ES2204980T3

ES2204980T3 - Nuevo promotor y metodo de expresion de genes que lo utiliza.

Info

Publication number: ES2204980T3
Application number: ES96110512T
Authority: ES
Inventors: Nobuto Koyama; Eiji Miyoshi; Yoshito Ihara; Atsushi C/O Mr. Kiyohiro Ogawa Nishikawa; Naoyuki Taniguchi
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2016-06-28
Also published as: EP0753579A2; US5827687A; KR100455004B1; KR970001543A; CN1145951A; EP0753579A3; EP0753579B1; DE69629767D1; CN1105188C; DE69629767T2

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE UN ADN QUE TIENE ACTIVIDAD PROMOTORA EN UNA CELULA ANIMAL, UN METODO PARA EXPRESAR UN GEN UTIL QUE USA DICHO ADN ASI COMO UN METODO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA EN UNA CELULA ANIMAL UTILIZANDO DICHO ADN. EN PARTICULAR SE PROPORCIONA UN METODO PARA PRODUCIR UN PRODUCTO DE GEN DESEADO, EN UNA GRAN CANTIDAD, EN UNA CELULA ANIMAL.

Description

Nuevo promotor y método de expresión de genes que lo utiliza.

El presente invento se refiere a un nuevo promotor y a un método para expresar un gen usando el nuevo promotor. Específicamente, el invento se refiere a un ADN que comprende el promotor nuevo que es capaz de funcionar en células animales y a un método para producir una proteína usando un vector en el que se inserta un ADN obtenido ligando un gen útil aguas abajo del promotor. También, el presente invento se refiere a un método para expresar un gen útil, que comprende ligar el gen útil aguas abajo del promotor, e introducir el ADN resultante o un vector que lleva el ADN resultante en una célula animal.

Cuando se usa un hospedante microbiano, tal como la Escherichia coli, Bacillus subtilis o levadura, para producir un producto génico útil de origen animal mediante tecnología de ingeniería genética, la expresión génica está frecuentemente impedida. La obtención de la actividad deseada está frecuentemente impedida debido a una conformación errónea, una modificación postraduccional errónea, etc. de la proteína del producto génico. Para tratar este problema, se usan con frecuencia células animales como hospedantes, en cuyo caso la selección del promotor afecta significativamente la eficacia de expresión. Los promotores convencionales para células animales de uso común incluyen el promotor SV40, el promotor del citomegalovirus y el promotor de actina.

Cuando se va a producir una gran cantidad de un producto génico útil usando una célula animal como el hospedante, los promotores usados convencionalmente para células animales no son satisfactorios en términos de actividad de transcripción. Por tanto, ha sido muy solicitado el desarrollo de promotores más potentes.

Consecuentemente, el problema técnico subyacente del presente invento es el de proporcionar un ADN con una actividad promotora alta como un promotor para células animales así como un método para expresar un gen útil usando tal promotor.

Este problema técnico se soluciona mediante las realizaciones reflejadas en las reivindicaciones.

A saber, el presente invento está basado en el hallazgo de que existe un promotor potente aguas arriba del gen humano N-acetil glucosaminiltransferasa III (GnT-III humano).

La ligación de dicha secuencia promotora aguas arriba del gen Photinus luciferase, y la expresión del gen muestra que el promotor tiene una actividad mucho mayor que los promotores convencionales para células animales.

Así, en una realización, el presente invento se refiere a un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(a): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:1, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal

(b): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:2, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal

(c): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal

(d): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:4, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal; y

(e): una secuencia de ADN capaz de hibridar con cualquiera de los anteriores desde (a) hasta (d) que tiene una actividad promotora en una célula animal.

En otra realización, el invento se refiere a un ADN recombinante que comprende el ADN anterior y un gen útil operablemente unido a él, a un vector que comprende el ADN recombinante, a una célula hospedante en la que el ADN recombinante o el vector es introducido. En una realización preferida la célula hospedante es una célula animal. Además, el presente invento se refiere a un animal no humano que comprende la célula animal según el invento.

En otra realización, el invento se refiere a un método para producir una proteína y a un método para expresar un gen útil, usando el ADN recombinante del presente invento. Preferiblemente, tal método comprende el cultivo de una célula hospedante según el invento y, opcionalmente, la recuperación de la proteína producida a partir del cultivo.

Además, el presente invento se refiere al uso del ADN según el invento para la expresión de un gen útil operablemente unido a él en una célula animal. En una realización preferida, el gen es heterólogo con respecto al ADN.

La figura 1 indica la relación entre el ADN que comprende el promotor del presente invento (pPG204-1.1) y el cADN del gen humano GnT-III.

