DE69529276T2

DE69529276T2 - Gezielte gentherapie

Info

Publication number: DE69529276T2
Application number: DE69529276T
Authority: DE
Inventors: Peter John Ratcliffe; John David Firth; Adrian Llewllyn Harris; Christopher William Headington PUGH; Ian James Stratford
Original assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Current assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Priority date: 1994-02-15
Filing date: 1995-02-15
Publication date: 2009-09-17
Anticipated expiration: 2015-02-16
Also published as: JP3924007B2; JPH09508531A; EP1136561A2; GB9402857D0; JP2006314331A; DK0745131T3; US6265390B1; WO1995021927A2; WO1995021927A3; ES2185695T3; US5942434A; EP1136561A3; EP0745131A1; ATE230439T1; DE69529276D1; EP0745131B1

Description

Die Erfindung betrifft hypoxisch induzierbare Expressionskontrollsequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, die solche Sequenzen enthalten, und deren Verwendung zur selektiven Ausrichtung von Anti-Krebs-Therapie und anderen Therapiearten, wo Zielzellen von Hypoxie beeinflußt werden.
Vile und Hart (1993) beschreiben ein Verfahren, bei dem bestimmte Genpromotoren, die bevorzugt in melanozytischen Zellen aktiv sind, dazu verwendet wurden, Genexpression eines Reportergens spezifisch für Melanomzellen in vitro und in vivo in Mäusen zu steuern. Konstrukte, die aus den Promotoren und dem Beta-Galaktosidase-Gen bestanden, wurden direkt in Mäuse injiziert, und das Reportergen wurde in Melanomzellen und in einigen normalen Melanozyten, aber nicht in umgebendem normalem Gewebe exprimiert. Jedoch werden gewebespezifische Promotoren in den Tumoren, die sie angreifen können, notwendigerweise begrenzt sein und auch dazu neigen, normale Zellen des betroffenen Gewebes anzugreifen (wie es in Vile und Hart erwähnt ist, siehe oben).
Krebs neigt dazu, die Blutzufuhr zu überwachsen und weist häufig Bereiche mit Hypoxie und Nekrose auf, die sie von normalem Gewebe unterscheiden. Dieses Merkmal macht Tumore auch beständig gegen Strahlung aufgrund niedriger Sauerstoffmengen, und eine Röntgenstrahlenbehandlung wird weniger wirksam. Bestimmte Gene, wie das Gen für Erythropoietin, sind dafür bekannt, daß sie durch Hypoxie reguliert werden. Erythropoietin ist ein Hormon, das Erythropoiese und somit den Blutsauerstoffgehalt reguliert. Cis-aktivierende DNA-Sequenzen, die als gewebespezifische, durch Hypoxie induzierbare Verstärker der humanen Erythropoietinexpression funktionieren, wurden identifiziert (Semenza et al., 1991). Von einer DNA-Verstärkersequenz, die 3' zu dem Maus-Erythropoietingen angeordnet ist, wurde gezeigt, daß sie einer Vielzahl heterologer Promotoren durch Sauerstoff regulierte Expression verleiht (Pugh et al., 1991). Es wurde weiterhin gezeigt, daß das Sauerstoff wahrnehmende System, welches die Erythropoietinexpression steuert, in Säugerzellen weit verbreitet ist (Maxwell et al., 1993).
Ein zweites Beispiel für einen mit Hypoxie assoziierten Regulator ist ein Regulator, der 5' zu dem Maus-Phosphoglyceratkinasegen-Promotor liegt. Die Sequenz des Regulators wurde veröffentlicht (McBurney et al., 1991), aber seine durch Hypoxie induzierbaren Eigenschaften wurden zuvor in der Literatur nicht erörtert oder definiert. Es wurde nun von den Erfindern erkannt, daß die native Sequenz des Regulators hypoxisch induzierbare Eigenschaften aufweist. Die verantwortlichen Nukleotide wurden definiert, und die Erfinder haben gezeigt, daß eine Wiederholung der Sequenz zu verstärkter Induktion des Gens, dessen Expression gesteuert wird, führt. Weiterhin haben die Erfinder gezeigt, daß die Verwendung des Interleukin-2-Gens unter gewebespezifischen Promotoren eine wirksame Strategie für das spezifische Angreifen von Tumoren ist.
Es gibt Anti-Krebs-Wirkstoffe, die unter Hypoxie aktiviert werden (Workman und Stratford, 1993), aber die Verwendung eines Wirkstoffaktivierungssystems, bei dem das Enzym, das die Wirkstoffe aktiviert, unter Hypoxie in hohem Maße zunimmt, liefert eine weitaus bessere therapeutische Wirkung.
Die Erfindung liefert ein Nukleinsäurekonstrukt mit wenigstens einem Gen, das ein Cytokin oder ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem codiert, welches wirksam mit einer hypoxisch induzierbaren Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
Wenn das Konstrukt in einer geeigneten Wirtszelle vorhanden ist, wird die Expression des Gens somit entsprechend dem Maß der Oxigenation reguliert werden. Vorzugsweise ist die Expressionskontrollsequenz ein Promotor oder ein Verstärker. In einer Wirtszelle unter hypoxischen Bedingungen wird die Expression des Gens initiiert oder hochgeregelt, wogegen unter Bedingungen von Normoxie (normale Sauerstoffmenge) das Gen in einer niedrigeren Menge oder überhaupt nicht exprimiert wird. Das Expressionsniveau kann entsprechend dem Grad der Hypoxie variieren. Somit kann ein Genprodukt, das therapeutische Aktivität besitzt, auf Zellen gerichtet sein, die von einer Krankheit betroffen sind, z. B. Tumorzellen.
