DE69629767T2

DE69629767T2 - Promoter und dessen Verwendung zum Expressionsverfahren

Info

Publication number: DE69629767T2
Application number: DE69629767T
Authority: DE
Inventors: Nobuto Uji-shi KOYAMA; Eiji Osaka-shi Miyoshi; Yoshito Mino-shi Ihara; Atsushi C/O Mr.Kiyohiro Ogawa Nishikawa; Naoyuki Toyonaka-shi Taniguchi
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: EP0753579A2; US5827687A; KR100455004B1; KR970001543A; ES2204980T3; CN1145951A; EP0753579A3; EP0753579B1; DE69629767D1; CN1105188C

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Promotor und ein Verfahren zur Expression eines Gens unter der Verwendung des neuen Promotors. Im Besonderen betrifft die Erfindung eine DNA, die den neuen Promotor, der in tierischen Zellen funktionieren kann, umfasst und ein Verfahren zur Produktion eines Proteins unter der Verwendung eines Vektors, in den eine DNA, die durch die Ligation eines nützlichen Gens stromabwärts des Promotors erhalten wurde, inseriert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens, was das Ligieren des nützlichen Gens stromabwärts des Promotors und das Einbringen der resultierenden DNA oder eines die resultierende DNA tragenden Vektors in eine tierische Zelle umfasst.
Wenn ein mikrobieller Wirt wie zum Beispiel Escherichia coli, Bacillus subtilis oder Hefe verwendet wird, um ein nützliches Genprodukt tierischen Ursprungs durch Genmanipulationstechnologie zu produzieren, ist die Genexpression oft erschwert. Das Erhalten der gewünschten Aktivität ist oft wegen der falschen Konformation, der falschen post-translationalen Modifikation des Genproduktproteins usw. erschwert. Um mit diesem Problem fertig zu werden, werden oft tierische Zellen als Wirte verwendet, in welchem Fall die Wahl des Promotors die Expressionseffizienz eindeutig beeinflusst. Herkömmliche Promotoren für tierische Zellen im allgemeinen Gebrauch schließen den SV40-Promotor, den Cytomegalovirus-Promotor und den Aktin-Promotor ein.
Wenn eine große Menge eines nützlichen Genproduktes unter der Verwendung einer tierischen Zelle als Wirt produziert werden soll, sind die herkömmlich verwendeten Promotoren für tierische Zellen hinsichtlich ihrer Transkriptionsaktivität nicht befriedigend. Daher war eine Entwicklung stärkerer Promotoren gefragt.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist es dementsprechend, eine DNA mit höherer Promotoraktivität als ein Promotor für tierische Zellen und ebenso ein Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens unter der Verwendung eines solche Promotors bereitzustellen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Patentansprüchen reflektierten Ausführungsformen gelöst.
Die vorliegende Erfindung beruht nämlich auf dem Befund, dass ein starker Promotor stromaufwärts des menschlichen N-Acetylglucosaminyltransferase III (menschlichen GnT-III)-Gens vorhanden ist.
Die Ligation dieser Promotorsequenz stromaufwärts des Luciferase-Gens von Photinus und die Expression des Gens zeigen, dass der Promotor eine viel höhere Aktivität als die von herkömmlichen Promotoren für tierische Zellen aufweist.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) DNA, bestehend aus der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit einer Promotoraktivität in einer tierischen Zelle;
(b) DNA, bestehend aus der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit einer Promotoraktivität in einer tierischen Zelle;
(c) DNA, bestehend aus der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit einer Promotoraktivität in einer tierischen Zelle;
(d) DNA, bestehend aus der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit einer Promotoraktivität in einer tierischen Zelle;
(e) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (a) bis (d) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine rekombinante DNA, die die vorstehende DNA und ein nützliches, damit funktionell gekoppeltes Gen umfasst, einen die rekombinante DNA umfassenden Vektor und eine Wirtszelle, in welche die rekombinante DNA oder der Vektor eingefügt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine tierische Zelle. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein nichtmenschliches Tier, das die der Erfindung entsprechenden, tierische Zelle umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Proteins und ein Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens unter der Verwendung der rekombinanten DNA der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise umfasst ein solches Verfahren die Züchtung einer Wirtszelle entsprechend der Erfindung und gegebenenfalls die Gewinnung des produzierten Proteins aus der Kultur.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung den der Erfindung entsprechenden Gebrauch der DNA zur Expression eines damit funktionell gekoppelten, nützlichen Gens in einer tierischen Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA heterolog in Bezug auf die DNA.
1 lässt die Beziehung zwischen der DNA, die den Promotor der vorliegenden Erfindung (pPG204-1.1) umfasst und der cDNA des menschlichen GnT-III-Gens erkennen.
2 ist eine Restriktionsenzym-Karte der Insertion von pHug5'-204.
Der Ausdruck „Promotor", wie er hier verwendet wird, soll die TATA-box oder eine ähnliche Region einschließen, die sich 20 bis 30 Basenpaare stromaufwärts des Transkriptions-Initiationspunktes (+1) befindet und als Induktor der RNA-Polymerase bei der Transkriptions-Inititation an der richtigen Position funktioniert, aber nicht auf Teile in der Nähe dieser Region beschränkt ist. Zusätzlich zu dieser Region kann eine andere, für die Assoziation eines anderen Proteins als die RNA-Polymerase notwendige Region für die Regulation der Expression vorhanden sein. Der Ausdruck „Promotorregion", wie er hier verwendet wird, ist definiert als eine Region, die einen wie hier definierten Promotor enthält.
