ein Genom hat, dem ein Gen fehlt, das ein die biologische Aktivität der DGAT1 (oder tatsächlich irgendeine DGAT1-Aktivität überhaupt) aufweisendes Protein kodiert; oder sie weisen eine transgene Maus mit einem Genom auf, das ein Gen hat, das ein die biologische Aktivität irgendeiner DGAT1 aufweisendes Rinderprotein kodiert; oder sie weisen ein transgenes Rind mit einem Gen auf, das ein Rinderprotein kodiert, das die biologische Aktivität einer Rinder-DGAT1 und die heterologe Nukleotidsequenz aufweist, die im Gegensinn zum Gen steht. Das transgene Rind kann ein Gen aufweisen, die eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die eine Ribozymaktivität aufweist und in Transkriptionsverbindung mit der Nukleotidsequenz steht, die im Gegensinn mit dem Gen steht.
  • Die Erfindung sieht ferner ein transgenes Rind mit einem Genom vor, das zusätzliche Kopien eines Gens umfasst, das ein Protein kodiert, das die biologische Aktivität der DGAT1 unter der Kontrolle eines starken Expressionspromotors aufweist.
  • Diese Anwendungen der Erfindung sind nur eine Auswahl aus vielen. Weitere Anwendungen können vom Fachmann klar erkannt werden und sind vom Patentschutz nicht ausgeschlossen. Im Gegenteil erstreckt sich die Erfindung nicht nur auf die vorgesehene, besondere Lehre, sondern auch auf alle Variationen und Modifikationen, die im Fachgebiet und Interesse des Lesers liegen.
  • Die Erfindung wird nun anhand von besonderen Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne dass diese die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken sollen.
  • Experimentell
  • 1. Stelle des Gens, das für die beobachtete QTL verantwortlich ist
  • Aufbau einer BAC-Contig, die das BULGE9-BULGE30-Intervall überbrückt.
  • Um das Gen oder die Gene zu klonen, die für die beobachtete QTL-Wirkung verantwortlich sind, wurde eine BAC-Contig aufgebaut, die das entsprechende Markierungsintervall überbrückt. Dies wurde dadurch erreicht, dass ein BAC-Verzeichnis durch Filterhybridisierung mit den Mikrosatellitenmarkierungen, die für die nahe BTA14q verfügbar sind, und auch mit der menschlichen cDNA-Klonkartei in Bezug auf das orthologe Chromosomensegment auf der menschlichen RH-Transkriptionskarte 8q23.3-ter (Riquet et al., 1999) durchsucht wurde. Die Enden des isolierten BACs wurden in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Sequenzendstellen (STS) sich aus den entsprechenden Sequenzen entwickelten, und auf einer Tafel aufgetragen, auf der ein ganzes Rinder-x-Hamster-Genom in strahlenförmiger Hybridanordnung verzeichnet war. Dieses STS-Gehalt-Karteiverfahren führte zum Aufbau des in 1 gezeigten BAC-Contigs.
  • Die DGAT1 legt das BULGE9-BULGE30-Intervall fest und ist ein genauer Positionskandidat für die QTL.
  • Ein ein Protein kodierendes, murines Gen mit einer Diazylglyzerol-o-azyltransferase-Aktivität (DGAT1-Aktivität) wurde identifiziert (Cases et al., 1998) und gezeigt, das die Milchabgabe vollständig verhindert, wenn es in der Maus ausgeschieden wird (Smith et al., 2000). Dieses Gen soll beim Menschen unter HSA8qter (Cases et al., 1998) verzeichnet sein, d.h. in einem Bereich, der ortholog zu demjenigen angeordnet ist, der die Rinder-QTL enthält. Die Durchforschung der öffentlich verfügbaren Datenbanken nach den veröffentlichten, murinen und menschlichen DGAT1-cDNA-Sequenzen erlaubte das Identifizieren von (i) einem menschlichen BAC-Klon, das das menschliche DGAT1-Gen (AF205589) enthielt, und (ii) drei Rinderexpressionssequenzenden (AW446908; AW445985; AW652329), die zusammen etwa zwei Drittel der Gene abdeckten. Als die menschlichen DGAT1-Genomsequenzen mit den Menschen- und Rinder-cDNA-Sequenzen ausgerichtet wurden, konnten die entsprechenden Intron-Exon-Grenzen identifiziert werden. Primer wurden entwickelt, um einen Teil des Rinder-DGAT1-Gens PCR zu verstärken. Die Durchsuchung der BACs, die die BULGE9-BULGE30-Contig zusammensetzen, zeigte klar, dass das Rinder-DGAT1-Gen in einer Untermenge der BACs enthalten war, so dass das DGAT1-Gen in der Contig der 1 genau positioniert werden konnte.
  • Diese Ergebnisse zeigten, dass die Kartenposition der DGAT1 mit der wahrscheinlichsten Position des Chromosomen 14QTL übereinstimmte, wie sie durch die Verbindungsanalyse und die Verbindungsgleichgewichtsstörungsanalyse festgestellt ist. In dem Bewusstsein, dass die QTL vorwiegend den Fettgehalt beeinflusst, und in dem Bewusstsein, dass die enzymatische Aktivität der DGAT1 und die Wirkung einer DGAT1-Löschung einen Einfluss auf die Milchabgabe hat, wurde dieses Gen als ein sehr starker Positionskandidat für die entsprechende QTL angesehen.
  • Organisation des Rinder-DGAT1-Gens.
  • Die Organisation des Rinder-DGAT1-Gens wurde durch eine Sequenzanalyse eines der die DGAT1 enthaltenden BACs festgestellt. Die Primer wurden derart ausgebildet, dass sie auf der verfügbaren Rinder-, murinen und menschlichen cDNA-Sequenzen basierten, die entweder für das direkte Festlegen der Reihenfolge des BAC-Klons oder für die Erzeugung von PCR-Produkten verwendet wurden, die den verschiedenen Teilen des Rinder-DGAT1-Gens dieses BAC entsprechen, die dann einer Festlegung der zyklischen Reihenfolge unterworfen wurde. Alle verfügbaren Sequenzen wurden dann eng miteinander verbunden, wobei die Phred/Phrap-Software (Ewing et al., 1998); Ewing & Green, 1998; Gordon et al., 1998) verwendet wurde, um die in den 2a und 2b gezeigte Übereinstimmungssequenz zu gewinnen.
  • RT-PCR-, 5'- und 3'-RACE-Experimente wurden an der mRNA durchgeführt, die von der Rinderbrustdrüse isoliert wurde, und die gewonnenen PCR-Produkte wurden der Festlegung der zyklischen Reihenfolge unterworfen. Ein Vergleich der Genomsequenz und der cDNA-Sequenz zeigte, dass das Rinder-DGAT1-Gen 8,6Kb überbrückt und 17 Exons enthält, die im Durchschnitt ein Maß von 121,8bp (Bereich 42-436bp) aufweisen und das Identifizieren der Intron-Exon-Grenzen erlaubten (2a, 2b und 3). Die cDNA-Sequenz tritt auch in der SEQ-ID-Nr. 4 auf. Während die ersten beiden Introns 3,6Kb bzw. 1,9Kb lang sind, sind die übrigen 14 Introns im Durchschnitt nur 92,4bp lang (Bereich 70-215bp). Alle Introns entsprechen der GT-AG-Regel und sind zwischen Mensch und Tier streng bewahrt. Das Rinder-DGAT1-Gen in eine mRNA transkribiert, die >31bp der 5'-UTR-Sequenz (2a), 1470bp, die für ein Protein der 489-Aminosäuren kodieren, und 275bp der 3'-UTR-Sequenz einschließlich eines kanonischen AATAAA-Polyadenylationssignals enthalten. Das Menschen- und Rinder-DGAT1-Nukleotid- (kodierend) und Proteinsequenzen sind zu 89,5% bzw. zu 92,5% identisch (2a, 2b, 4a und 4b). Ferner wird eine alternative Spleißvariante im Rind für das Exon VIII (2b) vorhergesagt. Die entsprechende Rinder-cDNAs werden vorausgesagt, die Proteine kodieren, die 489 bzw. 467 (alternative Spleißvariante) Aminosäurereste (4a und 4b) aufweisen.