Die von dem Gen in dem Konstrukt gemäß der Erfindung codierte Spezies kann z. B. ein Cytokin sein, wie Interleukin-2 (IL-2), welches dafür bekannt ist, daß es bei der Immunreaktion gegen Tumore aktiv ist. Es können auch Gene verwendet werden, die andere Moleküle codieren, welche eine Anti-Tumor-Wirkung haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Konstrukts gemäß der Erfindung ist die von dem Gen codierte Spezies ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem, z. B. das Thymidinphosphorylaseenzym, welches einen relativ inaktiven Wirkstoff in einen viel aktiveren umwandelt. Es wurde gezeigt, daß Transfektion des Thymidinphosphorylasegens in menschliche Brustkrebszellen in hohem Maße die Empfindlichkeit der Krebszellen für 5-Desoxy-5FU erhöht (siehe Beispiel 8). Das Thymidinphosphorylasegen wurde zuvor nicht als ein Mittel für die Gentherapie beschrieben. Ein weiteres Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem, welches verwendet werden kann, ist Cytosindesaminase, die den Pro-Wirkstoff-5-Fluorocytosin (5-FC) unter Bildung des Anti-Tumor-Mittels 5-Fluorouracil (5-FU) aktiviert. Ein weiteres Beispiel für ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem für die Verwendung in der Erfindung ist Cytochrom p450 zur Aktivierung des Wirkstoffs SR4233 (Walton et al., 1992).
Das Konstrukt gemäß der Erfindung kann mehr als ein Gen und mehr als einen Gentyp enthalten. Zusätzliche Gene können weitere Spezies mit Aktivität gegen eine Krankheit codieren, oder sie können Genprodukte mit anderen Aktivitäten haben.
Hypoxisch induzierbare Promotoren oder Verstärker können unter denjenigen ausgewählt werden, auf die hierin Bezug genommen wird, oder es können andere hypoxisch induzierbare Promotoren oder Verstärker sein. Es wird erwartet, daß andere hypoxisch induzierbare Promotoren oder Verstärker entdeckt werden; Sauerstoff wahrnehmende Systeme sind in Säugerzellen weit verbreitet und viele Gene sind wahrscheinlich unter hypoxischer Kontrolle.
Vorzugsweise umfaßt das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung wenigstens ein Hypoxie-Antwortelement, welches der Expressionskontrollsequenz Hypoxie-Induzierbarkeit verleiht. Es können z. B. zwei oder mehr Hypoxie-Antwortelemente miteinander verknüpft sein, so daß die Hypoxie-Induzierbarkeit erhöht wird und daß somit die Induktion des Gens oder der Gene unter Hypoxie verstärkt wird. Hypoxie-Antwortelemente können unter denjenigen ausgewählt sein, auf die hierin Bezug genommen wird, oder sie können andere Hypoxie-Antwortelemente sein. Wie oben erwähnt, sind Sauerstoff wahrnehmende Systeme in Säugerzellen weit verbreitet, und es wird erwartet, daß andere Hypoxie-Antwortelemente gefunden werden.
Das folgende Hypoxie-Antwortelement kann in dem Konstrukt gemäß der Erfindung verwendet werden:

a) Der folgende Abschnitt des Transkriptionsverstärkers, welcher 3' zu dem Maus-Erythropoietingen (Epo) liegt:
b) Einer der folgenden Abschnitte der 5'-flankierenden Sequenz des Maus-Phosphoglyceratkinasegens (PGK):

Bezüglich dieser PGK-Sequenzen wurde zuvor nicht erkannt, daß sie hypoxisch induzierbare Eigenschaften aufweisen.
Alle diese Sequenzen haben Pendants in menschlichen Genen und sind zwischen den Spezies hochgradig konserviert. Sie sind auch gut charakterisiert.
Die Erfindung liefert daher auch eine hypoxisch induzierbare Expressionskontrollsequenz, welche die folgende Nukleinsäuresequenz enthält:
oder eine Nukleinsäuresequenz mit erheblicher Homologie dazu. Diese Sequenzen kann man in der. EMBL-Datenbank unter der Hinterlegungsnummer M18735 bei den Nukleotiden 631 bis 654 und 634 bis 651 finden.
Das Konstrukt gemäß der Erfindung kann mehr als eine, z. B. drei oder mehr Kopien einer der oben genannten Epo- oder PGK-Sequenzen enthalten. Zusätzlich oder alternativ kann in dem Konstrukt ein längerer Abschnitt des Epo- oder PGK-1-Verstärkers oder der flankierenden Sequenz verwendet werden, wobei der längere Abschnitt das Hypoxie-Antwortelement und einen Teil der umgebenden Sequenz enthält.
Hypoxisch induzierbare Expressionskontrollsequenzen und Hypoxie-Antwortelemente können so ausgewählt werden, daß sie in bestimmten therapeutisch anzugreifenden Geweben oder Zelltypen wirksam sind, oder sie können so ausgewählt werden, daß sie in einem weiten Bereich von Geweben oder Zelltypen arbeiten.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Nukleinsäurekonstrukt, wie es hierin beschrieben ist, für die Verwendung in der Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit leidet, bei der Hypoxie eine Ursache oder ein Symptom oder in anderer Weise vorhanden ist. Alternativ liefert die Erfindung die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, wie es hierin beschrieben ist, bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit leidet, bei welcher Hypoxie eine Ursache oder ein Symptom oder in anderer Weise vorhanden ist, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Nukleinsäurekonstrukts, wie es hierin beschrieben ist, an den Patienten umfaßt.
