KR100379654B1 - 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 - Google Patents

동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 Download PDF

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Abstract

프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 재조합 DNA 바이러스 벡터, 및 두개의 리컴비나제 - 인식 서열과 추가로 그 외에 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하며 그 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열 모두는 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 모두로 동물 세포를 공 - 형질 감염시킨다. 그런 후, 공 - 형질 감염된 동물 세포에서, 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 DNA 절편을 또 다른 벡터에서 발현된 리컴비나제의 작용에 의하여 그 벡터로부터 절단한다. 그 DNA 절편은 복제 기원으로 인해 공 - 형질 감염된 동물 세포에서 자가적으로 복제되는 환상의 DNA 분자를 형성하여, 외부 유전자가 계속해서 발현된다.
따라서, 환자에게 결함이 있는 유전자를 외부 유전자로 사용하는 상기 두 DNA 바이러스 벡터의 조합은 유전적 질병을 가진 환자의 치료에 특별히 유용하다.

Description

동물 세포의 형질 감염을 위한 재조합 DNA 바이러스 벡터
본 발명은 동물 세포의 형질 감염을 위한 재조합 DNA 바이러스 벡터에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 리컴비나제 유전자 또는 리컴비나제 인식 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 바이러스 벡터, 그 벡터를 사용하여 외부 유전자를 동물 세포로 형질 도입하는 방법 및 이 벡터의 유전자 치료에서의 용도에 관한 것이다.
레트로바이러스 (retrovirus) 는 유전자 형질 도입을 위한 바이러스 벡터로 종종 사용되어 왔다. 그러나, 레트로바이러스는 오직 체세포 분열 세포에만 형질 감염되어 숙주 세포의 염색체로 삽입되며 그러므로, 바이러스 벡터로서의 레트로바이러스는 안정성, 특히 유전자 치료의 관점에서 문제가 있다. 따라서, 레트로바이러스는 바이러스 벡터로서는 제한되게 사용되어야 한다.
아데노바이러스 벡터는 다양한 동물 배양 세포에서 거의 100 % 의 형질 도입율을 나타내고, 레트로바이러스와 달리 염색체로의 삽입에 어떠한 양성 기작도 가지지 않으며 휴지기의 세포에 조차 유전자를 형질 도입할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러한 이점으로, 아데노바이러스 벡터는 외부 유전자를 형질 도입하기 위한 시도의 경우 극단적으로 넓은 분야에 적용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 가까운 장래에는 아데노바이러스 벡터를 유전자 치료의 중요한 기술중의 하나로 사용하는 것이 입증될 수 있을 것이다.
아데노바이러스 벡터는 유전자 치료용 또는 신경계 세포와 같이 고도로 분화된 세포에서의 발현 연구용 기술중 하나로 널리 이용되어 왔다. 유전자 치료 기술의 경우, 살아있는 세포내 결함이 있는 유전자를 그 세포가 존재하는 조직 내에 유전자를 직접 주입함으로써 세포로 형질 도입하는 생체내 유전자 치료가 광범위하게 연구되었다. 미합중국에서, 5 개의 연구 그룹들이 생체내 유전자 치료를 사용하여 낭포성 섬유증의 환자를 치료하기 위한 임상 실험을 수행하도록 이미 허가받았다. 더욱이, 유전자 치료의 연구는 이미 근위축증, 가족성 고콜레스테롤 혈증 및 뇌암으로 확장되고 있다. 한편, 아데노바이러스 벡터는 휴지기 세포에게 조차도 유전자를 형질 도입할 수 있다. 그러므로, 아데노바이러스 벡터는 1 차 배양 세포 또는 동물체로의 유전자 형질 도입에 관한 실험을 수행할 때에, 분화된 세포, 특별히 신경계 세포로 유전자의 형질 도입에 이용되어 왔다.
장래에, 아데노바이러스 벡터가 신경계 세포를 포함한 다양한 미분화 및 분화 세포로 유전자를 형질 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 직접 동물체로 주입 또는 투여함으로 유전자를 발현할 수 있기 때문에 그 벡터가 특별히 유전자 치료에 사용될 수 있을 것이 크게 기대된다.
