JPH07505534A - 筋芽細胞における遺伝子発現を増大させるための転写コントロール要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 胚芽細胞における遺伝子発現を増大させるための転写コントロール要素３５Ｕ、 Ｓ、Ｃ，９２０２ｆｃ）により、米国政府が、ここに記載された発明に成る権利 を有し、そしてその発明はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅ ａｌｔｈからの資金により一部なされた技術分計 本発明は、遺伝子発現及び遺伝子治療の領域に関する。特に、転写コントロール 要素が、胚芽性細胞における遺伝子発現をコントロールするために提供される。

背景技術 を椎動物の骨格筋の繊維は、原種の胚芽細胞の細胞融合により形成され、該細胞 は、胚の筋肉形成域を増殖しそして存在する胚の細胞である。

胚芽性の系統は、体部の形態形成中決定されるようになり、安定に決定された胚 芽細胞の形成に導かれる。

筋肉繊維への胚芽細胞の分化の過程は、クローンの胚の胚芽細胞の細胞培養で研 究されてきており、胚芽細胞のラインを確立した。分散された細胞培養では、胚 芽細胞は、成長因子に富む培地の存在下クローン的に増殖できるが、融合された 筋肉細胞で分化するそれらの潜在力を維持する。従って、胚芽細胞は、広範囲の 細胞の分裂ができる安定に決定された細胞のタイプであり、その子孫は、それら の胚芽細胞の同一性を忠実に受け継ぎ、筋肉繊維中へ分化するそれらの潜在力を 発現できる。胚芽細胞の成長及び分化は、細胞外の因子、特に成長因子例えばｂ ａｓｉＣ縁維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子− β（ＴＧＦ−β）によりコントロールされる。これら成長因子の存在下、胚芽細 胞は増殖し、一方これら因子の低い濃度では、胚芽細胞は、Ｇ、で細胞サイクル に存在し、融合しそして収縮性の繊維に分化する。

胚形成は、それ故、体部における胚芽細胞の系統の「決定」及び胚の筋肉形成域 における胚芽細胞の「分化」を含む。細胞系統の決定を調節する分子のメカニズ ムは、マウス細胞ラインＣ３Ｈ１０Ｔ１／２　（１０Ｔｌ／２）を使用して研究 されてきた。Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ及びＥｍｅｒｓｏｎ、Ｃｅ１ｌ、３８．７９１ 　（１９８４）。このモデル細胞培養系は、骨格筋の系統の決定を調節する二三 の暖」動物の遺伝子（ｍｙ。

Ｄ、ミョーゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、Ｍｙｆ−５及びＭＲＦ−４）の同定を 行わせた。これらの遺伝子は、Ｍｙｃ関連ＤＮＡ結合蛋白の塩基性ヘリックス− ルーブーへリックス（ｂＨＬＨ）スーパーファミリのサブファミリを含む転写因 子をエンコードする。

ｂＨＬＨ筋芽性筋部性調節蛋白ミノ配列の相同により証拠立てられるように、進 化的に保存されていることが決定された。Ｐｏｗｎａｌ　ｌら、Ｓｅｍ１ｎａｒ ｓ　ｉｎ　Ｄｅｖｅｌ、Ｂｉｏｌ、、３．２２９−２４１（１９９２）、ｄｅ　 ｌａ　Ｂｒｏｕｓｓｅら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄＤｅｖｅｌ、４．５６７−５８１ 　（１９９０）、特にウズラ（ｑｕａｌｌ）からのｍｙｏＤ蛋白（ＱＭｙｏＤ） である蛋白ｑｍｆｌは、マウスＭｙｏＤ　１、Ｍｙｆ５、ミョーゲニン並びにＸ ｅｎｏｐｕｓ　ＬａｅｖｉｓからのＭｙｏＤ１配列（ＸＭｙｏＤ）と広範囲の相 同をともにする。ｄｅ　ｌａ　Ｂｒｏｕｓｓｅら、同上。

トランスフェクションされたｃＤＮＡとして、上記の胚芽性調節因子は、増殖性 の胚芽細胞の安定に決定された集団へのマルチポテンシャル１０Ｔ１／２細胞の 胚芽性転換を誘発する。決定におけるそれらの機能と一致して、これらの胚芽性 調節遺伝子は、胚の骨格筋系統でのみ発現し、体部の形成の初期段階で開始する 。これらの転写因子は骨格筋の系統の決定を調節するが、それらも、それら自体 調節される。胚の骨格筋系統におけるそれらの発現を活性化する転写調節メカニ ズムは、現在まで未知であった。

胚芽細胞が増殖性（即ち再生性）でありそして既に発育した筋肉組織中に注・射 されるとき、ともに融合して成熟した筋肉繊維を形成できるために、胚芽細胞の 転移の技術は、筋肉疾患に対する可能性のある療法又は治療として提案されてき た。胚芽細胞の転移は、処置を要する患者の筋肉中に胚芽細胞を注射することを 含む。発育した筋肉繊維は再生性ではないが、胚芽細胞は、制限された量の増殖 ができ、そのため胚芽細胞の注入の位置で筋肉細胞の量を増加させる。成熟され た筋肉組織中にそのように転移された胚芽細胞は増殖し、そして成熟した筋肉繊 維中に分化する。このプロセスは、これらの単核胚芽性の細胞（胚芽細胞）の融 合を含み、多核シンシチウム（筋繊維又は篩管）を形成する。従って、疾患又は 外傷の何れかにより危険にさらされた筋肉組織は、危険にさらされた組織中への 胚芽性の厘種細胞即ち胚芽細胞の転移により、補強される。

胚芽細胞の転移は、又遺伝子治療に使用でき、有用性は、増殖し融合する胚芽細 胞の能力により増大する。元来、胚芽細胞は、二三の手段の一つにより遺伝学的 に改変されて、この治療を必要とする患者において不完全又は欠けている機能的 な遺伝子を含む。組換え胚芽細胞は、次に患者に転移されて、それらは、増加し 融合し、さらに組換え遺伝子を発現する。この技術を使用して、患者の筋肉系に おける失った又は不完全な遺伝子は、遺伝学的に改変された胚芽細胞の注入によ り補強又は置換できる。

遺伝学的に欠陥のあるｍｄｘマウス中に注射された胚芽細胞が、宿主の筋肉繊維 中に融合し、そして組換え遺伝子の生成物即ちシストロフィン（細胞内蛋白、そ の欠陥はデュシエン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）筋肉ジストロフィー（ＤＭＤ）を生じ る）を発現できることが示された。Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３３ ７．１７６　（１９８９）、Ｍｏｒｇａｎら′、　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 ｌｉｌ　、　２４３７　（１９９０）　、Ｋａｒｐａｔｊら、Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔ ｈｏｌ、１３５．２７　（１９８９）。ヒトの患者を含む最近の研究では、祖先 又は影響を受けていない同胞（ｓ　ｉｂｌ　ｉｎｇｓ）からの正常な胚芽細胞は 、ＤＭＤにかがった二三人の子供の筋肉中に移植され、注射された筋肉の組織に おける正常なドナーのシストロフィンの発現を生ずる。Ｇｕｓｓｏｎｉら、Ｎａ ｔｕｒｅ、３５６．４３５−４３８　（１９９２）。非筋肉遺伝子生成物（ヒト の成長ホルモン）の長期な発現も、マウスの筋肉中への遺伝子工学的筋芽細胞の 転移を使用して達成される。Ｄｈａｗａｎら、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、２５４．１５ ０９−１２　（１９９１）。それ故、胚芽細胞の転移を使用する遺伝子治療は、 筋肉組織ばかりでなく、筋肉組織から血流への分泌を経て必須の遺伝子生成物を 提供するのに適用できる。

胚芽細胞の転移を経る遺伝子治療は非常に可能性のある有用性を有するが、その 有用性は、最近、組換え胚芽細胞における遺伝子発現を誘発するのに利用できる 胚芽細胞特異性のプロモーター又はエンハンサ−が存在しないという事実により 制限される。これらの転写コントロール要素は、二つの理由のため胚芽細胞介在 遺伝子治療に必要とされる。（１）有用な遺伝子（例えば胚芽細胞の成長のオー トクリン制御）を胚芽細胞で発現させること、並びに（２）この組換え遺伝子発 現を胚芽細胞及びそれらの子孫に制限すること。従って、胚芽細胞介在遺伝子治 療を助けるために、筋芽細胞特異的転写コントロール要素が必要とされる。

遺伝子発現の胚芽細胞特異的エンハンサ−も、農業用動物における筋肉の集まり の人工的な操作に、非常に望まれている代替を提供できた。

最近、食用動物例えばウシ、ブタ及びニワトリの筋肉の重量は、伝統的な飼育プ ログラムにより、そしてホルモン処置例えば成長ホルモンにより操作されている 。体重の増加を助けるための動物のホルモン処置は、高価であり、これらの食品 添加物に過敏な消費者に危険の可能性を与えるとともに、動物の市場の価格の増 大に導く。明らかに、もし体重の増加が代替的な手段により媒介できるならば、 ホルモン処置の潜在的に危険な使用が避けられるだろう。

胚の段階において遺伝可能な遺伝子による改変を導入することにより、トランス ジェニック動物を創作するための技術の有効性は、遺伝子工学による筋肉の成長 を操作するための可能性のある手段を提供する。しかし、胚芽性の系統の原種胚 細胞の特定の操作は、胚芽性の系統に特異的なプロモーター及びエンハンサ−の 有効性を必要とする。さもなければ、筋肉特異的遺伝子の改変は、導入できない だろう。これらエンハンサ−の有効性は、筋肉のサイズ及び成長における遺伝子 に基づく改良の発展のために必要であり、現在まで、より時間のかかる又はさも なければ望ましくない技術例えばホルモン処置によってのみ達成可能であった。

発明の概要 本発明によれば、胚芽性細胞の遺伝子発現を調節する転写コントロール要素が提 供される。本発明の一つの態様では、培養された細胞及び非培養の胚芽性細胞に おいてエンハンサ−活性を有する隔離されたＤＮＡセグメントが提供される。こ のエンハンサ−活性は、ＤＮＡセグメント及び標的遺伝子がＤＮＡ鎖内に配列さ れ、そしてＤＮＡセグメントがその標的遺伝子の発現を増大させるために標的遺 伝子に関して５′方向の位置するとき、標的遺伝子の発現を増大させる。好まし い態様では、エンハンサ−活性を有する隔離されたＤＮＡセグメントは、ｂＨＬ Ｈ筋芽性筋部性調節蛋白コードする遺伝子に対して５゛方向に隣接する５Ｏ−１ ００ｋｂ領域から隔離される。

本発明の他の態様によれば、ここに記載された配列１．Ｄ、Ｎｏ、２て５′方向 に隣接する約２５．５ｋｂフラグメントから隔離及び精製されたＤＮＡセグメン トが提供される。好ましい態様では、ここに記載された配列１．Ｄ、Ｎｏ、２の 塩基１−２５８と実質的に同じヌクレオチド配列から本質的になるＩ）　Ｎ　Ａ セグメントがｆｉｌされる。又、ここに記載された配列１．Ｄ、Ｎｏ、３と実質 的に同じヌクレオチド配列を有する、ウズラｑｍｆ　１遺伝子に対して５゛方向 に隣接する約１８ｋｂフラグメントから隔離及び精製されたＤＮＡセグメントも 提供される。

本発明の他の態様によれば、上記されたＤＮＡセグメントを含むベクターが提供 される。これらのベクターによりトランスフェクションされた又は形質転換され た原核又は真核の生物の宿主細胞も提供される。

本発明の他の態様によれば、上記のエンハンサ−活性を有するＤＮＡセグメント によるハイブリッド形成可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが 提供される。これらアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の転写コントロ ール要素における特に機能的な領域を同定し位置を定めるのに有用であろう。

本発明のさらに他の！ＩＪ様によりば、培ｉＩ細胞においてエンハンサ−活性を 有する隔離されたＤＮＡセグメントが提供され、それは、（１）このエンハンサ −活性を有するものと考えられるｂＨＬＨ筋芽性筋部性調節蛋白コードする遺伝 子の１００ｋｂ内の５′上流領域からＤＮＡ配列のテストセグメントを得て、（ ２）テストセグメントの一つ、リポータ−遺伝子及び培養した真植生物の細胞で の発現に適合したベクターをそれぞれ含むテストコンストラクトのセットを製造 し、その際テストセグメント及びリポータ−遺伝子は、互いにそしてベクターの 任意の調節配列に関して位置して、もし存在するならばテストセグメントのエン ハンサ−活性とともにリポータ−遺伝子の発現を行わせ、（３）リポータ−遺伝 子及びベクターを含むがテストセグメントを有しないコントロールコンストラク トを同様に製造し、（４）リポータ−遺伝子の発現を行わせる条件下で培養した 真核生物の細胞中にテストコンストラクト或はコントロールコンストラクトを導 入しくリポータ−遺伝子の発現は、遺伝子の発現と相関しつる量で形成される検 出可能な生成物の形成を生じさせ）、（５）テストコンストラクトから形成され る検出可能な生成物の量を、コントロールコンストラクトを有する細胞中に形成 される検出可能な生成物の量とを比較し、これら二つの間の比の大きさは、テス トセグメントにより保持されていると思われるエンハンザ−活性を示し、そして （６）このエンハンサ−活性を保持することが分ったそれぞれのテストセグメン トを同定し隔離することを含む方法により隔離できる。

