DE69534902T2

DE69534902T2 - Rekombinanter viraler DNS Vektor zur Transfektion tierischer Zellen

Info

Publication number: DE69534902T2
Application number: DE69534902T
Authority: DE
Inventors: Izumu Shibuya-ku Saito; Yumi Shinagawa-ku Kanegae
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2015-09-15
Also published as: EP0704534A2; CN1132791A; KR100379654B1; US5817492A; CA2157063C; AU698250B2; ATE321874T1; NZ272883A; JP4216350B2; CA2157063A1; AU3024895A; EP0704534A3; JPH0884589A; KR960010864A; EP0704534B1; DE69534902D1; CN1077919C

Description

Hintergrund der Erfindung
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten adenoviralen Vektor zum Transfizieren einer tierischen Zelle. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten adenoviralen Vektor, der ein Rekombinasegen oder eine DNA-Sequenz umfasst, die für eine Rekombinase-Erkennungssequenz kodiert, ein Verfahren zum Transduzieren eines Fremdgens in eine tierische Zelle unter Verwendung dieses Vektors und deren Verwendung in der Gentherapie.
Ausführungen zum Stand der Technik
Als viraler Vektor für die Gentransduktion ist häufig ein Retrovirus verwendet worden. Ein Retrovirus wird jedoch nur in mitotische Zellen transfiziert und integriert sich in das Chromosom der Wirtszellen, und ein Retrovirus als viraler Vektor bringt daher ein Problem unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit, insbesondere der Gentherapie mit sich. Es wird daher davon ausgegangen, dass ein Retrovirus nur begrenzt als viraler Vektor verwendet werden sollte.
Ein adenoviraler Vektor ist vorteilhaft, da er eine Transduktionseffizienz von fast 100% in einer Vielzahl tierischer kultivierter Zellen zeigt, anders als ein Retrovirus, keinen positiven Integrationsmechanismus in das Chromosom aufweist und ein Gen selbst in eine ruhende Zelle transduzieren kann. Im Hinblick auf solche Vorteile wird ein adenoviraler Vektor als über einen extrem breiten Bereich von Gebieten anwendbar gesehen, um zu versuchen, ein fremdes Gen zu transduzieren. Es könnte daher in naher Zukunft etabliert werden, dass ein adenoviraler Vektor als eine Haupttechnik für die Gentherapie verwendet wird.
Ein adenoviraler Vektor ist als Technik für die Gentherapie oder zum Forschen der Expression in stark differenzierten Zellen, wie einer Zelle aus dem Nervensystem, umfassend verwendet worden. Als Technik für die Gentherapie ist die in vivo-Gentherapie intensiv untersucht worden, wobei ein Gen, das in einer lebenden Zelle defekt ist, in die Zelle durch direkte Injektion des Gens in Gewebe, in dem die Zelle vorhanden ist, transduziert wird. In den Vereinigten Staaten haben fünf Forschungsteams bereits die Erlaubnis bekommen, eine klinische Untersuchung zur Behandlung von Patienten mit zystischer Fibrose mit in vivo-Gentherapie durchzuführen. Des weiteren hat sich die Forschung bei der Gentherapie ebenfalls auf Muskeldystrophie, familiäre Hypercholesterinämie und Hirntumor ausgedehnt. Andererseits ermöglicht ein adenoviraler Vektor die Transduktion eines Gens selbst in eine ruhende Zelle. Deswegen ist ein adenoviraler Vektor für die Transduktion eines Gens in differenzierte Zellen, insbesondere in eine Zelle des Nervensystems, verwendet worden, wenn Experimente zur Gentransduktion in eine Primärkulturzelle oder einen tierischen Körper durchgeführt wurden.
Im Hinblick auf das oben Gesagte ist es stark zu vermuten, dass ein adenoviraler Vektor insbesondere in der Gentherapie in die Praxis umgesetzt wird, da der Vektor die Expression eines Gens durch direkte Injektion oder Verabreichung in den Tierkörper ermöglicht, wie auch die Transduktion eines Gens in verschiedene differenzierte und nicht differenzierte Zellen, einschließlich einer Zelle des Nervensystems.
Anders als beim Retrovirus, fehlt einem adenoviralen Vektor jedoch ein positiver Mechanismus für die Integration in das Chromosom, was dazu führt, dass die Expression eines Gens in dem Vektor nur temporär auftritt. Das heißt, dass die Expression nur über einige wenige Wochen anhält, und maximal für ungefähr 2 Monate. Das bedeutet, wenn die therapeutische Wirkung aufrechtzuerhalten ist, die Injektion oder Verabreichung des Vektors wiederholt werden sollte, um die Expression fortzusetzen. Die wiederholten Injektionen oder Verabreichungen können jedoch die Erzeugung eines Antikörpers hervorrufen, welcher die therapeutische Wirkung reduziert.
Wang und Taylor offenbaren, dass ein Gen, das α1-Antitrypsin, CFTR oder Ornithintranscarboxylase kodiert, in einen adenoviralen Vektor eingeschleust wurde. Jedoch wird von allen diesen Genen erwartet, dass sie direkt therapeutische Wirkungen ausüben (Molecular and Cellular Biology, Band 13, Nr. 2, Februar 1993, Seiten 918 bis 927).
Sauer und Henderson offenbaren ein Expressionsplasmid zum Exprimieren einer Rekombinase, jedoch lehren sie nichts über die Verwendung eines adenoviralen Vektors (New Biologist, Mai 1990, Band 2, Nr. 5, Seiten 441 bis 449). Gleiches betrifft auch den Artikel von Sauer und Kollegen in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, Seiten 9108–91112, Dezember 1987.
Gleichermaßen offenbart EP 0 542 466 einen baculoviralen Vektor mit zwei lox P-Stellen. Jedoch wird ein adenoviraler Vektor, der in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, nicht offenbart.
Gage et al. beschreiben, dass das Cre/lox-Reaktionssystem verwendet werden kann, um ein zirkuläres DNA-Molekül in ein anderes DNA-Molekül zu inserieren. Jedoch lehrt dieses Dokument nichts über ein Verfahren in dem Cre/loxP-Reaktionssystem zum Herstellen eines zirkulären DNA-Moleküls verwendet wird, das in der Lage ist, sich autonom zu replizieren (Journal of Virology, Band 66, Nr. 9, Seiten 5509 bis 5515).
EP-A-0 300 422 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten viralen Vektors unter Verwendung von zwei loxP-Stellen, in denen die erste loxP-Stelle in einem viralen Vektorgenom vorhanden ist, und die zweite loxP-Stelle in einem separaten zirkulären DNA-Molekül vorhanden ist. Dieses Dokument beschreibt jedoch keinen Vektor mit beiden loxP-Stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Deswegen ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes adenovirales Vektorsystem bereitzustellen, in dem ein fremdes Gen in eine Tierzelle mit Hilfe eines adenoviralen Vektors transduziert ist, und dann in eine Form umgewandelt wird, die in der Lage ist, sich innerhalb der Zelle autonom zu replizieren. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein solches System für die Gentherapie bereitzustellen.
Um die oben erwähnten Ziele zu erreichen, haben die vorständigen Erfinder intensive Untersuchungen angestellt und es geschafft, ein rekombinantes adenovirales Vektorsystem zu erhalten:
wobei eine Expressionseinheit, die ein fremdes Gen trägt, in Zellen mit Hilfe eines adenoviralen Vektors transduziert wird, und dann in ein zirkuläres DNA-Molekül unter Verwendung eines Rekombinasegens und einer Rekombinase-Erkennungssequenz umgewandelt wird, und
wobei ferner ein Replikationsursprung in das so gebildete zirkuläre DNA-Molekül eingeschleust worden ist, wodurch die Genexpressionseinheit, die das Fremdgen trägt, in der Lage ist, sich autonom zu replizieren, um das Fremdgen in den Zellen weiter zu exprimieren.
Hier betrifft der Begriff "Rekombinase" ein spezifisches DNA-Rekombinationsenzym, welches in der Lage ist, eine spezifische DNA-Sequenz zu erkennen, die aus mehreren zehn Basenpaaren zusammengesetzt ist, um die Sequenz zu spalten und die DNA-Fragmente, die durch solche Spaltungen gebildet wurden zu ändern, um diese Fragmente zu religieren, um eine neue DNA-Sequenz zu produzieren. Demgemäß werden ein rekombinanter adenoviraler Vektor, der die Rekombinase exprimiert und ein rekombinanter adenoviraler Vektor mit zwei Kopien der Rekombinase-Erkennungssequenz in gleicher Orientierung hergestellt, und beide der Vektoren werden in eine Zelle co-transfiziert, wobei die Rekombinase in dem Vektor exprimiert wird, um die zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen zu spalten, die in dem anderen Vektor vorhanden sind, gefolgt von der Rekonstruktion, um ein zirkuläres DNA-Molekül herzustellen, das aus einem DNA-Fragment gebildet wird, das zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen vorhanden gewesen ist, und das aus dem Vektor mit der Rekombinase ausgeschnitten worden ist. Daher repliziert sich das DNA-Fragment autonom, nachdem es in ein zirkuläres DNA-Molekül umgewandelt worden ist und permanent in der Zelle bewahrt wird, um das Fremdgen weiter zu exprimieren, wenn ein solches DNA-Fragment eine Expressionseinheit mit einem Fremdgen hat und einen darin eingeschleusten Replikationsursprung aufweist. Das heißt, dass, wenn ein solches rekombinantes adenovirales Vektorsystem in der Gentherapie verwendet wird, eine therapeutische Wirkung über einen langen Zeitraum ermöglicht wird, indem eine einzelne Injektion oder Verabreichung solcher Vektoren durchgeführt wird.
Auf Grundlage dieser neuen Befunde wurden weitere Untersuchungen gemacht, um die vorliegende Erfindung zu erfüllen.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (1) zur Transfizierung einer menschlichen oder tierischem Zelle bereitzustellen, welcher einen Promotor, ein Rekombinasegen und eine Poly(A)-Sequenz umfasst.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (2) gemäß dem oben erwähnten Vektor (1) bereitzustellen, wobei dieser virale DNA-Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Weiter ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (3) gemäß dem oben erwähnten Vektor (2) bereitzustellen, wobei dieses Rekombinasegen ein Rekombinase-Cre-Gen ist, das aus dem E. coli P1-Pagen stammt.
Weiter ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (4) zum Transfizieren einer tierischen Zelle bereitzustellen, welcher zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, einen Replikationsursprung, welcher an einer tierischen Zelle funktionsfähig ist, einen Promotor, ein Fremdgen und eine Poly(A)-Sequenz, wobei alle aus diesem Replikationsursprung, Promotor, Fremdgen und der Poly(A)-Sequenz zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.
Des weiteren ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (5) gemäß dem oben erwähnten Vektor (4) bereitzustellen, wobei dieser virale DNA-Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (6) gemäß dem oben erwähnten Vektor (5) bereitzustellen, wobei dieser Replikationsursprung, Promotor, Fremdgen und die Poly(A)-Sequenz in dieser Reihenfolge von der stromaufwärts gelegenen der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (7) gemäß dem obigen Vektor (5) bereitzustellen, wobei dieses Fremdgen, Poly(A)-Sequenz, Replikationsursprung und Promotor in dieser Reihenfolge von der stromaufwärts der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen liegenden, lokalisiert sind.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (8) gemäß irgendeinem der oben erwähnten Vektoren (4) bis (7) bereitzustellen, wobei dieses Rekombinase-Erkennungssequenz eine DNA-Sequenz ist, die loxP kodiert, welcher ein Substrat für die Rekombinase Cre ist.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (9) gemäß irgendeinem der obigen Vektoren (4) bis (8) bereitzustellen, wobei dieser Replikationsursprung von einem Virus oder einer tierischen Zelle stammt.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (10) gemäß dem obigen Vektor (9) bereitzustellen, wobei dieser Replikationsursprung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Replikationsursprüngen, die von Papovavirus, und Herpesvirus stammen.
Des weiteren ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten adenoviralen Vektor (11) gemäß einem der oben erwähnten Vektoren (1) bis (10) bereitzustellen, wobei dieser Promotor und die Poly(A)-Sequenz in einem Hybridpromotor (CAG-Promotor) involviert sind, welcher einen Zytomegalievirusenhancer, einen Hühner-β-Actin-Promotor und einen Kaninchen-β-Globin-Splicing-Akzeptor und eine Poly(A)-Sequenz umfasst.
Des weiteren ist es noch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren (12) zum Transduzieren eines Fremdgens in eine menschliche oder tierische Zelle bereitzustellen, welches die Schritte umfasst:
Co-transfizieren einer menschlichen oder tierischen Zelle sowohl mit dem rekombinanten adenoviralen Vektor, umfassend einen Promotor, ein Rekombinasegen und eine Poly(A)-Sequenz, und einem rekombinanten adenoviralen Vektor, umfassend zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen, einen Replikationsursprung, welcher in der Tierzelle funktionsfähig ist, einen Promotor, ein Fremdgen und eine Poly(A)-Sequenz, wobei alle dieser Replikationursprung, Promotor, Fremdgen und Poly(A)-Sequenz zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind;
Ausschneiden eines DNA-Fragments, das diesen Replikationsursprungs-Promotor, Fremdgen und Poly(A)-Sequenz enthält, um ein zirkuläres DNA Molekül bereitzustellen; und um
dieses zirkuläre DNA-Molekül autonom innerhalb der co-transfizierten menschlichen oder tierischen Zelle zu replizieren.
Des weiteren ist es noch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren (13) zum Transduzieren eines Fremdgens in eine menschliche oder tierische Zelle gemäß dem obigen Verfahren (12) bereitzustellen, wobei jede dieser zwei viralen DNA-Vektoren ein adenoviraler Vektor ist.
Des weiteren ist es noch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Transduzieren eines menschlichen Gens in eine Zelle bereitzustellen, welches umfasst, dass das oben erwähnte Verfahren (12) oder (13) in einer Gentherapie verwendet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse, die durch Transfizieren von COS-1-Zellen oder CV-1-Zellen mit Kombinationen aus verschiedenen rekombinanten adenoviralen Vektoren gewonnen wurden, das Gewinnen der DNAs aus den transfizierten Zellen, das Verdauen der gewonnenen DNA mit Hind III, das Fraktionieren der DNA-Fragmente durch das Unterwerfen der behandelten DNAs gegenüber Elektrophorese und das Analysieren durch Southern Blotting. In der Figur bezeichnen die Symbole das folgende:

