KR100455004B1 - 신규 프로모터 및 이를 이용한 유전자 발현방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 동물세포에서 프로모터 활성을 갖는 분리 DNA; 상기 분리 DNA를 이용한 유용한 유전자의 발현 방법; 그리고 상기 분리 DNA를 이용한 동물세포에서 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 동물세포에서 상당한 양으로 원하는 유전자 산물을 생산하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 신규 프로모터 및 신규 프로모터를 이용한 유전자의 발현 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 동물 세포에서 작용할 수 있는 신규 프로모터를 구성하는 DNA 및 프로모터 하류 방향에 유용한 유전자를 결찰시킴으로써 획득되는 DNA 가 삽입되어 있는 벡터를 이용한 단백질 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유용한 유전자의 발현 방법, 즉, 프로모터 하류 방향에 유용한 유전자의 결찰, 및 상기 결과로 얻어지는 DNA 또는 상기 결과로 얻어지는 DNA를 운반하는 벡터를 동물세포내로의 도입으로 구성된 발현 방법에 관한 것이다.
에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtillus), 또는 효모와 같은 미생물 숙주가 유전자 공학 기술에 의해 동물 기원의 유용한 유전자 산물을 생산하는데 이용될 때, 유전자 발현은 종종 방해가 된다.바람직한 활성의 획득은 유전자 산물인 단백질의 잘못된 형태, 잘못된 해독후 변형 등에 의하여 종종 방해가 된다. 이러한 문제점에 대처하기 위하여, 동물세포가 종종 숙주로 이용되는데, 이 경우에 프로모터의 선택이 효율적인 발현에 중요한 영향을 준다. 일반적인 용도에서의 동물세포에 대한 종래의 프로모터에는 SV40 프로모터, 시토메갈로비루스 프로모터 및 엑틴 프로모터가 포함된다.
유용한 유전자 산물의 많은 양이 숙주로 동물세포를 이용하여 생성될시에, 종래에 사용되어오던 동물세포용 프로모터는 전사 활성면에서 만족스럽지 못하다. 따라서, 보다 강력한 프로모터의 개발이 요구되어 왔다.
따라서, 본 발명의 목적은 동물세포용 프로모터로서 높은 프로모터 활성을 갖는 DNA를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 이용한 유용한 유전자의 발현 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 높은 전사 효율을 갖는 프로모터를 획득하기 위하여 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 강력한 프로모터가 인간 N-아세틸로글루코자미닐 트랜스퍼라제 Ⅲ (인간 GnT-Ⅲ) 유전자의 상류 방향에 존재한다는 것을 발견하였다. 그런 다음, 본 발명자들은 프로모터를 구성하는 DNA 의 염기서열을 결정하고, 상기 DNA를 포티누스 루시퍼라제 (Photinus luciferase) 유전자의 상류 방향에 결찰시켜, 그 유전자를 발현시켰다. 그 결과, 그들은 상기 프로모터가 종래의 동물세포용 프로모터보다 훨씬 높은 활성을 가짐을 확인하였다. 이러한 발견을 기초로 하여, 본 발명은 완성되었다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는서열을 갖는 분리 DNA 에 관한 것이다:
(a) 서열 ID 번호 : 1 의 서열 또는 이의 단편으로 구성된 DNA 서열;
(b) 서열 ID 번호 : 2 의 서열 또는 이의 단편으로 구성된 DNA 서열;
(c) 서열 ID 번호 : 3 의 서열 또는 이의 단편으로 구성된 DNA 서열;
(d) 서열 ID 번호 : 4의 서열 또는 이의 단편으로 구성된 DNA 서열; 및
(e) 상기 (a) 내지 (d) 서열 중 어느 하나와 혼성화될 수 있는 DNA 서열,
여기서, 상기 분리 DNA 는 동물세포에서 프로모터 활성을 갖는다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 분리 DNA 및 여기에 작동 가능하게 연결되어 있는 유용한 유전자로 구성되는 재조합 DNA, 재조합 DNA 로 구성되는 벡터, 재조합 DNA 또는 벡터가 도입되는 동물세포, 및 상기 동물세포를 갖는 동물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA를 이용한 단백질 생산방법 및 유용한 유전자의 발현 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터" 용어는 복제 개시점 (+1) 로 부터 20 내지 30 염기쌍 정도 상류 방향에 위치하고 그 오른쪽 지점에서 전사가 개시될 수 있도록 RNA 폴리머라제를 유도하는 기능을 갖는 TATA 박스 또는 비슷한 영역을 포함함을 의도하지만 이러한 영역에 밀접한 부위만으로 제한되는 것은 아니다. 이러한 영역 이외에, RNA 폴리머라제 이외의 단백질의 결합을 위한 다른 필요한 영역이 발현 조절을 위해 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "프로모터" 용어는 여기서 정의한 프로모터를 포함하는 영역으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터 활성" 용어는 유용한 유전자를 그것이 상기 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 프로모터의 하류 방향에 결찰시키고, 숙주 (동물세포)에 도입할 때, 숙주가 숙주내 또는 숙주외에서 유용한 유전자의 산물을 생성하는 기능및 능력을 보여줌을 의미한다.