本発明の他の態様によれば、特に生体動物の胚芽性細胞にエンハンサ−活性を有 する隔離されたＤＮＡセグメントが提供され、それは、（１）このエンハンサ− 活性を有するものと考えられるｂＨＬＨ筋芽性筋部性調節蛋白コードする遺伝子 の１００ｋｂ内の５′上流領域からＤＮＡ配列のテストセグメントを得て、（２ ）テストセグメント、リポータ−遺伝子、並びにを椎動物の胚の細胞におけるリ ポータ−遺伝子の発現に必要なすべての調節配列をそれぞれ含むテストコントラ クトのセットを製造し、その際会ての配列は、互いに関して位置して、もし存在 するならばテストセグメントのエンハンサ−活性とともにリポータ−遺伝子の発 現を行わせ、（３）リポータ−遺伝子の発現を行わせる条件下で培養した真植生 物の細胞中にテストコンストラクト或はコントロールコンストラクトを導入しく リポータ−遺伝子の発現は、遺伝子の発現と相関しつる量で形成される検出可能 な生成物の形成を生じさせ）、（４）もしあるならば、を椎動物の胚のどの細胞 が検出可能な生成物を形成するかを決定し、特に胚芽性細胞における検出可能な 生成物の形成は、エンハンサ−活性を示し、そして（５）このエンハンサ−活性 を保持するテストセグメントを同定し隔離することを含む方法により隔離できる 。

本発明の胚芽細胞特異的転写コントロール要素は、胚芽細胞の伝達及び顕微注射 の技術を使用して遺伝子治療の分野で顕著な進歩を行うことができるだろう。最 近、これらの技術を使用する遺伝操作は、胚芽性細胞に対して特異的でないプロ モーター及びエンハンサ−のコントロールの下紐換え遺伝子により行われている 。胚芽細胞の特異性のこの欠如は、遺伝子が胚芽性細胞の系列にのみ発現するが 又は筋肉の成長の過程で発現することを要する、遺伝子治療又は他の遺伝工学の 技術にこれらの方法の有用性を制限する。本発明の転写コントロール要素は、必 要な胚芽細胞の特異性をもたらす。

本発明の胚芽細胞特異的転写コントロール要素の他の有利な応用は、エンハンサ −例えばｍｙｏＤエンハンサ−が「オン」及び「オフ」と変るために、それは、 胚芽性の系列の決定に非常に早く操作する転写因子によりそれ自体調節されねば ならないという鮫察に関する。本発明の転写コントロール要素は、これら初期の 転写因子の活性に関する生化学的アッセイに、非常に大きな利点で利用できるだ ろう。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、ヒトのコスミドクローンｃｈＭＤ−１３のマツプである。

ＥｃｏＲｌ　（マークされていない横ｌｉ）及びＮｏｔ　Ｉ制限部位並びに推定 Ｍｂｏｌクローニング部位が、指示されている。ＭｙｏＤのエキソン及びイント ロンは、それぞれ黒ブロック及び白ブロックにより示されている。参考のために 、示されている酵素のための制限フラグメントは、コスミドクローニングベクタ ーの５′末端がら３′末端に連続してラベルされている。太線、ヒトの配列（一 定の比率で縮小）、細線、ｐＷＥ１５ベクター配列。太線の下の数字１−１０は 、ｃｈＭＤ−１３を含むＥｃ　６Ｒ１フラグメントに関する。

図ＩＢは、コスミドクローンｃｈＭＤ−１３のＥｃｏＲ１フラグメント３のマツ プである。Ａｐａｌ、ＢａｍＨｌ、Ｋｐｎｌ及びＰｓｔｌ制限部位が示される。

横線の下の数字０−４は、キロベースによる長さに関する。配列１．Ｄ、Ｎｏ、 ２に対応するｃｈＭＤ−４３フラグメント３の１７５７ｂｐ領域の位置が指示さ れる。

図２は、上流ｍｙｏＤ転写コントロール要素を含むＣＡＴコンストラクトを示す 。ＥｃｏＲ１制限部位（マークのない横１１［）が示される。−２，５ＣＡＴ及 び−２４ＣＡＴは、リポータ−遺伝子に追加したヒトｍｙｏＤ上流配列の最小量 及び最大量を有するＣＡＴリポータ−遺伝子コンストラクトに関する。太線、ヒ トの配列（一定の比率で縮小）、細線、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター配列、 点線、ｐｔｋＣＡＴ　ＥＨベクター配列。ＣＡＴ構造遺伝子配列及びＳＶ４０が 示される。

図３は、ヒトｍｙｏＤ遺伝子の上流の５′フランキング配列を含むＣＡＴリポー タ−遺伝子コンストラクトを有する２３Ａ２筋芽細胞の過渡的転写を示す。Ｐｏ ＣＡＴは、プロモーターのないＣＡＴ遺伝子コンストラクトであり、そして−２ ４ΔＦ３ＣＡＴは、フラグメント３が欠失したことを除き一２４ＣＡＴと同じで ある。Ｙ軸、３７℃における毎時の蛋白１ｍｃｇ当りのブチリル−１Ｈ−クロラ ムフェニコールへの”Ｈ−クロラムフェニコールの変換％として示されるＣＡＴ 活性。

図４は、ウズラからのｑｍｆ　１　（ＱｍｙｏＤｌＤＮＡ座を含むλＥＭＢＬ３ クローンｇｃ１．１２０のマツプである。ＥｃｏＲｌ　（○）及びＰｓｔｌ（ロ ）制限部位が示される。ｑｍｆ　１のエキソン（Ｅｌ、、Ｅ２及びＥ３）が示さ れる。参考のために、示された酵素に対する制限フラグメントは、クローニング ベクターの５゛末端から３′末端に連続してラベルされている（ＥｃｏＲ１フラ グメント＝Ｒ１−Ｒ９、Ｐｓｔ　１フラグメント＝Ｐ１−Ｐ４）。

図５は、ｑｍｆ遺伝子の上流の５°フランキング配列を含むＣＡＴリポータ−遺 伝子を含むウズラの一次筋芽細胞の過渡的トランスフェクションを示す。ＣＡＴ リポータ−遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター（ｐＴＫＣａｔ△ ＥＨ）に結合しさらに図４に示されるｑｍｆ１制限フラグメントに結合した。Ｘ 軸では、ＴＫ＝チミジンキナーゼプロモーターのみ、Ｒ１−Ｒ５及びＰＬ−Ｐ４ ＝指示された制限フラグメントと結合されたチミジンキナーゼプロモーター。Ｙ 軸、３７℃における毎時の蛋白１０μｇ当りのブチリル−３Ｈ−クロラムフェニ コールへのｊＨ−クロラムフェニコールの変換％として示されるＣＡＴ活性。

詳細な説明 以下の語及び語句は、本発明を記述するのに参考のために、以下のように規定さ れる。

１、転写コントロール要素：特定の条件下、標的遺伝子の発現に関して転写コン トロール活性を有する隔離されたＤＮＡセグメントに関する。

エンハンサ−は、転写コントロール要素の一つのタイプである。エンハンサ−は 、それに対する適切な近位に置かれるとき、標的遺伝子の発現を一般に増大する 。用語「転写コントロール要素」及び「エンハンサ−」は、本発明の隔離された ＤＮＡセグメントに関するとき、ここでは相互に交換可能に使用される。

２、胚芽性細胞：その後代がそれらの胚芽細胞の同一性を忠実に受け継ぎそして 成熟した筋肉繊維に分化する可能性を有する、広範囲な細胞の分裂ができる安定 に決定された細胞のタイプに関する。用語「胚芽細胞」及び「胚芽性細胞」は、 ここでは相互に交換可能に使用される。

３、標的遺伝子：その上に本発明の転写コントロール要素がその転写コントロー ル活性を働かす遺伝子に関する。特に、本発明のエンハンサ−要素が、標的遺伝 子から上流に置かれたとき、標的遺伝子の発現を増大させる。ここで使用される とき、「標的遺伝子」は、プロモーターを含む。これらのプロモーターは、標的 遺伝子の相同的ブロモ−夛−であってもよいし、又は、それらは非相同的プロモ ーターであってもよい。しかし、標的遺伝子は、プロモーターのコントロールの 下でなければならない。

４、「実質的に同じ」：ここで示された特異的ＤＮＡ配列に関するとき、「実質 的に同じ」は、多数の理由のために生ずる小さい変異又は置換を考慮に入れるこ とを意味するが、配列により規定されたＤＮＡ分子の全体の特徴を変更するもの ではない。例えば、動物の異なる系又は亜種から隔離された相同性の領域は、こ れらの配列をここで示された配列と実質的に同じにさせるがしがし同一ではない 配列の多室性を有することができる。さらに、ＤＮＡ配列情報の分析における誤 差又はこの情報を記録システムに入れるときの誤差も、又ここで示された配列と 実質的に同じであるがしかし同一ではない配列を生じさせる。

５、「大体（約）Ｊ：ＤＮＡフラグメントの長さを記述するのにここで使用され るとき、「大体（約）」は、標準の方法例えばアガロースゲル電気泳動並びに既 知のサイズの標準のフラグメントとの比較による、ＤＮＡフラグメントのサイズ 又はＤＮＡ鎖に対する相対的位置の測定に関する普通許容可能な誤差の範囲以内 を意味する。

本発明によれば、ヒトｍｙｏＤ遺伝子の発現は、プロモーターによるばかりでな く、ｍｙｏＤ遺伝子から１８−２２キロベース上流（５”）の端部エンハンサ− 配列により調節されることが見出された。ｍｙｏＤプロモーター及びエンハンサ −の転写活性は、５−アザシチジン処理により多罷性１０ＴＩ／２細胞系から由 来する胚芽性細胞でアッセイされた。ｍｙｏＤエンハンサ−及びプロモーターは 、筋芽性細胞系及び非筋芽性細胞系で活性であった。ｍｙｏＤプロモーターは、 上流エンハンサ−配列と組み合わされない限り、それ自体は全く活性が弱いこと が分った。その上、ｍｙｏＤエンハンサ−配列は、又たとえ非相同プロモーター 例えばヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳ　Ｖ　ｔ　ｋ　）プロモーター と組み合わされるときでも、遺伝子の発現を増加可能にすることができることが 見出された。

ウズラＭｙｏＤ蛋白（ＱＭｙｏＤｌをエンコードする第二のｍｙｏＤエンハンサ −（ここではｑｍｆ　１と呼ばれる）も、又隔離されクローンされた。ヒトｍｙ ｏＤエンハンサ−と同様に、ｑｍｆ　１エンハンサーは、筋芽性及び非筋芽性の 細胞系で活性である。ｑｍｆｌエンハンサ−配列は、又ｑｍｆ　１プロモーター 又は非相同プロモーター例えばヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖｔｋ ｌプロモーターの何れかと組み合わされるとき、遺伝子の発現を増加できる。し かし、ヒトｍｙｏＤエンハンザ−と異なり、ｑｍｆ　１エンハンサ−は、ｑｍｆ 　１遺伝子から大体１１．５−１５ｋｂ上流に位置する。その上、ｑｍｆｌエン ハンサ−は、ヒトｍｙｏＤエンハンサー配列と広範囲な配列の相同性を含まない 。

二つのｍｙｏＤプロモーター及びエンハンサ−は、非筋芽性培養細胞で活性であ るが、トランスジェニックマウスの肚では、ヒトｍｙｏＤエンハンサ−及びｑｍ ｆ　１エンハンサ−は、骨格筋系統（筋芽細胞）のみに特異的な遺伝子の発現を 導くことが、さらに見出された。しかし、ヒトｍｙｏＤエンハンサ−のコントロ ール下の遺伝子の空間及び時間的な発現は、以下の実施例６に詳細に記述されて いるように、ｑｍｆ　１エンハンサ−のコントロールの下の遺伝子のそれとは異 なる。

知られている限り、上記のエンハンサ−は、隔離されクローンされた始めての慕 芽細胞特異的エンハンサ−である。これらのエンハンサ−は、以下にさらに詳細 に記述されているように、相同又は非相同プロモーターとともに利用できて、胚 芽細胞特異的遺伝子の発現を増加する。

以下の記述は、本発明を実施するのに含まれる一般的なやり方を示す。

特定の物質が述べられている程度に関し、それは単に説明のためのものであり、 そして本発明を制限することを目的としていない。

■、筋筋線細胞特異的転写コントロール要素製造胚芽細胞特異的転写コントロー ル要素は、二つの一般的な方法により製造できる。（１）それらは、適切なヌク レオチドトリホスフェートから合成できるか、又は（２）それらは、生物学的源 から隔離されそして精製できる。両方の方法は、当業者に周知のプロトコールを 利用する。

他に特定されないならば、標準のクローニング及び組換えＤＮＡのやり方例えば Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ、Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ（１９８９）（ 以下、ｒｓａｍｂｒｏｏｋら」）が使用される。

ＤＮＡ配列の情報が周知であるときには、本発明の胚芽細胞特異的エンハンサ− は、オリゴヌクレオチド合成により製造できる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ＢＯＡＤＮＡ合成機又は同様な装置で 使用されるホスホルアマダイト法により製造できる。得られるコンストラクトは 、当業者により周知のやり方例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ ）により精製できる。長い二本鎖ポリヌクレオチド例えば本発明のそれらは、現 在のオリゴヌクレオチド合成法に固有のサイズの制限によって、段階にわけて合 成しなければならないだろう。従って、例えば、４ｋｂ二本鎖ＤＮＡ分子は、適 切な相補性の二三のより小さいセグメントとして合成できる。このようにして生 成した相補性のセグメントは、それぞれのセグメントが、隣接するセグメントの 付着のために適切な付着末端を有するように、アニーリングされる。隣接するセ グメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下付着末端のアニーリングにより連結されて 、全４ｋｂ二本鎖分子を構築する。