Der Ausdruck „Promotoraktivität", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass, wenn ein nützliches Gen stromabwärts eines Promotors auf eine solchen Art und Weise ligiert wird, dass das Gen exprimiert werden kann, und in einen Wirt (tierische Zelle) eingebracht wird, der Wirt die Fähigkeit und die Funktion der Produktion eines Produktes des nützlichen Gens innerhalb oder außerhalb des Wirtes zeigt.
Im Allgemeinen wird die Promotoraktivität oder die Anwesenheit oder die Abwesenheit oder die Stärke eines bestimmten Promotors durch das Ligieren eines Gens, das ein einfach zu quantifizierendes Protein kodiert (Reportergen), stromabwärts des Promotors, dergestalt, dass das Gen exprimiert werden kann, durch das Einbringen des Gens in einen Wirt und durch das Messen der Menge des exprimierten Proteins bestimmt. Wenn ein nützliches Gen stromabwärts eines Promotors ligiert wird, dergestalt, dass das Gen exprimiert werden kann, und in einen Wirt eingebracht wird und wenn das Expressionsprodukt des nützlichen Gens innerhalb oder außerhalb des Wirtes nachgewiesen wird, kann man behaupten, dass der Promotor in dem Wirt, in den er eingebracht wurde, Promotoraktivität besitzt.
Der Ausdruck „tierische Zelle", wie er hier verwendet wird, soll einschließen, ist aber nicht beschränkt auf menschliche Zellen, solange der Promotor der vorliegenden Erfindung in einer tierischen Zelle Promotoraktivität zeigt. Solche tierischen Zellen schließen Zellen von nicht-menschlichen Säugern (z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schweinen, Rindern, Pferden, Hunden, Affen und Schimpansen), Vögeln (z. B. Hühnern, Truthähnen, Wachteln, Enten und Wildenten), Reptilien (z. B. Schlangen, Krokodilen und Schildkröten), Amphibien (z. B. Fröschen, Salamandern und Molchen) und Fischen (z. B. Stachelmakrelen, Makrelen, Wolfsbarschen, Goldbrassen, Zackenbarschen, Gelbschwänzen, Thunfischen, Lachsen, Forellen, Karpfen, Ayus, Aalen, Plattfischen, Haien, Rachen und Stören) ein.
Der Ausdruck „nützliches Gen", wie er hier verwendet wird, soll Gene, die ein in tierischen Zellen exprimierbares Protein kodieren, Antisense-DNA oder Antisense-RNA von Genen tierischen Ursprungs, Köder, z. B. eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, das ein Bindeprotein eines Transkriptionsfaktors tierischen Ursprungs kodiert, oder eine DNA-Sequenz, die die Bindestelle des Transkriptionsfaktors und eine ähnliche Sequenz enthält, und Ribozyme, die mRNA aus dem Ursprung tierischer Zellen spalten, einschließen.
Gene, die ein in tierischen Zellen exprimierbares Protein kodieren, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Gene tierischen Ursprungs. Solange sie in tierischen Zellen exprimierbar sind, sind Gene, die von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Actinomyceten, Schimmelpilzen, Ascomycotina und Basidiomyceten stammen, und diejenigen, die von nicht-mikrobiellen Organismen wie Pflanzen und Insekten stammen, ebenfalls in den hier erwähnten, nützlichen Genen eingeschlossen.
Der Ausdruck „Köder", wie er hier verwendet wird, soll eine DNA-Sequenz mit einem Gen, das ein Bindeprotein eines Transkriptionsfaktors tierischen Ursprungs kodiert, oder eine DNA-Sequenz mit einer Sequenz der Bindestelle des Transkriptionsfaktors oder einer ähnlichen Sequenz bedeuten, wobei die DNA-Sequenz des „Köders" in der Lage ist, die Funktion des Transkriptionsfaktors, wenn sie in eine Zelle als „Köder" eingebracht wurde, zu unterdrücken.
Der Ausdruck „Ribozym", wie er hier verwendet wird, wird als ein Enzym definiert, welches die mRNA eines bestimmten Proteins spaltet, um die Translation des Proteins zu inhibieren. Ein Ribozym kann aus der ein bestimmtes Protein kodierenden Gensequenz konstruiert werden. Zum Beispiel kann ein Ribozym vom Hammerkopf-Typ durch das in FEBS Letter, 228, 228–230 (1988) beschriebene Verfahren hergestellt werden. Zusätzlich zu den Ribozymen vom Hammerkopf-Typ sind Ribozyme vom Haarnadelschleifen-Typ, vom Delta-Typ oder von anderen Typen im Umfang der hier erwähnten Ribozyme eingeschlossen, solange sie die mRNA eines bestimmten Proteins spalten, um die Translation des Proteins zu inhibieren.
