CN1105188C - 新的启动子以及利用该启动子进行基因表达的方法 - Google Patents

新的启动子以及利用该启动子进行基因表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1105188C
CN1105188C CN96110986A CN96110986A CN1105188C CN 1105188 C CN1105188 C CN 1105188C CN 96110986 A CN96110986 A CN 96110986A CN 96110986 A CN96110986 A CN 96110986A CN 1105188 C CN1105188 C CN 1105188C
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
zooblast
sequence
carrier
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN96110986A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1145951A (zh
Inventor
小山信人
三善英知
井原义人
西河淳
谷口直之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Inc
Takara Holdings Inc
Original Assignee
Takara Shuzo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co Ltd filed Critical Takara Shuzo Co Ltd
Publication of CN1145951A publication Critical patent/CN1145951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1105188C publication Critical patent/CN1105188C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在动物细胞中具有启动子活性的离体DNA；利用该离体DNA表达有效基因的方法；以及利用该离体DNA动物细胞中生产蛋白质的方法。本发明提供了在动物细胞中大量地生产预期的基因产物的方法。

Description

新的启动子以及利用该启动子 进行基因表达的方法
本发明涉及新的启动子以及利用该新的启动子表达基因的方法。具体地说，本发明涉及含有该新启动子的DNA，所述启动子能在动物细胞中起作用，还涉及利用载体生产蛋白质的方法，所述载体中插入了通过将有效基因连接到该启动子的下游获得的DNA。本发明还涉及表达有效基因的方法，包括将有效基因连接到启动子下游，并将得到的DNA或携带该DNA的载体导入动物细胞中。
当采用基因工程技术将如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或酵母的微生物宿主用于生产动物源的有效基因产物时，基因表达常常受阻。由于该基因产物蛋白质的错误构型，转译后错误修饰等原因使所需活性的获得经常受阻。为了解决这个问题，常将动物细胞用作为宿主，在这种情况下启动子的选择显著地影响表达效率。通常用于动物细胞的常规启动子包括SV40启动子，巨细胞病毒启动子和肌动蛋白启动子。
当利用动物细胞作为宿主生产大量有效基因产物时，就转录活性而言通常用于动物细胞的启动子不是令人满意的。因此，需要研制更有效力的启动子。
因此，本发明一个目的是提供作为动物细胞启动子的DNA，它具有强启动子活性。本发明另一个目的在于提供利用该启动子表达有效基因的方法。
为了达到上述目的，本发明人进行了广泛的研究试图获得具有高转录效率的启动子。结果，本发明人发现在人N-乙酰基葡糖胺转移酶III(人GnT-III)基因上游存在一个强启动子。然后，他们测出了含有该启动子的DNA的碱基序列，将该DNA连接到Photinus萤光素酶基因的上游并表达该基因。结果是他们已经证实该启动子的活性比动物细胞常规启动子的活性高得多。基于这些发现，完成了本发明。
在一个实施方案中，本发明涉及具有选自下列组中序列的离体DNA：
(a)含有SEQ ID NO：1的序列或其片段的DNA序列；
(b)含有SEQ ID NO：2的序列或其片段的NDA序列；
(c)含有SEQ ID NO：3的序列或其片段的DNA序列；
(d)含有SEQ ID NO：4的序列或其片段的DNA序列：
(e)能够与上述(a)-(d)任一序列进行杂交的DNA序列，其中所说的离体DNA具有在动物细胞中起作用的启动子活性。
在另一实施方案中，本发明涉及含有可操作连接的上述离体DNA和有效基因的重组DNA，涉及含有该重组DNA的载体，涉及导入了该重组DNA或载体的动物细胞，以及含有所述动物细胞的动物。
在另一实施方案中，本发明涉及利用本发明的重组DNA生产蛋白质的方法以及表达有效基因的方法。
图1显示了含有本发明启动子的DNA(pPG204-1.1)与人GnT-III基因的cDNA之间的关系。
图2是pHug5′-204插入物的限制性酶切图谱。
本文中使用的术语“启动子”包括TATA盒或类似区域，它定位于复制起始点(+1)上游20-30个碱基对处并且它具有诱导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分。除该区域以外，还提供了与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的另一个必需区域以用于调节表达。本文中使用的术语“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。
本文中使用的术语“启动子活性”是指当以该基因的可表达方式将有效基因连接到启动子的下游，并导入到宿主(动物细胞)中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该有效基因产物的能力和功能。
通常，以该基因的可表达方式将编码容易定量检测的蛋白质(报道基因)的基因连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质的量，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。当以该基因的可表达方式将有效基因连接到启动子的下游并导入到宿主中，当在宿主内或宿主外证实该有效基因的表达产物时，则可认为该启动子在其导入的宿主内具有启动活性。