  • Die vorausgesagten „Q"- und „q"-QTL-Allele unterscheiden sich durch einen nicht erhaltenden Lysin-Alanin-Aminosäureersatz im DGAT1-Gen.
  • Wenn angenommen wird, dass die DGAT1 tatsächlich die QTL ist, wird vorausgesagt, dass die identifizierten „Q"- und „q"-QTL-Allele funktionell festgelegten DGAT1-Allelen entsprechen, d.h., dass sie sich in einer oder mehreren Mutationen unterscheiden, die diese Allele verursachen und funktionell unterschiedlich sind. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde der Aufbau des DGAT1-Gens in Individuen geprüft, von denen vorausgesagt wird, dass sie die unterschiedlichen QTL-Genotypen „QQ", „Qq" und „qq" aufweisen. Genauer gesagt wurden die DGAT1-Gene von
    • (i) zwei Ahnen mit dem „HQ-NZ/hq"-Genotyp und auch zwei ihrer „HQ-D/HQ-D"-Nachkommen, zwei ihrer „hq/hq"-Nachkommen und ein „HQ-D/hq"-Nachkomme und
    • (ii) ein „HQ-NZ/hq"-Ahne mit einem seiner „HQ-NZ/HQ-NZ"-Nachkommen
    analysiert, wobei HQ-D dem holländischen Q-Haplotyp und „HQNZ" dem neuseeländischen Q-Haplotyp entspricht. Die Primmerpaare wurden derart ausgebildet, dass sie aus der Genom-DNA (i) den kodierenden Teil des Exons I, (ii) das Exon II und (iii) die Chromosomenbereiche verstärken konnten, die die Exons III bis XVII überbrücken. Die entsprechenden PCR-Produkte der ausgewählten Individuen wurden in eine zyklische Reihenfolge gebracht, und die sich ergebenden Sequenzen wurden mit der Polyphred-Software geprüft.
  • Eine zusätzliche Sequenzanalyse, wie sie oben beschrieben ist, hinsichtlich der DNA eines Zuchtbereichs zeigte zusätzliche Polymorphismen, die in Tabelle 1 (s. Verfahrensabschnitt für die Züchtungen) aufgeführt sind. Vier dieser Polymorphismen wurden näher untersucht:
    • (i) K232A: entsteht durch eine Substutution einer ApA durch ein GpC-Dinukleotid im Exon VIII (ensprechend den Positionen 694 und 695, gerechnet vom Startkodon in der cDNA). Diese Substitution dieser beiden benachbarten Nukleotide führt zu einer nicht erhaltenden Lysin-Alanin-Substitution (Lysin = hydrophile Basenaminosäure; Alanin = hydrophobe Basenaminosäure) im DGAT1-Protein. Der durch diesen Polymorphismus beeinflusste Lysinrest ist in der menschlichen und murinen DGAT1-Sequenz konserviert. Zusammen mit der sich ergebenden Änderung der elektrischen Ladung des Proteins legt dies die Annahme nahe, dass diese Aminosäurensubstitution wahrscheinlich einen funktionellen Unterschied zwischen den beiden entsprechenden Allelen er gibt und mindestens teilweise für die beobachtete QTL-Wirkung verantwortlich ist.
    • (ii) Nt984+8(Base 7438 A-G): eine A-G-Substitution im Intron 12, acht Basenpaare in Abwärtsrichtung vom Exon XII. Wenn der Standardnomenklatur gefolgt wird, wird dieser Polymorphismus als Nt984+8(A-G) bezeichnet. Es kann nicht vorausgesagt werden, ob dieser Polymorphismus die Funktionalität der entsprechenden Allele verändert, obwohl eine Wirkung auf den Spleißmechanismus nicht ausgeschlossen werden, kann, wenn dessen Nähe zur Intron-Exon-Grenze gegeben ist.
    • (iii) Nt984+26(Base 7456 C-T): eine C-T-Substitution im Intron 12, 26 Basenpaare in Abwärtsrichtung vom Exon XII. Wenn der Standardnomenklatur gefolgt wird, wird dieser Polymorphismus als Nt984+26(Base 7456 C-T) bezeichnet. Wieder kann nicht vorausgesagt werden, ob dieser Polymorphismus die Funktionalität der entsprechenden Allele verändert, obwohl eine Wirkung auf den Spleißmechanismus nicht ausgeschlossen werden kann, wenn seine Nähe zur Intron-Exon-Grenze gegeben ist.
    • (iv) Nt1470+85(Base 8402 C-T): eine C-T-Substitution im Intron 3'-UTR. Wenn der Standardnomenklatur gefolgt wird, wird dieser Polymorphismus als Nt1470+85(Base 8402 C-T) bezeichnet. Wieder kann nicht vorausgesagt werden, ob dieser Polymorphismus die Funktionalität der entsprechenden Allele verändert, obwohl eine Wirkung auf die Polyadenylation oder die mRNA-Stabilität nicht ausgeschlossen werden kann.
  • Schlussfolgerung
  • Diese vier Polymorphismen wurden dargelegt, um sie in drei bestimmten SNP-Haplotypen einzuteilen, nämlich in sHQ-D, sHQ-NZ und shq, weil sie in den Sequenzmustern mit den entsprechenden Mikrosatelliten-Mustern μHQ-D, μHQ-NZ und μhq übereinstimmen. Die Basenpaarzusammensetzungen dieser drei SNP-Haplotypen sind in 3 gezeigt.
  • Weil die sHQ-NZ- und shq-Markierungshaplotypen sich den G-Rest an der DGAT1-Nt984+8(Base 7438 A-G)-Stelle teilen, kann die Kausalität dieses Polymorphismus bei der Bestimmung der QTL ausgeschlossen werden. Für die drei übrigen Polymorphismusstellen erweisen sich jedoch die DGAT1-Haplotypen, die mit den Markierungshaplotypen sHQ-D und sHQ-NZ verbunden sind, als identisch miteinander, während sie zum shq-DGAT1-Haplotyp unterschiedlich sind. Jeder dieser Polymorphismen kann deshalb für die beobachtete QTL-Wirkung verantwortlich sein. Der Nt984+26(Base 7456 C-T)-Polymorphismus und der Nt1470+85(Base 8402 C-T)-Polymorphismus sind a priori wahrscheinlich neutral in Bezug auf die DGAT1-Aktivität wegen ihrer entsprechenden Position in einem Intron und im 3'-UTR, und in gleicher Weise ist es der andere, nicht kodierende oder neutrale, in der Tabelle 1 gezeigte Polymorphismus. Eine direkte Wirkung der K232A-Mutation auf die DGAT1-Aktivität ist jedoch sehr verständlich. Tatsächlich wird der entsprechende Lysinrest unter allen geprüften Säugtieren (das sind Mensch, Maus, Ratte, Schwein, Schaf, Bison) konserviert, wodurch seine funktionelle Bedeutung bewiesen ist (5). Die evolutionäre Konservierung dieses Lysinrests zeigt auch, dass der K-Rest, der den sHQ-D-Markierungshaplotyp und den sHQ-NZ-Markierungshaplotyp kennzeichnet, mehr als wahrscheinlich der angestammte Zustand ist und dass es der A-Rest ist, der die shq-Haplotypen kennzeichnet und der einem neueren, entwickelten Zustand entspricht.
  • 2. Genotypprüfung und Analyse I
  • Nun wird eine Zusammenfassung der Genotypprüfung und der nachfolgenden Analyse der Holstein-Friesland-Tiere gegeben, die von den Neuseelandtier und dem Hollandtier abstammen, die auf das Vorhandensein des K232A-Polymorphismus geprüft worden sind. Der Bezug auf das Allel „Q" entspricht dem K-Rest, und das Allel „q" entspricht dem A-Rest (wie in 3 und in der Tabelle 1 gezeigt ist).