Durch das funktionelle Koppeln eines nützlichen Gens stromabwärts des DNA Fragments, das eine Promotoraktivität der vorliegenden Erfindung besitzt, kann die Expression des nützlichen Gens verbessert werden. Die Expression des nützlichen Gens findet in tierischen Zellen statt, in welche das die Promotoraktivität der vorliegenden Erfindung besitzende DNA-Fragment mit oder ohne Hilfe eines Vektors eingebracht werden kann. Als Vektor wird vorzugsweise ein Plasmidvektor oder ein Virusvektor verwendet. In dem Fall, dass kein Vektor verwendet wird, kann das DNA-Fragment durch das in Virology, 53, 456 (1973), Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987), Journal of the National Cancer Institute, 41, 351 (1968), EMBO Journal, 1, 841 (1982) und BioTechniques, 6, 682 (1988) beschriebene Verfahren direkt eingebracht werden. Tierische Zellen, die das erfindungsgemäße DNA-Fragment tragen, und nicht-menschliche Tiere, die solche tierischen Zellen besitzen, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung eingeschlossen. Die nützlichen Gene, deren Expression durch die vorliegende Erfindung verbessert werden kann, schließen DNA, die ein Protein kodiert, Antisense-DNA, Antisense-RNA, ein Polynukleotid, das einen Köder kodiert, eine Nukleotidsequenz, die als Köder fungieren kann und ein Ribozym ein. Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls das Verfahren zur Produktion eines gewünschten Proteins und das Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens durch die Verwendung eines DNA-Fragments, das eine Promotoraktivität der vorliegenden Erfindung besitzt.
Die DNA der vorliegenden Erfindung besitzt Promotoraktivität für tierische Zellen und enthält die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 in der Sequenzliste. In anderen Worten ist das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung ein DNA-Fragment, das einen neuen Promotor enthält, und, solange es diesen Promotor enthält, kann es irgendein Fragment der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 oder irgendein Fragment, das einen Teil der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 enthält, sein. Solche DNA-Fragmente schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die DNA-Fragmente von SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 und DNA-Fragmente, die einen Anteil des DNA-Fragmentes von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 3 umfassen, und DNA-Fragmente, die die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 4 enthalten. DNA-Fragmente, die mit diesen DNA Fragmenten hybridisieren können und Promotoraktivität in tierischen Zellen besitzen, sind ebenfalls im Umfang des DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Der Promotor für tierische Zellen der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt entdeckt:
Das menschliche GnT-III-Gen, das von Ihara et al. [Journal of Biochemistry, 113, 692–698 (1993)] aus einer fötalen, hepatischen cDNA-Genbank und einer genomischen Cosmid-Genbank isoliert wurde, wurde für die vorliegende Erfindung verwendet. Von den das menschliche GnT-III-Gen kodierenden cDNA-Klonen H15 und H20 (offengelegtes, japanisches Patent Nr. 6-62865) enthält jeder eine 5'-seitige, untranslatierte Region und die DNA-Sequenzen der zwei 5'-seitigen, untranslatierten Regionen sind unterschiedlich zueinander, außer der 8 Basenpaare stromaufwärts des erwarteten Initiationskodons. Die zwei Cosmide Hug3 und Hug5 wurden als genomische Klone erhalten, von denen Hug3 die kodierende Region des GnT-III-Gens und eine etwa 35 kb-große Region stromaufwärts davon enthält.
Mit dieser Tatsache im Sinn wurden Southern-Hybridisierungen, DNA-Sequenzierungen usw. des Hug3-Cosmidklons mit den 5'-seitigen, untranslatierten Regionen von H15 und H20 als Sonden durchgeführt, was demonstrierte, dass H15 Exonen etwa 29 kb (H15 Exon-2) und 1 kb (H15 Exon-1) stromaufwärts des Initiationskodons und H20 ein Exon etwa 26 kb stromaufwärts des Initiationskodons aufweist. Eine 5'-seitige, rasche cDNA-Enden-Amplifikation (RACE) mit mRNA von menschlichem Gehirn als Matrize wurde unter der Verwendung eines für das GnT-III-Gens spezifischen Primers durchgeführt, was die Anwesenheit von mRNA ohne Spleißen an einer Position 7 Basenpaare stromaufwärts des Initiationskodons, wo in H15 und H20 Spleißen stattfindet, demonstrierte. Die aus dieser mRNA erhaltene cDNA wurde mit H204 bezeichnet.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es mindestens drei Transkriptionsprodukte des menschlichen GnT-III-Gens gibt. Da von den in der Transkription von H15, H20 und H204 involvierten Promotoren angenommen wird, dass sie stromaufwärts des H15 Exons-2, stromaufwärts des H20 Exons-1 bzw. stromaufwärts des erwarteten Translations-Initiationspunktes in dem Genom vorliegen, wurde die Promotoraktivität der DNA-Fragmente, die diese Regionen enthalten, in COS1-Zellen mit dem Luciferase-Gen von Photinus als Reportergen bestimmt. Wie in 1 gezeigt (Kästen sind Exon-Anteile; punktierte Linien sind Intron-Anteile), wurde in dem etwa 3 kb-großen Fragment (das Plasmid, das dieses Fragment enthält, ist mit pPG20B bezeichnet) stromaufwärts von H20 von der HindIII-Stelle in H15 Exon-2 bis zu der SacII-Stelle in H20 Exon-1 keine Promotoraktivität nachgewiesen. Promotoraktivität wurde jedoch in dem etwa 3 kb-großen Fragment (das Plasmid, das dieses Fragment enthält, ist mit pPG15 bezeichnet) von der EcoRI-Stelle stromaufwärts von H15 bis zu der HindIII-Stelle in H15 Exon-2 und in dem etwa 1,1 kb großen Fragment (das Plasmid, das dieses Fragment enthält, ist als pPG204-1.1 bezeichnet) von der SphI-Stelle stromaufwärts der kodierenden Region bis zu der NaeI-Stelle in der kodierenden Region, d. h. dem H204 enthaltenden Fragment, nachgewiesen; es wurde festgestellt, dass das letztere etwa 10 mal stärker als das erstere und etwa 1,5 mal stärker als der SV40-Promotor ist.