La figura 2 es un mapa de sitios para enzimas de restricción del inserto de pHug5'-204.

El término "promotor" como se usa aquí pretende incluir la caja TATA o una región similar, que está situada 20 a 30 pares de base aguas arriba del punto (+1) de iniciación de la transcripción y que funciona induciendo la ARN polimerasa para iniciar la transcripción en la posición correcta, pero no se limita a las porciones próximas a esta región. Además de esta región, otra región necesaria para la asociación de una proteína, distinta de la ARN polimerasa, puede estar presente para la regulación de la expresión. El término "región promotora" como se usa aquí se define como una región que contiene un promotor como se define aquí.

El término "actividad promotora" como se usa aquí significa que cuando un gen útil está ligado aguas abajo a un promotor en una manera tal que el gen es capaz de expresarse, y se introduce en un hospedante (célula animal), el hospedante muestra la capacidad y función de producir un producto del gen útil dentro o fuera del hospedante.

En general, la actividad promotora, o presencia o ausencia o potencia de un promotor particular, se determina mediante la ligación de un gen que codifica para una proteína fácilmente cuantificable (gen reportero) aguas abajo del promotor en un modo tal que el gen es capaz de expresarse, introduciendo el gen en un hospedante, y midiendo la cantidad de proteína expresada. Cuando un gen útil está ligado aguas abajo de un promotor en un modo tal que el gen es capaz de expresarse, e introducido en un hospedante, y cuando el producto de expresión del gen útil se confirma dentro o fuera del hospedante, se puede decir que el promotor tiene una actividad promotora en el hospedante en el que es introducido.

El término "célula animal" como se usa aquí pretende incluir, pero no está limitado a ello, células humanas, mientras el promotor del presente invento muestre actividad promotora en la célula animal. Tales células animales incluyen células de mamíferos no humanos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cabras, cerdos, bóvidos, caballos, perros, monos, y chimpancés), pájaros (por ejemplo, pollos, pavos, codornices, patos, y patos silvestres), reptiles (por ejemplo, serpientes, cocodrilos, y tortugas), anfibios (por ejemplo, ranas, salamandras, y tritones) y peces (por ejemplo, jureles, caballas, lubinas, besugos, meros, colas amarillas, atunes, salmones, truchas, carpas, ayus, anguilas, lenguados, tiburones, rayas, y esturiones).

El término "gen útil" como se usa aquí pretende incluir genes que codifican para una proteína capaz de expresarse en células animales, ADN antisentido o RNA antisentido de genes de origen de célula animal, señuelos, por ejemplo, una secuencia de ADN que contiene un gen que codifica una proteína de unión de un factor de transcripción de origen de célula animal o una secuencia de ADN que codifica para el sitio de unión del factor de transcripción y una secuencia similar, y ribozimas que corta al mRNA de origen de célula animal.

Los genes que codifican para una proteína capaz de expresarse en células animales incluyen, pero no se limitan a ellos, genes de origen animal. Mientras son capaces de expresarse en células animales, los genes derivados de microorganismos, tales como bacterias, levaduras, actinomicetos, mohos, ascomicotina y basidiomicetos, y aquellos derivados de organismos no microbianos, tales como plantas e insectos, están también incluidos en los genes útiles mencionados aquí.

El término "señuelo" como se usa aquí pretende indicar una secuencia de ADN que tiene un gen que codifica para una proteína de unión de un factor de transcripción de origen de célula animal o una secuencia de ADN que tiene una secuencia del sitio de unión del factor de transcripción o una secuencia similar, la secuencia de ADN de "señuelo" que es capaz de suprimir la acción del factor de transcripción cuando se introduce en una célula como "cebo".

El término "ribozima" como se usa aquí se define como una enzima que corta el mARN de una proteína particular para inhibir la traducción de la proteína. Una ribozima puede designarse a partir de la secuencia génica que codifica para una proteína particular. Por ejemplo, una riboenzima tipo cabeza de martillo puede ser preparada mediante el método descrito en el FEBS Letter, 228, 228-230 (1988). Además de las ribozimas de tipo cabeza de martillo, ribozimas del tipo horquilla, tipo delta u otros tipos se incluyen en el ámbito de las ribozimas mencionadas aquí, mientras corten el mARN de una proteína particular para inhibir la traducción de la proteína.