Spur M: : Molekulargewichtsmarker;
Spur 1: : CV-1-Zellen, denen nur Medium hinzugegeben wurde;
Spur 2: : CV-1-Zellen, die mit der Kombination eines adenoviralen Vektors transfiziert wurden, denen E3-, E1A- und E1B-Regionen deletiert wurden, und die kein Fremdgen aufweisen, und einem rekombinanten adenoviralen Vektor, der in Beispiel 1 konstruiert wurde, wobei das Rekombinase-Cre-Gen und der CAG-Promotor hierin inseriert worden sind;
Spur 3: : CV-1-Zellen, die mit der Kombination aus einem adenoviralen Vektor AdexlLCAHBsSL transfiziert sind, welcher in Beispiel 2 hergestellt wird, mit einem adenoviralen Vektor, dem E3-, E1A- und E1B-Regionen deletiert wurden, und der kein Fremdgen hat;
Spur 4: : CV-1-Zellen, die mit der Kombination aus dem Vektor AdexlLCAHBsSL transfiziert wurde, und mit dem rekombinanten adenoviralen Vektor, der in Beispiel 1 konstruiert worden ist, wobei das Rekombinase-Cre-Gen und der CAG-Promotor hierin inseriert worden sind;
Spur 5: : COS-1-Zellen, die in gleicher Weise wie in Spur 1 transfiziert worden sind;
Spur 6: : COS-1-Zellen, die in gleicher Weise wie in Spur 2 transfiziert worden sind;
Spur 7: : COS-1-Zellen, die in gleicher Weise wie in Spur 3 transfiziert worden sind;
Spur 8: : COS-1-Zellen, die in gleicher Weise wie in Spur 4 transfiziert worden sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unten in genaueren Details beschrieben.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete virale DNA-Vektor ist ein Vektor, der von einem Adenovirus abstammt, welcher nur extrachromosomal nach der Infektion existieren kann.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf den adenoviralen Vektor, welcher ein Rekombinasegen oder eine Rekombinase-Erkennungssequenz trägt, zum Transfizieren einer tierischen Zelle beschrieben.
Das erfindungsgemäß verwendete Adenovirus ist ein Adenovirus, welches ein Tier als einen natürlichen Wirt benutzt, und ein besonders bevorzugtes Adenovirus ist ein humanes Adenovirus, das einen Menschen als Wirt benutzt. Das Genom des Menschen-Adenovirus ist eine doppelsträngige lineare DNA von ungefähr 36 kbp, und hat insofern eine einzigartige Struktur, als der DNA-Strang eine ungefähr 100 bp umgekehrte Wiederholungssequenz an den beiden Enden hat, und dadurch, dass der DNA-Strang weiter zwei 55 k Proteine aufweist, welche durch das E2B-Genprodukt prozessiert werden und kovalent an das 5'-Ende jedes der beiden Enden des DNA-Strangs gebunden sind.
Das Genom des erfindungsgemäß verwendeten Adenovirus ist hinsichtlich der E1-Region deletiert, insbesondere der E1A-Region. Dies liegt daran, dass dadurch, dass es in der E1A-Region deletiert worden ist, welche mit einer neoplastischen Transformierungsaktivität eines Adenovirus assoziiert ist, das Adenovirus nicht virulent gemacht wird, und nur das Fremdgen im Genom selektiv exprimiert wird. Die gesamte E1A-Region wird nicht notwendigerweise deletiert, aber die Deletion einer Teil-E1A-Region allein, insbesondere des 1,3 bis 9,3% Segments der E1A-Region allein kann den gewünschten Zweck, wie oben erwähnt, erreichen.
Des weiteren kann das Genom des Adenovirus, das erfindungsgemäß verwendet wird, ebenfalls hinsichtlich der E3-Region deletiert sein. Insbesondere ist die Deletion des 79,6 bis 84,8% Segments in der E3-Region bevorzugt, da das Segment nicht für die Replikation des Adenovirus essenziell ist.
Deswegen ist das Adenovirus, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird dadurch gekennzeichnet, dass das Adenovirus sich nicht in gewöhnlichen Wirtszellen vermehren kann, außer in einer menschlichen fötalen Nierenzelllinie (293 Zelllinie), wobei die E1A- und E1B-Gene persistent exprimiert werden.
Die rekombinanten adenoviralen Vektorpartikel, die erfindungsgemäß verwendet werden, können in der 293er Zelllinie bis auf ein Titerniveau von bis zu 10⁸ bis 10⁹ pfu (plaque forming unit)/ml proliferieren, was gleich denen der Wildtypstämme ist. Wenn sie in andere Zellen oder tierische Gewebe transfiziert werden, invadieren die Viruspartikel die Zellen mit hoher Effizienz und das Virusgenom wird in den Nukleus transferiert. Jedoch fehlt dem Adenovirusvektor das E1A-Gen und die nativen adenoviralen Promotoren in dem Vektor, welche durch das EIA-Genprodukt aktiviert werden, können nicht arbeitsfähig werden. Andererseits kann das Fremdgen, das in das adenovirale Genom integriert ist, nicht durch den Fremdpromotor transkribiert werden, welcher ebenfalls in das adenovirale Genom integriert worden ist. Demgemäß können die erfindungsgemäß verwendeten adenoviralen Partikel Nebenwirkungen, die durch native adenovirale Genome verursacht werden, minimieren, und das Fremdgen in dem rekombinanten adenoviralen Vektor kann wirksam in verschiedenen Arten tierischer Zellen exprimiert werden.
Obwohl menschliche Adenovirus-Wildtypstämme nur in menschlichen Zellen nach der Infektion propagiert werden können, kann das Fremdgen in dem rekombinanten Adenovirus der vorliegenden Erfindung in einem viel breiteren Bereich an Zellen und Geweben exprimiert werden. Dies liegt daran, dass das rekombinante Adenovirus der vorliegenden Erfindung wirksam als Expressionsvektor selbst in einer Zelle arbeiten kann, in der ein gewöhnliches Adenovirus nicht proliferieren kann, sofern die rekombinanten adenoviralen Partikel die Zelle infizieren und invadieren können.
Das Genom in dem rekombinanten Adenovirus der vorliegenden Erfindung kann nicht extrachromosomal repliziert werden, und wird nur für zwei Wochen bis zwei Monate in dem Nukleus bewahrt. Dadurch sind wiederholte Verabreichungen des rekombinanten Adenovirus zum Exprimieren des Fremdgens über einen langen Zeitraum notwendig. Jedoch würde in diesem Fall ein Problem verursacht, dass die Erzeugung eines Antikörpers induziert werden kann.
Erfindungsgemäß wird ein neues rekombinantes Adenovirus mit einem Rekombinasegen konstruiert, und andererseits wird ein weiteres neues rekombinantes Adenovirus konstruiert, welches zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen enthält, welche Substrate für die Rekombinase sind, und welche weiter ein fremdes Zielgen und einen Replikationsursprung enthalten, von denen beide zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.
Die zwei rekombinanten Adenoviren werden in eine Tierzelle co-transfiziert, wobei die Rekombinase exprimiert werden wird. Dann wirkt die Rekombinase auf die zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen ein, um diese zu spalten, um ein zirkuläres DNA-Molekül zu bilden. Auf diese Weise können das gebildete zirkuläre DNA-Molekül, welches den Replikationsursprung enthält, sowie ein fremdes Gen sich autonom innerhalb der co-transfizierten Zellen replizieren, um die Expression des Fremdgens fortzusetzen.
Als Promotoren, die erfindungsgemäß verwendet werden, gibt es einen Tiervirus-Gen-Promotor und einen Tierzell-Gen-Promotor. Beispiele des Tiervirusgen-Promotors schließen den SV40-Genpromotor und den Adenovirus-major late-Gen-Promotor ein. Beispiele der tierischen Zellgen-Promotoren sind der Thymidinkinase-Gen-Promotor, der Metallothionin-Gen-Promotor und der Immunglobulin-Gen-Promotor. Ein besonders vorteilhafter Promotor in der vorliegenden Erfindung ist der CAG-Promotor. Der CAG-Promotor ist ein Hybridpromotor, der einen Zytomegalievirusenhancer umfasst, einen Hühner-β-Actin-Promotor und einen Kaninchen-β-Globin-Splicing acceptor sowie eine Poly(A)-Sequenz. Der CAG-Promotor wurde als starker Expressionsvektor in der japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer 3 (1991)-168087 beschrieben. Der CAG-Promotor kann durch Ausschneiden aus dem Plamid pCAGGS, welches in der offengelegten Beschreibung oben auf Seite 13, Zeile 20 bis Seite 20, Zeile 14 und Seite 22, Zeile 1 bis Seite 25, Zeile 6 beschrieben ist, mit den Restriktionsenzymen SalI und Hind III hergestellt werden. Der so hergestellte CAG-Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendete Rekombinase ist ein spezifisches DNA-Rekombinations-Enzym, und in der Lage, eine spezifische DNA-Sequenz zu erkennen, um die Sequenz auszuschneiden, und die erhaltenen DNA-Fragmente dadurch auszutauschen, um die Fragmente zu religieren. Als ein solches Enzym gibt es eine Rekombinase Cre, die durch den Bacteriophagen P1 von E. coli kodiert wird. Das Substrat für dieses Enzym ist die DNA-Sequenz loxP im Bakteriophagen P1 [Abremski et al., J. Biol. Chem., 1984, 1509–1514 und Hoess et al., P.N.A.S., 1984, 81, 1026–1029]. Das heißt, dass die loxP-DNA-Sequenz eine Erkennungssequenz für die Rekombinase Cre ist. Ein weiteres Beispiel der Rekombinase ist eine Rekombinase, die durch das FLP-Gen kodiert wird, welche aus dem Hefe-2 μ-Plasmid stammt [James R. Broarch et al., Cell, 29, 227–234]. Des weiteren kann ebenfalls eine Rekombinase verwendet werden, die vom pSR1-Plasmid von Schizosaccharomyces luxii stammt. Diese Rekombinase wird durch das R-Gen kodiert [Matsuzaki et al., Molecular and Cellular Biology, 8, 955–962 (1988)]. Von diesen ist die von Bakteriophage P1 stammende Rekombinase, die Rekombinase Cre, besonders für die vorliegende Erfindung bevorzugt.
Das Rekombinase-Cre-Gen kann mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durch Amplifizieren der Sequenz hergestellt werden, welche das Rekombinasegen der Bacteriophagen P1 DNA kodiert. Die anderen Rekombinasegene können mit dem PCR-Verfahren in ähnlicher Weise hergestellt werden. Primer, die in dem PCR-Verfahren verwendet werden, werden so ausgewählt, dass sie die Sequenz amplifizieren, die die Gesamtsequenz des Rekombinasegens kodiert. Um einfach den rekombinanten adenoviralen Vektor herzustellen, wird es bevorzugt, die Primer mit einer geeigneten Restriktionsschnittstelle am Ende jedes Primers auszustatten.
Die Erkennungssequenz der Rekombinase beträgt für gewöhnlich mehrere zehn Basenpaarsequenzen. Beispielsweise setzt sich die loxP-Sequenz zusammen aus 34 Basenpaaren, und die Nukleotidsequenzen sind von Abremski et al., J. Biol. Chem., 1984, 1509–1514 und Hoess et al., P.N.A.S., 1984, 81, 1026–1029 identifiziert worden. Demgemäß kann das Rekombinasegen chemisch in konventioneller Weise synthetisiert werden, und für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
Die Poly(A)-Sequenz, die erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht besonders begrenzt, aber eine von Kaninchen-β-Globin stammende Sequenz ist besonders bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, zusammen mit dem Rekombinasegen, eine nukleäre Transfersignalsequenz in den adenoviralen Vektor einzuschleusen. Nach der Transfektion des adenoviralen Vektors in die Zellen, wird die Rekombinase im Nukleus der Zellen transkribiert und dann extranukleär sezerniert. Das heißt, dass um die exprimierte Rekombinase auf die Rekombinase-Erkennungssequenz einwirken zu lassen, in einen anderen adenoviralen Vektor, die Rekombinase transferiert werden muss, um in den Nukleus zurückzukehren. Die nukleäre Transfersignalsequenz beschleunigt den Transfer der Rekombinase in den Nukleus [Daniel Kalderon et al., Cell, 39, 499–509 (1984)].
Als Replikationsursprung, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, welcher in tierischen Zellen funktionsfähig ist, gibt es solche, die von einem Virus und aus Tierzellen stammen. Beispiele der aus einem Virus stammenden Replikationsursprünge schließen solche ein, die von einem Papovavirus und einem Herpesvirus stammen. Als ein vom Papovavirus stammender Replikationsursprung ist der Replikationsursprung von SV40 stammende, zu nennen.
Diese Replikationsursprünge werden in den rekombinanten adenoviralen Vektor der vorliegenden Erfindung eingeschleust, wodurch das zirkuläre DNA-Molekül, welches durch die Rekombinase ausgeschnitten wurde, sich autonom in den transfizierten Zellen replizieren kann.
Das Fremdgen, das erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht besonders begrenzt, solange das Gen unter Kontrolle des Hybridpromotors (CAG-Promotors), welcher oben beschrieben wurde, oder anderer Promotoren, exprimiert wird. Im Hinblick auf die praktische Anwendbarkeit schließen bevorzugte Beispiele normale Gene, die in Patienten defekt sind, wie beispielsweise Adenosindeaminase, Dystrophin, low density-Lipoproteinrezeptor, α-1-Antitrypsin, Blutgerinnungsfaktor VIII oder Blutgerinnungsfaktor IX und Galaktosidase-α oder β; Zytokine, wie Interleukine 1 bis 12, Interferon-α, β oder γ, Tumornekrosefaktor-α oder β, Granulozytenkolonie stimulierenden Faktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor, Erythropoietin, Wachstumshormon, Insulin und insulinartige Wachstumshormone; neurotrophe Faktoren; nicht eigene Antigengene, wie allo-HLA (HLA-B7); Nukleotidsequenzen, die ein virales Antigen kodieren; ein Antioncogen, wie p53, RB, WT-1, NM23 und NF-1; ein Antisense eines Oncogens, wie der Ras-Sequenz; und Suizidgene, wie Thymidinkinase und Zytosindeaminase.
Der Replikationsursprung, Promotor, Fremdgen und Poly(A)-Sequenz werden in dem adenoviralen Vektor zwischen die zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen inseriert und liegen im allgemeinen in dieser Reihenfolge von der stromabwärts gelegenen der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen.
Jedoch können das Fremdgen, die Poly(A)-Sequenz, der Replikationsursprung und der Promotor ebenfalls in dieser Reihenfolge von der stromaufwärts gelegenen der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen liegenden angesiedelt sein. Wenn sie einmal in ein zirkuläres DNA-Molekül eingeschlossen sind, welches vom adenoviralen Vektor durch die Rekombinase gebildet worden ist, können die zwei oben erwähnten Reihenfolgen nicht voneinander unterschieden werden.
Wenn die vorliegende Erfindung auf die Gentherapie angewendet wird, wird eine tierische Zelle sowohl mit der rekombinanten adenoviralen Vektor, der die Rekombinase exprimiert, und dem recombinanten adenoviralen Vektor, der die zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen und weiter einen Promotor, ein Fremdgen und eine Poly(A)-Sequenz trägt, von denen jede zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert ist, co-transfiziert. Die Transfektionen der zwei Vektoren können simultan oder nacheinander durchgeführt werden, da die DNA-Vektoren, die in die tierischen Zellen transferiert werden, über mehr als einen Monat stabil persistieren.
Nachdem der rekombinante adenovirale Vektor, der die Rekombinase exprimiert, in die Zelle co-transfiziert worden ist, exprimiert der rekombinante adenovirale Vektor, der die Rekombinase exprimiert, die Rekombinase über einen bestimmten Zeitraum kontinuierlich, wodurch die Rekombinase kontinuierlich hergestellt wird. Die hergestellte Rekombinase wirkt auf den anderen co-transfizierten rekombinanten adenoviralen Vektor ein, der die zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen trägt, um das DNA-Fragment auszuschneiden, welches zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert ist, um das DNA-Fragment auszuschneiden, welches zwischen den beiden Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert ist, um ein zirkuläres DNA-Molekül zu bilden. Das zirkuläre DNA-Molekül hat den Replikationsursprung, der in tierischen Zellen funktionsfähig ist, und deswegen repliziert es sich autonom in den co-transfizierten Zellen, um das Fremdgen kontinuierlich zu exprimieren. Demgemäß kann nur die einzelne Co-Transfektion der zwei adenoviralen Vektoren fast permanent den gewünschten therapeutischen Effekt aufweisen. Es wird daher vermutet, dass die rekombinanten Adenovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung für die Gentherapie extrem effizient sind.
Die Gentherapie gemäß der vorliegenden Erfindung kann über einen weiten Bereich an menschlichen und tierischen Zellen angewendet werden, beispielsweise an hoch differenzierten menschlichen und Säuger-Nervensystemzellen, Muskelsystemzellen, Leberzellen, undifferenzierten Epithelzellen und Fibroblastenzellen.
Nachfolgend werden Verfahren zum Konstruieren der rekombinanten Adenoviren der vorliegenden Erfindung erklärt.