일반적으로, 프로모터 활성, 또는 특별한 프로모터의 존재 또는 결여 또는 강력함은, 용이하게 정량화할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자(리포터 유전자)를 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 프로모터의 하류 방향에 결찰시키고, 상기 유전자를 숙주에 도입시키고, 그리고 발현된 단백질의 양을 측정함으로써 결정된다. 유용한 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 프로모터 하류 방향에 결찰시키고, 숙주에 도입시키고, 그리고 유용한 유전자의 발현 산물이 숙주내 또는 숙주외에서 확인될 경우에, 상기 프로모터는 그것이 도입된 숙주내에서 프로모터 활성을 갖는다고 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "동물세포" 용어는 인간세포를 포함하는 것으로 의도되지만, 그러나 본 발명의 프로모터가 동물세포에서 프로모터 활성을 나타내는 한 인간세포로 한정되지는 않는다. 이러한 동물세포는 비-인간 포유동물 (예를들어, 생쥐, 래트, 토끼, 염소, 돼지, 소, 말, 개, 원숭이, 및 침팬지), 조류 (예를들어, 닭, 칠면조, 메추라기, 집오리, 및 물오리), 파충류(예를들어, 뱀, 악어, 및 거북), 양서류 (예를들어, 개구리, 도룡뇽, 및 영원) 및 어류 (예를들어, 다랑어, 고등어, 농어, 도미, 참바리, 방어, 전갱이, 연어, 송어, 잉어, 아이유(ayu), 뱀장어, 넙치, 상어, 가오리, 및 철갑상어) 의 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "유용한 유전자" 용어는 동물세포에서 발현될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자, 동물세포 기원 유전자의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA, 유도체, 예를들어, 동물세포 기원의 전사요소의 결합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 서열 또는 전사요소 결합부위 및 유사한 서열을 코딩하는 DNA 서열, 및 동물세포 기원의 mRNA 를 쪼개는 리보자임을 포함하는 것으로 의도된다.
동물세포에서 발현 가능한 단백질을 코딩하는 유전자가 포함되지만, 그러나 동물 기원 유전자로 한정되지는 않는다. 이러한 것들이 동물세포에서 발현 가능한 한 박테리아, 효모, 엑티노마이세테스 (actinomycetes), 사상균, 아스코마이코티나 (ascomycotina) 및 바시디오마이세테스 (basidiomycetes) 와 같은 미생물로 부터 유래된 유전자, 그리고 식물 및 곤충과 같은 비-미생물체로 부터 유래된 유전자 또한 여기서 언급된 유용한 유전자에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "유도체" 용어는 동물세포 기원의 전사요소의 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 서열 또는 전사 요소 결합 부위 및 유사한 서열을 코딩하는 DNA 서열을 나타내는 것으로 의도되며, 상기 "유도체" 의 DNA 서열은 "유인물"로 세포내로 도입될 경우에 전사요소의 작용을 억제할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "리보자임" 용어는 단백질 해독을 방해하는 특별한 단백질의 mRNA 를 쪼개는 효소로 정의된다. 리보자임은 특별한 단백질을 코딩하는 유전자 서열로 부터 디자인될 수 있다. 예를들어, 해머 머리형 리보자임은 문헌 "FEBS Letter, Vol. 228, pp. 228-230(1988)" 에 기술되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 해머 머리형 리보자임 이외에, 머리핀형, 델타형 또는 다른 형태의 리보자임이 본 발명의 단백질 해독을 방해하는 특별한 단백질의 mRNA 를 쪼개는한 여기서 언급하는 리보자임의 영역에 포함된다.
유용한 유전자를 본 발명의 프로모터 활성을 소유하는 DNA 단편의 하류 방향에 작동가능하게 연결함으로써, 유용한 유전자 발현은 강화될 수 있다. 유용한 유전자의 발현은 본 발명의 프로모터 활성을 소유하는 DNA 단편이 벡터에 의하여 또는 벡터 없이 도입될 수 있는 동물세포내에서 일어난다. 벡터로서, 플라스미드 벡터 또는 비루스 벡터가 바람직스럽게 사용된다. 벡터를 사용하지 않는 경우에, DNA 단편은 문헌 "Virology, 52, 456 (1973)", "Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987)", "Journal of the National Cancer Institute, 41, 351 (1968)", "EMBO Journal, 1, 841 (1982)", 및 "BioTechniques, 6, 682 (1988)" 에 기술되어 있는 방법에 의하여 직접 도입될 수 있다. 본 발명의 DNA 단편을 수용하는 동물세포 및 이러한 동물세포를 갖는 동물은 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 발현이 본 발명에 의해 강화될 수 있는 유용한 유전자는 단백질을 코딩하는 DNA, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 유도체를 코딩하는 폴리누클레오티드, 유도체로 작용할 수 있는 누클레오티드 서열, 및 리보자임을 포함한다. 또한, 본 발명은 원하는 단백질 생성 방법 및 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편을 사용하여 유용한 유전자를 발현시키는 방법을 밝히고 있다.