Uniendo de modo operable un gen útil aguas abajo del fragmento de ADN que posee una actividad promotora del presente invento, la expresión del gen útil se puede potenciar. La expresión del gen útil tiene lugar en células animales donde el fragmento de ADN que posee actividad promotora del presente invento puede ser introducido por medio de un vector o si usar un vector. Como vector, se usa preferentemente un vector plasmídico o un vector viral. En el caso en el que no se usa vector, el fragmento de ADN se puede introducir directamente mediante el método descrito en Virology, 52, 456 (1973), Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987), Journal of the National Cancer Institute, 41, 351 (1968), EMBO Journal, 1, 841 (1982), and BioTechniques, 6, 682 (1988). Las células animales que abrigan el fragmento de ADN del invento y los animales no humanos que tienen tales células animales se incluyen también en el alcance del invento. Los genes útiles cuya expresión se puede mejorar por el presente invento incluyen un ADN que codifica para una proteína, ADN antisentido, ARN antisentido, un polinucleótido que codifica para un señuelo, una secuencia nucleotídica que puede funcionar como un señuelo, y una ribozima. El presente invento también describe el método para producir una proteína deseada y el método para expresar un gen útil mediante el uso del fragmento de ADN que posee actividad promotora del presente invento.

El ADN del presente invento posee actividad promotora para células animales y contiene la porción entera o parcial de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:1 en el listado de secuencias. En otras palabras, el fragmento de ADN del presente invento es un fragmento de ADN que contiene un promotor nuevo y, mientras contenga dicho promotor, puede ser cualquier fragmento de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:1 o puede ser cualquier fragmento que contenga una porción de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:1. Tales fragmento de ADN incluyen, pero no están limitados a ello, los fragmentos de ADN de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, y SEQ ID NO:4, y los fragmentos de ADN que comprenden una porción del fragmento de ADN de SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:3 y fragmentos de ADN que contienen la porción entera o parcial de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:4. Los fragmentos de ADN capaces de hibridar con estos fragmentos de ADN, y que poseen actividad promotora en células animales, están también incluidos en el alcance del fragmento de ADN del presente invento.

El promotor del presente invento para células animales se descubrió como sigue:

El gen humano GnT-III, aislado de una librería de cADN hepatico fetal y de una librería cosmídica genómica por Ihara y otros [Journal of Biochemistry, 113, 692-698 (1993)], se usó para el presente invento. De los clones de cADN que codifican para el gen humano GnT-III, H15 y H20 (Patente Japonesa abierta No. 6-62865) que contiene cada uno una región 5' no traducible, y las secuencias de ADN de las dos regiones 5' no traducibles difieren las unas de las otras excepto por los 8 pares de bases aguas arriba del codon de iniciación esperado. Dos cósmidos, Hug3 y Hug5, se han obtenido como clones genómicos, del que Hug3 contiene la región codificante para el gen GnT-III y una región de alrededor de 35 kb aguas arriba de él.

Con esto en mente, se llevó a cabo hibridación mediante Southern, secuenciación de ADN, etc. del clon cosmídico Hug3 con las regiones 5' no traducibles del H15 y H20 como sondas, demostrando que H15 tiene exones alrededor de 29 kb (H15 exon-2) y 1 kb (H15 exon-1) aguas arriba del codon de iniciación, y que H20 tiene un exón alrededor de 26 kb (H20 exon-1) aguas arriba del codon de iniciación. También se llevó a cabo la amplificación rápida del extremo 5' del cADN (RACE) con mARN de cerebro humano como molde usando un cebador específico para el gen GnT-III, demostrando la presencia de mARN sin corte y empalme en una posición 7 pares base aguas arriba del codon de iniciación, donde tiene lugar el corte y empalme en H15 y H20. El cADN obtenido a partir de este mARN se designa como H204.

Estos hallazgos demuestran que hay al menos tres productos de transcripción del gen humano GnT-III. Puesto que los promotores implicados en la transcripción de H15, H20 y H204 se suponen presentes aguas arriba de H15 exon-2, aguas arriba de H20 exon-1 y aguas arriba del punto de iniciación de la traducción esperado en el genoma, respectivamente, la actividad promotora del fragmento de ADN que contiene estas regiones en las células COS1 se determinó con el gen Photinus luciferasa como un gen reportero. Como se muestra en la Figura 1 (las cajas son porciones de exón; las líneas de puntos son porciones de intrón), no se detectó actividad promotora alrededor del fragmento 3 kb (el plásmido que contiene este fragmento se designó como pPG20B) aguas arriba de H20 a partir del sitio HindIII en H15 exon-2 hasta el sitio SacII en H20 exon-1. Sin embargo, se detectó actividad promotora alrededor del fragmento 3 kb (el plásmido que contiene este fragmento se designó como pPG15) desde el sitio EcoRI aguas arriba de H15 hasta el sitio HindIII en H15 exon-2, y alrededor del fragmento 1,1 kb (el plásmido que contiene este fragmento se designó como pPG204-1.1) desde el sitio SphI aguas arriba de la región codificante hasta el sitio NaeI en la región codificante, es decir, el fragmento que contiene H204; el último se encontró que era alrededor de 10 veces más potente que el anterior y alrededor de 1,5 veces más potente que el promotor SV40.