  • Eine Oligonukleotidbindungsprüfung (OLA) wurd entwickelt, die im Verfahrensabschnitt unten beschrieben ist und die gleichzeitig ein wirksames Ge notypisieren der vier DGAT1-Polymorphismen erlaubt. Diese OLA-Prüfung wurde dazu verwendet, um ein vorher von Farnir et al., 2000, beschriebenes „Enkelinmodell" (d.i. eine Reihe von väterlichen Halbbruder-Stammbäumen, das 1818 holländische Holstein-Friesland-Ahnen aufweist, und auch ein „Tochtermodell" (d.i. eine Reihe von väterlichen Halbschwester-Stammbäumen) zu genotypisieren, das 529 neuseeländische Holstein-Friesland-Kühe aufweist, die, wie unten beschrieben ist, nach dem Phänotyp ausgewählt worden sind. Die Markierungsverbindungsphase für jedes Individuum wurde, wie unten beschrieben ist, festgestellt.
  • Die 6 gibt die Frequenzverteilung der DGAT1-Haplotypen wieder, die in der Holland-Population bzw. in der Neuseeland-Population auftreten. Vier bestimmte SNP-Haplotypen wurden identifiziert. Drei dieser Haplotypen entsprechen den sHQ-D-, sHQ-NZ- und shq-Typen, die vorher durch die Folgeregelung identifiziert worden waren und die für 99% der Chromsomen der holländischen Population und für 98% der Chromosomen der neuseeländischen Population stehen. Ferner wurde festgestellt, dass ein vierter weniger bedeutende Haplotyp für die restliche 1 % und 2% der Chromosomen stehen. Da dieser Haplotyp für einen K-Rest an der Stelle 232 kodiert, wurde von ihm angenommen, dass er einem fetterhöhenden „Q"-Allel entspricht, und deshalb wurde er als sHQ-III-Typ bezeichnet (3). Die Beobachtung, dass der K-Rest auf drei bestimmten DGAT1-Haplotypen gefunden wird, während der A-Rest auf einem einzigen DGAT1-Haplotyp gefunden wird, steht in Übereinstimmung mit K, das der angestammtere Zustand ist.
  • Die sHQ-D- und sHQ-NZ-Haplotypen (die für einen K-Rest an der Stelle 232 kodieren) scheinen eine starke Verbindungsgleichgewichtsstörung (LD) in Bezug auf die flankierenden Mikrosatellitenmarkierungen BULGE09 und BULGE11 aufzuweisen, weil sie im Wesentlichen mit einzigartigen Mikrosatelliten-Haplotypen verbunden sind, die dem vorher definierten μHQ-D-Haplotyp bzw. dem μHQ-NZ-Haplotyp (6C und 6D) entsprechen. In scharfem Kontrast dazu ist der shq-Haplotyp (der für einen A-Rest an der Stelle 232 kodiert) über mehr als zehn bestimmte Mikrosatelliten-Haplotypen (6B) fast gleichmäßig verteilt.
  • Die Beobachtungen stimmen ausgezeichnet mit den Ergebnissen der kombinierten Verbindungs- und LD-Analyse überein (Fernier et al., 2000). Die Studien sagen tatsächlich voraus, dass sich (i) in der holländischen Population die überwiegende Mehrheit (schätzungsweise im Bereich von 81-92%) der "Q"-Allele (=K) auf dem μHQ-D-Mikrosatelliten-Haplotyp befindet, dass (ii) in der neuseeländischen Population ein großer Bruchteil (schätzungsweise im Bereich von 36-51%) der „Q"-Allele sich auf dem Haplotyp μHQ-NZ befindet (es ist zu erkennen, dass sich der Rest hauptsächlich auf auf dem μHQ-D-Mikrosatelliten-Haplotyp befindet) und dass (iii) in beiden Populationen die „Q"-Allele (=A) den Vielfachmarkierungshaplotypen entsprechen, die hq entsprechen.
  • Die 7 gibt die Verstärkung des LD-Signals wieder, das im Muster der holländischen Holstein-Friesland-Enkelin gewonnen werden kann, wenn der DGAT1-Polymorphismus zu den vorher verfügbaren Markierungen für das proximale BTA14q zugefügt wird und eine diesbezügliche Verbindungs- und LD-Vielfachpunkt-Analyse (Fernier et al., 2000) durchgeführt wird, die die Ahnen „Tochterübergabeabweichungen" (DYD, Van Raden und Wiggans, 1991, die Halbzuchtwerten entsprechen) für den Milchfettprozentsatz als Phänotyp verwendet. Es ist zu erkennen, das sich die mit der LD verbundene LOD-Zahl (Logarithmus der Wahrscheinlichkeit für...) im Wesentlichen verdoppelt (von 3,7 auf 7,8) und einen Höchstwert genau an der Position des DGAT1-Gens erreicht. Dieses Ergebnis unterstützt die kausale Einbeziehung des DGAT1-Gens in den QTL-Effekt. Die entsprechenden ML-Schätzungen des Effekts (α/2) der Substitution des „Q"-Allels durch das „q"-Allel (durch Falconer und Machay 1996 definiert), die restliche Standardabweichung (c), die Populationsfrequenz des „Q"-Allels (fQ), die Anzahl der Vereinigungsgenerationen (g) und die Heterogenitätsparameter (p) betrugen der Reihe nach 0,11 % (α/2), 0,06% (σ), 0,20 (fQ), 5 (g) und 0,84 (p).
  • Bei der Verwendung derselben holländischen Holstein-Friesland-Population wurde der additive Effekt des DGAT1-K232A-Polymorphismus auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung geprüft. Die Söhne-DYDs für den Milchertrag (kgs), den Proteinertrag (kgs), den Poteinprozentsatz und den Fettprozentsatz wurden analysiert, wobei ein Mischmodell verwendet wurde, das (i) einen Rückgang der Anzahl der K-Allele im Genotyp (0, 1 oder 2) aufwies und (ii) eine polygene Zufallskomponente aufwies, die offenbar ein individuelles Tiermodel verwendete und für alle bekannten Abstammungsverhältniise verantwortlich war. Die folgende Tabelle 2 stellt die gewonnenen Ergebnisse dar. Es ist zu erkennen, das die K232A-Mutation eine extrem bedeutende Wirkung auf die fünf analysierten Milchmerkmale ausübt. Das Verhältnis der Milchmerkmaländerung, die durch diesen Polymorphismus in dieser Population bedingt ist, erstreckt sich von 8% (Proteinertrag) bis zu 51 % (Fettprozentsatz), was einem Bereich von 10% (Proteinertrag) bis 64% (Fettprozentsatz) der genetischen Veränderlichkeit (= QTL + polygenetisch) entspricht. Es sei darauf hingewiesen, dass das durch das Vollmodell (1 – r2 Fehler) erklärte Veränderlichkeitsverhältnis die Größenordnung von 70% die Ergebnismerkmale und 80% für die Prozentsatzmerkmale aufweist, wobei diese Werte mit der bekannten Zuverlässigkeit der entsprechenden DYDs (Van Raden und Wiggans, 1991) übereinstimmen. Ein interessantes Merkmal dieses QTL-Effekts besteht darin, dass die Substitition von „Q" durch „q" den Fettertrag erhöht, während der Milch- und Proteinertrag trotz der starken, positiven Gesamtkorrelation abnimmt, die die drei Ertragsmerkmale kennzeichnet. Tabelle 2 Wirkung der DGAT1-K232A-Mutation auf die Stammtöchterertragsabweichungen (DYDs) für den Milchertrag und die Milchzusammensetzung
    Figure 00370001
    • (i) α/2: Substitutionswirkung des QTL-Allels auf die DYD (Halbzuchtwert), wobei diese Wirkung im Mischmodell dem Rückgangskoeffizienten der Anzahl der K-Allele im DGAT1-K232A-Genotyp und α/2 entspricht und α gemäß dem Bezug Falconer und Mackay, 1996, definiert ist.
    • (ii) r2 QTL: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die durch den DGAT1-K232A-Polymorphismus bedingt ist.
    • (iii) p-WertQTL: statistische Bedeutung der DGAT1-K232A-Wirkung.
