DE69432444T2

DE69432444T2 - Promotor-Sequenz des Rezeptors p55 für Tumor-Nekrosis-Faktor

Info

Publication number: DE69432444T2
Application number: DE69432444T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Oliver Kemper
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1993-01-10
Filing date: 1994-01-10
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2014-01-11
Also published as: ATE236986T1; IL104355A; ES2191668T3; CA2113023A1; AU677798B2; US6479655B1; DE69432444D1; ZA94129B; JP2004329216A; AU5307994A; JPH0746987A; EP0606869A1; IL104355A0; CA2113023C; EP0606869B1; JP3725536B2; PT606869E; DK0606869T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Promotor-Sequenz des Rezeptors p55 für Tumor-Nekrosis-Faktor (TNF-R), dessen Herstellung und Verwendung.
TNF ist ein multifunktionelles pro-inflammatorisches Cytokin, das einen weiten Bereich zellulärer Funktionen beeinflusst. Einerseits ist TNF am Schutz des Organismus beteiligt, andererseits aber kann es eine bedeutende pathogene Rolle bei einigen Krankheiten spielen, wenn es überproduziert wird. TNF ist bekanntermaßen an Entzündungsvorgängen beteiligt und ist ein Überträgerstoff von Gewebeschäden bei septischem Schock¹, Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen² und rheumatischen Krankheiten³.
TNF übt diese Wirkungen durch Bindung an zwei unterschiedliche Zelloberflächen-Rezeptoren aus, die sich in ihrer Größe unterscheiden (ungefähr 55 und 75 kDa) und strukturell verschiedene intrazelluläre Domänen besitzen, was darauf hinweist, dass sie unterschiedliche Signale erzeugen^4–11. Nahezu alle Zellen exprimieren TNF-Rezeptoren (TNF-Rs), dennoch variieren die Mengen und relativen Anteile der beiden Rezeptoren in verschiedenen Zelltypen. Diese Variationen werden zum Teil durch Entwicklungsvorgänge gesteuert; sie betreffen den Phänotyp der Zelle und ihren Differenzierungszustand und können teilweise vorübergehend durch Cytokine und immunstimulierende Bestandteile von Pathogenen induziert werde^12–22. Untersuchungen über die Funktion der beiden TNF-Rs weisen darauf hin, dass sie unterschiedliche Aktivitäten besitzen, die sich dennoch gegenseitig beeinflussen^23–28, und dass der Grad ihrer Aktivität dem Ausmaß ihrer Expression durch die Zelle entspricht^29,30. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass die Mechanismen, die die Mengen und relativen Anteile der beiden TNF-Rs beeinflussen, bedeutenden Einfluss sowohl auf die Art als auch auf das Ausmaß der zellulären Antwort auf TNF haben können, und damit bedeutende Determinanten der physiologischen wie auch der pathologischen Manifestation der Wirkung dieses Cytokins bilden.
Um die schädlichen Auswirkungen von TNF zu hemmen wurden Wege und Mittel gesucht, in die Bindung von TNF an seine Rezeptoren einzugreifen. So wurden neutralisierende Antikörper gegen TNF hervorgebracht ( EP 186 833 ). Ein anderer Ansatz, die Wirkung von TNF zu hemmen, war die Bereitstellung löslicher TNF-Rezeptoren, die mit den Zelloberflächen-TNF-Rs um die Bindung mit TNF konkurrieren ( EP 308 378 und EP 398 327 ).
Da TNF an seine Rezeptoren binden muss um seine Wirkung auszuüben, sollte es möglich sein, die schädlichen Auswirkungen von TNF zu verringern oder zu hemmen, wenn weniger oder keine Zelloberflächen-Rezeptoren exprimiert werden. Aus dem selben Grund kann es in gewissen Fällen wünschenswert sein, die vorteilhafte Wirkung von TNF zu verstärken, und das könnte unter Umständen in einem solchen Fall erreicht werden, indem die Menge der exprimierten Zelloberflächen-Rezeptoren erhöht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Promotor-Sequenz des menschlichen p55 TNF-R-Gens bereit, die stromaufwärts vom 5'-Ende des Gens lokalisiert ist und in einer 976 bp-Sequenz enthalten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung das NheI-PstI-Fragment des genomischen Volllängen-Clons bereit, der den menschlichen p55 TNF-R codiert.
Die Erfindung stellt ebenfalls das NheI-EcoRI-Fragment des vorstehenden NheI-PstI-Fragments bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin das BglII-EcoRI-Fragment des vorstehenden NheI-EcoRI-Fragments bereit.
Eine Promotor-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Diagnose von entweder geerbten oder erworbenen Mutationen in der Promotor-Region, die zur Pathologie von Krankheiten beitragen, verwendet werden.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Sequenz-Motive, die in den vorstehend beschriebenen Promotor-Sequenzen vorhanden sind, bereit. Es ist gezeigt worden, dass solche Motive bestimmte Transkriptionsfaktoren binden, die für die Promotoraktivität nötig sein könnten und die an der Regulation dieses Promotors beteiligt sein könnten.
Diese Motive können durch Deletion der ungewollten Sequenzen, die sich stromaufwärts oder stromabwärts des gewünschten Motivs in der Sequenz voller Länge befinden, hergestellt werden, d. h. indem Restriktionsenzyme verwendet werden, um die vollständige Promotor-Sequenz zu spalten, um zu dem gewünschten Motiv zu gelangen; das daraus hervorgegangene Motiv kann dann zusammen mit geeigneten Kontrollsequenzen und anderen herkömmlichen Mitteln, die dazu benötigt werden, einen Vektor zu erhalten, der nach Einbringung in einen geeigneten prokaryotischen Stamm dazu tauglich ist, bei der Züchtung des Stammes das gewünschte Motiv zu exprimieren, in einen Vektor eingesetzt werden.
Das dadurch erhaltene Motiv kann verwendet werden, um z. B. eine menschliche genomische Genbank oder eine cDNA-Genbank nach Faktoren, z. B. Transkriptionsfaktoren, die daran binden, zu durchmustern. Wenn diese Faktoren einmal isoliert, gereinigt und mithilfe aller herkömmlichen Mittel identifiziert worden sind, sollte deren Hemmung die TNF-R Bildung hemmen, während deren vermehrte Herstellung eine erhöhte TNF-R-Expression bewirken sollte, was auf diesem Wege zum gewünschten Effekt, nämlich der Modulierung der Wirkung von TNF, d. h. zur Hemmung oder Verstärkung der Bindung von TNF an seine Rezeptoren, führt.