Por otra parte, este fragmento de 1,1 kb contiene un sitio XhoI alrededor de 0,8 kb desde el sitio NaeI, un sitio SspI alrededor de 0,5 kb, y un sitio HincII a 0,2 kb; cuando pPG204-1,1 es digerido con una cualquiera de estas enzimas de restricción en combinación con BamHI, una enzima de restricción que tiene un sitio de corte en el sitio de clonaje múltiple del vector, un fragmento de 0,8 kb (fragmento A), un fragmento de 0,5 kb (fragmento B) y un fragmento de 0,2 kb (fragmento C), que contiene el codon de iniciación GnI-III, puede se recortado. Estos fragmentos se descubrió que eran 2-3 veces más potentes que el fragmento 1,1 kb arriba mencionado y 3-5 veces más potentes que el promotor SV40 en términos de actividad promotora. El presente invento demuestra así que los fragmentos de ADN que contienen una porción de alrededor de 0,2-1 kb aguas arriba del gen humano GnT-III que codifica para la región poseen una potente actividad promotora. El método de obtención del fragmento de ADN del presente invento se describe con detalle a continuación.

(1) Secuencia nucleotídica del fragmento de ADN que posee actividad promotora en células animales

Un clon genómico cosmídico que contiene una porción aguas arriba del gen humano GnT-III, por ejemplo, el clon cosmídico Hug3 de Ihara y otros, fue cortado con enzimas de restricción SphI y NaeI (ambas producidas por Takara Shuzo); un fragmento de ADN de1,1 kb que contiene una región inmediatamente aguas arriba de la región codificante para GnT-III es aislado. Este fragmento de ADN tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:1. Este fragmento se subclona en un vector plasmídico, por ejemplo, pUC19 (producido por Takara Shuzo), para facilitar su uso para la ligación con un gen útil y otros fines.

La secuencia nucleotídica del fragmento SphI-NaeI de 1,1 kb subclonado (pHug5'-204) se puede determinar mediante, por ejemplo, el método didesoxi [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74, 5463 (1977)]. Normalmente es difícil determinar la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN de 1,1 kb en una reacción única; para este propósito, están disponibles algunos métodos, incluyendo el método en el que el fragmento es digerido adicionalmente con enzimas de restricción apropiadas y subclonado, seguido por una reacción didesoxi, el método en el que una serie de plásmidos de delección se preparan usando exonucleasa III, seguido poruna reacción dideoxi, y el método en que los cebadores son sintetizados secuencialmente en base a las secuencias nucleotídicas conocidas, seguido de una reacción didesoxi. En el presente invento, el fragmento fue digerido adicionalmente con enzimas de restricción BstXI, XhoI, SspI, KpnI y HincII (mapa de enzima de restricción para los insertos pHug5'-204 se muestra en la Figura 2), subclonado, y sometido a reacción didesoxi, para determinar la secuencia nucleotídica de pHug5'-204 como se muestra en SEQ ID NO:1 del listado de secuencias.

Como se muestra en la Figura 2, este fragmento de 1,1 kb contiene un sitio XhoI alrededor de 0,8 kb desde el sitio NaeI, un sitio SspI alrededor de 0,5 kb y un sitio HincII a 0,2 kb. Cuando el pHug5'-204 es digerido con una cualquiera de estas enzimas de restricción en combinación con BamHI, una enzima de restricción que tiene un sitio de corte en el sitio de clonaje múltiple del vector, el fragmento de 0,8 kb (fragmento A) de SEQ ID NO:2 en el listado de secuencias, el fragmento de 0,5 kb (fragmento B) de SEQ ID NO:3 y el fragmento de 0,2 kb (fragmento C) de SEQ ID NO:4, que contienen todos el codon de iniciación GnT-III, se pueden recortar.

(2) Preparación del fragmento de ADN que contiene el promotor del presente invento

La aproximación más fácil a la preparación del fragmento de ADN que contiene el promotor del presente invento es la de recortarlo del cósmido o plásmido descritos anteriormente mediante digestión con enzimas de restricción SphI y NaeI (ambas producidas por Takara Shuzo), con digestión adicional con enzimas de restricción tales como XhoI, SspI y HincII según sea necesario. Otros métodos útiles incluyen digestión con otras enzimas de restricción, ultrasonicación, síntesis química mediante el método fosforamidita, y el método que usa la reacción polimerasa en cadena. Por ejemplo, el fragmento de ADN deseado se puede preparar fácilmente mediante el método de reacción polimerasa en cadena usando un cebador apropiado preparado a partir de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:1, por ejemplo.