Darüber hinaus enthält dieses 1,1 kb-Fragment eine XhoI-Stelle etwa 0,8 kb, eine SspI-Stelle etwa 0,5 kb und eine HincII-Stelle etwa 0,2 kb entfernt von der NaeI-Stelle; wenn pPG204-1.1 mit irgendeinem dieser Restriktionsenzyme in Kombination mit BamHI, ein Restriktionsenzym mit einer Spaltstelle in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors, gespalten wird, kann ein 0,8 kb-großes Fragment (Fragment A), ein 0,5 kb-großes Fragment (Fragment B) und ein 0,2 kb-großes Fragment (Fragment C), welche das GnT-III-Inititationskodon enthalten, herausgeschnitten werden. Es wurde festgestellt, dass diese Fragment hinsichtlich ihrer Promotoraktivität etwa 2–3 mal stärker als das vorstehend erwähnte 1,1 kb-Fragment und 3–5 mal stärker als der SV40-Promotor sind. Die vorliegende Erfindung demonstriert also, dass die DNA-Fragmente, die einen etwa 0,2–1,0 kb-großen Anteil stromaufwärts der das menschliche GnT-III-Gen kodierenden Region enthalten, starke Promotoraktivität besitzen. Das Verfahren, um das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung zu erhalten, ist hier im folgenden genau beschrieben.
(1) Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das in tierischen Zellen Promotoraktivität besitzt
Ein genomischer Cosmid-Klon, der einen Anteil stromaufwärts des menschlichen GnT-III-Gens enthält, z. B. der Cosmid-Klon Hug3 von Ihara et al., wurde mit den Restriktionsenzymen SphI und NaeI (beide produziert durch Takara Shuzo) gespalten; ein 1,1 kb-großes DNA-Fragment, das eine Region unmittelbar stromaufwärts der GnT-III-kodierenden Region enthält, wird isoliert. Dieses DNA-Fragment hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr: 1. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor, z. B. pUC 19 (produzeirt durch Takara Shuzo), subkloniert, um seine Verwendung zur Ligation mit einem nützlichen Gen und zu anderen Zwecken zu vereinfachen.
Die Nukleotidsequenz des subklonierten 1,1 kb-SphI-NaeI-Fragmentes (pHug5'-204) kann zum Beispiel durch das Didesoxy-Verfahren [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74, 5463 (1977)] bestimmt werden. Es ist üblicherweise schwierig, die Nukleotidsequenz eines 1,1 kb-großen Fragmentes in einer einzigen Reaktion zu bestimmen; zu diesem Zweck stehen einige Verfahren zur Verfügung, einschließlich des Verfahrens, in dem das Fragment mit geeigneten Restriktionsenzymen weiter gespalten und subkloniert wird, gefolgt durch die Didesoxy-Reaktion, des Verfahrens, in dem unter der Verwendung von Exonuklease III eine Reihe von Deletionsplasmiden hergestellt wird, gefolgt durch die Didesoxy-Reaktion, und des Verfahrens, in dem auf der Basis der bekannten Nukleotidsequenzen nacheinander Primer synthetisiert werden, gefolgt durch die Didesoxy-Reaktion. In der vorliegenden Erfindung wurde das Fragment mit den Restriktionsenzymen BstXI, XhoI, SspI, KpnI und HincII weiter gespalten (Restriktionsenzymkarte für die pHug5'-204-Insertionen ist in 2 gezeigt), subkloniert und der Didesoxy-Reaktion unterzogen, um die Nukleotidsequenz von pHug5'-204, wie in SEQ ID NR: 1 der Sequenzliste gezeigt, zu bestimmen.
Wie in 2 gezeigt, enthält dieses 1,1 kb-Fragment eine XhoI-Stelle etwa 0,8 kb, eine SspI-Stelle etwa 0,5 kb und eine HincII-Stelle etwa 0,2 kb entfernt von der NaeI-Stelle. Wenn pHug5'-204 mit irgendeinem dieser Restriktionsenzyme in Kombination mit BamHI, ein Restriktionsenzym mit einer Spaltstelle in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors, gespalten wird, kann das 0,8 kb-große Fragment (Fragment A) von SEQ ID NR: 2 in der Sequenzliste, das 0,5 kb-große Fragment (Fragment B) von SEQ ID NR: 3 und das 0,2 kb-große Fragment (Fragment C) von SEQ ID NR: 4, welche alle das GnT-III-Inititationskodon enthalten, herausgeschnitten werden.