Die Nukleinsäurekonstrukte sind zur Behandlung von Krebspatienten geeignet. In hypoxischen Tumorzellen werden die physiologischen Stimuli derart sein, daß das Gen, welches Aktivität gegen die Krankheit besitzt, exprimiert wird. Obwohl es sehr schwierig sein kann, alle Zellen dazu zu bringen, das Gen aufzunehmen, um es anzuschalten, zeigen Experimente, daß sogar mit 10% der Zellen, die das Thymidinphosphorylasegen exprimieren, eine Wirkung auf andere Zellen erzielt wird, was in einer 10-fachen Zunahme der Empfindlichkeit der gesamten Population resultiert. Dies ist als der Zuschauer-Effekt bekannt und ist wahrscheinlich auf aktive Metaboliten des Anti-Krebs-Wirkstoffs zurückzuführen, die von einer Zelle zu einer anderen hindurchtreten. Da dieser Wirkstoff proliferierende Zellen tötet, sollte er dennoch viel geringere Toxizität auf normales Gewebe als auf Krebszellen haben. Manchmal werden auch normale Zellen in der Nähe das Gen exprimieren, und der aktive Wirkstoff oder das Cytokin oder eine andere Spezies, die von dem Gen codiert wird, wird in der Lage sein, aus der normalen Zelle in den Tumor zu diffundieren.
Die Erfinder haben sowohl stabile als auch transiente Transfektion von Zellen mit Genen unter der Kontrolle von hypoxisch induzierbaren Verstärkern gezeigt. Transiente Transfektion dauert nur wenige Tage an, wogegen stabil transfizierte Gene in das Zellgenom eingefügt werden und unbegrenzt fortbestehen können. Stabile Transfektion kann sich für therapeutische Anwendungen der Erfindung als notwendig erweisen, jedoch ist es möglich, daß transiente Transfektion ausreichend sein wird.
Die Verabreichung von Konstrukten gemäß der Erfindung für therapeutische Zwecke kann durch Injektion von DNA direkt in den festen Tumor erfolgen. Bestimmte Typen von Zellen, einschließlich Tumorzellen, Hautzellen und Muskelzellen, nehmen nackte DNA auf, und bei Tumorzellen erfolgt dies besonders gut. Die Konstrukte können somit in der Form von nackten DNA-Plasmiden verabreicht werden. Alternativ können andere Vektoren, wie Retroviren, verwendet werden.
Eine geeignete therapeutische Methode wird die direkte Injektion von DNA in die betroffene Stelle und die Verabreichung eines Pro-Wirkstoffs im Falle eines Konstrukts, welches ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem codiert, wahlweise kombiniert mit Radiotherapie, sein.
Obwohl die Erfindung oben in Bezug auf das Angreifen von Tumorzellen beschrieben wird, ist sie auch für andere Krankheitstypen, bei denen Hypoxie auftritt, geeignet, einschließlich z. B. Koronararterienerkrankung und Schlaganfall. Das Nukleinsäurekonstrukt kann ein Gen umfassen, das ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem für einen geeigneten Wirkstoff codiert, oder das Gen kann ein Cytokin oder einen Wachstumsfaktor codieren. Ein vaskulärer Wachstumsfaktor kann dazu verwendet werden, die Bildung von neuen Blutgefäßen in hypoxischen Bereichen zu stimulieren, und die Expression des Wachstumsfaktors durch das Konstrukt wird dann automatisch abgeschaltet, wenn der Bereich revaskularisiert wird.
Die Erfinder haben Deletionsanalyse und Mutationsanalyse der Maus-Epo-Verstärkersequenz in den Zellinien HepG2 und a23 (a23 sind nicht Zellen, die kein Epo produzieren) durchgeführt. Es wurden Experimente mit transienter Transfektion durchgeführt, wobei Plasmide verwendet wurden, die vollständige oder teilweise Verstärkersequenzen enthielten, die 1,4 Kilobasen 5' zu dem α₁-Globin-Reportergen liegen.
Drei kritische Stellen für die Verstärkung wurden festgelegt, welche den Nukleotiden 5-12, 21-24 und 33-34 der 96 Nukleotide langen Verstärkersequenz entsprechen (Maus-Epo-Verstärker: EMBL-Hinterlegungsnummer X73471). Alle drei Bereiche waren absolut erforderlich für die Verstärkerfunktion in den oben genannten Experimenten. Aber insgesamt zeigten Untersuchungen, daß die 1-25- oder 1-26-Nukleotidsequenz hypoxisch induzierbare Funktion hat (EMBL, X73471, Nukleotide 407 bis 431 oder 432). Über die 1-26-Nukleotidsequenz induzierbare Funktion wurde auch für MEL- und HeLa-Zellen gezeigt, über die man zuvor herausgefunden hatte, daß sie nicht in der Lage sind, sauerstoffregulierte Reportergenexpression unter Verwendung von Plasmiden, welche die 1-96 Nukleotide lange Verstärkersequenz enthielten, zu unterstützen (Maxwell et al., 1993). Es wurden insgesamt 19 Zellinien (einige unbeschriebene) von den Erfindern getestet, und bei keiner wurde gefunden, daß ihr die Fähigkeit fehlt, sauerstoffabhängige Veränderungen der Reportergenexpression durch die Sequenz 1-26 zu modulieren. Obwohl früher angenommen wurde, daß die hypoxisch induzierbare Antwort nicht universal in Säugerzellen ist, erscheint es jedoch nun wahrscheinlicher, daß sie es ist.