Da die Menge von in vivo vorhandenen spezifischen Transkriptionsfaktoren nicht unbegrenzt ist, könnte die Hemmung der TNF-R Expression und der daraus folgenden Hemmung schädlicher Auswirkungen von TNF auch durch Expression einer großen Anzahl an Motiven oder Motiv-Regionen erreicht werden. Diese werden mit Promotoren, die solche Motive oder Motiv-Regionen enthalten, um die Bindung mit den Transkriptionsfaktoren konkurrieren. Eine „Motiv-Region" umfasst das Motiv selbst, zusammen mit Sequenzen, die auf beiden Seiten angrenzen, oder mehrere Motive, die durch Teile der Sequenz des gesamten Promotors verbunden sind und an die auf beiden Seiten Sequenzteile angrenzen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die ein Sequenz-Motiv gemäß der Erfindung einschließen.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Arzneimittel bereit, die eine Motiv-Region gemäß der Erfindung umfassen.
1 zeigt die Nucleotidsequenz der 5' an das p55 TNF-R-Gen angrenzenden Sequenz, sowie das erste Exon und einen Teil des ersten Introns. Das A des ATG-Translationsstarts ist als +1 definiert. Transkriptionsstartstellen, wie sie mithilfe von S 1 Nuclease-Kartierung bestimmt wurden (3), sind durch Pfeile dargestellt. Potentielle Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sind durch Linien über der Sequenz angezeigt. Die Konsensus Intron-Donor-Stelle ist unterstrichen.
2 zeigt die Aktivität von p55 Promotor-Konstrukten in HeLa-Zellen. Linke Seite: Diagrammartige Darstellung von Promotor-Konstrukten. Die Zahlen über dem Schema entsprechen Nucleotid-Nummern wie in 1. Die gestrichelte Linie in Konstrukt P6 stellt eine Deletion dar. Rechte Seite: Relative Werte der CAT-Aktivität, die von den Konstrukten nach transienter Transfektion erhalten wurden, wobei 100 einer Acetylierung von CAT von 4% entspricht.
3 zeigt die S 1 Nuclease-Kartierung von Transkriptionsstartstellen der p55 TNF-Rezeptor-mRNA. Gesamt-RNA (100 μg) von HeLa-, U937- oder A9-Zellen, oder 100 μg Hefe-tRNA wurde einer S 1 Nuclease-Analyse unter Verwendung von 5'-endmarkierten ds (doppelsträngigen)-DNA-Sonden unterzogen. Pfeile zeigen geschützte Fragmente unter Angabe deren Länge in Nucleotiden. Der Pfeil bei 273 Basen zeigt eine unverdaute StyI-Sonde. Einander entsprechende Banden, die mithilfe verschiedener Sonden erhalten wurden, sind mit Linien verbunden; die Zahlen an den Linien zeigen wie in 1 Nucleotid-Positionen an. Eine Sequenzier-Leiter, die als Molekulargewichts-Marker (links gezeigt A-C-G-T) diente, wurde unter Verwendung des genomischen Clons als Vorlage und eines Oligonucleotids 5'GGTGACAGTTGAGGGTTGAGACT, das 5 Nucleotide stromaufwärts vom 3'-Ende der StyI-BglII-Sonde positioniert war, erhalten.
Spur 1: SmaI-BglII-Sonde. Spur 2 bis 5: S 1 Nuclease-Analyse unter Verwendung der SmaI-BglII-Sonde. Spur 6 und 7: S1 Nuclease-Analyse unter Verwendung der StyI-BglII-Sonde. Spuren 2 und 7: A9 RNA; Spuren 3 und 6: HeLa-RNA; Spur 4: U937 RNA; Spur 5: HefetRNA.
4 zeigt in ihrem oberen Teil den Nucleotidgehalt der 5'-Region des p55 Gens. Der Prozentsatz von G/C und C/T und die Häufigkeit des CpG Dinucleotid-Paares wurden in einem Fenster von 200 Nucleotiden für die in 1 dargestellte Sequenz berechnet. Der untere Teil von 4 zeigt ein Diagramm der 5'-Region. Die Pfeile kennzeichnen bedeutende Transkriptionsstartstellen.
Ein genomischer Volllängen-Clon des menschlichen p55 TNF-R wurde aus einer menschlichen genomischen Genbank isoliert. Es hat sich gezeigt, dass der Clon 809 Basenpaare (bp) stromaufwärts über die Translationsstartstelle des TNF-R hinausgeht. Ein 1,16 kb NheI-PstI-Fragment dieses Clons wurde subkloniert und mehrere Deletions-Konstrukte davon hergestellt.
Das 1,16 kb-Fragment besitzt Promotor-Aktivität, was durch dessen Fähigkeit, eine wirkungsvolle Expression des CAT-Reportergens in menschlichen HeLa-Zellen (und Maus-A9-Zellen) zu steuern, gezeigt wurde. Deletions-Konstrukte dieses Clons haben gezeigt, dass die Promotor-Aktivität auf ein 178 by BglII-EcoRI-Fragment beschränkt war, das den größten Teil der Transkriptionsstartstelle beinhaltete. Eine weitere Analyse hat gezeigt, dass ein Minimalpromotor von 69 by immer noch Aktivität aufweist.
Eine S1 Nucleaseverdau-Analyse der RNA aus HeLa- und U 937-Zellen mit DNA-Sonden hat in beiden Zelllinien multiple Transkriptionsstartstellen zum Vorschein gebracht. Die Position dieser Startstellen war mit allen verwendeten Sonden identisch.
Es hat sich gezeigt, dass die Promotor-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung Promotoren von Haushalts-Genen ähnelt, z. B. der Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase⁶¹, dem EGF-Rezeptor⁶², dem NGF-Rezeptor⁶⁰, oder dem p55 Interleukin-l-Rezeptor⁶³. Sie besitzt keine TATA-Box und kein CCAAT-Motiv und hat einen relativ hohen Gehalt an G und C-Resten an ihrem 3'-Ende. Das proximal gelegene 5'-Ende des ersten Introns besitzt sogar einen noch höheren Gehalt an G- und C-Resten. Diese Region hat auch einen hohen Gehalt an dem Dinukleotid-Paar CpG, das Differenzierungs-abhängige Veränderungen der Promotor-Aktivität als Funktion des Ausmaßes an Methylierung dieser Nucleotide gestatten könnte.