본 발명의 DNA 는 동물세포용 프로모터 활성을 소유하며, 서열 목록에서 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 서열 전체 또는 일부분을 포함한다. 다시말해서, 본 발명의 DNA 단편은 신규 프로모터를 포함하는 DNA 단편이며, 그리고 DNA 단편이 상기 프로모터를 포함하는 한 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 서열의 어느 단편 또는 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 서열 부위를 포함하는 어느 단편이라도된다. 이러한 DNA 단편은 서열 ID 번호 : 2, 서열 ID 번호 : 3 및 서열 ID 번호 : 4 의 DNA 단편, 그리고 서열 ID 번호 : 2 또는 서열 ID 번호 : 3 의 DNA 단편 부위 및 서열 ID 번호 : 4 의 DNA 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 DNA 단편으로 구성된 DNA 단편을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 DNA 단편에 혼성화할 수 있으며, 그리고 동물세포에서 프로모터 활성을 소유하는 DNA 단편도 또한 본 발명의 DNA 단편 범위에 포함된다.
동물세포용 본 발명의 프로모터는 다음과 같이 발견되었다:
이하라 및 그의 동료에 의해 태아간 cDNA 라이브러리 및 게노믹 코스미드 라이브러리로 부터 분리된 인간 GnT-Ⅲ [Journal of Biochemistry, Vol. 113, pp. 692-698 (1993)] 이 본 발명을 위해 사용되었다. 인간 GnT-Ⅲ 유전자를 코딩하는 cDNA 클론 중에서, H15 및 H20 (일본국 특허 공개번호 제 6-62865 호) 각각은 5' 비-해독부위를 가지며, 그리고 상기 2개의 5' 비-해독부위의 DNA 서열은 예상되는 개시코돈으로 부터 상류 방향으로 8 염기 서열까지를 제외하고는 서로 다르다. 2 개의 코스미드, Hug3 및 Hug5 는 게노믹 클론으로 획득되었는데, 이중 Hug3 는 GnT-Ⅲ 유전자 및 이로부터 약 35 kb 상류 부위에 대한 코딩 영역을 포함한다.
이러한 것을 염두에 두고, 탐침으로 H15 및 H20 의 5' 비-해독 영역을 이용하여 Hug3 코스미드의 서던 혼성화, DNA 염기 서열화 등을 수행하여, H15 는 개시코돈으로 부터 약 29 kb (H15 엑손-2) 및 1 kb (H15 엑손-1) 상류부위에 엑손을 가지며, 그리고 H20 은 개시코돈으로부터 약 26 kb (H20 엑손-1) 상류 부위에 엑손을 가짐을 입증하였다. 또한, GnT-Ⅲ 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하고 주형으로 인간 뇌 mRNA 를 사용하여 cDNA 말단의 5'-빠른 증폭 (RACE) 을 수행하여, 스플라이싱이 H15 및 H20 에서는 발생하지만, 개시코돈으로 부터 7 염기쌍 상류방향에 위치하는 지점에서는 스플라이싱이 일어나지 않는 mRNA 의 존재를 입증하였다. 이러한 mRNA 로부터 획득된 cDNA 를 H204 로 표시하였다.
이러한 발견은 적어도 3 개 이상의 인간 GnT-Ⅲ 유전자 전사 산물이 있음을 입증하는 것이다. H15, H20 및 H204 의 전사에 관련된 프로모터가 각각 H15 엑손-2, H20 엑손-1 및 게놈상의 예상되는 해독개시점 상류부위에 존재하는 것으로 추측되기 때문에, COS1 세포에서 이러한 부위를 포함하는 DNA 단편의 프로모터 활성은, 리포터 유전자로 포티누스 루시퍼라제를 사용하여 결정하였다. 제 1 도에 나타낸 바와같이 (박스는 엑손 부위; 점선은 인트론 부위), 어떠한 프로모터 활성도 H15 엑손-2내 HindⅢ 자리 부터 H20 엑손-1 내 SacⅡ 자리까지 H20 상류방향의 약 3 kb 단편 (이러한 단편을 포함하는 플라스미드를 pPG20B 로 표시함) 내에서 탐지되지 않았다. 그러나, 프로모터 활성은 H15 상류방향의 EcoRI 자리로 부터 H15 엑손-2 내 HindⅢ 자리까지 약 3 kb 단편 (이 단편을 포함하는 플라스미드를 pPG15 로 표시함), 및 코딩부위 상류 방향에 있는 SphI 자리부터 코딩 영역내 NaeI 자리까지, 즉, H204 를 포함하는 단편인 약 1.1 kb 단편 (이 단편을 포함하는 플라스미드를 pPG204-1.1) 내에서 탐지되었다; 후자의 프로모터는 전자의 프로모터 보다 약 10 배 더 강력하며 SV40 프로모터 보다는 약 1.5 배 더 강력하다는 것이 밝혀졌다.