本文中使用的术语“动物细胞”是指包括但不限于人细胞，只要本发明的启动子在该动物细胞中显示启动活性。这样的动物细胞包括非人哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔，山羊，猪，牛，马，狗，猴和黑猩猩)的细胞，鸟类(例如，鸡，火鸡，鹌鹑，鸭和野鸭)细胞，爬行动物(例如，蛇、鳄鱼和海龟)，两栖动物(例如，青蛙，火蛇和蝾螈)以及鱼类(例如竹荚鱼，鲭鱼，海鲈鱼，海鲤鱼，科鱼，鲱鱼，金枪鱼，鲑鱼，真鳟鱼，鲤鱼，香鱼，鳝鱼，平鱼，鲨鱼，鹞鱼以及鲟鱼)的细胞。
本文中使用的术语“有效基因”是指包括编码可在动物细胞中表达的蛋白质的基因，来源于动物细胞的基因的反义DNA或反义RNA，引诱物，例如，含有编码动物细胞源转录因子结合蛋白基因的DNA序列或者编码转录因子结合位点和类似序列的DNA序列以及编码切割动物细胞源的mRNA核酶的DNA序列。
编码可在动物细胞中表达的蛋白质的基因包括，但不限于动物源的基因。只要它们可以在动物细胞中表达，来源于微生物例如细菌，酵母，放线菌，霉菌，子囊菌和担子菌的基因，以及那些来自于非微生物生物体例如植物和昆虫的基因也包括在上面介绍的有效基因范围内。
本文中使用的术语“诱导物”表示具有编码动物细胞源的转录因子结合蛋白基因的DNA序列或者具有转录因子结合位点序列或者类似序列的DNA序列，当导入到细胞中作为“诱饵”时，“诱导物”的DNA序列能够抑制转录因子的作用。
本文中使用的术语“核酶”的定义为能够裂解特定蛋白质的mRNA从而抑制该蛋白质转译的酶。由编码特定蛋白质的基因序列可以设计核酶。例如，采用FEBS Letter，Vo1.228，PP228-230(1988)中描述的方法可以制备锤头型核酶。除锤头型核酶以外，本文所述核酶的范围内包括发夹型，δ型或其他型核酶，只要它们能裂解特定蛋白质的mRNA从而抑制该蛋白质的转译。
通过将有效基因可操作地连接到具有本发明启动子活性的DNA片段的下游，则可以增强该有效基因的表达。通过借助于载体或不使用载体可将具有本发明启动子活性的DNA片段导入到动物细胞中，从使该有效基因在该动物细胞中实现表达。作为一个载体，优选使用质粒载体或病毒载体。对于没有使用载体的情况，采用Virology，52，456(1973)，Molecular and Cellular Biology，7，2745(1987)，Journal of theNational Cancer Institute，41，351(1968)，EMBO Journal，1，841(1982)以及Biotechniques，6，682(1988)描述的方法可直接导入该DNA片段。携带了本发明DNA片段的动物细胞以及具有所述动物细胞的动物也在本发明范围内。由本发明加强表达的有效基因包括编码蛋白质的DNA，反义DNA，反义RNA，编码诱导物的多聚核苷酸，起着诱导物以及核酶作用的核苷酸序列。本发明还公开了生产所需蛋白质的方法以及通过使用具有本发明启动子活性的DNA片段而表达有效基因的方法。
本发明的DNA具有动物细胞的启动子活性并且含有序列表中SEQ ID NO：1的整个或部分DNA序列。换句话说，本发明的DNA片段是含有新启动子的DNA片段，只要它包含有所述启动子，它可以是SEQ ID NO：1的DNA序列的任何片段或者可以是含有SEQ ID NO：1的DNA序列的一部分的任何片段。所述DAN片段包括，但不限于SEQID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DNA片段以及含有SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的DNA片段一部分的DNA片段，以及含有SEQ ID NO：4的整个DNA序列或部分DNA序列的DNA片段。能够与这些DNA片段杂交并且具有动物细胞启动子活性的DNA片段也在本发明的DNA片段的范围内。
适用于动物细胞中的本发明的启动子的发现过程如下：
由Ihara等人从胎儿肝cDNA文库和基因组粘粒文库中分离的人GnT-III基因[Journal of Biochemistry，Vol.113，pp.692-698(1993)]可用于本发明中。在编码人GnT-III基因的cDNA克隆中，H15和H20(日本专利特许公开No.6-62865)各含有5′-非转译区，并且除预料中的起始密码子上游的8个碱基对以外，两个5’非-转译区的DNA序列互不相同。已获得了基因组克隆形式的两种粘粒Hug3和Hug5，其中Hug3含有GnT-III基因的编码区以及其上游的约35kb区域。
记住这些以后，利用H15和H20的5’-非转译区作为探针对Hug3粘粒克隆进行Southern杂交DNA碱基测序等，证明H15在起始密码子的上游约29kb处有外显子(H15外显子-2)，在上游1kb处有外显子(H15外显子-1)，H20在起始密码子上游约26kb处有外显子(H20外显子-1)。利用人脑mRNA作为模板利用特异于GnT-III基因的引物也可以对cDNA末端进行5’-快速扩增(RACE)，证明存在着在起始密码子上游7个碱基对位置处没有剪接的mRNA，其中剪接出现于H15和H20。从该mRNA获得的cDNA命名为H204。
这些结果证明至少有三个人GnT-III基因转录产物。由于假设H15，H20和H204转录中涉及的启动子分别存在于H15外显子-2的上游，H20外显子-1的上游，以及基因组上预期的转译起始位点的上游。用Photinus萤光素酶基因作为报道基因可确定含有这些区域的DNA片段在COS1细胞中的启动子活性。如图1所示(方盒为外显子部分；打点线是内含子部分)，在从H15外显子-2的HindIII位点至H20外显子-1的SacII位点的H20上游的约3kb片段(含有该片段的质粒命名为pPG20B)中未检测到启动子活性。但是，在从H15上游的EcoRI位点到H15外显子-2的HindIII位点的约3kb片段(含有该片段的质粒命名为pPG15)以及在从该编码区上游的SphI位点至该编码区内的NaeI位点的约1.1kb片段(含有该片段的质粒命名为pPG204-1.1)即编码H204的片段中检测到启动子活性，发现后者的效力是前者的约10倍并且是SV40启动子的约1.5倍。