그러나, 레트로바이러스와 달리, 아데노바이러스 벡터는 염색체로의 삽입에 어떠한 양성 기작도 없으므로 벡터 내의 유전자의 발현은 단지 일시적으로 발생한다. 즉, 발현은 단지 수주일 동안만 계속되고, 기껏해야 약 2 개월간이다. 따라서, 치료 효과가 유지되어야 할때, 계속적인 발현을 위하여 벡터의 주입 또는 투여가 반복되어야 한다. 그러나, 반복된 주입 또는 투여는 항체의 생성을 유도하여 치료 효과를 감소시킬 수도 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 아데노바이러스 벡터를 사용하여 외부 유전자를 동물 세포로 형질 도입하고 세포 내에서 자가 복제를 할 수 있는 형태로 전환시킴을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터 체계를 제공하는 것이다. 본 발명의 더 나은 목적은 유전자 치료를 위한 그러한 체계를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 많은 연구를 수행하여 하기의 재조합 아데노바이러스 벡터 체계를 수득하는데 성공하였다:
아데노바이러스 벡터를 사용하여 외부 유전자를 포함하는 발현 단위를 세포 내로 형질 도입하고, 리컴비나제 유전자 및 리컴비나제 인식 서열을 사용하여 환상의 DNA 분자로 전환시키고;
그렇게 형성된 환상의 DNA 분자에 복제 기원을 더 도입하여, 외부 유전자를 포함하는 유전자 발현 단위가 자가 복제되어 세포 내에서 계속해서 외부 유전자가 발현될 수 있다.
여기에서 용어 "리컴비나제" 는 수십개의 염기쌍으로 이루어진 특이 DNA 서열을 인식하여 그 서열을 절단하고, 이같은 절단으로 형성된 DNA 절편을 변화시켜 그 절편들을 재결찰시켜 새로운 DNA 서열을 만들 수 있는 특이 재조합 DNA 효소로 간주된다. 따라서, 리컴비나제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 동일한 배향으로 리컴비나제 인식 서열의 두 카피 (copy) 를 가지는 재조합 아데노바이러스 벡터 모두를 구축하고, 두 벡터 모두를 세포내로 공 - 형질 감염시키면, 리컴비나제가 벡터에서 발현되어, 또 다른 벡터의 두 리컴비나제 인식 서열을 절단하고, 두 리컴비나제 인식 서열 사이에 존재하고 리컴비나제에 의하여 벡터로부터 절단된 DNA 절편으로부터 환상의 DNA 분자가 형성되는 재구축이 일어난다. 그러므로, 그러한 DNA 절편이 도입된 외부 유전자 및 복제 기원을 가지는 발현 단위를 가질 때, DNA 절편은 환상의 DNA 분자로 전환된 이후에 자가 복제를 하고, 세포 내에서 영구적으로 유지되어 외부 유전자를 계속해서 발현한다. 따라서, 그러한 재조합 아데노바이러스 벡터 체계를 유전자 치료에 적용한다면 치료 효과는 그러한 벡터의 1 회의 주입 또는 투여로 장시간 지속될 수 있다.