Die oben beschriebenen Eigenschaften stimmen mit der Vielzahl von Transkriptionsstartstellen für das p55 TNF-Rezeptor-Gen überein. Sie stimmen ebenfalls mit dem gegenwärtigen Wissensstand über die Art und Weise, wie dieses Gen reguliert wird, überein: es zeigt konstitutive Expression in einer Vielzahl verschiedener Zellen, z. B. Fibroblasten^5,6, einschließlich einiger, in denen das Rezeptorprotein kaum nachgewiesen werden kann, z. B. in den U937-Zellen (vergleiche ⁹ und ⁵), in einem Ausmaß, das in Zusammenhang mit deren Differenzierungsstadium variieren kann²². Im Gegensatz zu diesen Haushaltsgen-Eigenschaften des Gens, das den p55-Rezeptor kodiert, wird TNF selbst vorübergehend von nur wenigen Zelltypen in strikter Abhängigkeit von induzierenden Mitteln gebildet⁶⁴. Dementsprechend weisen die Promotoren sowohl vom TNFaα als auch vom TNFβ-Gen Eigenschaften auf, die charakteristisch für induzierbare Gene sind⁶⁵ (besprochen in: ⁶⁶). Diese Unterschiede in der Regulation der Expression von TNF und seinen Rezeptoren stimmen mit der physiologischen Rolle von TNF überein. Da es als „Alarmsignal" fungiert, insbesondere während des Eindringens von Pathogenen, wäre die Bildung dieses Cytokins auf den Zeitraum beschränkt, in dem es gebraucht würde, während die Fähigkeit darauf zu reagieren, was vollständig von der Expression von TNF-Rezeptoren abhängig ist, permanent gewährleistet wäre. Generell würde man erwarten, dass die Rezeptoren für Cytokine auf weniger eingeschränkte Art und Weise exprimiert werden, als die Cytokine selbst, sowohl was den Zeitpunkt der Expression als auch den Zelltyp, in dem diese stattfindet, betrifft. Der Promotor für den NGF-Rezeptor, dessen extrazelluläre Domäne evolutionär zu denen der TNF-Rezeptoren verwandt ist, weist ebenfalls Haushaltsgen-Eigenschaften auf⁶⁰. Wie der Promotor für den p55 TNF-R fehlen ihm ebenfalls CCAAT- und TATA-Elemente, er besitzt multiple Transkriptionsstartstellen und zahlreiche G/C-Reste. Dennoch ist der Aufbau der beiden Promotoren in anderer Hinsicht recht unterschiedlich. Während beispielsweise die 5'angrenzende Sequenz des NGF-Rezeptor-Gens sehr viele G/C-Reste besitzt (71%), ist die G/C-reiche Region im p55 TNF-R auf die Region stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstellen beschränkt und ist besonders auffallend am 5'-Ende des ersten Introns (70% G/C, by 40-200).
Wie oben erwähnt, besitzen einige bekannte Rezeptoren Eigenschaften von Haushaltsgenen. Die Gene einer Reihe von bekannten Rezeptoren werden auch vorübergehend moduliert und enthalten die Regulations-Elemente, die für eine solche Regulation nötig sind (z. B. die IL-2 Rezeptor Alpha-Kette⁶⁷). Eine Untersuchung der Promotor-Sequenz des p55 Rezeptors offenbart Sequenz-Motive, die, in ähnlicher Weise, eine Antwort auf Transkriptionsfaktoren erlauben könnten, die von induzierenden Mitteln beeinflusst werden, einschließlich Konsensus-Sequenzen für AP2 und NF-kB. Diese Regulations-Elemente könnten vorübergehende induzierte Veränderungen ermöglichen, die das Muster der konstitutiven Expression des Rezeptors überlagern, eventuell herbeigeführt durch bestimmte Cytokine, die an Entzündungsherden gebildet werden. Vorübergehende Veränderungen der TNF-Bindung, die teilweise durch veränderte Expression des p55 TNF-R herbeigeführt werden, wurden in einer Reihe von Untersuchungen beobachtet^12–19, allerdings muss noch herausgefunden werden, ob diese Veränderungen auf der transkriptionellen oder posttranskriptionellen Ebene stattfinden.
Von den mutmaßlichen Motiven, die in der Promotor-Region erkannt werden können, ist die Sequenz GGCCTCCTCCTCC, die bei by -332 und -309 zu finden ist, von besonderem Interesse. Die Sequenz TCCTCCTCC innerhalb dieses Motivs kommt auch im Promotor des EGF-Rezeptors vor und ist essentiell für dessen Promotoraktivität; sie stellt eine Nuclease S 1-hypersensitive Stelle dar und bindet einen SP-1-ähnlichen Faktor⁵¹. Die Region, die diese Elemente umgibt, weist insgesamt ein zahlreiches Vorkommen von C/T auf – eine Eigenschaft, die mit DNAse-Hypersensitivität und Bereichen aktiver Transkription im Chromosom in Verbindung gebracht worden ist. Daher wird angenommen, dass diese Region auch für die Promotoraktivität des p55 TNF-Rezeptors benötigt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Sequenz-Motiv oder eine Motiv-Region der Erfindung einschließen. Diese Zusammensetzungen können gegen beliebige Krankheiten, die durch einen Überschuss an TNF verursacht sind, der entweder endogen vorhanden ist oder exogen verabreicht wurde, eingesetzt werden. Krankheitsbeispiele sind septischer Schock, Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen, rheumatische Krankheiten und andere Autoimmunkrankheiten.
Die Verabreichung kann auf dem Wege einer beliebigen der akzeptierten Arten der Verabreichung für ähnliche Mittel stattfinden und wird von dem zu behandelnden Zustand abhängen, z. B. je nach Bedarf intravenös, intramuskulär, subkutan, durch lokale Injektion oder topische Anwendung.
Die Arzneimittel der Erfindung werden für die Verabreichung durch Mischung des Sequenz-Motivs oder der Motiv-Region mit physiologisch verträglichen Trägern, Stabilisatoren und Arzneistoffträgern hergestellt und in Dosierungsform gebracht, z. B. durch Lyophilisierung in Dosierungs-Fläschchen. Die Menge des zu verabreichenden Wirkstoffs wird vom Weg der Verabreichung, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand des Patienten abhängen. Lokale Injektion beispielsweise wird einer auf das Körpergewicht bezogenen geringeren Menge bedürfen als z. B. intravenöse Infusion.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht:
Zelllinien und Anzuchtbedingungen
Die menschliche HeLa³¹- und die A9 Maus-Zelllinie wurden in Dulbecco's modifizierter Eagle's-Nährlösung kultiviert. Die menschliche histiozytäre Zelllinie U937³³ wurde in RPMI 1640-Nährlösung kultiviert. Beiden Nährlösungen wurde 10% fetales Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100μg/ml Streptomycin zugesetzt. Die Zellkulturen wurden in einer 5% CO₂-Athmosphäre bei 37°C gehalten.