더군다나, 이러한 1.1 kb 단편은 NaeI 자리로 부터 약 0.8 kb 떨어진 곳에 XhoI 자리, 약 0.5 kb 떨어진 곳에 SspI 자리, 그리고 약 0.2 kb 떨어진 곳에 HincⅡ 자리를 포함하며; pPG204-1.1 가 벡터의 다중 클로닝 자리에 절단자리를 갖는 제한효소인 BamHI 과 결합하여 이러한 제한효소중 어느하나로 절단될 경우에, GnT-Ⅲ 개시코돈을 포함하는 0.8 kb 단편 (단편 A), 0.5 kb 단편 (단편 B) 및 0.2 kb 단편 (단편 C) 으로 절단될 수 있다. 이러한 단편은 프로모터 활성면에서 상기 언급한 1.1 kb 단편 보다 2 내지 3 배 더 강력하며, 그리고 SV40 프로모터 보다 3 내지 5 배 더 강력하다. 따라서, 본 발명자들은 인간 GnT-Ⅲ 유전자-코딩 영역의 약 0.2 내지 1 kb 상류 부위를 포함하는 DNA 단편이 강력한 프로모터 활성을 소유함을 입증하였다. 본 발명자들은 이러한 발견에 기초한 추가적인 조사를 하여, 본 발명을 확립하였다. 본 발명의 DNA 단편을 얻는 방법을 이하에서 상세히 기술하고자 한다.
(1) 동물세포에서 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편의 염기서열
인간 GnT-Ⅲ 유전자의 상류부위를 포함하는 게노믹 코스미드 클론, 예를들어, 이하라 및 그의 동료들에 의한 코스미드 클론 Hug3 는 제한효소 SphI 및 NaeI (2 개 효소 모두 Takara Shuzo 에 의해 생산됨) 에 의해 절단되었으며; GnT-Ⅲ 를 위한 상류 코딩 부위에 인접한 부위를 포함하는 1.1 kb DNA 단편을 분리하였다. 이러한 DNA 단편은 서열 ID 번호 :1 의 염기서열을 갖는다. 이러한 단편은 플라스미드 벡터, 예를들어, pUC19 (Takara Shuzo 에 의해 생산됨) 내로 서브클론시켜 유용한 유전자와의 결찰을 위한 상기 단편의 사용 및 기타 다른 목적을 수월하게 한다.
서브클론된 1.1kb SphI-NaeI 단편 (pHug5'-204) 의 염기서열은 예를들어, 디데옥시 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 74, p. 5463 (1977)] 에 의해 결정할 수 있다. 단일 반응을 통해 1.1 kb DNA 단편의 염기서열을 결정하는 것은 보통의 경우 어렵다; 이러한 목적을 위해, 약간의 방법들이 이용가능한데, 이러한 방법에는 상기 단편을 적절한 제한효소로 추가로 절단하고, 서브클론시킨후에, 디데옥시 반응을 시키는 방법, 엑소누클라아제 Ⅲ를 이용하여 일련의 플라스미드 결실을 제조한후에, 디데옥시 반응을 시키는 방법, 그리고 프라이머를 알려진 염기서열을 기초로 순차적으로 합성한후에, 디데옥시 반응을 시키는 방법이 포함된다. 본 발명에 있어서는, 상기 단편을 제한효소 BstXI, XhoI, SspI, KpnI 및 HincⅡ (pHug5'-204 삽입체에 대한 제한효소 지도가 제 2 도에 나타나 있음) 으로 추가적으로 절단하고, 서브클론하고, 그리고 서열목록의 서열 ID 번호 : 1 에 나타낸 바와같은 pHug5'-204 의 염기서열을 결정하기 위하여 디데옥시 반응시킨다.
제 2 도에 도시된 바와같이, 이러한 1.1 kb 단편은 NaeI 자리로부터 약 0.8 kb 위치에 XhoI 자리, 약 0.5 kb 위치에 SspI 자리 및 0.2 kb 위치에 HincⅡ 자리를 포함한다. pHug5'-204 가 벡터의 다중 클로닝 자리에 절단 자리를 갖는 제한효소인 BamHI 과 결합하여 이러한 제한효소중 어느하나로 절단될 경우에, 모든 단편이 GnT-Ⅲ 개시코돈을 포함하는 서열 목록 중 서열 ID 번호 : 2 의 0.8 kb 단편 (단편 A), 서열 ID 번호 : 3 의 0.5 kb 단편 (단편 B) 및 서열 ID 번호 : 4 의 0.2 kb 단편 (단편 C) 으로 절단될 수 있다.