이러한 새로운 발견으로, 본 발명을 달성하기 위하여 더 많은 연구가 수행되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 프로모터 (promoter), 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하는 동물 세포의 형질 감염용 재조합 DNA 바이러스 벡터 (1) 을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (1) 에 따라, 상기 DNA 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 재조합 DNA 바이러스 벡터 (2) 를 제공하는 것이다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (2) 에 따라 상기 리컴비나제 유전자가 대장균 (E. coli) P1 파지로부터 유래하는 리컴비나제 Cre 유전자임을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (3) 을 제공하는 것이다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 목적은 두 개의 리컴비나제 - 인식 서열, 동물 세포에서 작용할 수 있는 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하며 이들 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열 모두가 두 리컴비나제 - 인식 서열의 사이에 위치하는 동물 세포의 형질 감염용 재조합 DNA 바이러스 벡터 (4) 를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (4) 에 따라, 상기 DNA 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터임을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (5) 를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 벡터 (5) 에 따라, 두 리컴비나제 - 인식 서열중의 하나의 상류 (upstream) 쪽에서 상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열이 순서대로 위치함을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (6) 을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (5) 에 따라, 두 리컴비나제 - 인식 서열중의 하나의 상류 (upstream) 쪽에서 상기 외부 유전자, 폴리 (A) 서열, 복제 기원 및 프로모터가 순서대로 위치함을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (7) 을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (4) 내지 (7) 중 어느 하나에 따라 상기 리컴비나제 - 인식 서열이 리컴비나제 Cre 의 기질인 loxP 를 코딩하는 DNA 서열임을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (8) 을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (4) 내지 (8) 중 어느 하나에 따라, 상기 복제 기원이 바이러스 또는 동물 세포로부터 유래됨을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (9) 를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (9) 에 따라, 상기 복제 기원이 파포바바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 천연두바이러스 및 파르보바이러스로부터 유래하는 복제 기원으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터(10)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따라, 상기 프로모터 및 폴리 (A) 서열이 사이토메갈로바이러스 인핸서 (enhancer), 닭의β- 액틴 프로모터 및 토끼β- 글로빈 스플라이싱 (splicing) 억셉터 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 하이브리드 (hybrid) 프로모터 (CAG 프로모터) 에 포함됨을 특징으로 하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 (11) 을 제공하는 것이다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포로의 외부 유전자의 형질 도입하는 방법을 제공하는 것이다:
프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 재조합 DNA 바이러스 벡터, 및 두개의 리컴비나제 - 인식 서열, 동물 세포에서 작용할 수 있는 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하며 상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열 모두는 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 재조합 DNA 바이러스 벡터 모두를 동물 세포로 공 - 형질 감염시키고;
상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하는 DNA 절편을 절단하여 환상의 DNA 분자를 만들고;
상기 환상의 DNA 분자를 공 - 형질 감염된 동물 세포 내에서 자가 복제시킨다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법 (12) 에 따라, 상기 두 DNA 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터임을 특징으로 하는 외부 유전자를 동물 세포로 형질 도입하는 방법 (13) 을 제공하는 것이다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 목적은 유전자 치료에 있어서 상기 방법 (12) 또는 (13) 을 사용하는 것을 특징으로 하는 인간 유전자를 세포로 형질 도입하는 방법을 제공하는 것이다.
제 1 도는 다양한 재조합 아데노바이러스 벡터의 조합으로 COS - 1 세포 또는 CV - 1 세포를 형질 감염시키고, 형질감염된 세포로부터 DNA 를 회수하고, 회수된 DNA 를 Hind Ⅲ 으로 절단하고 처리된 DNA 를 전기 영동을 수행하여 DNA 절편을 분획하고 서던 블러팅 (Southern blotting) 으로 분석한 결과를 나타낸다. 제 1 도에서, 부호는 하기의 의미이다:
레인 (lane) M : 분자 표식자;
레인 1 : 매질만 첨가한 CV - 1 세포;
레인 2 : 외부 유전자를 가지지 않으며 E3, E1A 및 E1B 부위가 결실된 아데노바이러스 벡터 및 리컴비나제 Cre 유전자 및 CAG 프로모터가 삽입되어 있는 실시예 1 에서 구축된 재조합 아데노바이러스 벡터의 조합으로 형질 감염된 CV - 1 세포;
레인 3 : 외부 유전자를 가지지 않으며, E3, E1A 및 E1B 부위가 결실된 아데노바이러스 벡터 및 실시예 2 에서 구축된 아데노바이러스 벡터 AdexILCAHBsSL 의 조합으로 형질 감염된 CV - 1 세포;
레인 4 : 리컴비나제 Cre 유전자 및 CAG 프로모터가 삽입된 실시예 1 에서 구축된 재조합 아데노바이러스 벡터 및 벡터 AdexILCAHBsSL 의 조합으로 형질 감염된 CV - 1 세포;
레인 5 : 레인 1 에서와 동일한 방법으로 형질 감염된 COS-1 세포;
레인 6 : 레인 2 에서와 동일한 방법으로 형질 감염된 COS-1 세포;
레인 7 : 레인 3 에서와 동일한 방법으로 형질 감염된 COS-1 세포;
레인 8 : 레인 4 에서와 동일한 방법으로 형질 감염된 COS-1 세포.
본 발명은 하기에 더욱 자세하게 설명된다.
