JP2001509395A

JP2001509395A - 細胞又は組織特異的な人工転写調節領域の同定方法

Info

Publication number: JP2001509395A
Application number: JP2000502228A
Authority: JP
Inventors: シュワーツ，ロバート・ジェイ; イーストマン，エリック・エム; リ，ズヤン; ノードストロム，ジェフ
Original assignee: バレンティス・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2001-07-24
Also published as: EP1003911A1; US20030068631A1; US6410228B1; US20050164282A1; CA2296771A1; AU8574898A; WO1999002737A1; US7960536B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子発現を制御する人工調節領域を合成して評価することに関する。本発明は、転写因子の結合部位を同定する方法及び人工調節領域の調節機能を評価する方法を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景技術本発明は、特定の細胞又は組織において遺伝子の転写を調節する天然及び合成
の細胞又は組織特異的な転写調節領域に関する。さらに、本発明は、細胞又は組
織特異的な人工転写調節領域の選択、同定及び評価の方法にも関する。本明細書
に記載される情報は、本発明に対する先行技術であると認められず、読者の理解
を助けるためにのみ提供される。

【０００２】細胞又は組織特異的な遺伝子発現は細胞の増殖及び分化において中心的な役割
を担っている。遺伝子発現の第一工程として、転写は調節のための重要な工程で
ある。転写調節領域の研究は現代生物学における主要研究分野の１つである。転
写調節領域はまた、遺伝子治療及び組換えタンパク質の生産のようなバイオテク
ノロジーにおける応用にとっても非常に重要である。

【０００３】一般に転写調節領域は２つの部分を有する：転写開始部位、及びその開始部位
から離れたところで転写レベルを調節し得るエンハンサーである。調節領域が転
写を調節するためには、転写因子が調節領域に結合することが必要である。この
調節領域はいくつかのカテゴリーに分類される：生物体の全細胞における転写を
調節する一般的な調節領域、あるシグナルに反応したときだけ転写を調節する誘
導性の調節領域、及びある種の細胞における転写だけを調節する細胞又は組織特
異的な調節領域である。

【０００４】調節領域を同定するためにいくつかの方法が使用されてきた。これらの方法の
１つは、クローン化遺伝子の適切な発現のために重要である領域の分析である。
通常この第一工程は、クローン化遺伝子の欠失及び突然変異の分析を使用して調
節領域のおおまかな境界を同定することである。これらの領域は、５’上流領域
、３’下流領域、及び遺伝子そのものの内部、時にイントロン又はコード配列を
包含する。ほとんどの研究は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ又は成長
ホルモン（ＧＨ）のようなレポーター遺伝子を含有するキメラ構築体を用いて実
施される。タンパク質の因子が実際に結合する領域は、ＤＮＡフットプリント技
術に続く突然変異分析を使用してより正確に定められ得る。タンパク質の転写因
子が結合する配列はしばしば転写因子結合部位として言及される。

【０００５】数多くの共通した結合部位についてコンセンサス配列が決定されてきた。１つ
の例は、塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のファミ
リーによって認識される結合部位である。ｂＨＬＨタンパク質に対する結合部位
のコンセンサス配列は５’−ＣＡＮＮＴＧ−３’であり、ここで「Ｎ」は任意の
ヌクレオチドであり得る。この結合部位は「Ｅボックス」と呼ばれ、リンパ球、
筋肉細胞及び繊維芽細胞を包含する、様々な細胞型において発現される数多くの
遺伝子の調節領域に見出される。ほとんど又はすべての細胞に共通するｂＨＬＨ
タンパク質もあれば、細胞特異的であるｂＨＬＨタンパク質もある。さらに、ｂ
ＨＬＨタンパク質はヘテロダイマーを形成し、これらダイマーのいくつかのＤＮ
Ａとの相互作用は細胞特異的である。特定の調節領域に対する様々なｂＨＬＨタ
ンパク質の結合は、コアのコンセンサス配列内の変異し得るジヌクレオチド配列
及びこのコア配列に隣接した配列によって影響されているらしい（Ｓｕｎら、Ｃ
ｅｌｌ６４：４５９〜４７０（１９９１））。

【０００６】新たにクローン化されて配列が決定された遺伝子に関連した結合部位は、他の
、時に関連した遺伝子から特徴づけられた既知の結合部位の配列との相同性で配
列を検索することによっても同定され得る。

【０００７】さらに、ターゲット遺伝子のクローニングをせずに転写因子の結合部位を同定
する方法がいくつか開発された。結合部位の選択増幅（ＳＡＡＢ）法が既知の転
写因子の結合部位を同定するために使用された（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５０：１１０４〜１１１０（１９９０））。この方法を使用するこ
とにより、ランダム配列を有する合成された鋳型が精製された転写因子とともに
インキュベートされる。転写因子に結合した鋳型が電気泳動的移動シフトアッセ
イ（ＥＭＳＡ）で単離される。次いで鋳型はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よって増幅される。転写因子の結合部位は、繰り返し再結合されて再増幅された
後で、配列決定され、同定される。転写因子ｍｙｃの結合部位はこの方法を用い
て同定された（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：１１０４〜１
１１０（１９９０））。

【０００８】しかしながら、このようなアッセイに使用される転写因子を同定して精製する
ことはしばしば難しい。実際、結合部位のほうがしばしば先に同定され、その部
位に結合する転写因子の同定及び精製を促進するために使用されるのである。さ
らに、多くの研究では、ある種の調節領域の特性を理解することが緊要であって
も、調節領域に結合する転写因子については知る必要がない。そのために、ＳＡ
ＡＢに似た方法であるマルチプレックス選択技術（ＭｕＳＴ）が開発された（Ｎ
ｕｌｌｕｒら、ＰＮＡＳ９３：１１８４〜１１８９（１９９６））。マルチプ
レックス選択技術では、転写因子を同定せずとも結合部位が同定できるように、
精製された転写因子が粗核抽出物に置き換えられている。次に、同定された結合
部位を使用して、対応する転写因子が同定され得る。

【０００９】調節領域はしばしば転写因子の多くの異なる結合部位からなる。ある調節領域
の特性は結合部位の組成及び配置によって決定される。天然に存在する調節領域
だけでなく、人工の調節領域も結合部位の複合及び修飾を介して構築され得る。

【００１０】入手可能な天然に存在する調節領域は必ずしも所望されるやり方で転写を調節
できるわけではない。この場合、他の場合と同様に、所望の機能特性を提供する
ために人工の調節領域が利用され得る。１例として、単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）の人工調節領域は、ＨＳＶα遺伝子の５’非転写ドメインを、ＨＳＶλ遺
伝子由来の転写開始部位及び５’転写非コード領域を含有するフラグメントに連
結することによって構築された（Ｒｏｉｚｍａｎ，ＰＣＴ９４／１４９７１）。
得られた人工調節領域は、このウイルスの増殖サイクルを通して高い累積レベル
でこの異種遺伝子の構成的な転写を指令する。人工調節領域はまた、高い誘導性
の転写レベル及び低い基底レベルを実現するためにも構築された（Ｆｉｌｍｕｓ
ら、ＰＣＴ９３／２０２１８）。

【００１１】上記の例のいずれでも、結合部位は、よく理解された転写因子応答要素である
。しかしながら、多くの結合部位、特に対応する転写因子をクローニングせずに
同定されたものは十分理解されていない。それ故、これらの結合部位は、機能ア
ッセイを用いて転写調節機能が確認されるまでは、転写因子応答要素である可能
性があるにすぎない。これらのアッセイは通常人手とコストのかかる作業である
。様々な結合部位の複合、修飾及び再配置によって製造された人工調節領域では
このことはずっと複雑になる。発明の要約出願人は細胞又は組織特異的な人工調節領域を創出、同定及び評価する有用な
方法を設計した。特定すると、この方法は転写因子結合部位の選択、この結合部
位及び／又は既知調節領域の部分を使用する人工調節領域の創出、及びこの人工
調節領域の評価を包含する。この方法によって得られる人工調節領域は、ターゲ
ット細胞において所望の遺伝子発現を達成する遺伝子デリバリー又は遺伝子治療
に使用され得る。得られる人工調節領域は、組換えタンパク質の生産を高いレベ
ルで達成するためにも使用され得る。

【００１２】本発明は、最も重要であるか又は細胞内の基本的な転写因子によって認識され
る結合部位を同定するために必要なすべての情報を細胞それ自身が含有している
という認識を利用する。結合部位の選択について記載される方法は、発現される
遺伝子や細胞に存在する転写因子に関する従前の知識を必要としない。従って、
これらの方法は、転写因子の精製、同定及び解析に必要とされる広範な作業を回
避する。さらに、これらの方法は組織特異的な転写因子の結合部位について知る
必要性も除いている。さらに、この方法を使用すれば、精製された転写因子を用
いる方法を使用するよりも、多くのより可能性のある結合部位が同定され得る。
同様に、人工調節領域を創出及び評価する方法は結合部位についての完全な理解
を必要としない。結合部位は様々な複合、及び様々な配置で連結され、ある細胞
系において機能する特定の人工調節領域を選択するために評価され得る。従って
、これらの方法は有用な人工調節領域を大規模に創出して同定することを可能に
する。

【００１３】上記のように、本明細書で論じられる方法は、遺伝子デリバリー又は遺伝子治
療のための調節領域配列を同定するのに有用である。遺伝子デリバリー又は遺伝
子治療の主要な障害の１つは、ある細胞又は組織で遺伝子を好ましいレベルで発
現させることの難しさにある。この難点は、所望の遺伝子転写を指令するべき適
切な調節領域の不足に幾分は起因する。上記の方法から同定される機能的な人工
調節領域は、遺伝子デリバリー又は遺伝子治療に必要とされる調節領域の多くの
候補を提供するだろう。さらに、これらの人工調節領域は、ある細胞系における
高レベルの遺伝子転写をやはり必要とする、組換えタンパク質の大規模生産に必
要とされる調節領域の候補ともなろう。

【００１４】本発明の第一の側面は転写因子の結合部位を同定する方法を特徴とする。この
方法は、一群の細胞由来の細胞又は核の抽出物と複数の任意の二本鎖オリゴヌク
レオチドフラグメントとの間に形成されるタンパク質−オリゴヌクレオチド複合
体においてオリゴヌクレオチドを同定することを含む。好ましくは、この複合体
はサイズ排除クロマトグラフィーを使用してフリーのオリゴヌクレオチドから分
離される。複合体におけるオリゴヌクレオチドの存在は、オリゴヌクレオチドが
結合部位を包含することを示唆している。

【００１５】好ましい態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドの
合成、及びこの一本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの変換
によって合成される。また、好ましい態様では、オリゴヌクレオチドフラグメン
トは中央にランダム配列を、両端に制限部位とプライマー配列の両方を有する。
好ましい態様では、同定の工程は、結合部位を同定するためにタンパク質−オリ
ゴヌクレオチド複合体由来のオリゴヌクレオチドフラグメントを増幅し、クロー
ニングして配列を決定することを包含する。増幅工程は、好ましくはポリメラー
ゼ連鎖反応によって実施される。

【００１６】オリゴヌクレオチドフラグメントは様々なサイズであり得るが、好ましくは約
５〜５００ｂｐ、より好ましくは約５〜１００ｂｐ、さらにより好ましくは２０
〜５０ｂｐの長さのテスト配列を包含する。

【００１７】本明細書で使用される「転写する」又は「転写」という用語は、鋳型ＤＮＡに
倣ったＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの合成に言及する。転写は遺伝子発現の
第一工程であり、遺伝子発現を調節するための最も重要な工程である。つまり、
遺伝子発現の調節は、主に転写の調節を介して達成される。

【００１８】「遺伝子発現」という用語は、遺伝情報がＤＮＡからタンパク質又はＲＮＡ分
子のような機能性の分子へ流れるプロセスに言及する。遺伝子発現の一部として
の転写の調節は、遺伝子の調節領域と様々な転写因子との間の相互作用で達成さ
れる。