そのように構築された合成りＮＡ分子は、次に適切なベクターにクローンされ増 殖される。

本発明のコンストラクトは、任意の好都合なりローニングベクターで維持できる 。好ましい態様では、大きなコンストラクトは、コスミドクローニング／転移ベ クター例えばｐＷＥ１５　（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅｌに維持され、それは、好 適なＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞例えばＥ、ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４　（Ｓｔａｒａｔ ａｇｅｎｅ）で増殖し、さらに又哺乳動物の細胞に転移される。別に、コンスト ラクトは、ラムダベクター（例又は、λＥＭＢＬ）に維持でき、それは、ゲノム ライブラリーを構築するのにしばしば使用される。より小さいコンストラクトは 、好都合にプラスミド中にクローンされる。

胚芽細胞特異的転写コントロール要素は、当業者に周知の方法を使用して適切な 生物学的源から隔離できる。一つの好ましい態様では、ヒトｍｙｏＤ転写コント ロール要素は隔離されそしてクローンされる。胚芽細胞ゲノムライブラリーは、 ニスミドクローン中に構築できる。ライブラリーは、Ｐｉｎｎｅｙら、Ｃｅ１ｌ 、５３．７８１　（１９８８）により記述されているように、ｃＤＮＡ例えば省 略なしの（ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈｌマウスｍｙｏＤ　ｃＤＮＡによりスクリー ニングできる。このスクリーニングにより同定されるクローンは、有意な量の上 流ＤＮＡ配列の存在について、例えば制限地図により分析できる。ｍｙｏＤ遺伝 子の５′末端の５０ｋｂまでを有するクローンが選択され、そしてエンハンサ− 及びプロモーター活性について分析される。最近の技術における制限により、普 通に使用されるクローニングベクターは、大体５０ｋｂより大きい挿入ＤＮＡを 含むことができない。この理由のため、ｍｙｏＤ遺伝子から５Ｏ−１００ｋｂの ５′領域は、ｍｙｏＤ遺伝子から２５−５０ｋｂの上流配列を含む既に同定され たクローンを使用して、第二のスクリーニング段階により同定されなければなら ないだろう。さらに、端部の配列を得るためのこのような戦略は、当業者により 普通に使用される。

ヒｔ−ｍ　Ｖ　ｏ　Ｄ遺伝子及び大体２５ｋｂの上流領域を含むコスミドクロー ンが構築され、それは、本発明により胚芽細胞特異的転写コントロール要素を構 成する。このコンストラクトのダイアグラムは、図ＩＡに提供される。ヒトｍｙ ｏＤ転写コントロール要素は、二三の特有の特徴を含む。プロモーター領域は、 遺伝子の５゛末端に隣接する２、５ｋｂフラグメントに存在する。プロモーター 領域を含むｌｋｂの上流配列を含むヒトｍｙｏＤ遺伝子のＤＮＡ配列は、配列Ｉ ＤＮｏ、１として以下に示される。推定のＴＡＴＡボックス、プロモーター領域 の３１末端、並びにｍｙｏＤ遺伝子の翻訳開始部位の位置が指示される。

Ｉ　ＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡ　ＣＡＡＡＴＣＡＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴ ＧＡＧＴＣＴＧ　ＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧ５１　ＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＣＧＣＡＣ ＴＣＴＣＧ　ＧＡＧＡＣＴＴＣＡＧ　ＧＴＧＡＧＡＴＧＡＧ　ＧＴＣＡＧＧＴＴ ＣＴ１０１　ＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴ　ＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴ　ＧＡＣＡＣＣＴＴ ＧＧ　ＣＧＡＡＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣ１５１丁ＣＡＧＣＡＣＣＧＣ ＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧ　ＧＡＧＣ［；ＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡ　ＧＧＧ τＴＴＴＣＴＴ２０１　ＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡ　ＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣ ＴＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧ　ＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣ２５１ＣＣＣＴＧＣ ＴＧＴＧ　ＧＡＡＡＣＧＴＧＣＡ　ＧＡＴＴＴＡＧＡＴＧ　ＧＡＧＧＧＧＡＴＴ ＣＣＴＡＡＣＣＴＧＧＧ３０１　ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡ　ＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧ 　ＡＴＴＧＧＣＧＣＧＡ　ＡＣＧ丁ＴＴＡＧＣＡ　ＧＣＡＡＴＣ丁ＣＣＧ３５１ 　ＡＴＴＣＣ丁ＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧＣＴ　ＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡ　ＧＣＧ ＴＣＴＡＧＧＧ　ＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴ４０１　ＧＧＧＣＣＣＡＣＧＡ　ＣＣＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧ　ＴＣＧＧＧＧＡＣＴＧ　ＧＣＧＧＡＡＴ ＡＴＣ４５１ＡＧＡＧＣＣＴＣＴＡ　ＣＧＡＣＣＣＧ丁ＴＴ　ＧＴＣＴＣＧＧＧ ＣＴ　ＣＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＧＧＧ５０１　ＧＴＣＴＣＴＣＣＧ ＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＣＴＣＧ丁ＧＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡ ＣＧＣＴＣＴ５５１　＾ＡＧＣＴＴＴＣＴＧ　ＣＴ丁ＴＣＴＧＣＧＴ　ＧＴＣＴ ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＧＧＴ　ＣＣＣＴＣＴＴＴＣＡ６０１　ＣＧＧＴＣ ＴＣＡＣＴ　ＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴ　ＧＴＧＣＣＣＣＣＡＡ　ＴＧＣＣＴＴＧＣ ＣＴ　ＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴ６５１　ＣＴＣＴＣＡＣＧＡＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴ Ａ　ＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴ　ＡＣＣＣＡＴＧＧＧＴ　ＣＣＣＣＣＡＣＡＡＡ７０ １　ＴＣＡＧＧＧＧＡＣＡ　ＧＡＧＧＡＧ丁ＡＴＴ　ＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＡ　ＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣ７５１ＡＧＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＧ ＡＴＡＣＡＧ　ＣＡＧＴＣＧＧＧＴＧ　ＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴ　Ｔ丁ＧＧＡＡＡ ＧＧＧ８０１　ＣＧＴＧＣＣＧＧＡＧ　ＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴ ＡＧ　ＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴ　ＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣ８５１ＣＴＣＣＣＴＧＣＣ ＣＧＧＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＣＧＣＡ　ＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧ　ＧＡＧ ＧＧＧＣＧＧＧ９０１　ＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＧ　ＣＣＣＣ ＴＧＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧ　ＡＣＣＣＣＣＣＣＣＡ９５１　ＡＧＣＣＣ ＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＡ丁丁ＧＧＣＣＴ　ＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣ ＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣ１０５１ＧＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＧ　Ｇ ＧＧＴＧＡＧＧＡＡ　ＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴｌｌｏｌ　丁 ＴＣＣτＴＡＡＣＣＡＣ＾＾ＡＴＣＡＧＧ　ＣＣＧＧＡＣＡＧＧＡ　ＧＡＧＧＧ ＡＧＧＧＧ　ＴＧＧＧＧＡＣＡＧτ１１５１　ＧＧＧＴＧＧＧＣＡＴ　ＴＣＡＧ ＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣ丁ＣＣＣ ｌ３０１　ＣＣＧＣＧＡＣＧＴＡ　ＧＡＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣ ＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴ　ＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣ１３５１ＡＡＣＧＧＡＣＧＡＣＴ ＴＣＴＡＴＧＡＣＧ　ＡＣＣＣＧＴＧＴＴＴ　ＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧ　ＧＡＣＣ ＴＧＣＧＣＴ１４０１　ＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡ　ＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧ　ＣＧＣ ＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣ丁ＧＡＡＡ１４５１　ＣＣＣＧ ＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ　ＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧ　ＧＴＧＣＡＣＣＣ ＧＧ　ＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣ１５０１ＡＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＴＧＴＧ ＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧ　ＣＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣ１５５１ ＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴ　ＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡ　ＧＧＣＧＴＧＣＡＡＧ　ＣＧＣ ＾＾ＧＡＣＣＡ　ＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡ１６０１　ＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧ　ＧＣ ＣＧＣＣＡＣＣＡ　ＴＧＣＧＣＧＡＧＣＧ　ＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧ　ＡＧＣＡＡ ＡＧＴＡ＾１６５１　ＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴ　ＴＧＡＧＡＣＡＣＴＣＡＡＧＣＧ ＣＴＧＣＡ　ＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡ　ＴＣＣＡＡＡＣＣＡＧ１７０１　ＣＧＧ丁 ＴＧＣＣＣＡ　ＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴ　ＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣ＾ＧＣＣＣ ＣＴ　ＡＴＡＴＣＧＡＧＧＧ１７５１　ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴ　ＣＴＧＣＴＧＣ ＧＣＧ　ＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＣＧＣＣＧＣＡＧＣ１ ８０１ＣＧＧＣＣＴＴＣ丁＾　ＴＧＣＧ丁入ＧＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧ ＧＧＣＣＧＣＧＧ　ＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣ１８５１ＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧ　ＡＣ ＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧ　ＣＧＣＴＣＣ＾＾ＣＴ　ＧＣＴＣＣＧ ＡＣＧＧ１９０１　ＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧ　ＣＣＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧ 丁ＧＡＧ　ＧＡＡＧＴＴＡＧＧＧ　ＣＧＧＣＧＣ丁ＣＧＧ１９５１　ＧＡＴＡＴ ＣＡＧＧＧ　ＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧ　ＡＧＣＴＧＧＣＣＴ Ｔ　ＧＣＧＧＧＡＧＧＴＴ２００１　ＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡ　ＴＣＣＴＴＣＣＣ ＧＡ　ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧ２０５ １　ＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴ　ＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴ　ＧＧＡＡＧＴＧＴＧＣＧＧ ＧＣＡＡＧＣＧＴ　ＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣ２１０１ＣＣＡＴＴＧＧＧＧＧ　ＣＧ ＣＴＡＴＴＡＧＡ　ＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＡ　ＡＧＡＴＣＴ ＴＴＴＴ２１５１　ＣＴＣＴＡＣＴＴＡＴ　ＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧ ＴＡＡＡ　ＴＴＴＧＣＧＣＣＣＣ丁ＴＧＧＴＧＡＣＴＧ２２０１　ＴＣＣＧＣＣ ＣＴＴＧ　ＧＴＴＴＧＧＣＣＣＴ　ＧＣＡＴＧＴＴＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＣＡＴＣ Ｔ　ＣＣＴＡＣＣＣＡＣ［：２２５１　ＣＧＴＡＡＴＴＡＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣ ＣＡ　ＧＧＡＣＡＧＧＴＣＴ　ＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡ　ＣＴＡＧＡＧＣＣＴＴ２ ３０１　ＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴ　ＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧ　ＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧ 　ＧＡＡＴＴＧＧＴＧＴ　ＴＣＧＧＧＣＣＴＣＧ２３５１　ＡＧＣＣＧＴＣＣＣ Ｇ　ＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴ ＧＧＡＣＴＡ２４０１　ＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣＧ　ＣＣＣＧ ＧＣＧＧＣＧ　ＧＡＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＴ２４５１　ＡＣＴＡ ＣＡＡＣＧＡ　ＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴ　ＣＣＧＧＧＣＣＴ ＣＴ　ＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣ２５０１ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ　ＴＣＡＴＧＧＡＧ ＣＴ　ＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴ　ＣＴＡＴＣＴＡＧＧＡ　ＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣ２ ５５１ＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡ　ＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧ　ＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧ　 ＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡ　ＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣ２６０１Ｔ＾＾ＧＣＡＡＧＴＡ　 ＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＧＡＴＴＧ　ＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＡＣＴ ＡＡＡＧＴ２６５１　ＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴ　ＣＡＡＡＧ ＴＡＣＴＧ　ＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧ　ＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴ２７０１　ＧＴＣＧ ＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴ　ＴＡＣＴＡＡＣＣＧＡ　ＧＣＣＣ，ＴＣＣ ＣＣＧ　ＣＧＣＡＧＡＡＣＣＣ２７５１ＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡ　ＡＧＡＧＴＧＣ ＧＧＣＧＧＴＧＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣ丁ＧＴＣＣＡＧＣＡＴ２８０ １　ＣＧＴＧＧＡＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧ　ＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧ　ＧＣ ＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣ２８５１ＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴ　ＴＣＴ ＧＡＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧ　ＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴ　ＧＣＣＧＣＣＣ ＣＣＡ２９０１　ＧＣＧＡＧＧＧＡＧＡ　ＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＣＣＣＡ ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＡ　ＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧ２９５１　ＣＡＧＴＣＧＧ ＧＴＧ　ＣＧＧＧＴＧＣＧＡＡ　ＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧ　ＡＴＡＴＡＣＣＡＧＧ 　ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧ３００１　ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＡＴＧＧＴ　ＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧ３０５１　 ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＴ　ＧＡＡＣＴＴＡＡＡＴ　ＧＣＣＣ ＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＴ３１０１　ＴＴＡＡＡＡＧＣＧＡ　ＣＣＴＣ ＴＣＴＴＧＡ　ＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧ　ＧＣＧＧＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴ ＣＣ３１５１ＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＡ　ＧＧＡＣＡＣＡＧＣ Ｇ　ＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＧＣＡＧＣＡＣ３２０１ＣＣＴＴＣＴＣＧＧＡ 　ＧＡＣＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴ　ＣＣＧＴＧ丁ＴＣＣＴ　ＣＧＧ ＴＧＧＧＣＣ＾３２５１　ＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴ　ＡＧＧ ＴＴＣＡＧＣＴ　ＴＴＣＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧ３３０１　ＧＧＧ ＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＧ ＣＡＣＣＧＧＴＴＡＴＴ３３５１　ＴＧＧＧＧＧＧＧＣＧ　ＴＧＡＧＡＣＣＣＡ Ｇ　ＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧ　ＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴ　ＡＧＣＡＧＧＴＧＴＡ３４ ０１　ＡＣＣＧＴＡＡＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＧ　ＴＴ ＣＡＧＧＡＣＣＡ　ＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡ３４５１　ＴＡＣＴＴＴＴＧＴＡ　Ａ ＴＣＴＡＴＴＣＣＴ　ＧＴＡ＾＾Ｔ＾＾ＧＡ　ＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧ ＣＡＧＧＡ３５０１　ＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧ　ＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴ　ＣＴＣＴ ＧＡＧＧＣＡ　ＴＧＧＴＧＴＧ丁ＧＧ　ＴＧＣ丁＾丁入ＧＧＧ３５５１　ＡＡＴ ＴＴＧＴＡＣＧ　ＴＴＴＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡ　ＧＣＣＧＣＧＧ ＧＣＧ　ＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧ３６０１　τＧＡＴＣＡＡＡＡＴ　ＡＡＡＧＧＣ ＧＣＴＡ　ＡＴＴＴＡＴＡＣＣＧ　ＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴ ３６５１　ＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴ　ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧ　ＧＡＧＧＡＡＡＡＴ ＣＣＧＣＡＡＡＣＴＧＧ　ＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣ３７０１ＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣ ＧＣＧＴＣＴＡＧＧＧ　ＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡ　ＴＴＧＣＡＡＧＧＡＧ　ＧＡＡ ＧＣＣＴＧＣ丁３７５１　ＧＣＣＴＧＧＧＧＡＡ　ＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧ　ＧＴ ＧＣＡＡＡＴＴＴ　ＣＴＣＣＡＧＴＡＣＧ　ＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴ３８０１　Ｃ ＣＴＣＴＧＡＣＣＴ　ＴＧＡＣＴＡＣＡＴＴ　ＡＣＴＡＣＡＣＡＣＧ　ＴＣＣＧ ＴＧＧＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＡＧＧ３８５１　ＧＴＡＣＡＣＡＧＧＴ　ＴＧＡＴ ＡＴＧＡＧＴ　ＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡ　ＣＣＣＡ丁ＧＴＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＧＣ ＣＣＣ３９０１ＣＴＡＧＡＴＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴ＾＾ＴＧ　ＴＴＴＣＴＧＣＣ ＣＣＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＣＡＧＧ丁＾丁３９５１　丁ＧＧＴＡＴＴＴ ＴＴ　ＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＴＧ　ＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴ　Ｔ ＣＡＴＴＣ＾＾ＧＧ４００１　ＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡ　ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＡ　 ＴＡＡＧＴＧＡＧ丁Ｇ　ＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧ　ＴＧＡＴＡＣＡＧＡＧ４０５１ 　ＡＣＡＣＧＧＡＧＴＧ　ＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴ　ＣＡＣＴＴＧＧＧＧＣ丁ＣＧ ＴＧＧ（ａ）−推定のＴＡＴＡボックス （ｂ）−プロモーター領域の３″末端 （ｃ）−翻訳開始部位 エンハンサ−要素は、ヒトｍｙｏＤ遺伝子から大体１８−２２ｋｂ上流の４ｋｂ フラグメント（フラグメント３）に存在する。このフラグメントの制限マツプは 、図１に示される。このフラグメントの大体１．７ｋｂのＤＮＡ配列は、配列Ｉ ＤＮｏ、２として以下に示される。