본 발명에서 사용되는 DNA 바이러스 벡터는 감염 후, 염색체 외부에만 존재할 수 있는 아데노바이러스와 같은 DNA 바이러스로부터 유래하는 어떠한 벡터일 수도 있다. 그러한 DNA 바이러스 유래 벡터는 어떠한 제한도 없이 사용될 수 있다. 그러한 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 왁진바이러스 벡터 및 파포바바이러스 벡터가 포함된다.
이하, 본 발명은 동물 세포의 형질 감염을 위한 DNA 바이러스 벡터의 바람직한 예이며, 리컴비나제 유전자 또는 리컴비나제 - 인식 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 참고로 하여 설명된다.
본 발명에서 사용된 아데노바이러스는 자연 숙주로 동물을 이용하는 아데노바이러스이며, 특별히 바람직한 아데노바이러스는 숙주로 인간을 이용하는 인간 아데노바이러스이다. 인간 아데노바이러스 게놈 (genome) 은 약 36 kbp 의 이중 가닥의 선형 DNA 이며, DNA 가닥이 양쪽 끝에 약 100 bp 의 인버트 (invert) 반복 서열을 갖고 DNA 가닥이 E2B 유전자 산물로부터 프로세싱되고 DNA 가닥의 양쪽 끝의 각각의 5'말단에 공유적으로 결합한 두개의 55 k 단백질을 더 가지는 독특한 구조를 가진다.
본 발명에서 사용되는 아데노바이러스의 게놈은 E1 부위, 특별히 E1A 부위가 결실된다. 이것은 아데노바이러스의 신생의 형질 전환 활성과 관련된 E1A 부위의 결실로, 아데노바이러스가 비병원성이 되고, 오직 게놈 내에 삽입된 외부 유전자만이 선택적으로 발현되기 때문이다. 온전한 E1A 부위가 결실될 필요는 없으며, 부분적인 E1A 부위의 결실, 특별히 E1A 부위에서 1.3 내지 9.3 % 단편의 결실만으로 상기 서술한 원하는 목적을 달성할 수 있다.
더욱이, 본 발명에서 사용되는 아데노바이러스의 게놈은 또한 E3 부위가 결실될 수도 있다. 특별히, 그 부위가 아데노바이러스의 복제의 필수 불가결한 부분이 아니기 때문에, E3 부위에서 79.6 내지 84.8 % 절편의 결실이 바람직하다.
그러므로, 본 발명에서 사용되는 아데노바이러스는 E1A 및 E1B 유전자가 항구적으로 발현되는 태아 신장 유래 세포주 (293 세포주) 의 경우를 제외하고 일반적인 숙주 세포에서 증식할 수 없는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 재조합 아데노바이러스 벡터 입자는 야생 세포주에서처럼, 108∼ 109pfu (플라크 형성 단위) / ml 의 높은 양적 수준으로 293 세포주에서 증식할 수 있다. 다른 세포 또는 동물 조직에 형질 감염되었을 경우, 바이러스 입자는 고 효율로 세포속으로 침입하고, 바이러스 게놈이 핵으로 전달된다. 그러나, 아데노바이러스 벡터는 E1A 유전자가 없기 때문에, E1A 유전자 산물에 의하여 활성화되는 벡터 본래의 아데노바이러스 프로모터가 작동할 수 없게 된다. 한편, 아데노바이러스 게놈에 삽입된 외부 유전자는 아데노바이러스 게놈에 또한 삽입된 외부 프로모터에 의하여 전사될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 재조합 아데노바이러스 입자는 본래의 아데노바이러스 게놈에 의하여 야기되는 부작용을 최소화할 수 있고, 재조합 아데노바이러스 벡터의 외부 유전자는 다양한 종류의 동물 세포에서 효율적으로 발현될 수 있다.
인간 아데노바이러스 야생주가 감염 후 오직 인간 세포에서만 증식될 수 있음에도 불구하고, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 외부 유전자는 더 넓은 범위의 세포 및 조직에서 발현될 수 있다. 이것은 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 재조합 아데노바이러스 입자가 감염시키고 세포 내로 침투할 수 있는 한, 일반적인 아데노바이러스가 증식할 수 없는 세포에서조차 발현 벡터로써 효율적으로 기능하기 때문이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에서의 게놈은 염색체외에서 복제될 수 없으며, 단지 두 주일 내지 두 달 동안만 핵내에서 유지된다. 따라서, 장기간에 걸쳐 외부 유전자의 발현을 위해서는 재조합 아데노바이러스의 반복투여가 요구된다. 그러나, 이러한 경우 항체의 생성이 유도될 수도 있다는 문제가 야기된다.