Mediante hibridación usando la secuencia nucleotídica del promotor del presente invento, el promotor del presente invento se puede obtener también a partir de un gen derivado de otra célula. En este caso, el siguiente método, por ejemplo, es aplicable. Primero, el ADN cromosómico obtenido de otra fuente de genes celular está ligado a un plásmido, vector fago, o similar, mediante un método convencional, e introducido en un hospedante, para preparar una biblioteca. La biblioteca es luego cultivada en placas; las colonias o placas resultantes se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nilón, seguido de desnaturalización, para inmovilizar el ADN en la membrana. Esta membrana es luego incubada en una disolución que contiene una sonda, previamente marcada con ^{32}P, etc. (sondas útiles incluyen el fragmento de ADN de SEQ ID NO:1 en el listado de secuencias, y porciones del mismo, tal como fragmento A (SEQ ID NO:2), fragmento B (SEQ ID NO:3) y fragmento C (SEQ ID NO:4)) para formar un híbrido entre el ADN sobre la membrana y la sonda.

Por ejemplo, la membrana de ADN inmovilizado se híbrida con la sonda a 65ºC durante 20 horas en una disolución que contiene 6 x SSC, dodecil sulfato sódico (SDS) 1%, ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml y 5 x Denhardt's. Después de completar la hibridación, la adsorción inespecífica se lava, seguida por autoradiografía etc., para identificar los clones que han formado un híbrido con la sonda. Este procedimiento se repite hasta que un clon único ha formado el híbrido. El clon único así obtenido tiene el promotor deseado insertado ahí.

La secuencia nucleotídica del gen obtenido se determina mediante, por ejemplo, el método descrito a continuación para demostrar la identidad del gen como el promotor deseado. La secuenciación nucleotídica de los clones obtenidos por hibridación se consigue como se menciona a continuación, cuando el recombinante es Escherichia coli: el recombinante se cultiva en tubos de ensayo, etc.; el plásmido es extraído y cortado con enzimas de restricción; el injerto se retira y se subclona en el vector fagoM13, etc., seguido por secuenciación nucleotídica mediante el método didesoxi. Cuando el recombinante es un fago, se pueden seguir básicamente los mismos procedimientos para lograr la secuenciación nucleotídica. Estas operaciones básicas desde el cultivo a la secuenciación nucleotídica se pueden llevar a cabo como se describe en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, editado por T. Maniatis y otros, Capítulo 1, pp. 90-104, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

La identidad del gen obtenido como promotor deseado se puede estimar en base a la homología de la secuencia nucleotídica determinada con la secuencia nucleotídica del promotor del presente invento. Cuando el gen obtenido no se supone que contiene el promotor entero, la secuencia nucleotídica del promotor entero que hibrida con el promotor del presente invento se puede determinar preparando un cebador de ADN sintético en base al gen obtenido, amplificando la región que falta mediante PCR, o cribando una biblioteca de ADN o una biblioteca de cADN usando un fragmento del gen obtenido como una sonda.

El método del presente invento para expresar un gen útil se caracteriza en que el gen útil está ligado aguas abajo al promotor del presente invento en un modo tal que el gen es capaz de expresarse; el fragmento de ADN así preparado se introduce en una célula animal; y la célula resultante es cultivada. Para ligar el gen útil deseado aguas abajo del fragmento de ADN preparado como se indica anteriormente, que contiene el promotor del presente invento en un modo tal que el gen es capaz de expresarse, el método de la ADN ligasa y el homopolímero puede ser usado. Cuando la ADN ligasa se usa para la ligación de los dos fragmentos de ADN que comparten el mismo sitio de enzima de restricción, la ligación se logra digiriéndolos con la enzima de restricción apropiada, mezclándolos juntos en el tampón de reacción descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, editado por T. Maniatis y otros, Capítulo 1, p. 62, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y añadiendo ADN ligasa. Alternativamente, cuando los dos fragmentos de ADN no comparten el mismo sitio de enzima de restricción, se ligan juntos haciendo romos sus extremos usando ADN polimerasa T4 (producida por Tajara Shuzo) y tratándolos con ADN ligasa como se describe anteriormente. Cuando el método del homopolímero se usa, una cadena poli-G se añade al extremo 3' terminal del vector, previamente linealizado con enzima de restricción, usando desoxiribonucleotidil transferasa terminal y dGTP; al extremo 3' terminal del inserto de ADN, se añade una cadena poli-C en la misma forma; estas cadenas poli-G y poli-C se hibridan juntas y se introducen a Escherichia coli mediante, por ejemplo, el método del cloruro cálcico [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75, 3727 (1978)].