【００１９】本明細書で使用されるように、「転写調節領域」又は「調節領域」という用語
は、遺伝子の転写を制御する遺伝子の領域に言及する。調節領域はしばしばいく
つかの部分を包含する。これらの部分には転写の開始部位にあるものもあれば、
開始部位から離れて位置しているものもある。従ってこの用語は、通常エンハン
サーとして言及される領域を包含する。

【００２０】本明細書で使用される「人工調節領域」という用語は、様々な転写因子結合部
位の１つ又はそれ以上の修飾、複合、又は再配置を用いた創出によるように、人
工的に作られる（即ち、分子生物学の技術を使用して人間によって作られる）調
節領域に言及する。

【００２１】本明細書で使用される「転写因子」という用語は、調節領域の要素に結合して
対応する遺伝子の転写を調節するタンパク質に言及する。その機能によって、転
写因子はいくつかのカテゴリーに分類される。これらは、ほとんどの細胞のほと
んどの遺伝子によって必要とされる一般的な転写因子、ある種の細胞の遺伝子転
写だけを調節する細胞又は組織特異的な転写因子、及びある種のシグナルに応答
して遺伝子転写を調節する誘導性の転写因子を包含する。

【００２２】「転写因子結合部位」又は「結合部位」という用語は、転写条件又は細胞内の
物理条件に近い条件の下で転写因子に結合し得る任意の核酸配列に言及する。

【００２３】本明細書で使用されるように、「転写因子応答要素」又は「応答要素」という
用語は、転写因子と結合し、それによって対応する遺伝子の転写を調節し得る機
能性の調節領域成分に言及する。従って、結合部位は可能性のある応答要素であ
り、その調節機能は容易に試験して特徴付けることができる。

【００２４】本明細書で使用されるように、「制限部位」という用語は、特定の制限エンド
ヌクレアーゼが配列特異的な方法で開裂し得るデオキシリボ核酸の配列に言及す
る。

【００２５】本明細書で使用される「細胞」という用語は、独立した生殖が可能である、膜
に包まれた原形質体に言及する。細胞は、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ又
は組織培養において維持又は増殖され、本明細書で論じられるようにプラスミド
によって形質転換され得る。

【００２６】本明細書で使用されるように、「組織」は、同一の機能を果たす同じ種類の細
胞からなる集団に言及する。

【００２７】「核又は細胞の抽出物」という用語は、それぞれ核膜又は細胞の原形質膜内部
由来の、特にタンパク質成分を包含する細胞含有物の全部又は一部を含有する調
製物に言及する。そのような抽出物は、精製した転写因子とは区別される。

【００２８】本文脈で使用されるように、「混合」という用語は、オリゴヌクレオチドと抽
出物の成分が互いに接触し得るように、オリゴヌクレオチドと核又は細胞の抽出
物を一緒にすることに言及する。好ましくは核の抽出物が使用される。

【００２９】本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、互いに共有結合
している同じか又は異なる別個のヌクレオチドからなる核酸分子に言及する。オ
リゴヌクレオチドは、一本鎖であるか、又は相補的な配列をした２つの逆平行な
一本鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖であり得る。結合部位の同定に使用す
るには、各オリゴヌクレオチド鎖は、好ましくは約５〜５００、より好ましくは
５〜１００、さらにより好ましくは約７〜５０、最も好ましくは約２０〜５０ヌ
クレオチドの長さである。「フリーのオリゴヌクレオチド」という用語は、タン
パク質又は他のいかなる化合物にも結合していないオリゴヌクレオチドに言及す
る。本明細書で使用される「タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体」という用
語は、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドに結合したタンパク質を含む
複合体に言及する。

【００３０】オリゴヌクレオチドフラグメントの文脈で使用されるように、「変換」という
用語は、二本鎖ＤＮＡ分子を形成するために、もう１つのＤＮＡ分子に相補的な
一本鎖ＤＮＡ分子を合成することに言及する。

【００３１】本明細書で使用される「プライマー」という用語は、３’末端がＤＮＡポリメ
ラーゼを用いたＤＮＡ合成の開始部位として使用され得る一本鎖オリゴヌクレオ
チドに言及する。本明細書で使用されるように、「プライマー配列」という用語
は、プライマー又はその相補配列の配列に言及する。

【００３２】本明細書で使用されるように、「５’」及び「３’」という用語は、一般的な
使用法に一致した、一本鎖ＤＮＡ分子の２つの異なる末端それぞれに言及する。
コード配列に関連して使用される場合、この用語は、コード配列から５’の方向
又はコード配列から３’の方向にあることに言及する。環状核酸分子の配列、例
えば環状プラスミドでは、この用語はある基準配列からの方向に言及するが、鎖
を一周することはなく、好ましくは機能上の関連性を包含する。従って、例えば
、調節配列が機能的に転写に影響することが期待される位置にあって、それが直
線状分子の５’位にあるならば、それはコード領域に対して５’の位置にある。
通常、５’位はコード配列の３’末端よりは５’末端により近い。

【００３３】本明細書で使用されるように、「サイズ排除クロマトグラフィー」という用語
は、生体分子の分離技術に言及する。このアプローチは、分子を２つの群、つま
りクロマトグラフィー媒体の排除サイズより小さいものと排除サイズより大きい
ものとに分離する。タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体はフリーのオリゴヌ
クレオチドよりずっと大きいので、フリーのオリゴヌクレオチドのサイズより大
きくてタンパク質−オリゴヌクレオチド複合体のサイズよりも小さい排除サイズ
を利用すれば容易に両者を分離することができる。この文脈では、サイズは分子
又は複合体の有効半径に言及する。上記のように、本発明では、精製した転写因
子の代わりに多くの異なる転写因子を包含する核又は細胞の抽出物が使用される
。それ故、オリゴヌクレオチドフラグメントと核又は細胞の抽出物との混合から
生じるタンパク質−オリゴヌクレオチド複合体は、多くの異なるサイズを有する
。結果として、サイズ排除クロマトグラフィーは電気泳動的移動シフトアッセイ
（ＥＭＳＡ）より有用な分離を提供するが、これはサイズ排除クロマトグラフィ
ーが結合性と非結合性のオリゴヌクレオチドを単純に分離するのに対し、ＥＭＳ
Ａではゲル一面に分布したバンド系列をもたらすからである。典型的に利用され
るゲルの性質により、ＥＭＳＡは、さらなる操作のために、結合したオリゴヌク
レオチドをゲルから回収する抽出の工程も概して必要とする。

【００３４】本明細書で使用される「増幅」という用語は、ＤＮＡ分子の数を増加させるこ
とに言及する。増幅のアプローチは、限定しないが、ポリメラーゼ連鎖反応を包
含する。

【００３５】本明細書で使用されるように、「配列決定」という用語は、ＤＮＡ分子のヌク
レオチド配列を同定する方法に言及する。「ヌクレオチド配列」という用語は、
ＤＮＡ分子又は他の核酸分子にあるヌクレオチドの直線状の順番に言及する。核
酸分子の配列決定法は当業者によく知られている。

【００３６】本発明の第二の側面は、細胞又は組織特異的な人工調節領域を評価する方法に
言及する。この方法は、選択条件下で細胞が選択されるかどうかを決定すること
を含む。この方法は、ある選択遺伝子に対して転写調節の位置にある様々な推定
の転写調節領域を含有する細胞を使用する。細胞は、選択遺伝子が十分に高いレ
ベルで発現される場合のみ選択され、選択遺伝子は、推定の転写調節領域が特定
の細胞において活性であれば十分高いレベルで発現されるだろう。選択条件に応
答して選択される細胞の能力は、核酸のテスト配列がその細胞内で活性な転写調
節領域を含有することを示す。選択条件は、強い調節領域だけがその選択条件に
おいて有効に選択され得るように調整され得る。一般に、この方法は推定の転写
調節配列を有する細胞を培養することを含む。

【００３７】「十分に高いレベル」という用語は、使用される選択のタイプ及び選択に適用
されるストリンジェンシーに依存する機能的な発現のレベルに言及する。従って
、ポジティブ選択では、このレベルは「十分に高いレベル」で選択遺伝子を発現
している細胞と十分高いレベルでこの遺伝子を発現していない他の点では相同遺
伝的（イソジェニック）な細胞との区別を可能にするのに十分なものである。ネ
ガティブ選択では、「十分に高いレベル」は選択条件の存在下で細胞が成長する
のを可能にするレベルである。

【００３８】好ましい態様では、選択条件はポジティブ選択条件である。少なくとも１つの
細胞が選択条件の存在下で選択される能力は、核酸のテスト配列が細胞内で活性
な転写領域を含有することを示唆している。選択条件は、強い調節領域だけがそ
の選択条件において有効に選択され得るように調整され得る。

【００３９】もう１つの好ましい態様では、選択条件はネガティブ選択条件、即ち、ストレ
ス条件であり、選択遺伝子は保護遺伝子である。細胞の成長は、保護遺伝子の高
レベル発現が無いストレス条件では阻害される。ストレス条件の存在下で少なく
とも１つの細胞が増殖することは、核酸のテスト配列が細胞内で活性な転写領域
を含有することを示唆している。ストレス条件は、強い調節領域だけがそのスト
レス条件を有効に克服し得るように調整され得る。

【００４０】本明細書で使用される「調節する」又は「調節」という用語は、応答又は作用
の制御に関わる核酸配列又は他の分子の効果に言及する。特に、このことは構造
遺伝子の発現レベル又は速度を調節又は制御する、又はそれに影響を及ぼすこと
に関わる配列の効果を包含する。一般に、このことは転写因子が配列に結合して
遺伝子発現における転写速度又は他の工程に影響を及ぼすことを包含する。

【００４１】この文脈で使用されるように、「転写調節位置」という用語は、機能性の調節
領域が選択遺伝子の転写に影響を及ぼし得る位置に言及する。転写調節位置は、
限定しないが、選択遺伝子のコード配列に対して５’、選択遺伝子のコード配列
に対して３’、及び選択遺伝子のイントロン又はシグナル配列の内部を包含する
。人工調節領域の同定及び／又は評価のためには、選択遺伝子のコード配列に対
する５’領域は特に興味があるが、他の位置もまた興味のあるものであり、本発
明で利用され得る。

【００４２】本明細書で使用される「細胞又は組織特異的な転写調節領域」という用語は、
１つ又はそれ以上のコード配列を介して細胞又は組織特異的なやり方で転写を制
御することに関わる核酸配列に言及する。本明細書で使用されるように、「細胞
又は組織特異的な転写」という用語は、一群の細胞又はある組織において、対応
する生物体の他の細胞又は組織に比較して慨してより高いレベルで出現する遺伝
子の転写に言及する。

【００４３】本明細書で使用されるように、「トランスフェクトされた」又は「トランスフ
ェクション」という用語は、培養細胞を異種ＤＮＡにさらすことによってそれら
へそのようなＤＮＡを取込むことに言及する。このことは、様々なデリバリー方
法、例えば、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体、リポソーム内のＤＮ
Ａを使用するベクター又はプラスミドを介して、ＤＮＡを導入することを包含す
る。この方法は、エレクトロポレーション又は溶解性ペプチドの使用のような、
細胞膜の浸透を強化する技術を包含し得る。

【００４４】本明細書で使用される「一群の細胞」という用語は、同一又は同様のステージ
へ分化して、同一又は同様の特徴、例えば転写制御に関する同一又は同様の特徴
を有する細胞に言及する。

【００４５】本明細書で使用されるように、「ベクター」という用語は、細胞へトランスフ
ェクトされ得るＤＮＡ構築体に言及する。ベクターは、プラスミド、ウイルスベ
クター等を包含する多種多様な様々なタイプのものであり得る。様々な遺伝子が
細胞へデリバリーされ得るように、ベクターへ挿入され得る。この文脈での「挿
入」という用語は、核酸配列をベクターの核酸配列へ組込むことに言及する。ベ
クターは直線状と環状のＤＮＡ構築体の両方を包含し得る。

【００４６】「選択条件」という用語は、選択遺伝子を発現する細胞が顕著な特徴を示し、
それによって選択遺伝子を発現しない細胞から容易に分離され得る条件に言及す
る。選択条件はポジティブ選択条件であるか又はネガティブ選択条件、即ち、ス
トレス条件であり得る。