1. Zuerst wird unten das Verfahren zum Herstellen des rekombinanten adenoviralen Vektors mit dem Promotor, dem Rekombinasegen und der Poly(A)-Sequenz erklärt. Es ist äußerst schwierig, den erfindungsgemäßen adenoviralen Vektor herzustellen, da das adenovirale Genom Proteine aufweist, die kovalent an beide Enden gebunden sind, wie oben beschrieben worden ist. Deswegen werden unter Bezugnahme auf das Rekombinase-Cre-Gen als Rekombinasegen vorzugsweise die folgenden Verfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Verfahren sind in ähnlicher Weise auch auf die anderen Rekombinasegene anwendbar. (1) Rekombinase-Cre-Gen, amplifiziert mit dem PCR-Verfahren und Plasmid pUC19 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) werden gleichzeitig mit den Restriktionsenzymen Pst I und XbaI verdaut (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Die erhaltenen Produkte werden gemischt und ligiert, um das Plasmid pUCCre zu erhalten, das das hierin eingeschleuste Rekombinase-Cre-Gen aufweist. (2) Das Kassetten-Cosmid pAdexlCAwt, welches den CAG-Promotor trägt, welcher durch ein Verfahren hergestellt worden ist, welches von SAIBO KOGAKU (Cell Engineering), 13, 760–763 (1994) beschrieben wird, wird mit dem Restriktionsenzym SwaI (Boehringer, Deutschland) verdaut. Das verdaute Produkt wird mit dem Produkt gemischt, das durch das Verdauen des Plasmids pUCCre mit den Restriktionsenzymen PstI und XbaI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gewonnen wird, gefolgt vom Auffüllen desselben mit Klenow-Enzym (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Dann werden die DNA-Fragmente präzipitiert und mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Kassetten-Cosmid mit dem darin eingeschleusten Rekombinase-Cre-Gen zu gewinnen. Wenn Promotoren verwendet werden, die nicht der CAG-Promotor sind, wird von der Gesamtlänge des adenoviralen Genoms (36 kb) zuerst ein Kassetten-Cosmid hergestellt, welches ungefähr 31 kb genomische DNA trägt, deren E3-Region (1,9 kb), die nicht für die Replikation essentiell ist und die E1A·E1B-Region (2,9 kb) deletiert worden ist. Daneben wird ein Plasmid mit einem Promotor, einem Rekombinase-Cre-Gen und einer Poly(A)-Sequenz hergestellt, und das Plasmid wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, um eine Rekombinase-Cre-Gen-Expressionseinheit zu gewinnen. Die Expressionseinheit wird in die E1A·E1B-deletierte Stelle des adenoviralen Genoms inseriert, um ein Kassetten-Cosmid zu gewinnen. (3) Das so erhaltene Kassetten-Cosmid wird einer in vitro-Verpackung unter Verwendung von λ in vitro-packaging kit Gigapack XL (Stratagene Co., Ltd., USA) unterworfen. (4) Ferner wird ein Adenovirus DNA-Proteinkomplex (Ad5dlX DNA-TPC) hergestellt. Als adenovirale DNA wird der Vektor Ad5dlX (I. Saito et al., J. Virology, Band 54, 711–719 (1985)) verwendet. Der Vektor Ad5dlX wird in HeLa-Zellen in einer Menge von 10 Roux tubes (Röhrchen) infiziert, gefolgt von der Kultivierung. Die viralen Partikel werden gewonnen, mit Guanidinhydrochlorid behandelt, und einer Ultrazentrifugation unterworfen, um den DNA-TPC-Komplex zu trennen und zu gewinnen. Der so gewonnene Ad5dlX DNA-TPC-Komplex wird im folgenden Schritt mit einer ausreichenden Menge an EcoT22I zur Herstellung des rekombinanten Adenovirus behandelt. (5) Als letzeter Schritt wird das Kassetten-Cosmid mit dem Rekombinase-Cre-Gen eingeschleust, mit dem Ad5dlX DNA-TPC-Komplex gemischt, welcher zuvor mit EcoT22I behandelt worden ist, und das erhaltene Gemisch wird in 293 Zellen unter Verwendung der Celfect-Kits (Pharmacia) gemäß dem Calciumphosphatverfahren transfiziert. Aus den, aufgrund der Propagierung des transfizierten Virus, toten Zellen wird die Viruslösung gewonnen, um einen rekombinanten adenoviralen Vektor mit dem Promotor, dem Rekombinasegen und der Poly(A)-Sequenz zu erhalten.
2. Unten wird ein Verfahren zum Konstruieren des anderen rekombinanten adenoviralen Vektors beschrieben, der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen, einen weiteren Replikationsursprung, einen Promotor, ein Fremdgen und eine Poly(A)-Sequenz enthält, von denen alle zwischen zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind. Aus Gründen der Einfachheit wird das Verfahren unten im Fall der Verwendung des Replikationsursprungs von SV40 beschrieben. (a) Zuerst wird ein Kassetten-Cosmid, das ein gewünschtes Fremdgen exprimiert, hergestellt. (1) Das Plasmid pCAWG wird durch Inserieren des SwaI-Linkers in das Plasmid pCAGGS hergestellt, welches den CAG-Promotor trägt (Niwa et al., Gene, 108, 193–200, 1990), an der Klonierungsstelle. Das Plasmid pCAWG wird mit SwaI verdaut, gefolgt von der Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Dann wird das gewünschte Fremdgen mit dem erhaltenen pCAWG gemischt und mit Ligase behandelt. Unter Verwendung des Produktes wird der E. coli DHI-Stamm (ATCC 33849) transformiert, um ein Plasmid zu gewinnen, in dem das Fremdgen unter Kontrolle des CAG-Promotors exprimiert wird. (2) Ein DNA-Fragment, das eine Fremdgen-Expressionseinheit trägt, in der das Fremdgen unter Kontrolle des CAG-Promotors, wie auch des SV40-Replikationsursprungs exprimiert wird, wird hergestellt. Das erhaltene Plasmid aus (1) wird mit den Restriktionsenzymen SapI und SalI verdaut, mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dann einer Elektrophorese unterworfen, um das gewünschte DNA-Fragment zu erhalten. Das erhaltene DNA-Fragment wird mit dem Plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gemischt, welches zuvor mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut worden ist, und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das erhaltene Produkt wird mit Ligase behandelt, um ein Plasmid zu erhalten, das die Fremdexpressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 aufweist. (3) Um die loxP-Sequenz an beide Enden des DNA-Fragments anzufügen, welches die Expressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält, werden die folgenden Verfahren durchgeführt. Das Plasmid pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wird mit dem Restriktionsenzym Ecl136II verdaut. Nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase wird das verdaute Plasmid mit einem synthetischen DNA-Fragment (SEQ ID NO: 3) ligiert, welches die loxP-Sequenz trägt, welche eine MluI-Schnittstelle und eine XhoI-Schnittstelle an den Enden hat, und so entworfen worden ist, dass nach der Ligierung von jeder der MluI- und XhoI-Schnittstellen eine NruI-Schnittstelle gebildet wird. Auf diese Weise wird ein Plasmid gewonnen, welches die zwei hierin inserierten synthetischen DNA-Fragmente enthält. Nachdem dieses Plasmid mit dem Restriktionsenzym NruI verdaut worden ist, und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden ist, wird das behandelte Plasmid mit einem DNA-Fragment ligiert, welches durch das Verdauen des in dem obigen (2) hergestellten Plasmids mit den Restriktionsenzymen SalI und Ecl136II gewonnen wurde und dann aufgefüllt. Auf diese Weise wird ein Plasmid erhalten, das ein DNA-Fragment trägt, welches die Fremdgenexpressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält und außerdem die loxP-Schnittstellen an beiden Enden enthält. (4) Danach werden die folgenden Verfahren durchgeführt, um ein rekombinantes Cosmid zu gewinnen, das das DNA-Fragment trägt, welches die Fremdgenexpressionseinheit enthält, und den Replikationsursprung von SV40 und weiter die loxP-Schnittstellen an beiden Enden enthält. Zuerst wird das in obigem (3) erhaltene Plasmid mit den Restriktionsenzymen SmaI und EcoRI verdaut, und mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Das Produkt wird durch Elektrophorese gereinigt, um ein DNA-Fragment herzustellen, welches die Fremdgenexpressionseinheit enthält, und den Replikationsursprung von SV40 und welches weiter die loxP-Schnittstellen an beiden Enden enthält. Daneben wird der Vektor pAdex1cw [SAIBO KOGAKU (Cell Engineering), 13, 760–763, 1994] mit dem Restriktionsenzym SwaI verdaut. Das oben hergestellte Fragment und das Kassetten-Cosmid werden gemischt und präzipitiert. Das DNA-Gemisch wird mit der T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Kassetten-Cosmid zu gewinnen, das das Fragment enthält, welches das DNA-Fragment trägt, welches die Fremdgen-Expressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält und welches ferner die loxP-Schnittstellen an beiden Enden enthält. (b) Konstruktion eines rekombinanten adenoviralen Vektors, welcher ein Fragment hat, das die zwei loxP-Sequenzen enthält, und weiter einen Replikationsursprung, einen CAG-Promotor und ein Fremdgen enthält, von denen jedes zwischen den zwei loxP-Sequenzen lokalisiert ist.