Beispiel 1: Klonierung und Sequenzierung
Die Klonierung und einige Eigenschaften des genomischen Volllängen-Clons, der das p55 Gen kodiert sind beschrieben worden³⁴. Ein 1,16 kb NheI-PstI-Fragment dieses Clons, das einen Teil des ersten Introns des p55 Gens, das erste Exon, die 5'-angrenzenden Gensequenzen und 180 by vom linken Arm des Phagen Lambda einschließt, wurde in den pBluescript-Vektor subkloniert, der mit XbaI und PstI verdaut war. Dieses Konstrukt wurde NP genannt. Teildeletionen dieses Konstrukts wurden unter Verwendung der internen Restriktionsschnittstellen EcoRI und BglII hergestellt. Ein 3'-Deletions-Konstrukt, NR (siehe 2B), wurde durch Verdau des NP-Konstrukts mit EcoRI geschaffen, wobei by -211 bis +168 des Inserts (die Nummerierung beginnt am ATG Translationsstart, siehe in 1) ausgeschnitten wurde, und anschließend das 3,69 kb Vektor-Fragment isoliert und wieder ligiert wurde. Ein weiteres 3'-Deletions-Konstrukt, NB, wurde durch Verdau des NP-Konstrukts mit BglII und EcoRI geschaffen, wobei by –384 bis +168 des Inserts ausgeschnitten wurden, anschließend die Enden mit Klenow-Polymerase abgestumpft wurden, und das 3,55 kb Vektor-Fragment isoliert und wieder ligiert wurde. Ein 5'-Deletions-Konstrukt, BP, wurde durch Klonierung des 0,54 kb BglII-PstI-Fragments des genomischen Phagen (von by –384 bis +168) in den mit BamHI und PstI verdauten Vektor pBluescript erhalten. Die Promotor-Fragmente wurden aus pBluescript mit SacI und SaII ausgeschnitten und in den mit SacI und SaII verdauten CAT-Expressionsvektor pGEMCAT (ein großzügiges Geschenk von Dr. J. Chebath³⁵) kloniert. DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode³⁶ durchgeführt. Die vorstehenden Konstrukte wurden unter Verwendung der T3 und T7-Primer von pBluescript sequenziert. Zusätzliche Sequenzinformation wurde von innerhalb der klonierten Sequenz unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer 5'CAATTCAGAATGCTTAGCTTT und 5'GATCAGTAAATTCCCAAGAAAGA erhalten. Das letztere Oligonucleotid, das bei by –809 in 1 beginnt, wurde auch in einer PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer T3 des Vektors pBluescript verwendet, um Promotor-Fragmente zu erzeugen, die nicht mit Sequenzen des Phagen Lambda verbunden sind.
Beispiel 2: Promotoraktivität einer 5'-Sequenz im p55 TNF-R Gen
Ein genomischer Volllängen-Clon des p55 TNF-R wurde aus einer menschlichen genomischen Genbank unter Verwendung eines partiellen cDNA-Clons des Rezeptors als Sonde isoliert³⁴. Eine Sequenzanalyse des 5'-Endes des Clons hat gezeigt, dass er 809 Nucleotide stromaufwärts über die Translationsstartstelle des Proteins hinausragt. Im Unterschied zur kodierenden Region⁴⁰ scheint die 5' herausragende Region nicht durch Introns unterbrochen zu sein.
Um festzustellen, ob die klonierte Sequenz Promotoraktivität aufweist, wurde ein von einer NheI-Stelle im linken Arm des Phagen Lambda bis zu einer PstI-Stelle an Pos. +168 in der Gensequenz reichendes Fragment und Teile dieses Fragments in pBluescript kloniert. Die Sequenz (P1) stromaufwärts vom Translationsstart-Codon ATG (bp –809 bis –1) wurde unter Verwendung von PCR-Technik subkloniert, und diese Sequenz sowie Deletionen davon wurden mithilfe einer transienten Transfektions-Untersuchung auf Expression von CAT-Aktivität untersucht. Wie in 2A gezeigt, hat das Volllängen-Fragment P1 effektiv die Expression des CAT Gens in menschlichen HeLa-Zellen gesteuert.
Eine Deletion von 206 by vom 3'-Ende des Fragments (Konstrukt P2) wies etwas erhöhte CAT-Expression auf. Diese Zunahme könnte zusammenhängen mit dem Auftreten zweier ATGs gefolgt von Stop-Codons im Leseraster in der entfernten Region (bei by –141 und –31), die eine effiziente Initiation der Translation hemmen könnten. In der Tat führte die Entfernung von nur 74 by vom 3'-Ende von P1, die das Stop-Codon für das 3'-ATG-Codon in der Leader-Sequenz beseitigte, zu verminderter CAT-Expression (Konstrukt P3). Ein signifikanter Anstieg wurde beobachtet, als 425 by vom 5'-Ende von P1 (Konstrukt P4) entfernt wurden, was das Vorhandensein eines negativen Regulationselements in der entfernten Region nahe legt. Eine noch höhere Promotor-Aktivität wurde bei der Entfernung von sowohl der 5' 425 by als auch der 3' 206 bp-Sequenz von P1 (Konstrukt P5) beobachtet. Das interne Deletions-Konstrukt P6 (Entfernung von by –663 bis –379) wies die selbe Aktivität auf wie P2, was nahe legt, dass sich das negative Regulationselement zwischen by – 809 und by –663 befindet. Die 425 by 5'-Region selbst besitzt keine Promotor-Aktivität (Konstrukt P7 in 2).
Eine weitergehende Deletions-Analyse des 178 bp-Fragments (Konstrukt P5 in 2) hat gezeigt, dass dessen Aktivität nicht durch Entfernung der by –238 bis –207 beeinflusst wurde, dessen Aktivität aber abnahm, wenn mehr 3'-Sequenzen (bis zu by –287) entfernt wurden. Die Entfernung von by –306 bis –207 hat allerdings die Promotor-Aktivität vollständig vernichtet. Daher besitzt die Sequenz zwischen –287 bis –238 verstärkende Aktivität, während sich der Kernteil des Promotors stromaufwärts von by –287 befindet. Am 5'-Ende des 178 bp-Fragments (P5 in 2) konnten by –385 bis –355 ohne Auswirkung entfernt werden, jedoch führte die weitere Entfernung von bis zu by –335 zu ungefähr fünffach verminderter Promotor-Aktivität. Die Grenzen des Kernbereichs des Promotors befinden sich daher zwischen by –355 und –287.