而且，该1.1kg片段含有离NaeI位点约0.8kb的一个XhoI位点，以及离NaeI位点约0.5kb处的SspI位点，和离约0.2kb处的HincII位点；当用这些限制性酶中任一种与BamHI(一种在该载体的多克隆位点处有切割位点的限制性酶)结合在一起用于消化pPG204-1.1时，可以切割出含有GnT-III起始密码子的0.8kb片段(片段A)，0.5kb片段(片段B)和0.2kb片段(片段c)。就启动子活性而言，这些片段的效力为上述1.1kb片段的2-3倍，并且为SV40启动子的3-5倍。因此本发明人证实含有人GnT-III基因编码区上游约0.2-1kb部分的DNA片段具有潜在的启动子活性。基于上述发现本发明人作了进一步调查，并且研制了本发明。下文中将详细描述获得本发明DNA片段的方法。
1)具有动物细胞的启动子活性的DNA片段的碱基序列
用限制性酶SphI和NaeI(由Takara Shuzo生产的两种酶)裂解含有人GnT-III基因的上游部分的基因组粘粒克隆，例如Ihara等人的粘粒克隆Hug3；分离出含有紧接GnT-III编码区上游区域的1.1kb DNA片段。该DAN片段具有SEQ ID NO：1的碱基序列。将该片段亚克降到一个质粒载体例如，pUC19(由TakaraShuzo生产)上以促进其用于与有效基因的连接和其他目的使用。
通过例如双脱氧法可确定亚克隆的1.1kb SphI-NaeI片段(pHug5′-204)的碱基序列[Proceeding of the NationalAcademy of Sciences of the USA，Vol.74，P.5463(1977)]。在单个反应中要确定1.1kb NDA片段的碱基序列通常是困难的，为此，可以利用这样的方法，包括用合适的限制性酶进一步消化该片段并亚克隆，随后进行双脱氧反应的方法，以及利用核酸外切酶III制备系列缺失的质粒，随后进行双脱氧反应的方法，以及利用以已知的碱基序列为基础按顺序合成引物，随后进行双脱氧反应的方法。在本发明中，进一步用限制性酶BstXI，XhoI，SspI，KpnI和HincIII消化该片段(pHug5′-204插入物的限制性酶切图谱显示于图2中)，亚克隆，并进行双脱氧反应，以确定pHug5′-204的碱基序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示。
如图2所示，该1.1kb片段在离NaeI位点约0.8kb处有-XhoI位点，在离NaeI位点约0.5kb处有一个SspI位点并且在约0.2kb处有一个HincII位点.当用这些限制性内切酶中任一种与BamHI，(在该载体的多克隆位点处有一个裂解位点的一种限制性酶)一起用于消化pHug5′-204时，可以切割出序列表中SEQ ID NO：2的0.8kb片段(片段A)，SEQ ID NO：3的0.5kb片段(片段B)以及SEQ ID NO：4的0.2kb片段(片段c)，所有这些片段均含有GnT-III起始密码子。(2)含有本发明启动子的DNA片段的制备
制备含有本发明的启动子的DNA片段的最简便的方法是通过用限制性酶SphI和NaeI(由Takara Shuzo制备)，如果必要进一步用类似于XhoI，SspI和HincII的限制性酶消化可以从上述粘粒或质粒中切下该片段。其它有用的方法包括用其它限制性酶消化，超声处理，用亚磷酰胺方法化学合成，利用聚合酶链反应的方法。例如利用从SEQ ID NO：1DNA序列制备的合适的引物，通过聚合酶链反应法可以容易地制备所需的DNA片段。
通过用本发明启动子的碱基序列进行杂交，也可以从另一个细胞中衍生的基因获得本发明的启动子。在这种情况下，可以使用例如下面的方法。首先，采用常规方法将从另一个细胞中的基因获得的染色体DNA连接到质粒，噬菌体载体或类似载体中，并导入到宿主中，制备一个文库。然后将该文库平板培养；将得到的菌落或者噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，随后进行变性，将该DNA固定到膜上。然后将该膜在含有已经用32P等标记的探针(有效的探针包括序列表中SEQ ID NO：1的DNA片段，和其部分，例如片段A(SEQ ID NO：2)，片段B(SEQ ID NO：3)和片段C(SEQ ID NO：4))的溶液中保温以便使该膜上的DNA和探针之间形成杂合体。
例如在含有6×SSC，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt′s的溶液中于65℃将固定于膜上的DNA与探针杂交20小时。在杂交完成之后，洗掉非特异性吸附，随后进行放射自显影等等，以便鉴定出与该探针形成杂合体的克隆。重复该程序直到单克隆形成杂合体。由此获得的单克隆含有插入其中的所需的启动子。
通过例如下文中描述的方法确定所获得的基因的碱基序列以证明该基因与所需的启动子同性。按照下文中介绍的方法可以对杂交获得的克隆进行碱基测序，当重组体为大肠杆菌时：将该重组体培养于试管中等等；提取质粒并用限制性酶切割；获取该插入物并亚克隆到M13噬菌体载体等等，随后用双脱氧法进行碱基测序。当重组体是噬菌体时，基本上可用相同的方法进行碱基测序。从培养到碱基测序的基本操作，可按如下的描述进行，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，edited by T.Maniatis et al.，Chapter 1，PP.90-104，published by cold Spring Harbor Laboratory，1989。
根据测定的碱基序列与本发明的启动子碱基序列的同源性可估评所获得的基因作为所需启动子的特性。当假设获得的基因不含有整个启动子时，则可通过根据该获得的基因制备合成的DNA引物，采用PCR扩增缺失的区域，或者利用获得的基因片段作为探针筛选一个DNA文库或者cDNA文库，可以确定与本发明的启动子进行杂交的整个启动子的碱基序列。
用于表达有效基因的本发明的方法特征在于以基因可表达的方式将该有效基因连接到本发明启动子的下游；将由此制备的DNA片段导入到动物细胞中；培养获得的细胞。为了将所需的有效基因以基因可表达的方式连接到按上述制备的DNA片段的下游，该片段含有本发明的启动子，可以使用DNA连接酶和同聚物的方法。当将DNA连接酶用于连接两个具有相同限制性酶位点的DNA片段时，则通过用合适的限制性酶将它们消化，在由Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，edited by T.Maniatis et al.，Chapter1，p.62published by cold Spring Harbor Laboratory，1989描述的反应缓冲液中将它们混合，加入DNA连接酶可实现连接。另外，当两个DNA片段不具有相同的限制性酶位点时，通过用T4DNA聚合酶(Takara Shuzo制备)使其成平齐末端并且用上文中描述的DNA连接酶处理可将它们连接在一起。当使用同聚物的方法时，利用末端脱氧核糖核苷酰转移酶和dGTP将多聚G链加到已经用限制性酶线性化的载体的3’末端；按同样的方法将多聚C链加到该插入DNA的3’末端；将这些多聚G和多聚C链一起退火并且采用例如氯化钙方法导入到大肠杆菌中[Proceedings the National Academy of Sciences of the USA，Vol.75，P.3727(1978)]。