Ｉ　ＣＣＡＣＡＧＣＡＧＴ　ＴＧＧＧＧＧＣＡＴＴ　丁＾ＴＧＧＧＣＣＴＴ　Ｃ ＣＴＡＴＡＡＡＣＴ　ＴＣＴＧＡＧＡＧＧＧ５１　ＴＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧ ＣＴＴＣＴＴＴ　ＣＡＧＣＣＡＡＧＴＡ　ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡ　ＧＣＡＧＣＴ ＧＧＴＣｌｏｌ　ＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧ　ＴＴＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣ ＴＣＡ　ＧＣＴＴＡＡＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＴＣＡＣ１５１＾ＧＣＡＣＡＧＣＣ Ａ　ＧＴＧＴＧＧＧＧＧＡ　ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＡＴＡ　Ｃ ＧＴＧＧＣＧＣＣＣ２０１ＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴ　ＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＴ ＣＴＣＴＧＧＴ　ＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴ　ＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ２５１　Ｇ丁Ｔ ＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴ　ＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴ ＣＡ　ＣＴＧＡＣＣＣＣＴＡ３０１　ＣＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＧＴ ＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡ　ＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣ３５１Ｃ ＴＴＧＧＣＴＴＴＧ　ＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴ　ＣＡＧＧＣＴＡＴＣＣＣＡＧ＾＾ ＡＴＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣ丁４０１　ＴＧＧＣＣＴＴＣＣＡ　ＧＡＧＡＡＧ ＧＧＧＡ　ＡＧＧＴＴＴＣＡＡＧ　ＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧ　ＧＧＡＧＧＧＧＴＴ Ｇ４５１　ＧτＣＣＴＧＡＡＡＴ　ＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＡＣＣＴ Ｇ　ＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧ　ＧＡ＾＾＾ＡＴＴＣＣ５０１ＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴ 　ＧＡＣＣＣＴＣ丁ＣＡ　ＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴ　ＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧ　ＴＣ ＡＧＣＡＴＧＴＧ５５１　ＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴ　ＧＧＣ ＴＧＡＡＧＴＧ　ＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡ　＾＾ＧＴＡＡＣＡＣＡ８５１　ＴＣＡ ＧＧＴＡＧＡＡ　ＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴ　ＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧ　ＣＣＴＴＧＧ ＡＧＡＧ　ＡＣＡＴＧＧＧＴ丁Ｃ７０１ＡＡＧＴＣＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＡＣ ＣＴ　ＡＣＴＡＧＣＴＧＡＡ　ＴＡＧＣＴＴＣＣＣＴ　ＧＡＧＣＣＴＣＴＧＴ７ ５１　ＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ　ＧＴＡＡＡＡＣＴＧＧ　ＧＡＴＡＧＴＡＡＴＡ　 ＧＣＡＴＴＡＣＣＴＴ　ＧＧＣＧＡＧＣＴＡＡ８０１　ＴＧＴＧＡＧＡＡＴＣＡ ＡＡＡＣＣＴＡＴＴ　ＴＴＣＣＴＧＣＴＴＡ　ＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡ　ＧＣＴＡ ＴＴＡＡＴＡ８５１　ＴＴＡＴＴＧＴＴＧＴ　ＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ ＡＣＴＧＣＴＣＡＡ＾＾ＡＧＣＡ　ＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡ９０１　ＴＴＴＴＣＡ ＴＴＴＧ　ＴＣＡＧＧＧＧＡＣＴ　ＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡ　ＴＡＧＣＧＧＧＧＡ Ｇ　ＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴ９５１　ＧＧＴＣＴＧＡ＾＾Ｇ　ＧＡＴＴＴＣＡＧＴ Ｇ　ＡＣＡＣＣＴＣＴＣＡ　ＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡ　ＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴｌｏ ｏｌ　ＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧ　ＡＣＴＣＴＧＴＡＡＡ　ＴＧＡＴＡＡＧＧＧＡ　 ＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡ　ＧＣＣＡＧＴＧＧＣ＾１０５１　ＴＣＧＴＧＣＴＴＧＴ 　ＴＡＴＧＧＴＴＧＡＡ　ＧＡＣＣＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡ ＧＣＡＧＡ’Ｔ１１０１　＾ＣＡＣＧＡＣＧＧＡ　ＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴ　ＧＧ ＴＡＣＣＴＣＴＡ　ＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧ　ＣＡＣＡＡＡＴＣＧＴ１１５１　Ｇ ＴＧＣＴＡＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＴＧＣＣＡＧＴＧ　ＡＴＴＣＴ ＣＡＡＴＡ　ＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣ１２０１ＣＡＴＣＴＧＡＡＡＡ　ＧＴＣＣＣ ＡＴＡＣＴ　ＣＡＴＣＣＡＡＡＧＡ　ＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧ　ＴＡＡＧＧＡＧＧ ＡＡ１２５１　ＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴ　ＴＡＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧ ＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＡＴ　ＡＴＴＡＡＡＣＡＣ＾１３０】　＾＾ＴＡＴＴＴＧ ＡＣＣＡＴＡＴＣＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡ　ＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧ　ＴＧ ＧＧＴＡＴＡＣＴ１３５１　ＡＴＴＡＴＣＴＡＣＡ　ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡ ＡＴＴＡＴＡＴＴ　ＡＡＴＧＡＡＴＣＴＡ　ＧＴＴＣＴＴＣＡＣＴｌ、４０１　 ＣＣＴＣＣＴＣＧＴＡ　ＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴ　ＴＴＧＣＣＴＴＡＴＧ　ＡＴＴ ＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣ１４５１＾ＧＧＡＧＧＣＡＴＡ　ＴＴＧＴ ＧＴＡＴＴＴ　ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴ　ＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧ　ＴＴＣＡＧＣＣ ＡＴＧ１５０１　丁＾ＡＣＴＴＧＴＴＴ　ＴＡＡＣＣＣＡＴＧＡ　ＧＡＴＡＴＴ ＡＡＣＡ　ＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴ１５５１　ＴＴＧＧＧＡ ＡＡＴＧ　ＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴ　ＴＣＴＧＣＴＴＧＣＡ　ＣＴＴＴＴＧＣＡＣ ＣＡＣＴＡＣＣＡＴＴＡ１６０１、ＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣＣＴＡＧＧＣ ＴＡＧＣＣＴＧＣＴＡ　ＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＧ１６５１　 ＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣ＾＾ＧＡ　ＣＣＡＧＣ ＣＴＧＡＧ　ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＴ１７０１　＾ＣＡＧＣＡＴＧＴＧ　ＡＧ丁Ｇ ＡＧＣＣＣＡ　ＧＣＡＧＡＧＣＣＴＡ　ＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡ　ＣＣＡＡＴＣＴ ＡＡＡ１７５１　ＴＡＧＣＣＡ＾ 特別な増大活性を有する、現在までに同定されたエンハンサ−要素の配列化部分 の二つのサブ領域は、ｂｐｌ−２５８及び１１８５−１７５７に位置する。ｂｐ ｌ−２５８に位置するサブ領域は、胚芽細胞特異性に関Ｖるように思われ、一方 １．１８５−１７５７サブ領域は、発現増大活性の量に影響する。他の領域特に 配列化領域の５′末端も活性を有することは、当業者に明かであろう。

他の好ましい態様では、ウズラｍｙｏＤ転写コントロール要素が、隔離されそし てクローンされる。この態様では、ウズラ胚−次筋繊維が、ラムダベクターに構 築され、そしてｄｅ　ｌａ　Ｂｒｏｕｓｓｅら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅ ｌ、４．５６７−５８１　（１９９０１により記述されるように、ＱＭｙｏＤ調 節蛋白をエンコーディングしたＣＤＮＡ例えばウズラｑｍｆｌｃＤＮＡクローン によりスクリーニングされる。スクリーニングにより同定されたクローンは、有 意な量の上流ＤＮＡ配列の存在について分析され、モしてｑｍｆ　１の５′末端 の５０ｋｂまでを有するクローンを選びそしてエンハンサ−及びプロモーター活 性について分析する。それより上流のＤＮＡ配列は、父上記のように二次スクリ ーニングを行うことにより分析される。

ｑｍｆｌ遺伝子及び大体１８ｋｂ上流領域を含む＾ＥＭＢＬ３クローンは隔離さ れ、それは、本発明による胚芽細胞特異的転写コントロール要素を構成する。こ のコンストラクト（ｇｃｌ１２０と呼ばれる）のダイアグラムは、図４に示され る。

エンハンサ−要素は、制限フラグメントＰ３において、ｑｍｆｌ遺伝子から大体 １１．５−１５ｋｂ上流の２．２ｋｂフラグメントに存在する。フラグメントＰ ３のＤＮＡ配列は、配列１．Ｄ、Ｎｏ、３として以下に示される。