    • (iv) r2 polygen: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die durch die polygene Zufallswirkung im Mischmodell erklärt wird.
    • (v) r2 Fehler: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die nicht durch das Modell erklärt wird.
  • Die beiden vorhergehenden Analysen prüften die Wirkung des DGAT1-Polymorphismus auf die geschätzten Zuchtwerte. Aufgrund der Definition ist dieser Phänotyp nur für die additive Komponente der DGAT1-Wirkung verantwortlich; dieser Phänotyp rechtfertigt die Verwendung eines Rückgangs der Anzahl der K-Allele im Mischmodell. Um das Dominanzverhältnis zwischen den DGAT1-Allelen auszuwerten, wurde die Wirkung des K232A-Genotyps auf die Milchabgabewerte (erste Ertragsabweichungen; Van Raden und Wiggans, 1991) der Kühe analysiert, die das Neuseeland-Tochter-Modell bilden. Dies wurde dadurch erreicht, dass ein Mischmodell verwendet wurde, das (i) eine dem K232A-Genotyp entsprechende, feste Wirkung aufwies, das (ii) eine polygene Zufallskomponente aufwies, die für alle bekannten Ahnenverhältnisse verantwortlich ist („Tiermodell"). Sehr bedeutende Wirkungen des K232A-Genotyps auf alle geprüften Ertrags- und Zusammensetzungsmerkmale wurden ebenfalls in dieser Population gefunden (s. die folgende Tabelle 3), wobei diese Wirkungen für den Merkmalveränderlichkeitsbereich von 1% (Proteinertrag) bis 31 % (Fettprozentsatz) verantwortlich ist. Die beobachteten Dominanzabweichungen d, die der Differenz zwischen dem Genotypwert des KA-Genotyps und dem Mittelpunkt der AA- und KK-Genotypwerte entsprechen (Falconer und Mackay, 1996) sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Die Genotypwerte des heterozygoten Genotyps liegen systematisch zwischen sich ändernden Homozygoten. Keiner der d-Werte, die sich als bedeutendunterschiedlich von Null erwiesen, zeigten ein Abwesenheit der Dominanz an. Die Durchschnittswirkungen α (Falconer und Mackay, 1996) der K- zur A-QTL-Allelensubstitution wurden aus den Schätzungen der α- und d-Werte errechnet, ebenso die Populationsfrequenzen der K- und A-QTL-Allele (Tabelle 3). Die vorausgesagten Substitutionswirkungen stimmen mit denen überein, die aus dem Enkelinmodell errechnet wurden: das K-Allel erhöht den Fettertrag, den Fettprozentsatz und den Proteinprozentsatz, während der Milch- und Proteinertrag gesenkt wird. Die Absolutwerte von a, die vom Enkelin- und Tochtermodell geschätzt wurden, stimmen genau mit dem Fett- und Proteinprozentsatz überein, während für die Ertragsmerkmale die Schätzungen im Enkelinmodell im Vergleich mit dem Tochtermodell größer sind. Die genauen Gründe dafür werden gerade untersucht. Der Grund dafür könnte darin bestehen, dass die Ahnenpopulation bei dem Enkelinmodell nicht generell für die Kuhpopulation repräsentativ ist oder dass wesentliche Unterschiede zwischen der holländischen Population und der neuseeländischen Population und/oder der Umgebung bestehen. Tabelle 3 Wirkung der DGAT1-K232A-Mutation auf die Milchabgabewerte der Kühe für den Milchertrag und die Milchzusammensetzung
    Figure 00390001
    • (i) a: halbe Differenz zwischen den Genotypwerten der KK- und AA-Genotypen (Falconer und Machay, 1996).
    • (ii) d: Dominanzabweichung (Falconer und Mackay, 1996), Abweichung des KA-Genotypwerts vom Mittelpunkt zwischen den AA- und KK-Genotypwerten; keiner dieser Werte erwies sich als wesentlich unterschiedlich von Null.
    • (iii) α: durchschnittliche Wirkung der Substitution von A durch K, berechnet als „a + d(q – p)" (Falconer und Mackay, 1996), wobei q die Allelfrequenz von K (=0,7) und p die Allelfrequenz von A (=0,3) ist.
    • (iv) r2 QTL: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die durch den DGAT1-K232A-Polymorphismus erklärt wird.
    • (v) p-WertQTL: statistische Bedeutung der DGAT1-K232A-Wirkung.
    • (vi) r2 polygen: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die durch die polygene Zufallswirkung im Mischmodell erklärt wird.
    • (vii) r2 Fehler: Verhältnis der Merkmalsveränderlichkeit, die durch das Modell erklärt wird.
  • Abstammungsmaterial und Phänotypen.
  • Das für die Verbindungsstudien verwendete Abstammungsmaterial wies ein „Enkelinmodell" (Weller et al., 1990) mit 1818 Holstein-Friesland-Stieren aus den Niederlanden und ferner ein „Tochtermodell" mit 529 Holstein-Friesland-Kühen aus Neuseeland auf. Die Phänotypen der Ahnen waren „Tochterertragsabweichungen" (DYD: nicht rückentwickelte Gewichtsdurch schnittswerte der Milcherzeugungsleistungen der Töchter, wobei diese Leistungen auf systematische Umgebungseinwirkungen eingestellt waren, und Zuchtwerte der Tochtermuttertiere und als Abweichungen vom Populationsmittelwert ausgedrückt, Van Raden und Wiggans, 1991), der von CR-Delta (Arnheim, Niederlande) gewonnen wurde. Die Phänotypen der Kühe waren „Milchabgabewerte" (erste Milchertragsabweichungen YD, d.h., Gewichtsdurchschnittswerte der Milchabgabeleistungen, die als Abweichungen vom Populationsmittelwert ausgedrückt waren, der auf die Managementgruppe, die dauernden Umgebungseinwirkungen und Viehahnenwechselwirkungswirkungen eingestellt waren, Van Raden und Wiggans, 1991), die direkt von der „Livestock Improvement Corporation (Hamilton, Neuseeland) gewonnen wurden.
  • Kombinierte Verbindungs- und Verbindungsgleichgewichtsstörungsanalyse und Verbindungsstudien.
  • Die Maximalwahrscheinlichkeitsprozedur für die kombinierte Verbindungs- und Verbindungsgleichgewichtsstörungsanalyse ist im Einzelnen in Farnie, 2000, beschrieben. Die Verbindungsstudie im Enkelinmodell wurde unter Verwendung des folgenden Modells durchgeführt: yi = μ + βxi + αi + ei,wobei yi die DYD des Sohns i, μ der Gesamtpopulationsmittelwert, β ein fester Rückentwicklungskoeeffizient für die Abschätzung der Wirkung der Substitution des K-Allels durch das A-Allel, xi eine Anzeigevariable, die der Anzahl der K-Allelen im K232A-Genotyp entspricht, αi eine polygene Zufallskomponente, die für alle Ahnenverhältnisse („Tiermodell", Lynch und Walsh, 1997) verantwortlich ist, und ei ein Zufallsrest ist. Die Verbindungsstudie im Tochtermodell wurde unter Verwendung des folgenden Modells durchgeführt: yi = μ + gi + αi + ei,wobei yi die DYD der Kuh i, gi eine feste Wirkung, die dem DGAT1-Genotyp (KK, KA oder AA) entspricht, αi eine polygene Zufallskomponente, die für alle Ahnenverhältnisse („Tiermodell", Lynch und Walsh, 1997) verantwortlich ist, und ei ein Zufallsrest ist. In beiden Fällen wurden die Maximalwahrscheinlichkeits-Lösungen für β, gi, αi, ei, σ2 α und σ2 e unter Verwendung des MTDFREML-Programms (Boldmann et al., 1997) gewonnen.
  • 3. Genotypprüfung und Analyse II
  • Im Folgenden wird die Genotypprüfung und danach die Analyse der Holstein-Fiesland-Jersey- und Ayrshire-Tiere in einer getrennten Population beschrieben, die von denen getrennt ist, die bei der obigen Genotypprüfung und Analyse I beschrieben sind.