用于本发明的所需有效基因的例子包括但不限于白细胞介素1-12基因，干扰素α，β，γ基因，肿瘤坏死因子基因，集落刺激因子基因，促红细胞生成素基因，转化生长因子β基因，免疫球蛋白基因，组织纤维蛋白溶酶原刺激因子，尿激酶基因和Photinus萤光素酶基因。
将本发明的DNA片段和有效基因连接得到的DNA片段插入到动物细胞的合适载体中，产生用于基因表达的质粒。所说载体包括pTM[Nucleic Acids Research，Vol.10，p.6715(1982)]、cos202[The EMBO Journal，Vol.6，p.355(1987)]，p91203(B)[Science，Vol.288，p.810(1985)]and BCMGSNeo[Journal ofExperimental Medicine，Vol.172，p.969(1990)]。
采用常规方法例如磷酸钙方法([Molecular and CellularBiology，Vol.7，p.2745(1987)]，电穿孔方法[Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，Vol.81，p.7161(1984)]，DEAE-葡聚糖方法[Methods in Nucleic AcidsResearch，p.283，edited by Karam，J.D.et al.，publishedby CRc Press，1991]和脂质体方法[BioTechniques，Vol.6，p.682(1989)]将获得的用于基因表达的质粒导入到合适的宿主细胞中。所说的宿主细胞包括COS1细胞，HELA细胞，CHO-21细胞和BHK-21细胞。通过将获得的转化细胞在合适的培养基中培养，可以有效地生产所需的有效基因产物。
通过利用本发明的DNA片段作为启动子，可以在动物细胞中大量地表达所需的有效基因产物。
                     实施例
下面的实施例用于描述本发明但不以任何方式限制本发明。
实施例1
用限制性酶SphI和NaeI(都由Takara Shuzo生产)消化粘粒克隆Hug3，该克隆插入了一个基因组区，该区含有Ihara et al.[Journal of Biochemistry，Vol.113，P.692(1993)]报道的GnT-III基因，并且进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶上切下1.1Kb片段，随后用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo制备)回收DNA。借助于T4DNA连接酶将该DNA片段连接到已经用SphI和HincII消化的pUC19上，之后采用氯化钙法将其导入到大肠杆菌XL1-Blue中。挑选得到的氨苄西林抗性菌落并培养；采用碱法从培养的细胞中制备质粒。在pUC19的多克隆位点处，按照HindIII、SphI，HincII和BamHI位点的顺序彼此紧密的排列。用BamHI和HindIII对该质粒进行双重消化，并进行琼脂糖凝胶电泳；发现该质粒含有一个1.1KbHindIII-BamHI片段(鉴定出该片段的碱基序列为SEQ ID No：1序列)并命名为pHug5′-204。用该质粒转化大肠杆菌XL1-Blue，产生转化子大肠杆菌XL1-Blue/pHug5′-204(该转化子已保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienec and Technology，保藏号为FERM BP-5532)。
用BamHI和HindIII对pHug5′-204进行消化；利用EASYTRAP从琼脂糖凝胶上回收得到的1.1Kb片段，随后用T4DNA聚合酶(由Takara Shuzo制备)在dATP，dGTP，dCTP和dTTP存在下使末端钝化。单独的，在紧靠Photinus萤光素酶基因上游的SmaI位点处消化加强载体(由Toyo Ink制备)，该载体是含有Photinus萤光素酶基因，SV40增强子，大肠杆菌复制起始位点和氨苄西林抗性基因的缺失启动子的质粒。
并且利用T4-DN进接酶将其连接到前面得到的1.1Kb片段上，之后采用氯化钙的方法将得到的产物导入到大肠杆菌XL1-Blue中。
为了测定该1.1kb片段的方向，从具氨苄西林抗性的细菌中制备质粒，用XhoI消化并进行琼脂糖凝胶电泳。从该限制性酶切图谱可判断，正如预料中的如果该1.1kb片段以与Photinus萤光素酶基因的插入相同的方向插入则可发现0.8kb的片段，以及如果该1.1kb片段以相反方向插入则可发现一个0.3kb的片段。根据这些结果，选择一个具有0.8kb XhoI片段的质粒用于生产pPG204-1.1。
向装有含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基[1％细菌培养用胰蛋白胨，0.5％细菌培养用酵母提取物(两者由DIFCO生产)，0.5％NaCl]的2升圆锥瓶中，接种携带pPT204-1.1的大肠杆菌，随后在37℃振荡培养过夜，培养之后采用由Molecular andCellularBiology，Vol.7，p.2745(1987)描述的氯化铯平衡的密度梯度离心方法制备该质粒。采用Molecuar Cellular Biology，Vol，7，p.2745(1987)中描述的磷酸钙方法以每10cm的平皿中20μg的浓度将pPG204-1.1转染COS1细胞(ATCC CRL1650)。
利用Plca GeneTM试剂盒(由Toyo Ink生产)按照该试剂盒的使用手册的说明确定cosl转染细胞的萤光素酶活性。转染之后48小时，将细胞悬浮于该试剂盒中含有的0.7ml细胞裂解溶液中；将20μl的上清液和100μl的发光物质一起混合，混和之后立即用液体闪烁计数器确定发光强度。对于阳性对照而言，用该试剂盒中含有的对照载体(SV40启动子)转染该细胞；对于阴性对照而言，用增强子载体转染细胞。