Ejemplos de los genes útiles deseados para el presente invento incluyen, pero no se limitados a ellos, los genes de la interleuquina 1 hasta 12, genes del interferón \alpha, \beta y \gamma, gen del factor de necrosis tumoral, gen del factor estimulante de colonias, gen de la eritropoyetina, gen del factor de crecimiento transformante -\beta, gen de la inmunoglobulina, gen del activador de plasminógeno tisular, gen de la uroquinasa y gen Photinus luciferasa.

El fragmento del ADN así obtenido, que resulta de la ligación del fragmento de ADN del presente invento y un gen útil, se puede insertar en un vector adecuado, preferiblemente un vector para células animales, para producir un plásmido para expresión génica. Tales vectores incluyen pTM [Nucleic Acids Research, 10, 6715 (1982)], cos202 [The EMBO Journal, 6, 355 (1987)], p91203(B) [Science, 228, 810 (1985)] and BCMGSNeo [Journal of Experimental Medicine, 172, 969 (1990)].

El plásmido obtenido para la expresión génica se puede introducir en una célula hospedante apropiada mediante métodos convencionales, tal como el método de fosfato cálcico [Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987)], el método de electroporación [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 81, 7161 (1984)], el método de DEAE-dextrano [Methods in Nucleic Acids Research, p. 283, editado por Karam, J.D. y otros, publicado por CRC Press, 1991] y el método de liposomas [BioTechniques, 6, 682 (1989)]. Tales células hospedantes son preferiblemente células animales e incluyen, por ejemplo, células COS1, células HELA, células CHO-21 y células BHK-21. Cultivando las células transformantes obtenidas en un medio apropiado, el producto génico útil deseado se puede producir eficazmente.

Mediante el uso del fragmento de ADN del presente invento como un promotor, un producto génico útil deseado puede ser expresado en una gran cantidad en una célula animal.

Los siguientes ejemplos ilustran el presente invento.

Ejemplo 1

El clon cosmídico Hug3, que incorpora una región del genoma que contiene el gen GnT-III documentado por Ihara y otros [Journal of Biochemistry, 113, 692 (1993)], se digirió con enzimas de restricción SphI y NaeI (ambas producidas por Takara Shuzo) y fue sometido a electroforesis en gel de agarosa. Un fragmento de 1,1 kb fue recortado del gel, seguido por recuperación de ADN usando el EASYTRAP™ (producido por Takara Shuzo). Este fragmento de ADN se ligó a pUC19, previamente digerido con SphI y HincII, por medio de ADN ligasa T4, después de lo cual fue introducido en Escherichia coli XL1-Blue por el método de cloruro cálcico. Las colonias resultantes resistentes a la ampicilina fueron recogidas y as; se preparó un plásmido a partir de las células cultivadas por el método del álcali. Al sitio de clonación múltiple de pUC19, los sitios HindIII, SphI, HincII y BamHI fueron dispuestos mutuamente próximos en este orden. El plásmido se digirió doblemente con BamHI y HindIII y se sometió a electroforesis en gel de agarosa; se descubrió que el plásmido contenía un fragmento HindIII-BamHI de 1,1 kb (la secuencia nucleotídica de este fragmento se identificó como la secuencia de SEQ ID NO:1), y se designó como pHug5'-204. Escherichia coli XL1-Blue fue transformada con este plásmido para producir Escherichia coli XL1-Blue/pHug5'-204 transformada (depositado bajo FERM BP-5532 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología humana, Agencia de Ciencia y Tecnología industrial).

El pHug5'-204 fue luego digerido con BamHI y HindIII; el fragmento resultante de 1,1 kb se recuperó del gel de agarosa usando el EASYTRAP™, seguido de hacer los extremos romos en presencia de dATP, dGTP, dCTP y dTTP usando el ADN polimerasa T4(producido por Takara Shuzo). Por separado, un vector potenciador (producido por Toyo Ink) como un plásmido carente de promotor que contiene el gen Photinus luciferasa, potenciador SV40, punto de iniciación de la replicación de Escherichia coli y gen de resistencia a ampicilina, fue digerido en el sitio SmaI inmediatamente aguas arriba del gen Photinus luciferasa y ligado al fragmento de 1,1 kb previamente recuperado usando la ADN ligasa T4, después de lo cual el producto de ligación fue introducido en Escherichia coli XL1-Blue por el método del cloruro cálcico.