Ｉ　ＡＣＧＴＴＧＴＣＡＡ　ＧＧＡＡＡＡＴＴＣＴ　ＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴ　Ｔ ＡＡＡＡＧＴＧＡＡ　ＡＧＣＣＡＡＣＡＣＡ５１　ＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡ　ＣＡ ＣＴＴＧＴＧＴＧ　ＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴ　ＧＡＧＧＴＣ＾＾ＴＧ　ＡＣＴＧＴ ＴＡＴＧＧｌｏｌ　ＡＴＴＴＴＡＧＡＣＴ　ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧ ＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＡ　ＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣ１５１ＴＣＣＴＴＧＡＡ ＧＴ　ＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴ　ＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＴ　Ｃ ＣＣＡＴＣＴＧＧ＾２０１　ＣＡＴＧＧＴＣＣＡＡ　ＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧ　Ａ ＣＴＣＡＡＡＡＣＴ　ＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴ　ＣＡＧＡＡＧＧＴＣＡ２５１　Ａ ＡＡＮＴＧＡＡＡＡ　ＧＡＧＧＴＡＣＡＧＴ　ＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴ　ＡＣＡＴ ＧＴＴＡＧＡ　ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡ３０１　ＧＡＧＡＡＧＴＴＧＴ　ＧＡＣＴ ＧＧＴＧＡＴ　ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴ　ＴＧＴＡＧＣＡＡＧＧ　ＴＣＡＴＧＴＴ 丁ＴＣ、１５１　ＣＣＣＴ＾＾ＣＡＣＴ　ＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧ　ＣＡＣＴＴＴ ＧＧＡＡ　ＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴ　ＴＧＣＴＣＡＧＧ丁Ｔ４０１　ＴＴＧＴＣＴ ＧＡＴＧ　ＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡ　ＣＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＴ 　ＴＧ＾＾ＧＧＡＴＧＣ４５１ＴＴＡＴＧＧＴＣＴＡ　ＧＡＡＴＣＴＧＧＧＡ　 ＴＧ（：ＡＡＡＣＡＧＧ　ＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＴＣ丁ＴＧ丁Ｇ５０１　 ＾ＧＧＣＡＧＣＡＧＴ　ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧ　ＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡ　ＧＡＧ ＧＧＡＧＧＧＴ　ＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴ５５１　ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡ　ＧＣＴ ＴＴＴＧＡＣＴ　ＴＧＴＡＧＣＴＧＴＮ　ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＧ　ＣＡＧＧＡＧ ＡＣＡＡ６０１　Ｇ＾＾ＧＡＴＴＴＡＴ　ＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴ　ＧＡＡＧＧＡ ＡＧＡＴ　ＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧ　ＣＡ＾＾ＧＡＴＡＧＧ６５１　ＴＧＡＧ＾＾ ＧＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＧＡＧＡ　ＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧ　 ＣＡＣＴＡＡＣＴＧＧ７０１　ＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣ ＴＧＴＴＧＴＡＴ　ＡＴＧＧＧＣＡＴＴＡ　ＣＴＣＡＴＡＣ＾＾Ｃ７５１ＴＴＣ ＡＡＧＡＧＡＧ　ＴＡＣＡＴＧＡＴＴＧ　ＡＡＣ丁ＧＡＧＣＡＴ　ＧＴＡＣＣＡ ＧＣＴＧ　ＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣ８０１ＣＣＡＴＡＡＴＧＴＴ　ＣＮＴＴＡＴＡ ＡＡＧ　ＧＴＣＣＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＡ＾＾ＴＡ　ＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴ８ ５１　ＣＴＣＴＣＴＴＣ＾＾　ＡＧＧＧＧＣＡＣＣＴ　ＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧ　 ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡ　ＴＧＡＴＡＣＴＧＧＡ９０１　Ｔ丁ＡＧＴＧＣＡＣＡ　 ＴＧＣＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＴ　ＧＧＡＣＣ ＣＡ＾＾＾９５１　ＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＧＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧ ＣＡＧＧ　ＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡｌｏｏｌ　ＧＣＴＧＴＴ ＴＧＡＡ　ＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴ　ＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴ　ＡＧＧＣＧＧＧＧＴ に　ＡＧＴＣＣＴＣＴＧＡ１０５１　ＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧ　ＧＡＡＧＡＧＣＴ ＧＧ　ＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧ　ＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡ　ＧＧＣＡＣＡＧＡＧＣｌ ｌｏｌ　ＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴ　ＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡ　ＴＴＴＡＧＣ＾＾ＧＧ 　ＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴ　ＣＣＡＧＣＡＴＡＧＴ１１５１　＾ＴＧＧＴＧ［；Ａ ＡＡ　ＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧ　ＴＧＧＣＴＧＧＴＡＴ　ＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡ　 ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣ１２０１＾ＴＧＡＣＣＣＡＧＴ　ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴ　 ＴＧＴＴＣＣＣＡＡＡ　ＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡ　ＧＡＣＣＴＡＴＡＧＡ１２５１ 　ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡ　ＡＡＴＧＣＴＧＧＡＴ　ＣＴ ＧＴＡＡＧＡＴＧ　ＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣ１３０１ＣＴＴＧＴＣＡＧＴ丁　＾Ｃ ＴＧＧＣＣＴＡＧ　ＴＧＴＧＡＧＡＣＡＴ　ＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴ　ＧＣ丁ＧＧ ＣＡＴＣＴ１３５１　ＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴ　ＣＡＧＴＧ丁丁ＴＴＣＡＧＣＣＡ ＣＴＧＧＴ　ＴＴＡ＾＾ＧＣＴ丁Ｔ　＾＾＾ＧＡＧＣＴＧＣ１４０１ＣＴＧＧＣ ＧＡＡＧＧ　ＴＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧＣＧ　ＴＧＣＡＧＧＧＴＧ Ａ　ＡｒＡＴＣｒｒ；Ｔｃ＾１４５１　ＣＧＴＧＣＡＡＮＡＧ　ＣＴＧＡＡＡＣ ＣＡＧ　ＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡ　ＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡ　ＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡ １５０１　＾ＡＴＧＧＧＴＴＡＡ　ＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡ　ＣＧＧＧＡＧＴＧＣ Ａ　ＡＧＧＧＡＣＴＧＴＧ　ＣＣＡＧＧＴＣＡＧ丁１５５１　ＧＧＡＧＧＧＴＧ ＡＧ　ＧＡＧＡＣＮＣＧＧＧ　ＣＧＴＴＣＡＧＡＧＴ　ＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴ ＧＧＡＡＧＴＣＡＧ１６０１　ＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴ　ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧ　 ＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡ　ＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡ　ＡＴＧＧＴＡＧＡＧＣ１６５１ ＾ＧＴＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＮ　）ＩＡＧＡＧＡＧＡＡＧ　ＧＧＡ ＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＮＮＴＧＡＡＧ１７０１　ＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＣＴ ＡＣＡＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＴ　ＣＡＴＣＡＧＣＣ ＡＧ１７５１　ＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴ　ＣＴＴＣＡＴＧＣＣＴ　ＴＴＧＣＴＡＡ ＴＴＧ　ＣＴＣＡＡＧＣＡＡＧ　ＣＴＣＴＣＡＧＣＧＡ１８０１　＾ＣＣＴＣＣ ＡＴＡＴ　ＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴ　ＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣ ＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡ１８５１　ＡＣＡＴＡＡＡＴＡＴ　ＴＴＧＡＧＧＣＣＴＣ ＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧ　Ｇ＾＾＾ＴＧＧＧＡＴ　ＴＴＣＮＧＣＡＧＧＴ１９０１ 　ＧＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧ　ＣＡＴＧＣＴＴＣＴＧ　ＡＧＧ ＣＴＴＧＧＮＡ　ＴＡ）ＩＧＧｃＡＴＴＧ１９５１　（：ＴＡＡＡＴＣＣＴＧ　 ＡＴＴＣＡＧＧ＾丁Ｇ　ＣＡＡＧＡＡＴＧ丁Ｃ丁ＣＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡ ＴＧＴＡＡ２００１　ＡＣＴＧＴＴＧＴＣＣＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴ　ＧＧ＾＾Ｇ ＴＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴ　ＧＧＣＡＣテ＾ＧＡＣ２０５１ＡＡＧＴＡＴ ＧＧＧＴ　ＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡ　ＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＣ ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴ２１０１　ＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡ　ＡＧＴＡＣＡＧＡＴＧ 　ＧＧＣＣＡＡＴＴＣＡ　ＣＡＧＴＴＴＧ＾＾Ｔ　ＡＧＴＡＴＡＡＣ＾＾２１５ １　ＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡ　ＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡ　ＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧ ＣＡＧＧＮＮＮＴ　ＣＧＡＮＮＮＮＡＮＮ２２０１　ＮＮＮＮＮＣＧＡＴＡ　Ｃ ＣＧＡＣＧＡＣＣＴ　ＣＧＡＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＴＡ遺伝子の発現は、転写開 始部位の５′末端（こ隣接して位置するプロモーター配列により、少なくとも一 部コントロールされることカイ通常予想されるだろう。しかし、成る遺伝子は、 遺伝子それ自体力）ら遥力）（こ離れた位置に存在できるエンハンサ−要素によ りざら（ニ調節される。これらエンハンサ−要素は、遺伝子から遥かに離れた上 流（成る場合に＋、ｔ、約５ｏ−ｔ６ｏｋｂ＋に、又は３′未翻訳領域で遺イ云 子力・らの下流（こ、又は遺伝子それ自体の中、イントロンにすら見出される。

ＭＩＮこ、遺伝子（よ、任意のエンハンサ−要素のコントロールなしくこ発現で きる。Ｓ、Ｄ、Ｇ２３０　（１９８５）参照。

エンハンサ−要素が存在するかどうか又（よどこ（こ存在する力）を予言するの に困難があるにかかわらず、一度特定の遺伝子に関するエンハンサー配列が同定 されると、同様に位置するエンハンサー要素も関連する遺伝子、又は他の種類か らの相同遺伝子に存在するようである。従って、本発明によれば、上記のヒトｍ ｙｏＤエンハンサーカｆ見出され、そしてヒトｍｙｏＤ転写開始部位から１．８ −２２　ｋ　ｂ上流で存在する１、７ｋｂフラグメントの特徴がある。一度ここ に記述された方法に従ってヒトｍ　ｙ　ｏ　Ｉ）エンハンサ−が見出されそして 位置を突き止めると、ウズラｍｙｏＤ遺伝子（ｑｍｆｌ）の上流領域は、同様（ こ位置するエンハンサー要素の存在について調べられた。このエンＡンサー（よ 、ｑｍｆ　１転写開始部位から大体１５−１７ｋｂ上流で同定された。このエン ノｘンサー【よ、ヒトｍｙｏＤエンハンサ−から異なる配列相同性のものであり そしてマウスの胚で胚成長のやや異なる〕＼ターンを導く力τ、それＣよ、本発 明によりもたらされる筋芽細胞特異的エンハンサー要素の基本的な特徴を含む。

従って、ヒトｍｙｏＤ遺伝子及びウズラｑｍｆ　１遺伝子の両者は、遺伝子発現 の上流のエンハンサ−を有することが示されている。背景技術で記述されたよう に、ｍｙｏＤ及びｑｍｆｌの蛋白は、胚芽性調節蛋白のｂＨＬＨ群の一部である 。これらの蛋白は、高度の進化的保存を有することが示されている。Ｐｏｗｎａ ｌｌら、前出。この理由のため、ヒトｍｙｏＤ遺伝子及びウズラｑｍｆｌ遺伝子 の両者の上流エンハンサ−の存在は、このエンハンサ−要素もｂ　ＨＬ　Ｈ胚芽 性調節蛋白群の他の遺伝子に存在することの明らかな表れである。これは、ヒト ｍｙｏＤ及びウズラｑｍｆ　１がｂＨＬＨ群の最も密接に関連するメンバーでは ないことが観察されるとき、まさにそうである。

ｂＨＬＨ筋芽性筋芽蛋白群のメンバーの中の関係から見て、本発明は、ｂＨＬＨ 群の任意の一つからの上流エンハンサ−を含む転写コントロール要素を提供する 。ｂＨＬＨ群は、以下のものを含むが、これらに限定されない。（１）ＭＲＦ４ 　（マウス、ラット、ヒト）、（２）ｍｙｏｇにワトリ、マウス、ラット、ヒト ）、（３）ＭｙｏＤ　（ヒト、ヒツジ、マウス、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐ ｈｉｌａ、ウニ、Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓ、ウズラ（ｑｍｆｌ、ｑｍｆ２及びｑｍｆ ３を含む））、（５）ミオゲニン及び（６）ｍｙｆ５（ウシ、ヒト、Ｘｅｎｏｐ ｕｓ）ｏ任意のｂＨＬＨ筋芽性筋部性調節遺伝子領域を分析するためのここで示 された方法は、これらエンハンサ−要素を同定し位置を定めるのに適切であろう 。その上、このエンハンサ−を同定するための好ましい方法は、ここで記載され るように機能的アッセイによることは、当業者に明らかであろう。例えば、ここ で特に例示された２種のｍｙｏＤエンハンサ−要素は、ともに、たとえそれぞれ のエンハンサ−が配列の相同性を示さないとしても、非筋芽性又は胚芽性の培養 細胞の遺伝子発現を増大する、そして特に非培養筋芽細胞の遺伝子発現を増大す る同じ基本的な官能的特徴を有する。

胚芽細胞特異的転写コントロール活性は、推定のエンハンサ−要素が、普通のリ ポータ−遺伝子例えばクロラムフェニコールアセチル転移酵素ｆｃＡＴ）をエン コードした遺伝子から上流に位置するコンストラクトを調製することにより分析 できる。ＣＡＴリポータ−遺伝子を使用するクローン化ＤＮＡセグメントのプロ モーター／エンハンサ−活性をテストする方法は、以下の実施例に詳細に記述さ れる。

一度エンハンサー配列が同定されると、それらの胚芽細胞特異性は、トランスジ ェニックマウスの胚のリポータ−遺伝子の発現を調べることにより生体内でテス トできる。転写コントロール要素は、リポータ−遺伝子例えば１ａｃＺ遺伝子に 組み合わされ、そして周知の方法により、前核注射により動物の胚中に導入され る。リポータ−遺伝子の発現は、体細胞筋節肢芽の胚芽性細胞が先ず高濃度で胚 芽性遺伝子転写を発現するときである、受精後数日（例えば１１−１２１の全封 入及び連続切片の胚を観察することによりモニターできる。もし推定の転写コン トロール要素が本当に胚芽細胞に特異的でありそして胚芽性細胞で活性であるな らば、リポータ−遺伝子は、これらの条件下で発現すべきである。生体内で胚芽 細胞特異的転写コントローロール要素の能力をテストする方法は、以下の実施例 に詳細に記述される。

Ｉｌ、胚芽細胞特異的転写コントロール要素を使用する方法Ａ１体細胞遺伝子治 療 本発明の転写コントロール要素は、胚芽細胞介在遺伝子治療にかなりの有利さで 使用される。胚芽細胞は増殖し互いに融合するので、それらは、正常の筋肉の成 長の段階で、組換又遺伝子を含む後代を多数の多核筋繊維にすることができる。

Ｄｈａｗａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２５４．１５０９−１２　（１９９１）。本 発明の転写コントロール要素は、現在の胚芽細胞転移技術と関連して使用されて 、組換え遺伝子の高度の発現、並びに遺伝子の発現の大きな特異性をもたらす。

本発明の転写コントロール要素の顕著な特徴は、胚芽細胞が成熟した筋肉細胞に 分化した後にそれが不活性であるということにあることを注意しなければならな い。

そのため、この要素は、遺伝子の発現の必要なコントロールをもたらし、それに より組換え遺伝子が融合の胚芽細胞の増殖中に発現するが、一度筋芽性の細胞及 びそれらの後代が分化するか又はその直後に、「切れる」だろう。好ましい態様 では、本発明の転写コントロール要素は、一度筋芽細胞が、胚芽細胞に特異的で はないプロモーターと関連して使用されて、筋肉細胞に分化すると、不活性にな るエンハンサ−要素を含む。