结果，就启动活性而言发现掺入了本发明DNA片段的pPG204-1.1比SV40启动子更有效力。
                              相对发光强度(％)增强子载体                              0.4SV40启动子                              100pPG204-1.1                              156
                     实施例2
用XhoI消化pHug5′-204，随后在dATP，dGTP，dCTP和dTTP存在下利用T4-DNA聚合酶使其成平齐末端，之后，进一步用BamHI消化，并进行琼脂糖凝胶电泳，随后利用EASYTRAP回收0.8kb片段(片段A)。单独地，用SspI和BamHI消化pHug5′-204，随后按制备片段A的相同方法回收0.5kb片段(片段B)。再用HincII和BamHI消化pHug5-204，随后按制备片段A的相同方法回收0.2kb片段(片段C)。
片段A是817bp长的DNA片段，它覆盖了SEQ ID NO：1的第300位C到第1,116位C的DNA片段区域；片段B是522bp长的DNA片段，它覆盖了SEQ ID NO：1的第595位A到第1,116位C的DNA片段区域，片段C是200bp长的DNA片段，包覆盖了SEQ ID NO：1的第917位G到第1,116位C的DNA片段的区域。将片段A，B或C连接到前面已用SmaI和BamHI消化的增强子载体上，并导入到大肠杆菌XLl-Blue中。从由此获得的氨苄西林抗性菌株中提取质粒DNA，并用ScaI和Hind III切割；证实插入了所需的片段。具体地说，正如预料中的，如果插入了片段A可发现一个2.0kb片段，如果插入了片段B可发现一个1.7kb片段，如果插入了片段C可发现一个1.4kb片段。于是获得了携带片段A的pPG204-0.8携带片段B的pPG204-0.5，携带片段C的pPG204-0.2。
采用实施例1中描述的氯化铯平衡密度梯度离心法分别从携带pPG204-0.8，pPG204-0.5和pPG204-0.2的大肠杆菌菌株中制备质粒，随后转染cos-1细胞。按与实施例1相同方法确定cos-1转染细胞的提取物的萤光素酶活性，所不同的是利用发光测量计(LB9501.，由Belthold生产)确定发光强度。
结果，就启动子活性而言发现较小的片段比1.1kb SphI-NaeI片段的效力大2-3倍。
对上面描述的实施方案进行本领域内技术人员显而易见的其他修饰都在下列权利要求的范围内。
                       相对的发光强度(％)pPG204-1.1                       100pPG204-0.8                       316pPG204-0.5                       333pPG204-0.2                       219
                  序列表
(1)一般资料
(iii)序列数：4
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1116碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)几何结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)推测：非
(iv)反义：非
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GCATGCGCCA CTACACTCAG CTACTTTGTA TTTTTAGTAG AGACAGGGTT TCACCATGTT   60GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CCTGACCTTG TGATCTGCCC ACCTCGGCCT CCCAAAGTGC  120TGGGATTATA GGCGTGAGCC ACTGCACTGG CCGACCTCAA ATTTTTATGC CTGGAGATTA  180GTAAAGGGCA TGGAATAATG AAGGGGAACT TTTATTTTAT TTTGTTTTTG AGATAGGGTC  240TCAGTCTGTT GTCCAGGCTG GGGCGCAGTG GTGCAATCAT GGCTCACTGC AGCCTCAACC  300TCGAGGTCTC AAGTGATCCT CCCACCTCAC CTCAGCCTCC TAAGTAGCTG GGACCACAAG  360CACATGGCAC CACACCTGGC ACCACACCTG GCTAATTTTT AAATTTTCTG TAGAGATGGG  420GTCTCACTAT GTTGTCCAGC TGGTCTCAAA CTCCTGGGCT CAAGTGATCC TCCTGCCTCA  480GCCTCTGAAG GTGTTGGGAT TACAGGCGTG AGCACCACGC CTGGCCTAAT TTTATTCATT  540AAATATGTTA GAATTAAGTG TTTTCCCTTG AGACCTGTGA GTTTTTCAGT GAAAAATATT  600CAAAAGGTTT GTCAGTATGT CCATAAAAAA GAAGATAGGA GGGGAGGGAC AGGACCCAGG  660AGGGCAGCCT ACAGCCTGCT CTCCCCGTTC TGTCCTGGGG CGGAGTCTGT ACTGCGAGTT  720GAGCTTTTCC CAAGTCGTCA TGTTACTCCT GGAGCCAAGC CTAGCAGTGC AGCCTCACAG  780TCAGGTTGGG GTGGTCCAGC GGAGAAGCAG GCTGCAGAGG GGGCAGGGTG GTGGCCTGGG  840GATCTCAGGG AAGGGCTATG GGAGCACGGC GGTGTCCTCA GTGCTGGGGC TTTCAGGGGC  900CTTGGTACCG CGAGTTGACT CTTGGGGGCA GGAGGTCACT CCATGCAGGG GCAGCAGGTG  960CTGGCCACCA CATTGTCCAG CAAGGTGGCA GCAGAGGCCT CCTAGGTCCC CTTCCTAGGA 1020AAGGAGCCTG GGCTGCCCTG ATGAGTCTCC TGTCTCTCTC TCTCCCGCAG GATGAAGATG 1080AGACGCTACA AGCTCTTTCT CATGTTCTGT ATGGCC                           1116