Beispiel 3: Identifizierung der Transkriptionsstartstellen
Die Transkriptionsstartstellen des p55 TNF-R Gens wurden mithilfe des Nuclease S₁ Protektions-Assays kartiert, wobei SmaI-BglII- (310 bp) und StyI-BglII- (274 bp) Fragmenten aus der 5'-Region des p55 TNF Rezeptor-Gens (5' ³²P-endmarkiert mit T4-Kinase an den SmaI- und StyI-Stellen) als DNA-Sonden verwendet wurden. Die Sonden wurden über Nacht bei 52°C an 100 μg kompletter RNA aus HeLa-, U937- oder A9-Zellen, hergestellt gemäß McDonald et al.³⁸, hybridisiert. Nach einstündigem Verdau bei 37°C mit 200 Einheiten S2-Nuclease (Boehringer, Mannheim) wurden die Reaktionsprodukte mit Ethanol gefällt und auf einem 6% Sequenzgel analysiert. Als Molekulargewichtsmarker dienten Sequenzreaktionen mit dem Oligonucleotidprimer 5'GGTGACAGTTGAGGGTTGAGACT (komplementär zu by –112 bis –134). Das 5'-Ende des Primers befindet sich 5 Nucleotide stromaufwärts vom 5'-Ende der StyI-Sonde (bp –110). S 1 Nucleaseverdau-Analyse der RNA aus HeLa- und U937-Zellen offenbarte multiple Startstellen der Transkription in beiden Zelllinien, die deutlichste bei G-268 (3 und Pfeile in 1, Nucleotid-Nummern beginnen beim Translationsstart-Codon ATG, siehe 1). Die Orte der Startstellen, wie sie durch eine Sonde, die von –111 bis -384 (StyI-BglII reicht, identifiziert wurden, waren mit denen identisch, die durch eine Sonde offenbart wurden, die von –75 bis –384 (SmaI-BglII reicht. Die Lage der Startstellen in HeLa- und U937-Zellen waren dieselben mit ähnlichen Anteilen ihrer Benutzung.
Beispiel 4: Transiente Transfektion und CAT-Test
HeLa- und A9-Zellen wurden in 9 cm-Schalen (500.000 Zellen/Schale) angesetzt und 16 h lang wachsen gelassen. CaPO4-Präzipitate von DNA³⁹ wurden dem Medium zugesetzt und 12 h lang auf den Zellen gelassen. Die Zellen wurden dann gespült und in frischem Medium 48 h lang wachsen gelassen, erneut gespült und von den Platten geschabt. Es wurden Extrakte hergestellt und der CAT-Test wie beschrieben³⁹ durchgeführt, wobei 20-25μg Protein pro Probe verwendet wurden. Die Inkubationszeiten lagen im Bereich zwischen 4-12h. Jeder Test wurde mindestens zweimal mit Duplikat-Transfektionen für jedes getestete Konstrukt durchgeführt.
Beispiel 5: Sequenz-Motive
Die Nucleotid-Sequenzen im p55-Promotor, des ersten Exons und eines Teiles des ersten Introns sind in 1 gezeigt. Es befindet sich keine TATA-Sequenz in der Nähe der Transkriptionsstelle. Die Sequenz TACAAA an Position –354, die mit geringer Effizienz als Alternative dienen würde⁴¹, ist zu weit entfernt von diesen Stellen, um funktionsfähig zu sein.
Anscheinend besitzt das 5'-Ende des genomischen Clons ebenfalls kein funktionsfähiges CCAAT-Motiv. Die Sequenz ATTGG, die einer CCAAT-Box des Promotors des hsp70-Gens ähnelt⁴², kommt dreimal vor: bei –631, –536 und –413. Allerdings befindet sich keines der drei Elemente innerhalb 60 bis 80 Nucleotide von den Transkriptionsstartstellen entfernt, was der Entfernung entspricht, die man gewöhnlich bei CCAAT-Elementen findet⁴³.
Eine Computer-Suche nach Sequenz-Motiven für Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, durchgeführt unter Verwendung des GCG-Programmpakets⁴⁴, offenbarte einige bekannte Motive, einschließlich dreier Konsensus-Stellen für NF-kB⁴⁵ an den Positionen –804 (revers), –73 (revers) und 194, eine Stelle für den Transkriptionsfaktor AP-2⁴⁶ bei –407 und eine AP-1-ähnliche Sequenz⁴⁷ bei –235. Der Kernbereich der Sequenz des ubiquitären Transkriptionsfaktors SP-1, GGCGGG⁴⁸ oder CCGCCC⁴⁹ befindet sich an den Positionen – 321, 313 und 364. Allerdings stimmt keine dieser potentiellen SP-1-Bindungsstellen vollständig mit der Konsensus-Sequenz G/T G/A GGCG G/T G/A G/A C/T überein, die von Briggs et al. vorgeschlagen wurde⁵⁰. An die mutmaßliche SP-1-Stelle an Position –321 grenzen zwei Nuclease S 1-hypersensitive Konsensus-Sequenzen (S 1 HS⁵¹) an. Die Sequenz, die sich stromabwärts der unbedeutenderen Startstelle bei Adenosin –210 befindet (ATTCTCTGGACT), weist hohe Homologie zu der entsprechenden Sequenz im „Initiator"-Motiv auf, das ursprünglich in dem Lymphocyten-spezifischen terminalen Desoxynucleotidtransferase-Gen definiert wurde (ATTCTGGGAGAC)⁵². Jedoch wies die Sequenz stromaufwärts von dieser Stelle keine Ähnlichkeit zu diesem Motiv auf. Innerhalb des Introns wurde eine Sequenz gefunden, die in mehreren transkriptionshemmenden Elementen vorkommt (NRE, AGCCTCTC an Pos. 122)⁵³.
Eine Reihe viraler Verstärker-Motive konnte ebenfalls erkannt werden. Die NF-kB-Stelle an Position –804 überlappt mit einer Sequenz, die sich im E2A-Promotor von Adenovirus befindet und die als Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor E2aE-Cb definiert ist⁵⁴. Eine weitere Konsensus-Sequenz, die sich in den Verstärkern der JC- und BK-Typ Polyomaviren sowie im SV40-Verstärker und in den regulatorischen Regionen mehrerer zellulärer Gene befindet, GGGXGGPuPu („JVC")⁵⁵, befindet sich bei 110, 349, –326 (revers) und –256 (revers).