Jüngere Studien des menschlichen Epo-Verstärkers definieren auch wenigstens drei kritische Bereiche der Sequenz (Semenza et al., 1992, und Blanchard et al., 1992).
Die folgenden Beispiele enthalten experimentelle Beweise der Erfinder, welche die Art und Weise zeigen, in welcher verschiedene Gesichtspunkte der Erfindung arbeiten.
BEISPIELE
Beispiel 1
Wirkung von Untersequenzen aus dem Maus-Epo-Verstärker auf einen benachbarten SV40-Promotor
1(A) zeigt die Struktur des Testplasmids, wobei E die Epo-Verstärkersequenz, SV40P den frühen SV40-Promotor und GH den Hauptteil des Gens des Wachstumshormons repräsentiert. Die in jedem Testplasmid verwendete Epo-Verstärkersequenz (E) ist unter den entsprechenden Balken des Histogramms angegeben. Ein cotransfiziertes Plasmid, welches das α₁-Globin-Gen alleine enthielt (pBsαa^–), wurde zur Korrektur bezüglich der Transfektionseffizienz verwendet. Die Expression wird auf diejenige des verstärkerlosen pSVGH in normoxischen Zellen normalisiert und repräsentiert den Mittelwert ± S. D. von drei unabhängigen Experimenten (B). Induzierbare Aktivität wird in allen Zelltypen von der Sequenz 1-25 vermittelt. Die induzierbare Aktivität war viel höher durch Konkatamerisierung dieser Sequenz, welche auch einige konstitutive Aktivität in normoxischen Zellen (1-25)₂ und (1-25)₅ förderte. Im Gegensatz dazu wurde weder konstitutive noch induzierbare Aktivität durch die Sequenz 25-60 in irgendeinem Zelltyp gefördert. Konkatamere dieser Sequenz wurden in jeder Orientierung (25-60)₃ und (60-25)₄ getestet, aber keine hatte irgendeine Wirkung. Die monomere Sequenz 1-60 war aktiver als die monomere Sequenz 1-25 in HepG2-Zellen und a23, aber nicht in MEL-Zellen.
Beispiel 2
Sauerstoffregulierte Kontrollelemente in den PGK-1- und LDH-A-Genen
Die nachfolgenden Materialien und Methoden werden in den Beispielen 3 bis 6 verwendet.
Zellinien und Kulturbedingungen
Die verwendeten Zellinien waren HepG2 (humanes Hepatom), HeLa (humanes Gebärmutterkarzinom) und L-Zellen (Maus-Fibroblasten), die in minimalem essentiellem Medium mit Earle's-Salzen, versetzt mit fötalem Rinderserum (10%), Glutamin (2 mM), Penicillin (50 Einheiten/ml) und Streptomycinsulfat (50 μg/ml), gezüchtet wurden. Zum Test der endogenen Genexpression und zur Herstellung von Kernextrakten wurden die Zellen bis etwa 70% Konfluenz gezüchtet. Das Medium wurde dann ersetzt und die Zellen den folgenden Bedingungen für 14–16 Stunden ausgesetzt: (1) Normoxie (20% Sauerstoff mit 5% CO₂ und 75% N₂); (2) Hypoxie (1% Sauerstoff mit 5% CO₂ und 94% N₂ in einem Napco 7100-Inkubator); (3) Hypoxie mit Cycloheximid (100 μM); (4) Normoxie mit Kobaltchlorid (50 μM); (5) Normoxie mit Cyanid (100 μM); (6) Hypoxie mit Cyanid (100 μM).
Transiente Transfektion
In allen Experimenten wurde das Testplasmid (10–100 μg), welches entweder humanes α₁-Globin (α) oder humanes Wachstumshormon (GH) als einen Reporter enthielt, mit einem Kontrollplasmid (10–50 μg) unter Verwendung von Elektroporation, wie sie zuvor beschrieben wurde (Pugh et al., 1991), cotransfiziert. Das Kontrollplasmid, dessen Expression durch Hypoxie nicht verändert wurde, war entweder das humane α₁-Globin-Gen, wenn das Testplasmid GH enthielt, oder FGH, ein Fusionsgen, das aus dem Maus-Ferritin-Promotor (290 Bp), verknüpft mit dem humanen Wachstumshormongen, besteht, wenn das Testplasmid das α-Globin-Gen enthielt.
Details der Gestaltung des Testplasmids sind folgende. Die Maus-PGK-1 5'-flankierende Sequenz, die in dem Grundkonstrukt (pPGKGH) verwendet wurde, war ein 502 Basenpaare langes Fragment der PGK-1-Sequenz in pDEneo, das sich von der EcoR1-Stelle bei –523 Bp (1 = Translationsinitiation) zu der Taq1-Stelle bei –21 Bp erstreckt. Die Maus-LDH-A-Gensequenz in pLDHGH wurde durch PCR-Vervielfältigung aus genomischer DNA der Maus von einem 233 Bp Fragment (–186 bis +47 von der Transkriptionsstartstelle) unter Verwendung von Oligonukleotiden, die aus einer veröffentlichten Sequenz abgeleitet waren, erzeugt. Plasmid-DNA für die Transfektion wurde über einen Cäsiumgradienten gereinigt; die Nukleotidsequenz der wichtigen Elemente für alle Plasmide wurde durch direkte Sequenzierung bestätigt.