【００４７】「ポジティブ選択条件」という用語は、選択遺伝子を発現する細胞が容易に単
離されるように、それを区別する条件に言及する。ポジティブ選択は、限定しな
いが、蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）及び磁気ビーズソーティングであり得る
。

【００４８】「選択遺伝子」という用語は、その発現が、宿主細胞が結びついている他の細
胞から宿主細胞が区別されることを可能にする特殊な特徴をその宿主細胞に与え
る遺伝子に言及する。選択遺伝子は、限定しないが、特定の抗原又は抗体をコー
ドする遺伝子又は保護遺伝子であり得る。

【００４９】「ストレス条件」という用語は、細胞を殺すか又は細胞の分裂及び増殖を阻害
する条件に言及する。そのようなストレス条件は、限定しないが、１）上昇温度
；２）放射線；及び３）特定の生化学物質を包含する。

【００５０】「保護遺伝子」という用語は、細胞をストレス条件から保護し得るタンパク質
をコードする遺伝子を意味する。そのような保護遺伝子は、限定しないが、１）
アデノシンデアミナーゼ；２）ジヒドロ葉酸レダクターゼ；及び３）熱ショック
タンパク質の遺伝子を包含する。

【００５１】本明細書で使用される「生化学物質」という用語は、ある細胞を殺すか又はあ
る細胞の分裂及び増殖を阻害する化合物に言及する。これら生化学物質は、限定
しないが、１）キシロフラノシル−アデニン；２）メトトレキセート；３）キシ
ロフラノシル−アデニン及びデオキシコルフォルマシン；４）アラノシン、アデ
ノシン及びウリジンを包含する。

【００５２】結合部位及び調節領域に関連して使用されるように、「複合」という用語は、
２つ又はそれ以上の同一又は異なる種類のオリゴヌクレオチドを一緒に連結する
ことに言及する。「修飾」という用語は、限定しないが、１つ又はいくつかのヌ
クレオチドの置換又は、基準配列に比較した１つ又はいくつかのヌクレオチドの
追加又は消去を包含する、ＤＮＡ分子の配列内の変化に言及する。「再配置」と
いう用語は、調節領域のサブ配列の順序における１つ又はそれ以上の変化に言及
し、新しいサブ配列を挿入すること又はあるサブ配列を新しいサブ配列で置換す
ることを包含する。このことはサブ配列の並べ替え、置換及び挿入の組み合わせ
を包含する。

【００５３】本発明の第三の側面は、細胞又は組織特異的な転写調節領域を評価するための
、上記２つの側面を組み合わせる方法を特徴とする。この方法は、一群の細胞由
来の細胞又は核の抽出物と複数の任意の二本鎖オリゴヌクレオチドフラグメント
との間に形成されたタンパク質−オリゴヌクレオチド複合体においてオリゴヌク
レオチドを同定することを含む。複合体におけるオリゴヌクレオチドの存在は、
このオリゴヌクレオチドが結合部位を包含することを示唆する。次いで１つ又は
それ以上の細胞が選択条件下で培養される。この細胞のなかで、少なくとも１つ
の細胞、及び好ましくは複数の細胞が、選択遺伝子に対する転写調節位置に挿入
された核酸テスト配列を含有する。テスト配列は、細胞又は核の抽出物を使用し
て同定される少なくとも１つの結合部位からなる。選択条件の存在下で選択され
得る少なくとも１つの細胞の能力は、核酸テスト配列が細胞内で活性な転写領域
を含有することを示唆する。選択条件は、強い調節領域だけがその選択条件にお
いて有効に選択され得るように調整され得る。

【００５４】さらに、もう１つの側面では、本発明は、実施例５及び図表に記載される人工
調節領域の全部又は一部を包含する人工調節領域を提供する。人工調節領域は、
好ましくは、関心対象のコード領域に関する転写調節位置のなかにある。記載さ
れる領域の１つの部分は、記載される人工調節領域の１つの少なくとも２０の連
続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０の連続したヌクレオチド、
さらにより好ましくは少なくとも８０の連続したヌクレオチドを包含する。好ま
しくは、この部分は、本明細書に記載されるような分析のために使用されるプラ
スミドのなかにコード配列が占められたとき、それに対してほぼ同じ位置に配置
される。従って、この部分は、対応する記載された人工調節領域のなかにコード
配列が占めた位置の好ましくは１００ヌクレオチド以内、より好ましくは６０ヌ
クレオチド以内、及びさらにより好ましくは３０ヌクレオチド以内にある。

【００５５】本発明の他の特徴及び利点は、付随の図面に関連した以下の発明の詳細な説明
及び特許請求の範囲から明らかになろう。発明の詳細な説明本発明は、転写因子の結合部位を同定して選択する方法及び人工調節領域又は
同定される転写調節領域を創出して評価する方法を提供する。以下の記載は説明
のために提示されるのであって、本発明をいかなるやり方でも限定することを意
図していない。

【００５６】本記載は本発明の好ましい態様の特定の実施例を包含する。これらの例は転写
因子の結合部位を同定するためにオリゴヌクレオチドフラグメント及び核又は細
胞の抽出物がいかに使用されるかを示す。これらの例はまた、これらの結合部位
又はその部分、及び／又は既知の調節領域又は結合部位の修飾、複合及び再配置
を介して人工調節領域が創出され得る方法を示す。さらに、これらの例は、人工
調節領域が評価され得る方法を示す。そのような評価は、特定の細胞系において
高レベルで遺伝子の転写を指令する機能的な人工調節領域を同定し得る。これら
の例はｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏの技術を包含する。

【００５７】転写因子結合部位の同定本発明は、細胞のタンパク質に結合し、それ故に推定の転写調節領域となる核
酸配列を同定する方法を提供する。この方法は、特定の細胞又は組織の核抽出物
又は全細胞抽出物からの粗転写因子調製物を特に包含する、ＤＮＡ結合性タンパ
ク質の多種多様な任意の混合物を使用し得る。そのような混合物又は抽出物にお
けるある種のタンパク質は、オリゴヌクレオチド配列の混合物からの特定のオリ
ゴヌクレオチド配列と結合して、それを選択する。オリゴヌクレオチド配列は、
ランダム配列、又はゲノム又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡフラグメント、又は既知の
結合部位又は他の選択された核酸配列の部分であるか、それを修飾又は再配置し
たものであり得る。

【００５８】タンパク質に結合したか又は選択されたオリゴヌクレオチドは、増幅、クロー
ニング及び配列決定によるようにして同定される。選択されたオリゴヌクレオチ
ドの配列からこれらの細胞中のより豊富な転写因子によって認識されるコンセン
サス配列が明らかになるだろう。選択される配列のなかには、共通の非細胞特異
的な転写因子によって認識されるものもあるが、選択される配列の多くは細胞特
異的な転写因子によって認識されるだろう。

【００５９】人工調節領域を同定するための典型的な選択法の第一工程として、好ましくは
５つの重要な特徴を有する人工の一本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴ）が構築又
は獲得される。これらのオリゴは、好ましくは以下を含有する：１．選択プロセスが実施された後でＤＮＡ増幅のプライマーアニーリング部位
として作用する、５’末端にある１０〜３０ヌクレオチドの特定配列。この配列
はすべてのオリゴで同一であり、図１で「Ｐ１」と表示されている。

【００６０】２．この５’プライマー配列に対してすぐの３’か又はその３’末端の内部に
位置している特定の制限酵素開裂部位。この部位は選択されたオリゴのクローニ
ングのために使用されるだろう。この部位はすべてのオリゴで共通であり、図１
で「Ｒ１」と表示されている。

【００６１】３．多くのランダム配列（好ましくは１０以上のヌクレオチド）を含有する、
オリゴの中央部分内の領域。この領域内の配列が選択プロセスにおいてオリゴを
選択する能力を担う。

【００６２】４．ランダムヌクレオチド領域のすぐ３’末端に位置する特定の制限酵素開裂
部位。この部位は選択されたオリゴをクローニングするために他の制限部位とと
もに使用されるだろう。この部位はすべてのオリゴで共通であり、ランダムヌク
レオチド領域の５’側にある制限酵素開裂部位（Ｒ１）とは異なる場合があり、
図１で「Ｒ２」と表示されている。

【００６３】５．元のオリゴに相補的な第二の鎖の選択前合成と、選択プロセスが実施され
た後でのＤＮＡ増幅の両方にとってプライマーアニーリング部位として作用する
、オリゴの３’末端にある１０〜３０ヌクレオチドの特定配列。この配列はすべ
てのオリゴで同一であろうが、オリゴの５’末端にある配列（Ｐ１）とは異なる
場合があり、図１で「Ｐ２」と表示されている。

【００６４】図２に示されるように、この態様における結合部位選択の全体スキームは以下
のようである。

【００６５】先ず、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ又はＴ７ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラ
ーゼを使用してプライマーＰ２を拡張することにより、一本鎖オリゴを二本鎖オ
リゴへ変換する。二本鎖オリゴをゲルで精製し、好ましくは単離核から調製され
るが全細胞抽出物からも調製され得る粗転写因子調製物とともにインキュベート
する（Ｄｅｎｔら、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｎＦａｃｔｏｒｓ：ＡＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ（編）ＩＲＬプレ
ス、オックスフォード、１〜２６，（１９９３））。タンパク質抽出物の転写因
子は、適切な認識配列又は結合部位を含有するオリゴに結合する。好ましい態様
では、タンパク質−ＤＮＡ複合体がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に
よって非結合オリゴから分離される。ＳＥＣがこの工程に好ましいのは、結合し
た転写因子の分子量における違い、及び多重結合性のタンパク質複合体がいくつ
かの結合部位に結合し得る可能性における違いにより、タンパク質−ＤＮＡ複合
体が様々なサイズになり得るからである。従って、電気泳動ではゲル全体にバン
ドが分布してさらなる抽出が必要とされるだろう。対照的に、ＳＥＣの媒体及び
条件はフリーのオリゴとタンパク質結合オリゴとの明確な分離を提供するために
選択され得る。

【００６６】次いで選択されたオリゴを精製し、プライマーＰ１及びＰ２を使用して増幅し
、制限酵素のＲ１及びＲ２で消化して、隣接するプライマー配列から中央のタン
パク質結合領域を切り出す。当業者は適切なプライマー及び制限酵素を容易に決
定し得る。次いで消化されたオリゴを連結してコンカタマーを形成させ、２００
〜４００ｂｐ範囲のフラグメントを精製し、適切なクローニング／配列決定用ベ
クターへクローン化する。２０又はそれ以上の異なる選択された配列を含有する
２００〜４００ｂｐのコンカタマーをクローニングすることで、配列決定反応ご
とに、単一の選択オリゴをクローン化して配列を決定する場合に得られるよりも
ずっと多くの配列情報を得ることが可能になる。しかしながら、この方法はまた
単一のオリゴ、又は他のサイズのコンカタマーも利用し得る。

【００６７】個々の選択されたオリゴの配列を並置して最も豊富な転写因子に対するコンセ
ンサス配列を同定する。レポーター遺伝子を推進させる基底の異種調節領域の上
流にあるこれらの配列を単独に又は組み合わせてクローニングすることにより、
その細胞特異性をテストする。選択されたオリゴはまた、人工調節領域を作るた
めに、既知の転写因子応答要素と組み合わせても使用され得る。

【００６８】この方法は発現される遺伝子又は関心対象の細胞に存在する転写因子に関する
知識を必要としないので、この方法は遺伝子調節がほとんど理解されていない細
胞型又は条件の下で利用される転写調節配列を同定するために使用され得る。こ
の方法は、特定の細胞型又は組織において高活性である調節領域、並びに細胞特
異的な調節領域を同定して特徴づけるために使用され得る。これは細胞の様々な
発生段階、誘導状態又は形質転換状態を包含するように拡張され得る。

【００６９】人工調節領域の評価方法上記に論じたように、従来法に限界があるために、人工調節領域の機能を評価
するには新しい方法が必要とされる。本発明は、機能的な人工調節領域を選択す
るために、薬物のようなストレス条件から細胞を保護し得るタンパク質の発現を
利用するアプローチを提供する。人工調節領域を評価することに加え、この方法
は様々な他の任意の転写調節配列を評価するために使用され得る。