本発明による遺伝工学的に処理された胚芽細胞を使用する胚芽細胞の転移は、当 業者に周知の方法により達成できる。例えば、Ｄｈａｗａｎら、前出、参照。例 えば、培養された胚芽性細胞は、遺伝学的に変更されて、当業者に周知のトラン スフェクション又は感染法を使用する胚芽細胞特異的転写コントロールの下で安 定に挿入された組換え遺伝子を含む。これらのトランスフェクション又は感染法 は、哺乳動物の発現ベクター又は高能率レトロウィルス介在感染を経るトランス フェクションを含む。このやり方で遺伝学的に変更された胚芽細胞は、次に組換 え遺伝子の発現について調べられる。これらの遺伝学的に変更された細胞は、生 体内で筋肉組織中への導入のために拡大される。

筋肉中への胚芽細胞の注入には、細胞は、トリプシン処理され、洗浄され、そし て例えばホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）に懸濁される。１ｏ’−ｉｏ’個の胚 芽細胞が、処理されるべき筋肉組織全体に一連の二二の注入で少量（例えば１０ −１００ミクロＬ）で注入される。転移された組換え胚芽細胞は、それらが増殖 しそして存在する筋肉細胞と融合し始める間中、組換え遺伝子生成物を発現する だろう。しかし、一度この期間が終ると、組換え遺伝子をコントロールするエン ハンサ−は、不活性化され、それにより組換え遺伝子の発現は経る。

本発明の胚芽細胞特異的エンハンサ−を使用する胚芽細胞の転移は、筋肉の成長 のオートクリン調節（即ち、それ自身の成長を調節する胚芽細胞の能力）を操作 するのに特に有利に使用できる。成長因子（例えば、Ｆ　Ｇ　Ｆ又はインスリン 様成長因子）をエンコードした遺伝子は、本発明の胚芽細胞特異的エンハンサ− のコントロールの下に置かれたとき、遺伝学的（ζ変更した胚芽細胞に使用でき た。これらの胚芽細胞は、組換え遺伝子が発現するであろう筋肉中に転移された 。組換え胚芽細胞により発現される成長因子は、組換え細胞をして非組換え胚芽 細胞よりも大きな程度に胚芽細胞として増殖させ、それにより処−理される筋肉 組織の胚芽性細胞の量を拡大した。

本発明の胚芽細胞特異的転写コントロール要素のコントロールの下で潜在的に有 用な遺伝子を含むコンストラクトは、生体中への胚芽細胞の転移を行う前に培養 された細胞でテストできる。例えばこのコンストラクトは、適切な発現ベクター に置かれたとき、以下の実施例２に詳細に記述されるように、２３Ａ２筋芽細胞 をトランスフェクトするのに使用できる。コンストラクトにより発現される組換 え蛋白の量は、標準の方法（例えば免疫沈降により）に従って測定できる。この やり方で、本発明の転写コントロール要素のコントロール下の遺伝子によりエン コードされた潜在的に有用な蛋白が、それが胚芽細胞の転移に適切である好適な レベルに発現できるかどうかを生体外で決定できる。

さらに、本発明の転写コントロール要素のコントロール下の組換え遺伝子を含む 潜在的に有用なコンストラクトは、成長している動物の胚でテストできる。胚動 物における発現のテストは、胚芽細胞の転移に使用される胚芽細胞における発現 条件にさらに密接に近い。マウスの胚中へのこれらコンストラクトの導入方法は 、以下の実施例３に詳細に記述されている。

Ｂ、生殖系列遺伝操作 既に述べたように、本発明の転写コントロール要素のコントロール下の組換又遺 伝子は、胚細胞の遺伝学的変更に使用されて、改良された筋肉の特徴を有するト ランスジェニック動物を生ずる。胚芽細胞特異的転写コントロール要素のコント ロール下の組換え遺伝子は、以下の実施例３に記述されているように、前核注射 により導入される。胚を犠牲にする代りに、実施例に記述されているように、胚 は、雌の受容者に移植され、そして動物を産ませる。推定のトランスジェニック 動物を育て、そして産ませて、動物のゲノム中に組換え遺伝子の遺伝可能な挿入 があったかどうかを決定する。

トランスジェニック動物の発生学的成長中、組換え遺伝子は、胚芽細胞の決定が 始まるような時間まで、休止状態のままでなければならない。

組換え遺伝子は、次に胚芽細胞で活性化されるようになり、選択された組換え遺 伝子生成物の利益を与えなければならない。例えば、成長ホルモンをエンコード された遺伝子は、本発明の転写コントロール要素のコントロールの下に置かれ、 そして筋肉の形成が生じつつある動物の成長の期間を通じて活性化されるように なる。筋肉組織が成熟すると、転写コントロール要素は、既に述べたように、不 活性化され、そして組換え遺伝子生成物は生成が停止する。

上記のそして以下の実施例３におけるマウスの発生学的システムは、本発明の転 写コントロール要素のコントロールの下紐換え遺伝子をテストするための極めて 有用な動物モデルシステムである。これらの動物は、胚として実験室で操作でき 、そして又コントロールされた条件下で成体に育てられる。従って、潜在的に有 用な組換え遺伝子は、マウスの成長期間を通して発現及び有効性についてスクリ ーンされ、そして他の動物における効力に関してそのＩ＆礎に晟づいて評価され る。

以下の実施例は、さらに詳細に本発明を記述するために提供される。

これらの実施例は、説明のためのものでありそして本発明を制限することを目指 すものではない。

実施例　１ ヒトｍｙｏＤ転写コントロール要素の隔離及びクローニングヒトｍｙｏＤ遺伝子 の発現を調節する転写コントロール要素を同定しクローンした。省略なしのマウ スｍｙｏＤｃＤＮＡ　ｆＰｉｎｎｅｙら、Ｃｅ１ｌ　５３．７８１．１９８８） を使用してｐＷＥ１５ヒトゲノムＭｂｏＩコスミドライブラリー（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）をスクリーンした。２０枚の重複ニトロセ ルロースフィルター上の大体４０００００個のコロニーを、３ｉｐをラベルした ランダムプライムマウスＭｙｏＤ１　ｃＤＮＡにより、中程度の厳密さでハイブ リッド形成した（前ハイブリッド形成及びハイブリッド形成では６５℃、洗浄で は５５℃）。

このスクリーンは、合計４０ｋｂに及ぶ３個のユニークなオーバーラツプクロー ンを示す４個の組換え体を生じた。ヒトＭｙｏＤ　ｃＤＮＡとの配列の比較は、 ハイブリッド種をｍｙｏＤと同定した。

クローンのＥｃｏＲ１マツプは、Ｗａｈｌら、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、’　１゜Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡＩ　８４．２１６０　（１９８７）により記述されている ように、間接的末端ラベル法により生じた。次の分析（ａｈＭＤ−１３１で使用 されるコスミドクローンの編成は、図ＩＡに示されるように、大体２５．５ｋｂ のＤＮＡ上流及び４ｋｂ下流のｍｙｏＤ遺伝子を含む。ｃｈＭＤ−１３の制限フ ラグメントの大体のサイズは、以下の通りである。１．１．７ｋｂ、２．１．９ ｋｂ、３．４．１ｋｂ、４、０．　４５ｋｂ、５．９．　７ｋｂ、６．０．　６ ５ｋｂ、７．０．２５ｋｂ、８．３．　９ｋｂ、９．６．４ｋｂ、　１０．２． ８ｋｂ０実施例　２ 培養した胚芽性細胞のｍｙｏＤ調節転写コントロール要素の転写コントロール活 性の測定 実施例１に記載されたｍｙｏＤ転写コントロール要素の転写活性は、２３Ａ２筋 芽細胞、即ち５−アザシチジン処理により多能性１０Ｔ１／２細胞系から由来す る胚芽性細胞でアッセイされた。Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら、Ｃｅ１ｌ、３８．７９ １　（１９８４）。：れは、二重のクローンを構築することにより達成され、ｍ ｙｏＤの５°フランキング配列の異なる領域は、クロラムフェニコールアセチル 転移酵素（ＣＡＴＩ　リポータ−遺伝子に融合し、次に増殖性２３Ａ２筋芽細胞 中への過渡的なトランスフェクション後ＣＡＴ活性についてアッセイされた。

全ての細胞系は、２３Ａ２を除きＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから得られ、２３Ａ２は、上言己のように、５−アザシ チジン処理によりｌ０ＴＩ／２から由来した。Ｃ３Ｈ１０ＴＩ／２及び２３Ａ２ の細胞は、１５％牛血清（ＦＢＳＩを補給された基本培地Ｅａｇｌｅ　（ＢＭＥ Ｉに維持された。ＪＥＧ−３ヒト絨毛癌の細胞は、１０％ＦＢＳを補給されたＤ ｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇ１ｅ培地（ＤＭＥＭ）に維持され、そしてＨｅｐＧ ２ヒトへバトーマ細胞は、１０％ＦＢＳを補給された５０：５０ＤＭＥＭ　Ｈａ ｍのＦ１２に維持された。全ての培地は、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）及び 硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ、ＧｒａｎｄＩｓｌ ａｎｄ、ＮＹ）を補給された。トランスフェクションに使用される全てのＤＮＡ は、標準の方法に従って、アルカリ性溶解により調製され、そしてＣｓＣ１勾配 に二重バンドされた。細胞は、以下の燐酸カルシウム沈降法によりトランスフェ クションされた。細胞は、トリプシン処理され、そして１００ｍｍプレート当り ２Ｘ１０’個の細胞で置がれるか（ＩＯＴＩ／２及び２３Ａ２の細胞）、又は５ ０％集密的プレートから〜１：１０で通過された（ＪＥＧ−３及びＨｅ　ｐ　Ｇ 　２の細胞）。

次の日に、細胞に新鮮な培地を供給し、そして３時間後燐酸カルシウムーＤＮＡ 共沈降物４１００ｍｍ皿当り１ｍＬ）を加えた（ｏ、８、ｐモルのテストベクタ ー、ベクター担体ＤＮＡにより２５μｇにした）。約１６−１８時間後、沈降物 を取り出し、細胞をＦＢＳなしの基本培地で結融解により溶解した。細胞抽出物 のＣＡＴ酵素活性は、’Ｈをラベルしたクロラムフェニコール（３１，２Ｃｉ／ ｍ−モル、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）及びＮ−ブヂリル補＃素 Ａ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕ　ｉｓ、ＭＯ）により、５ｅｅｄら、Ｑ ｅｎｅ、６７．２７１（１９８Ｂ）により記述されたように、キシレン抽出法に よって定量された。等量の蛋白Ｎ５ｉｏＲａｄ蛋白キツトにより測定されるとき １５−２５μｇ、並びに標準として牛血清アルブミン）並びに１時間の反応時間 を全てのＣＡＴアッセイに使用し、それは、全ての値をアッセイの１１！線範囲 に維持した。１５μｇの蛋白による代表的な実験では、ブチリル３ＨりＦ１ラム フェニコールへの３Ｈをラベルしたクロラムフェニコールの１％転換は、シンチ レーション計数により測定して〜４５０００ｃｐｍであった。

ＣＡＴコンストラクトを図２に示す。コンストラクトは、以下の方法により製造 した。ｐＵＣ１８のＮｄｅ　１−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントの欠失によりｐ 　Ｂ　Ｌ　ＣＡ　Ｔ　２　ｆ　Ｌ　ｕ　ｃ　ｋ　ｏ　ｗら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ− ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１５．５４９０　（１９８７））から由来するｐｔ　ｋ 、　ＣＡ　ＴΔＥＨを、全てのトランスフェクションの実験に使用した。

同様なＣＡＴ活性ベクターは、又例えばＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　（Ｍ ａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から市販されており、そしてここで使用されるベクターに 代りつる。全てのクローニングのやり方は、標準の方法によった。ｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈから入手可能な広い ｐＵＣ誘導体）配列欠失から由来するｍｙｏＤプロモーターを含む２．８ｋｂフ ラグメントは、Ｓａｃ　Ｉによる消化、次にＫｐｎ　Ｉによる部分的消化により 生じ（両者の部位は、ｐＢ］、ｕｅ−ｓｃｒｉｐｔベクターのマルチクローニン グ部位から由来）、そしてＸｂａ　Ｉ及びＢｇｌ’　ＩＩによる消化後ｐｔｋＣ ＡＴΔＥＨ中に平滑末端連結した（それにより−１０５から＋５１の全てのＨ８ Ｖｔｋプロモーター配列を除いた）。得られたコンストラクトは、ｍｙｏＤ遺伝 子のＥｃｏ　Ｒ１部位〜２．５ｋｂ５’　（図ＩＡ参照）からＴＡＴＡボックス に関する＋１９８（翻訳の開始に関してヌクレオチド−３７、配列１．Ｄ、Ｎｏ 、１参照）に延びるヒトの配列の〜２．７ｋｂを含む。

−２４ＣＡＴ：ｌンストラクトは、ＮｏｔＩによるｃｈＭＤ−１３の消化、次に ＥｃｏＲｌによる部分的開裂により生じた。部分的開裂生成物は、０．６％アガ ロースゲル上でサイズ分画され、そして約２Ｏ−２５ｋｂのフラグメントはゲル 精製され、そしてＮｏｔＩにより消化され次にＥｃｏＲｌにより部分的に消化さ れた−２．５ＣＡＴ中に指向的にクローンされた（−２，５ＣＡＴのベクター配 列は二つのＥｃ　ｏＲ１部位を含む）。得られたクローンは、端部ＮｏｔＩ部位 から＋１９８までの連続的ヒト配列を含んだ。フラグメント２−８は、ＮｏｔＩ 及びＥｃｏＲｌによりｃｈＭＤ−１３を消化しそしてユニークＸｂａｉ部位中に フラグメントを平滑末端連結することにより−２，５ＣＡＴのＸｂａ１部位中の クローンされた（図２参照）。フラグメント３は、ユニークＢａｍＨ１部位中へ の平滑末端連結によりｔｋプロモーターの上流の両方の配向にクローンされた（ Ｆ３／１ｋＣＡＴ及びＦ３’　／１ｋＣＡＴ）。−２４ΔＦ３ＣＡＴコンストラ クトは、ＥｃｏＲ１連結のゲル精製及びサイズ選択消化生成物により一２４ＣＡ Ｔを部分的に消化し、そしてフラグメント３のみを失ったクローンについてのコ ロニーハイブリッド形成によりスクリーニングすることにより生じた。