(2) Herstellung des DNA-Fragmentes, das den Promotor der vorliegende Erfindung enthält
Der einfachste Ansatz für die Herstellung eines DNA-Fragmentes, das den Promotor der vorliegenden Erfindung enthält, ist es, es aus dem vorstehend beschriebenen Cosmid oder Plasmid durch die Spaltung mit den Restriktionsenzymen SphI und NaeI (beide produziert durch Takara Shuzo) herauszuschneiden, nötigenfalls mit einer weiteren Spaltung mit solchen Restriktionsenzymen wie XhoI, SspI und HincII. Andere nützliche Verfahren schließen Spaltung mit anderen Restriktionsenzymen, Ultraschallbehandlung, chemische Syntheses mit Hilfe des Phosphoamidit-Verfahrens und Verfahren unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion ein. Das erwünschte DNA-Fragment kann zum Beispiel auf einfache Weise durch das Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Verwendung eines geeigneten Primers, der zum Beispiel aus der DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 1 gewonnen wurde, hergestellt werden.
Durch eine Hybridisierung unter der Verwendung der Nukleotidsequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung kann der Promotor der vorliegenden Erfindung auch von einem aus einer anderen Zelle stammenden Gen erhalten werden. In diesem Fall ist zum Beispiel das folgende Verfahren anwendbar. Zuerst wird chromosomale DNA, die aus einer anderen zellulären Genquelle erhalten wurde, durch ein herkömmliches Verfahren an ein Plasmid, einen Phagenvektor oder ähnliches ligiert und in einen Wirt eingebracht, um eine Genbank herzustellen. Die Genbank wird dann auf Platten gezüchtet; die resultierenden Kolonien oder Plaques werden auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran transferiert, gefolgt durch eine Denaturierung, um die DNA auf der Membran zu immobilisieren. Die Membran wird anschließend in einer Lösung inkubiert, die eine vorher mit ³²P markierte Sonde (nützliche Sonden schließen das DNA-Fragment von SEQ ID NR: 1 in der Sequenzliste und Anteile davon, wie Fragment A (SEQ ID NR: 2), Fragment B (SEQ ID NR: 3) und Fragment C (SEQ ID NR: 4 ein), usw. enthält, um ein Hybrid zwischen der DNA auf der Membran und der Sonde zu erzeugen.
Zum Beispiel wird die Membran mit der immobilisierten DNA mit der Sonde für 20 Stunden bei 65°C in einer Lösung, die 6 SSC, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 μg/ml Lachsspermien-DNA und 5 × Denhardt's enthält, hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung wird unspezifische Adsorption weggewaschen, gefolgt durch Autoradiographie usw., um Klone zu identifizieren, die mit der Sonde ein Hybrid gebildet haben. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis ein einzelner Klon das Hybrid gebildet hat. Der auf diese Weise erhaltene einzelne Klon trägt den gewünschten Promotor in sich inseriert.
Die Nukleotidsequenz des erhaltenen Gens wird zum Beispiel durch das nachstehend beschriebene Verfahren bestimmt, um die Identität des Gens als den gewünschten Promotor zu beweisen. Die Nukleotidsequenzierung der durch die Hybridisierung erhaltenen Klone wird wie nachstehend erwähnt bewerkstelligt, wenn die Rekombinante Escherichia coli ist: die Rekombinante wird in Teströhrchen inkubiert usw.; das Plasmid wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen gespalten; die Insertion wird herausgenommen und in den M13-Phagenvektor usw. subkloniert, gefolgt durch eine Nukleotidsequenzierung durch das Didesoxy-Verfahren. Wenn die Rekombinante ein Phage ist, kann im wesentlichen den gleiche Prozeduren nachgegangen werden, um eine Nukleotidsequenzierung zu bewerkstelligen. Diese grundlegenden Arbeitsschritte von der Züchtung bis zur Nukleotidsequenzierung können durchgeführt werden, wie zum Beispiel beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, herausgegeben durch T. Maniatis et al., Kapitel 1, S. 90–104, veröffentlicht durch Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Die Identität des erhaltenen Gens als der gewünschte Promotor kann auf der Basis der Homologie der bestimmten Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung eingeschätzt werden. Wenn angenommen wird, dass das erhaltene Gen den vollständigen Promotor nicht enthält, kann die Nukleotidsequenz des vollständigen Promotors, der an den Promotor der vorliegenden Erfindung hybridisiert, bestimmt werden, indem auf der Basis des erhaltenen Gens ein synthetischer DNA-Primer synthetisiert und der fehlende Bereich durch PCR amplifiziert wird oder eine DNA- oder cDNA-Genbank unter der Verwendung eines Fragmentes des erhaltenen Gens als Sonde durchmustert wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Expression eines nützlichen Gens ist dadurch gekennzeichnet, dass das nützliche Gen stromabwärts des Promotors der vorliegenden Erfindung dergestalt ligiert wird, dass das Gen exprimiert werden kann; ein auf diese Weise hergestelltes DNA-Fragment wird in eine tierische Zelle eingebracht; und die resultierende Zelle wird gezüchtet. Um das gewünschte, nützliche Gen stromabwärts des wie vorstehend hergestellten DNA-Fragments, welches den Promotor der vorliegenden Erfindung dergestalt enthält, dass das Gen exprimiert werden kann, zu ligieren, kann DNA-Ligase und das Homopolymer-Verfahren verwendet werden. Wenn für die Ligation von zwei DNA-Fragmenten, denen die gleiche Restriktionsenzymschnittstelle gemeinsam ist, DNA-Ligase verwendet wird, wird die Ligation bewerkstelligt, indem die Fragmente mit dem entsprechenden Restriktionsenzym gespalten, in dem in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben durch T. Maniatis et al., Kapitel 1, S. 62, veröffentlicht durch Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschriebenen Reaktionspuffer zusammengemischt werden und DNA-Ligase zugegeben wird. In einer anderen Ausführungsform, wenn den zwei DNA-Fragmenten nicht die gleiche Restriktionsenzymschnittstelle gemeinsam ist, werden sie zusammen ligiert, indem ihre Enden unter der Verwendung von T4-DNA-Polymerase (produziert durch Takara Shuzo) geglättet werden und sie wie vorstehend beschrieben mit DNA-Ligase behandelt werden. Wenn das Homopolymer-Verfahren angewendet wird, wird an das 3'-seitige Ende des Vektors, der vorher mit einem Restriktionsenzym linearisiert wurde, unter der Verwendung der terminalen Desoxyribonukleotidyl-Transferase und dGTP ein polyG-Schwanz angehängt; an das 3'-seitige Ende der Insertions-DNA wird auf die gleiche Weise ein polyC-Schwanz angehängt; diese polyG- und polyC-Schwänze werden miteinander verschmolzen und zum Beispiel durch das Calciumchlorid-Verfahren [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75, 3727 (1978)] in Escherichia coli eingebracht.