Beispiel 6: Nucleotid-Häufigkeit
Ein hoher Gehalt an C und T Nucleotiden wurde mit DNAse-Hypersensitivität in Verbindung gebracht und wird an Orten aktiver Transkription auf dem Chromosom angetroffen⁵⁶. Eine große Anzahl des Dinucleotids CpG und Veränderungen im Methylierungsmuster von CpG-Regionen wurde mit dem Einfluss von Differenzierungs-Mechanismen auf die Genexpression in Verbindung gebracht⁵⁷, während die insgesamte Anzahl von G/C in Promotor-Sequenzen mit der Kontrolle von Haushalts-Genen in Verbindung gebracht wurde (z. B. ^58-60). Daher haben wir das 5'-Ende des TNF-Rezeptor-Gens auf diese Eigenschaften hin untersucht, indem wir den Gehalt an C/T, G/C und CpG in einem 200 Nucleotide breiten Fenster entlang dieser Region berechnet haben.
Wie in 4 gezeigt, besitzt eine bestimmte Region innerhalb dieser Sequenz, die ungefähr von Nucleotid –400 bis –100 reicht, einen hohen Gehalt an C und T Nucleotiden. Diese Region überlappt mit jener, in der sich die Transkriptionsstartstellen häufen. Eine bestimmte C/T-reiche Sequenz, GGCCTCCTCCTCC, kommt zweimal nahe stromaufwärts von der am weitesten 5' gelegenen Startstelle (bei Nucleotiden -332 und -309) vor.
Stromabwärts von der Region, in der sich viele C und T Reste befinden, gelegen, befindet sich eine Region mit hohem CpG-Gehalt; der höchste Gehalt kommt im 5'-Ende des ersten Introns vor. Eine insgesamt große Häufigkeit von C und G Nucleotiden wurde in der Region stromabwärts von ungefähr Nucleotid –331 beobachtet; wiederum war sie im 5'-Ende des ersten Introns des p55-Gens am höchsten (Nt. 40-200), wo die G und C Nucleotide zusammen 70% der Sequenz ausmachen.
Beispiel 7: Anfängliche Schritte zur Identifizierung von Faktoren, die an die Promotor-Region binden
Ein einfaches Mittel zur Identifikation von Faktoren, die an eine vorgegebene Sequenz binden, ist der elektrophoretische Mobilitätsveränderungs-Assay (EMSA), der in diesem Fall angewendet wurde. Das 178 bp-Fragment BglII-EcoRI (entspricht dem Konstrukt P5 in 2) wurde durch eine Auffüllungsreaktion unter Verwendung von Klenow-Polymerase und ³²PdCTP am 5'-Ende markiert. 10.000 cpm markiertes Fragment wurden zusammen mit 5μg koplettem Protein aus Kernextrakt von HeLa-Zellen bei verschiedenen Puffer-Konzentrationen inkubiert und auf einem 3,5% nativen Acrylamid-Gel aufgetrennt. Dieses Experiment zeigte das Folgende:

(1) einige unbedeutendere und eine bedeutendere Bande(n) wurden beobachtet, die möglichen Transkriptionsfaktoren, die an das BgIII-EcoRI-Fragment binden, entsprechen;
(2) Inkubation des Kernextrakts mit einem Überschuss an unmarkiertem BglII-EcoRI-Fragment verhinderte vollständig die Bindung, was darauf hinweist, dass die beobachteten Interaktionen spezifisch sind;
(3) Zugabe unspezifischer Kompetitor-DNA (Lachssperma-DNA) verminderte den Hintergrund, aber verhinderte nicht das Auftreten der bedeutenderen Bande;
(4) Salzkonzentrationen von bis zu 250 mM Na⁺ und K⁺ waren auf die Bindung ohne Wirkung, was erneut die spezifische Natur dieser Interaktion bewies, da unspezifische Bindung bei einer Erhöhung der Salzkonzentration oftmals vermindert oder gehemmt wird;
(5) eine Erhöhung der Mg⁺⁺-Konzentration bis zu 10 mM verminderte die Bindung aller beobachteten Komplexe, aber hemmte sie nicht vollständig;
(6) bei 20°C und bei 0°C wurden identische Bindungsmuster beobachtet;
(7) keine Bindung konnte beobachtet werden, wenn cytoplasmatische Extrakte von HeLa-Zellen verwendet wurden. Dies beweist einmal mehr die spezifische Natur der Bindung, da aktive Transkriptionsfaktoren erwartungsgemäß im Kern der Zelle lokalisiert sind.

Zusammengefasst legen diese Daten den Schluss nahe, dass wenigstens ein Faktor spezifisch mit der Region interagiert, die von wesentlicher Bedeutung für die Promotor-Aktivität der stromaufwärts gelegenen Gensequenz des p55 TNF-Rezeptors ist.
Beispiel 8: Reinigung von Transkriptionsfaktoren, die an die Promotor-Region binden
Funktionsfähige Motive in der Promotor-Region können durch schrittweise Entfernung von Nucleinsäure-Sequenz vom 3'- und/oder 5'-Ende des Promotors mithilfe herkömmlicher Mittel (Erase-a-Base Paket, Promega Corp.) identifiziert werden. Die deletierten Promotor-Fragmente werden dann auf Aktivität getestet. Genauso können interne Sequenzen durch in vitro-Mutagenese oder Linker-Durchmusterung entfernt oder geändert werden³⁹. Motive, die aktivierende Transkriptionsfaktoren binden, werden dadurch offenbart, dass die Promotor-Aktivität verloren geht, wenn sie entfernt oder mutiert werden. Umgekehrt werden Motive, die Transkriptionsfaktoren binden, die die Promotor-Aktivität unterdrücken, mithilfe mutierer oder deletierter Promotor-Fragmente, die im Vergleich zum Wildtyp-Promotor erhöhte Aktivität aufweisen, identifiziert. Eine detaillierte Analyse dieser Motive wird dann durch chemische Synthese von Oligonucleotiden mit der Sequenz des ursprünglichen Motivs und mutierten Formen davon ausgeführt. Diese Oligonucleotide werden mit den Promotor-Fragmenten, denen die entsprechenden Motive fehlen, verbunden, und das daraus hervorgegangene Konstrukt wird auf Promotor-Aktivität getestet. Wenn die ursprüngliche Aktivität wiederhergestellt wird, kann das Motiv als funktionell unverändert betrachtet werden, d. h. jene Mutationen, die in das Motiv eingeführt wurden, greifen micht in dessen Funktion ein. Wenn weniger Promotor-Aktivität bei einem mutierten Motiv beobachtet wird, kann andererseits darauf geschlossen werden, dass die Nucleotide, die im Vergleich zum Wildtyp-Motiv verändert wurden, wesentlich für dessen Funktion sind.