Der rekombinante adenovirale Vektor der vorliegenden Erfindung kann in gleicher Weise wie in den obigen Verfahren 1. (3) bis (5) beschrieben, hergestellt werden.
Der rekombinante adenovirale Vektor, der den Promotor, das Rekombinasegen und die Poly(A)-Sequenz trägt, und ein anderer rekombinanter adenoviraler Vektor, der den Replikationsursprung von SV40, die Fremdgenexpressionseinheit und die loxP-Sequenz an beiden Enden trägt, kann effizient zur Behandlung von zahlreichen Erkrankungen verwendet werden, die genetische Erkrankungen einschließen. Genauer wird eine hoch-titrige virale Lösung, die die zwei rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, in geeigneter Weise verdünnt, und die verdünnte Lösung kann durch einen passenden Weg verabreicht werden, z.B. topisch (Zentralnervensystem, Portalvene), oral (unter Verwendung einer enterischen Beschichtung), durch Inhalieren, subkutan und ähnlich.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung mit mehreren Details unter Bezugnahme auf die Beispiele und Referenzbeispiele beschrieben, aber es wird nicht davon ausgegangen, dass sie hierauf beschränkt ist.
In den Beispielen wurden zahlreiche Verfahren zum Manipulieren von Phagen, Plasmiden, DNAs, verschiedenen Enzymen, E. coli, Kulturzellen und ähnliches, wenn es nicht anders angegeben wurde, nach Modifikationen von Verfahren, die in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, herausgegeben von T. Maniatis et al., 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben sind, durchgeführt. DNA-Restriktionsenzyme und modifizierte Enzyme wurden von Takara Shuzo Co., Ltd., New England Biolabs (NEB), Stratagene oder Boehringer bezogen und gemäß deren Anweisungen verwendet.
Beispiel 1
Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, der ein Rekombinase-Cre-Gen und einen CAG-Promotor trägt
(1) Herstellung eines Kassetten-Cosmids zum Exprimieren des Rekombinase-Cre-Gens:

1) Eine PCR-Reaktion wurde durchgeführt, indem E. coli-Phagen-P1-DNA als Vorlage verwendet wurde, die das Rekombinase-Cre-Gen enthält (ATCC 11303-B23), das folgende Oligonukleotid (SEQ ID NO: 1) als 5'-Primer, das folgende Oligonukleotid (SEQ ID NO: 2) als 3'-Primer und Vent^R (NEB) als Polymerase. Die detaillierten Bedingungen für die PCR-Reaktion werden unten beschrieben. Das Produkt wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, und eine Bande, die ungefähr 1 kb anzeigte, wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, um ein ungefähr 1 kb DNA-Fragment zu gewinnen, welches das Rekombinase-Cre-Gen trägt.

Die Unterstreichungen geben die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme an. PCR-Bedingungen

Puffer:	10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM
	(NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100 (Puffer,
	der von NEB angeboten wurde, wurde verwendet)
Polymerase:	2 Einheiten
dNTP:	400 μM
Primer:	1 μM
P1-Phagen DNA:	1 ng
Temperatur zum Auftrennen des Doppelstrangs:	1,5 Minuten
Temperatur zum Anlagern:	1,5 Minuten
Temperatur zur Kettenverlängerungsreaktion:	2,0 Minuten
Reaktionszyklus:	20mal

Nachdem jedes der so erhaltenen DNA-Fragmente und pUC19 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) mit den Restriktionsenzymen PstI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) und XbaI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verdaut worden waren, wurden die verdauten Produkte gewonnen, und die Produkte des DNA-Fragments und das von pUC19 wurden miteinander in einem molaren Verhältnis von ungefähr 3:1 gemischt. Das Gemisch wurde dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli JM109-Stamm (ATCC 53323) zu transformieren. Die behandelten E. coli-Zellen wurden auf eine LB-Agarplatte inokuliert, welche mit 100 μg/ml Ampicillin supplementiert war, und die Transformanten, die auf dem Agar wuchsen, wurden ausgewählt, um das Plasmid pUCCre zu gewinnen, welches das Rekombinase-Cre-Gen trägt.
Als nächstes wurde ein Kassetten-Cosmid pAdex1CAwt, welches den CAG-Promotor enthält, der nach dem Verfahren, das in SAIBO KOGAKU (Cell Engineering), 13, 760–763 (1994) beschrieben wurde, hergestellt wurde, mit SwaI verdaut. Dann wurden 1 μg des verdauten Produktes mit 0,1 μg eines ungefähr 1 Kb DNA-Fragments gemischt, das durch Verdauen des Plasmids pUCCre mit PstI und XbaI gewonnen wurde, und mit Klenow-Enzym aufgefüllt (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan).
Der hier verwendete CAG-Promotor wird als Hochexpressionsvektor in der japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer 3 (1991)-168087 offenbart. Der CAG-Promotor kann durch Ausschneiden aus dem Plasmid pCAGGS hergestellt werden, welches mit den Restriktionsenzymen SalI und Hind III in der offengelegten Beschreibung oben auf Seite 13, Zeile 20 bis Seite 20, Zeile 14 und Seite 22, Zeile 1 bis Seite 25, Zeile 6, beschrieben ist. Der so hergestellte CAG-Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

2) Zu dem oben erhaltenen Gemisch wurde Ethanol gegeben, um das Cosmid z präzipitieren. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und in einer 5fach verdünnten TE-Lösung (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) gelöst.
3) Die erhaltene Lösung, die das Cosmid enthält, wurde einer Ligationsreaktion über Nacht in einem Endvolumen von 7 μl unterworfen, wobei ATP und T4-DNA-Ligase ein einer Pufferlösung enthalten waren. Sterilisiertes Wasser und eine Pufferlösung für Swa1-Reaktion wurden hinzugegeben, um das gesamte Volumen auf 48 μl zu bringen. Dann wurde die Ligase durch Erwärmen auf 70°C für 10 Minuten inaktiviert. Anders als ein Plasmid, kann ein Cosmid für gewöhnlich makromolekulare DNA effizient verpacken, die durch Verbinden miteinander in einer linearen Tandemform anstelle einer cyclischen Form gebildet worden ist.
4) Nach Zugabe von 2 μl Swa1 (Boehringer, Deutschland) wurde die Verdauungsreaktion des Cosmids für eine Stunde bei 25°C durchgeführt. Die Gründe dafür, warum das Cosmid mit Swa1 verdaut worden ist, werden unten angegeben. Wenn das Kassetten-Cosmid ohne Einschließen einer Expressionseinheit religiert wird, wird die Swa1-Erkennungsschnittstelle regeneriert. Auf diese Weise kann der Verdau mit Swa1 das Cosmid ohne darin eingeschlossene Expressionseinheit wieder spalten, was dazu führt, dass keine Kolonie gebildet wird. Dies ist ein mögliches Verfahren zum Auswählen nur solcher Kassetten-Cosmide mit Insertionssequenz.
5) Das Kassetten-Cosmid wurde einer Phenolextraktion, Zentrifugation und Gelfiltration gemäß einem konventionellen Verfahren, wie in dem Molecular Cloning, Band 3, E.34 beschrieben, unterworfen.
6) Der Verdau mit Swa1 wurde erneut durchgeführt. Das heißt, dass 5 μl Swa1 zu dem Puffer für die Swa1-Reaktion hinzugegeben wurden, um das Cosmid bei 25°C für 2 Stunden zu spalten. Die Spaltung wurde aus den oben erwähnten Gründen durchgeführt.
7) Das erhaltene Cosmid (1 μl) wurde einer in vitro-Verpackung unterworfen. Das bedeutet, dass der lambda-in-vitro-Verpackungskit, Gigapack XL (Stratagene Co., Ltd., USA) in einem 1/4-Ausmaß verwendet worden ist, und dass der Rest bei –80°C eingefroren wurde. Da Gigapack XL eine niedrige Verpackungseffizienz bei einem Cosmid von 42 kb oder weniger ermöglicht, kann der Kit bis zu einem gewissen Ausmaß ein Cosmid, das eine größere Größe bekommen hat, durch Einschließen einer Insertionssequenz auswählen. In diesem Experiment enthielten, wenn 10 Kolonien gepickt wurden, die meisten eine Insertionssequenz. Deswegen konnte ein Klon mit der gewünschten Richtung (d.h. die linke Richtung, welche die Richtung von der E3-Genregion bis zur E1-Genregion bedeutet) leicht gewonnen werden. Das Cosmid wurde nach einem konventionellen Verfahren, wie beschrieben in Izumu Saito et al., JIKKEN IGAKU (Experimental Medicine), Band 7, 183–187 (1989), manipuliert.
8) Das verpackte Cosmid wurde in den E. coli-Stamm DH1 (ATCC 33849) infiziert. Das bedeutet, dass das Cosmid auf jede von drei Ap+-Agarplatten (supplementiert mit Ampicillin) inokuliert wurde, und dass 5 ml an Ap+ LB (Pool) in einer Menge von jeweils 1/200, 1/20, 1/2 und dem Rest inokuliert wurden, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Die Miniprep-DNA wurde aus dem Pool extrahiert und hergestellt. Das Verhältnis des Cosmids mit einer Insertionssequenz wurde nach vollständigem Enzymverdau untersucht. Die Kolonie wurde zusammen mit der Agarplatte gepickt, und in 1,5 ml Ap+ LB über Nacht kultiviert, um die Miniprep-DNA herzustellen.
9) Die Orientierung und Struktur der Expressionseinheit, die in dem Cosmid enthalten ist, wurde durch Verdaus mit Restriktionsenzymen bestätigt. Das bedeutet, dass ein Plasmid, das eine Expressionseinheit trägt, aber bei dem der größte Teil der Adenovirus-DNA deletiert worden war, mit NruI und Ligase hergestellt worden war, und dann wurde von dem Plasmid ein DNA-Fragment für die endgültige Bestätigung der cDNA-Klonierung hergestellt.