Beispiele für gewünschte, nützliche Gene für die vorliegende Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Interleukin 1 bis 12-Gene, Interferon α, β und γ-Gene, das Tumor-Nekrose-Faktor-Gen, das Kolonie-stimulierender Faktor-Gen, das Erythropoietin-Gen, das transformierender Wachstumsfaktor-β-Gen, Immunglobulin-Gen, das Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen, das Urokinase-Gen und das Photinus-Luciferase-Gen.
Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment, das aus der Ligation des DNA-Fragmentes der vorliegenden Erfindung mit einem nützlichen Gen resultiert, kann in einen geeignete Vektor, vorzugsweise ein Vektor für tierische Zellen, inseriert werden, um ein Plasmid für die Genexpression zu ergeben. Solche Vektoren schließen pTM [Nucleic Acids Research, 10, 6715 (1982)], cos202 [The EMBO Journal, 6, 355 (1987)], p91203(B) [Science, 228, 810 (1985)] und BCMGSNeo [Journal of Experimental Medicine, 172, 969 (1990)] ein.
Das erhaltene Plasmid kann für die Genexpression durch herkömmliche Verfahren wie das Calciumphosphat-Verfahren [Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987)], das Elektroporations-Verfahren [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 81, 7161 (1984)], das DEAE-Dextran-Verfahren [Methods in Nucleic Acids Research, S. 283, herausgegeben durch Karam, J. D. et al., veröffentlicht durch CRC Press, 1991] und das Liposomen-Verfahren [BioTechniques, 6, 682 (1989)] in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden. Solche Wirtszellen sind vorzugsweise tierische Zellen und schließen zum Beispiel COS 1-Zellen, HELA-Zellen, CHO-21-Zellen und BHK-21-Zellen ein. Durch das Züchten der erhaltenen transformierten Zellen in einem geeigneten Medium kann das gewünschte, nützliche Genprodukt auf effiziente Weise produziert werden.
Durch die Verwendung des DNA-Fragmentes der vorliegenden Erfindung als Promotor kann ein gewünschtes, nützliches Genprodukt in großen Mengen in einer tierischen Zelle exprimiert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Der Cosmid-Klon Hug3, der eine Genomregion birgt, die das durch Ihara et al. [Journal of Biochemistry, 113, 692 (1993)] berichtete GnT-III-Gen enthält, wurde mit den Restriktionsenzymen SphI und NaeI (beide produziert durch Takara Shuzo) gespalten und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Ein 1,1 kb-großes Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten, gefolgt durch eine DNA-Gewinnung unter Verwendung von EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo). Dieses DNA-Fragment wurde mittels T4-DNA-Ligase an pUC19, das vorher mit SphI und HincII gespalten wurde, ligiert, wonach es durch das Calciumchlorid-Verfahren in Escherichia coli XL1-Blue eingebracht wurde. Die resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden abgepickt und gezüchtet; aus den gezüchteten Zellen wurde mit Hilfe des Alkali-Verfahrens ein Plasmid gewonnen. An der multiplen Klonierungsstelle von pUC19 sind HindIII-, SphI-, HincII- und BamHI-Stellen in dieser Reihenfolge nah zueinander angeordnet. Das Plasmid wurde mit BamHI und HindIII doppelt gespalten und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen; es wurde gefunden, dass das Plasmid ein 1,1 kb-großes HindIII-BamHI-Fragment (die Nukleotidsequenz dieses Fragmentes wurde als die Sequenz von SEQ ID NR: 1 identifiziert) enthält und das Plasmid wurde mit pHug5'-204 bezeichnet. Escherichia coli XL1-Blue wurde mit diesem Plasmid transformiert, um die Transformante Escherichia coli X11-Blue/pHug3'-204 zu ergeben (hinterlegt unter FERM BP-5532 am Nationalen Institut für Biowissenschaften und Human-Technologie, Geschäftsstelle für industrielle Wissenschaft und Technologie).