Sobald ein einen Transkriptionsfaktor bindendes Motiv identifiziert wurde, wird der entsprechende Transkriptionsfaktor isoliert. Zu diesem Zweck werden Extrakte aus verschiedenen Quellen auf hohe Expression dieses Transkriptionsfaktors überprüft. Die Menge an Transkriptionsfaktor kann mithilfe eines Gelverschiebungstests unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotide als 5'-endmarkierte ds-DNA-Sonden, die die Sequenz des funktionellen Motivs enthalten, gemessen werden.
Nach Identifizierung einer reichlichen Quelle des Transkriptionsfaktors können die Bedingungen, die für das optimale Binden benötigt werden, bestimmt werden. Unterschiedliche chemische Parameter wie pH, Vorhandensein verschiedener mono- und divalenter Kationen, Salzkonzentration und das Vorhandensein reduzierender Mittel, z. B. DTT oder Mercaptoethanol werden eingestellt, um dieses Ziel zu erreichen.
Nach Etablierung der optimalen Bindungsbedingungen für den Transkriptionsfaktor wird die Reinigung mithilfe herkömmlicher Methoden durchgeführt, z. B. durch Salzfällung, Phosphocellulose- und/oder DEAE-Chromatographie. Ein angereichertes Präzipitat des Transkriptionsfaktors wird dann auf einer DNA-Affinitäts-Säule, in der das Oligonucleotid, das das entsprechende Motiv enthält, an eine unlösliche Matrix gebunden ist, weiter aufgereinigt, und die den Transkriptionsfaktor enthaltende Lösung wird unter Bedingungen, die optimal für dessen Bindung sind, über die Säule gegeben. Nach Wegwaschen von Verunreinigungen wird der gereinigte Transkriptionsfaktor unter Bedingungen, die keine DNA-Bindung zulassen, z. B. pH-Verschiebung, Veränderung der Salzkonzentration oder Chelatbildung von divalentem Salz, das für die DNA-Bindung notwendig ist (gewöhnlich Zn⁺⁺), eluiert.
Nach Reinigung des Transkriptionsfaktors ist die Anwendung „reverser Genetik" auf dieses Molekül möglich: Protein-Sequenzierung, cDNA-Klonierung unter Verwendung degenerierter Oligonucleotide, die der Protein-Sequenz entsprechen und letztlich Klonierung des Gens, das den Transkriptionsfaktor kodiert, durch Überprüfung genomischer Genbanken unter Verwendung der cDNA als Sonde.
Wenn man alle diese Werkzeuge besitzt: genomische Clone, cDNA und gereinigte Transkriptionsfaktoren ist es möglich, Mittel und Wege zu bestimmen, um die Aktivität des Transkriptionsfaktors durch eines der folgenden Mittel zu steuern: (1) Beeinflussung des Promotors; (2) Beeinflussung der Bindung an dessen Ziel im Promotor des p55 Gens; oder (3) Modulierung seiner Aktivität.
Ein detailliertes Vorgehen für (1) wird in Beispiel 8 angegeben. Die Verfahren (2) und (3) können durch Durchmusterung einer großen Zahl von Medikamenten auf deren Einflussnahme auf die Funktion dieses Transkriptionsfaktors ausgeführt werden.
Beispiel 9: Modulierung der Promotor-Aktivität durch spezifische Sequenz-Regionen
Die Aktivität eines Promotors kann durch Abfangen von Transkriptionsfaktoren, die im Mangel vorhanden sind, reguliert werden. Dies kann durch Expression vieler Kopien des entsprechenden Motivs, an das die Transkriptionsfaktoren binden, erreicht werden. Dieser Mechanismus wurde kürzlich von Pai et al.⁶⁸ bewiesen, die den negativen Promotor-Bereich des c-myc Promotors in der CHO-Zelllinie aus Hamster exprimiert und vervielfältigt haben. Danach haben die Autoren eine erhöhte Expression des Hamster c-myc und die entsprechenden Veränderungen von Zellwachstum und -morphologie, die durch das myc-Protein ausgelöst werden, beobachtet. Auf ziemlich dieselbe Art und Weise ist es möglich, Promotorregionen zu vervielfältigen, die die Promotor-Aktivität aktivieren und verstärken und dadurch die Expression des entsprechenden Proteins zu vermindern.
In Bezug auf den p55-Promotor können entweder der ganze Promotor oder Teile davon, die als positive oder negative Regulations-Bereiche identifiziert wurden, aus der Promotor-Sequenz mithilfe von Restriktionsverdau oder Exonuclease-Entfernung unerheblicher Sequenzen ausgeschnitten werden. Die erhaltenen Fragmente werden dann mit einem Vektor, der Gen-Amplifikation erlaubt, verbunden und in eine Zelllinie, z. B. CHO-Zellen, die die Selektion auf vervielfältigte Vektor-Sequenzen erlaubt, transfiziert. Nach Selektion und Vervielfältigung werden die erhaltenen Clone von CHO-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene auf Expression des p55-Gens überprüft. Zusätzlich wird die Funktion der Rezeptoren mithilfe eines Cytotoxizitätstests mit TNF oder Antikörpern, die TNF nachahmen und mit dem Hamster-Rezeptor kreuzreagieren (z. B. die α-Maus p55-Antikörper), überprüft.
Nach Etablierung von Promotor-Regionen, die nach Vervielfältigung in diesem System die Aktivität des p55-Rezeptors modulieren, werden dieselben Regionen auf zwei Wegen in Zellen eingebracht, die keine Selektion auf vervielfältigte Genprodukte zulassen:

1) Coexpression von Promotor-Regionen, die mit einem Vektor verbunden sind, der einen viralen Replikationsursprung besitzt (z. B. SV40 oder EBNA), mit einem Vektor, der das T-Antigen (von SV40) oder EBNA-Antigen exprimiert. Dies gestattet die Replikation hoher Zahlen episomaler Kopien des eingebrachten Promotor-Fragments im Kern der Zielzelle und ahmt daher die Wirkung von DNA-Vervielfältigung integrierter Sequenzen nach.
2) Chemische Synthese eines ds-Oligonucleotids, das den Promotor-Bereich einschließt und die Anwendung ausreichender Mengen dieses Oligonucleotids auf Zellen ermöglicht genauso die entsprechenden Transkriptionsfaktoren abzufangen und somit die Promotor-Aktivität zu beeinflussen. Die Chemie der Oligonucleotide muss verändert werden um (a) das Oligonucleotid lipophiler zu machen, so dass es die Cytoplasma-Membran durchdringen kann und (b) seine Stabilität zu erhöhen, um dessen Abbau zu minimieren. Dies wird durch herkömmliche Mittel erreicht, z. B. durch Verwendung von Phosphothioat-gekoppelten Oligonucleotiden.