  • Abstammungsgeprüfte Ahnen
  • Jedes Jahr prüft die Livestock Improvement Corporation (Neuseelnd) abstammumgsmäßig etwa 200-300 Stiere je Jahr. Dazu ist es nötig, dass die Stiere auf der Basis von 50-85 Töchtern je Ahne genetisch ausgewertet werden. Die Ahnen werden hinsichtlich des Milchfetts, Milchproteins, der Milchmenge und 20 Nichtproduktionsmerkmalen ausgewertet. Samen sind von allen abstammungsmäßig geprüften Ahnen seit den frühen Siebzigerjahren zurückbehalten worden. Die DNA wurde vom Samen abgezogen und auf den Genotyp für den K232A-DGAT1-Polymorphismus unter Verwendung des 7900-Taqman-System (s. Verfahrensabschnitt unten) untersucht.
  • Eine statistische Analyse wurde aufgrund dieses Datensatzes unter Verwendung der Restricted Maximum Likelihood (REML) und des Durchschnittsinformationsalgorithmus (Johnson und Thompson, 1995) vorgenommen. Das lineare Modell wies die festen Wirkungen der DGAT1 (3 Klassen; 0, 1 und 2 Kopien der Q-Alele, d.h. des K-Rests) und eine Kovariante auf, die dem Verhältnis der Überseegenetik entspricht. Die Zufallswirkung war ein Tier mit einer Verwandschaftsmatrix, die auf allen bekannten Verwandschaften basierte. Die Tochterertraggsabweichungen (DYDs) die Gewichtsdurchschnitte von Ahnentöchter-Milchabgabeleistungen, die als Abweichungen vom Populationsmittelwert (Van Raden und Wiggans, 1991) wurden als Phänotypmessung verwendet. Die Phänotypen wurden durch einen Ge wichtsfaktor gewichtet, der auf der Veränderlichkeit der DYD für einen Sohn basierte, wobei die Veränderlichkeit:
    Figure 00420001
    betrug, worin Var DYD die Veränderlichkeit der DYD des Sohns, n die Anzahl der Töchter, die zur DYD mithelfen, und h2 die Erbfähigkeit ist, die als Wert 0,35 für die Ertragsmerkmale eingesetzt wurde. Der Datensatz für die drei Hauptzüchtungen Holstein-Friesland, Jersey und Ayrshire wurde getrennt analysiert.
  • Siebenhundertunddreizehn Holstein-Friesland-Ahnen lagen der Analyse zugrunde. Die Wirkung des DGAT1-Polymorphismus war extrem bedeutend für die drei Milchproduktionsmerkmale (Tabelle 4). Mit jedem zusätzlichen Q-Allel erhöht sich das Niveau der Milchfettproduktion um etwa 6kg je Milchabgabe, während sich die Proteinproduktion um etwa 2,5kg je Milchabgabe verringerte und die Milchmenge um etwa 125l je Milchabgabe sank. Tabelle 4 Wirkung des DGAT1-Polymorphismus auf die Milchproduktion in der Holstein-Friesland-Stierpopulation (in Kilogramm je Milchabgabe)
    Figure 00420002
  • Die Wirkungen für die Jersey- und Ayrshire-Züchtungen waren weniger bedeutend als diejenigen der Holstein-Friesland-Züchtung, aber in der Richtung der Wirkungen beständiger.
  • Töchter für die Milchkomponenten
  • Die Datensammlung wurde mit dem LIC-Viehprüfdienst integriert, wobei ein Muster von 102 Viehstücken im LIC-Sire-Proving-Scheme (SPS) im Jahr 1995 verwendet wurde. Zusätzlich zur Milchmenge bei der Viehprüfung wuden die Konzentrationen von Fett, Rohprotein (Gesamtstickstoff), Kasin, Molke und Laktose festgestellt. Die Daten wurden von über 3000 Kühen gesammelt, die 1996 geboren waren. Die ersten Kälber kamen im Frühling 1998 und waren vorwiegend Töchter der etwa 220 SPS-Stiere. Die Milchmerkmale wurden in drei Viehprüfungen an jeder Kuh gemessen, wobei jedes Stück Vieh einer Viehprüfung jeweils im Zeitabschnitt September-Oktober, November-Dezember und Januar-Februar unterzogen wurde. Das Gerät Milkoscan FT120, das eine Fourier-Transformations-Infrarotspektrofotometrie mit vergrößerten Milchkalibrierungen verwendete (Foss Electric Application Note Nrn. 95, P/N 492280 und 102, P/N 578377), wurde dazu verwendet, die Milchkomponentenkonzentrationen festzustellen.
  • Neunhundertundzwölf Töchter wurden hinsichtlich des DGAT1-Polymorphismus genotypisiert, wobei das OLA-System verwendet wurde. Die Analyse wurde unter Verwendung des SAS-Modells (statistisches Material, Version 5, 1985) vorgenommen, das generell linear ausgebildet war. Das Modell umfasste Vater- und Großvatertiere als Festwirkungen, den DGAT1-Polymorphismus (3 Klassen; 0, 1 und 2 Kopien des Q-Allels), Kovariantentiere, die die Sechzehnten der Holstein-Friesland-, Jersey-, Ayrshire- und anderer Rassen umfassten, und Teile der Überseegenetik mit Holstein-Friesland-, Jersey- und Ayrshire-Zuchten. Ertragsabweichungen wurden verwendet, die für das Vieh, die Milchabgabestufe und andere Festwirkungen voreingestellt waren (Johnson et al., 2000).
  • Der DGAT1-Polymorphismus ist für den Laktose-, Kasein-, Betakasein- und Molkeertrag und auch für den Kasein- und Betakaseinprozentsatz statistisch bedeutend, s. die folgende Tabelle 5: Tabelle 5 Wirkung des DGAT1-Polymorphismus auf die Milchkomponenten
    Figure 00440001
    • *Einheiten = g/Tag für den Laktose-, Kasein-, und Molkeertrag und g/l für den β-Kaseinertrag.
  • Töchter in Bezug auf den Festfettgehalt.
  • Sechshundertundzweiundneunzig Töchter wurden inbezug auf den Festfettgehalt genotypisiert. Der Festfettgehalt des Milchfetts ist ein Merkmal, das einen Haupteinfluss auf die Funktionalität der Milchfettprodukte und insbesondere eine bedeutende Wirkung auf die Butterhärte ausübt (MacGibbon & McLennan, 1987). Der Festfettgehalt bei einer Temperatur von 10°C (SFC 10) wurde für einen Vergleich der Eigenschaften des Milchfetts verwendet, das sich gut auf die Schneidhärtemessung der Butter, eine Hauptfunktionseigenschaft, beziehen lässt. Somit können die Eigenschaften der Milchfettprodukte aus den Merkmalen der produzierten Milch vorausgesagt werden. Der Festfettgehalt (SFC) des abgezogenen Fetts wurde mit der gepulsten, nuklearmagnetischen Resonanz (NMR) festgestellt und und als Prozentsatz des Festfetts ausgedrückt (MacGibbon & McLennan, 1987). Wenn das Milchfett geschmolzen wurde, um vor der Rekristallisation unter Standardbedingungen jedwede Wärmevorgeschichte zu beseitigen, gibt der SFC in einfacher Weise die chemische Zusammensetzung des Milchfetts wieder.
  • Die 692 Töchter waren eine Untergruppe der 912 Töchter, die für die in der Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse phänotypisiert und genotypisiert worden sind. Die Festfettgehaltmessungen wurden in zwei Milchabgaben gesam melt. Die Zuchtwerte wurden unter Verwendung eines Tiermodells berechnet, das dem des Johnson et al., 2000, ähnlich war.
  • Dasselbe statistische Model wie für die Milchkomponentenanalyse wurde für die Bestimmung des Festfettgehalts angepasst. Der DGAT1-Polymorphismus besitzt eine statistisch bedeutende Wirkung (p-Wert < 0,0001) auf den Festfettgehalt, der um etwa 1 % für jede Zufügung eines Q-Allels erhöht wird.