【００７０】多くの様々なタンパク質が特定の生化学物質（薬物）の毒性効果から真核細胞
を保護することができる。これらのタンパク質のあるものをコードする遺伝子（
保護遺伝子）は、この保護遺伝子に連鎖している他の選択不能な遺伝子を増幅す
るための選択に使用されてきた。この増幅が起こるのは２つの連鎖した遺伝子を
トランスフェクトされた細胞のゲノムの同一部位へ統合した後である。これらの
選択システムは、組換えタンパク質の生産を増加するために外来遺伝子を増幅す
るために使用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５
：５３７〜５６６（１９９０）；Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉ
ｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２：７２３〜７２９（１９９１）；
Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ５：１４３〜１５５（１９９４））。

【００７１】遺伝子増幅スキームにおいて最も頻繁に使用されている遺伝子は、薬物メトト
レキセートの毒性効果に抗する保護を提供する、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ
ＨＦＲ）をコードする遺伝子である。ＤＨＦＲ遺伝子と関心対象の遺伝子を両方
含有する発現プラスミドでメトトレキセート感受性細胞をトランスフェクション
した後、メトトレキセートの増加濃度で細胞を処置することによって、これらの
遺伝子が共増幅するように誘導し得る（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．１８５：５３７〜５６６（１９９０））。

【００７２】アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）の遺伝子も連鎖した遺伝子の増幅に対して
選択するために使用され得る（Ｋｅｌｌｅｍｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒら（編）Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン、２１５〜２
２５（１９８９）；Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２：７２３〜７２９（１９９１）；Ｋｅｌｌｅｍ
ｓ，ＧｅｎｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅ
ｌｌｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、２０７〜２２１（１９
９２）；Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＭｅｔｈｏｄｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ５：１４３〜１５５（１９９４））。ＡＤＡは哺乳類細胞のプリン代
謝に関わる酵素であり、キシロフラノシル−アデニン（ｘｙｌ−Ａ）のような薬
物の毒性効果に抗する保護を提供し得る。

【００７３】出願人は、転写調節領域の転写活性を評価する方法にＡＤＡ遺伝子が使用され
得ることを見出した。この方法では、細胞の成長を可能にするために高レベルの
ＡＤＡ遺伝子発現が必要とされる。そのような高レベルの発現は、転写調節位置
、例えばＡＤＡ遺伝子の上流に挿入されたテスト配列がＡＤＡ遺伝子の十分な転
写を可能にすることに有効である場合にのみ提供されるだろう。

【００７４】このシステムでは、ランダム・コンビナトリアル・アプローチを使用して合成
オリゴヌクレオチド、クローン化された天然の調節領域フラグメント、及び／又
はタンパク質結合部位の混合物から人工調節領域／エンハンサーが組立てられる
。人工調節領域は、プラスミドに含有された基本ＴＡＴＡボックス及び機能的な
ＡＤＡミニジーン（ｃＤＮＡ）の上流に挿入される。これによって、何百万もの
異なる組み合わせを含有し得る人工又は組換えの調節領域ライブラリーが産生さ
れる。次いでこのプラスミド・ライブラリーを様々な起源の細胞へトランスフェ
クトし、一過性アッセイにおけるＡＤＡ活性の上昇でトランスフェクトした細胞
を選択する。ＡＤＡを発現しないか又は発現レベルが低い細胞は、不十分なＡＤ
Ａ活性の故に殺されるか又は培養から失われる。人工調節領域が強いために高レ
ベルのＡＤＡを発現する細胞は生き残るだろう。従ってこの方法は、特定の細胞
型でＡＤＡの発現を推進する人工調節領域を選択する。このアプローチは、遺伝
子発現の様式がほとんど理解されていないか又は特定遺伝子の調節領域が特徴づ
けられていない細胞又は組織において機能する強い調節領域を開発するために使
用され得る。

【００７５】このアプローチはＡＤＡをベースとする選択プロトコールの使用に限定されず
、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、メタロチエニン、ＣＡＤ、チミジル
酸シンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等を限定せずに包含する、他の
遺伝子の発現に基づいて開発された選択戦略も利用し得る（より広汎なリストに
ついては、Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２：７２３〜７２９（１９９１）を参照のこと）。

【００７６】このタイプの選択システムが使用され得る例を以下に述べる：人工調節領域の転写因子結合部位からの創出すでに論じたように、転写因子それぞれの結合部位の変化した組成、順序、及
び／又はスペーシングを有する人工調節領域が創出される。人工調節領域の創出
には、通常、特定の制限部位を組み合わせたものを使用する。簡便な部位がない
場合は、結合部位の末端で化学的に再合成又は工学処理した様々な制限部位のよ
うな代替物が使用され得る。様々な成分を組み立てるために、方向性のある核酸
指令アセンブリー法（ＮＯＭＡＤ）（Ｒｅｂａｔｃｈｏｕｋら、ＰＮＡＳ９３
：１０８９１〜１０８９６（１９９６））のような多種多様な方法が使用され得
る。

【００７７】ＮＯＭＡＤは、一般的なクローニング戦略である（ＷＷＷ供給元：ｈｔｔｐ：
／／Ｌｍｂｌ．ｂｉｏｓ．ｕｉｃ．ｅｄｕ／ＮＯＭＡＤ／ＮＯＭＡＤ．ｈｔｍｌ
）。ＮＯＭＡＤは、標準化された付着構造を有する「モジュール」の形態で結合
部位を操作し得る。特殊設計された「アセンブリーベクター」は、ＩＩＳ型制限
酵素の、その制限配列外のＤＮＡを切断する能力を使用して、任意に前決定され
た順序で任意数の結合部位を連続的及び指向的に挿入することを可能にする（Ｒ
ｅｂａｔｃｈｏｕｋら、ＰＮＡＳ９３：１０８９１〜１０８９６（１９９６）
）。ＮＯＭＡＤは、転写因子に対する個々の結合部位の変化した組成、順序又は
スペーシングを有する人工調節領域を簡便に構築することを保証する。得られた
人工調節領域は、ＡＤＡ選択法のような方法で評価され得る。

【００７８】ＡＤＡ選択に使用される生化学物質遺伝子を増幅するためにＡＤＡ選択を使用する多くのプロトコールが開発され
てきた（Ｋｅｌｌｅｍｓら、ＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
，Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒら（編）ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン、２１５〜２２５（１９８９）；Ｋ
ｅｌｌｅｍｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ２：７２３〜７２９（１９９１）；Ｋｅｌｌｅｍｓ，ＧｅｎｅＡｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、２０７〜２２１（１９９２）；Ｋｅｌｌｅｍ
ｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ５：１４
３〜１５５（１９９４））。

【００７９】本発明では、人工調節領域のような調節領域又は他の調節領域を同定して評価
するためにＡＤＡを使用する方法が開発された。この方法は、以下を包含する多
くの異なる方法で実施され得る。

【００８０】最も単純な方法は、キシロフラノシル−アデニン（ｘｙｌ−Ａ）だけの上昇濃
度を使用する。低レベルのＡＤＡを発現している細胞では、アデノシンキナーゼ
によってｘｙｌ−Ａはｘｙｌ−ＡＭＰへ変換される。ｘｙｌ−ＡＭＰは引き続い
てｘｙｌ−ＡＴＰへ変換され、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡへ取込まれ、
ＲＮＡ鎖のさらなる伸長を阻止するように作用する。この鎖終止は、リボヌクレ
オシドに含有される正常の糖と異なり、ＲＮＡ鎖の伸長に必要とされる３’ヒド
ロキシル基をキシロースが欠くという事実によるものである。ＡＤＡはｘｙｌ−
Ａをヒポキサンチン及びキシロース−Ｐ_i（いずれも無毒である）へ変換することによってそれを解毒化し得る。ｘｙｌ−Ａの鎖終止効果はＤＮＡ合成とは独立
しているので、ｘｙｌ−Ａは分裂中の細胞だけでなく、分裂していない細胞もす
ぐに殺す（Ｋｅｌｌｅｍｓら、ＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
，Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒら（編）ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン、２１５〜２２５（１９８９））。
特定タイプの細胞を殺すのに必要とされるｘｙｌ−Ａの濃度は、その細胞によっ
て発現される内因性ＡＤＡのレベルに依存している。普通ほとんどの細胞は比較
的低いレベルのＡＤＡを産生するので、低濃度（マイクロモル）のｘｙｌ−Ａに
よってすぐに殺される。内因性のＡＤＡはデオキシコルフォルマシンとのインキ
ュベーションによって選択的に阻害され得る。このプロトコールは、ＡＤＡの発
現が増加するのはｘｙｌ−Ａの約１０μＭ程度の上昇濃度までであるという制限
を有する。より高い濃度のｘｙｌ−Ａに対して抵抗性である細胞を選択すること
は可能であるが、それらがより高いレベルのＡＤＡを発現するわけではない。約
１０μＭ以上のｘｙｌ−Ａに対する抵抗性のために選択される細胞では、（ＲＮ
Ａポリメラーゼの基質となるｘｙｌ−ＡＴＰを産生する第一工程であるｘｙｌ−
Ａからｘｙｌ−ＡＭＰへの変換をする）アデノシンキナーゼの活性を欠いている
ことが見出された。

【００８１】１）アラノシン（ＡＭＰのｄｅｎｏｖｏ合成を阻害する）；２）アデノシン
（サルベージ生合成経路を介してアデノシンキナーゼに必要とされる基質になる
）；及び３）ウリジン（ＵＮＴ合成に対する高濃度アデノシンの阻害効果を克服
する）を組合せて使用する、１１ＡＡＵ選択法（Ｙｅｕｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５８：８３３８〜８３４５（１９８３）；Ｙｅｕｎｇら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８３３０〜８３３７（１９８３）と呼ばれるＡＤＡ選
択のもう１つの方法が引き続いて開発された。この選択プロトコールは、ＡＭＰ
を産生するアデノシンキナーゼを必要とし、選択プロセスの間にこの酵素が影響
され得る可能性を大幅に減らしている。このプロトコールでは、正常細胞に対し
て細胞毒性となる濃度でアデノシンが使用される。従って、このプロトコールは
過剰アデノシンを解毒化するのに必要とされるＡＤＡの発現上昇で選択する。１
１ＡＡＵ選択と上昇濃度のデオキシコルフォルマシンの両方に細胞をさらすこと
によって、ＡＤＡ活性はさらに増加され得る（Ｙｅｕｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５８：８３３０〜８３３７（１９８３））。しかしながら、１１ＡＡ
Ｕ／デオキシコルフォルマシンの選択システムに耐えられない細胞もある。

【００８２】さらに別の選択システムは、デオキシコルフォルマシンと組合せた細胞毒性薬
としてｘｙｌ−Ａを使用し、内因性ＡＤＡ活性を阻害する（Ｋａｕｆｍａｎら、
ＰＮＡＳ８３：３１３６〜３１４０（１９８６）；Ｋｅｌｌｅｍｓら、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＩｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒら（編）
ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワ
シントン、２１５〜２２５（１９８９））。これは上昇したＡＤＡレベルに対し
て選択するために非常に有効な方法であるが、アデノシンキナーゼ活性の維持に
対する選択を何も提供しない。従って、この方法によりアデノシンキナーゼ突然
変異体が出現する確率が高まるので、これは長い時間使用されるべきではない。

【００８３】すでに論じたように、上記の選択法が人工調節領域の選択及び評価に使用され
得る。評価される人工調節領域の１つの制御下にある外因性のＡＤＡ遺伝子が選
択圧力下に置かれる細胞へトランスフェクトされる。生き残っている細胞は、生
化学物質の毒性効果から細胞を保護するＡＤＡ遺伝子の強い転写を指令する機能
的な人工調節領域を担っているはずである。

【００８４】示されたように、有効な人工調節領域を同定するために多種多様な選択法が使
用され得る。一般に、保護遺伝子の発現に基づいた選択法が使用され得て、ここ
でその選択法は、低い又は適度の発現レベルと高い発現レベルとを明確に区別で
きる。このことは、様々な人工及び天然のプロモーター又は他の調節領域の相対
効果を半定量的に比較することを可能にする。