본 발명에 따라서, 리컴비나제 유전자를 가지는 신규의 재조합 아데노바이러스가 구축되고, 한편으로는 리컴비나제의 기질인 두 리컴비나제 - 인식 서열을 포함하고, 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 목적의 외부 유전자와 복제 기원을 더 함유하는 또 다른 신규의 재조합 아데노바이러스가 또한 구축된다.
두 재조합 아데노바이러스는 리컴비나제가 발현될 동물 세포로 공 - 형질 감염된다. 그런 후, 리컴비나제가 두 리컴비나제 - 인식 서열에 작용하여 절단하고, 환상의 DNA 분자를 형성한다. 따라서, 그렇게 형성된 외부 유전자 및 복제 기원을 포함하는 환상의 DNA 분자는 공 - 감염된 세포 내에서 자가 복제를 하여, 외부 유전자의 발현이 계속될 수 있다.
본 발명에서 사용된 프로모터로 동물 바이러스성 유전자 프로모터 및 동물 세포성 유전자 프로모터가 있다. 동물 바이러스성 유전자 프로모터의 예로는 SV 40 유전자 프로모터 및 아데노바이러스 주동 후기 유전자 프로모터가 포함된다. 동물 세포성 유전자 프로모터의 예로는 티미딘 키나제 유전자 프로모터, 메탈로티오네인 유전자 프로모터 및 면역글로블린 유전자 프로모터가 포함된다. 특별히, 본 발명에서 이로운 프로모터는 CAG 프로모터이다. CAG 프로모터는 사이토메갈로 바이러스 인핸서, 닭β- 액틴 프로모터, 및 토끼β- 글로빈 스플라이싱 억셉터 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 하이브리드 프로모터이다. CAG 프로모터는 고 발현 벡터로 일본국 특허 출원 공개 번호 3 (1991) - 168087 에 보고되어 있다. CAG 프로모터는 상기 공개 명세서 13 쪽 20 줄 ∼ 20 쪽 14 줄, 및 22 쪽 1 줄 ∼ 25 쪽 6 줄에 기재된 플라스미드 pCAGGS 를 제한 효소 SalI 및 Hind Ⅲ 로 절단하여 구축될 수 있다. 그렇게 구축된 CAG 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 리컴비나제는 특이 DNA 재조합 효소이며, 특이 DNA 서열을 인식하여, 그 서열을 절단하고, 그 결과의 DNA 절편을 변경하여 이 절편들을 재결찰시킬 수 있다. 그러한 효소로, 대장균의 박테리오파지 P1 에 의하여 코딩되는 리컴비나제 Cre 가 있다. 이러한 효소의 기질은 박테리오파지 P1 에서 loxP 의 DNA 서열이다 [아브람스키 일행, J. Biol. Chem., 1984, 1509 - 1514 및 호에스 일행, P.N.A.S., 1984, 81, 1026 - 1029]. 즉, loxP DNA 서열은 리컴비나제 Cre 에 대한 인식 서열이다. 리컴비나제의 또 다른 예는 효모 2μ- 플라스미드 유래의 FLP 유전자에 의하여 코딩되는 리컴비나제이다 [브로우치 일행, Cell, 29, 227 - 234]. 더욱이,쉬조사카로마이세스 룩시(Schizosaccharomyces luxii) 의 pSR1 플라스미드 유래의 리컴비나제가 또한 사용될 수 있다. 이러한 리컴비나제는 R 유전자에 의하여 코딩된다 [마쯔자끼 일행, Molecular and Cellular Biology, 8, 955 - 962 (1988)]. 그것들 중에서 박테리오파지 P1 유래 리컴비나제인 리컴비나제 Cre 가 특별히 본 발명에 바람직하다.