  • Diese Wirkung wurde ferner in 50 Töchtern (vorwiegend Holstein-Frieland-Zucht) bestätigt, die an einer Stelle gehalten wurden und deren SFC an ein und demselben Tag gemessen wurde. Die geschätzte Wirkung des DGAT1-Polymorphismus auf den SFC war, dass dieser um etwa 2% je Zufügung eines Q-Allels erhöht würde. Der Befund lag deutlich am Fünfprozent-Schwellwertniveau.
  • Die genetische Standardabweichung für den SFC beträgt 2,25 (persönliche Mitteilung von D. Johnson), und daher beträgt die Wirkung des DGAT1 etwa 0,5 einer genetischen Standardabweichung.
  • 4. Relative Transkriptniveaus der Spleißvariante
  • Realzeit-PCR-Experimente wurden unter Verwendung der umgekehrt transkribierten mRNA durchgeführt, die von milchabgebenden Rindbrustdrüsen abgeleitet wurde (s. experimetelle Verfahren). Diese Experimente ergaben, dass das in 2 gezeigte, alternativ gespleißte Transkript etwa 100 mal kürzer als das Volllängentranskript war.
  • Verfahrensabschnitt
  • Um weitere Polymorphismen im Rinder-DGAT1-Gen zu identifizieren, wurde DNA vom Sperma getrennt, PCR-verstärkt und dann unter Verwendung von Primern, die aus der Sequenz, die in den 2a und 2b gezeigt ist, und/oder aus der cDNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 4) entwickelt wurden, direkt auf einem Gerät ABI 3100 verstärkt. Die geprüften Zuchten waren: Ayrshire, Angler, Belgian Blue, Blond Dáquitaine, Brown Swiss, Charolais, Red Devon, Devon, Dexter, Friesian, Guernsey, Belted Galloway, Gelbvieh, Hereford, Jersey, Limousin, Longhorn, Maine Anjou, MRI (Maas-Rhein-Yssel), Murray grey, Piedmontese, Romangola, Sahiwal, Santa Gertrudis, Scottish Highland, Shorthorn, South Devon, Sussex, Swedish Red, Simmental, Wagyu, WelshBlack, Angus und Zebu.
  • Alle entdeckten Polymorphismen sind in der obigen Tabelle 1 aufgelistet.
  • Die Majorität der Primer ist auch in der 2 aufgelistet oder in der cDNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 4) enthalten.
  • Experimentelles Verfahren für die OLA-Analyse von vier SNPs in DGAT1
  • PCR-Verstärkung der Bereiche, die den Polymorphismus aufweisen.
  • Das Protokoll für die PCR-Verstärkung des Exons VIII, des Introns XII und 3'-UTR, der Bereiche, die vier Polymorphismen aufweisen, die zu Beginn im DGAT1-Gen beschrieben sind:
    Figure 00460001
  • Die Primersequenzen und ebenso der durch diese angesteuerte Genombereich sind in folgender Tabelle aufgeführt:
    Figure 00460002
  • Die PCR-Verstärkung wurde auf einem MJ-PTC100- oder PTCT200-Kreisverstärker unter Verwendung der folgenden Schritte durchgeführt:
    Figure 00470001
  • Oligonukleotidverbindungsanalyse (OLA)
  • Die bei der OLA-Multiplexreaktion verwendeten Oligonukleotide sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Die Feststellung jeder Mutation basiert auf der Verwendung von zwei fluoreszierend gekennzeichneten Oligonukleotiden (SNPx_FAM und SNPx_HEX) und einem gemeinsamen 3'- und 5'-phosphorylierten, nicht gekennzeichneten Oligonukleotid (SNPx_2P).
    Figure 00470002
    • *Die Größe des Verbindungsprodukts ist die Summe der Anzahl der Nukleotide der beiden verbundenen Oligonukleotide plus 3 Basenäquivalente je Abstands-Phosphoramidmolekül, die an den 5'-Enden des gemeinsamen Oligonukleotids vorhanden sind.
  • Für jeden SNP wurde zunächst ein Mischung aus drei Oligonukleotiden präpariert, wobei der dünnen Führungslinien in der folgenden Tabelle zu folgen ist.
  • Figure 00480001
  • Die Verbindungsreaktion für ein Muster wurde folgendermaßen durchgeführt:
    Figure 00480002
    • *Die Endkonzentration der Oligonukleotide bei der Verbindungsreaktion wird in Paranthese angegeben(SNPxFAM bzw. SNPx_HEX bzw. SNPx_2P).
  • Das Muster wurde dem folgenden Temperaturzyklusprogramm in einer MJ-PTC100- oder PTC-200-Maschine ausgesetzt.
  • Figure 00480003
  • Beim Verfolgen der LCR wurden 20μl Wasser zur Verbindungsreaktion hinzugefügt. Zu 0,5μl der verdünnten Verbindungsreaktion wurden entweder 2μl eines Ladepuffers oder 2μl eines Ladepuffers zugefügt, der TAMRA350 Innenliniengrößenstandard aufwies.
  • Der Ladepuffer war folgendermaßen zusammengesetzt: 1 Teil Blaudextran (50mg/ml)/EDTA (25mM) und 6 Teile Formamid.
  • Die den Ladepuffer enthaltende Zusammensetzung TAMRA350 wurde folgendermaßen zusammengesetzt: 3 Teile TAMRA350 (angewandte Biosysteme 401736 und 8nM), 10 Teile Blaudextran (50mg/ml)/EDTA (25mM) und 60 Teile Formamid.
  • TAMR-enthaltende Muster wurden abwechselnd mit TAMRA-freien Mustern platziert, wenn sie dem Sequenziergel zugeführt wurden, um die Identifizierung der Spuren auf dem Gelbild zu erleichtern.
  • Die Muster können ferner eine Verdünnung erfordern, um ein zu intensives, fluoreszierendes Signalauf dem Sequenzer zu vermeiden. Es ist auch sehr wahrscheinlich, dass von einem Primeransatz zum anderen die Oligonukleidkomzentration eine Einstellung erfordert.
  • Die Muster wurden 5 Minuten lang bei einer Temperatur von 95°C vor dem Laden denaturiert. Die Muster wurden dann einem 6%-igen, denaturierenden Akrylamidgel auf einem Sequenzer ABI 373 oder einem 4%-igen Gel auf einem Sequenzer ABI 377 zugeführt.
  • Zusätzlich zu den oben genannten OLA-Analysen wurde die Genotypisierung des DGAT1-Polymorphismus durch Verwendung von zwei verschiedenen Techniken für die Feststellung der PCR-Produkte ausgeführt.
  • Auf Gel basierende Genotypanalyse
  • Die Primersequenzen 5'-3', wobei die Gensequenzüposition in Klammern angegeben ist:
    DGAT1 21: GT.AGCrFrGGCAGGTAAGAA (6811)
    DGAT1 22: GGGGCG (6984)
    DGAT1 23: TGGCCCTGATGGTCTACACC (6613)
    DGAT1 248: GGGCAGCTCCCCCGYI'GGCCGC (6850)
  • Die Endreaktionsbedingungen waren 1X Gold- PCR-Puffer, 2,5mM MgCl2 (angewandte Biosysteme), 200μM jeweils dNTP (Roche), 600nM DGAT21 und DGAT22, 400nM DGAT23 und DGAT24B (Invitrogen), 10% Dimethylsuphoxid (Sigma), 3μl DNA-Matrize und 2,5 Einheiten AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase (angewandte Biosysteme) in einer Gesamtmenge von 50μl.
  • Die Zykusbedingungen waren eine 94°C-Anfangsdenaturisierung mit einer Dauer von 5 Minuten, dann 35 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für eine Dauer von 30 Sekunden, eine Kühlung bei 56°C für eine Dauer von 30 Sekunden, eine Ausdehnung bei 72°C für eine Dauer von 20 Sekunden, die von einem Ausdehnungszyklus von 72°C für eine Dauer von 2 Minuten gefolgt wurde.