Referenzen
1. Tracey, J.T. et al. (1987) Nature, 230: 662-664.
2. Piquet, P.F. et al. (1987) J. Exp. Med., 166: 1280-89.
3. Beutler, B. und Cerami, C. (1987) NEJM, 316: 379-385.
4. Hohmann, H.-P. et al. (1989) J.Biol. Chem., 264: 14927-14934.
5. Engelmann, H. et al. (1990) J.Biol. Chem., 265 1531-1536 .
6. Brockhaus, M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3127-3131.
7. Loetscher, H. et al. (1990) Cell, 61: 351-359.
8. Schall, T.J. et al. (1990) Cell, 61: 361-370.
9. Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., 9: 3269-3278.
10. Smith, C.A. et al. (1990) Science, 248: 1019-1023.
11. Heller, R.A. et. al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6151-6155.
12. Aggarwal, B.B. et al. (1985) Nature, 318: 665-667.
13. Israel, S. et al. (1986) Immunol. Lett., 12: 217-224.
14. Tsujimoto, M. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun., 137: 1094-1100.
15. Ruggiero, V.J. et al. (1986) J. Immunol., 136: 2445.
16. Holtmann, H. und D. Wallach (1987) J. Immunol., 139: 1161-1167.
17. Ding, A.H. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264: 3924.
18. Porteu, F. und Nathan, C. (1990) J. Exp. Med., 17: 599-607.
19. Porteu, F. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266: 18846.
20. Ware, C.F. et al. (1991) J. Immunol., 147: 4229.
21. Erikstein, B.K. et al. (1991) Eur. J. Immunol., 21: 1033.
22. Winzen, R. et al. (1992) J. Immunol., 148: 3454.
23. Espevik, T. et al. (1990) J. Exp. Med., 171: 415-426.
24. Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 14497-14504.
25. Thoma, B. et al. (1990) J. Exp. Med., 172: 1019-1023.
26. Tartaglia, L.A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9292-6.
27. Gehr, G. et al. (1992) J. Immunol., 149: 911.
28. Heller, R.A. et al. (1992) Cell, 70: 47.
29. Brakebusch„ C. et al. (1992) ENBO J., 11: 943-950.
30. Vandenabeele, P. et al. (1992) J. Exp. Med., 176: 1015.
31. Gey, G.O. et al. (1992). Cancer Res., 12: 254-265.
32. Littlefield, J.W. (1964) Nature 203: 1142.
33. Sundstrom, C. und Nillson, K. (1976) Int. J. Cancer, 17: 565-577.
34. Derre, J. et al. (1991) Hum. Genet., 87: 231-233.
35. Benech, P. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7: 4498-4504.
36. Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467.
37. Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
38. McDonald, R.J. et al. (1987) Meth. Enzymol., 152: 223-226.
39. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
40. Fuchs, P. et al. (1992) Genomics, 13: 219-224.
41. Huang, D.H. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 12596-12601.
42. Morgan, W.D. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7: 1129-1138.
43. McKnight, S. and Tjian, R. (1986) Cell, 46: 795-805.
44. Devereux, J. et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 387-395.
45. Lenardo, M.J. und Baltimore, D. (1989) Cell, 58: 227-229.
46. Imagawa, M. et al. (1987) Cell, 51: 251-260.
47. Distel, R. et al. (1987) Cell, 49: 835-844.
48. Greene, J.M. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7: 3646-3655.
49. Jones, K.A. and Tjian, R. (1985) Nature, 317: 179-182.
50. Briggs, M. et al. (1986) Science, 234: 47-52.
51. Johnson, A.C. et al. (1988) Mol. Cell. Biol., 8: 4174-4184 .
52. Smale, S.T. and Baltimore, D. (1989) Cell, 57: 103-113.
53. Baniahmad, A. et al. (1987) EMBO J., 6: 2297-2303.
54. Jones, N.C. et al. (1988) Genes Dev., 2: 267-281.
55. Martin, J.D. et al. (1985) J. Virol., 53: 306-311.
56. Larsen, A. and Weintraub, H. (1982) Cell, 29: 609-622.
57. Bird, A.P. (1986) Nature, 321: 209-213.
58. Sauerwald, A. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 149 32-14937.
59. Srivastava, M. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 14922-14931.
60. Sehgal, A. et al. (1988) Mol. Cell. Biol., 8: 3160-3167.
61. Melton, D.W. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 2147.
62. Ishii, S. et al. (1985) Science, 230: 2592.
63. Ye, K., Dinarello, C.A. und Clark, B.D. (als Veröffentlichung eingereicht).
64. Giroir, B.P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4864-4868.
65. Nedospasov, S.A. et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 611.
66. Turetskaya, R.L. et al. (1992) in: B.B.a.V. Aggarwal, J. (Hrsg.) Tumor Necrosis Factor: Structure, Function and Mechanism of Action, Marcel Dekker, Inc., New York 56, S. 35-60.
67. Lowenthal, J.W. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2331-2335.
68. Pai et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 12428-31.

Claims

Promotorsequenz des humanen p55 TNF-R-Gens, die das BgIII-EcoRI-Fragment des NheI-EcoRI-Fragments des NheI-PstI-Fragments des genomischen Volllänge-Clons umfasst, der das humane p55 TNF-R codiert, wie in 1 dargestellt.
Sequenz nach Anspruch 1, umfassend by –354 bis –286 der Nucleotidsequenz von 1.
Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, die gekennzeichnet ist durch Deletionen von unerwünschten Sequenzbereichen, wobei die Sequenz noch Promotoraktivität zeigt.
Verfahren zur Herstellung eines Sequenzmotivs oder einer Sequenzmotivregion, das/die Promotoraktivität zeigt, umfassend die Deletion von unerwünschten Sequenzbereichen stromaufwärts und/oder stromabwärts des gewünschten Sequenzmotivs oder der gewünschten Sequenzmotivregion, das/die in der Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthalten ist, Einfügen des erhaltenen Sequenzmotivs oder der erhaltenen Sequenzmotivregion in einen Vektor, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Kontrollsequenzen, Einfügen des Vektors in einen geeigneten prokaryontischen Stamm, Züchten des Stamms und Isolieren des Sequenzmotivs oder der Sequenzmotivregion.