(2) 본 발명의 프로모터를 포함하는 DNA 단편의 제조
본 발명의 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 제조하기에 가장 손쉬운 시도는 제한효소 SphI 및 NaeI (2 개 효소 모두 Takara Shuso 에 의해 생산됨) 으로 절단하여 플라스미드 또는 상기 기술한 코스미드로부터 단편을 절단하고, 필요에 따라 XhoI, SspI 및 HincⅡ 와 같은 제한효소로 추가적으로 절단한다. 다른 유용한 방법은 다른 제한효소로의 절단, 초음파 분해, 포스포라미디트 (Phosphoramidite) 방법에 의한 화학합성, 그리고 중합효소 사슬 반응을 이용한 방법을 포함한다. 예를들어, 원하는 DNA 단편은 예를들어 서열ID 번호 : 1 의 DNA 서열로부터 제조되는 적절한 프로모터를 사용하는 중합효소 사슬 반응에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 프로모터의 염기서열을 사용한 혼성화에 의해, 본 발명의 프로모터는 또한 다른 세포로부터 유래된 유전자로부터 획득될 수 있다. 이 경우에, 예를들어, 아래의 방법을 적용할 수 있다. 첫째, 다른 세포 유전자원으로부터 획득한 염색체 DNA를 플라스미드, 파아지 벡터 등에 종래의 방법을 통해 결찰시키고, 그리고 라이브러리를 제조하기 위해 숙주에 도입시킨다. 다음에, 상기 라이브러리를 플레이트상에서 배양한다; 결과로서 얻어지는 콜로니 또는 플라크를 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막 상으로 옮긴후에, 막 상에 DNA를 고정화시키기 위해 변성시킨다. 그 다음, 탐침과 막 상에 있는 DNA 사이의 혼성화물을 형성하기 위해, 미리32P 등으로 라벨시킨 탐침 (유용한 탐침들은 서열 목록 중 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 단편, 및 단편 A(서열 ID 번호 :2), 단편 B(서열 ID 번호 :3) 및 단편 C(서열 ID 번호 :4) 과 같은 상기 DNA 단편의 일부분을 포함함)을 포함하는 용액내에서, 이러한 막을 인큐베이션시킨다.
예를들어, 6xSSC, 1% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 100μg/ml 연어 정자 DNA 및 5xDenhardt's 를 포함하는 용액내에서, 상기 DNA-고정화막을 65 ℃ 로, 20 시간 동안 탐침과 혼성화시킨다. 상기 혼성화 완성후에, 비특이적인 흡착을 씻어내고, 다음에 탐침과의 혼성화물을 형성한 클론을 확인하기 위해 자동 방사선 사진 등을 수행한다. 이러한 절차는 단일 클론이 혼성화물을 형성시킬때까지 반복한다. 이렇게 얻어진 단일 클론은 그 내부에 삽입되어 있는 원하는 프로모터를 갖는다.
수득한 유전자의 염기서열은 예를들어 원하는 프로모터로 상기 유전자의 동일성을 입증하기 위해 하기 방법으로 결정된다. 혼성화에 의해 수득된 클론의 염기 서열화는 하기 언급된 바와같이 달성되는데, 재조합체가 에세리키아 콜리 인 경우: 상기 재조합체를 시험관 등에서 배양하며; 플라스미드를 추출하고 제한효소로 절단하고; 삽입체를 빼내어 M13 파아지 벡터 등에 서브클론시킨후에, 디데옥시 방법을 통해 염기 서열화를 수행한다. 재조합체가 파아지인 경우에, 염기 서열화를 위해 근본적으로 동일한 절차를 따를 수 있다. 배양부터 염기 서열화까지 이러한 기본적인 작업은 예를들어 문헌 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, edited by T. Maniatis et al., Chapter 1, pp. 90-104, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989" 에 기술되어 있는 바와같이 수행할 수 있다.
원하는 프로모터로서의 상기 획득된 유전자의 동일성은 본 발명 프로모터의 염기서열과 상기결정된 염기서열사이의 유사성을 기초로하여 평가할 수 있다. 획득된 유전자가 전체 프로모터를 포함하는 것으로 여겨지지 않을 경우, 본 발명의 프로모터에 혼성화시키는 전체 프로모터의 염기 서열은 획득된 유전자를 기초로한 합성 DNA 프라이머 제조, PCR에 의한 결핍 부위의 증폭, 또는 탐침으로 획득한 유전자의 단편을 사용하여 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 통해 결정할 수 있다.