図２に示されるように、−２，５ＣＡＴ及び−２４ＣＡＴは、過渡的トランスフ ェクションアッセイでテストされた最小量及び最大量のヒトｍｙｏＤ５’配列を 有するＣＡＴリポータ−遺伝子コンストラクトに関する。−２，５ＣＡＴのこれ らの配列は、ｍｙｏＤの〜２．５ｋｂ上流のＥｃｏ１１部位からＴＡＴＡボック スに関する＋１９８に延びる（配列ＩＤＮｏ、１参照）。ｃｈＭＤ−１３のフラ グメント２−８（図ＩＡ参照）は、図２に示されるように、−２，５ＣＡＴのＸ ｂａＩ部位中にクローニング後転写増大活性についてテストされた。

過渡的トランスフェクションアッセイの結果は、図３に示される。ｍｙｏＤプロ モーター領域を含むコンストラクト（−２，５ＣＡＴ、図２）が、プロモーター のないＣＡＴコンストラクト（ＰｏＣＡＴ）より５−１０倍大きいＣＡＴ活性を 生ずることが分る。−２，５ＣＡＴ活性は、他のプロモーター即ちヘルペスウィ ルスチミジンキナーゼｆＨ３Ｖｔｋ）プロモーターが使用されるとき達成された ＣＡＴ活性の〜２０％を構成した（データは示さず）。その上、フラグメントＦ ２又はＦ４−Ｆ８の−２，５ＣＡＴへの添加は、ＣＡＴ活性に有意な増加を生じ なかった。

しかし、フラグメントＦ３が−２，５ＣＡＴに加えられたとき、ＣＡＴ活性は、 プロモーター単独より〜１０倍刺激された。事実、そのコンストラクトの活性は 、フラグメントＦｌ−Ｆ８の全てを含む一２４ＣＡＴ’の活性よりもさらに大き かった（図２）。Ｆ３フラグメントは、Ｆｌ−Ｆ８を含むがＦ３を欠＜ＣＡＴコ ンストラクト（−２４ΔＦ３ＣＡＴ）の構築を通してＣＡＴの発現のために必須 であることが示された。このコンストラクトは、上記のｍｙｏＤプロモーターと 同様にＣＡＴ活性を刺激した（図３）。

それ故、ｍｙｏＤ増加活性は、ｍｙｏＤの５′末端の１８−２２ｋｂのフラグメ ント（フラグメント３、図ＩＡ）で定量的に回収された。ｍｙｏＤプロモーター の活性の増加に加えて、フラグメント３もＨ５Ｖｔｋプロぞ一夕一の活性を増大 することが分り、そして両方の配向で等しく有効であった。さらに、何れの配向 のフラグメント３は、プロモーターのないＣＡＴコンストラクトのパックグラウ ンドＣＡＴ活性を示すに過ぎず、フラグメント３がプロモーター活性を有しない ことを立証した。

ｍｙｏＤが骨格筋で排他的に発現されるので、ｍｙｏＤ転写コントロール要素の 筋肉特異性が研究された。ｌ０ＴＩ／２細胞は、非筋芽性であり、そしてｍｙｏ Ｄを発現しないが、胚芽性調節ｃＤＮＡの強制的発現によりモしてゲノム遺伝子 座ｍｙｄのトランスフェクションにより、５−アザシチジンによって胚芽性細胞 に転換される。ｍｙｏＤプロモーター及びエンハンサ−１並びに全２４ｋｂの５ ′フランキング配列は、２３Ａ２筋芽細胞においてｌ０ＴＩ／２細胞と同様に活 性があった。安定なトランスフェクションアッセイにおいて、これらのコントロ ール要素も、ｌ０ＴＩ／２及び２３Ａ２細胞において同様な活性を示した。

種々の細胞系を、ｍｙｏＤプロモーター及びエンハンサ−を発現するそれらの能 力で非筋芽性細胞の中で多能性１０ＴＩ／２細胞がユニークであるかどうかを決 定するためにテストされた。これらは、Ｌｔｋ細胞、３種のｌ０ＴＩ／２由来脂 肪細胞系、ＢＮＬ肝細胞、ＨｅｐＧへバし−マ細胞及びＪＥＧ−３Ｍ毛癌細胞を 含んだ。ｍＶｏＤエンハンサ−及びプロモーターは、ＪＥＧ−３細胞を除いてこ れらの細胞系の全てで活性を有した。活性は、ＨｅｐＧ２細胞では比較的低いが 、他の細胞系では２３Ａ２筋芽細胞のそれど同様であった。同様に、レジデント ヒトｍｙＯＤ遺伝子は、染色体１１が一次ヒト繊維芽細胞から種々の組織培養細 胞系に転移されるとき、活性化された。周知のヘリックス−ループ−へリックス 筋芽性調節蛋白を全く発現しない、これらの非筋芽性細胞中のｍｙｏＤエンハン サ−及びプロモーターの発現は、それらの活性が、ヘリックス−ループーへリッ クス筋芽性蛋白群のメンバーによる自動活性化又は交差活性化に依存しないこと を示す。

実施例　３ ｍｙｏＤ転写コントロール要素の生体内胚芽細胞の特異性ｍｙｏＤ転写コントロ ール要素は、非筋芽性培養細胞で活性を有するが、生体内で胚芽細胞にとり特異 的であること−が分った。この生体内特異性を決めるために、２種の１ａｃＺリ ポータ−遺伝子コンストラクトをトランスジェニックマウスの胚でテストした。

１ａｃＺベクター即ちりＰＤ４６．２１を、トランス遺伝子の構築に使用した。

ｐＰＤ４６．２１は、それが５ｕｐ−７遺伝子を欠いていることを除いて、ｐＰ Ｄｌ、２７　ＣＦｉｒｅら、Ｇｅｎｅ、９３．１８９（１９９０））と同じであ る。それは、１ａｃＺからちょうど上流で開始コドン及びＳＶ４０抗Ｎ核局在信 号、並びに１ａｃＺの下流でＳＶ４０初期領域からのポリアゾニレ−ジョン配列 を含む。同様な１ａｃＺリポータ−コンストラクトは、市販されており（例えば 、ＰｒＯｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、そしてここで使用 される１ａｃＺコンストラクトを置換できる。−２，５１ａｃＺ及びＦ３’　／ −２，５１ａｃＺベクターは、フランキング５ａｌＩ及びＸｈｏＩ部位で−２， ５ＣＡＴ及びＦ３’　／−２，５ＣＡＴを消化し、そしてｐＰＤ４６２１の５゛ ポリリンカーの５ａｌＩ部位中にゲル精製フラグメントをクローンする（それに よりＸｈｏＩ部位を破壊する）ことにより構築された。−２，５１ａｃＺ及びＦ ３’　／−２，５１ａｃＺベクターは、２３Ａ２筋芽細胞中への過渡的トランス フェクション後、それぞれ微弱又は強い核局在Ｍ号を生じた（データは示さず） 。注射のためのＤＮＡは、ＮｏｔＩにより消化されてｐＵｃ１９配列を除き、そ して１ａｃＺ融合は、アガロースゲル上で精製された。市販の同系繁殖橿ＦＢＶ ／Ｎの受精卵の前核中へのプラスミドのない１ａｃＺ融合遺伝子の顕微注射ｎｇ 　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ、Ｙ、（ １９８６）ｉＭ、５ｈａｎｉ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６．２６２４　（ １９８６１参照。受精後（ｐ、−ｃ。）１１．５日の胚を、Ｏ，１Ｍホスフェー ト緩衝液、ｐＨ７，４中の１％バラホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデ ヒド中で３０−６０分間染色した。洗浄後、胚を、５ａｎｅｓら、ＥＭＢＯＪ、 ５．３１３３（１９８６）の方法に従ってβ−ｇａｌについて染色した。顕微鏡 写真法に従って、胚をパラフィンに埋め、８μｍに連続切片し、そして切片をニ ュクレアファーストレッドにより逆染色した。

プロモーター／　１　ａ　ｃ　Ｚ　：）ンストラクト（−２，５１ａｃＺ）は、 １ａｃＺの上流でクローンされたｍｙｏＤ遺伝子の５′末端で２．５ｋｂのヒト 配列を含んだが、他（Ｆ３’　／−２，５１ａｃＺｌは、２．５ｋｂのフランキ ングＤＮＡ、並びにアンチセンス配向でクローンされた上流のエンハンサ−フラ グメントを含んだ、−２，５１ａｃＺコンストラクトは、前核注射により９個の 胚中に導入された。全封入及び連続切片の胚を、ｐ、ｃ、１１．５日にβ−ガラ クトシダーゼ（β−ｇａ’ｌｌ活性について分析し、そのとき、体部、篩筒及び 腔部の胚芽性細胞が先ず高濃度でｍｙｏＤ転写物を発現する。−２，５１ａｃＺ を注射されたマウスの胚のいずれも体部、腔部又は胚芽性細胞の全ての他の集ま りにおいて１ａｃＺの発現を示さなかった。

Ｆ３’　／−２，５１ａｅＺを注射された１４個の胚の４個は、］、ａｃＺ発現 細胞を含んだ。４個全ての胚では、このトランス遺伝子が、その場の分析により 示される各骨格筋形成領域からの細胞で活性化されて、内在性ｍｙｏＤ遺伝子を 発現した。これらの肚の最も顕著な特徴は、体部及び肢贅の強い染色であった。

体部の染色は、胚の中心軸に沿ってβ−ｇａｌ陽性細胞の体部のパターンを生じ た。３個の胚の組織学的切片の観察は、体部１ａｅＺ染色は、体部の筋部区画に おける細胞に限定されることを立証した。ｐ、ｃ、１１．５日において、１ａｃ Ｚ発現細胞は、２０−２５個の最も吻の体部のみの筋部に観察され、１ａｃＺ発 現は、後肢のレベル又はその尾側の付近の体部に検出されなかった。後の段階で 、全ての体部の胚は、１ａＣＺトランス遺伝子を発現した。これは、１ａｃＺ発 現の嘲罵側の勾配を明らかに限定し、それは、ｍｙｏＤ及び池の胚芽性調節因子 に関する転写物蓄積の勾配に相当し、体部の形成及び成熟の嘲罵配列を反映する 。１ａｃＺ）ランス遺伝子は、腹から背の配列で活性化されるようである。それ は、１ａｃＺ発現細胞が、より成熟していない尾の体部における腹側の筋部に限 定されるが、さらに成熟した腹側の体部における腹−背筋節の軸全体に存在する からである。

全ての４個の１ａｃＺ陽性胚は、前及び後の腔部の両者の基部領域におけるβ− ｇａ１発現細胞を含んだ。これらの細胞は、腹及び背の前筋肉の集まりに局在し 、それは、肢の骨格の筋組織を生ずる。前肢は、トランス遺伝子を発現する細胞 の大きな集まりを含み、一方後肢は殆ど１ａｃＺ発現細胞を含まなかった。成長 する腔部の筋芽細胞は、体部す皮膚動節かも由来するので、後の腔部における１ ａｃＺ発現細胞のより小さい集まりは、前肢のレベルの吻側の体部に比較して後 肢のレベルの体部の初期の成長段階を恐らく反映している。

１ａｃＺ発現細胞は、又識号で観察され、染色された細胞のパッチ又は背腹の配 列として全封入で明らかであった。組織学的切片では、染色された細胞の群は、 識号の開票に見出され、中心及び周辺に局在する集まりに組織化された。ｍｙｏ Ｄに関する転写物、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、Ｍｙｆ−５は、識号のこ れらの領域にともに局在化し、そ炎中の横隔膜の仮定の筋肉は、β−ｇａｌにつ いて強く染まる。１ａｃＺトランス遺伝子は、ｍｙｏＤを発現しない筋肉のタイ プである平滑筋及び心筋では発現しなかった。この１ａＣＺトランス遺伝子を有 する安定なトランスジェニック系は、１ａｃＺ発現の同じ骨格筋特異的パターン を与えた。これらのトランスジェニックデータは、ｍｙｏＤ転写コントロール要 素をともに構成するｍｙｏＤエンハンサ−及びプロモーターは、それによりｍｙ ｏＤ発現が調節されるＤＮＡ要素であることを立証する。

実施例　４ ウズラｍｙｏＤ　（ｑｍｆ　１）転写コントロール要素の隔離及びクローニング ウズラｑｍｆｌ遺伝子の発現を調節するエンハンサ−要素は、同定されそしてク ローンされた。ｑｍｆｌ　ＤＮＡクローン（ｇＣ１０８３）ｆｄｅ　ｌａ　Ｂｒ ｏｕｓｓｅら、前出）を使用して、ウズラ筋芽性−次筋繊維ＤＮＡの部分的Ｍｂ ｏ　１制限フラグメントのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、Ｂａ ｍＨｌ？ｌ！１化ラムダＥうＢＬ３アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結し 、そして細菌菌株Ｌ　Ｅ　３９２に置いた。合計約４０００００個の一次ブシー クをスクリーニングし、そして２個の陽性のクローンを隔離し、それらをｑｍｆ ｌ遺伝子の５”上流配列のみを含むゲノムフラグメントに非常に厳しい条件（前 ハイブリッド形成及び洗浄に６５℃）下でハイブリッド形成した。これらのクロ ーンの内１個が、既にマツプしたラムダＣｈａｒｏｎ４Ａクローンｆｄｅｌａ　 Ｂｒｏｕｓｓｅら、前出）に似ていることが分り、一方他のものは、ｑｍｆ　１ 遺伝子の第一のエキメン領域でのみそのクローンと重複していることが分った。