pHug5'-204 wurde dann mit BamHI und HindIII gespalten; das resultierende 1,1 kb-Fragment wurde unter der Verwendung von EASYTRAPTM aus dem Agarosegel gewonnen, gefolgt durch ein Glätten der Enden unter der Verwendung der T4-DNA-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo) in der Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP. In einem separaten Ansatz wurde ein Enhancer-Vektor (hergestellt durch Toyo Ink) als ein Plasmid, dem ein Promotor fehlt und das das Photinus-Luciferase-Gen, den SV40-Enhancer, den Replikations-Initiationspunkt von Escherichia coli und das Ampicillin-Resistenzgen enthält, an der SmaI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des Photinus-Luciferase-Gens gespalten und unter der Verwendung der T4-DNA-Ligase an das vorher gewonnene 1,1 kb-Fragment ligiert, wonach das Ligationsprodukt mit Hilfe des Calciumchlorid-Verfahrens in Escherichia coli XL1-Blue eingebracht wurde.
Um die Orientierung des 1,1 kb-Fragmentes festzustellen, wurde ein Plasmid von dem Ampicillin-resistenten Bakterium präpariert, mit XhoI gespalten und einer Agarosegel elektrophorese unterzogen. Durch die Beurteilung der Restriktionsenzymkarte wurde erwartet, dass ein 0,8 kb-großes Fragment auftreten wird, wenn das 1,1 kb-Fragment in der gleichen Orientierung wie das Photinus-Luciferasegen inseriert wurde, und dass ein 0,3 kb-großes Fragment auftreten wird, wenn das 1,1 kb-Fragment in der umgekehrten Orientierung inseriert wurde. Mit dieser Tatsache im Sinn wurde ein Plasmid, das ein 0,8 kb-großes XhoI-Fragment trägt, ausgewählt, um pPG204-1.1 zu ergeben.
In einen 2 Liter-fassenden, konischen Kolben, der LB-Medium [1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt (beides hergestellt von DIFCO), 0,5% NaCl] und 100 μg/ml Ampicillin enthält, wurde der pPG204-1.1 tragende Escherichia coli angeimpft, gefolgt durch eine Schüttelkultur über Nacht bei 37°C, nach der das Plasmid durch das in Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987) beschriebene Cäsiumchlorid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrtfugations-Verfahren präpariert wurde. pPG204-1.1, 20 μg pro 10 cm-Petrischale, wurde durch das in Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987) beschriebene Calciumphosphat-Verfahren in COSI-Zellen (ATCC CRL 1650) transfiziert.
Die Luciferase-Aktivität der transfizierten COS1-Zellen wurde unter der Verwendung eines PicaGeneTM-Kits (hergestellt durch Toyo Ink) bestimmt, wie in der Bedienungsanleitung des Kits angegeben. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in 0,7 ml der in dem Kit enthaltenen zelllysierenden Lösung suspendiert; 20 μl der Überstandes und 100 μl eines Luminiszenz-Substrates wurden zusammengemischt, wonach unmittelbar die Intensität der Luminiszenz unter der Verwendung eines Flüssig-Szintillationszählers bestimmt wurde. Als Positivkontrolle wurden die Zellen mit dem in dem Kit enthaltenen Kontrollvektor (SV40-Promotor) transfiziert; als Negativkontrolle wurden die Zellen mit dem Enhancer-Vektor transfiziert.
Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass pPG204-1.1, das das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung beinhaltet, hinsichtlich der Promotoraktivität viel stärker als der SV40-Promotor ist.
Beispiel 2
pHug5'-204 wurde mit XhoI gespalten, gefolgt durch ein Glätten der Enden in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTp unter der Verwendung der T4-DNA-Polymerase, wonach es weiter mit BamHI gespalten und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen wurde, gefolgt durch die Gewinnung eines 0,8 kb-großen Fragmentes (Fragment A) unter Verwendung des EASYTRAPTM. In einem separaten Ansatz wurde pHug5'-204 mit SspI und BamHI gespalten, gefolgt durch die Gewinnung eines 0,5 kb-großen Fragmentes (Fragment B) auf die gleiche Weise wie für Fragment A. pHug5'-204 wurde ebenfalls mit HincII und BamHI gespalten, gefolgt durch die Gewinnung eines 0,2 kb-großen Fragmentes (Fragment C) auf die gleiche Weise wie für Fragment A.