유용한 유전자를 발현시키기 위한 본 발명의 방법은, 상기 유용한 유전자를, 그것이 발현될 수 있는 그러한 방식으로 본 발명의 프로모터 하류방향에 결찰시키며; 그와같이 제조된 DNA 단편을 동물세포내로 도입하고; 그리고 결과로서 얻어지는 세포를 배양한다는 점에서 특성이 있다. 유용한 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 본 발명의 프로모터가 포함되도록 상술한 바와같이 제조된 DNA 단편의 하류 방향에 상기 원하는 유용한 유전자를 결찰시키기위해, DNA 리가제 및 단일중합체 방법을 사용할 수 있다. DNA 리가제가 동일한 제한효소 자리를 공유하는 2개의 DNA 단편의 결찰을 위해 사용될 경우에, 결찰은 상기 단편들을 적절한 제한효소로 절단시키고, 이들을 문헌 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, edited by T. Maniatis et al., Chapter 1, p. 62, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989" 에 기술되어 있는 반응버퍼내에서 함께 혼합하고, 그리고 DNA 리가제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 또 다르게는, 2 개의 DNA 단편이 동일한 제한효소 자리를 공유하지 않을 경우에, 이들을 T4 DNA 중합효소 ( Takara Shuzo 에 의해 생산됨)를 사용하여 단편의 끝을 블런팅 (blunting) 시키고, 그리고 상술한 바와같이 DNA 리가제로 처리함으로써 함께 결찰시킨다. 단일중합체방법이 사용될 경우에, 폴리-G 사슬은, 터미널 데옥시리보누클레오티딜 트랜스퍼라제 및 dGTP를 사용하여, 미리 제한효소로 선형화시킨 벡터의 3' 말단에 첨가된다; 상기 삽입 DNA의 3' 말단에 동일한 방법으로 폴리-C 사슬이 첨가된다; 이러한 폴리-G 사슬 및 폴리-C 사슬은 함께 연결되고, 그리고 예를들어 염화칼슘 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 75, p. 3727 (1978)]을 통해 에세리키아 콜리 내로 도입된다.
본 발명을 위한 바람직한 유용한 유전자의 예로는, 인터루킨 1 내지 12 유전자, 인터페론 α, β 및유전자, 튜머 네크로시스 인자 유전자, 콜로니-자극 인자 유전자, 에리트로포이에틴 유전자, 변형 성장 인자-β 유전자, 면역글로불린 유전자, 조직형 플라스미노겐 활성화제 유전자, 유로키나제 유전자 및 포티누스 루시퍼라제 유전자를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 DNA 단편과 유용한 유전자의 결찰을 통해 얻어지는 상기와 같은 DNA 단편은, 유전자 발현용 플라스미드를 수득하기 위해 동물세포용으로 적절한 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 벡터에는 pTM [Nucleic Acids Research, Vol. 10, p. 6715 (1982)], cos202 [The EMBO Journal, Vol. 6, p. 355 (1987)], p91203(B) [Science, Vol. 228, p. 810 (1985)] 및 BCMGSNeo [Journal of Experimental Medicine, Vol. 172, p. 969 (1990)] 이 포함된다.
상기 획득된 유전자 발현용 플라스미드는 인산칼슘 방법 [Molecular 및 Cellular Biology, Vol. 7, p. 2745 (1987)], 전기천공법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 81, p. 7161 (1984)], DEAE-덱스트란 방법 [Method in Nucleic Acids Research, p. 283, edited by Karam, J.D. et al., published by CRC Press, 1991] 및 리포좀 방법 [BioTechniques, Vol. 6, p. 682 (1989)] 과 같은 종래 방법을 통해 적절한 숙주세포내로 도입될 수 있다. 이러한 숙주세포에는 COS1 세포, HELA 세포, CHO-K1 세포 및 BHK-21 세포가 포함된다. 적절한 배지에서 상기 획득한 형질전환 세포의 배양을 통해, 원하는 유용한 유전자 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
프로모터로 본 발명의 DNA 단편을 사용함으로써, 원하는 유용한 유전자 산물은 동물세포내에서 많은 양으로 발현될 수 있다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명을 설명하는 것이지만 어느 방식으로 간에 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1
이하라 및 그의 동료들에 의해 보고된 GnT-Ⅲ 유전자를 포함하는 게놈 영역이 결합되어있는 코스미드 클론 Hug3 [Journal of Biochemistry, Vol. 113, p. 692 (1993)] 을 제한효소 SphI 및 NaeI (2 개 효소 모두 Takara Shuzo 에 의해 생산됨) 으로 절단하였으며, 그리고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다. 1.1 kb 단편을 겔로부터 잘라낸후에, EASYTRAPTM(Takara Shuzo 에 의해 생산됨)을 사용하여 DNA 회복을 수행하였다. 이러한 DNA 단편을 미리 SphI 및 HincⅡ 로 절단한 pUC19 에 T4 리가제를 이용하여 결찰시켰으며, 다음에 이것을 염화칼슘 방법을 통해 에세리키아콜리 XL1-Blue 내로 도입시켰다. 결과로서 얻어지는 암피실신-내성 콜로니를 입수하여 배양하였다; 알칼리 방법을 통해 배양된 세포로부터 플라스미드를 제조하였다. pUC19 의 다중 클로닝 자리에서, HindⅢ, SphI, HincⅡ 및 BamH 자리가 이러한 순서로 상호 밀접하게 배열되어 있다. 상기 플라스미드를 BamHI 및 HindⅢ 로 이중 절단하고, 그리고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다; 상기 플라스미드는 1.1 kb HindⅢ - BamHI 단편 (이러한 단편의 염기서열은 서열 ID 번호 : 1 로 확인되었다) 을 포함하는 것으로 밝혀졌으며, pHug5'-204 로 표시했다. 에세리키아 콜리 XL1-Blue 가 이러한 플라스미드로 형질전환되어 형질전환체 에세리키아 콜리 XL1-Blue /pHug5'-204 (산업과학기술청, 생물과학 및 인간-기술 국가 기관에 FERM BP-5532 로 기탁되어 있음) 를 수득하였다.