【００８５】磁気ソーティング及びＦＡＣＳのようなポジティブ選択システムも使用され得
る。ＭＡＣ選択システム（ＭｉｌｔｅｎｖｉＢｉｏｔｅｃ，オーバーン、ＣＡ
）は、そのようなシステムの１例である。このシステムでは、ＣＤ４抗原をコー
ドする遺伝子が選択遺伝子となり、磁気ビーズに複合したＣＤ４抗体を使用して
、ＣＤ４抗原を発現している細胞を非発現細胞から分離する。別のやり方では、
蛍光標識化ＣＤ４抗体を使用してＣＤ４発現細胞を検出し、次いで発現細胞はＦ
ＡＣＳによって分離され得る。

【００８６】筋肉細胞の人工調節領域特定の細胞型又は状態にある高レベルの活性を有する人工調節領域の開発は、
筋肉細胞において高レベルの発現をしている領域を同定することによって例示さ
れ得る。上記のように、細胞特異的な転写因子（転写因子の結合部位）に結合し
得る既知のコンセンサス配列を含有するそれぞれの人工オリゴヌクレオチドを合
成し、ランダムな組合せで共に連結させ、ＡＤＡ遺伝子の上流でクローン化し得
る。例えば、血清結合部位（ＳＲＥ）、ＭＥＦ−１部位、ＭＥＦ−２部位及び／
又はＴＥＦ−１部位を包含する、筋肉特異的な結合部位のコンセンサス配列が使
用され得る。この人工調節領域のライブラリーが筋肉細胞（例えば、Ｃ₂Ｃ₁₂、ＳＯＬ８又は一次筋原細胞）へトランスフェクトされ得る。このＡＤＡ選択シス
テムは、弱い筋肉調節領域を含有するクローンを捨てて、強い筋肉調節領域を含
有するクローンを取る選択を可能にする。

【００８７】また、クローン化されたか又はＰＣＲ増幅された細胞特異的な調節要素を１つ
又はそれ以上の頻回切断性の制限酵素で消化して、細胞特異的な転写因子に結合
し得る配列を含有する小さなＤＮＡ断片の混合物を産生し得る。これらのフラグ
メントは、上記のように、ランダムな組合せで共に連結させ、ＡＤＡ遺伝子の上
流でクローン化され得る。例えば、筋肉特異的な結合部位を含有する骨格α−ア
クチン、心臓α−アクチン、ミオシン重鎖及びミオシン軽鎖の遺伝子の調節領域
が使用され得る。

【００８８】この人工調節領域のライブラリーが、筋肉細胞（例えば、Ｃ₂Ｃ₁₂、ＳＯＬ８又は一次筋原細胞）へトランスフェクトされる。このＡＤＡ選択システムは、弱
い筋肉調節領域を含有するクローンを捨てて強い筋肉調節領域を含有するクロー
ンを取る選択を可能にする。遺伝子発現を増強する３’、５’及びイントロン領域の同定遺伝子に対する適切な配向性でプラスミド構築体に挿入されると遺伝子の発現
を増強する効果を有する、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、５’非翻訳領域及び
イントロン要素のような新規領域を包含する遺伝子制御領域を同定するために、
選択の方法論と組合せたコンビナトリアルアプローチを、単独でか又は本明細書
に記載したプロモーター選択方法論と複合して使用し得る。当業者は、３’ＵＴ
Ｒ、５’ＵＴＲ及びイントロン由来の要素が挿入される適切な位置を認知するだ
ろう。既知遺伝子由来の３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ又はイントロンは、例えば本明
細書に記載される方法によってランダムにプロモーター／エンハンサー配列と連
結し、関心対象の遺伝子のコード配列に関連する適切な位置へ挿入される。上記
のように、ランダム配列及び様々な組合せで再編成された既知配列を限定せずに
包含する、他の配列も使用され得る。従って、上記に記載したような選択方法は
、その結びついた遺伝子の発現を増強する効果を有する制御領域を同定するため
に利用される。様々な組織タイプ由来の転写調節領域の選択本明細書で記載された方法は筋肉特異的なプロモーター配列の選択によって例
示されているが、この方法の使用は筋肉細胞には決して制限されない。例えば、
肺、腎臓、脳、眼、内耳、上皮、内皮、中皮、平滑筋、ニューロン、リンパ球、
マクロファージ、グリア、小膠細胞、腸、結腸、骨、造血、表皮、肝臓、癌、前
癌、転移細胞、胎児又は血管を起源とする細胞が、発現を増強する調節領域を同
定するために使用され得る。さらに、ある細胞型由来の調節要素が他の細胞型に
おいて、発現増強能力のために選択され得る。そのような方法も本発明の範囲内
にある。人工調節領域のサイズを減らした活性部分の同定上記の方法を使用して、選択された細胞の型又は集団において適切な発現レベ
ルを供給する人工調節領域を同定することが可能である。この同定に利用される
オリゴヌクレオチドの長さによっては、増強された転写調節効果を提供するより
大きい領域の部分を同定して有効利用することにより、人工調節領域のサイズを
減らすことが有用になり得る。そのような同定は、有効な調節領域の部分を同じ
長さの不活性配列に置換して、得られた修飾化領域の活性を決定するような、定
常的な方法によって実施され得る。発現増強活性が有意に減少すれば、修飾され
た領域が発現増強活性を提供する配列の少なくとも一部を包含することを示す。
一方、得られる発現にこの修飾が有意に影響しなければ、修飾された部分は人工
調節領域の活性に貢献しないことを示す。従って、転写調節活性に有意に貢献す
る部分は、元の人工調節領域の他の部分から分離した新たな、より小さい人工調
節領域として使用され得る。一般に、コード配列に関する活性部分の位置は、元
の人工領域でそれが占めていた位置のほぼ同じところに維持されるべきである。
しかしながら、それは正確に同じ位置に維持される必要はなく、好ましくは元の
位置の１００、６０、３０又はより少ない塩基の範囲内であり得る。

【００８９】活性部分は様々なサイズをとり得るが、小さな人工調節領域を提供する部分は
、元の人工領域の好ましくは少なくとも２０の連続したヌクレオチドを、より好
ましくは、少なくとも４０、６０、８０又は１００の連続したヌクレオチドを包
含する。

【００９０】本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、それは決して本発明を制
限するものではない。実施例１．調節要素のランダムな組合せによる筋肉特異的な人工調節領域ライブラリーの産生入手し得る天然に存在する筋肉特異的調節領域は、筋肉細胞における転写を必
ずしも所望されるやり方では調節し得ない。従って、この転写を制御するための
新しい候補を提供するために、筋肉特異的な人工調節領域が必要とされる。筋肉
特異的な人工調節領域は、一般的な転写又は筋肉特異的な転写の調節に重要であ
ることが知られている転写因子結合部位をランダムに組合せて構築され得る。こ
の実施例は、既知の結合部位の選択を使用して筋肉特異的な人工調節領域を構築
し得る方法を説明する。

【００９１】以下に示す配列は、ＭＲＥ（筋肉応答要素）、塩基性へリックス・ループ・へ
リックス（ｂＨＬＨ）転写因子のファミリーによって認識される結合部位である
Ｅボックス、及び転写因子の結合部位であるＭＥＦ−２、ＴＥＦ−１及びＳｐ１
を包含する。ＭＥＦ−２ＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＭＲＥＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＥボックスＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＥＦ−１ＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＧＧＳｐ１ＣＣＣＣＧＣＣＣ人工調節領域を構築する第一工程は、上記結合部位の１つを含有する二本鎖オ
リゴヌクレオチドを合成することである。この合成は、包含される結合部位のそ
れぞれについてなされる。オリゴヌクレオチドは付着末端である、つまり互いに
相補的である配列の付いた一本鎖である末端を有するべきである。好ましくは、
オリゴヌクレオチドは１つ又は２つのらせんターンに適合し、連結された後で要
素が同一面上にくるようにする。このことは、上記要素に含有される接触点が互
いに約１０塩基対離れている（又は約２０塩基対離れている）ように配列を構築
することによって達成され得る。当業者には、適切なスペーシング及び付着末端
を提供する適切な技術が知られている。

【００９２】これらオリゴヌクレオチドは、特定比率の様々なオリゴヌクレオチドを使用し
て一緒に混合される。この比率は特定要素の存在に有利になるように変化し得る
。例えば、ＭＥＦ−２、Ｅボックス、ＭＲＥ、ＴＥＦ−１及びＳｐ１は、人工調
節領域においてＭＥＦ−２の存在確率を高めるために、４：２：２：２：１の比
率で混合され得る。同様に、この比率は、他の結合部位が有利になるように偏ら
せてよい。混合されたオリゴヌクレオチドは、付着末端のアニーリングを介して
自動的に非共有的に連結され得る。次いでオリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼ
を使用して連結される。従って、オリゴヌクレオチドは共に共有結合して新しく
てより長いオリゴヌクレオチドを形成する。

【００９３】連結されたオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼを用いた部分消化によって切断
される。消化されたオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動によって分離し、特定の
サイズ、例えば２００ｂｐのオリゴヌクレオチドをゲルから回収する。回収した
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼを使用して付着末端アダプターでキャッ
プされる。

【００９４】キャップされたオリゴヌクレオチドは発現分析用の適切なベクターへクローン
化される。例えば、有効な筋原性プロモーター／エンハンサー配列の同定のため
には、筋原性ベクター系（ＭＶＳ）β−ｇａｌ構築体のＳｋ−アクチンＴＡＴＡ
ボックスに隣接した部位又はＭＶＳβ−ｇａｌ構築体の−２００位に、キャップ
したオリゴヌクレオチドが挿入され得る。実施例２．一次筋原細胞の分化期における調節領域活性の相対比較人工調節領域は、それが転写の調節に機能していることを確かめるために評価
されるべきである。大規模評価が、上記のように、ストレス条件選択（例、ＡＤ
Ａ）でなされ得る一方で、中規模評価はストレス条件選択か又は以下のアプロー
チ又は他の発現レベル分析のいずれかでなされ得る。この実施例はまた、特定の
細胞、この例では筋肉細胞における転写速度を調節する人工調節領域の選択につ
いても説明する。

【００９５】このアプローチでは、人工調節領域は、レポーター遺伝子の転写を調節するた
めに選択遺伝子ではなく、ベクターへ挿入される。レポーター遺伝子は、限定し
ないが、β−ｇａｌ及びルシフェラーゼをコードする遺伝子を包含する。実施例
１の構築体のような、ミニ溶解液（ｍｉｎｉｌｙｓａｔｅ）調製ＤＮＡを９６穴
マイクロタイターディッシュに入った筋原細胞の培養液へ移す。β−ｇａｌ活性
を定常的な方法、例えば、ミニＯＮＰＧアッセイによってアッセイし、サイトメ
ガロウイルスの極初期プロモーターによって推進されるβ−ｇａｌの発現（ＣＭ
Ｖ−β−ｇａｌ）と比較する。β−ｇａｌの高活性は強い人工調節領域を表す。
当然ながら、基準発現レベルには他の非細胞特異的な調節領域も使用され得る。

【００９６】 β−ｇａｌ活性のアッセイは評価される調節領域について定量的な情報をもた
らすので、ストレス条件アプローチを使用して得られる人工調節領域のさらなる
評価のためにも上記のアプローチが使用され得る。