Nach der Elektroporation wurden die transfizierten Zellen gleichmäßig ausgesät und parallel für 14–16 Stunden in 8 ml Kulturmedium in 100 mm Petrischalen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen inkubiert oder chemischen Mitteln ausgesetzt, wie es oben beschrieben ist.
RNA-Analyse
RNA wurde extrahiert, unter RNase-Schutz analysiert und wie zuvor beschrieben (Pugh et al., 1991) quantifiziert. Zum Testen von transient transfiziertem Material wurden 3–10 μg RNA einer Doppelhybridisierung mit Sonden unterzogen, welche 120 Bp von GH-mRNA und entweder 132 Bp (α132) oder 97 Bp (α97) der α-Globin-mRNA schützten, abhängig davon, ob das Test- oder das Kontrollpiasmid α-Globin enthielt.
Zum Testen von endogener PGK-1-Genexpression wurden 50 μg RNA, die aus HepG2-Zellen extrahiert worden waren, mit einer Ribosonde hybridisiert, die aus 121 Bp von dem 5'-Ende des Exons 3 des humanen PGK-1-Gens zusammen mit 68 Bp des benachbarten Introns bestand (erhalten durch PCR von genomischer DNA und Klonieren nach Standardmethoden). Für den Test von endogener LDH-A-Genexpression wurden 25 μg RNA, die aus L-Zellen erhalten worden war, mit einer Ribosonde hybridisiert, welche aus 47 Bp von dem 5'-Ende von Exon 1 des Maus-LDH-A-Gens, zusammen mit der benachbarten 5'-flankierenden Sequenz bestand (erhalten durch PCR von genomischer DNA und Klonierung nach Standardmethoden). In diesen Experimenten wurde eine geringe Menge (0,5 μg) von RNA, die aus K562-Zellen extrahiert worden war (einer humanen Epo-Zellinie, die α-Globin-mRNA in großer Menge exprimiert), zu jeder Probe vor der Hybridisierung hinzugegeben, und die Proben wurden gleichzeitig mit der α97-Sonde zusätzlich zu der PGK-1- oder LDH-A-Sonde sondiert. Dies lieferte ein Mittel zur Bestimmung, daß die Probenverarbeitung und die Gelbeladung zwischen den Proben vergleichbar waren.
Kernextrakt
Die Zellen wurden schnell gekühlt, in eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinein geerntet und bei 2000 × g pelletiert. Eine Modifikation des Protokolls von Dignam wurde zur Herstellung von Kernextrakt verwendet. Kurz gefaßt wurden die Zellen für 10 Minuten in Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂) gequollen, unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators lysiert und für 30 Minuten in Puffer C (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 420 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 20% Glycerin) extrahiert. Kerntrümmer wurden bei 10000 × g pelletiert und der Überstand für zwei Stunden gegen Puffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 20% Glycerin) dialysiert. Das gesamte Verfahren wurde bei 4°C unter Verwendung vorgekühlter Puffer durchgeführt. Darüber hinaus enthielten die Puffer A und C Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,5 mM; Aprotinin, 1 μg/ml; Leupeptin, 1 μg/ml; Pepstatin, 1 μg/ml; Natriumorthovanadat, 1 μM; Benzamidin, 0,5 mM; Levamisol, 2 mM; β-Glycerophosphat, 10 mM; DTT, 0,5 mM. Natriumorthovanadat und DTT wurden auch zu Puffer D hinzugefügt. Nach der Dialyse wurden aliquote Teile von Kernextrakt in einem Trockeneis-/Ethanol-Bad eingefroren und bei –70°C gelagert.
Test der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung
Oligonukleotide, die als Sonden oder Verdränger verwendet wurden, wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die Markierung wurde mit {gamma-³²P}ATP (3000 Ci/mmol) unter Verwendung von T₄-Polynukleotidkinase durchgeführt. Die markierten Oligonukleotide wurden mit vierfachem molarem Überschuß des komplementären Strangs einer Doppelstrangbildung unterzogen.
Die Bindungsreaktionen wurden in einem Volumen von 20 μl durchgeführt mit 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 5% Glycerin und 0,15–0,30 μg ultraschallbehandeltes PolydldC. Kernextrakt (5 μg, wenn nicht anders angegeben) wurde mit diesem Gemisch für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor Sonde (etwa 0,5 ng) und spezifische Verdränger hinzugefügt wurden. Die Inkubation wurde für weitere 10 Minuten fortgesetzt. Die Reaktionsansätze wurden der Elektrophorese unterzogen (12,5 v/cm) bei 4°C unter Verwendung von 5% Polyacrylamid in 0,3 × TBE (pH 7,3 bei 4°C).
Beispiel 3
RNA-Analyse von PGK-1- und LDH-A-Genexpression
Die Expression des endogenen humanen PGK-1-Gens in HepG2-Zellen und des endogenen Maus-LDH-A-Gens in L-Zellen wurde durch RNA-Analyse untersucht. Die Zellen wurden für 16 Stunden Normoxie (20% O₂), Hypoxie (1% O₂) und 100 μM Cycloheximid, Normoxie und 50 μM Kobaltchlorid, Normoxie und 100 μM Cyanid, Hypoxie und 100 μM Cyanid ausgesetzt. 50 mg RNA wurden für jede Hybridisierungsreaktion verwendet. Für jedes Gen führten sowohl Hypoxie als auch das Aussetzen an Kobalt zu einer 2–3-fachen Induktion der Genexpression. Der Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid hob die Antwort auf Hypoxie auf. Cyanid beeinflußte nicht die hypoxische Antwort und induzierte weder Expression bei Normoxie, noch verhinderte es Induktion durch Hypoxie.