ｇｃ１１２０と呼ばれるこの後者のゲノムクローンの制限マツピングは、それが ５°ｑｍｆ　１上流領域の大体１８ｋｂを含むことｉ示した。ｇｃ１１２０の制 限マツプは、図４に示される。

ｇｃｌ１２０の制限フラグメン］・の大体のサイズ（ｋｂ）は、以下の通りであ る。Ｒ１，６，１、Ｒ２，２，０、Ｒ３，４，５、Ｒ４，１，７、Ｒ５，０，７ 、Ｒ６，４，１、Ｒ７，０，８，’″Ｒ８，６，５、Ｒ９，４゜１、Ｐｌ、０． ７、Ｒ２，１，８、Ｒ３，２，２、Ｒ４，１，４゜実施例　５ 培養した胚芽性細胞におけるｑｍｆ　１調節転写コントロール要素の転写コント ロール活性の測定 実施例４に記載されたｑｍｆ　１上流領域の転写活性は、実施例１に記載された 方法に従ってアッセイされたが、但し、ウズシー次筋芽細胞が、２３Ａ２筋芽細 胞及びｑｍｆｌプロモーターが使用される代りに、ｑｍｆｉ−ＣＡＴリポータ− 遺伝子フンストラクトのトランスフェクションに利用された。

ＣＡＴコンストラクトに関して、ヘルペスウィルスＴＫプロモーター（ｐ　Ｔ　 Ｋ　ＣＡ　Ｔ△Ｅ　）（ｌに結合したＣＡＴ遺伝子は、図４に示されたｑｍｆｉ 制限フラグメントのそれぞれに結合した。各制限フラグメントの転写エンハンサ −活性は、３７℃で毎時１０μｇの蛋白当りのブチリル−１Ｈ−クロラムフェニ コールへのＳＨ−クロラムフェニコールの転換％どして報告された細胞抽出物の ＣＡＴ活性を測定することによりテストされた。

過渡的トランスフェクションアッセイの結果は、図５に示される。Ｒ１又はＲ３ の制限フラグメントを含むコンストラクトが最大のＣＡＴ活性を生じ、ＴＫプロ モーターのみに結合したＣＡＴ遺伝子より１２−２０倍大きいことが分る。図２ から分るように、Ｒ１９ｉ域は、ｑｍｆ　１遺伝子から大体１１．５−１５ｋｂ 上流であり、配列１．Ｄ、Ｎｏ、３としてここに同定される２、２ｋｂ配列に位 置する。

実施例　６ ウズラＭｙｏＤ　（ｑｍｆ　１）転写コントロール要素の生体内筋芽細胞の特異 性 ｑｍｆｌエンハンサ−の生体内の特異性を調べるために、前記のＲ３制限フラグ メントを含む１ａｃＺリポータ−遺伝子コンストラクトを、実施例３に記載され た方法に従って、トランスジェニックマウスの肚でテストした。トランスジェニ ックマウスに使用されるＲ３　１ａｃＺプラスミドは、先ずＰＤ４６．２１の５ ａｌＩ／ＸｂａＩ部位中にｑｍｆ１プロモーターを含む２．４ｋｂＳａｌＩ／Ｘ ｂａＩフラグメントをクローニングすることにより構築された。２．２ｋｂ　Ｒ ３フラグメントは、次にｑｍｆ　１プロモーターに隣接するＰｓｔＩ部位中にク ローンして、最終のＲ３−ｑｍｆ　１−１ａｃＺコンストラクトを生じた。この コンストラクトは、実施例３に記載されたように利用された。

ｑｍｆｌエンハンサ−は、実施例３に記載されたヒトｍｙｏＤエンハンサ−につ いて観察されたのに似たしかし正確に同じではないやり方で、トランスジェニッ クマウスの肝における１ａｃＺ発現をコントロールすることが分った。ｑｍｆ　 １エンハンサ−は、トランスジェニックの胚において９日までに吻側の体部の筋 部における１ａｃＺリポータ−遺伝子の発現を導き、一方ヒトｍｙｏＤエンハン サ−は、筋部において後で発現を導く（即ち１０−１０．５日まで）ことが分っ た。ｑｍｆ　１エンハンサ−は、胚芽で１２．５日までに発現され、それは、１ ０−１０．５日で発現するヒトｍｙｏＤエンハンサ−より後である。体部におけ るｑｍｆｌの初期の発現は、中心の篩筒細胞に局在し、そして活性化は吻−背の 進行で進む。ヒトｍｙｏＤエンハンサーコントロール１ａｃＺの後の活性化は、 先ず体部の腹側領域における顕著な染色を伴う前肢の腔部のレベルで生ずる。次 の発現は、より前の体部で生じ、それは、残りの体部にお゛けるよりもより背の 活性化を示す。ｑｍｆｌ増大１ａｃＺとは対照的に、ヒトエンハンサ−は、中心 の筋部筋肉に主として発現を導かないことが分った。従って、ｑｍｆ　１及びヒ トのｍｙｏＤエンハンサ−は、体部及び四肢における発現の異なる成長のタイミ ング及び体部における異なる空間発現を有する。空間発現のこれらの相違は、胚 の異なる筋肉を生ずる胚芽性細胞の異なる系統の形成を反映しているようである 。

しかし、ｑｍｆｌ及びヒトの両者のｍｙｏＤ発現は、体部の初期の胚の胚芽性系 列に制限される。

本発明の成る態様は、好ましい態様として上計に記述されそして例示されたが、 種々の他の態様は、前記の記述から当業者に明らかであろう。

それ故、本発明は、前記で特に記述されそして例示された態様に限定されず、請 求の範囲から逸脱することなく変化及び修飾しつるものである。

Ｆ工Ｇ℃ａ℃Ｅ　ＩＡ− ｃｈＭＤ−１３ Ｆ工ＧＵＲＥ　２ Ｆ工ＧＵＲＥ　３ Ｆ工ＧＵＲＥ　５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ａ 　９４５３−４ＢＩ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．培養された細胞及び培養されていない筋芽性細胞においてエンハンサー活性 を有する隔離されたＤＮＡセグメントにおいて、該ＤＮＡセグメント及び標的遺 伝子がＤＮＡ鎖内に配置され、そして該ＤＮＡセグメントが該標的遺伝子に関し て５′方向に位置して標的遺伝子の発現の増大を行わせるとき、該エンハンサー 活性は該標的遺伝子の発現を増大させる、隔離されたＤＮＡセグメント。
2. ２．該標的遺伝子の５′方向の１００キロベース（ｋｂ）内に位置する請求項１ の隔離されたＤＮＡセグメント。
3. ３．該標的遺伝子の５′方向の１０ｋｂ−３０ｋｂの間に位置する請求項２の隔 離されたＤＮＡセグメント。
4. ４．ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白をエンコーディングした遺伝子の５′方向に隣接す る１００ｋｂ領域から隔離された請求項１の隔離されたＤＮＡセグメント。
5. ５．該ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白がＭｙｏＤ蛋白である請求項４の隔離されたＤＮ Ａセグメント。
6. ６．該ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白をエンコーディングした該遺伝子がヒトｍｙｏＤ である請求項４の隔離されたＤＮＡセグメント。
7. ７．該ヒトｍｙｏＤ遺伝子から５′方向に大体１８−２２ｋｂの領域から隔離さ れた請求項６の隔離されたＤＮＡセグメント。
8. ８．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２と実質的に同じヌクレオチド配列を有 する請求項６の隔離されたＤＮＡセグメント。
9. ９．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２の塩基１−１５８と実質的に同じヌク レオチド配列を有する請求項６の隔離されたＤＮＡセグメント。
10. １０．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２の塩基１１８５−１７５７と実質的 に同じヌクレオチド配列を有する請求項６の隔離されたＤＮＡセグメント。
11. １１．該ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白をエンコーディングした該遺伝子がウズラｑｍ ｆ１である請求項４の隔離されたＤＮＡセグメント。
12. １２．該ｑｍｆ１遺伝子から５′方向に大体１１．５−１５ｋｂの領域から隔離 された請求項１１の隔離されたＤＮＡセグメント。
13. １３．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．３と実質的に同じヌクレオチド配列を 有する請求項１１の隔離されたＤＮＡセグメント。
14. １４．請求項１のＤＮＡセグメントを含むベクター。
15. １５．請求項１４のベクターにより形質転換された又はトランスフェクションさ れた原核又は真核宿主細胞。
16. １６．請求項１のＤＮＡセグメントとハイブリッド形成可能な配列を有するアン チセンスオリゴヌクレオチド。
17. １７．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２と実質的に同じヌクレオチド配列を 有する、ヒトｍｙｏＤ遺伝子に対して５′方向に隣接する大体２５．５ｋｂフラ グメントから隔離され精製されたＤＮＡセグメント。
18. １８．請求項１７のＤＮＡセグメントを含むベクター。
19. １９．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２の塩基１−１５８と実質的に同じヌ クレオチド配列から本質的になる請求項１７のＤＮＡセグメント。
20. ２０．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２の塩基１１８５−１７５７と実質的 に同じヌクレオチド配列から本質的になる請求項１７のＤＮＡセグメント。
21. ２１．ここに記載した配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．３と実質的に同じヌクレオチド配列を 有する、ウズラｑｍｆ１遺伝子に対して５′方向に隣接する大体１８ｋｂフラグ メントから隔離され精製されたＤＮＡセグメント。
22. ２２．請求項２１のＤＮＡセグメントを含むベクター。
23. ２３．培養された細胞においてエンハンサー活性を有する隔離されたＤＮＡセグ メントにおいて、該エンハンサー活性は、該ＤＮＡセグメント及び標的遺伝子が ＤＮＡ鎖内に配置され、そして該ＤＮＡセグメントが該標的遺伝子に関して５′ 方向に位置して標的遺伝子の発現の増大を行わせるとき、該標的遺伝子の発現を 増大させるものであり、該ＤＮＡセグメントは、 ａ）ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白をエンコーディングした遺伝子の１００ｋｂ内の５ ′方向に配置されたＤＮＡ配列を含む少なくとも１個のテストセグメントを入手 し、前記の少なくとも１個のテストセグメントの１個又はそれ以上は該エンハン サー活性を有するものと予想され、ｂ）テストコンストラクトのセットを作り、 それぞれの前記のテストコンストラクトは、一つの該テストセグメント、リポー ター遺伝子及び培養した真核細胞で発現するように適合したベクターを含み、該 テストセグメント及び該リポーター遺伝子は、互いに関してしかも該ベクターの 調節配列に関して位置して、該リポーター遺伝子の発現、並びにもし存在するな らば該テストセグメントの前記の増大する活性を生じさせ、ｃ）リポーター遺伝 子及び培養した真核細胞で発現するように適合したベクターを含むコントロール コンストラクトを作り、該リポーター遺伝子は、該ベクターの調節配列に関して 位置して、該リポーター遺伝子の発現を行わせ、 ｄ）該リポーター遺伝子の発現を行わせる条件下で培養した真核細胞中にそれぞ れの該テストコンストラクト又は該コントロールコンストラクトを導入し、該発 現は、該発現に相関可能な量で検出可能な生成物の形成を生じさせ、 ｅ）該コントロールコンストラクトを含む前記の培養した真核細胞に形成された 検出可能な生成物の前記の量に対する該テストコンストラクトを含む前記の培養 した真核細胞に形成された検出可能な生成物の前記の量の比を決め、該比の大き さは該テストセグメントにより有すると思われる該エンハンサー活性を指示し、 ｆ）該エンハンサー活性を有するそれぞれの該テストセグメントを同定し、それ により該エンハンサー活性を有する該ＤＮＡセグメントを隔離する ことよりなる方法により隔離されるＤＮＡセグメント。
24. ２４．特に生きている動物の筋芽性細胞においてエンハンサー活性を有する隔離 されたＤＮＡセグメントにおいて、該エンハンサー活性は、該ＤＮＡセグメント 及び標的遺伝子がＤＮＡ鎖内に配置され、そして該ＤＮＡセグメントが該標的遺 伝子に関して５′方向に位置して標的遺伝子の発現の増大を行わせるとき、該標 的遺伝子の発現を増大させるものであり、該ＤＮＡセグメントは、 ａ）ｂＨＬＨ筋芽性調節蛋白をエンコーディングした遺伝子の１００ｋｂ内の５ ′方向に配置されたＤＮＡ配列を含む少なくとも１個のテストセグメントを入手 し、前記の少なくとも１個のテストセグメントの１個又はそれ以上は該エンハン サー活性を有するものと予想され、ｂ）テストコンストラクトのセットを作り、 それぞれの前記のテストコンストラクトは、一つの該テストセグメント、リポー ター遺伝子及び脊椎動物の胚の細胞における該リポーター遺伝子の発現に必要な 調節配列を含み、該テストセグメント及び該リポーター遺伝子は、互いに関して しかも該調節配列に関して位置して、該リポーター遺伝子の発現、並びにもし存 在するならば該テストセグメントの前記の増大する活性を生じさせ、 ｃ）該リポーター遺伝子の発現を行わせる条件下で前記の脊椎動物の胚の細胞中 にそれぞれの該テストコンストラクトを導入し、該発現は、該発現に相関可能な 量で検出可能な生成物の形成を生じさせ、ｄ）もし存在するならば、前記の脊椎 動物の胚のどの細胞が前記の検出可能な生成物を形成するかを決定し、前記の脊 椎動物の胚の筋芽性細胞に特異的な前記の検出可能な生成物の形成は、該エンハ ンサー活性を指示するものであり、 ｅ）該エンハンサー活性を有するそれぞれの該テストセグメントを同定し、それ により該エンハンサー活性を有する該ＤＮＡセグメントを隔離する ことよりなる方法により隔離されるＤＮＡセグメント。