  • Primerpositionen um den Polymorphismus (in Fettschrift) auf der Gensequenz von 6587 bis 6986:
    Figure 00500001
  • Das Q-Allel weist die Polymorphismussquenz AA auf und wird durch die DGAT21- und DGAT22-Primer festgestellt, wobei ein Band 174bp erzeugt wird. Das q-Allel weist die Polymorphismussequenz GC auf und wird durch die DGAT23- und DGAT24-Primer festgestellt, wobei ein Band 238bp erzeugt wird.
  • Die Primer DGAT23 und DGAT22 erzeugen auch erfolgreich das DGAT1-Gen, das ein Produkt 372bp bei allen Reaktionen erzeugt. Deshalb würde ein QQ-Homzygot Bänder bei 372bp und 174bp, ein qq-Homozygot Bänder bei 372bp und 238bp und ein Qq-Heterozygot alle drei Bänder 372bp, 238bp und 174bp aufweisen.
  • 18μl PCR-Produkt wurden auf einem 1,2%-igen Agarose-TAE-Gel getrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und durch zwei Investigatoren auf der Basis der Anzahl und Größe der vorhandenen Bänder unabhängig voneinander bewertet.
  • Taqman-Alleldiskriminisierungs-Genotypisierungs-Analyse
    • Primersequenzen 5' bis 3', wobei die Gensequenzposition in Klammern gesetzt ist: DGAT1forAD: TTCTCCTACCGGGACGTCAA (6651) ReverseNZ: CCGCGGTAGGTCAGGTTGTC (6890)
    • Sensorsquenzen 5' bis 3', wobei die Gensequenzposition in Klammern gesetzt ist: ForAA (FAM): CGTTGGCCTTCTTA (6838) DGAT1ADGC (VIC): TTGGCCGCCTTACC (6836)
    • Beide Sensoren verwenden MGB (Kleinkerbenbinder) als nicht fluoreszierenden Löscher.
  • Die Endreaktionsbedingungen sind 1x Universal-PCR-Mastermix (angewandtes Biosystem), 500nM jeder Primer (Invitrogen), 70nM ForAA-(FAM)-Sensor, 300nM DGAT1ADGC-(VIC)-Sensor (angewandte Biosysteme) und 2μl einer 1/20-Verdünnung einer DNA-Matrize in einer Gesamtmenge von 10μl. Die Zyklusbedingungen waren 50°C für eine Dauer von 2 Minuten, 95°C der Anfangsdenaturisierung für eine Dauer von 10 Minuten, dann 37 Denaturisierungszyklen bei 94°C für eine Dauer von 15 Sekunden und eine Abkühlung und Ausdehnung bei 60°C für eine Dauer von 1 Minute.
  • Die Primerpositionen um den Polymorphismus (in Fettschrift) auf den Gensequenzen von 6587 bis 6986:
    Figure 00520001
  • Ein 240bp-Produkt wird bei dieser Reaktion erzeugt. Wenn das Q-Allel (AA) vorhanden ist, bindet der VIC-gekennzeichnete Sensor und fluoresziert bei 518nm. Wenn das q-Allel (GC) vorhanden ist, bindet der VIC-gekennzeichnete Sensor und fluoresziert bei 554nm. Nachdem der Zyklus abgeschlossen ist, wird die Platte auf dem ABI7900-Sequence-Detection-System abgetastet, die Fluoreszenz von jedem klar festgestellt, und dann wird ein Korrelationsdiagramm erstellt. Das Korrelationsdiagramm zeigt drei Ansammlungen aus Q-Homozygoten in der oberen, linken Ecke, q-Homozygoten in der unteren, rechten Ecke und Qq-Heterozygoten dazwischen. Jede Ansammlung ist rund, und die Software stellt den Genotyp für jedes Muster automatisch fest. Auf jeder Platte gibt es Kontrollen mit acht Wellen, von denen jede bekannte Q-Homozygoten, q-Homozygoten, Qq-Heterozygoten und Nichtmatrizenkontrollen aufweist.
  • Spleißvarianten-Genexpression
  • Um die relative Genexpression der Spleißvarianten festzustellen, die durch Einfügen bzw. Entfernen der 66bp um die Polymorphismusstelle durch Änderung der Exon-Verwendung geschaffen werden, wurde die RNA aus dem Brustgewebe herausgelöst und umgekehrt transkribiert, wobei ein oligodT-Primer verwendet wurde, der einen Erststrang-cDNA-Synthese-Kit (Invitrogen) benutzt. Die Realzeit-PCR zur Bestimmung der relativen Mengen jeder Variante wurde dann ausgeführt.
  • Die Primersequenzen 5' bis 3' waren, wobei die Genomsequenzposition in Klammern angegeben ist:

    DGAT1forRT66: TCTCCTACCGGGACGTCAAC (6652)
    DGAT1revRT66: GAGATCGCGGTAGGTCAGGTT (6964)
    DGAT1forRTless66: GCTGCTTTGGCAGATCTCTACTACTT (6711)
    DGAT1revRTless66: AAGCGCTTTCGGATGCG (7038)
  • Die Sensorsequenzen 5' bis 3' waren, wobei die Genomsequenzposition in Klammern gesetzt ist:

    DGAT1with66 (FAM): CCGTGAGCTACCC (6857)

    DGAT1less66 (VIC): CTTCGCCCCCACCCT (6976)
  • Beide Sensoren verwenden MGB (minor groove binder) als nicht fluoreszierenden Löscher.
  • Die Endreaktionsbedingungen waren 1X-Universal-PCR-Mastermix (angewandte Biosysteme), 60nM je Primer (Invitrogen), 60nM je Sensor (angewandte Biosysteme) und 1μl Matrizen-cDNA. in einer Gesamtmenge von 10μl. Die Zyklusbedingungen waren 50°C für eine Dauer von 2 Minuten, 95°C der Anfangsdenaturisierung für eine Dauer von 10 Minuten, dann 37 Denaturisierungszyklen bei 94°C für eine Dauer von 15 Sekunden und eine Abkühlung und Ausdehnung bei 60°C für eine Dauer von 1 Minute.
  • Die Primerpositionen um die 66bp-Einfügung (in Kursivschrift) auf der cDNA-Sequenz wird im Folgenden genannt; der Anfang der cDNA-Sequenz entspricht der Position 6479 auf der Gensequenz, wobei die letzt Base der cDNA der Position 7428 der Gensequenz entspricht:
    Figure 00540001
    Figure 00550001
  • Diese Reaktion stellt das Vorhandensein der Einfügungsspleißvarianten durch Schaffung eines 145bp-Produkts fest, das nur den FAM-Sensor bindet. Die Entfernungsspleißvariante wird durch ein 92bp-Produkt festgestellt, das nur den VIC-Sensor bindet.
  • Die cDNA für jede abwechselnde Spleißvariante wurde zu pGemT (Promega) geklont. Eine Verdünnungsreihe der pGemT in bekannter Menge von jeder Variantenplasmid-DNA wurde für die Erzeugung einer Standardkurve verwendet, die die Linearität der PCR-Reaktion in einem Bereich von DNA-Konzentrationen nachwies. Die Schwellwertzyklusanzahl der Mustervarianten wurde in eine DNA-Menge durch lineare Rückentwicklung zurückgewandelt, und die Mengen jeder vorhandenen Variante wurden verglichen.
  • Das Vorhandensein einer abwechselnden Spleißvariante ergab die Möglichkeit einer abwechselnden Funktion, die in dieser Stufe unbekannt ist.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass eine Beschränkung der Erfindung auf die oben beschriebenen Beispiele nicht beabsichtigt ist. Viele Abänderungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres klar sind, sind möglich, ohne den Schutzumfang zu verlassen, wie er in den beigefügten Ansprüchen zum Ausdruck kommt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Genotypisieren von Rindern für die Verbesserung von Milchproduktionsmerkmalen. Insbesondere umfassen diese Merkmale eine erhöhte Milchmenge, einen erhöhten Proteingehalt und einen verminderten Milchfettgehalt und Festfettgehalt. Es soll erreicht werden können, dass für solche Merkmale ausgewählte Rinderher den Milch erzeugen, die leichter verarbeitet werden kann und dass diese Milch und die daraus erzeugten Milchprodukte dem Verbraucher Gesundheitsvorteile bieten. Ferner soll ein erhöhter Milchertrag erreicht werden können.