Beispiel 4
Lokalisierung von Sequenzen, die für Hypoxie-induzierbare Expression der endogenen PGK-1- und LDH-A-Gene verantwortlich sind
Teile der 5'-flankierenden Sequenz der PGK-1- und LDH-A-Gene wurden mit einem Wachstumshormonrezeptorgen verbunden. Expression in transfizierten HepG2-Zellen von Fusionsgenen, die entweder ein 502 Bp großes Fragment aus dem PGK-1-Verstärker/Promotor-Bereich (pPGKGH) oder eine 233 Bp lange Sequenz aus dem LDH-A-Promotor (pLDHGH) enthielten, wurde nach Aussetzen an Bedingungen der Hypoxie, Normoxie etc., wie sie in Beispiel 3 verwendet wurden, gemessen. In jedem Fall wurde die hypoxisch induzierbare Expression durch die Sequenz vermittelt, wobei man ein etwas größeres Maß an Induzierbarkeit beobachtet als für das entsprechende endogene Gen. Die induzierbare Funktion dieser Sequenzen stand im Gegensatz zu dem SV40-Viruspromotor, dem α-Globin-Promotor, dem Ferritin-Promotor und dem Herpes Simplex-Thymidinkinase-Promotor, von denen keiner diese Eigenschaft hatte. Die Antworten waren nicht spezifisch für HepG2-Zellen, und ähnlich induzierbare Antworten erhielt man in transfizierten HeLa-Zellen.
In diesem Beispiel wurden 5 μg RNA für jede Hybridisierungsreaktion verwendet, und die α132- und GH-Sonden wurden dazu verwendet, die Expression der Transfektionskontroll- bzw. -testplasmide festzustellen.
Beispiel 5
Deletionsanalyse des PGK-1-Verstärkerbereichs
2 zeigt (A) einen Teil der Nukleotidsequenz des 253 Bp langen EcoR1-Spe1-Fragments, welches die Verstärker enthält (EMBL-Hinterlegungsnummer M18735, Nukleotide 417 bis 676). Die Positionen von Deletionen (D) von dem 5'-Ende der Sequenz sind durch Pfeile markiert. 2(B) zeigt das Verhältnis von hypoxischer zu normoxischer Expression, die auf dem Reporter durch das EcoR1-Spe1-Fragment und die Deletion davon vermittelt wird. Werte repräsentieren Mittelwerte von drei getrennten Transfektionen, wobei die Balken SEM zeigen.
Eine Reihe von ineinandergeschachtelten Deletionen wurde durchgeführt, wie es in 2 gezeigt ist. Die größte Reduktion in der Höhe der hypoxischen Induktion trat mit einer Deletion von 20 Bp zwischen D9 und D11 auf. Die funktionale Bedeutung dieses Bereichs wurde durch die Beobachtung bestätigt, daß ein pGKGH-Fusionsgen, von dem 18 Bp zwischen den Positionen von D9 und D11 entfernt worden waren, nicht länger hypoxische Induzierbarkeit zeigte.
Beispiel 6
Funktionsanalyse des durch Sauerstoff regulierten Elementes des PGK-Verstärkers
Zur Analyse der funktionalen Eigenschaften dieser isolierten Sequenz (der in Beispiel 8 beschriebenen 18 Bp langen Sequenz) wurden Oligonukleotide in eine Stelle 10 Bp 5' von der TATA-Box des Herpes Simplex-Thymidinkinasepromotors in einem Thymidinkinase-Wachstumshormon-Fusionsgen kloniert. Das 18 Bp lange Element (P18), dessen Deletion die hypoxische Induktion des PGKGH-Konstrukts ausschaltete, war in der Lage, die Reaktion auf Hypoxie zu vermitteln, wenn es in irgendeiner Orientierung angeordnet war. Konkatamere wirkten stärker als Monomere. Eine Verlängerung von P18 auf ein 24 Bp langes Element (P24) führte nicht zu verstärkter Aktivität.
Beispiel 7
Stabile Transfektion von Zellen mit dem PGK-1-Hypoxiepromotor
HeLa-Zellen wurden durch Elektroporation mit superhelikaler Plasmid-DNA transfiziert. Stabil transfizierte Zellen wurden durch Züchtung in G418-Medium selektiert. Es wurden zwei Plasmide transfiziert. Das erste enthielt einen hypoxischen Promotor, der an das Gen für den Zelloberflächenmarker CD2 gekoppelt war, und das zweite enthielt den gleichen hypoxischen Promotor, der an das Gen für das Enzym Cytosindesaminase gekoppelt war, sowie einen konstitutiv wirkenden Promotor (SV40-Promotor für den frühen Bereich), der an einen Neomycin-Resistenzbereich gekoppelt war. Der hypoxische Promotor, der in diesem Transfektionsexperiment verwendet wurde, bestand aus einem 456 Bp langen Sph-1/Taq-1-Fragment aus der Maus-PGK-1 5'-flankierenden Sequenz, in welche drei Kopien der aktiven Sequenz P24 an der Spe1-Stelle eingefügt worden waren.