그 다음, pHug5'-204 를 BamHI 및 HindⅢ 로 절단하였다; 결과로서 얻어지는 1.1 kb 단편을 EASYTRAP 를 이용하여 아가로즈 겔로부터 회수하였으며, 이어서 T4-DNA 중합효소 (Takara Shuzo 에 의해 생산됨)를 사용하여, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 의 존재하에 터미널 불런팅을 수행하였다. 이와는 별도로, 포티누스 루시퍼라제 유전자, SV40 인헨서, 에세리키아 콜리 복제 개시점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 프로모터-결핍 플라스미드로 인헨서 벡터 (Toyo Ink 에 의해 생산됨) 를 포티누스 루시퍼라제 유전자의 상류 방향에 인접한 SmaI 자리에서 절단한후, T4-DNA 리가제를 이용하여 미리 회수된 1.1 kb 단편에 결찰시켰다. 이후 상기 결찰 산물을 염화칼슘 방법을 사용하여 에세리키아 콜리 XL1-Blue 내로 도입시켰다.
1.1 kb 단편의 방향을 결정하기 위해, 암피실린-내성 박테리아로부터 플라스미드를 제조하고, XhoI 으로 절단하고, 그리고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다. 제한효소 지도로 판단하건데, 1.1 kb 단편이 포티누스 루시퍼라제 유전자의 방향과 동일한 방향으로 삽입된다면 0.8 kb 단편이 발견될 것이며, 그리고 1.1 kb 단편이 반대 방향으로 삽입된다면 0.3 kb 단편이 발견될 것으로 예상되었다. 이러한 것을 염두에 두고, 0.8 kb XhoI 단편을 함유하는 플라스미드를 선택하여 pPG204-1.1을 수득하였다.
100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지 [1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물 (양자 모두 DIFCO 에 의해 생산됨), 0.5% NaCl] 를 포함하는 2-리터 원추형 플라스크내에서, pPG204-1.1를 함유하는 에세리키아 콜리를 인큐베이션시킨후에, 37℃에서, 밤새 진탕 배양을 시켰다. 이후, 플라스미드를 문헌 "Molecular 및 Cellular Biology, Vol. 7, p. 2745 (1987)" 에 기술되어 있는 염화세슘 평형 밀도 구배 원심분리법을 통해 제조하였다. 10 cm 페트리 접시당 20 μg 의 pPG204-1.1 을 문헌 "Molecular 및 Cellular Biology, Vol. 7, p. 2745 (1987)" 에 기술되어 있는 인산칼슘법을 통해 COS1 세포 (ATCC CRL 1650) 에 트랜스펙션시켰다.
상기 트랜스펙트된 COS1 세포의 루시퍼라제 활성은 키트에 대한 안내서에 따라 PicaGeneTM키트 (Toyo Ink 에 의해 생산됨)를 사용하여 결정하였다. 트랜스픽션후 48 시간 경과후에, 세포들을 키트내 포함되어 있는 세포-용해 용액 0.7 ml 내에 현탁시켰으며; 상층액 20 μl 및 형광기질 100 μl 를 서로 섞었다. 이후, 형광강도를 액체 불꽃 카운터를 사용하여 즉시 결정하였다. 양성 대조구를 위해, 상기 세포를 키트내에 포함되어 있는 대조 벡터 (SV40 프로모터) 트랜스펙션시켰다; 음성 대조구를 위해, 상기 세포를 인헨서 벡터로 트랜스펙션시켰다.
그 결과, 본 발명의 DNA 단편을 포함하는 pPG204-1.1 이 프로모터 활성 면에서 SV40 프로모터 보다 휠씬 더 강력하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 2
pHug5'-204 XhoI 으로 절단한 후, T4-DNA 중합효소를 사용하여, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 의 존재하에 터미널 불런팅을 수행하였다. 이후에, BamHI 으로 추가적으로 절단하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행한 다음, 상기 EASYTRAP를 사용하여 0.8 kb 단편 (단편 A) 의 회수를 수행하였다. 이와는 별도로, pHug5'-204 를 SspI 및 BamHI 으로 절단한 후, 단편 A 와 동일한 방법으로 0.5 kb 단편 (단편 B) 의 회수를 수행하였다. 또한, pHug5'-204 를 HincⅡ 및 BamHI 로 절단한 후, 단편 A 와 동일한 방법으로 0.2 kb 단편 (단편 C) 의 회수를 수행하였다.