【００９７】図３は、一次筋原細胞の分化期における、相対的な調節領域活性の比較を示す
。この実験は、レポーター遺伝子産物アッセイを使用してなされた。２ｘＭＥＦ
−２を含有する調節領域は、試験された他の調節領域より約５倍高い活性を有す
る。この結果は、２ｘＭＥＦを含有する調節領域が筋原細胞において高レベルで
遺伝子転写を賦活化し得ることを示している。実施例３．ｃ−ＦｏｓのＳＲＥと筋肉のＳＲＥに対する異なったＳＲＦ活性レポーター遺伝子産物アッセイを使用する上記のアプローチ（実施例２）を使
用して、ｃ−ＦｏｓのＳＲＥ及び筋肉のＳＲＥ（配列を下に示す）に対する異な
ったＳＲＦ活性を定量した。両者の配列は、下線を施したＳＲＦ結合部位に配列
類似性を有する。Ｃ−ＦＯＳＳＲＥ：ＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧ
ＣＧ筋肉ＳＲＥ：ＧＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＧルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を調節するために、ｃ−Ｆｏｓ
ＳＲＥ及び筋肉ＳＲＥをベクターへ挿入した。このベクター構築体をＣ₂Ｃ₁₂ 筋原細胞へトランスファーした。ルシフェラーゼ遺伝子は様々なＳＲＦの存在下
で転写される。このルシフェラーゼ活性をアッセイした。ＧＣＮ１を除き、試験
した転写因子はすべてｃ−ＦｏｓＳＲＥと筋肉ＳＲＥに対して同等の活性を示
した。ｃ−ＦｏｓＳＲＥに対しては、ＧＣＮ１はＳＲＦｗｔより約３倍高い活
性を有するが、筋肉ＳＲＥに対しては、対照的に、ＧＣＮ１はＳＲＦｗｔの約１
／２の活性を有する（図４）。これらの結果は、転写結合部位におけるわずかな
変異が、特定の転写因子の存在下では、調節領域活性に大きな違いをもたらし得
ることを示している。実施例４．ｉｎｖｉｖｏにおける組織又は細胞特異的な要素の選択ｉｎｖｉｔｒｏの選択アプローチだけでなく、組織又は細胞特異的な人工の
転写調節領域はｉｎｖｉｖｏでも選択及び評価され得る。この人工的な要素の
最も重要な使用の１つは、生物体において組織又は細胞特異的な遺伝子発現を調
節することである。ｉｎｖｉｔｒｏで同定された人工要素がその機能をよりよ
く評価するか又は理解するためにｉｎｖｉｖｏでさらに研究され得る。有用な
ｉｎｖｉｖｏアプローチは、限定しないが、トランスジェニック動物及び筋肉
注射を包含する。

【００９８】Ａ．ベクターのトランスジェニックマウスへの挿入特定の細胞型、例えば筋肉細胞でｉｎｖｉｔｒｏ活性を有するものとして同
定された人工要素の制御下にあるレポーター遺伝子、例えばβ−ｇａｌを含有す
るベクターが構築される。このベクターを担うトランスジェニックマウスが、標
準的な卵母細胞注入法（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８〜４４４２（１９５８））によって産生され、
飼育され、トランス遺伝子を次世代へ安定に伝達することを示し得る。遺伝形質
転換性（トランスジェニクス）は、ポリメラーゼ連鎖反応又は、例えば末端切断
ＤＮＡからのサザンゲノムＤＮＡブロッティング分析によって同定され得る。

【００９９】遺伝形質転換性は、トランスファーされたベクターの組織特異的な発現、例え
ば筋肉特異的な発現について、いくつかの組織から単離した全ＲＮＡのＲＮＡブ
ロッティング又はβ−ｇａｌアッセイによって試験され得る。例えば、骨格筋、
精巣、リンパ節、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、脳、骨髄、血液及び他の組織由
来のサンプルを採取して分析し得る。様々な組織におけるβ−ｇａｌ活性の定量
によるような発現レベルの分析及び比較によって、生物体における人工調節領域
の調節パターンが明らかになるだろう。ある組織で他の組織よりも有意に高いレ
ベルで発現していることは、プラスミド上の調節領域がその組織に特異的である
ことを示している。

【０１００】組織特異的な発現のそのようなｉｎｖｉｖｏ分析は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴ
Ｒ及びイントロンの位置のような、コード配列に関する任意の位置にある調節領
域の評価に適用される。

【０１０１】Ｂ．ｉｎｖｉｖｏにおける体細胞遺伝子の骨格筋へのトランスファーｉｎｖｉｖｏの遺伝子治療に使用される場合の人工要素の効果を示すために
、及び／又は筋肉特異的な活性を有する要素を同定するために、β−ｇａｌ又は
ルシフェラーゼをコードする遺伝子のようなレポーター遺伝子の発現用ベクター
を成体の筋肉（例えば、鳥類又は哺乳類）へ注入し得る。

【０１０２】人工要素の制御下にあるか又は（対照として使用される）既知の調節領域の制
御下にあるβ−ｇａｌを担っているベクターを遠心分離によってペレット化し、
真空乾燥し、再懸濁して適切な製剤とし、６匹のマウス２組の四頭筋（他の筋肉
への注射も使用され得る）へ注入する（２０μｇ／ペレット−３ペレット／筋肉
）。ＤＮＡ導入後４８時間で動物を屠殺し、接種を受けた各動物から全筋肉（注
射した筋肉）を切除し、この組織内のβ−ｇａｌ活性につきアッセイした。実験
動物が十分あれば、ＤＮＡ導入後２４時間、４８時間、７日、１４日及び２８日
のように、多くの様々な時点での発現についてアッセイすることが好ましい。こ
うすれば、レポーター遺伝子の発現の時間経過に関する追加的な情報が提供され
る。

【０１０３】上記のように、レポーター遺伝子の発現はその遺伝子産物の活性、例えばβ−
ｇａｌ活性についてのアッセイによって決定されるが、逆転写酵素ＰＣＲアッセ
イを包含する他の方法も使用され得る。

【０１０４】発現が筋肉だけで起こるか又はそこで他の組織よりも有意に高いレベルで起こ
ることを示すことによって、筋肉特異的な発現が実証される。従って、評価は、
好ましくは骨格筋以外の組織におけるレポーター遺伝子の発現につきアッセイす
ることも包含する。注射されたベクターのある量が他の組織へ移動することが予
測される。従って、筋肉サンプルが採取される各時点で、精巣、リンパ節、肝臓
、脾臓、腎臓、肺、心臓、脳、骨髄及び血液のような他の組織セットからもサン
プルが採取され得る。サンプルのそれぞれに対してレポーター遺伝子の発現をア
ッセイする。

【０１０５】レポーター遺伝子発現のパターンはベクターの存在とも関連付けられる。ある
組織にベクターが存在することは、ベクター特異的な配列の増幅及びハイブリダ
イゼーションによって決定され得る。実施例５．人工調節領域の開発上記の実施例は、人工調節領域を構築、スクリーニング及び評価するアプロー
チを記載している。これらのアプローチを組合せれば特定の応用のために有利な
特質をもった調節領域を同定することが可能になる。以下の実施例は、コンビナ
トリアルアプローチにおいて結合配列を使用して構築した、有利な発現特性を提
供する人工調節領域が、特定の細胞及び組織の状態において同定され得ることを
示す。

【０１０６】この実施例の結果の理解に役立つためには、短い背景説明が助けになるかもし
れない。ＩＧＦ−１は破砕（クラッシュ）された運動ニューロンを修復する神経
栄養因子としての役割を果たしている。ＩＧＦ−１の局在化した発現はクラッシ
ュされた運動ニューロンの修復を早める。骨格α−アクチンプロモーターは、最
も強い筋肉特異的プロモーターの１つであるが、α−アクチンプロモーター活性
を高レベルで維持するためには筋肉の完全な神経支配が要求されるので、それは
ＩＧＦ−１発現の理想的な調節領域にはならない。α−アクチン／ｈＩＧＦ−１
トランス遺伝子を有し、ｈＩＧＦ−１の高レベルな発現を示すトランスジェニッ
クマウスでは、座骨神経クラッシュの後で、ｈＩＧＦ−１の発現レベルがダウン
レギュレートされた。クラッシュ後約２週間（筋肉が最も萎縮した時期に一致す
る）でｈＩＧＦ−１の発現は最少になり、クラッシュ後約３週目でようやく正常
レベルへ回復し始めたのである。従って、神経クラッシュは骨格α−アクチンプ
ロモーターを有効に抑圧し、それは再神経支配とともにようやく回復する。この
ことは、注射されたα−アクチン／ＩＧＦ−１プラスミドが効果を示すのに少な
くとも３週間を要するという観察事実に一致する。従って、神経及び筋肉の再生
の早い段階で神経栄養遺伝子の高レベル発現を維持するためには、ＩＧＦ−１の
より早い発現が所望されるだろう。

【０１０７】従って、筋肉の神経支配状態に影響されないＩＧＦ−１発現を推進する筋原性
の人工調節領域を創出することが有益なのである。筋肉においていつでもオンの
状態にある筋原性の調節領域があれば、神経修復プロセスをさらに早めることに
なろう。そのような調節領域を開発するために、我々は以下の工程を踏んだ。

【０１０８】Ａ．人工調節領域ライブラリーの構築先ず我々は、哺乳類細胞における遺伝子の活性化及び調節に関与している転写
制御要素の配列に基づいて、人工調節領域の系列を構築した。

【０１０９】（骨格α−アクチンプロモーターの上流にあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリ
ンカーを含有する）プラスミドｐ６１２ａＡＣＡＴＭＬＣから、このプロモータ
ーの上流、及びＡＴＡＡＡＡボックスの４７ｂｐ上流のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ポリリンカー内で切断するＥａｇＩを用いた消化により、ＡＴＡＡＡＡボックス
の上流にある骨格α−アクチンプロモーター部分を切り出した。この得られた最
小α−アクチンプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した。この最
小α−アクチン／ルシフェラーゼテストプラスミドの中へ人工調節領域をランダ
ムにクローン化した。

【０１１０】試験した制御要素は以下を包含する：ＳＲＥ５’−ＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧ−３’ ３’−ＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＧＣＴＧＧＣ−５’ ＭＥＦ−１５’−ＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣ−３’ ３’−ＧＧＴＴＧＴＧＧＡＣＧＡＣＧＧＡＣＧＧ−５’ ＭＥＦ−２５’−ＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣ−３’ ３’−ＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＧ−５’ ＴＥＦ−１５’−ＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＣ−３’ ３’−ＧＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧ−５’ ＳＰ１５’−ＣＣＧＴＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧ−３’ ３’−ＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＣ−５’ 上記ＳＲＥ配列は、近位骨格α−アクチンＳＲＥ配列に相当する。ＳＲＥコア
配列が重ねられている。ＭＥＦ−１配列（補足され、重ねられている）及び隣接
したＧＣＴＧＣモチーフ（星印がついた）は、筋創出キナーゼ遺伝子及びラット
ミオシン軽鎖遺伝子に保存されている（Ｌａｓｓｅｒら、１９８９）。ＳＰ１配
列（重ねられている）は、両端にＥａｇ１の半分の制限部位を有する。Ｓｐ１部
位は他の制御要素間のスペーサーとして包含された。

【０１１１】オリゴヌクレオチド対（ｄｓＤＮＡ）をアニールし、様々な組合せで連結して
制御要素がランダムに配置されたより大きなフラグメントを形成した。Ｓｐ１要
素のそれぞれは両端にＥａｇＩの半分の部位を含有するので、２つのＳｐ１要素
が連結するところでは必ず完全なＥａｇＩ制限部位が産生されるだろう。ＤＮＡ
フラグメントは、ＥａｇＩ付着末端を有する、ランダムに結合した８〜１４の制
御要素を含有し、それにより人工調節領域を表出する。要素のそれぞれの結合か
ら形成されたフラグメントは、結果的に別個のフラグメントのプールとなった。
オリゴヌクレオチドは様々な数及び順序でともにアニールし得るので、この結合
物のそれぞれは、オリゴヌクレオチドの特定の出発組合せに由来する雑多なフラ
グメントのセットを含有する。

【０１１２】各人工調節領域プール由来のＤＮＡフラグメントを最小α−アクチン／ルシフ
ェラーゼプラスミドのＥａｇＩ部位へ連結した。各組み合わせにつき約２０のク
ローンを摘出し、生育させ、Ｑｉａｇｅｎキットで精製した後、一次筋原細胞を
トランスフェクトするために使用した。

【０１１３】このクローンはＣｍ−ｎと命名したが、ｍは特定の組合せの番号であり、ｎは
その組合せから摘出された特定クローンの番号である。例えば、Ｃ５−１は、組
合せ番号５、クローン番号１を表す。図５は、いくつかの典型的な人工調節領域
のサブ要素の配置を示す。人工調節領域の配列を包含する、典型的な人工調節領
域を含有するプラスミドの部分配列が、図８~３１に示される。この配列は正確であると思われるが、数%の配列エラーは有り得る。当業者は、提供された配列から特定の要素及び調節領域におけるその位置を同定し、同一の位置及び配向性
にあるそれらの要素から人工調節領域を構築することによって、正確な人工調節
領域を容易に得ることができよう。