(2) Herstellung eines adenoviralen DNA-Proteinkomplexes (Ad5 d1X DNA-TPC)

1) Als Adenovirus-DNA wurde der Vektor Ad5 dlX (I. Saito et al., J. Virology, Band 54, 711–719 (1985)) verwendet. Die Vektor-Ad5 dlX-DNA wurde in HeLa-Zellen infiziert in einer Menge von Roux 10-Röhren, gefolgt von einer Inkubation. Das bedeutet, dass die virale Lösung (~10⁹ PFU/ml) aus Ad5-dlX in einer Menge von 0,2 ml/Roux-Röhre infiziert worden war. Drei Tage später wurden die abgelösten Zellen eingesammelt durch Zentrifugieren bei 1.500 Upm für 5 Minuten. Die meisten der Adenoviruspartikel waren nicht im Medium vorhanden, sondern im Nukleus, und das Virus wurde deswegen vorzugsweise aus den infizierten Zellen gereinigt. Die folgenden Verfahren wurden aseptisch durchgeführt.
2) Die erhaltenen Zellen wurden in 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert und bei 200 W für 2 Minuten (30 Sekunden × 4) mit Ultraschall behandelt, indem ein Ultraschallapparat vom versiegelten Typ verwendet wurde, um die Zellen hierdurch zu zerstören und Virus freizusetzen. Um das Virus aus den Zellen freizusetzen, wenn die Zellsuspension ein Volumen von 5 ml oder weniger hat, wurden fünf Wiederholungen des Einfrierens und Auftauens als ausreichend angesehen. Wenn es jedoch ein größeres Volumen hat, ist ein Ultrabeschallungsgerät zum Freisetzen des Virus vorteilhaft. In diesem Fall muss ein Ultraschallgerät vom versiegelten Typ mit einem einem einzigen Becher verwendet werden. Ein gewöhnlicher Typ vom Einstell-(throw-in)-Format ist gefährlich, selbst wenn der Arbeitsvorgang in einem Sicherheitsschrank durchgeführt wird.
3) Nachdem die so erhaltenen Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 10k Upm für 10 Minuten entfernt worden waren, wurde der Überstand auf 15 ml Cäsiumchloridlösung (spezifische Gravität von 1,43) überlagert, in eine Ultrazentrifugenmaschine (SW28-Röhrchen) geladen, gefolgt von einer Aufkonzentrierung durch Zentrifugieren (25k Upm, eine Stunde, 4°C).
4) Die Virus-Bande direkt unterhalb der Zwischenphase wurde in ein SW50.1-Röhrchen überführt. Die Virusphase direkt unterhalb der Zwischenphase wurde visuell beobachtet, und 5 ml der Virus-Bande wurden eingesammelt. Zum gleichen Zeitpunkt wurde eine weitere Röhre mit der Cäsiumchloridlösung (spezifische Gravität von 1,34) aufgefüllt. Diese Röhrchen wurden über Nacht bei 4°C bei 35k Upm zentrifugiert. Dann wurde das so gebildete Band eingesammelt, was das Virus anzeigte, und in ein Röhrchen transferiert, welches einen vorher geformten Gradienten enthält. Das Röhrchen wurde weiter einer Ultrazentrifugierung bei 4°C für 4 Stunden bei 35k Upm unterworfen.
5) Die das Virus anzeigende Bande wurde eingesammelt und mit der gleichen Menge 8 M Guanidinhydrochlorid gemischt. Des weiteren wurden 4 M Guanidinhydrochlorid-gesättigtes Cäsiumchlorid zur Mischung hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde in ein VTi65-Röhrchen gefüllt. Das Partikelprotein wurde mit 4 M Guanidinhydrochlorid denaturiert, um eine Dissoziierung zu verursachen, wodurch der DNA-TPC-Komplex freigesetzt wurde. Ethidiumbromid konnte in diesem Experiment nicht verwendet werden, da jedes Verfahren zum Entfernen des verwendeten Ethidiumbromids noch nicht etabliert worden ist.
6) Das Röhrchen, das oben beschrieben wurde, wurde über Nacht einer Ultrazentrifugation bei 15°C bei 55k Upm unterworfen, gefolgt von einer Fraktionierung mit 0,2 ml. Aus jeder der Fraktionen wurde 1 μl herausgepickt, und mit 1 μg/ml wässriger Ethidiumbromid-Lösung gemischt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von DNA durch eine Fluoreszenzfärbung zu bestätigen. Zwei bis drei Fraktionen, die eine DNA enthalten, wurden eingesammelt.
7) Die Fraktionen wurden über Nacht zweimal gegen 500 ml TE dialysiert und wurden dann bei –80°C aufbewahrt. Die Menge des so erhaltenen Ad5dlX-DNA-TPC-Komplexes wurde auf Grundlage des OD₂₆₀-Wertes in gleicher Weise wie in einem konventionellen Verfahren bestimmt.
8) Der erhaltene Ad5dlX-DNA-TPC-Komplex wurde mit einer ausreichenden Menge EcoT22I für 2 Stunden verdaut, und dann bei –80°C aufbewahrt, um im folgenden dritten Schritt einen rekombinanten adenoviralen Vektor herzustellen. In der Zwischenzeit konnte der DNA-TPC-Komplex einen Verdau mit den Restriktionsenzymen, eine Dialyse und eine Gelfiltration durchlaufen, aber er wurde keiner Elektrophorese, Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitierung unterworfen. Die Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation ist nur als ein Konzentrationsverfahren verfügbar. Deswegen wurde das DNA-TPC-Komplexsystem bei einer Konzentration gehalten, die so hoch wie möglich war. Ungefähr 300 μg des DNA-TPC-Komplexes konnten aus den infizierten Zellen von 10 Roux-Röhrchen gewonnen werden.
9) Ein Aliquot der DNA-TPC-Komplexlösung wurde eingesammelt, und 10 μl BPB-Puffer für die Elektrophorese wurden hinzugegeben. Dann wurden 1 μl Proteinase K (10 mg/ml) zu dem Gemisch hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei 37°C für 10 Minuten inkubiert, um das terminale Protein in dem DNA-TPC-Komplex zu verdauen. Nach einer Phenolextraktion wurde der Überstand durch Elektrophorese auf einem Agarosegel abgetrennt, um die Vollendung des Verdaus zu bestätigen. Nachdem der Restriktionsenzympuffer in dem EcoT221-verdauten DNA-TPC durch Zentrifugen-Gelfiltration entfernt worden war, wurden die erhaltenen Produkte separat in Röhrchen geladen, und bei –80°C gelagert.

(3) Isolierung des rekombinanten Virus und Herstellung einer hochtitrigen viralen Lösung