Dieses System war entworfen worden, um uns zu ermöglichen, bezüglich des Signalweges mutante Zellen zu erzeugen. Im wesentlichen werden die CD2- und Cytosindesaminasegene als selektierbare Marker verwendet, und das Neomycin-Resistenzgen liefert ein Mittel zur Beibehaltung des transfizierten Plasmids und daher zur Selektion von Zellen, die eher die Antwort als die transfizierten Gene verloren haben. Es ist klar, daß das Prinzip selektierbarer Marker dazu verwendet werden kann, gemäß der Erfindung unerwünschte Zellen zu töten.
Nach der Transfektion wurden die Zellen für zwei Wochen gezüchtet, und Pools wurden einer 16-ständigen Inkubation entweder bei 21% Sauerstoff (Normoxie) oder 1% Sauerstoff (Hypoxie) ausgesetzt. Die Markergenexpression wurde durch RNA-Analyse quantifiziert. Eine etwa 10-fach angestiegene Expression wurde bei 1% Sauerstoff gegenüber 21% beobachtet. Somit waren die selektierbaren Markergene unter der Kontrolle des hypoxisch induzierbaren Promotors.
Beispiel 8
Transfektion einer humanen Brustkrebszellinie mit Thymidinphosphorylasegen
Menschliche Brustkrebszellen der Zellinie MCF-7 wurden mit einem Gen für Thymidinphosphorylase transfiziert. Thymidinphosphorylase kann einen relativ inaktiven Wirkstoff in ein viel wirksameres Produkt umwandeln. Das Gen ist für eine Verknüpfung mit hypoxisch induzierbaren Promotoren/Verstärkern geeignet.
Es ist ein allgemeines Prinzip, daß, wenn Gene in Krebszellen transfiziert werden, sie in verschiedenen Mengen exprimiert werden, und daher ist es wichtig, mehrere verschiedene Klone der Zellen zu untersuchen, um die Variabilität zu erkennen.
Ergebnisse von Wirkstoffempfindlichkeitsexperimenten sind in den 3–7 gezeigt. –7, –4, –12, +4 und +16 sind alle Derivate von MCF-7, die mit dem Thymidinphosphorylasegen transfiziert wurden.
3 zeigt eine Überlebenskurve der Elternzellinie MCF-7 in Brustkrebs (WT) und ein Derivat davon, das mit einem Gen für Thymidinphosphorylase transfiziert wurde. Es besteht ein relativ geringer Unterschied in ihrer Empfindlichkeit auf den Wirkstoff 5FU. Jedoch ist der Transfektant (–4) nahezu 200-fach sensitiver auf 5-Desoxy-5FUdR (4).
5 zeigt, daß die Klone –12 und –4 im Vergleich zum Wildtyp besonders sensitiv für den Wirkstoff 5-Desoxy-5FUdR sind. Zwei andere Transfektanten, –7 und +4, und –16 sind ein bißchen sensitiver als der Wildtyp. Man beachte, daß es sich hier um eine logarithmische Skala handelt und daher ist die IC50 (die Konzentration an Wirkstoff, die erforderlich ist, um das Wachstum um 50% zu hemmen) für die Transfektanten –12 und –4 mehr als 100-mal geringer. Daher kann die Expression eines Gens in einer höheren Menge diese Zellen 100-mal sensitiver für Chemotherapie machen. Klarerweise gibt es eine Variation in Abhängigkeit von dem Niveau der Expression, und daher wollen wir in der Lage sein, diese so hoch wie möglich einzuschalten. Der Pro-Wirkstoff 5-Desoxy-5FUdR wird zu 5FU abgebaut, und ein Vergleich der Sensitivität der Zellen für 5FU in 6 offenbart, daß es tatsächlich einen sehr geringen Unterschied gibt. Dies bedeutet, daß eher die Aktivierungsstufe wichtig ist als nachfolgende Ereignisse.
Schließlich, wenn ein Wirkstoff durch die Krebszellen aktiviert wurde, könnte er zu anderen Zellen überführt werden, welche normalerweise resistent wären, aber die aktive Form des Wirkstoffs kann dies überwinden. Um dies zu zeigen, wurden die sensitiven Zellen (–4-Zellen) und die Wildtyp-Zellen miteinander gemischt, und aus 7 kann man sehen, daß die IC50 von 11,6 μM auf 1,5 μM abfällt, d. h. eine logarithmische 10-fache Zunahme der Sensitivität, wobei nur 20% der Zellen das Wirkstoffaktivierungsgen exprimieren. Somit wird es bei der Gentherapie nicht notwendig sein, alle der Zellen dazu zu bringen, das Gen zu exprimieren, sondern vielleicht nur 20%.
Dies zeigt, daß das Zielgen Thymidinphosphorylase als ein Mechanismus zur Aktivierung eines Anti-Krebs-Wirkstoffs geeignet ist, und daß dessen Überexpression sogar in einem Anteil der Zellen nicht nur diesen Zellen, sondern auch benachbarten Zellen Wirkstoffsensitivität verleihen kann.
Beispiel 9
Stabile Transfektion von Zellen mit hypoxisch induzierbaren PGK-1-Elementen und verschiedenen Promotoren
Das PGK-1-Hypoxie-Antwortelement wurde in dem Kontext des PGK-1-Genpromotors (M3), des 9-27-Genpromotors (9-3C) und des Thymidinkinasegenpromotors (sTK5) ausgewertet.