Para determinar la orientación del fragmento de 1,1 kb, se preparó un plásmido a partir de la bacteria resistente a ampicilina, se digirió con XhoI, y se sometió a electroforesis en gel. Considerando el mapa de enzimas de restricción, se esperaría que un fragmento de 0,8 kb se encontrara si el fragmento de 1,1 kb se insertaba en la misma orientación como la del gen Photinus luciferasa, y que un fragmento de 0,3 kb se encontrara si el fragmento de 1,1 kb se insertaba en la orientación contraria. Con esto en mente, un plásmido que abriga un fragmento XhoI de 0,8 kb se seleccionó para producir pPG204-1,1.

A un frasco cónico de 2 litros que contiene un medio LB [Bactotriptona 1%, extracto de Bactolevadura 0,5% (ambos producidos por DIFCO), NaCl 0,5%] que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, la Escherichia coli que abriga el pPG204-1,1 se inoculó, seguido por el cultivo con agitación durante toda la noche a 37ºC, después de lo cual se preparó el plásmido mediante el método de centrifugación de gradiente de densidad del cloruro de cesio equilibrado descrito en Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987). pPG204-1,1, 20 \mug por placa de petri de 10 cm, se transfirió a células COS1 (ATCC CRL 1650) mediante el método del fosfato cálcico descrito en Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 (1987).

La actividad luciferasa de las células COS1 transfectadas se determinó usando un kit PicaGene™ (producido por Toyo Ink) como se indica en el manual de instrucción para el kit.

Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron resuspendidas en 0,7 ml de disolución de lisado celular incluída en el kit; 20 \mul del sobrenadante y 100 \mul de un sustrato luminiscente se mezclaron juntos, después de lo cual la intensidad de luminiscencia fue inmediatamente determinada usando un contador de centelleo líquido. Como un testigo positivo, las células fueron transfectadas con el vector testigo (promotor SV40) incluído en el kit; como testigo negativo, las células se transfectaron con el vector potenciador.

Como resultado, pPG204-1.1, que incorpora el fragmento de ADN del presente invento, se descubrió que era más potente que el promotor SV40 en términos de actividad promotora.

	Intensidad de luminiscencia relativa (%)
Vector potenciador	0,4
Promotor SV40	100
pPG204-1.1	156

Ejemplo 2

El pHug5'-204 se digirió con XhoI, seguido de hacer los extremos romos en presencia de dATP, dGTP, dCTP y dTTP usando ADN polimerasa -T4, después de lo cual se digirió adicionalmente con BamHI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa, seguido de la recuperación de un fragmento de 0,8 kb (fragmento A) usando el EASYTRAP™. Por separado, el pHug5'-204 se digirió con SspI y BamHI, seguido de la recuperación de un fragmento de 0,5 kb (fragmento B) del mismo modo que para el fragmento A. El pHug5'-204 se digirió también con HincII y BamHI, seguido de la recuperación de un fragmento de 0,2 kb (fragmento C) del mismo modo que para el fragmento A.

El fragmento A es un fragmento de ADN de 817 pb de largo que cubre la región desde la posición 300 C hasta la posición 1.116 C del fragmento de ADN de SEQ ID NO: 1; el fragmento B es un fragmento de ADN de 522 pb de largo que cubre la región desde la posición 595 A hasta la posición 1.116 C del fragmento de ADN de SEQ ID NO:1; el fragmento C es un fragmento de ADN de 200 pb de largo que cubre la región desde la posición 917 G hasta la posición 1.116 C del fragmento de ADN de SEQ ID NO: 1. El fragmento A, B o C se ligó al vector potenciador, previamente digerido con SmaI y BamHI, y se introdujo en Escherichia coli XL1-Blue. El ADN plasmídico se extrajo de la cepa resistente a ampicilina así obtenida, y se cortó con ScaI y HindIII; se confirmó la inserción del fragmento deseado. Específicamente, se espera que se encuentre un fragmento de 2,0 kb si se inserta el fragmento A, que se encuentre un fragmento de 1,7 kb si se inserta el fragmento B, y que se encuentre un fragmento de 1,4 kb si se inserta el fragmento C. pPG204-0,8 que lleva el fragmento A, pPG204-0,5 que lleva el fragmento B, y pPG204-0,2 que lleva el fragmento C, fueron así obtenidos.

De las cepas de Escherichia coli que abrigan pPG204-0,8, pPG204-0,5 y pPG204-0,2, respectivamente, se prepararon plásmidos mediante el método de centrifugación en gradiente de densidad equilibrado de cloruro de cesio del mismo modo que en el Ejemplo 1, seguido por transfección de células COS-1. La actividad luciferasa del extracto de las células COS-1 transfectadas se determinó del mismo modo que en el Ejemplo 1, excepto que la intensidad de luminiscencia fue determinada usando un luminómetro (LB 9501, producido por Belthold).