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征
(A)长度：817碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)几何结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)推测：非
(iv)反义：非
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2CTCGAGGTCT CAAGTGATCC TCCCACCTCA CCTCAGCCTC CTAAGTAGCT GGGACCACAA   60GCACATGGCA CCACACCTGG CACCACACCT GGCTAATTTT TAAATTTTCT GTAGAGATGG  120GGTCTCACTA TGTTGTCCAG CTGGTCTCAA ACTCCTGGGC TCAAGTGATC CTCCTGCCTC  180AGCCTCTGAA GGTGTTGGGA TTACAGGCGT GAGCACCACG CCTGGCCTAA TTTTATTCAT  240TAAATATGTT AGAATTAAGT GTTTTCCCTT GAGACCTGTG AGTTTTTCAG TGAAAAATAT  300TCAAAAGGTT TGTCAGTATG TCCATAAAAA AGAAGATAGG AGGGGAGGGA CAGGACCCAG  360GAGGGCAGCC TACAGCCTGC TCTCCCCGTT CTGTCCTGGG GCGGAGTCTG TACTGCGAGT  420TGAGCTTTTC CCAAGTCGTC ATGTTACTCC TGGAGCCAAG CCTAGCAGTG CAGCCTCACA  480GTCAGGTTGG GGTGGTCCAG CGGAGAAGCA GGCTGCAGAG GGGGCAGGGT GGTGGCCTGG  540GGATCTCAGG GAAGGGCTAT GGGAGCACGG CGGTGTCCTC AGTGCTGGGG CTTTCAGGGG  600CCTTGGTACC GCGAGTTGAC TCTTGGGGGC AGGAGGTCAC TCCATGCAGG GGCAGCAGGT  660GCTGGCCACC ACATTGTCCA GCAAGGTGGC AGCAGAGGCC TCCTAGGTCC CCTTCCTAGG  720AAAGGAGCCT GGGCTGCCCT GATGAGTCTC CTGTCTCTCT CTCTCCCGCA GGATGAAGAT  780GAGACGCTAC AAGCTCTTTC TCATGTTCTG TATGGCC                           817
(3)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征
(A)长度：522碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)几何结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)推测：非
(iv)反义：非
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3AATATTCAAA AGGTTTGTCA GTATGTCCAT AAAAAAGAAG ATAGGAGGGG AGGGACAGGA   60CCCAGGAGGG CAGCCTACAG CCTGCTCTCC CCGTTCTGTC CTGGGGCGGA GTCTGTACTG  120CGAGTTGAGC TTTTCCCAAG TCGTCATGTT ACTCCTGGAG CCAAGCCTAG CAGTGCAGCC  180TCACAGTCAG GTTGGGGTGG TCCAGCGGAG AAGCAGGCTG CAGAGGGGGC AGGGTGGTGG  240CCTGGGGATC TCAGGGAAGG GCTATGGGAG CACGGCGGTG TCCTCAGTGC TGGGGCTTTC  300AGGGGCCTTG GTACCGCGAG TTGACTCTTG GGGGCAGGAG GTCACTCCAT GCAGGGGCAG  360CAGGTGCTGG CCACCACATT GTCCAGCAAG GTGGCAGCAG AGGCCTCCTA GGTCCCCTTC  420CTAGGAAAGG AGCCTGGGCT GCCCTGATGA GTCTCCTGTC TCTCTCTCTC CCGCAGGATG  480AAGATGAGAC GCTACAAGCT CTTTCTCATG TTCTGTATGG CC                     522
(4)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征
(A)长度：200碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)几何结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)推测：非
(iv)反义：非
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4GACTCTTGGG GGCAGGAGGT CACTCCATGC AGGGGCAGCA GGTGCTGGCC ACCACATTGT   60CCAGCAAGGT GGCAGCAGAG GCCTCCTAGG TCCCCTTCCT AGGAAAGGAG CCTGGGCTGC  120CCTGATGAGT CTCCTGTCTC TCTCTCTCCC GCAGGATGAA GATGAGACGC TACAAGCTCT  180TTCTCATGTT CTGTATGGCC                                              200

