DE19639103A1 - Nukleinsäurekonstrukte mit Hybridpromotoren für gentherapeutische Maßnahmen - Google Patents

Description

1. Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Nukleinsäurekonstrukte, die in der Gentechnologie und insbesondere in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen (im nachfolgenden Gentherapie genannt) verwendet werden können. Bei der Gentherapie werden Gene in den Organismus eingeführt, die im Organismus exprimiert werden sollen. Die Regulation der Expression dieser Gene ist bedeutsam für den prophylaktischen oder therapeutischen Effekt der Gentherapie.

In den Patentanmeldungen PCT/GB95/02000, EP 95.03370, EP 95.03371, EP 95.03368, EP 95.03339 werden Regulatoren für die Expression eines Gens beschrieben. Diese Regulatoren bestehen aus einer Aktivatorsequenz, deren Funktion beispielsweise die zellspezifische oder virusspezifische Aktivierung der basalen Transkription ist. Die DNA-Sequenz dieser Aktivatorsequenz ist mit ihrem 3′-Ende an das 5′-Ende eines Promotormoduls verknüpft. An das 3′-Ende des Promotormoduls ist wiederum mit seinem 5′-Ende das Strukturgen geknüpft.

Das Promotormodul besteht aus Nukleinsäuresequenzen zur Bindung der Transkriptionsfaktoren der Familien CDF und CHF oder E2F und CHF. Diese Bindung führt in der G0- und G1-Phase des Zellzyklus zu einer Hemmung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz und damit zu einer Inhibition oder Transkription des stromabwärts (d. h. in Richtung der Transkription) gelegenen Strukturgens.

In der G0- und G1 -Phase der Zellteilung liegt der DNA-Gehalt der Zelle im diploiden Zustand vor. In der G0-Phase ist die Zelle in Ruhe, in der G1-Phase ist sie in ihrer Zellzyklusprogression inhibiert. An die G1-Phase schließt sich die S-Phase an, in der die DNA-Synthese stattfindet und in der das Genom repliziert wird. Nachfolgend schließt sich die G2-Phase an, in der die Zelle im tetraploiden Zustand ist. Auf die G2-Phase folgt die Zellteilung (Mitose = M-Phase). Die Tochterzellen kommen anschließend in den G0- oder G1-Zustand.

Die Kombination einer zellspezifischen oder virusspezifischen Aktivatorsequenz mit einem diese Aktivatorsequenz in der G0- und G1-Phase hemmenden Promotormodul ermöglicht somit die zellspezifische oder virusspezifische als auch zellzyklusspezifische (d. h. auf die S- und G2-Phase beschränkte) Regulation der Expression eines Strukturgens.

Die Kombination einer Aktivatorsequenz mit einem Promotormodul wird chimärer Promotor genannt. Es gibt zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten für chimäre Promotoren in der Gentherapie, jedoch auch eine Reihe von durch Unzulänglichkeiten bedingte Einschränkungen.

Beispiele für diese Einschränkungen sind

• - eine schwache Aktivatorsequenz, die eine zu geringe Transkription des Strukturgens bewirkt,
• - die Verwendung einer Aktivatorsequenz, die durch das gewählte Promotormodul nicht ausreichend zellzyklusabhängig gehemmt werden kann,
• - die Beschränkung auf zwei (zum Beispiel zell- oder virusspezifische und zellzyklusspezifische) Regulatoren der Transkription des Strukturgens
• - der mangelhafte intrazelluläre Transport des Transkriptionsproduktes des in die Zelle eingeführten Strukturgens.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäurekonstrukte zur Verfügung zu stellen, die eine präzise Regulierung der Expression von fremden Genen (Transgene) in den Wirtszellen ermöglichen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäurekonstrukte, bei welchem mindestens eine Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation aufweist, durch welche die ordnungsgemäße Expression eines Transgens inhibiert ist und bei welchen mindestens eine weitere Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation aufweist, welche die Inhibition durch die Mutation der ersten Nukleinsäuresequenz(en) aufhebt.

Derartige Nukleotidsequenzen sind unter der Kontrolle von gleichen oder unterschiedlichen Promotorsequenzen, so daß die Expression eines Transgens nur erfolgen kann, wenn alle diese Promotorsequenzen aktiviert werden.

Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte wenigstens folgende Komponenten, und zwar in Leserichtung vom 5′-Ende zum 3′-Ende:

• a) eine erste unspezifische, zellspezifische, virusspezifische, durch Tetrazyklin oder metabolisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenz (I), die die Transkription eines Transgens aktiviert,
• b) ein Transgen, das als Strukturgen für einen Wirkstoff kodiert und eine Mutation enthält oder mit einer mutierten Nukleinsäuresequenz (Komponente a)) verbunden ist, welche die Transkription und/oder die Translation dieses Strukturgens stoppen und/oder die Expression eines funktionsfähigen Proteins verhindern,
• c) eine weitere Promotor- oder Enhancersequenz (II), welche die Transkription einer weiteren Nukleinsäure aktiviert,
• d) eine weitere Nukleinsäure kodierend für eine RNA oder ein Protein, welches die durch die Mutation im Transgen (Komponente b)) oder in der mit dem Transgen verbundenen Nukleinsäuresequenz (Komponente a)) verursachte Hemmung der Expression eines funktionsfähigen Proteins aufhebt.

Die erste (I) Promotor- oder Enhancersequenz (a) und die zweite (II) Promotor- oder Enhancersequenz (c) können gleich oder unterschiedlich sein, und mindestens eine der Komponenten a) und c) kann unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch, durch Tetrazyklin oder metabolisch, insbesondere durch Hypoxie, oder zellzyklusspezifisch aktivierbar sein.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann wenigsten eine der Promotor- oder Enhancersequenzen (a) und (c) ein chimärer Promotor sein, bei welchem das Promotormodul CDE-CHR oder E2FBS-CHR mit einer stromaufwärts benachbarten zellspezifisch, virusspezifisch oder metabolisch aktivierbaren Aktivatorsequenz interagieren und dadurch die Expression eines stromabwärts gelegenen Gens beeinflussen, insbesondere inhibieren kann.

Bei den Komponenten a) und c) kann es sich auch um eine Aktivator-responsive Promotoreinheit handeln. Derartige Konstrukte weisen weiterhin folgende Komponenten auf:

• e) wenigstens eine Promotor- oder Enhancersequenz, die unspezifisch, virusspezifisch, metabolisch, durch Tetrazyklin oder zellspezifisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbar ist und
• f) wenigstens eine Aktivatorsubeinheit, die stromabwärts von der Promotor- oder Enhancersequenz (e) gelegen ist und durch die Promotor- oder Enhancersequenz (e) in ihrer Transkription aktiviert wird,
• g) einen Aktivator-responsiven Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte einer oder mehrerer Aktivatorsubeinheit(en) gemäß (f) aktiviert wird.

In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um Nukleinsäurekonstrukte, bei welchen die Promotor- oder Enhancersequenz (a) und/oder (c) und/oder der Aktivator-responsive Promotor ein chimärer Promotor ist und die Aktivatorsubeinheit (f) ein Gen für wenigsten einen Transkriptionsfaktor darstellt, der den chimären Promotor des Aktivator-responsiven Promotors (g) aktiviert.

Ein Beispiel für einen Aktivator-responsiven Promotor aktiviert durch zwei Aktivatorsubeinheiten (f, f′) (h) stellt der LexA-Operator in Verbindung mit dem SV40-Promotor dar. Die Aktivatorsubeinheit (f) umfaßt die cDNA für das LexA-DNA- Bindeprotein kodierend für die Aminosäuren 1-81 oder 1-202, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für das Gal80-Protein (Aminosäuren 1435). Die zweite Aktivatorsubeinheit (f′) umfaßt die cDNA der Gal80-Bindungsdomäne des Gal14-Proteins kodierend für die Aminosäuren 851-881, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA des SV40 large T-Antigens kodierend für die Aminosäuren 126-132, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.

In einem weiteren Beispiel für einen Aktivator-responsiven Promotor aktiviert durch zwei Aktivatorsubeinheiten (f, f′) ist der oben aufgeführte LexA-Operator ersetzt durch die Gal14-Binderegion und das Gen für das LexA-DNA-Bindeprotein ersetzt durch das Gen für die DNA-Bindedomäne (AS1 bis 147) des Gal14-Proteins.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ein nukleäres Retentions-Signal (NRS) aufweisen, das in Leserichtung (d. h. mit dem 5′-Ende seiner DNA) stromabwärts mit einem Transgen (b), d. h. an dessen 3′-Ende) verknüpft ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat das Transkriptionsprodukt des nukleären Retentions-Signals eine Bindestruktur für einen nukleären Export-Faktor (NEF). Die cDNA für diesen nuklearen Export-Faktor ist mit ihrem 5′-Ende bevorzugterweise verknüpft mit dem 3′-Ende einer weiteren Promotor- oder Enhancersequenz, welche gleich oder unterschiedlich zu den Promotorsequenzen a) und/oder c) sein kann.

Der nukleäre Export-Faktor ist bevorzugterweise ein Gen ausgewählt aus der Gruppe umfassend das Rev-Gen der Viren HIV-1, HIV-2, Visna-Maidi Virus, Caprine arthritis encephalitis Virus, das Virus der infektiösen Anämie des Pferdes, das Immundefizienzvirus der Katze, von Retroviren, von HTLV oder das Gen des hnRN P-A1 -Proteins oder das Gen des Transkriptionsfaktors TFIII-A.

In der Regel handelt es sich bei der Nukleinsäure um DNS. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden üblicherweise als Vektoren, insbesondere Plasmidvektoren oder virale Vektoren eingesetzt.

Bei dem Transgen handelt es sich in der Regel um Strukturgene, die für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff kodieren, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Fusionsproteine zwischen Liganden wie z. B. Antikörper oder Antikörperfragmente und Cytokinen oder Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Thrombose-induzierenden Substanzen und Gerinnungshemmer, Blutplasmaproteine, Komplement aktivierende Proteine, Virushüllproteine, bakterielle Antigene und parasitäre Antigene und Ribozyme.

In einer besonderen Ausführungsform kann es sich bei dem Transgen um ein Strukturgen handeln, welches für ein Protein kodiert, das einen kontrollierten Zelltod auslöst. Zu diesen Proteinen gehört beispielsweise Sphingomyelinase.

In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem Transgen (b) um ein Strukturgen handeln, das für ein Enzym kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet. In einer weiteren Ausführungsform kann das Strukturgen für ein Ligand-Enzymfusionsprotein kodieren, wobei das Enzym eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet und der Ligand an eine Zelloberfläche bindet, bevorzugt an Endothelzellen oder Tumorzellen.

Die Promotor-, Enhancer- oder Aktivatorsequenz kann ausgewählt sein aus der Gruppe von genregulatorischen ,Nukleotidsequenzen aktivierend in Endothelzellen, glatten Muskelzellen, quergestreiften Muskelzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Tumorzellen, Leberzellen, Leukämiezellen und Gliazellen oder von Promotorsequenzen der Viren HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

Die Aktivatorsequenz kann desweiteren ein Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor sein.

Die Erfindung betrifft auch isolierte Zellen oder Zellinien, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten.