Como resultado, se encontró que los fragmentos más pequeños eran de 2 a 3 veces más potentes que el fragmento SphI-NaeI de 1,1 kb en términos de actividad promotora.

Otras modificaciones de las realizaciones del invento anteriormente descritas que son obvias a los expertos en la técnica se suponen dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

	Intensidad de luminiscencia relativa (%)
pPG204-1,1	100
pPG204-0,8	316
pPG204-0,5	333
pPG204-0,2	219

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Takara Shuzo Co., Ltd.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 609, Takenaka-cho, Fushimi-ku

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CITY: Kyoto-shi, Kyoto-fu

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PAÍS: Japón

\vskip0.333000\baselineskip

(E): CÓDIGO POSTAL (ZIP): ninguno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DEL INVENTO: NUEVO PROMOTOR Y MÉTODO DE EXPRESIÓN GÉNICA USANDO EL MISMO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FORMULARIO LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM compatible con PC

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE:PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: JP 7-187753

\vskip0.333000\baselineskip

(B): DATOS DE ARCHIVO: 30-JUN-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: JP 7-233364

\vskip0.333000\baselineskip

(B): DATOS DE ARCHIVO: 17-AGO-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1116 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 817 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 200 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

4

Claims

1. Un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(a): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:1, o un fragmento del mismo que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(b): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:2, o un fragmento del mismo que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(c): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento del mismo que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(d): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:4, o un fragmento del mismo que tiene una actividad promotora en una célula animal; y

(e): un ADN capaz de hibridar con cualquiera de los anteriores de (a) hasta (d) que tienen una actividad promotora en una célula animal.

2. Un vector que comprende un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(e): un ADN capaz de hibridar con cualquiera de los anteriores de(a) hasta(d) que tienen una actividad promotora en una célula animal;

y un gen útil operablemente unido al mismo, donde dicho gen útil es un heterólogo con respecto a dicho ADN.

3. El vector según la reivindicación 2, en el que dicho vector es un vector plasmídico o un vector de virus apropiado para células animales.

4. El vector según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho gen útil se selecciona del grupo que consiste en un ADN que codifica para una proteína, ADN antisentido, RNA antisentido, un polinucleótido que codifica para un señuelo, y un ribozima.

5. Una célula animal hospedante que comprende el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Un animal no humano que comprende la célula animal según la reivindicación 5.

7. Un método para producir una proteína usando una célula animal hospedante, que comprende las etapas de:

(a): ligar un ADN que codifica una proteína deseada aguas abajo de un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(1): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:1, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(2): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:2, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(3): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal;

(4): un ADN que consiste en la secuencia nucleotídica como se representa en SEQ ID NO:4, o un fragmento de la misma que tiene una actividad promotora en una célula animal; y

(5): un ADN capaz de hibridar con cualquiera de los anteriores (1) a (4) que tienen una actividad promotora en una célula animal;

en el que la secuencia de ADN que codifica para una proteína deseada es heteróloga con respecto a dicho ADN, para obtener un fragmento de ADN recombinante en un modo tal que el ADN que codifica para la proteína deseada puede ser expresado;

(b): insertar el fragmento de ADN recombinante en un vector;

(c): transformar una célula animal hospedante con el vector;

(d): cultivar la célula animal; y

(e): recuperar la proteína deseada del cultivo.

8. Un método para expresar un gen útil, que comprende las etapas de:

(a): ligar el gen útil aguas abajo de un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(5): un ADN capaz de hibridar con cualquiera de los anteriores de (1) a (4) que tienen una actividad promotora en una célula animal;

en el que dicho gen útil es heterólogo con respecto a dicho ADN, para obtener un fragmento de ADN recombinante en un modo tal que el gen útil puede ser expresado;

(b): introducir el fragmento de ADN recombinante en una célula animal hospedante; y

(c): cultivar la célula animal.

9. Un método para expresar un gen útil, que comprende las etapas de:

(b): insertar el fragmento de ADN recombinante en un vector;

(c): transformar una célula animal hospedante con el vector; y

(d): cultivar la célula animal.

10. Un método para producir una proteína que comprende cultivar una célula animal hospedante según la reivindicación 5 y recuperar la proteína del cultivo.

11. El uso de un ADN según la reivindicación 1, para la expresión de un gen útil operablemente unido al mismo en una célula animal hospedante.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que dicho gen es heterólogo con respecto a dicho ADN.

13. Un vector que comprende el ADN según la reivindicación 1, en el que dicho vector es un vector plasmídico o un vector de virus apropiado para células animales, y dicho vector es capaz de incorporar un gen útil heterólogo con respecto a dicho ADN aguas abajo de dicho ADN.