Claims (10)

1.一种具有选自于下列组的序列的分离的DNA：
a)包括SEQ ID NO：1的序列或其在动物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；
b)包括SEQ ID NO：2的序列或其在动物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；
c)包括SEQ ID NO：3的序列或其在动物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；
d)包括SEQ ID NO：4的序列或其在动物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；和
e)在65℃，在含6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt′s的溶液中在20小时内能与上述(a)-(d)中任一项进行杂交的在动物细胞中具有启动子活性的DNA序列。
2.重组DNA，它含有权利要求1的分离的DNA以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因选自于下列组：编码蛋白质的DNA、反义DNA、反义RNA、编码诱导物的多聚核苷酸和核酶。
3.含有权利要求2的重组DNA的载体。
4.根据权利要求3的载体，其中载体是质粒载体或病毒载体。
5.动物细胞，其中向该细胞中导入了权利要求2的重组DNA。
6.用权利要求3或4的载体转化的动物细胞。
7.利用动物细胞制备蛋白质的方法，包括下列步骤：
(a)按照编码所需蛋白质的DNA可以被表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到权利要求1的分离的DNA的下游以便获得重组DNA片段；
(b)将该重组DNA片段插入到载体中；
(c)用该载体转化动物细胞；
(d)培养该动物细胞；以及
(e)从培养物中回收所需的蛋白质。
8.表达有效基因的方法，该方法包括下列步骤：
(a)以该有效基因可表达的方式将该有效基因连接到权利要求1的分离的DNA的下游以便获得重组DNA片段；
(b)将该重组DNA片段导入动物细胞中；以及
(c)培养该动物细胞。
9.表达有效基因的方法，该方法包括下列步骤：
(a)以该有效基因可表达的方式将该有效基因连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得一个重组DNA片段；
(b)将该重组DNA片段插入载体中；
(c)用该载体转化动物细胞；以及
(d)培养该动物细胞。
10.一种表达载体，它含有权利要求1的DNA，其中所述载体是适用于动物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体可以掺入有效基因，所述有效基因选自编码蛋白的DNA、反义DNA、反义RNA、编码诱导物的多核苷酸和核酶。
CN96110986A 1995-06-30 1996-06-29 新的启动子以及利用该启动子进行基因表达的方法 Expired - Fee Related CN1105188C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP18775395 1995-06-30
JP187753/1995 1995-06-30
JP187753/95 1995-06-30
JP233364/1995 1995-08-17
JP23336495 1995-08-17
JP233364/95 1995-08-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1145951A CN1145951A (zh) 1997-03-26
CN1105188C true CN1105188C (zh) 2003-04-09