【０１１４】ｐ４８８Ｓｋα−アクチンプロモーター／ルシフェラーゼベクターが対照とし
て使用された。このプロモーターは強い筋肉特異的プロモーターの標準的な代表
物であり、現在入手される最も強いプロモーターの１つである。このベクターか
らの発現を、テスト用人工調節領域によって調節される発現レベルと比較するた
めの標準として使用した。

【０１１５】Ｂ．人工調節領域ライブラリーのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングＡ．に記載された人工調節領域ライブラリーのプラスミドを２系列のリポフェ
クタミン・トランスフェクションを用いて筋肉細胞へトランスフェクトした。こ
れらトランスフェクション系列由来のトランスフェクトされた細胞を生育し、ル
シフェラーゼ活性アッセイ用に回収した。

【０１１６】我々は、一次筋原細胞培養において重複してなされたリポフェクタミン・トラ
ンスフェクションの第一系列から、マルチマー化された（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ｅｄ）ＳＲＥ、Ｅボックス、ＭＥＦ−２及びＴＥＦ−１調節領域のそれぞれにつ
いて生育した８つの構築体（３２の個別プラスミド）のなかで、ルシフェラーゼ
プラスミド（ｐ４４８）によって推進される骨格α−アクチンプロモーター／エ
ンハンサーの活性より大きいか又は等しい活性を有するものは１つも無いことを
認めた。

【０１１７】第二系列では、６つの異なる人工調節領域の組み合わせを成熟した筋管におい
て試験した。骨格α−アクチンプロモーター／エンハンサーによって推進される
ものより５倍まで高いルシフェラーゼ活性が、クローンのサブセット、つまりＣ
１−２８（図８）、Ｃ２−２７（図９）、Ｃ５−１２（図１０）、Ｃ６−１６（
図１１）及びＣ６’−７（図１２）のトランスフェクションによって検出された
。従って、筋肉細胞では、これらの人工調節領域が骨格α−アクチンプロモータ
ーより高い転写レベルを賦活化している。

【０１１８】さらに、われわれは簡単なアッセイを使用して、筋肉の遺伝子発現に対する神
経支配の可能性を評価する１つの方法として筋原細胞脱分極化の効果をチェック
した。我々は、筋管培養の媒体へ２０分間ＫＣｌを適用することによって骨格α
−アクチンプロモーターが３〜４倍アップレギュレートされることを見出した。
Ｃ１−２８（図８）、Ｃ５−１（図１３）、Ｃ５−５（図１４）、Ｃ６−５（図
１５）、Ｃ５−１２（図１０）、Ｃ６−１６（図１１）及びＣ６’−７（図１２
）は、脱分極化した筋管において高レベルのかなり安定した発現をもたらした。
従って、これらの人工調節領域は骨格α−アクチンプロモーターよりは神経支配
の影響を受けることがずっと少ない可能性があり、さらなる評価へ供される。レ
ポーター発現レベル及びＫＣｌ脱分極試験での発現レベルの結果を表６に示す。

【０１１９】方法Ａ．第一のトランスフェクション１μｇの人工調節領域／ルシフェラーゼプラスミドを、６０ｍｍプレートにて
（５００，０００細胞／プレート）幼鶏の２４ｈｒ一次筋原細胞へトランスフェ
クトした。それぞれのトランスフェクションにおいて２００ｎｇのＣＭＶ・β−
ｇａｌプラスミドを同時にトランスフェクトした。

【０１２０】トランスフェクション後４０時間目に、ＫＣｌを直接培地へ加え、５０μＭの
濃度とし、細胞を３７℃で２時間処置した。ＫＣｌを含有する培地を吸引し、細
胞を一度ＨＢＳＳで濯ぎ、新鮮な培地を加えた。ＫＣｌ処置をしない対照プレー
トは、元の培地のまま手をつけなかった。

【０１２１】ＫＣｌ処置から２０時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイし
た。

【０１２２】Ｂ．第二のトランスフェクション１００ｎｇの人工調節領域−ルシフェラーゼプラスミドを、２００ｎｇのＣＭ
Ｖ・β−ｇａｌプラスミドとともに、６０ｍｍプレートにて（５００，０００細
胞／プレート）幼鶏の２４時間一次筋原細胞へトランスフェクトした。トランス
フェクションしたものそれぞれに対し、７００ｎｇのＹＥＡＳＴＭＡＲＫＥＲ
（酵母マーカー）キャリアーＤＮＡを加え、トランスフェクトされるＤＮＡの全
量を１μｇにした。

【０１２３】トランスフェクション後３６時間目に、細胞を一度ＨＢＳＳで濯ぎ、ＫＣｌ５
０μＭを含有する（無血清）ＭＥＭ（対照用）を加え、細胞を３７℃で４０分間
インキュベートした。次いで上記の培地を吸引し、細胞を一度ＨＢＳＳで濯ぎ、
十分な培地を加えた。

【０１２４】ＫＣｌ処置から２０時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイし
た。

【０１２５】Ｃ．神経クラッシュモデルにおける人工調節領域の評価特定のｉｎｖｉｖｏ環境で有効な人工調節領域の評価及び同定を示すために
、我々は、高レベルの筋原性の発現を提供することが示され、ｉｎｖｉｔｒｏ
試験からはＳｋα−アクチンプロモーター／エンハンサーよりも神経支配効果に
対する感受性が低いことが示唆された上記構築体のいくつかを試験した。神経ク
ラッシュモデルにおける構築体２つについての試験結果を記載する。骨格アクチ
ンプロモーターによって推進される発現の神経損傷誘導性のダウンレギュレーシ
ョンに抵抗する人工調節領域を試験する実験を設計した。

【０１２６】ＩＣＲマウスの脛骨筋に、１００μｇのクローン骨格α−アクチンプロモータ
ー４４８（対照）、対照よりも筋原細胞の脱分極効果による影響を受けないこと
がすでに示された（Ｂ節を参照のこと）人工調節領域ルシフェラーゼベクターＣ
１−２８（図６）及びＣ５−１２（図８）を注入した。座骨神経クラッシュ後２
週目に、注射した筋肉を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。Ｃ１−２
８及びＣ５−１２からの発現レベルは骨格α−アクチンプロモーターからよりも
それぞれ約７倍及び１５倍高かった（図７）。

【０１２７】これらの結果は、この２つの新しい調節領域が損傷誘導性の調節に対してより
抵抗することを示している。これら調節領域の利点は、骨格α−アクチンプロモ
ーターがダウンレギュレートされる神経及び筋肉再生の初期段階で神経栄養遺伝
子の高発現レベルを維持することであろう。このような人工調節領域によって提
供されるより高い発現レベルは、骨格α−アクチンプロモーターのようなプロモ
ーターによって推進される発現によってもたらされるのと同様の効果を達成する
のに、著しく少ない量のＤＮＡ、例えば１／１０のＤＮＡ量だけの使用を可能に
する可能性がある。

【０１２８】当業者は、本明細書に固有のものに加えて、上記の目的を実行してその成果及
び利点を得るのに、本発明が十分適用されることを容易に理解されよう。本明細
書に記載された分子複合体及び方法、手法、処置、分子、特定の化合物は、好ま
しい態様を代表するものであって、例示的であり、本発明の範囲を制限するもの
として意図されていない。当業者には、本発明の範囲及び精神から逸脱すること
なく本発明に開示された発明に対して様々な代替及び変更がなされ得ることがす
ぐに明らかであろう。

【０１２９】明細書に述べられたすべての特許及び公表物は、本発明が関連する技術分野の
当業者のレベルを示している。すべての特許及び公表物は、個々の公表物が参照
により特定かつ個別に本明細書に組込まれると示されるのと同じ程度で、参照に
より本明細書に組込まれている。

【０１３０】本明細書に実例と共に記載された本発明は、本明細書に特に開示されていない
要素又は制限がなくても適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書の各例
では、「〜を含む」、「本質的に〜なる」及び「〜なる」は、どれでも他の２つの用語のどれかに置換され得る。利用された用語及び表現は説明のために使用さ
れ、制限するものではなく、そのような用語及び表現の使用においては、示され
て記載された特徴の同等物又はその部分を除外する意図はないが、本発明の特許
請求の範囲内で様々な変更が可能であることが認められる。従って、本発明は好
ましい態様及び所望の特徴によって特定して開示されたが、本明細書に開示され
た概念の変更及びバリエーションが当業者に託され得ること、及びそのような変
更及びバリエーションが特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内にあ
ると考えられることは理解されるベきである。

【０１３１】さらに、本発明の特徴及び側面がマーカッシュ群特有の表現で説明される場合
は、当業者は、本発明がマーカッシュ群の個々のメンバーかメンバーのサブグル
ープに関しても説明されることを認知されるだろう。例えば、Ｘは臭素、塩素及
びヨウ素からなる群から選択されると記載されれば、Ｘが臭素である特許請求と
Ｘが臭素及び塩素である特許請求も完全に記載されることになる。

【０１３２】遺伝暗号の縮重性に照らせば、核酸の他の組合せも本発明の特許請求されたペ
プチド又はタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ及びＧＣ
Ｇという４つの核酸配列は、アミノ酸のアラニンをコードする。１つのアミノ酸
に平均３つのコドンがあるとすれば、１００アミノ酸の長さのポリペプチドは、
平均して、３¹⁰⁰又は５ｘ１０⁴⁷の核酸配列によってコードされることになる。従って、ある核酸配列は、定常的な方法を使用して不適当な実験をすることなく
、第一の核酸配列によってコードされるものと同じポリペプチドをコードする第
二の核酸配列を形成するように変更され得る。従って、特許請求されるペプチド
及びタンパク質をコードするすべての可能な核酸が、コドンの使用法、特にヒト
において選好されるものを十分考慮に入れてすべて略さずに書いたかのようにし
て、本明細書にやはり完全に記載される。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列
又はそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列における変化は、そ
のポリペプチドの重要な活性が変わらない配列領域で起こるように設計又は選択
され得る。例えば、ポリペプチドの活性部位から離れたｂ−ターンの内部でアミ
ノ酸の変化は起こり得る。また、欠失（例えば、ポリペプチド又はそのようなポ
リペプチドをコードする対応核酸配列における、活性部位に影響しない、セグメ
ントの除去）及び付加（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質の形成のような、活性部
位の機能に影響しない、ポリペプチド配列への更なるアミノ酸の付加、又は活性
部位の機能に影響しない、そのようなポリペプチドをコードする対応核酸配列に
おける付加）のような変更も本発明の範囲内にある。ポリペプチドに対するその
ような変更は、定常的な方法を使用して不適当な実験をすることなく、当業者に
より実施され得る。従って、本発明のペプチド又はタンパク質の重要な活性に影
響しないと容易に決定され得るすべての可能な核酸及び／又はアミノ酸も本明細
書にやはり完全に記載される。

【０１３３】他の態様は上記の特許請求の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】記載される選択法において使用される合成一本鎖オリゴヌクレオ
チド（オリゴ）の５つの重要な特徴を示す図である。

【図２】調節領域の転写因子選択に関する態様の全体スキームの概略図で
ある。

【図３】一次筋原細胞の分化期における、多くの異なる調節領域の相対的
な調節領域活性を比較した図である。

【図４】ｃ−ＦｏｓのＳＲＥと筋肉のＳＲＥに対する異なるＳＲＦ活性を
示す図である。

【図５】いくつかの例示的な人工調節領域のサブ要素の配置を示す図であ
る。

【図６】骨格α−アクチンプロモーターによって推進された発現と比較し
た、様々な人工調節領域によって推進されたルシフェラーゼレポーター遺伝子の
筋管における発現レベル、及びＫＣｌ脱分極の存在下での人工調節領域それぞれ
の発現レベルを示す棒グラフである。

【図７】神経損傷誘導性の骨格アクチンのダウンレギュレーション下での
例示的な調節領域の活性を示す。ＩＣＲマウスの脛骨筋に、１００μｇのクロー
ン骨格α−アクチンプロモーター４４８（対照）、人工調節領域Ｃ１−２８及び
C５−１２ルシフェラーゼベクターを注射した。座骨神経をクラッシュして２週目に筋肉を採取してルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性をアッセイした。

【図８】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ１−２８の人
工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図９Ａ及び９Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ２
−２７の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２つの
配列を示す。

【図１０Ａ及び１０Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ５−１２の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図１１Ａ及び１１Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ６−１６の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図１２】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ６’−７の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図１３Ａ及び１３Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ５−１の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２つ
の配列を示す。

【図１４Ａ及び１４Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ５−５の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２つ
の配列を示す。

【図１５Ａ及び１５Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ６−５の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２つ
の配列を示す。

【図１６Ａ及び１６Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ１−１の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２つ
の配列を示す。

【図１７Ａ及び１７Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ１−１４の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図１８】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ１−２０の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図１９】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ１−２１の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２０Ａ及び２０Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ１−２６の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図２１Ａ及び２１Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ２−２６の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図２２Ａ及び２２Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ５−１３の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図２３】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ５’−３の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２４】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ５’−５の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２５】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ５’−９の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２６】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ５’−１２
の人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２７Ａ及び２７Ｂ】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローン
Ｃ６−１２の人工調節領域を含有するプラスミドの部分の独立して決定された２
つの配列を示す。

【図２８】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ６’−８の
人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図２９】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ６’−１０
の人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図３０】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ６’−１１
の人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

【図３１】人工調節領域挿入物の配列を包含する、クローンＣ６’−２２
の人工調節領域を含有するプラスミドの一部分の配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リ，ズヤンアメリカ合衆国テキサス州77054，ヒューストン，ホリー・ホール 2111，ナンバー 310 (72)発明者ノードストロム，ジェフアメリカ合衆国テキサス州77840，カレッジ・ステイション，パーイア・ドライブ 1016 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA20 DA02 EA04 GA11 HA11 HA17 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ08 QQ41 QQ79 QR33 QR48 QR62 QR66 QR72 QR77 QS02 QS25 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】転写因子の結合部位を同定する方法であって、細胞又は核の抽出物の１つ又はそれ以上のタンパク質と複数の任意の二本鎖オ
リゴヌクレオチドフラグメントとの間に形成されるタンパク質−オリゴヌクレオ
チド複合体中のオリゴヌクレオチドを前記フラグメント及び前記抽出物の混合物
において同定し、ここで前記フラグメントはサイズ排除クロマトグラフィーを使
用して前記混合物内のフリーオリゴヌクレオチドから分離され；ここで前記複合体における前記オリゴヌクレオチドの存在が、前記オリゴヌク
レオチドが前記結合部位を含むことの指標であるの工程を含む方法。
【請求項２】前記二本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントが、一本鎖オリ
ゴヌクレオチドを合成して、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖オリゴヌク
レオチドに変換することによって作られる、請求項１の方法。
【請求項３】前記オリゴヌクレオチドフラグメントが中央にランダム配列
を、５’及び３’末端に制限部位とプライマー配列の両方を含む、請求項１の方
法。
【請求項４】前記同定が前記タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体から
前記オリゴヌクレオチドを増幅して配列決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項５】前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求
項４の方法。
【請求項６】細胞又は組織特異的な推定の転写調節領域を評価する方法で
あって、ある選択遺伝子に対する転写調節位置に前記推定の転写調節領域を含む細胞が
、選択条件の下で選択されるかを決定することを含み、ここで、前記細胞の前記
選択は、前記選択遺伝子が前記細胞において十分高いレベルで発現される場合に
のみ生じ、前記推定の転写調節領域が前記細胞で活性である場合にのみ前記選択
遺伝子が前記十分高いレベルで発現されることを特徴とする方法。
【請求項７】前記選択条件がポジティブ選択条件であり、前記方法が、１つ又はそれ以上の細胞を前記ポジティブ選択条件の下で培養し、ここで前記
少なくとも１つの前記細胞のそれぞれは選択遺伝子の転写調節位置に挿入された
様々な核酸テスト配列を含有し、前記１つ又はそれ以上の細胞の細胞は前記選択
遺伝子の高レベル発現のない前記ポジティブ選択条件では選択されることができ
ず；そして前記細胞のいずれかが選択され得るかを決定し、ここで細胞の選択は前記細胞
中の前記核酸テスト配列が前記細胞において活性な転写領域を含有することの指
標である、の工程を含む、請求項６の方法。
【請求項８】前記選択遺伝子が抗原をコードする遺伝子である、請求項７
の方法。
【請求項９】前記ポジティブ選択条件が、前記選択遺伝子を発現している細胞に特異的な蛍光標識化した抗体に前記細胞
を接触させ、そして前記選択遺伝子を発現している細胞を蛍光表示式細胞分取法で選択する、の工程を含む、請求項７の方法。
【請求項１０】前記ポジティブ選択条件が、前記選択遺伝子を発現している細胞に特異的な鉄標識化した抗体に前記細胞を
接触させ、そして前記選択遺伝子を発現している細胞を磁気ビーズソーティングで選択する、の工程を含む、請求項７の方法。
【請求項１１】前記選択条件がストレス条件であり、前記方法が、１つ又はそれ以上の細胞を前記ストレス条件の下で培養し、ここで前記少なく
とも１つの細胞のそれぞれは選択遺伝子の転写調節位置に挿入された様々な核酸
テスト配列を含有し、前記選択遺伝子は保護遺伝子であり、前記１つ又はそれ以
上の細胞の成長は前記保護遺伝子の高レベル発現のない前記ストレス条件で阻害
され、ここで前記ストレス条件の存在下における前記少なくとも１つの細胞の成長は
、前記核酸テスト配列が前記細胞において活性な転写領域を含むことの指標であ
る、の工程を含む、請求項６の方法。
【請求項１２】前記ストレス条件が少なくとも１つの生化学物質の存在で
ある、請求項１１の方法。
【請求項１３】前記保護遺伝子がアデノシンデアミナーゼ遺伝子である、
請求項１１の方法。
【請求項１４】前記少なくとも１つの生化学物質がキシロフラノシル−ア
デニンである、請求項１２の方法。
【請求項１５】前記保護遺伝子がジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である
、請求項１１の方法。
【請求項１６】前記少なくとも１つの生化学物質がメトトレキセートであ
る、請求項１２の方法。
【請求項１７】前記少なくとも１つの生化学物質がキシロフラノシル−ア
デニン及びデオキシコルフォルマシンからなる、請求項１２の方法。
【請求項１８】前記少なくとも１つの生化学物質がアラノシン、アデノシ
ン及びウリジンからなる、請求項１２の方法。
【請求項１９】前記テスト配列が既知の転写因子応答要素の組み合わせ又
は改変を含む、請求項８又は１１の方法。
【請求項２０】前記テスト配列が１つ又はそれ以上の未知機能の結合部位
を含む、請求項８又は１１の方法。
【請求項２１】前記テスト配列が少なくとも１つの既知の転写因子応答要
素、及び少なくとも１つの未知機能の結合部位の組み合わせを含む、請求項８又
は１１の方法。
【請求項２２】前記１つ又はそれ以上の細胞が筋肉細胞である、請求項８
又は１１の方法。
【請求項２３】細胞又は組織特異的な人工調節領域を同定する方法であっ
て、１群の細胞由来の細胞又は核の抽出物と複数の二本鎖オリゴヌクレオチドフラ
グメントとの間に形成されるタンパク質−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴ
ヌクレオチドを同定し、ここで前記フラグメントはサイズ排除クロマトグラフィ
ーを使用してフリーの前記オリゴヌクレオチドから分離され、ここで前記複合体において前記オリゴヌクレオチドの存在が、前記オリゴヌク
レオチドが前記結合部位を含むことの指標であり、そしてある選択遺伝子に対する転写調節位置に前記推定の転写調節領域を含む細胞が
選択条件の下で選択されるかを決定することによって、前記結合部位を含む推定
の細胞又は組織特異的な転写調節領域を選択条件下で評価し、ここで、前記細胞
の前記選択は、前記選択遺伝子が前記細胞において十分高いレベルで発現される
場合にのみ生じ、前記選択遺伝子は前記推定の転写調節領域が前記細胞で活性で
ある場合にのみ前記十分高いレベルで発現される、の工程を含む方法。
【請求項２４】前記二本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントが、一本鎖オ
リゴヌクレオチドを合成して、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖オリゴヌ
クレオチドへ変換することによって作られる、請求項２３の方法。
【請求項２５】前記オリゴヌクレオチドフラグメントが中央にランダム配
列を、５’及び３’末端に制限部位とプライマー配列の両方を含む、請求項２３
の方法。
【請求項２６】前記複合体がサイズ排除クロマトグラフィーを使用してフ
リーのオリゴヌクレオチドから分離される、請求項２３の方法。
【請求項２７】前記同定が前記タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体か
ら前記オリゴヌクレオチドを増幅して配列決定することを含む、請求項２３の方
法。
【請求項２８】前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請
求項２３の方法。
【請求項２９】前記選択条件がポジティブ選択条件であり、前記評価が、
１つ又はそれ以上の細胞を前記ポジティブ選択条件の下で培養し、ここで少な
くとも１つの前記細胞は選択遺伝子の転写調節位置に挿入された核酸テスト配列
を含有し、前記１つ又はそれ以上の細胞は前記選択遺伝子の高レベル発現のない
前記ポジティブ選択条件では選択されることができず、ここで少なくとも１つの細胞がポジティブ選択条件の存在下で選択され得るこ
とは、核酸テスト配列が前記細胞内で活性な転写領域を含有することの指標であ
る、の工程を含む、請求項２３の方法。
【請求項３０】前記選択遺伝子が抗原をコードする遺伝子である、請求項
２９の方法。
【請求項３１】前記ポジティブ選択条件が、前記選択遺伝子を発現している細胞に特異的な蛍光標識化した抗体に前記細胞
を接触させ、そして前記選択遺伝子を発現している細胞を蛍光表示式細胞分取法で選択する、の工程を含む、請求項２９の方法。
【請求項３２】前記ポジティブ選択条件が、前記選択遺伝子を発現している細胞に特異的な磁気ビーズで標識化した抗体に
前記細胞を接触させ、そして前記選択遺伝子を発現している細胞を磁気ソーティングで選択する、の工程を含む、請求項７の方法。
【請求項３３】前記選択条件がストレス条件であり、前記評価方法が、１つ又はそれ以上の細胞を前記ストレス条件の下で培養し、ここで少なくとも
１つの前記細胞は保護遺伝子の転写調節位置に挿入された核酸テスト配列を含有
し；前記１つ又はそれ以上の細胞の成長は前記保護遺伝子の高レベル発現のない
前記ストレス条件で阻害され、ここで前記ストレス条件の存在下における前記少なくとも１つの細胞の成長は
、前記核酸テスト配列が前記細胞において活性な転写領域を含むことの指標であ
る、の工程を含む、請求項２３の方法。
【請求項３４】前記ストレス条件が少なくとも１つの生化学物質の存在で
ある、請求項３３の方法。
【請求項３５】前記保護遺伝子がアデノシンデアミナーゼ遺伝子である、
請求項３３の方法。
【請求項３６】前記少なくとも１つの生化学物質がキシロフラノシル−ア
デニンである、請求項３４の方法。
【請求項３７】前記保護遺伝子がジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である
、請求項３３の方法。
【請求項３８】前記少なくとも１つの生化学物質がメトトレキセートであ
る、請求項３４の方法。
【請求項３９】前記少なくとも１つの生化学物質がキシロフラノシル−ア
デニン及びデオキシコルフォルマシンからなる、請求項３４の方法。
【請求項４０】前記少なくとも１つの生化学物質がアラノシン、アデノシ
ン及びウリジンからなる、請求項３４の方法。
【請求項４１】前記テスト配列が少なくとも１つの既知の転写因子応答要
素及び少なくとも１つの前記結合部位の組み合わせまたは改変を含む、請求項２
９又は３４の方法。
【請求項４２】前記１つ又はそれ以上の細胞が筋肉細胞である、請求項２
９又は３４の方法。