  • Sequenzliste
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
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  • Figure 00930001

Claims (25)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einem DNA-Molekül, das ganz oder teilweise die Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 aufweist oder das von der Sequenz aufgrund der Entartung des genetischen Kodes abweicht, oder ein isolierter Nukleinsäurestrang, der mit dem genannten Nukleinsäuremolekül in 6x-Natriumzitrat/Natriumchlorid (SSC) bei einer Temperatur von 45°C hybridisierbar ist, wobei das genannte Nukleinsäuremolekül eine Diacylglyzerol-o-azyltransferase (DGAT1) kodiert, den K232A-Polymorphismus von SEQ-ID-Nr. 13 aufweist und mit verbesserten Milchherstellungswesenszügen verbunden ist.
  2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 mit der Sequenz der SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 und mit dem K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13, wobei dieser Polymorphismus mit verbesserten Milchherstellungswesenszügen verbunden ist.
  3. Isolierte mRNA, die von einer DNA mit einer Sequenz transkribiert ist, die einem Nukleinsäuremolekül gemäß dem Anspruch 1 oder 2 entspricht.
  4. Primer mit einer Nukleotidsequenz, die etwa zwölf benachbarte Basen der SEQ-ID-Nr. 1, 3 oder 4 und ferner den K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 aufweist, der mit verbesserten Milchherstellungswesenszügen verbunden ist.
  5. Rekombinanter Klonvektor mit dem Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 1 oder 2.
  6. Prokaryontische oder eukaryontische Zelle mit dem Klonvektor des Anspruchs 5.
  7. Transfekte Zelllinie, die ein Protein ausdrückt, das durch das Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 1 oder 2 kodiert wird.
  8. Ausstattung zum Genotypisieren eines Rinds in Bezug auf die Milchzusammnensetzung und das Volumen, das mit dem DGAT1-Nukleinsäuremolekül entsprechend der SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 verbunden ist, mit a) einem Primer des Anspruchs 4 oder b) einem Sensor, der aus fünf oder mehr benachbarten Nukleotiden der DGAT1-Sequenz der SEQ-ID-Nr. 1, 3 oder 4 ausgewählt ist und ausreichend komplementär zur genannten Sequenz ist, um sich an diese in 6x-Natriumzitrat/Natriumchlorid (SSC) zu binden, wobei der Sensor ferner den K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 aufweist, oder c) einem ersten Primer und einem zweiten Primer zur Verstärkung des Nukleinsäuremoleküls des K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 in demjenigen Teil des Nukleinsäuremoleküls, der das DGAT1-Protein der SEQ-ID-Nr. 2 kodiert, wobei die Primer zum Nukleinsäuremolekül stromaufwärts bzw. stromabwärts komplementär sind.
  9. Ausstattung nach Anspruch 8, die ferner einen dritten Primer aufweist, der zum K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 komplementär ist.
  10. Gereinigtes Protein mit einer Aminosäurensequenz, die durch das isolierte Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 1 oder 2 kodiert wird.
  11. Antikörper, der in besonderer Weise das Protein des Anspruchs 10 erkennt.
  12. Transgenes, nichtmenschliches Tier mit Zellen, die ein Transgen aufweisen, das in das Tier eingeführt wird, oder ein Vorgänger des Tiers in einer vorgeburtlichen Phase, wobei das Transgen eine Rinder-cDNA aufweist mit a) der Nukleotidsequenz der SEQ-ID-Nr. 4, die den K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 aufweist, b) einer Sequenz, auf der SEQ-ID-Nr. 4 in 6x-Natriumzitrat/Natriumchlorid (SSC) bei einer Temperatur von 45°C hybridisierbar ist und die den K232A-Polymorphismus aufweist, oder c) einer Sequenz, von der die SEQ-ID-Nr. 4 aufgrund der Entartung des genetischen Kodes abweicht und die den K232A-Polymorphismus aufweist.
  13. Transgenes, nichtmenschliches Tier nach Anspruch 12, wobei das endogene, der SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 entsprechende DGAT1-Gen herausgetrennt und durch das genannte Transgen ersetzt worden ist.
  14. Transgenes, nichtmenschliches Tier nach Anspruch 12, wobei das genannte Transgen eine zusätzliche Kopie der der SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 entsprechenden, genkodierenden Rinder-DGAT1 und den K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 aufweist.
  15. Verfahren zum Feststellen der genetischen Hauptwerte eines Rinds inbezug auf die Milchzusammensetzung und das Volumen, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist: ein Rind, das den K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 in der DGAT1-Sequenz entsprechend der SEQ-ID-Nr. 2 aufweist, wird identifiziert, wobei das Feststellen hinsichtlich der DNA, der mRNA und/oder des vom Rind gewonnenen Proteins erfolgt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Feststellen durch Erkennen des Vorhandenseins des K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 in einer Rinder-Polynukleotidsequenz erfolgt, die der SEQ-ID-Nr. 1 oder 4 entspricht.
  17. Verfahren zum Auswählen eines Rinds mit dem K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 in der DGAT1-Sequenz der SEQ-ID-Nr. 2, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist: das Feststellen erfolgt nach Anspruch 15 oder 16, und das Rind wird auf der Basis dieses Feststellens ausgewählt.
  18. Verfahren zum Identifizieren eines Rinds, das einen Genotyp besitzt, der geänderte Milchherstellungswesenszüge aufweist, wobei das Verfahren folgenden Schritt aufweist: der K232A-Polymorphismus der SEQ-ID-Nr. 13 im Rinder-DGAT1-Gen (SEQ-ID-Nr. 1) in einer Probe, die von dem genannten Rind gewonnen wird, wird identifiziert, wobei das Vorhandensein des genannten Polymorphismus mit Milchherstellungswesenszügen verbunden ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die genannten, geänderten Milchherstellungswesenszüge einen Anstieg des Milchvolumens und/oder einen Anstieg des Protein-Fett-Verhältnisses der Milchzusammensetzung oder eine Absenkung des Milchvolumens und/oder eine Erhöhung des Fettgehalts der Milchzusammensetzung aufweisen.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei folgender, weiterer Schritt vorgesehen ist: die genannte Rinder-DGAT1-Gensequenz (SEQ-ID-Nr. 1) wird verstärkt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, die aus der Gruppe, die aus den SEQ-ID-Nummern 20 und 21 besteht, ausgewählten Primer werden bei der Verstärkung verwendet.
  22. Verfahren zur Erzeugung eines Proteins, das durch ein Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 1 oder 2 kodiert wird, mit folgenden Schritten: a) ein DNA-Bruchstück, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die das Protein kodiert, wird präpariert, b) das DNA-Bruchstück wird in einen Expressionsvektor integriert, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu gewinnen, das das DNA-Bruchstück aufweist und wiederholbar ist, c) eine Wirtszelle wird mit dem rekombinanten DNA-Bruchstück transformiert, um eine Transformante zu erzeugen, die das Protein ausdrücken kann, d) die Teransformante wird kultiviert, um das Protein zu erzeugen, und e) das Protein wird aus der sich ergebenden Kulturmischung wiedergewonnen.
  23. Verwendung der DGAT1-Gensequenz SEQ-ID-Nrn. 1, 3 und 4 beim Identifizieren eines oder mehrerer molekularer DNA-Marker bei den Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21.
  24. Verwendung des K232A-Morphismus der SEQ-ID-Nr. 13 bei einem Verfahren zum Identifizieren und Auswählen eines Rinds mit dem genannten Morphismus in dessen DGAT1-Gen (SEQ-ID-Nr. 1).
  25. Verwendung eines Sensors bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei der Sensor aus fünf oder mehreren benachbarten Nukleotiden der DGAT1-Sequenz der SEQ-ID-Nr. 1, 3 oder 4 ausge wählt ist, die zur genannten Nukleinsäuresequenz für die Anbindung daran in einem 6x-Natriumzitrat/Natriumchlorid bei einer Temperatur von 45°C ausreichend komplementär ist.
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