단편 A 는 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 단편의 300 번째 C 로부터 1,116 번째 C 까지의 부위를 함유하는 817 bp 길이의 DNA 단편이며; 단편 B 는 서열 ID 번호 : 1의 DNA 단편의 595 번째 C 로부터 1,116 번째 C 까지의 부위를 함유하는 522 bp 길이의 DNA 단편이며; 단편 C 는 서열 ID 번호 : 1 의 DNA 단편의 917 번째 C 로부터 1,116 번째 C 까지의 부위를 함유하는 200 bp 길이의 DNA 단편이다. 단편 A, 단편 B 또는 단편 C 를 미리 SmaI 및 BamHI 으로 절단한 인헨서 벡터에 결찰시키고, 그리고 에세리키아 콜리 XL1-Blue 내로 도입시켰다. 플라스미드 DNA를 상기와 같이 수득된 균주로 부터 추출하여, ScaI 및 HindⅢ 로 절단하였다; 원하는 단편의 삽입을 확인하였다. 특히, 단편 A 가 삽입되면 2.0 kb 단편이 발견될 것이고, 단편 B 가 삽입되면 1.7 kb 단편이 발견될 것이며, 그리고 단편 C 가 삽입되면 1.4 kb 단편이 발견될 것으로 예상된다. 이렇게 해서, 단편 A 를 운반하는 pPG204-0.8, 단편 B 를 운반하는 pPG204-0.5, 그리고 단편 C 를 운반하는 pPG204-0.2 를 수득하였다.
각각 pPG204-0.8, pPG204-0.5 및 pPG204-0.2 를 함유하는 에세리키아 콜리 균주로부터, 실시예 1 과 동일한 방법으로 염화세슘 평형 밀도 구배 원심분리법을 통해 플라스미드를 제조한후, COS-1 세포를 트랜스펙션시켰다. 상기 트랜스펙트된 COS-1 세포로부터 추출한 추출물의 루시퍼라제 활성을 루미노미터 (Belthold 에 의해 생산되는 LB 9501)를 사용하여 형광 강도를 결정하는 것을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법으로 결정하였다.
그 결과, 보다 작은 단편들이 프로모터 활성 면에서 1.1 kb SphI-NaeI 단편 보다 2 내지 3 배 더 강력하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에게 명백한 본 발명의 상기 기술한 구현예의 다른 변형들은 다음의 청구 범위의 범위내에 포함되는 것이다.
제 1 도는 본 발명의 프로모터를 구성하는 DNA (pPG204-1.1) 및 인간 GnT-Ⅲ 유전자의 cDNA 의 관계를 나타내는 도면.
제 2 도는 pHug5'-204 삽입체의 제한효소 지도.
Claims (11)
- 하기 (a) 내지 (d)로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 가지며, 동물세포에서 프로모터 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리 DNA:(a) 서열번호 1의 서열을 갖는 DNA 서열;(b) 서열번호 2의 서열을 갖는 DNA 서열;(c) 서열번호 3의 서열을 갖는 DNA 서열; 및(d) 서열번호 4의 서열을 갖는 DNA 서열.
- 제 1 항의 분리 DNA 및 이와 작동가능하게 연결된 유용한 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA로서, 상기 유용한 유전자가 단백질을 코딩하는 DNA, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
- 제 2 항의 재조합 DNA를 포함하는 벡터.
- 제 3 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 2 항의 재조합 DNA가 그 내부에 도입되는 것을 특징으로 하는 원숭이, 인간 또는 햄스터 유래의 동물세포.
- 제 5 항의 동물세포를 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
- 제 3 항 또는 제 4 항의 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 원숭이, 인간 또는 햄스터 유래의 동물세포.
- 제 7 항의 동물세포를 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
- 하기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포를 이용한 단백질 제조방법.(a) 재조합 DNA 단편을 수득하기 위해, 원하는 단백질을 코딩하는 DNA가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 상기 원하는 단백질을 코딩하는 DNA를 제 1 항의 분리 DNA 하류 방향에 결찰시키는 단계;(b) 상기 재조합 DNA 단편을 벡터내로 삽입시키는 단계;(c) 상기 벡터로 동물세포를 형질전환시키는 단계;(d) 상기 동물세포를 배양하는 단계; 및(e) 상기 배양액으로부터 상기 원하는 단백질을 회수하는 단계.
- 하기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유용한 유전자 발현방법.(a) 재조합 DNA 단편을 수득하기 위해, 유용한 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 상기 유용한 유전자를 제 1 항의 분리 DNA 하류 방향에 결찰시키는 단계;(b) 상기 재조합 DNA 단편을 동물세포내로 도입시키는 단계;(c) 동물세포를 배양하는 단계.
- 하기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유용한 유전자 발현 방법.(a) 재조합 DNA 단편을 수득하기 위해, 유용한 유전자가 발현될 수 있는 그러한 방식으로 상기 유용한 유전자를 제 1 항의 분리 DNA 하류 방향에 결찰시키는 단계;(b) 상기 재조합 DNA 단편을 벡터내로 삽입시키는 단계;(c) 상기 벡터로 동물세포를 형질전환시키는 단계; 및(d) 상기 동물세포를 배양하는 단계.
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