Derartige Zellen können zur Bereitstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung des Nukleinsäurekonstruktes in eine Zielzelle umfaßt. Derartige Erkrankungen gehen häufig mit übermäßiger Zellvermehrung einher.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte erlauben es, beliebige Promotoren, Enhancer oder Aktivatorsequenzen zu verwenden.

Die erfindungsgemäße Mutation im oder am Transgen (b) kann der Austausch der Nukleotidsequenz für einen oder mehrere Aminosäuren sein, so daß durch diesen Austausch das exprimierte Protein nicht mehr funktionsfähig ist. In diesem Falle stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche eine tRNA kodiert, die einerseits mit ihrem Anticodon an die mRNA der mutierten Nukleotidsequenz im Transgen (b) bindet, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure zur Behebung der Mutation im Transgen (b) aufnimmt.

Die erfindungsgemäße Mutation im oder am Transgen (b) kann jedoch auch ein in Säugerzellen nicht oder selten anzutreffendes Translations-Stop-Codon im Strukturgen sein, so daß das Strukturgen nicht effektiv translatiert wird. In diesem Falle stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche einerseits eine tRNA kodiert, die ein Anticodon komplementär zum Stop-Codon besitzt und hierdurch die Hemmung der Translation bedingt durch den Translations-Stop-Codon im Strukturgen (b) aufhebt, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure zur Behebung der Mutation im Transgen (b) aufnimmt.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Mutation im oder am Transgen (b) eine Mutation der TATA-Box einer dem Strukturgen am 5′-Ende vorgeschalteten Promotorsequenz sein. Durch diese Mutation wird die Initiation der Transkription des Strukturgens blockiert. In diesem Falle stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche ein Protein kodiert, das an die mutierte TATA-Box bindet und hierdurch die Transkription ermöglicht.

Die Anordnung der einzelnen Komponenten ist beispielsweise in den folgenden Schemata A und B wiedergegeben:

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten können die Promotor-oder Enhancersequenzen der Komponenten a) oder c) gleich oder unterschiedlich sein, des weiteren können die Komponenten c) und d) stromaufwärts oder stromabwärts der Komponenten a) und b) gelegen sein.

Als Promotor- oder Enhancersequenz wird bevorzugt wenigstens eine starke Promotor- oder Enhancersequenz, wie beispielsweise vom CMV (EP-A-01 731 77) oder SV40 oder ein Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor oder jede andere dem Fachmann bekannte Promotor- oder Enhancersequenz, verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine Promotor- oder Enhancersequenz zellspezifisch, metabolisch (z. B. durch Hypoxie), virusspezifisch oder zellzyklusspezifisch aktivierbar.

Besonders bevorzugt werden

• - diejenigen Promotor- oder Enhancersequenzen, die die Transkription zellspezifisch in Endothelzellen, glatten Muskelzellen, quergestreiften Muskelzellen, blutbildenden Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, Gliazellen oder Tumorzellen aktivieren und/oder
• - Promotorsequenzen bzw. Enhancersequenzen der Viren HBV, HCV, HSV, HPV, CMV, EBV, HTLV oder HIV und/oder
• - Promotor- oder Enhancersequenzen, welche metabolisch aktivierbar sind wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer (Semenza et al., PNAS 88 5680(1991)) oder Promotor (Mc Burney et al., NucleicAcids Res. 19, 5755 (1991); Wo 95/21927) und/oder
• - Promotoren, welche zellzyklusspezifisch aktivierbar sind wie beispielsweise der Promotor des cdc25C Gens, des Cyclin A Gens, des cdc2 Gens (Lucibello et al., EMBO J 14 132 (1995), Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995), Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 2833 (1995)), des B-myb Gens (Lam et al., EMBO J 12 2705 (1993)), des DHFR-Gens (Means et al., Mol. Cell Biol 12 1054 (1992) und des E2F-1 Gens (Johnson et al., Genes Dev. 8, 1514 (1994), Hsiao et al., Genes Dev. 8 15256 (1994))
• - Promotoren, welche durch Tetrazyklin aktivierbar sind, wie beispielsweise ein Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen et al., TIBS 18, 471(1993), Dingermann et al. EMBO J. 11, 1487 (1992)).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine Promotor- oder Enhancersequenz ein chimärer Promotor. Im Sinne dieser Erfindung stellt ein chimärer Promotor die Kombination einer stromaufwärts gelegenen zellspezifisch, metabolisch oder virusspezifisch aktivierbaren Aktivatorsequenz mit einem stromabwärts gelegenen Promotormodul dar. Das Promotormodul ist gekennzeichnet durch eine Nukleotidsequenz, welche die Transkriptionsfaktoren der Familien CDF und CHF oder E2F und CHF binden und hierdurch die Aktivierung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz in der G0- und G1-Phase des Zellzyklus hemmen kann (Lucibello et al., EMBO J. 14,132 (1994), PCT/GB95/02000).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine Promotor- oder Enhancersequenz (Komponente a) oder c)) eine Aktivator-responsive Promotoreinheit.

Eine Aktivator-responsive Promotoreinheit besteht ihrerseits aus folgenden Komponenten:

• e) eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Promotor- oder Enhancersequenz(en), die beispielsweise zellzyklusspezifisch, metabolisch, zellspezifisch oder virusspezifisch oder sowohl zellzyklusspezifisch als auch metabolisch, zellspezifisch oder virusspezifisch (sogenannte chimäre Promotoren) aktivierbar ist bzw. sind.
• f) eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Aktivatorsubeinheit(en), welche jeweils stromabwärts von den Promotor- oder Enhancersequenzen gelegen und durch diese in ihrer basalen Transkription aktiviert wird bzw. werden.
• g) einen Aktivator-responsiven Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte von einer oder mehreren Aktivatorsubeinheit(en) aktiviert wird.

Die Anordnung der einzelnen Komponenten einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit ist beispielsweise durch das folgende Schema C) wiedergegeben:

Die Einfügung einer bevorzugten Aktivator-responsiven Promotoreinheit in ein erfin­ dungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt ist beispielsweise durch das folgende Schema D) wiedergegeben:

In der einfachsten Form können Aktivator-responsive Promotoreinheiten beispiels­ weise chimäre Promotorkonstrukte nach folgendem Schema E darstellen:

In einer weiteren Ausführungsform können erfindungsgemäße Aktivator-responsive Promotoreinheiten Bindesequenzen für chimäre Transkriptionsfaktoren aus DNA- Bindungsdomänen, Protein-Proteininteraktionsdomänen und Transaktivierungsdomänen darstellen.

Bevorzugte Strukturgene für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff sind Proteine und Glykoproteine, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Fusionsproteine aus Liganden (z. B. Antikörpern oder Antikörperfragmenten) und Cytokinen oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Thrombose induzierende Proteine, Gerinnungshemmer, Blutplasmaproteine, Komplement aktivierende Proteine, Hüllsubstanzen von Viren und Hüllsubstanzen von Bakterien.

Entsprechend der Erfindung sind in einer besonderen Ausführungsform die Strukturgene (Komponente b)) mit einer Mutation versehen, welche die Expression eines funktionsfähigen Proteins (oder Peptides) verhindert.

Diese Mutation kann der Austausch einer Nukleotidsequenz für eine oder mehrere Aminosäuren sein, so daß durch diesen Austausch das exprimierte Protein nicht mehr funktionsfähig ist (missense Mutation), d. h. keinen aktiven Wirkstoff oder kein funktionsfähiges Enzym mehr darstellt. Bei einer derartigen Mutation des Strukturgens (Komponente b)) stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche eine tRNA kodiert, die einerseits mit ihrem Anticodon an die Mutationsstelle der mRNA des Strukturgenes (Komponente b)) bindet, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure zur Behebung der Mutation im Transgen aufnimmt (Supressor tRNA).

Dabei sollen besonders solche tRNAs zu Suppressor tRNAs mutiert werden, die in Säugerzellen normalerweise nur selten benutzt werden, um negative Auswirkungen auf die allgemeine Translationseffizienz der Zelle zu minimieren.

In einer anderen Ausführungsform ist die Mutation im Strukturgen die Einführung einer oder mehrere Translations-Stop-Codons (nonsense Mutationen). Als Translations-Stop-Codons sind in der mRNA die Nukleotidsequenzen UAA, UGA und UAG bekannt. Die entsprechenden DNA-Sequenzen hierfür sind TAA, TGA und TAG/kodierender Strang der DNA. Eine dieser Stop-Codons wird als Mutation bevorzugt in die DNA-Sequenz des Strukturgens (Komponente b)) eingefügt.

Bei einer derartigen Mutation des Strukturgenes (Komponente b)) stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche eine tRNA kodiert (Suppressor tRNA), die einerseits mit ihrem Anticodon an die Mutation, d. h. an das eingeführte Stop-Codon der mRNA des Strukturgenes (Komponente b)) bindet, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure, die von der ursprünglichen DNA-Sequenz am Ort der Mutation kodiert wurde, aufnimmt. Derartige Nukleinsäuresequenzen (b) sind für E. coli, Hefe und Pflanzellen bereits beschrieben worden (Dingermann et al., Mol. Cell Biol. 12, 4038 (1992), EMBO J. 11, 1487(1992); Gossen et al. TIBS 18 471(1993); Gatzet al., Plant. J. 2,397 (1992)). Entsprechend der Erfindung sollen auch hier tRNAs zu Suppressor tRNAs mutiert werden, die in Säugerzellen normalerweise nur selten benutzt werden.

So können beispielsweise folgende Kombinationen gewählt werden (Lewin Ed. Genes IV, Oxiford University Press 1990, Seite 151):

In einer weiteren Ausführungsform kann die Mutation im oder am Strukturgen eine Mutation der TATA-Box einer dem Strukturgen (Komponente b) 5′-Ende vorgeschaltete Promotorsequenz (Komponente a) sein. Die TATA-Box (TATAAA) gilt als eine zentrale Initiationsstelle der im Zellkern vorkommenden RNA- Polymerasen II und III. Die Initiation der Transkription an der TATA-Box erfolgt durch Bindung des TATA-Box bindenden Proteins (TBP), welches essentiell an der Transkription aller im Zellkern vorhandener RNA-Polymerasen (I, II, III) beteiligt ist. Ein strikt TATA-Box abhängiger Promotor ist beispielsweise der Promotor für das von der RNA-Polymerase III transkribierte U6-Gen, dessen Genprodukt essentiell am Spleißvorgang der mRNA beteiligt ist.

Entsprechend dieser Erfindung wird dem Strukturgen (Komponente b) am 5′-Ende ein mutierter TATA-Box abhängiger Promotor (Komponente a) vorgelagert. Eine derartige Mutation kann beispielsweise TGTAAA sein. Durch diese Mutation wird die DNA-Bindungsstelle des normalen TBP nicht mehr erkannt und das Strukturgen (b) nicht mehr effizient transkribiert. Bei einer derartigen Mutation stellt die Komponente d) eine Nukleinsäuresequenz dar, welche ein komutiertes TBP kodiert. Durch diese Komutation bindet das TBP an die mutierte TATA-Box (z. B. an TGTAAA) in der Komponente a) und führt damit zur effizienten Transkription des Strukturgens (Komponente b). Derartige Komutationen des TBP-Genes sind beispielsweise von Strubin und Struhl (Cell 68 721(1992)) und von Heard et al. (EMBO J. 12, 3519 (1993)) beschrieben worden.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ergänzt um ein nukleares Retentions-Signal (NRS) und ggf. um ein nukleares Export-Signal.

Die Anordnung der einzelnen Komponenten in einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind wie folgt in den Schemata F) und G) wiedergegeben:

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die in den Schemata F) und G) dargestellten Nukleinsäurekonstrukte miteinander kombiniert. Durch diese Kombination wird der Einschluß eines weiteren Promotors (Promotor IV, Komponente e) möglich. Die Anordnung der einzelnen Komponenten in dieser Kombination wird beispielhaft durch das folgende Schema H) wiedergegeben:

Das nukleare Retentions-Signal ist eine Nukleotidsequenz, die den Transport einer mit ihr verknüpften premessenger RNA durch die Kernmembran behindert, die jedoch andererseits eine Bindestruktur darstellt für ein Exportprotein genannt nuklearer Export-Faktor. Dieser nukleare Export-Faktor (NEF) vermittelt den Transport der ein NRS enthaltende premessenger oder messenger RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma. Eine, das NRS enthaltende premessenger oder messenger RNA wird somit durch Bindung an den NEF aus dem Zellkern ausgeschleust (Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)).

Bei den NRS (Komponente h)) handelt es sich bevorzugterweise um die Rev- Responsive Element (RRE)-Sequenz von Retroviren. Bei HIV-1 ist diese RRE eine 243 Nukleotide (Nukleotide 7362-7595; Muesing et al., Nature 313, 450 (1985)) umfassende Sequenz im env-Gen (Malim et al., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al., PNAS 88, 683 (1991)). Das nukleare Retentions-Signal (NRS) im Sinne der Erfindung kann jedoch auch jede homologe und/oder funktionell ähnliche (analoge) Nukleotidsequenz sein, so beispielsweise das RRE-äquivalente Element des HBV- Virus (Huang et al., Mol Cell Biol 13, 7476 (1993)).

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten ist der nukleare Export-Faktor (NEF, Komponente k)) eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, welches an die mRNA des NRS bindet und den Transport der ein NRS enthaltende premessenger RNA oder messenger RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma (oder aus dem Zytoplasma in den Zellkern) vermittelt. Im besonderen wird im Sinne der Erfindung das rev-Gen von Retroviren, speziell vom HIV-1 oder HIV-2 Virus (Daly et al., Nature 342, 816 (1989); Emerman et al., Cell 57, 1155 (1989); Felber et al., PNAS 86, 1495 (1989); Fischer et al., EMBO J 13, 4105 (1994)) verwendet.

Das rev-Protein des rev-Genes von Retroviren bindet mit seiner N-terminalen Domäne (Zapp et al., Nature 342, 714 (1989); Malim et al. Cell 65, 241(1991)) an das RRE in der pre-mRNA (Iwai et al., Nucl. Acids Res. 20, 6465 (1992)). Durch die Bindung zwischen dem RRE und dem rev-Protein wird der Transport von "nonspliced" premessenger RNA, aber auch jeder weiteren RNA, die ein RRE enthält, vom Zellkern in das Zytoplasma ermöglicht (Fischer et al., EMBO J 13, 4105 (1994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)) und damit die Translation erheblich verstärkt.

Im Sinne der Erfindung können als NEF auch Nukleotidsequenzen verwendet werden, die Proteine kodieren, die homolog und funktionell ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind (Bogerd et al., Cell 82, 485 (1995)), wie beispielsweise das rev-Gen des Visna-Maedi Virus (VMV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)) oder das rev- Gen des Caprine arthritis encephalitis Virus (CAEV; Tiley et al., J. Virol 65, 3877 (1991)).

Im Sinne der Erfindung können jedoch auch solche Gene eingesetzt werden, die Proteine kodieren, die zwar nur eine geringe oder keine Homologie zum rev-Protein besitzen, jedoch funktionell ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind.

Hierzu zählen z. B. das rex-Gen des HTLV-1 (Cullen, Microbiol. Rev 56, 375 (1992)), das rev-Gen des Virus der infektiösen Anämie des Pferdes (EIAV) und des Immundefizienzvirus der Katze (FIV) (Manusco et al., J. Virol 68, 1988 (1994)).

In einer alternativen Ausführungsform kann es sich bei den NEF auch um Nukleotidsequenzen für Proteine handeln, welche eine Ausschleusung von RNA aus dem Kern bewirken, auch ohne daß diese durch ein NRS im Kern zurückgehalten wird. Hierzu zählen beispielsweise der Transkriptionsfaktor TFIIIA (Gaddat et al. Cell 60, 619(1990); Drewet al., Gene 159, 215 (1995)) oder das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein A1 (hnRNPA1-Protein; Pinol-Roma et al., Nature 355, 730 (1992)).

Des weiteren gehören zu den nukleären Transportproteinen im erweiterten Sinne das "heat shock protein 70" (hsc70; Mandell et al., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)) oder der Proteinkinaseinhibitor CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem. 269, 2676 (1994), Wen et al., J. Biol. Chem. 269, 32214 (1994).

Gemeinsam ist dem NEF und seinen homologen und analogen Proteinen eine mehr aminoterminal gelegene Domäne für die Bindung des monomeren Proteins an die RNAdes NRS (J. Virol 64, 881 (1990); Kjems et al., EMBO J. 11, 1119 (1992)) und eine meist Leucin-reiche Domäne (Ausnahme hiervon hnRNPA1), welche für die Transportfunktion des NEF notwendig ist (Wen et al., Cell 82 463 (1995); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995); Malim et al., J. Virol 65, 4248 (1991); Venkatesh et al., Virol. 178, 327 (1990)).

Die Expression des NEF-Genes (Komponente k)) kann unter der Kontrolle einer stromaufwärts am 5′-Ende des NEF-Genes gelegenen Promotorsequenz (Komponente i) = Promotor- und Enhancersequenz III) stehen.

Als Promotor- und Enhancersequenz III oder IV entsprechend dieser Erfindung (siehe Schema H)) kann eine der Nukleinsäuresequenzen gewählt werden, wie sie bereits für die Promotor- und Enhancersequenzen I und II (Komponente a) und c)) beschrieben wurden.

Die Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS. Unter dem Begriff "Nukleinsäurekonstrukte" werden künstliche Gebilde aus Nukleinsäure verstanden, die in den Zielzellen transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen Vektor eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder virale Vektoren besonders bevorzugt sind.

Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein Transgen (Komponente b)) sowohl zellspezifisch oder virusspezifisch oder unter bestimmten metabolischen Bedingungen oder nach Exposition mit Tretrazyklin als auch zellzyklusspezifisch exprimiert werden, wobei es sich bei dem Strukturgen bevorzugt um ein Gen handelt, das für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder aber für ein Enzym kodiert, welches eine inaktive Vorstufe eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das Strukturgen kann so gewählt sein, daß dieses Enzym als Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser Ligand an die Oberfläche von Zellen, z. B. proliferierende Endothelzellen oder Tumorzellen bindet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen von Hefen oder Säugern, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden die Nukleinäurekonstrukte in Zellinien eingebracht, die dann nach Transfektion zur Expression des Transgens verwendet werden können. Diese Zellen können somit zur Bereitstellung eines Heilmittels für Patienten wie auch im Patienten und somit zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden. Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes besteht in der Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts in eine Zielzelle und dessen virus- oder zielzellspezifische und zellzyklusspezifische Expression umfaßt. Bei der Erkrankung handelt es sich häufig um eine solche, die mit übermäßiger Zellvermehrung einhergeht, wobei die Herstellung des Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes in eine Zielzelle und seine virus- oder zielzellspezifische Expression in dem Stadium der Zellproliferation umfaßt.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kommen in dieser Form nicht in der Natur vor, d. h. das Transgen oder Strukturgen für den Wirkstoff oder für ein Enzym oder für ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein ist nicht natürlicherweise mutiert und nicht natürlicherweise kombiniert mit einer Nukleinsäuresequenz, welche diese Mutation aufhebt des weiteren auch nicht natürlicherweise kombiniert mit dem nuklearen Retentions-Signal (NRS) und beide sind nicht natürlicherweise mit dem Promotor I und Promotor II verbunden und diese Kombination ist wiederum nicht natürlicherweise kombiniert mit der Nukleotidsequenz bestehend aus dem Promotor III und dem nuklearen Export-Faktor (NEF).

Die Promotoren I, II, III und IV und das Strukturgen für den Wirkstoff (oder für das Enzym) der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden je nach Verwendungszweck ausgewählt.

In Abhängigkeit von dem geplanten Einsatz der Nukleinsäurekonstrukte können folgende Ausführungsformen ausgewählt werden:

2. Therapie von Tumoren und chronischen Entzündungen über die Inhibition des proliferierenden Endothels 2.1.a) Auswahl der Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Endothelzellen

Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern solche genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente für Gene, die für besonders in Endothelzellen (oder aber in Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft mit proliferierenden Endothelzellen) nachweisbare Proteine kodieren.

Einige dieser Proteine sind von Borrows et al. (Pharmac. Ther 64, 155 (1994)) und Plate et al. (Brain Pathol 4, 207 (1994)) beschrieben worden. Im besonderen zählen zu diesen Endothelzell-spezifischen Proteinen beispielsweise:

• - Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter
  Die Promotorsequenz wurde von Murakami et al. (J. Biol. Chem. 267, 9300 (1992)) beschrieben.
• - Endoglin
  Die Promotorsequenz wurde von Bellon et al. (Eur. J., Immunol 23, 2340 (1993)) und Ge et al. (Gene 138, 201(1994)) beschrieben.
• - VEGF-Rezeptoren
  Zwei Rezeptoren werden unterschieden (Plate et al., Int. J. Cancer 59, 520 (1994)):
• - VEGF-Rezeptor-1 (flt-1)
  (de Vries et al., Science 255, 989 (1992); Wakiya et al. J. Vascul. Res. 33,105 (1996)) und der
• - VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR)
  (Terman et al., BBRC 187,1579 (1992)).

Beide Rezeptoren sind fast ausschließlich auf endothelialen Zellen (Senger et al., Cancer Metast. Rev. 12, 303 (1993)) anzutreffen.

• - andere Endothelzell-spezifische Rezeptortyrosinkinasen
• - til-1 oder til-2
  (Partanen et al., Mol. Cell. Biol 12, 1698 (1992), Schnürch und Risau, Development 119, 957 (1993), Dumont et al., Oncogene 7, 1471 (1992))
• - B61-Rezeptor (Eck-Rezeptor)
  (Bartley et al., Nature 368, 558 (1994), Pandey et al., Science 268, 567 (1995), van der Geer et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 10, 251 (1994))
• - B61
  Das B61-Molekül stellt den Liganden dar für den B61-Rezeptor.
  (Holzman et al., J. Am. Soc. Nephrol 4, 466 (1993), Bartley et al., Nature 368, 558 (1994))
• - Endothelin, im speziellen
• - Endothelin B
  Die Promotorsequenz wurde von Benatti et al., J. Clin. Invest. 91, 1149 (1993) beschrieben.
• - Endothelin-1
  Die Promotorsequenz wurde von Wilson et al., Mol. Cell. Biol 10, 4654 (1990) beschrieben.
• - Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B-Rezeptor
  (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47, 730 (1995), Haendler et al. J. Cardiovasc. Pharm. 20, 1 (1992)).
• - Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
  Die Promotorsequenzen sind von Ludwig et al. (Gene 142, 311 (19949), Oshima et al., (J. Biol. Chem. 263, 2553 (1988)) und Pohlmann et al. (PNAS USA 84 5575 (1987)) beschrieben worden.
• - von Willebrand Faktor
  Die Promotorsequenz wurde von Jahroudi und Lynch (Mol. Cell. Biol 14, 999 (1994)), Ferreira et al. (Biochem. J. 293, 641 (1993)) und Aird et al. (PNAS USA 92, 4567 (1995)) beschrieben.
• - IL-1α, IL-1β
  Die Promotorsequenzen wurden von Hangen et al., Mol. Carcinog. 2, 68 (1986), Turner et al., J. Immunol. 143, 3556 (1989), Fenton et al., J. Immunol. 138, 3972 (1987), Bensi et al., Cell Growth Diff 1, 491 (1990), Hiscott et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6231 (1993) und Mori et al., Blood 84, 1688 (1994) beschrieben.
• - IL-1-Rezeptor
  Die Promotorsequenz wurde von Ye et al., PNAS USA 90, 2295 (1993) beschrieben.
• - Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1)
  Die Promotorsequenz des VCAM-1 wurde beschrieben von Neish et al., Mol. Cell. Biol 15, 2558 (1995), Ahmad et al., J. Biol. Chem. 270, 8976 (1995), Neish et al., J. Exp. Med. 176, 1583 (1992), Jademarco et al., J. Biol. Chem. 267, 16323 (1992), und Cybulsky et al., PNAS USA 88, 7859 (1991).
• - synthetische Aktivatorsequenz
  Als Alternative zu natürlichen endothelspezifischen Promotoren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen verwenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5′- TTATCT-3′ ist (Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dorfmann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) und Wilson et al., Mol. Cell Biol 10, 4854 (1990)).

2.1.b) Auswahl der Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen

Bei proliferierenden Endothelien werden durch geöffnete "tight junctions" Nachbarzellen für Makromoleküle vom Blut aus zugänglich. Durch die funktionellen und anatomischen Wechselbeziehungen sind die Nachbarzellen von aktivierten Endothelzellen Zielzellen im Sinne dieser Erfindung.

• - VEGF
  Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind
• - die Promotorsequenz des VEGF-Gens (5′ flankierende Region)
  (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res 40, 35 (1994), Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947 (1991)) oder
• - die Enhancersequenz des VEGF-Gens (3′ flankierende Region)
  (Michenko et al., Cell Mol. Biol. Res 40, 35 (1994)) oder
• - das c-Src-Gen
  (Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Bonham et al., Oncogene 8, 1973 (1993), Parker et al., Mol. Cell. Biol 5, 831 (1985), Anderson et al., Mol. Cell. Biol 5, 112 (1985)) oder
• - das v-Src-Gen
  (Mukhodpadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Anderson et al., Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985), Gibbs et al., J. Virol 53, 19 (1985))
• - Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente (Truss und Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), insbesondere der
• - Maus-Mammatumor-Virus-Promotor
  Die cDNA-Sequenz der Promotorregion der long termina repeat region des MMTVwurde von Chalepakis et al., Cell 53, 371 (1988) und Truss und Beato (Endocr. Rev. 14, 459 (1993) beschrieben.

2.2. Strukturgene für antitumorale (oder antientzündliche) Substanzen 2.2.a) Inhibitoren der Proliferation

Als antitumorale oder antientzündliche Substanz im Sinne dieser Erfindung ist die DNA-Sequenz eines Proteins zu verstehen, welches die Proliferation von Endothelzellen inhibiert. Hierzu gehören beispielsweise die DNA-Sequenzen für:

• - das Retinoblastomprotein (pRb/p110) oder für seine Analoga p107 und 120
• - das p53 Protein
• - das p21 (WAF-1) Protein
• - das p16 Protein
• - weitere CdK-Inhibitoren
• - das GADD45 Protein
• - das bak Protein.

Um eine schnelle intrazelluläre Inaktivierung dieser Zellzyklusinhibitoren zu verhindern, sind bevorzugt solche Gene zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden.

Das Retinoblastomprotein (pRb) und die Verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt wird somit eine pRb/p1 10-, p107- oder p130 cDNA-Sequenz verwendet, die derartig punktmutiert ist, daß die Phosphorylierungsstellen des kodierten Proteins gegen nicht phosphorylierbare Aminosäuren ausgetauscht sind.

2.2.b) Gerinnung induzierter Faktoren und Angiogeneseinhibitoren

Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist des weiteren die DNA-Sequenz für ein Protein zu verstehen, welches die Gerinnung induziert und/oder die Angiogenese inhibiert. Zu diesen Proteinen zählt beispielsweise:

• - Tissue factor (TF) und gerinnungsaktive Fragmente von ihm
  (Morrissey et al., Cell 50, 129 (1987), Scarpati et al., Biochem 26 5234 (1987), Spicer et al., PNAS USA 84, 5148 (1987), Rehemtulla et al., Thromb. Heamost 65, 521 (1991))
• - Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
• - PAI-2
• - PAI-3
• - Angiostatin und gleichartige antiangiogene Peptide
  (O′Reilly et al., Nature Med 2, 689 (1996); Folkman et al., New Engl. J. Med. 26, 1757 (1995))
• - Interferone
• - IFNα
• - IFNβ
• - IFNγ
• - Thrombospondin
• - TNFα
• - Platelet factor 4
• - IL-12
• - TIMP-1
• - TIMP-2
• - TIMP-3
• - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)

2.2.c) zytostatische und zytotoxische Proteine

Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist jedoch auch eine DNA-Sequenz für ein Protein zu verstehen, welches direkt oder indirekt eine zytostatische Wirkung auf Tumoren aufweist. Hierzu zählen im besonderen:

• - Antikörper und Antikörperspaltprodukte
• - Perforin
• - Granzym
• - IL-2
• - IL-4
• - IL-12
• - Interferone, wie beispielsweise
• - IFNα
• - IFNβ
• - IFNγ
• - TNF
• - TNFα
• - TNFβ
• - Oncostatin M
• - Sphingomyelinase
  (Jarvis et al. PNAS-USA 91, 73 (1994))
• - Magainin und Magainin-Derivate
  (Cruciani et al. PNAS 88, 3792 (1991); Jacob et al., Ciba Found. Symp. 186, 197 (1994); Peck-Miller et al., Cancer Chemother. Pharmac. 32, 109 (1993))

2.2.d) Induktoren von Entzündungen

Als antitumorale Substanz ist des weiteren die DNA-Sequenz für ein Protein zu verstehen, welches ggf. zusätzlich zur antitumoralen Wirkung Entzündungen stimuliert und hierdurch zur Elimination von Tumorzellen beiträgt. Hierzu zählen im besonderen beispielsweise:

• - RANTES (MCP-2)
• - monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
• - IL-8
• - macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β)
• - neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
• - IL-3
• - IL-4
• - IL-5
• - human leukemia inhibitory factor (LIF)
• - IL-7
• - IL-11
• - IL-13
• - GM-CSF
• - G-CSF
• - M-CSF
• - Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen. Die DNA-Sequenz für CVF und seiner Teilsequenzen wurden von Frikinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12775 (1994) veröffentlicht
• - der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b. Die DNA-Sequenz für C3 und seiner Teilsequenzen wurde von De Bruÿn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 708 (1985) publiziert.
• - Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln. Derartige Spaltprodukte wurden von O′Keefe et al., J. Biol. Chem. 263, 12690 (1988) beschrieben.
• - Bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Samonella typhi murium (Galdiero et al., Infection and Immunity 46, 55 (1994)), "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus (Espersen Acta Path. Microb. Et Imm. Scandin. Sect C 93, 59 (1985)), Moduline besonders von gram-negativen Bakterien (Henderson et al., Inflam. Res. 44, 187 (1995)), "Major outer membrane protein" von Legionellen (Bellinger-Kawahara et al., J. Exp. Med. 172, 1201 (1990)) oder von Haemophilus influenza Typ B (Hetherington et al., Infection and Immunity 60, 19 (1992)) oder von Klebsiellen (Alberti et al., Infection and Immunity 61, 852 (1992)) oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G (Campoetal., J. Infect. Dis. 171, 601 (1995)).

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung können auch DNA-Sequenzen von Fusionsproteinen zwischen den aufgeführten Cytokinen oder Wachstumsfaktoren zum einen und Liganden für Rezeptoren auf der Zellmembran (wie beispielsweise einem Antikörper spezifisch für Endothelzellen oder Tumorzellen oder dem Fc-Teil des menschlichen Immunglobulins) zum anderen Verwendung finden. Derartige DNA-Sequenzen und ihre Herstellung wurden beispielsweise in der EPA 0464 633 A1 beschrieben.

2.2.e) Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika

Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist jedoch auch die DNA-Sequenz für ein Enzym zu verstehen, welches in der Lage ist, Vorstufen eines antitumoralen Wirkstoffes in einen antitumoralen Wirkstoff zu überführen.

Derartige Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), von Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden.

Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:

• - Herpes Simplex Virus thymidinkinase
  (Garapin et al., PNAS USA 76, 3755 (1979), Vile et al., Cancer Res. 53, 3860 (1993), Wagner et al., PNAS USA 78, 1441 (1981), Moelten et al., Cancer Res. 46, 5276 (1986), J. Natl. Cancer lnst. 82, 297 (1990))
• - Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
  (Huber et al., PNAS USA 88, 8039 (1991), Snoeck, Int. J. Antimicrob. Agents 4, 211 (1994))
• - bakterielle Nitroreduktase
  (Michael et al., FEMS Microbiol. Letters 125, 195 (1994), Bryant et al., J. Biol. Chem. 266, 4126 (1991), Watanabe et al., Nucleic Acids Res 18, 1059 (1990))
• - bakterielle β-Glucuronidase
  (Jefferson et al., PNAS USA 83, 8447 (1986))
• - pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
  (Schulz et al., Phytochemistry 26, 933 (1987))
• - humane β-Glucuronidase
  (Bosslet et al., Br. J. Cancer 65, 234 (1992), Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))
• - humane Carboxy peptidase (CB) z. B.
• - CB-A der Mastzelle
  (Reynolds et al., J. Clin. Invest 89, 273 (1992))
• - CB-B des Pankreas
  (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 267, 2575 (1992), Catasus et al., J. Biol. Chem. 270, 6651 (1995))
• - bakterielle Carboxy peptidase
  (Hamilton et al., J. Bacteriol. 174, 1626 (1992), Osterman et al., J. Protein Chem. 11, 561 (1992))
• - bakterielle β-Laktamase
  (Rodrigues et al., Cancer Res. 55, 63 (1995), Hussain et al., J. Bacteriol. 164, 223 (1985), Coque et al., EMBO J 12, 631 (1993))
• - bakterielle Cytosine deaminase
  (Mullen et al., PNAS USA 89, 33 (1992), Austin et al., Mol. Pharmac. 43, 380 (1993), Danielson et al., Mol. Microbiol 6, 1335 (1992))
• - humane Catalase bzw. Peroxidase
  (Ezurum et al., Nucl. Acids Res. 21, 1607 (1993))
• - Phosphatase, im besonderen
• - humane alkalische Phosphatase
  (Gum et al., Cancer Res. 50, 1085 (1990))
• - humane saure Prostataphosphatase
  (Sharieff et al., Am. J. Hum. Gen. 49, 412 (1991), Song et al., Gene 129, 291 (1993), Tailor et al., Nucl. Acids Res 18, 4928 (1990))
• - Typ 5 saure Phosphatase
  (Gene 130, 201 (1993))
• - Oxidase, im besonderen
• - humane Lysyloxidase
  (Kimi et al., J. Biol. Chem. 270, 7176 (1995))
• - humane saure D-aminooxidase
  (Fukui et al., J. Biol. Chem. 267, 18631 (1992))
• - Peroxidase, im besonderen
• - humane Gluthation Peroxidase
  (Chada et al., Genomics 6, 268 (1990), Ishida et al., Nucl. Acids Res. 15, 10051 (1987))
• - humane Eosinophilen Peroxidase
  (Ten et al., J. Exp. Med. 169, 1757 (1989), Sahamaki et al., J. Biol. Chem. 264, 16828 (1989))
• - humane Schilddrüsen Peroxidase
  (Kimura, PNAS USA 84, 5555 (1987)).

Zur Erleichterung der Sekretion der aufgeführten Enzyme kann die jeweils in der DNA-Sequenz enthaltende homologe Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.

So kann beispielsweise die Signalsequenz der β-Glucuronidase (DNA Position 27 bis 93; Oshima et al., PNAS 84, 685 (1987)) ersetzt werden durch die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA Position 63 bis 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) oder durch die Signalsequenz für das CEA (DNA- Position 33 bis 134; Schrewe et al., Mol. Cell. Biol. 10, 2738 (1990), Berling et al., Cancer Res 50, 6534 (1990)) oder durch die Signalsequenz des humanen respiratory syncytial virus glycoproteins (cDNA der Aminosäuren 38 bis 50 oder 48 bis 65; Lichtenstein et al., J. General Virol. 77, 109 (1996)).

Des weiteren sind bevorzugt DNAs solcher Enzyme zu wählen, welche durch Punktmutation in einem geringen Maße in Lysosomen gespeichert und vermehrt sekretiert werden. Derartige Punktmutationen wurden beispielsweise für die β- Glucuroidase beschrieben (Shiplex et al., J. Biol. Chem. 268, 12193 (1993)).

Zur Verankerung des Enzyms in die Zellmembran der das Enzym bildenden Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne eingeführt werden.

So kann beispielsweise die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position 1485 bis 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)) oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respirator Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren Teilsequenzen, Aminosäuren 38 bis 63; Vÿaya et al., Mol. Cell Biol. 8, 1709 (1988), Lichtenstein et al., J. General Virol. 77, 109 (1996)) oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis 27; Brown et al., J. Virol 62, 3824 (1988)) zwischen der DNA-Sequenz für den Promotor und der DNA-Sequenz für das Enzym (z. B. die β-Glucuronidase) eingefügt werden.

Zur Verstärkung der Translation kann am 3′ Ende des Promotors und unmittelbar vom 5, Ende des Startsignals (ATG) der Signal- bzw. Transmembransequenz die Nukleotidsequenz GCCACC oder GCCGCC eingefügt (Kozak, J. Cell. Biol. 108, 299 (1989)) werden.

Zur Verankerung des Enzyms in die Zellmembran der das Enzym bildenden Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.

Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3′ Ende der Nukleotidsequenz für das Enzym und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.

Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA (DNA-Position 893 bis 1079; Berling et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990)), für das N-CAM (Cunningham et al., Science 236, 799 (1987)) und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1 (Clissold, Biochem. J. 281, 129 (1992)) oder CD16 (Selvaray et al., Nature 333, 565 (1988)), beschrieben worden.

Eine Übersicht über Glycophospholipid verankerte Membranproteine wurde von Ferguson et al. (Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)) publiziert.

Eine weitere Möglichkeit der Verankerung von Enzymen an die Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz für ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein. Die Spezifität des Liganden dieses Fusionsproteins ist gerichtet gegen ein auf der Zellmembran von proliferierenden Endothelzellen oder von Tumorzellen befindliche Membranstruktur.

Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von proliferierenden Endothelzellen binden, gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen, wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 81989)) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744, 1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.

Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Ref. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol 28, 1379 (1991)) oder Huston et al. (Intern. Rev. Immunol 10, 195 (1993)) beschriebenen Weise.

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten, des weiteren IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGGβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) oder Kinin und Derivate oder Analoga von Kinin. Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 oder Vitronectin und Derivate oder Analoga von Vitronectin, wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell. Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adhesion and Commun. 3, 367 (1995)).

Zu den Liganden gehören jedoch auch Antikörper oder deren Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigen auf der Tumorzellmembran.

Beispiele für derartige Antigene und die zugehörigen Antikörper sind bei Sedlacek et al., Contrib. Oncol. 32 (1988) und Contrib. Oncol. 43 (1992) beschrieben. Antikörper-Enzym-Fusionsproteine wurden beispielsweise von Bosslet et al., Br. J. Cancer 65, 234 (1992) beschrieben. Zur Erleichterung der Sekretion der aufgeführten Ligand-Enzym-Fusionsproteine kann die jeweils in der DNA-Sequenz des Enzym enthaltende homologe Signalsequenz, wie bereits beschrieben, ersetzt werden durch eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.

2.3. Kombination von mehreren antitumoralen oder antientzündlichen Substanzen

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Nukleinsäurekonstrukte, in welchen eine Kombination der DNA-Sequenzen von mehreren gleichen antitumoralen oder antientzündlichen Substanzen (A,A) oder von unterschiedlichen antitumoralen Substanzen (A,B) vorliegt. Zur Expression von zwei DNA-Sequenzen wird vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischengeschaltet.

Derartige IRES wurden beispielsweise von Mountford und Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992), Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994) beschrieben.

So kann die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position 140 bis 630 des 5′ UTR; Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) zur Verknüpfung der DNA der antientzündlichen Substanz A (am 3′ Ende) und der DNA der antientzündlichen Substanz B (am 5, Terminus) verwendet werden.

Ein derartiger Wirkstoff weist je nach Kombination additive (A+A, A+B1) oder synergistische Wirkung im Sinne der Erfindung auf.

3. Wirkstoff zur Behebung der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes 3.1. Auswahl der Promotoren oder der Aktivatorsequenzen für blutbildende Zellen

Im Sinn der vorliegenden Erfindung wird als Promotor oder Aktivatorsequenz aus Promotoren oder Enhancern bevorzugt eine genregulatorische Sequenz bzw. ein Element aus einem Gen verwendet, welches ein Protein kodiert, welches besonders stark oder selektiv in Zellen der Blutbildung exprimiert ist. Zu solchen genregulatorischen Sequenzen gehören Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines Rezeptors, dessen Expression in den unreifen blutbildenden Zellen (oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem Stroma), dem nachfolgenden, auf die blutbildenden Zellen einwirkenden und als Wirksubstanz gewünschten Cytokin vorgeschaltet ist. Beispiele für derartige auf unreife blutbildende Zellen einwirkende Cytokine sind:

• - Stem Cell Factor
• - IL-1
• - IL-3
• - IL-6
• - GM-CSF

3.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen für blutbildende Zellen

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation und/oder Differenzierung von Blutzellen bewirkt.

4. Wirkstoff zur Therapie von Autoimmunerkrankungen, Allergien, Entzündungen und zur Verhütung von Organabstoßungen 4.1. Auswahl der Promotoren oder der Aktivatorsequenzen für Autoimmunerkrankungen u. a.

Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern sind genregulatorische Sequenzen der Gene für solche Proteine zu verwenden, welche bei der Immunreaktion in Makrophagen und/oder in Lymphozyten verstärkt gebildet werden. Derartige Proteine sind beispielsweise:

• - IL-1
• - IL-1β
• - IL-1-Rezeptor
• - IL-2
• - IL-2-Rezeptor
• - IL-3
• - IL-3-Rezeptor
• - IFNγ
• - IL-4
• - IL-4-Rezeptor
• - IL-5
• - IL-6
• - LIF
• - IL-7
• - IL-10
• - IL-11
• - IL-12
• - IL-13
• - GM-CSF
• - GM-CSF-Rezeptor
• - Integrin beta 2 proteins

4.2. Auswahl der Gene für Wirksubstanzen für Autoimmunerkrankungen u. a.

Die Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist die DNA-Sequenz für einen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Cytokin, ein Chemokin, einen Wachstumsfaktor oder einer ihrer Inhibitoren, für ein Blutplasmaprotein, für ein Ribozym katalytisch für das Transkriptionsprodukt eines dieser DNA-Sequenzen oder für das Transkriptionsprodukt eines Genes, welches für ein Zellzykluskontrollprotein oder eine DNA-Sequenz für einen Antikörper oder für ein Enzym. Die Auswahl der Wirksubstanz richtet sich nach der zu behandelnden Grunderkrankung und der gewählten Promotorsequenz.

5. Wirkstoff zur Behandlung der Arthritis 5.1. Auswahl der Promotoren oder der Aktivatorsequenzen für Arthritis

Im Sinne der Erfindung sind bevorzugt Promotoren, Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern oder genregulatorische Sequenzen solcher Gene zu verstehen, mit der Transkriptionsfaktoren gebildet oder aktiv in Synovialzellen und Entzündungszellen interagieren. Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotorsequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die für besonders in Synovialzellen und Entzündungszellen exprimierte Proteine kodieren.

5.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen für Arthritis

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.

6. Herstellung eines Wirkstoffes gegen Infektionserreger

Der Wirkstoff kann in zwei grundsätzlich unterschiedlichen Formen hergestellt werden:

• - für die Therapie von Virusinfektionen und Parasiteninvasionen oder aber
• - für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen durch Viren, Bakterien oder Parasiten.

Zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen dienen Impfstoffe. Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind jedoch beschränkt (Brown, Int. J. Technol. Assessm. Health Care 10, 161 (1994)), Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)), Arnon et al., FASEB J 6, 3265 (1992)).

Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt. Diese DNA- Vakzinen werfen jedoch Fragen zur Wirksamkeitsstärke, Sicherheit und zu Nebenwirkungen auf (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995), Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)).

Wirkstoffe zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen im Sinne dieser Erfindung zeichnen sich wegen ihrer Zellspezifität und Zellzyklusregulation durch ein hohes Maß an Sicherheit aus.

6.1. Auswahl der Promotor oder Aktivatorsequenzen 6.1.a) zur Therapie von Infektionserkrankungen

Als Aktivatorsequenz sind Promotorsequenzen von Zellgenen auszuwählen, deren Aktivität besonders durch Infektionen mit Bakterien oder Parasiten verändert werden oder es sind Promotorsequenzen solcher Viren auszuwählen, die die von ihnen infizierten Zellen transformieren und zur Proliferation anregen.

Zu diesen Viren gehören beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV und HTLV.

6.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen 6.2.a) zur Therapie von Infektionserkrankungen

Als Wirksubstanz ist die DNA eines Proteins auszuwählen, welches zytostatische, zytotoxische antibakterielle oder antivirale Wirkungen aufweist. Beispiele für zytotoxische oder zytostatische Proteine wurden schon oben aufgeführt. Als Beispiel für antibakterielle oder antivirale Proteine einer Antikörper oder Antikörperfragmente zu nennen. Bei der Wahl eines Enzyms ist nachfolgend die durch dieses Enzym spaltbare Vorstufe einer antiviralen zytotoxischen oder antiparasitären Substanz zu verabreichen.

Wirksubstanzen für antivirale Proteine im Sinne dieser Erfindung sind des weiteren antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise die DNA-Sequenzen für folgende Wirksubstanzen:

• - IFNα
• - IFNβ
• - IFNγ
• - TNFβ
• - TNFα
• - IL-1
• - TGFβ.

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung können jedoch auch DNA-Sequenzen von Fusionsproteinen zwischen den aufgeführten Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder dem extrazellulären Teil der Rezeptoren zum einen und einem Liganden zum anderen Verwendung finden, zum Beispiel wurden Fusionsproteine mit dem Fc-Teil das menschlichen Immunglobulins in der EPA 0464633 A1 beschrieben.

Als Wirksubstanzen gelten des weiteren Gene für Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.

Des weiteren ist eine Wirksubstanz im Sinne dieser Erfindung die DNA-Sequenz für einen Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen V_H und V_L enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene V_H und V_L Fragmente, hergestellt beispielsweise entsprechend der von Marasco et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889 (1993)) beschriebenen Methodik. Beispiele für Antikörper einer derartigen Spezifität gegen Viren werden im Abschnitt 8.4. aufgeführt.

6.2.b) zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen

Als Wirksubstanz ist die DNA entweder eines Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes spezifisch für den Infektionserreger oder die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T- Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)). Beispiele für DNA-Sequenzen, die Neutralisationsantigene kodieren, sind durch die folgenden Arbeiten zugänglich:

• - Influenza A-Virus-Antigen
  (Ulmer et al., Science 259, 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fynan et al., Int. J. Immunopharmac 17 79 (1995))
• - HIV-Antigene
  (Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993))
• - Tollwut-Virus-Antigen
  (Donnelly et al., Immunol 2/1, 20 (1994))
• - HSV (Herpes Simplex Virus)-Antigen
  (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978))
• - RSV (Respiratory Syncytial Virus)-Antigen
  (Du et al., Bio/Tech 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993))
• - Parainfluenza-Virus-Antigen
  (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994))
• - Rotavirus-Antigen
  (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (1987), Anderson et al., J. Infect. Dis. 153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (1987), Chanock et al., J. Infect. Dis. 148, 49 (1983), Dyall-Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981), Glass et al., Science 265, 1389 (1994))
• - VZV (Varizella Zoster Virus)-Antigen
  (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediatr. Infect. Dis 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Virol 64, 4540 (1990))
• - CMV (Cytomegalo-Virus)-Antigen
  (Plotkin, Science 265, 1383 (1994))
• - Masern-Virus-Antigen
  (Katz und Kellin, Science 265, 1391 (1994))
• - HPV (Humanes Papillomvirus)-Antigen
  (Tindl und Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (1994))
• - HBV (Hepatitis B-Virus)-Antigen
  (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerman et al., J. Virol. 52, 396 (1984))
• - HCV (Hepatitis C-Virus)-Antigen
  (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis 10, 253 (1992), Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 (1994))
• - HDV (Hepatitis D-Virus)-Antigen
  (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron 61 251 (1992))
• - HEV (Hepatitis E-Virus)-Antigen
  (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron 61, 251 (1992))
• - HAV (Hepatitis A-Virus)-Antigen
  (d′Hondt, Vaccine 10, 48 (1992), Andre, J. Infect. Dis. 171, 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et al., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillieres Clin. Gastroenterol 4, 707 (1990))
• - Vibrio Cholera-Antigen
  (Levine und Kaper, Vaccine 11, 207 (1993))
• - Borrelia Burgdorferi-Antigen
  (Schaible et al., Immunol. Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. 17, 669 (1993))
• - Helicobacter pylori-Antigen
  (Crabtree et al., Lancet 338, 332 (1991), Blaser, J. Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover und Blaser, J. Biol. Chem. 267, 10570 (1993), Cover et al., Infect. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (1990), Dunn e tal., Infect. Immunol 60, 1946 (1992), Lage et al., Acta Gastroenterol. Belg. 56 (suppl.), 61 (1993), Mobley et al., Scand. J. Gastroint. 26 (suppl. 187), 39 (1991))
• - Malaria-Antigen
  (Nussenzweig und Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Vaccines 10 920 (1992), Knapp et al., Infect. Imm. 60, 2397 (1992)).

Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen, die "complementary determining regions", Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.

Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.

Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.

6.3. Kombination gleicher oder unterschiedlicher Wirksubstanzen für die Therapie oder Prophylaxe von Infektionserkrankungen

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Wirkstoff, in welchem eine Kombination der DNA-Sequenzen von gleichen Wirksubstanzen (A, A) oder unterschiedlichen Wirksubstanzen (A, B) vorliegt. Zur Expression von zwei Sequenzen ist vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischengeschaltet.

Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992, Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994) beschrieben.

So kann die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position 140 bis 630 des 5′ UTR (Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) zur Verknüpfung der DNA der viralen Substanz A (am 3′ Ende) und der DNA der antiviralen Substanz B (am 5′ Terminus) verwendet werden.

Ein derartiger Wirkstoff weist je nach Kombination additive (A+A, A+B1) oder synergistische Wirkung im Sinne der Erfindung auf.

So können beispielsweise für die Therapie von Viruserkrankungen zwei gleiche oder zwei unterschiedliche antivirale Wirksubstanzen miteinander kombiniert werden.

Bei der Prophylaxe von Infektionserkrankungen können mehrere Wirksubstanzen, die für unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger kodieren, miteinander kombiniert werden. Des weiteren kann die Wirksubstanz, die für das Antigen eines Infektionserregers kodiert, kombiniert werden mit einer Wirksubstanz, die kodiert für ein Cytokin oder einen Cytokinrezeptor.

Die sich so (nach Injektion des Wirkstoffes) gleichzeitig mit dem Infektionserregerantigen bildenden Cytokine oder Cytokinrezeptoren können Einfluß auf die Art und Stärke der sich entwickelnden Immunreaktion nehmen.

DNA-Sequenzen für Cytokine und Cytokinrezeptoren, welche die humorale Immunreaktion verstärken, sind bereits unter 6.2.d) beschrieben, solche zur Verstärkung der zellulären Immunreaktion unter 6.2.a) und 6.2.c).

DNA-Sequenzen für Cytokine, welche die Immunreaktion insgesamt verstärken, sind beispielsweise:

• - II-1α
  (Fenton, Int. J. Immunopharm 14, 401 (1992), Furntani et al., Nucl. Acids Res. 14, 3167 (1986), Lafage et al., Blood L3, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 (1985))
• - II-1β
  (Bensi et al., Gene 52, 95 (1987), Auron et al., PNAS 81, 7907 (1984), Clark et al., Nucl. Acids Res. 14, 7897 (1986))
• - II-2
  (Fletscher et al., Lymphok. Res. 6, 45 (1987), Matsui et al., Lymphokines 12 1 (1985), Tanaguchi et al., Nature 302, 305 (1983))
• - GM-CSF
  (Gough et al., Nature 309, 763 (1984), Nicola et al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong et al., Science 228, 810 (1985))

7. Wirkstoff zur Behandlung von Tumoren 7.1. Auswahl der Promotoren oder Aktivatorsequenzen für Tumorzellen

Als Promotor oder Aktivatorsequenz ist eine genregulatorische Nukleotidsequenz vorgesehen, mit der Transkriptionsfaktoren, gebildet oder aktiv in Tumorzellen, interagieren.

Bevorzugt werden solche Tumoren, welche direkt für die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte zugänglich sind. Dieses sind nach intravenöser Applikation der Nukleinsäurekonstrukte (neben proliferierenden Endothelzellen im Umkreis von soliden Tumoren unterschiedlichen Typs) beispielsweise Leukämiezellen, nach intraperitonealer Injektion beispielsweise Ovarialkarzinome und Pankreaskarzinome, nach intrabronchialer Applikation beispielsweise Lungenkarzinome.

Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivatorsequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in Leukämiezellen, Krebszellen oder Sarkomzellen gebildete Proteine kodieren. So wird bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen bevorzugt der Promotor des N-CAM-Proteins, bei Ovarialkarzinomen der Promotor des "Hepatitis growth factor"-Rezeptors oder des L-Plastin und bei Pankreaskarzinomen der Promotor des L-Plastins oder des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) verwendet.

7.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen für Tumorzellen

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation von Zellen, insbesondere auch von Leukämiezellen, inhibiert. Zu diesen Zellzyklusinhibitoren gehören beispielsweise die DNA-Sequenzen für inhibitorische zytostatische und zytotoxische Proteine für Antikörper oder Antikörperspaltprodukte und für Enzyme, wie sie bereits beschrieben wurden.

Als Zellzyklusinhibitor ist des weiteren eine DNA-Sequenz zu verstehen, welche ein Protein exprimiert, welches direkt oder indirekt eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen oder Leukämiezellen aufweist.

Als Zellzyklusinhibitor ist des weiteren die DNA-Sequenz für ein Ribozym zu verstehen, welches die mRNA der Gene für Zellzykluskontrollproteine katalysiert.

8. Wirkstoff zur Inhibition der Proliferation glatter Muskelzellen bei Gefäßverschlüssen 8.1. Auswahl der Promotoren oder der Aktivatorsequenzen für glatte Muskelzellen

Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern im Sinne der Erfindung sind bevorzugt genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen zu verwenden, die, besonders in glatten Muskelzellen, gebildete Protein kodieren.

8.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen für glatte Muskelzellen

Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation von glatten Muskelzellen inhibiert. Zu diesen Inhibitoren der Proliferation gehören die bereits unter 2.2.a) und 2.2.c) erwähnten Proteine.

Als Wirksubstanz ist jedoch auch die DNA-Sequenz für ein Enzym zu verstehen, welches eine inaktive Vorstufe eines Zytostatikums in ein Zytostatikum umwandelt (siehe 2.2.e)).

Als Wirksubstanz ist jedoch auch die DNA-Sequenz für ein Ribozym spezifisch für die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine zu verstehen (siehe 2.2.f)).

9. Wirkstoff zur Beeinflussung der Gerinnung 9.1. Auswahl der Promotoren oder der Aktivatorsequenzen zur Beeinflussung der Gerinnung

Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen im Sinne der Erfindung sind bevorzugt genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen zu verwenden, welche in glatten Muskelzellen, in aktivierten Endothelzellen, in aktivierten Makrophagen oder in aktivierten Lymphozyten nachweisbare Proteine kodieren.

9.1.a) glatte Muskelzellen

Beispiele für Promotorsequenzen für Gene in glatten Muskelzellen sind bereits erwähnt.

9.1.b) aktivierte Endothelzellen

Beispiele für Proteine, welche besonders in aktivierten Endothelzellen gebildet werden, sind von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)) beschrieben worden. Im besonderen zählen zu diesen in Endothelzellen verstärkt auftretenden Proteinen beispielsweiße solche Protein, wie sie und die Promotorsequenzen ihrer Gene bereits oben aufgeführt wurden.

9.1.c) aktivierte Makrophagen und/oder aktivierte Lymphozyten

Als Aktivatorsequenz im Sinne dieser Erfindung sind außerdem Promotorsequenzen der Gene für Proteine zu verstehen, welche bei der Immunreaktion in Makrophagen und/oder in Lymphozyten verstärkt gebildet werden. Derartige Proteine sind bereits aufgeführt worden.

9.2. Auswahl der Strukturgene für Wirksubstanzen zur Beeinflussung der Gerinnung

Als Wirksubstanz im Sinne dieser Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verwenden, welche ein Protein kodiert, welches direkt oder indirekt die Thrombozytenaggregation oder einen Blutgerinnungsfaktor inhibiert oder die Fibrinolyse stimuliert.

Eine derartige Wirksubstanz wird als Gerinnungshemmer bezeichnet. Als Gerinnungshemmer sind Gene für beispielsweise Plasminogenaktivatoren (PA), so der Gewebe-PA (tPA) oder der Urokinase-ähnliche PA (uPA) oder Protein C, Antithrombin-III, C-1S-Inhibitor, µ1-Antitrypsin, der Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) oder Hirudin einzusetzen.

Als Wirksubstanz im Sinne dieser Erfindung ist jedoch auch eine DNA-Sequenz zu verwenden, welche ein Protein kodiert, welches die Blutgerinnung fördert. Beispiele für derartige Proteine sind beispielsweise Blutplasmaproteine wie F VIII oder F IX.

10. Wirkstoff zum Schutz vor CNS-Schäden 10.1. Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern für einen Wirkstoff zum Schutz vor CNS-Schäden 10.1.a) Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Endothelzellen

In besonderen zählen hierzu die Promotorsequenzen für die Gene von Endothelzellspezifischen Proteinen.

10.1.b) Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Gliazellen

Als bevorzugte Aktivatorsequenz ist des weiteren eine Nukleotidsequenz (Promotor- oder Enhancersequenz) zu verstehen, welche mit Transkriptionsfaktoren, im besonderen Maße gebildet oder aktiv in Gliazellen, interagieren.

10.2.) Wahl der Strukturgene für neurospezifische Faktoren

Als neurospezifische Faktoren im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, welche für einen neuronalen Wachstumsfaktor kodiert.

Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Herstellung eines Hybridpromotors

Der erfindungsgemäße Hybridpromotor besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:

Element I

• - dem Promotor des VEGF-Rezeptor 1 Genes
  (Nukleinsäuren -1195 bis 100 Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995). Die TATA-Box (Nukleinsäuren TATAAA in der Position -31 bis -26 ist mutiert zu TGTAAA))
• - der Sequenz GCCACC
  (Kodak, J. CeIl Biol. 108, 229 (1989))
• - der cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins
  (Nukleotidsequenz 63 bis 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988))
• - der cDNA der β-Glucuronidase
  (Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))

Element II

• - der Promotor des cdc25C Genes
  (Nukleinsäuren -290 bis +121; Zwickeretal., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))
  (Nukleinsäuren -487 bis +247; Jahroudi and Lynch, Mol. Cell Biol. 14, 999 (1994))
• - dem Gen für das TATA-Box Binding Protein
  (Nukleinsäuresequenz +1 bis +1001, mutiert in den Nukleinsäuren 862 (A ausgetauscht gegen T) 889,890 (GT ausgetauscht gegen AC) und 895 (C ausgetauscht gegen G) (Strubin und Struhl Cell 68, 721 (1992); Heard et al., EMBOJ 12, 3519 (1993)).

Die Nukleotidsequenz von Element I und Element II sind nach folgendem Schema verknüpft:

Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC18/19 oder Bluescript­ abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt werden.

Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA-Ligasen.

Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-38) mit dem Fachmann bekannter Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β- Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe von 4- Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.

Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).

Folgende Ergebnisse werden erzielt:

In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β-Glucoronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.

Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-Glucuronidase als nicht­ transfizierte Endothelzellen.

Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2 S; S = einfacher Chromosomensatz) sekretieren deutlich mehr β-Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte Endothelzellen (DNA = 2 S).

Somit führt die beschriebene multiple Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgens β-Glucuronidase.

Beispiel 2 Herstellung eine Hybridpromotors in Kombination mit einem nuklearen Retentions- Signal (NRS) und einem nuklearen Export-Faktor (NEF)

Der erfindungsgemäße Hybridpromotor besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:

Element III

• - dem Promotor des VEGF-Rezeptor I Genes
  (Nukleinsäuren -1195 bis 100 Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995). Die TATA-Box (Nukleinsäuren TATAAA in der Position -31 bis -26) ist mutiert zu TGTAAA)
• - der Sequenz GCCACC
  (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989))
• - der cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins
  (Nukleotidsequenz 63 bis 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988))
• - der cDNA der β-Glucuronidase
  (Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))
• - der cDNA für RER von HIV-1 Virus als nukleares Retentions-Signal (NRS)
  (Nukleotidsequenz 7357 bis 7602; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985); Malim et al., Nature 338, 254 (1989)).

Element II

• - der Promotor des cdc25C-Gens
  (Nukleotidsäuren -290 bis +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514(1995); Zwicker et al. Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))
• - dem Gen für das TATA-Box bindende Protein mit Komutationen
  (Nukleinsäuresequenz 1-1001 mutiert in den Nukleinsäuren 862 (A ausgetauscht gegen T) 889, 890 (GT ausgetauscht gegen AC) und 895 (C ausgetauscht gegen G) (Strubin und Struhl Cell 68, 721 (1992); Heard et al. EMBOJ 12, 3519 (1993)).

Element IV

• - der Promotor des von Willebrand Faktor (vWF)-Gens
  (Nukleinsäuren -487 bis +247; Jahroudi and Lynch, Mol Cell Biol. 14, 999 (1994))
• - der cDNA für REV von HIV-1 Virus als nuklearer Export-Faktor (NEF) Aminosäuresequenz 1-117; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985)).

Die Nukleotidsequenzen der Elemente II, III und IV sind nach folgendem Schema verknüpft:

Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC18/19 oder Bluescript­ abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt werden.

Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA-Ligasen.

Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-38) mit dem Fachmann bekannter Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β- Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe von 4- Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.

Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).

Folgende Ergebnisse werden erzielt:
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.

Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-Glucuronidase als nicht­ transfizierte Endothelzellen.

Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2 S) sekretieren deutlich mehr β- Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte Endothelzellen (DNA = 2 S).

Somit führt die beschriebene multiple Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgens β-Glucu 07400 00070 552 001000280000000200012000285910728900040 0002019639103 00004 07281ronidase.

Beispiel 3 Herstellung eines Hybridpromotors in Kombination mit einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit

Die erfindungsgemäße Aktivator-responsive Promotoreinheit besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:

Element V Aktivatorsubeinheit A

• - der Promotor des cdc25C-Gens
  (Nukleinsäuren -290 bis +121; Zwicker et al., EMBO J 14, 4514(1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))
• - der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Ga14-Proteins
  (Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Bio 10, 2916 (1990))
• - die cDNA für Ga180
  (Aminosäuren 1 bis 435; Leuther et al., Science 256, 1333 (1992))

Aktivatorsubeinheit B

• - der Promotor des VEGF-Rezeptor 1 Genes
  (Nukleinsäuren -1195 bis + 100 Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995) mit der Mutation TGTAAA in N -31 bis -26)
• - der cDNA für die Gal80-Bindungsdomäne von Gal14
  (Aminosäuren 851 bis 881; Leuther et al., Science 256, 1333 (1992))
• - dem nukleären Lokalisations-Signal (NLS) von SV40
  (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
• - der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16
  (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995))

Aktivator-responsiver Promotor

• - die Bindesequenz für Gal4 mit der Nukleotidsequenz 5′-CGGACAACTGTTGAC CG-3′ (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol 10, 2916 (1999)) gekoppelt an den basalen Promotor von SV40
  (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York; Cold Spring Harbor Laboratory).

Die Reihenfolge der Nukleotidsequenzen der Aktivator-responsiven Promotoreinheiten ist durch folgendes Schema dargestellt:

Die Funktionsweise der beschriebenen Aktivatorsequenz ist wie folgt:

• - Der Promotor cdc25C reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNA′s für das Gal4-Bindeprotein und für Gal80.
• - Der Promotor des VEGF-Rezeptors I beschränkt die Transkription der gekoppelten cDNA für die Gal80-Bindungsdomäne von Gal4, das NSL von SV40 und die TAP auf Endothelzellen. Durch die Mutation ist seine Aktivierung jedoch inhibiert.
• - Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung der Gal80-Bindungsdomäne von Gal4 an Gal80.

Die Dimerisierung ist schematisch wie folgt dargestellt:

Fusionsprotein der Aktivatoruntereinheit A

Fusionsprotein der Aktivatoruntereinheit B

• - Das dimere Protein stellt einen chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator-responsiven Promotor DNA-Sequenz für die Gal4- Bindedomäne/SV40-Promotor dar.

Der Promotor ist nunmehr an seinem 3′-Ende mit der Sequenz GCCACC (Kocak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) und diese mit der cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins (Nukleotidsequenz 63 bis 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) verknüpft. An diese schließt sich die cDNA der β-Glucuronidase (Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) gemäß folgendem Schema an:

Diese Einheit ist wiederum an ihrem 3′-Ende verbunden mit dem Element VI, das Element VI kann jedoch auch am 5′-Ende des Nukleotidkonstruktes angefügt sein.

Element VI

Das Element VI besteht aus

• - dem Promotor des von Willebrand Faktor Genes (Nukleinsäuren -487 bis +247; Jahroudi and Lynch, Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994))
• - dem Gen für das TATA-Box bindende Protein (Nukleinsäuresequenz 1-1001) mutiert in den Nukleinsäuren 862 (A ausgetauscht gegen T); 889, 890 (GT ausgetauscht gegen AC) und 895 (C ausgetauscht gegen G).

Durch die Komutation im TATA-Box bindenden Protein wird die Inhibition der Aktivierung des Promotors für den VEGF-Rezeptor (Aktivatorsubeinheit B) aufgehoben.

Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC1 8/19 oder Bluescript­ abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt werden.

Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA-Ligasen.

Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-38) mit dem Fachmann bekannter Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β- Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe von 4- Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.

Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).

Folgende Ergebnisse werden erzielt:

In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.

Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-Glucuronidase als nicht­ transfizierte Endothelzellen.

Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2 S) sekretieren deutlich mehr β- Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte Endothelzellen (DNA = 2 S).

Somit führt die beschriebene multiple Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgens β-Glucuronidase.

Ein Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt in den Beispielen I-III ermöglicht nach lokaler Applikation beispielsweise an den Ort des Tumors oder nach intrakranieller bzw. subarachnoidaler Gabe oder systemischer, bevorzugt intravenöser oder intrarterieller Gabe, daß durch die Zellzyklus- oder Endothelzellspezifität der Aktivator-responsiven Promotoreinheit vorwiegend, wenn nicht ausschließlich, nur proliferierende Endothelzellen β-Glucuronidase ausscheiden. Diese β-Glucuronidase spaltet ein nunmehr infiziertes gut verträgliches Doxorubicin-β-glucuronid (Jacquesy et al., EPO 0511 917 A1) in das zytostatisch wirkende Doxorubicin. Dieses hemmt die Endothelzellproliferation und wirkt zytostatisch auf diese Zellen wie auch auf benachbarte Tumorzellen. Hierdurch kommt es zur Hemmung des Tumorwachstums.

Claims (31)

1. Nukleinsäurekonstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß es zur präzise regulierten Expression von Genen in Wirtszellen geeignet ist und daß es mindestens eine Mutation aufweist, durch welche die ordnungsgemäße Expression besagten Gens inhibiert ist und daß es eine zweite Mutation aufweist, welche die Inhibition durch die erste Mutation aufhebt.

2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Komponenten in Leserichtung vom 5′-Ende zum 3′-Ende aufweist:

• a) eine erste unspezifische, zellspezifische, virusspezifische, metabolisch aktivierbare, durch Tetrazyklin und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenz, die die basale Transkription eines Transgens aktiviert und eine Mutation enthalten kann, welche die Funktion des Promotors inhibiert.
• b) ein Transgen, das als ein Strukturgen für einen Wirkstoff kodiert und welches eine Mutation enthalten kann, die die Expression oder die Funktion des kodierten Proteins inhibiert.
• c) eine zweite unspezifische, zellspezifische, virusspezifische, metabolisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenz, die die basale Transkription der Komponente d) aktiviert und eine Mutation enthalten kann, welche die Funktion des Promotors inhibiert.
• d) ein Gen für eine tRNA (Suppressor -tRNA) oder ein regulatorisches Protein zur Behebung der Mutation in einem oder mehreren der Promotoren (Komponenten a) oder c) oder im Transgen (Komponente b).

3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1) oder 2), dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b) ein nukleares Retentions-Signal aufweist, dessen cDNA am 5′-Ende mit dem 3′-Ende des Strukturgens mittelbar oder unmittelbar verknüpft ist und daß das Transkriptionsprodukt des nuklearen Retentions-Signals eine Bindestruktur für einen nukleären Export-Faktor aufweist.

4. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 2) oder 3), dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zu den Komponenten a) bis c) folgende Komponenten aufweist:

• j) eine weitere Promotor- oder Enhancersequenz, welche die basale Transkrip­ tion eines nuklearen Export-Faktors aktiviert.
• k) Eine Nukleinsäure kodierend für einen nuklearen Export-Faktor, der an das Transkriptionsprodukt des nuklearen Retentions-Signals (c) bindet und hier­ durch den Transport des Transkriptionsproduktes des Transgens aus dem Zellkern in das Zytoplasma vermittelt.

5. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß die erste Promotor- oder Enhancersequenz (a) und die zweiter Promotor- oder Enhancersequenz (d) gleich oder unterschiedlich sind und daß mindestens eine der Komponenten a) und d) unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch, metabolisch, insbesondere durch Hypoxie, durch Tetrazyklin, oder zellzyklusspezifisch aktivierbar ist.

6. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4) oder 5), dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Promotor- oder Enhancersequenzen (a) und (d) ein chimärer Promotor ist, bei welchem das Promotormodul CDE-CHR oder E2FBS- CHR mit einer stromaufwärts benachbarten zellspezifischen, virusspezifisch oder metabolisch aktivierbaren Aktivatorsequenz interagieren und dadurch die Expression eines stromabwärts gelegenen Gens beeinflussen, insbesondere inhibieren kann.

7. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3) oder 4), dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Komponente a) und d) eine Aktivator-responsive Promotorein­ heit darstellt umfassend folgende, Komponenten:

• e) wenigstens eine Promotor- oder Enhancersequenz, die unspezifisch, virus­ spezitisch, metabolisch, zellspezifisch, durch Tetrazyklin und/oder zellzyklus­ spezifisch aktivierbar ist und
• f) wenigstens eine Aktivatorsubeinheit, die stromabwärts von der Promotor- oder Enhancersequenz (e) gelegen ist und durch die Promotor- oder Enhancersequenz (e) in ihrer basalen Transkription aktiviert wird,
• g) ein Aktivator-responsiver Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte von einer Aktivatorsubeinheit (f) oder mehreren gleichen oder unterschiedlichen Aktivatorsubeinheiten (f, f′) aktiviert wird.

8. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7), bei welchem die Promotor- oder Enhancersequenz (a) und/oder (c) und/oder (i) und/oder der Aktivator-responsive Promotor ein chimärer Promotor ist und die Aktivatorsubeinheit (f) ein Gen für wenigstens einen Transkriptionsfaktor darstellt, der den chimären Promotor des Aktivator-responsiven Promotors (g) aktiviert.

9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß

• - der Aktivator-responsive Promotor (g) der LexA-Operator in Verbindung mit dem SV40 Promotor oder die Gal4-Bindestelle ist und
• - die Aktivatorsubeinheit (f) die cDNA für das LexA-DNA-Bindeprotein kodierend für die Aminosäuren 1-81 oder 1-202 umfaßt, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für das Gal80-Protein (Aminosäuren 1-435) darstellt und
• - eine weitere Aktivatorsubeinheit (f′) die cDNA der Gal80-Bindungsdomäne des Gal4-Proteins kodierend für die Aminosäuren 851-881 enthält, deren 3′- Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA des SV40 Large T-Antigens kodierend für die Aminosäuren 126-132, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.

10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen kodierend für das nukleare Retentions-Signal ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend das Rev-responsive Element (RRE) von HIV-1 oder HIV-2, das RRE-äquivalente Retentions-Signal von Retroviren oder das RRE-äquivalente Retentions-Signal des HBV.

11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß der nukleare Export-Faktor (k) ein Gen ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend das Rev-Gen der Viren HIV-1, HIV-2, Visna-Maidi Virus, Caprine arthritis encephalitis Virus, das Virus der infektiösen Anämie des Pferdes, das Immundefizienzvirus der Katze, von Retroviren, von HTLV oder das Gen des hnRNP-A1-Proteins oder das Gen des Transkriptionsfaktors TFIII-A.

12. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine TATA-Sequenz in einem oder in mehreren Promotoren (Komponenten a), c), i), f) oder g)) mutiert ist und Komponente d) ein Gen für ein TATA-bindendes Protein (TBP) darstellt, welches derartig mutiert ist, daß es die Mutation in der TATA-Box aufhebt.

13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 12), dadurch gekennzeichnet, daß die TATA-Box zu TGTAAA mutiert ist und das Gen für das TBP mutiert ist in N862 zu T, N889 zu A, N890 zu C, N895 zu G.

14. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das Transgen (Komponente b)) und/oder für den nukleären Export-Faktor (Komponente k)) und/oder für das TBP (Komponente d)) und/oder für die Bindeproteine im Aktivator-responsiven Promotor (Komponenten f) und/oder f,)) derartig mutiert ist, daß es mindestens ein Stop-Codon aufweist und daß die Komponente d) ein Gen für eine tRNA darstellt, welche ein Anti-Codon komplementär zum Stop-Codon besitzt, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure zur Behebung der Mutation in der Komponente b) oder k) oder d) oder f) oder f′) aufnimmt.

15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 14, bei welchem mindestens ein Codon ausgewählt aus UAU, UUG, UAC, UCG, CAG, AAA, AAG oder UGG in der Komponente b), k), a), f) oder f′) mutiert ist zu UAG, UAA, UAG, UGA oder UGG und die Suppressor tRNA (Komponente d)) das Gen sup F(su+3); sup C (su+4), sup D (su+1); sup E (su+2); sup G (su+5) oder sup U (su+7) darstellt.

16. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das Transgen (Komponente b)) und/oder für den nukleären Export-Faktor (Komponente k)) und/oder für das TBP (Komponente d)) und/oder für die Bindeproteine im Aktivator-responsiven Promotor (Komponente f und/oder f′) derartig mutiert ist, daß das exprimierte Protein nicht funktionsfähig ist und daß die Komponente d) ein Gen für eine tRNA darstellt, welche ein Anti-Codon komplementär zur Mutation besitzt, andererseits eine Endgruppe trägt, welche die korrekte Aminosäure zur Behebung der Mutation in der Komponente b) oder k) oder d) oder f) oder f′) aufnimmt.

17. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um DNS handelt.

18. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Nukleinsäurekonstrukt um einen Vektor handelt.

19. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 18), dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Plasmidvektor handelt.

20. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 18), dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen viralen Vektor handelt.

21. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Transgen (b) um ein Strukturgen handelt, das für einen Wirkstoff kodiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Cytokine, Interferone, Wachstumsfaktoren, Antikörper, Antikörperfragmente, Fusionsproteine aus einem Liganden und einem Cytokin oder Wachstumsfaktor, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ, apoptotisch, zytostatisch oder zytolytisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren und/oder Thrombose­ induzierenden Proteinen, Gerinnungshemmer, Blutplasmaproteine, Komplement aktivierende Proteine wie Cobra Venum Faktor, humanes C3b, modifiziertes C3b, bakterielle Proteine, Virushüllproteine, bakterielle Antigene und parasitäre Antigene und Ribozyme.

22. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotor-, Enhancer- oder Aktivatorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von genregulatorischen Nukleotidsequenzen aktiviert in Endothelzellen, glatten Muskelzellen, quergestreiften Muskelzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Tumorzellen, Leberzellen, Leukämiezellen und Gliazellen oder von Promotorsequenzen der Viren HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

23. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Transgen (b) um ein Strukturgen handelt, das für ein Enzym kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.

24. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Transgen b) um ein Strukturgen handelt, das für ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein kodiert.

25. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 24), dadurch charakterisiert, daß der Ligand an proliferierende Endothelzellen bindet und ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Antikörper oder deren Fragmente, endständig Mannose-haltige Proteine, Cytokine wie IL-1 oder TNF, Wachstumsfaktoren wie PDGF, G-FGF, VEGF, TGFβ oder Adhäsionsmoleküle wie SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 oder VLA-1.

26. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 24), dadurch charakterisiert, daß der Ligand an Tumorzellen bindet.

27. Isolierte Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1) bis 26) enthält.

28. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1) bis 26) oder einer Zelle nach Anspruch 27) zur Bereitstellung eine Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung.

29. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts nach Anspruch 28) zur Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung des Nukleinsäurekonstrukts in eine Zielzelle umfaßt.

30. Verwendung nach Anspruch 29), dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung mit übermäßiger Zellvermehrung einhergeht.

31. Verwendung gemäß Anspruch 28) bis 30), dadurch gekennzeichnet, daß die Bereitstellung des Heilmittels die Überführung eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß einem der Ansprüche 1) bis 26) in eine Form umfaßt, die die Einführung des Nukleinsäurekonstrukts in die Zielzelle ermöglicht.