Die Konstrukte waren denjenigen ähnlich, die in Beispiel 7 beschrieben sind. Die Promotoren und die PGK-1-Hypoxie-Antwortelemente wurden stromaufwärts von Genen angeordnet, die das endotheliale CD2-Oberflächenprotein und den negativ selektierbaren Marker Cytosindesaminase codieren. Die 9-27- und Thymidinkinasepromotoren wurden jeweils mit drei Kopien des P18-PGK-1-Elementes verwendet, und der PGK-1-Genpromotor wurde mit drei Kopien des P24-PGK-1-Elementes verwendet.
Die stabilen Transfektanten wurden hinsichtlich ihrer Reaktion auf schwere Hypoxie (0,001% und 0% O₂) und verschiedene Mengen an Sauerstoff (0,1, 1, 2, 5 und 20% O₂) getestet. Die Zelloberflächenexpression von transfiziertem CD2 wurde unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Anti-CD2-Antikörpern analysiert. Markierte Zellen wurden hinsichtlich CD2-Expression auf einer Sortiereinrichtung für fluoreszenzaktivierte Zellen untersucht.
Die Zunahme der CD2-Produktion hing von der Länge und der Stärke der Hypoxie ab. Nach schwerer Hypoxie stieg die CD2-Expression in den transfizierten Linien nur nach anschließender Belüftung (maximal 5 Stunden nach der Hypoxie), wogegen nach weniger schweren Hypoxiebedingungen die CD2-Expression unmittelbar nach der Hypoxie maximal wurde.
1% O₂induzierte CD2-Expression, aber nicht auf das gleiche Maß wie schwere Hypoxie (< 5 ppm). 5% und 20% O₂ führten nicht zu einer CD2-Induktion.
CD2-Expression dauerte nach Reoxigenierung für 24 Stunden an.
Die 8a, b und c zeigen CD2-Induktionsdaten für M3, sTK5 bzw. 9-3C mit Sauerstoff bei 5%, 2%, 1%, 0,001% (N₂, fast kein Sauerstoff), 0% O₂ (AnO₂). n repräsentiert die Anzahl der durchgeführten Experimente. CD2-Expression wurde unmittelbar nach der Behandlung (0 h) und 5 Stunden nach der Behandlung (5 h) gemessen.
Beispiel 10
Hypoxie-induzierte Pro-Wirkstoff-Sensitivierung
Das bakterielle Enzym Cytosindesaminase katalysiert die Umwandlung von Cytosin in Uracil und kann daher den Pro-Wirkstoff 5-Fluorocytosin (5-FC) in das Anti-Tumor-Mittel 5-Fluorouracil (5-FU) umwandeln.
Transfizierte Zellen (9-3C und M3), wie sie in Beispiel 9 beschrieben sind, wurden hinsichtlich Sensitivität auf 5-FC getestet. Die Zellen wurden hypoxischer Exposition (16 Stunden) ausgesetzt, gefolgt von Exposition an 5-FC oder 5-FU (24 Stunden), gefolgt von einer Wachstumsverzögerung von 96 Stunden.
Die Ergebnisse sind in den 9a und 9b gezeigt (Wt repräsentiert nichttransfizierte HT1080-Zellen). M3- und 9-3C-Zellinien waren signifikant sensitiver auf 5-FC nach Hypoxie (9a). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der 5-FU-Sensitivität bei der Kontrolle (Wt) oder bei transfizierten Zellen nach hypoxischer oder normoxischer Behandlung (9b).
Beispiel 11
In vivo Experiment in Mäusen
Tumorzellen (HT1080-Zellen) wurden mit einem DNA-Konstrukt transfiziert, welches das CD2-Gen enthielt, verknüpft mit einem Promotor, der das PGK-1-Hypoxie-Antwortelement (wie es in Beispiel 9 beschrieben ist) enthielt. Etwa eine Million transfizierte Zellen wurden unter die Haut einer Maus implantiert. Der Tumor wurde später entfernt und histologisch geschnitten. Färbung mit Anti-CD2-Antikörpern zeigte hypoxisch induzierte Expression des Markergens.
Literatur

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Claims

Nukleinsäurekonstrukt mit wenigstens einem Gen, welches ein Cytokin oder ein Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem, welches wirksam mit einer hypoxisch induzierbaren Expressionskontrollsequenz verbunden ist, codiert.
Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Expressionskontrollsequenz einen Promotor oder einer Verstärker enthält.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin wenigstens ein Hypoxie-Antwortelement der Expressionskontrollsequenz Hypoxie-Induzierbarkeit verleiht.
Konstrukt nach Anspruch 3, welches 2 oder mehr Hypoxie-Antwortelemente enthält.
Konstrukt nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin das Hypoxie-Antwortelement die P18 oder P24-PGK-1-Sequenz (SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:2) oder eine Sequenz mit erheblicher Homologie dazu ist.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Pro-Wirkstoff-Aktivierungssystem ein Enzym ist, welches in der Lage ist, einen Pro-Wirkstoff in einen aktiven Wirkstoff zu überführen.
Konstrukt nach Anspruch 6, wobei das Enzym Cytosindesaminase ist.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der Form eines Vektors, wie einem Plasmid.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit leidet, bei der Hypoxie eine Ursache oder ein Symptom oder in anderer Weise vorhanden ist.
Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit leidet, bei der Hypoxie eine Ursache oder ein Symptom oder in anderer Weise vorhanden ist.
Hypoxisch induzierbare Expressionskontrollsequenz, welche wenigstens eine Kopie der P18 oder P24 PGK-1-Sequenz (SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:2) oder eine Sequenz mit erheblicher Homologie dazu enthält und welche wirksam mit einem Gen verbunden ist, das eine Spezies mit Aktivität gegen Krankheit codiert.