Fragment A ist 817 bp-langes DNA-Fragment, das die Region vom 300sten C bis zu dem 1116ten C des DNA-Fragmentes von SEQ ID NR: 1 abdeckt; Fragment B ist ein 522 bp-langes DNA-Fragment, das die Region von dem 595sten A bis zu dem 1116ten C des DNA-Fragmentes von SEQ ID NR: 1 abdeckt; Fragment C ist ein 200 bp-langes DNA-Fragment, das die Region von dem 917ten G bis zum 1116ten C des DNA-Fragmentes von SEQ ID NR: 1 abdeckt. Fragment A, B oder C wurde an den Enhancer-Vektor, der vorher mit SmaI und BamHI gespalten wurde, ligiert und in Escherichia coli XL1-Blue eingebracht. Von dem auf diese Weise erhaltenen Ampicillin-reisitenten Stamm wurde Plasmid-DNA extrahiert und mit ScaI und HindIII gespalten; die Insertion des gewünschten Fragmentes wurde bestätigt. Im Besonderen wird erwartet, dass ein 2,0 kb-großes Fragment auftritt, wenn Fragment A inseriert wurde, dass ein 1,7 kb-großes Fragment auftritt, wenn Fragment B inseriert wurde, und das ein 1,4 kb-großes Fragment auftritt, wenn Fragment C inseriert wurde. pPG204-0.8, das Fragment A trägt, pPG204-0.5, das Fragment B trägt, und pPG204-0.2, das Fragment C trägt, wurde somit erhalten.
Von Escherichia coli-Stämmen, die pPG204-0.8, pPG204-0.5 bzw. pPG204-0.2 tragen, wurden Plasmide durch das Cäsiumchlorid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugations-Verfahren auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 präpariert, gefolgt durch eine Transfektion von COS1-Zellen. Die Luciferase-Aktivität der Extrakte der transfizierten COS1-Zellen wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, außer dass die Intensität der Luminiszenz unter der Verwendung eines Luminometers (LB 9501, hergestellt durch Belthold) bestimmt wurde.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die kleineren Fragmente hinsichtlich ihrer Promotoraktivität 2 bis 3 mal stärker als das 1,1 kb-SphI-NaeI-Fragment sind.
Andere Modifikationen der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die für Fachleute offensichtlich sind, sollen im Umfang der folgenden Patentansprüche enthalten sein.
SEQUENZLISTE

Claims

DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (b) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (c) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (d) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und (e) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (a) bis (d) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle.
Vektor, umfassend eine DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (b) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (c) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (d) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und (e) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (a) bis (d) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und ein nützliches Gen, welches funktionell daran gekoppelt ist, wobei das nützliche Gen heterolog in Bezug auf die DNA ist.
Vektor nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein Plasmidvektor oder ein Virusvektor ist, welche für tierische Zellen geeignet sind.
Vektor nach Anspruch 2 oder 3, wobei das nützliche Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, welche ein Protein codiert, Antisense-DNA, Antisense-RNA, einem Polynucleotid, welches einen Köder („decoy") codiert, und einem Ribozym.
Tierische Wirtszelle, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
Nicht-menschliches Tier, umfassend die tierische Zelle nach Anspruch 5.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins unter Verwendung einer tierischen Wirtszelle, umfassend die Schritte: (a) Ligieren einer DNA, die ein gewünschtes Protein codiert, stromabwärts einer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (1) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (2) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (3) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (4) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und (5) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (1) bis (4) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; wobei die DNA-Sequenz, welche ein gewünschtes Protein codiert, heterolog in Bezug auf die DNA ist, um ein rekombinantes DNA-Fragment zu erhalten, dergestalt, dass die DNA, welche das gewünschte Protein codiert, exprimiert werden kann; (b) Einfügen des rekombinanten DNA-Fragments in einen Vektor; (c) Transformieren einer tierischen Wirtszelle mit dem Vektor; (d) Züchten der tierischen Zelle; und (e) Gewinnen des gewünschten Proteins aus der Kultur.
Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens, umfassend die Schritte: (a) Ligieren des nützlichen Gens stromabwärts einer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (1) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (2) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (3) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (4) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und (5) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (1) bis (4) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; wobei das nützliche Gen heterolog in Bezug auf die DNA ist, um ein rekombinantes DNA-Fragment zu erhalten, dergestalt, dass die DNA, welche das gewünschte Protein codiert, exprimiert werden kann; (b) Einfügen des rekombinanten DNA-Fragments in eine tierische Wirtszelle; (c) Züchten der tierischen Zelle.
Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, umfassend die Schritte: (a) Ligieren des nützlichen Gens stromabwärts einer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (1) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (2) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (3) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; (4) DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt oder einem Fragment davon, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; und (5) DNA, welche in der Lage ist, an eine vorstehende DNA aus (1) bis (4) zu hybridisieren, mit Promotoraktivität in einer tierischen Zelle; wobei das nützliche Gen heterolog in Bezug auf die DNA ist, um ein rekombinantes DNA-Fragment zu erhalten, dergestalt, dass die DNA, welche das gewünschte Protein codiert, exprimiert werden kann; (b) Einfügen des rekombinanten DNA-Fragments in einen Vektor; (c) Transformieren einer tierischen Wirtszelle mit dem Vektor; (d) Züchten der tierischen Zelle.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches das Züchten einer tierischen Wirtszelle nach Anspruch 5 und Gewinnen des Proteins aus der Kultur umfasst.
Verwendung einer DNA nach Anspruch 1 zur Expression eines nützlichen Gens, welches funktionell daran gekoppelt ist, in einer tierischen Wirtszelle.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Gen heterolog in Bezug auf die DNA ist.
Vektor, umfassend die DNA nach Anspruch 1, wobei der Vektor ein für tierische Zellen geeigneter Plasmid- oder Virusvektor ist und der Vektor in der Lage ist, ein nützliches Gen einzubauen, welches heterolog in Bezug auf die DNA ist, stromabwärts der DNA.