1) Jeweils eine Petrischale von 6 cm und 10 cm Durchmesser wurden mit den 293er Zelllinien beladen, die in DME kultiviert worden waren, welches mit 10% FCS supplementiert worden war.
2) Nachdem 8 μg (3 bis 9 μg ist geeignet) an pAdex1W-DNA mit der Expressionseinheit darin eingeschlossen, mit 1 μg Ad5dlX-DNA-TPC-Komplex gemischt worden war, welcher zuvor mit EcoT22I verdaut worden war, wurde das erhaltene Gemisch in die 293er Zelllinien in der 6 cm Petrischale unter Verwendung des Celfect-Kits (Pharmacia) gemäß dem konventionellen Calciumphosphatverfahren transfiziert. Das bedeutet, dass das Gemisch auf das Medium in der 6 cm Petrischale getropft wurde, und die Inkubation fortgesetzt wurde. Nach der Inkubation über Nacht (für ungefähr 16 Stunden) wurde das Kulturmedium am nächsten Morgen ausgetauscht. Dann wurde das Medium, das die Zellen enthält, am Abend ml/Vertiefung mit 5in einer Menge von 0,1 % FCS-haltigem DME in die Vertiefungen von drei 96-Well collagenbeschichteten Platte geschüttet (nicht verdünnt, 10fach verdünnt und 100fach verdünnt). Um einen signifikanten Unterschied in der Zellzahl zwischen jeder Platte zu vermeiden, wurde ein Drittel der 293er Zellen, die aus der 10 cm Petrischale geerntet wurden, auf jede der zwei verdünnten Lösungsplatten gegeben.
3) Drei bis vier Tage danach und acht bis zehn Tage danach wurden 50 μl 10% FCS-haltiges DME weiter zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Sobald die 293er Zelllinien dünn wurden, wurde 10%iges FCS-haltiges DME früher zu der Vertiefung hinzugegeben. Die Vertiefungen, in denen das Virus propagiert wurde, und in denen die Zellen tot waren, wurden nach 7 bis 15 Tagen beobachtet. Von jeder Vertiefung, in der die Zellen vollkommen tot waren, wurde das Kulturmedium, das die toten Zellen enthält, mit einer sterilen Pasteurpipette in ein sterilisiertes 1,5 ml Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde schnell eingefroren und bei –80°C aufbewahrt.
4) Die Beobachtung wurde nach 15 bis 18 Tagen beendet. Ungefähr zehn (10) Röhrchen, die aus den Röhrchen ausgewählt wurden, die mit Kulturmedium beladen worden waren, welche Zellen enthielten, die in einem relativ späten Stadium tot waren, wurden ausgewählt. Nach sechs (6) Wiederholungen des Einfrierens und Auftauens wurde eine Zentrifugierung bei 5k Upm für 10 Minuten durchgeführt. Der daraus resultierende Überstand wurde als erste Saat bei –80°C aufbewahrt. Die Vertiefungen, in denen das Virus sich in einem früheren Stadium begann fortzupflanzen, lassen eine höhere Wahrscheinlichkeit von Mischinfektionen mit einer Vielzahl an Virusstämmen vermuten.
5) Die 293er Zelllinien wurden in eine 24-Well-Platte gegeben und 5% FCS-DME (0,4 ml/well) und 10 μl der ersten viralen Saat wurden zu den Vertiefungen in Duplikaten hinzugegeben.
6) Sobald die Zellen, nach ungefähr 3 Tagen, alle tot waren, wurde der Überstand von einem der Duplikat-Vertiefungen durch sechs (6) Wiederholungen von Einfrieren und Auftauen und Zentrifugieren in einer ähnlichen Weise wie im Verfahren zum Herstellen der ersten viralen Saat, wie oben beschrieben, gewonnen. Der so erhaltene Überstand wurde bei –80°C zur Verwendung als zweite Saat aufbewahrt. Der Titer der zweiten viralen Lösung betrug ungefähr 10⁷ bis 10⁸ PFU/ml. Die toten Zellen in einer anderen Vertiefung des Duplikats wurden bei 5k Upm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen alleine werden bei –80°C (Zellklumpen) aufbewahrt. Die Zellklumpen aus 10 viralen Stämmen wurden eingesammelt und die Gesamt-DNA wurde aus den infizierten Zellen gemäß den folgenden Verfahren extrahiert. Zu jedem Zellklumpen wurden 400 μl TNE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA), 4-μl Proteinase K (10 mg/ml) und 4 μl 10% SDS gegeben.
7) Nach der Behandlung bei 50°C für eine Stunde wurden zwei Extraktionen mit Phenol-Chloroform, zwei Extraktionen mit Chloroform und dann eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Die durch die Ethanol-Präzipitation gewonnene Nukleinsäure wurde in 50 μl TE, enthaltend 20 μg/ml Ribonuklease, gelöst. Nachdem 15 μl der Lösung mit XhoI, welches Stellen erkennt, die CG enthalten, wurde das verdaute Produkt zusammen mit dem XhoI-verdauten Produkt einer Expressions-Cosmid-Kassette über Nacht einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit einer Länge von ungefähr 15 cm unterworfen. Die so erhaltenen Muster wurden verglichen. Ausgewählt wurden der Klon, welcher eine Bande hat, die genau die DNA-Sequenz von der gespaltenen Stelle in der Expressionseinheit auf der linken Seite des Adenovirusgenoms zeigt. Die Klone, die viele Banden zeigten, was auf unbestimmte DNA-Sequenzen hinwies, wurden verworfen, da die Möglichkeit bestand, dass die Klone mit Viren mit Deletionen kontaminiert sein würden. Die Adenovirus-DNA propagiert sich im allgemeinen in einer Menge von 10.000 Kopien/Zelle. Daher konnten selbst Gesamt-DNA, einschließlich der nativen zellulären DNA und der adenoviralen DNA, extrahiert werden, mit den Restriktionsenzymen verdaut werden und dann einer Elektrophorese unterworfen werden, wodurch Banden beobachtet werden konnten, die DNA-Fragmente anzeigen, die von der adenoviralen DNA stammen. Ein Restriktionsenzym, wie beispielsweise XhoI, welches CG in der Erkennungsstelle enthält, verdaut die zelluläre DNA nicht. Als Ergebnis konnten Muster unterschieden werden, wenn sie in eine Elektrophorese geladen wurden, leicht beobachtet werden. Wenn andere Enzyme verwendet wurden, wurde die DNA der nicht infizierten 293er Zelllinien als eine Kontrolle benötigt, da es eine Erzeugung wiederholter Sequenzen in der menschlichen Zelle gibt. Die verdaute DNA nicht infizierter 293er Zelllinien wurde einer Elektrophorese unterworfen, um Banden zu beobachten, die die wiederholten Sequenzen einer menschlichen Zelle anzeigten.
8) Die zweite Saat-Lösung, welche durch den XhoI-Verdau bestätigt worden war, wurde in einer Menge von 0,1 ml in die 293er Zelllinien transfiziert, die in eine 150 cm² mit Collagen-beschichtete Flasche mit 25 ml Medium gegeben worden waren. Sobald die Zellen nach drei Tagen tot waren, wurde das Kulturmedium, das die toten Zellen enthält, aseptisch mit einem Ultraschallgerät vom versiegelten Typ bei der maximalen Rate von 200 W für 2 Minuten (30 Sekunden × 4) behandelt, um das Virus freizusetzen. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugieren bei 3k Upm für 10 Minuten bei 4°C gewonnen und der gewonnene Überstand wurde in einer Menge von 2 ml in jeweils eines von 13 Röhrchen eines 5 ml Einfrierröhrchens gegeben. Die Röhrchen wurden schnell mit Trockeneis eingefroren und bei –80°C gelagert, um eine dritte Saatlösung herzustellen. Die dritte Saatlösung, die den rekombinanten adenoviralen Vektor der vorliegenden Erfindung enthält, zeigte einen Titer von bis zu 10⁹ PFU/ml. Nach dem Transfizieren von 5 μl der dritten Saatlösung in eine Vertiefung, die die 293er Zelllinien in einer 24 Well-Platte enthält, wurde die propagierte virale DNA mit Restriktionsenzymen verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen. Die erhaltenen Muster wurden durch die Verfahren, die oben beschrieben worden sind, bestätigt. Wenn es irgendeinen Zweifel gab, dass das Virus möglicherweise mit dem deletierten Virus oder dem Parentalvirus gemischt sein könnte, wurde die gesamte dritte Saat verworfen. Dies liegt daran, dass es die Möglichkeit geben könnte, dass das deletierte Virus, das bereits in der zweiten viralen Lösung vorhanden war, sich schnell auf ein erkennbares Niveau propagiert. Deswegen wurden die obengenannten Verfahren wiederum mit einer anderen zweiten Saatlösung durchgeführt. Alternativ dazu wurde die Viruslösung gereinigt, indem die ersten Saatlösungen einem limiting dilution-Verfahren unterworfen wurden.

Referenzbeispiel
Einfacher Test für den Titer des rekombinanten adenoviralen Vektors der vorliegenden Erfindung
Der erfindungsgemäße rekombinante adenovirale Vektor kann hinsichtlich des Titers in einer einfachen Weise gemäß den folgenden Verfahren untersucht werden.

(1) Eine Petrischale mit 10 cm Durchmesser, die mit 293er Zellen beladen wird, wird hergestellt. Die rekombinante adenovirale Vektorlösung (d.h. die dritte Saatlösung) wird seriell von 10^–1 bis 10^–4 unter Verwendung von 5% FCS-supplementierten DME verdünnt. Beispielsweise werden 0,9 ml DME und 0,1 ml der Viruslösung verwendet, um die Lösung herzustellen. Die Mikropipettenspitzen werden alle ausgetauscht.
(2) In allen Wells einer collagenbeschichteten 96-Well-Platte werden 5% FCS-supplementiertes DME zu 50 μl jeweils geladen.

In 8 Vertiefungen der ersten Spur werden jeweils 25 μl einer rekombinanten adenoviralen Vektorlösung, die auf 10^–4 verdünnt ist, geladen.
Indem eine Mehrfachkanalpipette für eine 8-Well-Platte verwendet wird, werden 25 μl der Vektorlösung in die Wells der zweiten Reihe übertragen. Danach wird der gleiche Arbeitsschritt bis zur 11. Spur wiederholt, und die letzten 25 μl der Vektorlösung werden verworfen. Im Ergebnis können die 3ⁿ seriell verdünnten Lösungen bis zu 3¹¹ × 10^–4 hergestellt werden. Die Lösung in der 12. Reihe sind nicht infizierte Zellen als Kontrolle.
Die Spitzen, die in diesem Experiment verwendet werden, werden nach jeder Verwendung ausgetauscht.
Beispiel 2
Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, der zwei loxP-Sequenzen und weiter einen Replikationsursprung von SV40, einen CAG-Promotor und das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBs) trägt, von denen jedes zwischen den zwei loxP-Sequenzen lokalisiert ist.
(1) Konstruktion eines Kassetten-Cosmids zum Exprimieren des Hepatitis B-Virus-Oberflächenaktivens (HBs):

1) Das Plasmid pHBVadr4 mit HBs-cDNA (Fujiyama et al., Nucleic Acids Res., 11, 4601–4610, 1983) wurde mit den Restriktionsenzymen Psp1406I und XhoI verdaut, gefolgt vom Auffüllen mit Klenow-Enzym. Das erhaltene verdaute Plasmid wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, um ein 710 bp DNA-Fragment zu gewinnen.
2) Die folgenden Verfahren wurden durchgeführt, um eine Expressionseinheit zum Exprimieren von HBs-cDNA unter Kontrolle des CAG-Promotors zu gewinnen. Durch Inserieren des SwaI-Linkers in die Kloningstelle in einem Plasmid pCAGGS, enthaltend den CAG-Promotor (Niwa et al., Gene, 108, 193–200, 1990), wurde das Plasmid pCAWG hergestellt. Das Plasmid pCAWG wurde mit SwaI verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Dann wurde das erhaltene Produkt mit dem 710 bp DNA-Fragment, das in oben 1) erhalten wurde, in einem molaren Verhältnis von ungefähr 1:3 gemischt. Die Mischung wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Der E. coli DHI-Stamm (ATCC 33849) wurde mit dem Reaktionsgemisch transfiziert. Die Transformanten wurden von einer LB-Agarplatte abgepickt, die mit Ampicillin supplementiert war. Das Plasmid pCAG·HBs wurde gewonnen, indem ein 710 bp DNA-Fragment korrekt in einer solchen Weise insertiert worden war, dass HBs cDNA unter Kontrolle des CAG-Promotors exprimiert wird.
3) Die folgenden Verfahren wurden durchgeführt, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das die HBs-Expressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält. Das Plasmid pCAG·HBs wurde mit SapI und SalI verdaut, gefolgt vom Auffüllen mit Klenow-Enzym. Dann wurde das erhaltene Produkt einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, um ein 3,6 kb DNA-Fragment zu gewinnen. Das Plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt und dann mit dem 3,6 kb DNA-Fragment in einem molaren Verhältnis von ungefähr 1:3 gemischt. Das Gemisch wurde ligiert, um das gewünschte Plasmid pUC18CAHBsS zu bekommen.
4) Als nächstes wurden die folgenden Verfahren durchgeführt, um die loxP-Schnittstellen an die beiden Enden des DNA-Fragments anzufügen, welches die HBs-Expressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält. Das Plasmid pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wurde mit dem Restriktionsenzym Ecl136II verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das erhaltene Produkt wurde mit dem folgenden synthetischen DNA-Fragment (SEQ ID NO: 3) ligiert, das die loxP-Sequenz trägt, welche die MluI-Schnittstelle und die XhoI-Schnittstelle an den Enden hat, und so entworfen wurde, dass es NruI-Stellen aus jeder der MluI- und XhoI-Schnittstellen nach der Ligierung bildet. Auf diese Weise wurde das Plasmid pULL2r gewonnen, bei dem die zwei synthetischen DNA-Fragmente inseriert worden waren. Synthetisches DNA-Fragment
Die unterstrichene Sequenz zeigt die loxP-Stelle an. Das pUC18CAHBsS, das im obigen 3) gewonnen worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und Ecl136II verdaut. Nachdem das verdaute Produkt mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt worden war, wurde das erhaltene Produkt einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, und ein 3,6 kb DNA-Fragment wurde gewonnen. Das Plasmid pULL2r wurde mit dem Restriktionsenzym NruI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das so behandelte Plasmid wurde mit dem 3,6 kb DNA-Fragment ligiert, um das gewünschte Plasmid pULCA·HBsS zu erhalten.
5) Die folgenden zwei DNAs wurden hergestellt, um ein rekombinantes Cosmid mit einem DNA-Fragment mit loxP-Seiten an beiden Enden zu gewinnen, wobei das Fragment die HBs-Expressionseinheit und den Replikationsursprung von SV40 enthält. (a) Das Plasmid pULCA·HBsS wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI und EcoRI verdaut, gefolgt vom Glätten der Enden mit Klenow-Enzym. Dann wurde das Produkt einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, um 0,3 μg eines 3,7 kb DNA-Fragments zu gewinnen. (b) Das Plasmid pAdex1cw [SAIBO KOGAKU (cell Engineering), 13, 760–763, 1994] wurde mit dem Restriktionsenzym SwaI verdaut, um 1 μg des verdauten Produktes zu erhalten.