Family

ID=26504538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96110986A Expired - Fee Related CN1105188C (zh) 1995-06-30 1996-06-29 新的启动子以及利用该启动子进行基因表达的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5827687A (zh)
EP (1) EP0753579B1 (zh)
KR (1) KR100455004B1 (zh)
CN (1) CN1105188C (zh)
DE (1) DE69629767T2 (zh)
ES (1) ES2204980T3 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020034772A1 (en) * 1999-06-29 2002-03-21 Orlow Seth J. Methods and compositions that affect melanogenesis
CN111161929B (zh) * 2019-12-30 2021-03-23 重庆工程职业技术学院 一种扭转分拆钢丝绳或钢绞线的装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0585083A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-02 Takara Shuzo Co. Ltd. Human glycosyltransferase gene

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5496731A (en) * 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0585083A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-02 Takara Shuzo Co. Ltd. Human glycosyltransferase gene

Also Published As

Publication number Publication date
EP0753579B1 (en) 2003-09-03
EP0753579A2 (en) 1997-01-15
CN1145951A (zh) 1997-03-26
KR100455004B1 (ko) 2004-12-17
EP0753579A3 (en) 1997-08-20
ES2204980T3 (es) 2004-05-01
DE69629767D1 (de) 2003-10-09
US5827687A (en) 1998-10-27
DE69629767T2 (de) 2004-07-15
KR970001543A (ko) 1997-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020223370B2 (en) Enzymes with RuvC domains
CN106085984B (zh) 一种新型磷脂酶d及其制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法
CN110527697B (zh) 基于CRISPR-Cas13a的RNA定点编辑技术
CN113278619B (zh) 双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法
EP4146800A1 (en) Enzymes with ruvc domains
Royle et al. Isolation of telomere junction fragments by anchored polymerase chain reaction
CN106754949B (zh) 猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用
Sohn et al. A family of telomere-associated autonomously replicating sequences and their functions in targeted recombination in Hansenula polymorpha DL-1
CN1105188C (zh) 新的启动子以及利用该启动子进行基因表达的方法
Slobodyanyuk et al. The evolutionary relationships of two families of cottoid fishes of Lake Baikal (East Siberia) as suggested by analysis of mitochondrial DNA
Laptev et al. The piggyBac transposon as a tool in genetic engineering
CN118139979A (zh) 具有hepn结构域的酶
CN1989255A (zh) 降低细胞中的自发突变率
CN116426527B (zh) IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用
CN108794645A (zh) 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法
CN106754995A (zh) 中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其应用
CN115052980B (zh) 衍生自黄杆菌的基因编辑系统
CN114774421B (zh) 运动发酵单胞菌内源性启动子突变体
US20240352433A1 (en) Enzymes with hepn domains
JP4177904B2 (ja) 新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法
CN101492673B (zh) 非洲爪蟾xpapc基因启动子及其组织特异性增强子
CN1387573A (zh) 在丝状真菌中发挥作用的调控序列和表达体系
KR20240004618A (ko) Ruvc 도메인을 갖는 효소
JP2840730B2 (ja) ラン藻シネココッカスの熱誘導性ベクター
KR20210078894A (ko) 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: TAKARA BIO INC.

Free format text: FORMER OWNER: BAO HOLDINGS LIMITED

Effective date: 20040903

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: BAO HOLDINGS LIMITED

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: TAKARA SHUZO CO., LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Kyoto City

Patentee after: Takara Holdings Inc.

Address before: Kyoto Japan

Patentee before: TAKARA SHUZO Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20040903

Address after: The Japanese city of Tianjin

Patentee after: Takara Bio Inc.

Address before: Kyoto City

Patentee before: Takara Holdings Inc.

C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee