WO2000065075A1 - Verwendung von coxsackieviren zur verbesserung der transfektion von zellen - Google Patents

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WO2000065075A1
WO2000065075A1 PCT/EP2000/003588 EP0003588W WO0065075A1 WO 2000065075 A1 WO2000065075 A1 WO 2000065075A1 EP 0003588 W EP0003588 W EP 0003588W WO 0065075 A1 WO0065075 A1 WO 0065075A1
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Jan-Heiner KÜPPER
Reinhard Kandolf
Hans-Christoph Selinka
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention is generally concerned with the use of coxsackieviruses (hereinafter: CV) to improve the transfection of cells.
  • CV coxsackieviruses
  • Coxsackieviruses belong to the Picornaviridae family and are divided into subgroup A with serotypes 1-22 and 24 and subgroup B with serotypes 1-6. While the invention generally starts from coxsackieviruses, the invention is particularly concerned with coxsackieviruses of subgroup B, preferably of serotype B3.
  • transfection means not only the introduction of DNA or RNA into cells, but also the introduction of peptides into cells. The transfection can thus be used for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes, in particular gene therapy.
  • the present invention pays particular attention to the diagnosis, treatment and prevention of cardiac diseases, which are becoming increasingly important, particularly in the industrialized nations.
  • cardiac diseases which are becoming increasingly important, particularly in the industrialized nations.
  • cardiac muscle-specific gene transfer systems for the selective modulation of the endogenous is Cardiac myocyte gene activity is of great clinical importance for the future treatment of a variety of congenital and acquired heart muscle diseases.
  • ideal vector systems for the controlled modulation of the endogenous gene activities of cardiac myocytes have so far not been available.
  • This liposome formulation is sold by GIBCO / BRL under the trade name LIPOFECTIN ® .
  • Lipofection is now a recognized method for introducing recombinant DNA into cells and expressing it there. Since lipofection is viral vector with respect to safety Systems is superior, attempts are increasingly being made to use this technique for the gene therapy of metabolic or tumor diseases. However, the efficiency is low in most applications, in particular in the case of primary cultures or in vivo applications, the known liposome systems have so far not been very suitable.
  • CVB3 a subgroup B coxsackie virus with serotype 3 is a picornavirus with a single-stranded RNA genome of positive polarity and a genome size of only 7.4 kb.
  • adenoviruses have a genome size of 48 kb.
  • the complete nucleotide sequence of the cDNA of this infectious CBV3 variant is described in Klump et al., Journal of Virology, 1990, pages 1573-1783.
  • the cDNA-derived virus is reported to have the same tropism and plaque morphology as the wild type.
  • Kern et al. describe that the inactivated CVB3 increases the transfection mediated by the liposome formulation DOTAP (Bschreibinger).
  • the maximal Transfection efficiency is reported for the use of 10 pfu (plaque-forming units) of inactivated CVB3 per cell, it was up to 6 times higher for the reporter gene of the ⁇ -galactosidase than when the reporter gene construction was transfected exclusively with DOTAP.
  • this object is achieved by non-infectious particles or peptides derived from the coxsackie virus, preferably from CVB, which are suitable for acting endosomolytically in the context of a transfection of cells or for enhancing endocytosis.
  • the particles are selected from the group consisting of:
  • CV preferably CVB-A, particles formed by cleavage of virus protein 4
  • CV preferably CVB, provirus particles in which virus proteins 2 and 4 are still fused
  • the peptide which preferably comprises less than 30 amino acids, is advantageously selected from the group:
  • peptides or polypeptides which comprise the amino acid sequence of one of the peptides from a) or b).
  • the inventors of the present application have in fact recognized that particles or peptides derived from the CV, preferably CVB, more preferably from CVB3, can be used for gene transfer, since they have an endosomolytic effect and / or increase endocytosis.
  • the use of these particles and / or peptides makes the process of transfection very inexpensive, on the one hand, since extremely high yields are obtained during production, very simple cleaning is possible, and very small peptides / particles are used which have a significantly lower number have more immunogenic epitopes than adenovirus or influenza viruses.
  • the inventors were able to show that optimal biological effects result with much smaller amounts of peptides than with adenoviruses, the greater biological effectiveness is also accompanied by a reduction in immunogenicity.
  • Another advantage of using the particles and peptides is that they are not infectious in any case, and in many cases UV radiation to inactivate the RNA can also be dispensed with.
  • a method for producing such a particle has the steps:
  • Isolating native CV preferably CVB particles
  • Heating the isolated CV preferably CVB particles for 5-20 minutes, preferably about 10 minutes, to above 45 ° C, preferably about 51 ° C.
  • CV-A particles can also be produced using the following process:
  • the present invention further relates to a method for the transfection of cells, preferably cardiac myocytes with a polyanion, preferably a therapeutic gene sequence, in which at least one particle or peptide of the type mentioned above is used to enhance the transfection, preferably before Transfection a complex of the polyanion, the peptide and a cationic lipid, preferably DOTMA is formed.
  • a particle or peptide of the type mentioned above is used to enhance the transfection, preferably before Transfection a complex of the polyanion, the peptide and a cationic lipid, preferably DOTMA is formed.
  • the particles and peptides mentioned generally have an endosomolytic effect, that is to say ensure that the new method is highly efficient, there is a particular advantage in lipofection of cardiac myocytes.
  • endosomolysis can have organ-specific aspects, so that the use of particles and peptides derived from the CV, preferably the CVB3, is the method of choice for gene transfer to the heart muscle. It has been shown that other viruses are nowhere near as efficient, in particular adenoviruses have no way of colonizing this organ as efficiently as the cardiotrophic CVB3.
  • the transfected polyanion can be a DNA, an RNA or a correspondingly charged protein with a therapeutic effect.
  • the invention further relates to a method for formulating complexes for the transfer of polyanions, preferably a therapeutic gene sequence in cells, preferably cardiac myocytes, in which the polyanion is incubated with at least one peptide or particles of the type mentioned above.
  • the peptide is preincubated with a cationic lipid, preferably with DOTMA, before incubation with the polyanion.
  • a cationic lipid preferably with DOTMA
  • the present invention also relates to the use of a peptide or particle of the type mentioned above for the therapy, diagnosis or prophylaxis of cardiovascular diseases, in particular cardiomyopathies.
  • the invention further relates to the use of a peptide or particle of the type mentioned above as an agent for improving the transfection of cells, preferably cardiac myocytes, in particular for improving lipofection in gene therapy.
  • the peptides and particles found can not only be used in the scientific field or for individual preparation, they are also suitable for general use in less specialized hospitals or medical practices.
  • the present invention also relates to a therapeutic composition with a peptide or particle of the type mentioned above, and a kit for the formulation of transfectable complexes, in particular for gene therapy, which contains a peptide or particle of the type mentioned above.
  • a therapeutic composition with a peptide or particle of the type mentioned above and a kit for the formulation of transfectable complexes, in particular for gene therapy, which contains a peptide or particle of the type mentioned above.
  • Such therapeutic compositions and kits can contain the particles and / or peptides in stock solutions or already in final concentrations, it also being possible for the further required reagents, for example the liposome formulation, to be present in the kit.
  • the peptides and particles can be generated enzymatically on the one hand by digesting virus particles, but on the other hand also by genetic engineering.
  • the invention further relates to a replicable expression vector which contains a gene sequence which expressively codes for a peptide or particles of the type mentioned above.
  • the invention further relates to a DNA isolate with a DNA sequence which codes for the peptide or protein of the type mentioned above.
  • replication-incompetent virus particles are used due to genetic manipulation, on the one hand there is a very high level of security, because these particles can only be replicated in a helper cell that provides the destroyed functions in trans. These particles can then also be used for lipofection without further inactivation by UV radiation or thermal treatment.
  • the replication-incompetent virus particles are produced, for example, by deleting coding genome sequences, preferably the VP2 and VP3 regions, which contain the information for the replication-relevant proteins. On the other hand, these replication-relevant gene functions can also be destroyed by point mutations.
  • the deleted sequences are replaced by other sequences, preferably non-coding sequences, in order to restore the optimal genome size for the packaging.
  • the deleted or mutated genome sequences are then made available in helper cells according to the invention.
  • the present invention also relates to a vector plasmid with at least one DNA sequence which codes for a genetically modified CV, preferably CVB, more preferably CVB3 genome, in which parts of the coding sequence are exchanged or changed, so that the Virus genome is not infectious, and with a promoter upstream of the DNA sequence.
  • the invention further relates to a helper construct for complementing the portions of the coding sequence of the virus genome which have been changed or exchanged in the vector plasmid.
  • This helper construct can be a helper plasmid, a viral vector or a helper cell which is stably transfected with helper DNA coding for at least one of the exchanged or changed sequences.
  • Host cells are used to produce virus particles which are replication-incompetent through genetic manipulation the vector plasmid, the exchanged or modified sequences in the host cell being complemented by the helper construct.
  • replication-incompetent virus particles can be produced easily and reproducibly, which have an endosomolytic effect in the context of a transfection of cells or which increase endocytosis.
  • Example 1 CVB3 genome and cDNA
  • Coxsackieviruses are members of the enterovirus genus in the Picorna virus family. Under natural conditions, coxsackieviruses only cause diseases in humans, but the initial isolation of coxsackieviruses works best in newborn mice, which also serve to differentiate the viruses into two groups:
  • Group A with 23 serotypes and Group B with 6 serotypes are Group A with 23 serotypes and Group B with 6 serotypes.
  • CVB especially CVB3 are considered to be common pathogens of viral myocarditis, which can manifest themselves both in this acute form and in chronic courses. Myocarditis is often fatal in infants.
  • Coxsackieviruses have icosahedral nucleocapsids, which consist of four virus proteins VP1, VP2, VP3 and VP4. While the proteins VP1, VP2 and VP3 form the outer envelope, VP4 is located on the inside of the particles and is associated with the single-stranded RNA genome.
  • the genome is infectious per se; If it is taken up in a cell under suitable conditions, the purified RNA can already induce an infection because it has a plus-strand orientation, so the virus proteins can be translated from the RNA without an intermediate step.
  • the 3 'end of the genomic RNA is polyadenylated, and a small, virus-encoded protein V Pg is covalently bound to the 5' end.
  • FIG. 1 A schematic example of the CVB3 genome is shown in Fig. 1.
  • the genome contains a single, open reading frame that codes for a precursor protein. This polyprotein is proteolytically cleaved into the various viral components during its synthesis.
  • the capsid proteins VP1-VP4 mentioned above result from the polyprotein in the specified manner from the regions 1A to ID and the Vpg from the region 3B. Regions 2A and 3C code for proteases that break down the polyprotein. The proteins emerging from areas 2B and 2C are related to the host specificity of the viruses.
  • Area 3D codes for an RNA-dependent RNA polymerase, which replicates the RNA genome in the host cell.
  • the genome contains regions that have not yet been translated (NTR), the NTR region at the 5 'end having a pronounced secondary structure and allowing the binding of ribosomes, that is to say allowing the genome to be translated into the polyprotein .
  • the cell culture supernatants and the cells are harvested.
  • viruses are released from the cells by conventional freeze / thaw lysis. This virus suspension is first cleaned of cell debris by centrifugation at 1,500 rpm.
  • the virus-containing supernatant is layered on 10 ml of a 5-30% sucrose gradient and ultracentrifuged. This results in a separation of native virions (Sedimentation coefficient 160 S), CVB3-A particles (135 S) and Proviren (125 S).
  • Proviruses are incompletely matured viruses, which are present in large quantities with each preparation and are characterized by the fact that the VPO protein has not yet been cleaved into VP2 and VP4.
  • a particles are formed from native virions by splitting off the virus protein 4, a process that occurs naturally during infection. They are then no longer infectious, but can still be multiplied in a cell.
  • the relevant individual fractions are dialyzed against PBS / 20 mM MgCl 2 for 24 hours at 4 ° C.
  • the cleaned virus stocks are stored at -20 ° C. Dilutions of these virus stocks are sown on host cells in order to check the virus titer in a conventional plaque test.
  • Example 3 Generation of CVB3-A particles
  • the fractions produced according to Example 2 contain only small amounts of CVB3-A particles, so that they can be produced from infectious CVB3 particles in the following two ways:
  • A) native virions are heated for 10 min at 51 ° C and thereby pass quantitatively into CVB3-A particles.
  • the alternative is based on column purification, in which recombinant CVB3 receptors are coupled to a matrix.
  • the column is then loaded with active CVB3 particles that interact with the receptor and thereby lose the virus protein 4.
  • the CVB3-A particles can be obtained by eluting the column.
  • CVB3-enhanced lipofection is independent of the receptor, so that no A-particles are generated during lipofection.
  • A-particles are the particles that occur naturally in a receptor-dependent infection and have a higher endosomolytic activity than native virions. Therefore, the results with that by
  • A-particle enhanced lipofection can be achieved better than that of Kern et al. described lipofection with native virions.
  • CVB3 clear endosomolytic activity of CVB3 could be demonstrated by the CVB3-mediated enhancement of lipofection by bafilomycin, a specific inhibitor of the endosomal proton pump (Bowman et al., PNAS, volume 85, pages 7972-7962, 1988; Drose et al., Biochemistry, volume 32, pages 3902-3906, 19993) is canceled.
  • bafilomycin a specific inhibitor of the endosomal proton pump
  • Peptides from the capsid region of CVB3 that are endosomolytically active are shown in the following table:
  • Table 1 CVB3 peptides with endosomolytic activity. Hydrophilic acidic or basic amino acids are printed in bold.
  • the problem with the peptides may be that their amphipathic properties make it difficult to combine them with liposomes, because these are destroyed.
  • This problem can be solved by additionally synthesizing some acidic amino acids at the N-terminal or C-terminal and the synthetic peptide is then bound to the DNA to be transferred via a positively charged poly-lysine bridge.
  • This has the further advantage that transferrin-coupled poly-lysine can be used, so that an efficient binding to the transferrin receptor is possible (Wagner, op. Cit.).
  • the starting point for the production of genetically modified, replication-incompetent virus particles is a vector plasmid, as shown in FIG. 2.
  • This vector plasmid contains behind a promoter a DNA sequence which codes for the RNA genome from Fig. 1, but certain parts of the RNA genome are exchanged or e.g. were changed by point mutation such that the RNA genome itself is no longer infectious.
  • FIG. 2 the RNA genome from FIG. 1 is schematically divided into a first part I and a second part II.
  • the parts I and II do not necessarily have to be arranged schematically one behind the other, they can also be present several times in any order.
  • Part I represents the exchanged or modified sequence part
  • part II represents the remaining genome from FIG. 1.
  • the vector plasmids of Figure 2 are then co-transfected with helper constructs in host cells to produce replication-incompetent virus particles.
  • the helper constructs must complement the exchanged or modified part I.
  • helper cells serve as host cells when transfecting with vector plasmid and make the missing or modified portions of the virus genome available in trans.
  • helper constructs are also plasmids which are transfected stably or transiently in host cells, in order then to be transcribed into RNA, which in turn is translatable to produce the structural and non-structural proteins for which the Vector plasmid itself is not encoded.
  • a promoter for example the CMV promoter
  • an IRES internal ribosomal entry site
  • the amplificates with parts I of CVB3 are then cloned behind.
  • the IRES the translation efficiency of the helper parts increased, for example the IRES from EMVC (Enzyphalomyocarditis Virus), the EMCV-IRES from CLONETECH can be used.
  • helper plasmids are generated which can be amplified in bacteria and transcribable in RNA, which in turn can be translated in order to complement the translation products of the vector plasmids in such a way that replication-incompetent virus particles are formed.
  • helper cells which are transiently or stably transfected with the helper plasmid, are transfected with the corresponding vector plasmid, which is then complemented by the host cell in trans.
  • One way that allows greater variability is to co-transform host cells with the vector plasmid of FIG. 2 and the corresponding complementary helper plasmid of FIG. 3, thereby creating the replication-incompetent virus particles.
  • CHO Chinese hamster ovarian cells
  • H9C2 rat myoblast cells
  • HeLa human cervical carcinoma cells
  • primary human fibroblasts primary adult cardiac muscle cells of the pig were used as target cells.
  • 5 x 10 4 cells were sown on 24-hole plates.
  • the following solutions were prepared on the second day:
  • Solution A 150 ⁇ l serum-free medium
  • Solution A is incubated for 30 min at room temperature.
  • Solution B 1.5 ⁇ g plasmid DNA (e.g. pCMVLacZ) ad 150 ⁇ l serum-free medium
  • Solutions A and B are mixed and incubated for 15 min at room temperature.
  • the cells are washed once with serum-free medium.
  • the medium is completely removed and the 300 ⁇ l lipofection solution is added to the 24-hole plate. Then the cells are incubated for 5 hours at 5% CO 2 and 37 ° C. After this time, the lipofection solution is removed and replaced by cell culture medium.
  • the transfected plasmid pCMVLacZ codes for the ⁇ -galactosidase, which produces a blue, insoluble reaction product in the cells from the initially colorless solution.
  • the cells are first fixed and then incubated with the staining solution. The transfection efficiency results from the number of stained cells / total number of cells and is determined in the microscope.

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Abstract

Es werden von dem Coxsackievirus abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide beschrieben, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch zu wirken und/oder die Endocytose zu verstärken.

Description

Verwendung von Coxsackieviren zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich allgemein mit der Verwendung von Coxsackieviren (im folgenden: CV) zur Verbesserung der Transfektion von Zellen.
Coxsackieviren gehören zur Familie der Picornaviridae und werden in die Subgruppe A mit den Serotypen 1-22 und 24 sowie die Subgruppe B mit den Serotypen 1-6 eingeteilt. Während im Rahmen der Erfindung allgemein von Coxsackieviren ausgegangen wird, beschäftigt sich die Erfindung im Besonderen mit Coxsackieviren der Subgruppe B, vorzugsweise des Serotyps B3. Unter Transfektion wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung nicht nur das Einbringen von DNA oder RNA in Zellen, sondern auch das Einbringen von Peptiden in Zellen verstanden. Die Transfektion kann somit zu therapeutischen, diagnostischen oder prophylaktischen Zwecken, insbesondere einer Gentherapie eingesetzt werden.
Besonderes Augenmerk richtet die vorliegende Erfindung auf die Diagnose, Behandlung und Prävention von kardialen Erkrankungen, die insbesondere in den Industrienationen eine immer größere Bedeutung erlangen. Nachdem bereits verschiedene Gene für kar- diale Erkrankungen identifiziert wurden und es allgemein erwartet wird, daß eine Vielzahl von pathologischen Genen, die Herzerkrankungen auslösen können, in den nächsten Jahren noch identifiziert werden, ist die Entwicklung von Herzmuskel-spezifischen Gentransfersystemen zur selektiven Modulation der endogenen Genaktivität kardialer Myozyten für die zukünftige Behandlung einer Vielzahl von angeborenen und erworbenen Herzmuskelerkrankungen von großer klinischer Bedeutung. Ideale Vektorsysteme für die kontrollierte Modulation der endogenen Genaktivitäten kardialer Myozyten stehen jedoch bisher nicht zur Verfügung.
Für die Transfektion von Zielzellen des kardiovaskulären Systems wurden zwar bereits verschiedene Techniken beschrieben, diese weisen jedoch alle spezifische Nachteile auf. In präklinischen Studien zur somatischen Gentherapie kardiovaskulärer Erkrankungen wurden bislang insbesondere replika- tionsdefekte rekombinante Adenoviren angesetzt, mit denen eine hinreichende Transfektionseffizienz erreicht wird (Barr et al., Gene Therapy 1, 1994, 51). Im Gegensatz zu rekombinanten Adenoviren ist die Applikation von retroviralen Konstrukten (Nabel EG et al., Science 249, 1990, 1285) sowie von Lipid/ DNA/Komplexen (Nabel EG et al., Science 244, 1989, 1342) durch die niedrige Transfektionseffizienz des Gentransfers limitiert. Trotz der Vorteile des Adenovirus-vermittelten Gentransfers bezüglich der hohen Genexpression liegen die Nachteile dieses Verfahrens in der aus der Literatur bekannten Komplementierung replikationsinaktiver Konstrukte, der Multiorgantropie von Adenoviren sowie der möglichen Induktion einer T-Zell- vermittelten Immunantwort.
Feigner et al., PNAS, Band 84, Seiten 7413-7417, 1987 beschreiben eine Lipofektion genannte Transfektion von DNA in Zellkulturzellen, bei der eine Liposomenformulierung aus dem kationischen Lipid N-[ l-( 2 , 3-Dioleyloxy )propyl]-n,n,n-Trime- thylammoniumchlorid (DOTMA) und Dioleoyl-Phosphotidylethano- lamin (PtdEtn) verwendet wird. Die zu transferierende DNA interagiert spontan mit der Liposomenformulierung, und es bilden sich Lipid-DNA-Komplexe . Die Fusion des Komplexes mit Zellkulturzellen führt zu einer effizienten Aufnahme und Expression der DNA.
Diese Liposomenformulierung wird von GIBCO/BRL unter dem Handelsnamen LIPOFECTIN® vertrieben. Die mitgelieferten Herstellinformationen, in denen PtdEtn mit DOPE bezeichnet wird, geben detaillierte Anweisungen für die Durchführung der Lipofektion an.
Mittlerweile ist Lipofektion eine anerkannte Methode, um rekom- binante DNA in Zellen einzuschleusen und dort zu exprimieren. Da die Lipofektion in bezug auf Sicherheit viralen Vektor- Systemen überlegen ist, wird zunehmend versucht, diese Technik auch für die Gentherapie von Stoffwechsel- oder Tumorerkrankungen einzusetzen. Die Effizienz ist jedoch bei den meisten Anwendungen gering, insbesondere bei Primärkulturen oder in vivo-Applikationen sind die bekannten Liposomen-Systeme bisher nicht gut geeignet.
Ein weiterer Ansatz geht von der Erkenntnis aus, daß viele Viren über zelluläre Rezeptoren aufgenommen werden, auf natürlichem Weg in zytoplasmatische Endosomen gelangen und von dort ihren Replikationszyklus antreten, nachdem die Endosomen aufgebrochen wurden. Diese endosomolytische Wirkung nutzen Cotten et al., PNAS Band 89, Seiten 6094-6098, 1992 aus und verwenden replikationsinkompetente Adenoviren als endosomolytisches Agens zusammen mit Transferrin als Ligand für die Zielzellrezeptoren.
Wagner et al., PNAS Band 89, Seiten 7934-7938, 1992 zeigen, daß Peptidfragmente eines Influenzavirus endosomolytisch wirken. Als synthetisches, virusartiges Gentransfervehikel verwenden sie DNA-Komplexe aus Poly-Lysin zum Verpacken der DNA, Poly- Lysin-modifiziertem Transferrin als Ligand für die Zellober- flächenrezeptoren sowie Poly-Lysin-gebundene Influenzapeptid- fragmente als endosomolytisches Agens.
Die beschriebenen Verfahren sind zum einen sehr aufwendig und damit für Standardanwendungen nicht geeignet. Bei den beiden zuletzt beschriebenen Verfahren werden darüber hinaus sehr große Peptidmengen benötigt, was aufgrund der starken Immuno- genität bei in vivo-Applikationen ungünstig und aufgrund der teuren Herstellung darüber hinaus auch für in vitro-Anwendungen ungeeignet ist. Einen weiteren Ansatz beschreiben Kern et al. in "Coxsackievirus-verstärkter endosomolytischer Gentransfer in kontraktile Kardiomyozyten" , Verh. Dtsch. Ges. Path. Band 81, Seite 611, 1997. Ausgehend von der Erkenntnis, daß das Coxsackievirus einen bisher unverstandenen Tropismus in das Herz aufweist, setzen sie bei der Lipofektion durch UV-Strahlung replikationsinkompetente CVB3-Partikel für den Gentransfer in Kardiomyozyten ein. Bei CVB3, einem Coxsackievirus der Subgruppe B mit Serotyp 3 handelt es sich um ein Picornavirus mit einem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität und einer Genomgröße von nur 7,4 kb. Zum Vergleich, Adenoviren haben eine Genomgröße von 48 kb.
Das Verfahren, durch UV-Strahlung replikationsinkompetente CVB3-Partikel herzustellen, ist jedoch nicht hinreichend sicher. Es ist nämlich nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung nicht auszuschließen, daß einige Viruspartikel überleben und dann eine produktive Infektion in den Zielzellen einleiten.
Kandolf und HofSchneider, PNAS, Band 82, Seiten 4818/4822, 1985, beschreiben eine CVB3-Variante mit ausgeprägtem Tropismus für das Herz. Die vollständige Nukleotidsequenz der cDNA dieser infektiösen CBV3-Variante ist beschrieben bei Klump et al., Journal of Virology, 1990, Seiten 1573-1783. Es wird berichtet, daß das cDNA-abgeleitete Virus denselben Tropismus und dieselbe Plaque-Morphologie aufweist wie der Wildtyp.
Kern et al. (a.a.O.) beschreiben, daß durch das inaktivierte CVB3 eine Verstärkung der durch die Liposomenformulierung DOTAP (Böhringer) vermittelten Transfektion erfolgt. Die maximale Transfektionseffizienz wird für die Verwendung von 10 pfu (Plaque-bildende Einheiten) an inaktiviertem CVB3 pro Zelle berichtet, sie lag für das Reportergen der ß-Galactosidase bis zu 6-fach höher als bei einer Transfektion der Reportergenkonstruktion ausschließlich mit DOTAP.
Obwohl aus der Veröffentlichung von Kern et al. bekannt ist, daß die CVB3-verstärkte DOTAP-vermittelte Lipofektion dazu führt, daß die transfizierte DNA schneller aus den Endosomen in das Zytosol gelangt, ist die beschriebene Effizienz sowie der hohe Einsatz von CVB3 aus immunologischen Gründen noch nicht zufriedenstellend .
Hiervon ausgehend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für eine Steigerung der Effizienz der Transfektion von Zellen zu sorgen, wobei das Verfahren gleichzeitig preiswert, sicher und immunologisch unbedenklich sein soll.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch von dem Coxsackievirus, vorzugsweise von CVB abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch zu wirken oder die Endocytose zu verstärken.
Die Partikel sind dabei ausgewählt aus der Gruppe
a) leere CV-, vorzugsweise CVB-Kapsidpartikel,
b) durch Abspaltung von Virusprotein 4 entstandene CV-, vorzugsweise CVB-A-Partikel, c) CV-, vorzugsweise CVB-Proviruspartikel, bei denen die Virusproteine 2 und 4 noch fusioniert sind,
d) modifizierte Formen der Partikel aus a), b) oder c),
e) durch genetische Modifikation replikationsinkompetente CV-, vorzugsweise CVB-, weiter vorzugsweise CVB3-Partikel .
Das Peptid, das vorzugsweise weniger als 30 Aminosäuren umfaßt, ist dabei vorteilhafterweise ausgewählt aus der Gruppe:
a) Peptide mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr . 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll,
b) Peptide, bei denen gegenüber den Peptiden aus a) eine oder mehrere der Aminosäuren fehlen oder gegen eine andere ausgetauscht sind, und
c) Peptide oder Polypeptide, die die Aminosäuresequenz eines der Peptide aus a) oder b) umfassen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß von dem CV, vorzugsweise CVB, weiter vorzugsweise dem CVB3 abgeleitete Partikel oder Peptide für den Gentransfer eingesetzt werden können, da sie endosomolytisch wirken und/oder die Endocytose verstärken. Das Verfahren der Transfektion wird durch die Verwendung dieser Partikel und/oder Peptide zum einen sehr preiswert, da sich äußerst hohe Ausbeuten bei der Herstellung ergeben, eine sehr einfache Reinigung möglich ist, sowie sehr kleine Peptide/Partikel eingesetzt werden, die eine wesentlich geringere Anzahl immunogener Epitope als Adeno- oder Influenzaviren haben. Die Erfinder konnten zeigen, daß sich bei sehr viel geringeren Peptidmengen als bei Adenoviren optimale biologische Effekte ergeben, die größere biologische Wirksamkeit geht ferner einher mit einer Herabsetzung der Immunogenität .
Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der Partikel und Peptide besteht darin, daß diese in jedem Fall nicht infektiös sind, wobei in vielen Fällen auch auf die UV-Bestrahlung zur Inaktivierung der RNA verzichtet werden kann.
Gegenüber dem von Kern et al. (a.a.O.) beschriebenen Einsatz von inaktivierten CVB3 Partikeln bei der Lipofektion war zunächst unerwartet, daß auch die abgeleiteten Peptide und Partikel zu einer Verstärkung der Transfektion führten. Es zeigte sich sogar, daß die Effizienz größer ist als bei inaktivierten CVB3.
Erfindungsgemäß weist ein Verfahren zur Erzeugung eines derartigen Partikels die Schritte auf:
Isolieren von nativen CV-, vorzugsweise CVB-Partikeln, Erhitzen der isolierten CV-, vorzugsweise CVB-Partikel für 5-20 min, vorzugsweise ca. 10 min, auf über 45°C, vorzugsweise ca. 51 °C.
Versuche im Labor der Erfinder haben gezeigt, daß durch dieses Verfahren auf einfache Weise CV-A-Partikel erzeugt werden, bei denen das Virusprotein 4 abgespalten wurde.
Alternativ können CV-A-Partikel auch mit dem folgenden Verfahren hergestellt werden:
Bereitstellen einer Matrix mit gekoppeltem CV-Rezeptor,
Beschicken der Matrix mit nativen CVB3-Partikeln, und
Eluieren der Matrix.
Hier wird von der Tatsache Gebrauch gemacht, daß das Virusprotein 4 nach der Interaktion des CV mit dem zellulären Rezeptor abgespalten wird, so daß nur noch das verbleibende CV-A- Partikel internalisiert wird, das nicht infektiös ist und nach Erkenntnis der Anmelder endosomolytisch wirkt.
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Transfektion von Zellen, vorzugsweise von kardialen Myozyten mit einem Polyanion, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz, bei dem zur Verstärkung der Transfektion zumindest ein Partikel oder Peptid der oben genannten Art eingesetzt wird, wobei vorzugsweise vor der Transfektion ein Komplex aus dem Polyanion, dem Peptid sowie einem kationischen Lipid, vorzugsweise DOTMA gebildet wird. Während die erwähnten Partikel und Peptide allgemein endosomolytisch wirken, also für eine hohe Effizienz des neuen Verfahrens sorgen, besteht ein besonderer Vorteil bei der Lipofektion von kardialen Myozyten. Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß die Endosomolyse organspezifische Aspekte haben kann, so daß die Verwendung von Partikeln und Peptiden, die von dem CV, vorzugsweise dem CVB3 abgeleitet sind, für den Gentransfer am Herzmuskel die Methode der Wahl ist. Es hat sich gezeigt, daß andere Viren bei weitem nicht so effizient sind, insbesondere haben Adenoviren keine Möglichkeit, dieses Organ so effizient zu besiedeln wie z.B. der kardiotrophe CVB3.
Das transfizierte Polyanion kann dabei eine DNA, eine RNA oder ein entsprechend geladenes Protein mit therapeutischer Wirkung sein.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Formulierung von Komplexen für den Transfer von Polyanionen, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz in Zellen, vorzugsweise kardiale Myozyten, bei dem das Polyanion mit zumindest einem Peptid oder Partikel der oben genannten Art inkubiert wird.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das Peptid vor der Inkubation mit dem Polyanion mit einem kationischen Lipid, vorzugsweise mit DOTMA, vorinkubiert wird.
Dieses Verfahren ist besonders effizient, preiswert und einfach durchzuführen, die einzelnen Agenzien sind lediglich der Reihe nach miteinander zu vermischen und für kurze Zeit zu inkubieren, wobei sich spontan der gewünschte Komplex bildet. Derartige Komplexe sind somit einfach und damit preiswert herzustellende sowie immunologisch unbedenkliche Vehikel für den Transfer von diagnostisch, therapeutisch oder prophylaktisch wirkenden Agenzien in Zellen insbesondere des Herz-Kreislauf- Systems .
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Peptides oder Partikels der vorstehend genannten Art für die Therapie, Diagnostik oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere von Kardiomyopathien .
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung eines Peptides oder Partikels der vorstehend genannten Art als Agens zur Verbesserung der Transfektion von Zellen, vorzugsweise kardialen Myozyten, insbesondere zur Verbesserung der Lipofektion bei der Gentherapie.
Die gefundenen Peptide und Partikel lassen sich nicht nur im wissenschaftlichen Bereich oder bei der Einzelzubereitung einsetzen, sie sind vielmehr auch geeignet für den allgemeinen Einsatz auch in weniger spezialisierten Krankenhäusern oder Arztpraxen.
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch eine therapeutische Zusammensetzung mit einem Peptid oder Partikel der vorstehend genannten Art, sowie einen Kit für die Formulierung von transfizierbaren Komplexen, insbesondere für die Gentherapie, der ein Peptid oder Partikel der vorstehend genannten Art enthält. Derartige therapeutische Zusammensetzungen und Kits können die Partikel und/oder Peptide in Stammlösungen oder bereits in Endkonzentrationen enthalten, wobei im Kit ferner die weiter benötigten Reagenzien, z.B. die Liposomenformulierung vorhanden sein können.
Die Peptide und Partikel lassen sich zum einen enzymatisch durch Verdau von Viruspartikeln erzeugen, zum anderen aber auch auf gentechnische Weise.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine Gensequenz enthält, die auf exprimierbare Weise für ein Peptid oder Partikel der vorstehend genannten Art kodiert.
Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Isolat mit einer DNA- Sequenz, die für das Peptid oder Protein der vorstehend genannten Art kodiert.
Auf diese Weise ist es möglich, die Peptide und Partikel im großtechnischen Maßstab durch mikrobiologische Verfahren oder in vitro-Translation zu erzeugen.
Wenn durch genetische Manipulation replikationsinkompetente Viruspartikel eingesetzt werden, ergibt sich zum einen eine sehr hohe Sicherheit, denn diese Partikel können nur noch in einer Helferzelle repliziert werden, die die zerstörten Funktionen in trans zur Verfügung stellt. Diese Partikel können dann auch ohne weitere Inaktivierung durch UV-Bestrahlung oder thermische Behandlung für die Lipofektion eingesetzt werden. Die Herstellung der replikationsinkompetenten Viruspartikel erfolgt zum Beispiel durch Deletion von kodierenden Genomsequenzen, vorzugsweise der VP2- und VP3-Region, die die Informationen für die replikationsrelevanten Proteine enthalten. Andererseits können diese replikationsrelevanten Genfunktionen auch durch Punktmutationen zerstört werden. Die deletierten Sequenzen werden durch andere Sequenzen, vorzugsweise nicht-kodierende Sequenzen ersetzt, um die optimale Genomgröße für die Verpackung wieder herzustellen. Die deletierten oder mutierten Genomsequenzen werden dann erfindungsgemäß in Helferzellen zur Verfügung gestellt.
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Vektorplasmid mit zumindestens einer DNA-Sequenz, die für ein genetisch modifiziertes CV-, vorzugsweise CVB-, weiter vorzugsweise CVB3-Genom kodiert, bei dem Anteile der kodierenden Sequenz ausgetauscht oder verändert sind, so daß das Virusgenom nicht infektiös ist, und mit einem der DNA- Sequenz vorgeschalteten Promotor. Ferner betrifft die Erfindung ein Helferkonstrukt zum Komplementieren der bei dem Vektorplasmid veränderten oder ausgetauschten Anteile der kodierenden Sequenz des Virusgenoms.
Dieses Helferkonstrukt kann dabei ein Helferplasmid, ein viraler Vektor oder eine Helferzelle sein, die stabil mit für mindestens eine der ausgetauschten oder veränderten Sequenzen kodierender Helfer-DNA transfiziert ist.
Zur Herstellung von durch genetische Manipulation replikationsinkompetenten Viruspartikeln werden Wirtszellen mit dem Vektorplasmid transfiziert, wobei die ausgetauschten oder veränderten Sequenzen in der Wirtszelle durch das Helfer- Konstrukt komplementiert werden.
Auf diese Weise können einfach und reproduzierbar zuverlässig replikationsinkompetente Viruspartikel erzeugt werden, die im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch wirken bzw. die Endocytose verstärken.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele.
Beispiel 1: CVB3-Genom und -cDNA
Coxsackieviren sind Vertreter des Genus Enteroviren in der Familie der Picornaviren. Unter natürlichen Bedingungen erzeugen Coxsackieviren nur im Menschen Krankheiten, die initiale Isolierung von Coxsackieviren gelingt jedoch am besten in neugeborenen Mäusen, die auch zur Differenzierung der Viren in zwei Gruppen dienen:
Die Gruppe A mit 23 Serotypen und die Gruppe B mit 6 Serotypen.
CVB, vor allen Dingen CVB3 , gelten als häufige Erreger von viralen Herzmuskelentzündungen, die sich sowohl in dieser akuten Form wie auch in chronischen Verläufen äußern können. Bei Säuglingen verläuft die Myocarditis oft tödlich. Wie alle Picornaviren haben auch Coxsackieviren ikosaedrische Nukleokapside, die aus vier Virusproteinen VPl, VP2, VP3 und VP4 bestehen. Während die Proteine VPl, VP2 und VP3 die äußere Hülle bilden, ist VP4 an der Innenseite der Partikel lokalisiert und mit dem einzelsträngigen RNA-Genom assoziiert. Das Genom ist per se infektiös; wird es unter geeigneten Bedingungen in einer Zelle aufgenommen, so kann schon die gereinigte RNA eine Infektion induzieren, denn sie besitzt Plusstrangorientierung, die Virusproteine können also ohne Zwischenschritt von der RNA translatiert werden. Das 3 ' -Ende der genomischen RNA ist polyadenyliert , an das 5 ' -Ende ist kovalent ein kleines, viruskodiertes Protein VPg gebunden.
Ein schematisches Beispiel für das CVB3-Genom ist in Fig. 1 dargestellt. Das Genom enthält einen einzigen, offenen Leserahmen, der für ein Vorläuferprotein kodiert. Dieses Poly- protein wird noch während seiner Synthese proteolytisch in die verschiedenen viralen Komponenten gespalten.
Aus dem Polyprotein gehen die bereits erwähnten Kapsidproteine VP1-VP4 in angegebener Weise aus den Bereichen 1A bis ID und das Vpg aus dem Bereich 3B hervor. Die Bereiche 2A und 3C kodieren für Proteasen, die das Polyprotein aufspalten. Die aus den Bereichen 2B und 2C hervorgehenden Proteine stehen mit der Wirtspezifität der Viren in Verbindung.
Der Bereich 3D kodiert für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die in der Wirtszelle die Replikation des RNA-Genomes durchführt . Am 5'- und 3 ' -Ende enthält das Genom noch nicht translatierte Bereiche (NTR) , wobei der NTR-Bereich am 5 ' -Ende eine ausgeprägte Sekundärstruktur aufweist und die Bindung von Ribosomen ermöglicht, also die Translation des Genoms in das Polyprotein erlaubt.
Die vollständige Nukleotidsequenz einer cDNA einer infektiösen CVB3-Variante mit ausgeprägtem Tropismus für das Herz ist beschrieben bei Klump et al. (a.a.O.). Diese infektiöse cDNA von CVB3 steht in dem Konstrukt pCB3/T7 aus Klump et al. oder dem von den Erfindern neu bereitgestellten Konstrukt pcMV-CVB3 zur Verfügung. Vor dem 5 ' -Ende befindet sich ein Promotor (Prom), der die Transkription der cDNA in das RNA-Genom ermöglicht.
Beispiel 2: Reinigung von CVB3-Partikeln
Zellkulturen mit konfluent gewachsenen Kardiomyozyten werden mit 1 - 5 infektiösen Einheiten (PFU) CVB3 infiziert. Nach einigen Stunden ist der zytopathische Effekt erkennbar.
Nach 6 - 12 Stunden werden die Zellkulturüberstände sowie die Zellen geerntet.
Die Viren werden durch übliche Gefrier/Tau-Lyse aus den Zellen freigesetzt. Diese Virussuspension wird zunächst durch Zentri- fugation bei 1.500 Upm von Zelltrümmern gereinigt.
Der virushaltige Überstand wird auf 10 ml eines 5 - 30 % Saccharosegradienten geschichtet und ultrazentrifugiert . Dadurch ergibt sich eine Trennung von nativen Virionen (Sedimentationskoeffizient 160 S), CVB3-A-Partikeln (135 S) und Proviren (125 S) . Proviren sind unvollständig maturierte Viren, die bei jeder Präparation in großer Menge vorliegen und sich durch noch nicht erfolgte Spaltung des VPO-Proteins in VP2 und VP4 auszeichnen.
A-Partikel entstehen aus nativen Virionen durch Abspaltung des Virusproteins 4, einem bei der Infektion natürlicherweise ablaufenden Vorgang. Sie sind dann nicht mehr infektiös, jedoch in einer Zelle noch vermehrbar.
Die erfahrungsgemäß in den ersten fünf Fraktionen zu findenden infektiösen Partikel werden durch Western-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der viralen Partikel untersucht.
Zur Elimination der Saccharose aus den Viruspräparationen werden die relevanten Einzelfraktionen gegen PBS/20 mM MgCl2 für 24 Stunden bei 4°C dialysiert.
Die gereinigten Virusstocks werden bei -20°C gelagert. Verdünnungen dieser Virusstocks werden auf Wirtszellen ausgesät, um den Virustiter in einem üblichen Plaque-Test zu überprüfen.
Zur Inaktivierung der CVB3-Viren wird der Virusstock in eine Petrischale gefüllt und 30 - 60 min mit UV-C bestrahlt. Dabei werden die Nukleinsäuren der Viren geschädigt, nicht aber die biologisch aktiven Proteine. Beispiel 3: Erzeugung von CVB3-A-Partikeln
In den gemäß Beispiel 2 hergestellten Fraktionen finden sich nur geringe Mengen an CVB3-A-Partikeln, so daß diese auf die beiden folgenden Weisen aus infektiösen CVB3-Partikeln hergestellt werden können:
A) native Virionen werden für 10 min bei 51°C erhitzt und gehen dabei quantitativ in CVB3-A-Partikel über.
Auf diese Weise steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem beliebig große Mengen dieser sonst nur in limitierenden Mengen von infizierten Zellen freigesetzten Partikel erzeugt werden können.
B) Die Alternative beruht auf einer Säulenaufreinigung, bei der rekombinante CVB3-Rezeptoren an eine Matrix gekoppelt werden. Die Säule wird dann mit aktiven CVB3-Partikeln geladen, die mit dem Rezeptor interagieren und dabei das Virusprotein 4 verlieren. Durch die Elution der Säule lassen sich die CVB3-A-Partikel gewinnen.
Beispiel 4: Endosomolytische Aktivität
Es konnte gezeigt werden, daß die CVB3-verstärkte Lipofektion unabhängig vom Rezeptor ist, so daß bei der Lipofektion keine A-Partikel erzeugt werden. A-Partikel sind jedoch die bei einer Rezeptor-abhängigen Infektion natürlicherweise entstehenden Partikel und haben eine höhere endosomolytische Aktivität als native Virionen. Daher sind die Ergebnisse, die mit der durch
A-Partikel verstärkten Lipofektion erzielt werden, besser als die von Kern et al. beschriebene Lipofektion mit nativen Virionen.
Die eindeutige endosomolytische Aktivität von CVB3 konnte dadurch nachgewiesen werden, daß die CVB3-vermittelte Verstärkung der Lipofektion durch Bafilomycin, einem spezifischen Inhibitor der endosomalen Protonen-Pumpe (Bowman et al., PNAS, Band 85, Seiten 7972-7962, 1988; Drose et al., Biochemistry, Band 32, Seiten 3902-3906, 19993) wieder aufgehoben wird. Die Infektion von Zellen mit CVB3 läßt sich durch Bafilomycin jedoch nicht hemmen .
Peptide aus der Kapsidregion von CVB3, die endosomolytisch aktiv sind, sind in der folgenden Tabelle abgedruckt:
Tabelle 1: CVB3-Peptide mit endosomolytischer Aktivität. Hydrophile saure bzw. basische Aminosäuren sind fett gedruckt.
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Bei den Peptiden kann das Problem bestehen, daß sie sich aufgrund ihrer amphipathischen Eigenschaften nur schwer mit Lipo- somen kombinieren lassen, denn diese werden dadurch zerstört. Dieses Problem kann dadurch gelöst werden, daß einige saure Aminosäuren zusätzlich N-terminal oder C-terminal synthetisiert werden, und das synthetische Peptid dann über eine positiv geladene Poly-Lysin-Brücke an die zu transferierende DNA gebunden wird. Dies hat den weiteren Vorteil, daß Transferrin-gekoppel- tes Poly-Lysin verwendet werden kann, so daß eine effiziente Bindung an den Transferrin-Rezeptor möglich ist (Wagner, a.a.O. ) .
Beispiel 5: Replikationsinkompetente, genetisch modifizierte Viruspartikel
Ausgangspunkt für die Herstellung von genetisch modifizierten, replikationsinkompetenten Viruspartikeln ist ein Vektorplasmid, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Dieses Vektorplasmid enthält hinter einem Promotor eine DNA-Sequenz, die für das RNA-Genom aus Fig. 1 kodiert, wobei jedoch bestimmte Anteile des RNA- Genoms ausgetauscht oder z.B. durch Punktmutation derart verändert wurden, daß das RNA-Genom selbst nicht mehr infektiös ist.
In Fig. 2 ist das RNA-Genom aus Fig. 1 schematisch in einen ersten Anteil I sowie einen zweiten Anteil II aufgeteilt. Die Anteile I und II müssen nicht zwingend schematisch hintereinander angeordnet sein, sie können auch in beliebiger Reihenfolge mehrfach vorhanden sein.
Der Anteil I representiert den ausgetauschten oder modifizierten Sequenzanteil, während der Anteil II das Rest- Genom aus Fig. 1 repräsentiert. Die Vektorplasmide aus Fig. 2 werden dann mit Helfer- Konstrukten in Wirtszellen ko-transfiziert, um replikationsinkompetente Viruspartikel zu erzeugen. Damit diese Ko-Transfizierung zum Erfolg führt, müssen die Helfer- Konstrukte den ausgetauschten oder modifizierten Anteil I komplementieren.
Dies kann zum einen dadurch erfolgen, daß der Anteil I mittels spezifischer PCR-Pri er aus dem in Beispiel 1 erwähnten Plasmid pCMV-CVB3 amplifiziert wird. Diese Amplifikate können mit einem viralen Vektor in Wirtszellen eingebracht werden, wobei andererseits eine Helferzelle auch stabil mit diesen Amplifikaten transfiziert werden kann. Auf diese Weise dienen die Helferzellen bei der Transfizierung mit Vektorplasmid als Wirtszellen und stellen in trans die fehlenden oder veränderten Anteile des Virusgenoms zur Verfügung.
Bevorzugt ist es jedoch, wenn die Helfer-Konstrukte ebenfalls Plasmide sind, die stabil oder transient in Wirtszellen transfiziert werden, um dann in RNA transkribiert zu werden, die wiederum translatierbar ist, um die Struktur- und Nichtstruktur-Proteine zu erzeugen, für die das Vektorplasmid selbst nicht kodiert.
Zu diesem Zweck ist es erforderlich, in z.B. das pCR-Script™- Plasmid einen Promotor, z.B. den CMV-Promotor , und eine IRES (internal ribosomal entry site) zu klonieren. Dahinter werden dann die Amplifikate mit den Anteilen I von CVB3 kloniert. Durch die IRES wird die Translationseffizienz der Helferanteile erhöht, es kann z.B. die IRES von EMVC (Enzyphalomyocarditis- Virus), die EMCV-IRES von CLONETECH verwendet werden.
Auf diese Weise werden Helfer-Plasmide erzeugt, die in Bakterien verstärkbar und in RNA transcribierbar sind, die wiederum translatiert werden kann, um die Translationsprodukte der Vektor-Plasmide derart zu komplementieren, daß replikationsinkompetente Viruspartikel gebildet werden.
Dazu werden die Helferzellen, die transient oder stabil mit dem Helfer-Plasmid transfiziert sind, mit entsprechendem Vektorplasmid transfiziert, das dann durch die Wirtszelle in trans komplementiert wird.
Auf diese Weise entstehen replikationsinkompetente Viruspartikel, die nach entsprechender Aufreinigung verwendet werden können.
Ein Weg, der eine größere Variabilität ermöglicht, besteht darin, Wirtszellen mit dem Vektor-Plasmid aus Fig. 2 und dem entsprechenden, komplementierenden Helfer-Plasmid aus Fig. 3 zu ko-transformieren, wodurch die replikationsinkompetenten Viruspartikel entstehen.
Beispiel 6: CVB3-verstärkte Lipofektion
Als Zielzellen wurden Chinese-Hamster-Ovarian-Zellen (CHO), Rattenmyoblasten-Zellen (H9C2), humane Zervix-Karzinom-Zellen (HeLa), primäre humane Fibroblasten sowie primäre adulte Herzmuskelzellen des Schweins eingesetzt. Am ersten Tag wurden 5 x 104 Zellen auf 24-Loch-Platten ausgesät. An zweiten Tag wurden die folgenden Lösungen angesetzt:
Lösung A: 150 μl Serum-freies Medium
5 μl Lipofektin (GIBCO/BRL)
1 Partikel pro Zelle CVB3 bzw. 100 ng-10 μg-
Peptidlösung
Lösung A wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Lösung B: 1 , 5 μg Plasmid-DNA (z.B. pCMVLacZ) ad 150 μl Serum-freies Medium
Die Lösungen A und B werden gemischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Vor Zugabe der fertigen Lipofektionslösung werden die Zellen einmal mit Serum-freiem Medium gewaschen.
Das Medium wird vollständig entfernt und die 300 μl Lipofektionslösung auf die 24-Loch-Platte gegeben. Danach werden die Zellen für 5 Stunden bei 5 % C02 und 37 °C inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Lipofektionslösung entnommen und durch Zellkulturmedium ersetzt.
Die Auswertung der Transfektion erfolgt am nächsten Tag durch einen In-situ-Lac-Z-Assay:
Das transfizierte Plasmid pCMVLacZ kodiert für die ß-Galactosidase, die aus der zunächst farblosen Lösung ein blaues, unlösliches Reaktionsprodukt in den Zellen erzeugt. Die Zellen wer- den dabei zunächst fixiert und dann mit der Färbelösung inkubiert. Die Transfektionseffizienz ergibt sich aus der Anzahl der gefärbten Zellen/Gesamtzellzahl und wird im Mikroskop bestimmt.
Erste Ergebnisse aus dem Labor der Erfinder zeigen, daß durch die Partikel gemäß Beispiel 2, 3 und 5 sowie die Peptide gemäß Beispiel 4 eine Transfektion vermittelt werden kann, deren Effizienz oberhalb der Effizienz von Adenovirus-vermittelter Lipofektion liegt.

Claims

Patentansprüche
1. Vom Coxsackievirus, vorzugsweise vom CVB, weiter vorzugsweise vom CVB3 abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen endosomolytisch zu wirken.
2. Vom Coxsackievirus, vorzugsweise vom CVB, weiter vorzugsweise vom CVB3 abgeleitete, nicht infektiöse Partikel oder Peptide, die dazu geeignet sind, im Rahmen einer Transfektion von Zellen die Endocytose zu verstärken.
3. Partikel nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe : a) leere CV-, vorzugsweise CVB-Kapsidpartikel, b) durch Abspaltung von Virusprotein 4 (VP4) entstandene CV-, vorzugsweise CVB-A-Partikel, c) CV-, vorzugsweise CVB-Proviruspartikel, bei denen die Virusproteine 2 (VP2)und 4 (VP4) noch fusioniert sind, d) modifizierte Formen der Partikel aus a), b) oder c), und e) durch genetische Modifikation replikationsinkompetente CV-, vorzugsweise CVB-, weiter vorzugsweise CVB3-Partikel.
4. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das vorzugsweise weniger als 30 Animosäuren umfaßt und ausgewählt ist aus der Gruppe : a) Peptide mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10 aus dem Sequenzprotokoll, b) Peptide, bei denen gegenüber den Peptiden aus a) eine oder mehrere der Aminosäuren fehlen oder gegen eine andere ausgetauscht sind, und c) Peptide oder Polypeptide, die die Aminosäuresequenz eines der Peptide aus a) oder b) umfassen.
5. Verfahren zur Erzeugung eines Partikels nach Anspruch 3, mit den Schritten:
Isolieren von nativen Coxsackievirus-Partikeln, Erhitzen der isolierten Coxsackievirus-Partikel für 5 - 20 min, vorzugsweise ca. 10 min auf über 45°C, vorzugsweise ca. 51°C.
6. Verfahren zur Erzeugung eines Partikels nach Anspruch 3, mit den Schritten:
Bereitstellen einer Matrix von gekoppeltem Cox- sackievirus-Rezeptor,
Beschicken der Matrix mit nativen Coxsackievirus- Partikeln, und Eluieren der Matrix.
7. Verfahren zur Transfektion von Zellen, vorzugsweise von kardialen Myozyten mit einem Polyanion, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz, bei dem zur Verstärkung der Transfektion zumindest ein Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Transfektion ein Komplex aus dem Polyanion, dem Peptid sowie einem kationischen Lipid, vorzugsweise DOTMA gebildet wird.
9. Verfahren zur Formulierung von Komplexen für den Transfer eines Polyanions, vorzugsweise einer therapeutischen Gensequenz in Zellen, vorzugsweise kardiale Myozyten, bei dem das Polyanion mit zumindest einem Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 inkubiert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid vor der Inkubation mit dem Polyanion mit einem kationischen Lipid, vorzugsweise mit DOTMA, vorinkubiert wird.
11. Verwendung eines Partikels oder Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 4, für die Therapie, Diagnostik oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere von Kardiomyopathien.
12. Verwendung eines Partikels oder Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Agens zur Verbesserung der Transfektion von Zellen, vorzugsweise kardialen Myozyten, insbesondere zur Verbesserung der Lipofektion bei der Gentherapie.
13. Replizierbarer Expressionsvektor, der eine Gensequenz enthält, die auf exprimierbare Weise für ein Peptid oder Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
14. DNA-Isolat mit einer DNA-Sequenz, die für ein Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
15. Kit für die Formulierung von transfizierbaren Komplexen, insbesondere für die Gentherapie, der zumindest ein Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
16. Therapeutische Zusammensetzung mit zumindest einem Partikel oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
17. Vektor-Plasmid mit zumindest einer DNA-Sequenz , die für ein genetisch modifiziertes CV-, vorzugsweise CVB-, weiter vorzugsweise CVB3-Genom kodiert, bei dem Anteile der kodierenden Sequenz ausgetauscht oder verändert sind, so daß das Virusgenom nicht infektiös ist, und mit einem der DNA-Sequenz vorgeschalteten Promotor.
18. Helfer-Konstrukt zum Komplementieren der bei dem Vektor- Plasmid aus Anspruch 17 veränderten oder ausgetauschten Anteile der kodierenden Sequenz des Virusgenoms .
19. Helfer-Konstrukt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Helfer-Plasmid ist, das für zumindest einen der ausgetauschten oder veränderten Anteile in translatierbarer Weise kodiert.
20. Helfer-Konstrukt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es ein viraler Vektor ist, der für zumindest einen der ausgetauschten oder veränderten Anteile in translatierbarer Weise kodiert.
21. Helfer-Konstrukt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Helferzelle ist, die stabil mit für mindestens einen der ausgetauschten oder veränderten Anteile kodierender Helfer-DNA transfiziert ist.
22. Verfahren zur Erzeugung des durch genetische Modifikation replikationsinkompetenten Partikels aus Anspruch 3 e) , mit den Schritten:
Transfizieren von Wirtszellen mit dem Vektor-Plasmid nach Anspruch 17 , und
Komplementieren der ausgetauschten oder veränderten Anteile in der Wirtszelle durch das Helfer-Konstrukt nach einem der Ansprüche 18 bis 20.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle die Helferzelle nach Anspruch 21 ist.
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