Die zwei in dem obigen Schritt (a) und (b) erhaltenen DNA-Produkte wurden gemischt, und das Gemisch wurde in gleicher Weise wie in dem Verfahren in Beispiel 1, (1), 2) bis 9) behandelt, um das gewünschte rekombinante Cosmid zu erhalten.
Der gewünschte rekombinante adenovirale Vektor AdexlLCAHBsSL, der die zwei loxP-Sequenzen enthält und weiter den Replikationsursprung von SV40, den CAG-Promotor und das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBs) trägt, von denen jedes zwischen den zwei loxP-Sequenzen lokalisiert ist, wurde durch ähnliche Verfahren wie die des Beispiels 1, (2) und (3) erhalten.
Beispiel 3 Infektionsexperiment
COS-1-Zellen oder CV-1-Zellen wurden in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm kultiviert, bis die Zellen die gesamte Bodenoberfläche der Schale bedeckten.
Die in Beispielen 1 und 2 erhaltenen adenoviralen Vektoren wurden über eine Stunde bei einer m.o.i. von = 5 adsorbiert, gemäß dem folgenden Protokoll. Drei Tage später wurden die Zellen geerntet, um sie einer Southern-Blot-Analyse zu unterwerfen.
Das heißt, dass der rekombinante adenovirale Vektor AdexlLCAHBsSL eine HindIII-Schnittstellt von ungefähr 6,0 kb trägt und ein 3,5 kb zirkuläres DNA-Molekül nach der Spaltung mit der Rekombinase Cre und den loxP-Seiten bildet. Da dieses zirkuläre DNA-Molekül eine HindIII-Schnittstelle hat, wurden die gewonnen DNAs, die mit HindIII behandelt worden waren, durch Southern-Blot analysiert. Ein 710 bp HBs-Fragment wurde als Sonde verwendet.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie klar aus der 1 erkennbar wird, wurde eine lineare 3,5 kb DNA, die durch den Verdau des zirkulären DNA-Moleküls mit HindIII hergestellt wurde, in den Spuren 4 und 8 nur beobachtet, wenn die Transfektion mit der Kombination der zwei adenoviralen Vektoren, die in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurden, durchgeführt wurde.
Wenn sie mit dem adenoviralen Vektor der in Beispiel 2 und dem adenoviralen Vektor, der kein Rekombinase-Cre-Gen trägt, transfiziert wurden, wurde die 3,5 kb-Bande nicht beobachtet, sondern nur eine 6.0 kb-Bande, welche von AdexlLCAHBsSL durch Ausschneiden mit HindIII in Spuren 3 und 7 stammt.
Des weiteren zeigt ein Vergleich der Bandendichte zwischen den Spuren 7 und 8, dass das zirkuläre DNA-Molekül sich in den transfizierten COS-1-Zellen 40mal autonom replizierte. Andererseits weist die Tatsache, dass die Dichte der Spur 3 fast die gleiche war wie die der Spur 4 darauf hin, dass das zirkuläre DNA-Molekül sich nicht innerhalb der CV-1-Zellen replizierte. Dies stimmt damit überein, dass der Replikationsursprung, der von SV40 stammt, nicht in CV-1-Zellen funktionieren kann.
Die vorher erwähnten Ergebnisse machen es offensichtlich, dass wenn eine tierische Zelle mit einer Kombination aus den zwei adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung, die in den Beispielen 1 und 2 gewonnen wurden, das zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen in dem Vektor liegende fremde Gen ausgeschnitten wird, um ein zirkuläres DNA-Molekül zu bilden, und das zirkuläre DNA-Molekül sich innerhalb der transfizierten Zelle repliziert.
Die oben beschriebenen Infektionsexperimente werden einfach wie folgt durchgeführt.
Wenn das Serum in dem Medium nicht FCS ist (wenn es z.B. CS ist), werden die kultivierten Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen.
Die virale Lösung (verdünnt mit serumfreiem oder FCS-supplementiertem Medium) wird während der Verfahren in einer solchen Menge zugegeben, dass die Zelloberfläche nicht ausgetrocknet wird. Die Menge beträgt ungefähr 30 bis 40 μl in einer 96-Well-Mikroplatte, 50 bis 70 μl für eine 24-Well-Mikroplatte und 100 bis 200 μl in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Es ist praktisch vorteilhaft, das Medium bewußt in einer geringen Menge vor dem Supplementieren des verbleibenden Mediums zu lassen, um das oben angegebene Volumen herzustellen.
Indem die Platte mehrere Male in wenigen Sekundenintervallen, hin- und hergeschüttelt wird, verteilt sich die virale Lösung gleichmäßig auf den Zellen. Dieser Arbeitsschritt wird dreimal alle 20 Minuten durchgeführt, und während des Arbeitsschritts sollten die Zellen in einen CO₂-Inkubator gegeben werden.
Nachdem der dritte Arbeitsschritt beendet wurde (eine Stunde nach der Transfektion), wird eine konventionelle Menge an Kulturflüssigkeit hinzugegeben, um eine konventionelle Inkubation durchzuführen. Die Dauer der Transfektion beträgt im allgemeinen eine Stunde und es sind höchstens 2 Stunden für diesen Zweck ausreichend.
Erfindungsgemäß werden rekombinante adenovirale Vektoren bereitgestellt, die in eine Vielzahl von Tierzellen in einer solchen Weise transfiziert werden können, dass ein Fremdgen in der Lage ist, sich in den transfizierten Tierzellen autonom zu replizieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein einfaches Verfahren zum Herstellen der rekombinanten adenoviralen Vektoren bereit. Die rekombinanten adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich zur Behandlung von Erbkrankheiten.

Claims

Rekombinanter adenoviraler Vektor zum Transfizieren einer menschlichen oder tierischen Zelle, umfassend einen Promotor, ein Rekombinasegen und ein Polyadenylierungssignal.
Vektor gemäß Anspruch 1, wobei das Rekombinasegen das Rekombinase-Cre-Gen ist, das vom E.coli P1-Phagen stammt.
Vektor gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei dieser Promotor und das Polyadenylierungssignal ein Hybrid-CAG-Promotor sind, die einen Zytomegalovirusenhancer, einen β-Actinpromotor des Huhns, einen β-Globin-Splicing-Akzeptor des Kaninchens und ein Polyadenylierungssignal umfassen.
Verfahren zum Transduzieren eines fremden Gens in eine menschliche oder tierische Zelle, wobei das Verfahren aus den Schritten besteht: Co-Transfizieren der menschlichen oder tierischen Zelle außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers mit beiden Vektoren a) und b): a) ein rekombinanter adenoviraler Vektor wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht; b) ein rekombinanter adenoviraler Vektor umfassend zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen, einen Replikationsursprung, der von einem Virus oder einer menschlichen oder tierischen Zelle stammt, einen Promotor, ein fremdes Gen und ein Polyadenylierungssignal, wobei dieser Replikationsursprung, Promotor, fremdes Gen und Polyadenylierungssignal alle zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind, wobei einem DNA-Fragment, das diesen Replikationsursprung, Promotor, fremdes Gen und Polyadenylierungssignal enthält, ermöglicht wird, ausgeschnitten zu werden und ein zirkuläres Molekül herzustellen, und Ermöglichen der autonomen Replikation des zirkulären DNA-Moleküls innerhalb der co-transfizierten menschlichen oder tierischen Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei dieser Replikationsursprung, Promotor, fremdes Gen und Polyadenylierungssignal in dieser Reihenfolge von der stromaufwärts gelegenen der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei dieses fremde Gen, Polyadenylierungssignal, Replikationsursprung und Promotor in dieser Reihenfolge von der stromabwärts liegenden der zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei diese Rekombinase-Erkennungssequenz loxP kodiert, welche ein Substrat der Rekombinase Cre ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei dieser Replikationsursprung ausgewählt ist aus den Replikationsursprüngen von Papovavirus und Herpesvirus.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei dieser Promotor und das Polyadenylierungssignal ein Hybrid-CAG-Promotor sind, der einen Zytomegalovirusenhancer, einen β-Actinpromotor des Huhns, ein β-Globin-Splicing-Akzeptor des Kaninchens und ein Polyadenylierungssignal umfasst.
Eine Kombination der Vektoren a) und b) zur Verwendung bei der Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers durch eine Therapie: a) ein rekombinanter adenoviraler Vektor, wie er in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird; und b) ein rekombinanter adenoviraler Vektor umfassend zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen, einen Replikationsursprung, der von einem Virus oder einem Menschen oder einer Tierzelle stammt, einen Promotor, ein fremdes Gen und ein Polyadenylierungssignal, wobei dieser Replikationsursprung, Promotor, Fremdgen und das Polyadenylierungssignal alle zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.
Kombination der Vektoren a) und b) zur simultanen oder sequenziellen Verwendung in der Gentherapie: a) ein rekombinanter adenoviraler Vektor, wie er in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird; und b) ein rekombinanter adenoviraler Vektor umfassend zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen, einen Replikationsursprung, der von einem Virus oder einem Menschen oder einer Tierzelle stammt, einen Promotor, ein fremdes Gen und ein Polyadenylierungssignal, wobei dieser Replikationsursprung, Promotor, Fremdgen und das Polyadenylierungssignal alle zwischen den zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen lokalisiert sind.