리컴비나제 Cre 유전자는 박테리오파지 P1 DNA 에서의 리컴비나제를 코딩하는 서열을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 을 사용하여 증폭함으로 제조할 수 있다. 다른 리컴비나제 유전자도 유사한 방법의 PCR 법에 의하여 제조할 수 있다. PCR 법에 사용되는 프라이머 (primer) 는 온전한 리컴비나제를 코딩하는 서열을 증폭할 수 있는 것으로 선택된다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 편리하게 구축하기 위하여 각 프라이머의 끝에 적당한 제한 효소 부위를 가지는 프라이머를 제공하는 것이 바람직하다.
리컴비나제의 인식 서열은 일반적으로 수 십개의 염기쌍이다. 예를 들면, loxP 서열은 34 bp 로 구성되며, 그 뉴클레오티드 서열의 특성은 규명되었다 [아브렘스끼 일행, J. Biol. Chem., 1984, 1509 - 1514 및 호에스 일행, P.N.A.S., 1984, 81, 1026 - 1029]. 따라서, 리컴비나제 유전자는 종래의 방법에 의하여 화학적으로 합성되어, 본 발명에 사용되도록 제공될 수 있다.
본 발명에 사용되는 폴리 (A) 서열은 특별히 제한되지 않으나, 토끼β- 글로빈 유래 서열이 특별히 바람직하다.
본 발명에서, 리컴비나제 유전자와 함께 핵 전달 신호 서열을 아데노바이러스 벡터로 도입하는 것이 바람직하다. 세포로 아데노바이러스 벡터의 형질 감염 이후에, 리컴비나제는 세포의 핵에서 전사되고 세포의 핵외로 방출된다. 따라서, 발현된 리컴비나제가 또다른 아데노바이러스 벡터의 리컴비나제 - 인식 서열에 작용하기 위하여, 리컴비나제는 다시 핵으로 전달되어 되돌아가야만 한다. 핵 전달 신호 서열은 핵으로의 리컴비나제 전달을 가속화한다 [다니엘 칼데론 일행, Cell, 39, 499 - 509, 1984].
동물 세포에서 작용할 수 있는 본 발명에서 사용되는 복제 기원으로, 바이러스 및 동물 세포에서 유래한 것이 있다. 바이러스 유래의 복제 기원의 예로는 파포바바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 천연두 바이러스, 파르보바이러스가 포함된다. 파르보바이러스 유래의 복제 기원으로는 SV 40 으로부터 유래한 복제 기원이 있다.
이러한 복제 기원이 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터로 도입되어, 리컴비나제에 의하여 절단된 환상의 DNA 분자가 감염된 세포에서 자가 복제될 수 있게 된다.
본 발명에서 사용되는 외부 유전자는 그 유전자가 상기 언급된 하이브리드 프로모터 (CAG 프로모터) 또는 다른 프로모터의 조절 하에 발현되는 한 어떠한 특별한 제한도 없다. 실제적인 이용의 관점에서 바람직한 예로는 아데노신 디아미나제, 디스트로핀 (dystrophin), 저밀도 지단백질 수용기,α- 1 항트립신, 혈액 응집 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ, 및 갈락토시다제α또는β와 같은 환자에게 있어 결함이 있는 정상 유전자; 사이토카인 예컨대 인터루킨 1 내지 12, 인터페론 -α,β또는r, 종양 괴사 인자 -α또는β, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자; 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 성장 호르몬, 인슐린 및 인슐린 유사 성장 호르몬; 신경 영양 인자; 알로 - HLA (HLA - B7) 와 같은 비자기 항원 유전자; 바이러스 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; p53, RB, WT - 1, NM 23 및 NF - 1 과 같은 항종양 유전자; Ras 서열과 같은 종양 유전자의 안티센스 (antisense); 및 티미딘 키나제 및 시토신 디아미나제와 같은 자살 (suicide) 유전자가 포함된다.
복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열은 아데노바이러스 벡터에서 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 삽입되고, 일반적으로 이러한 순서로 두 리컴비나제 - 인식 서열 중의 하나의 상류로부터 위치한다.
그러나, 외부 유전자, 폴리 (A) 서열, 복제 기원 및 프로모터의 순서로 두 리컴비나제 인식 서열중의 하나의 상류쪽으로부터 또한 위치할 수 있다. 리컴비나제에 의하여 아데노바이러스 벡터로부터 형성된 환상의 DNA 분자에 그것들이 포함되면, 상기 두 순서는 서로 구별될 수 없다.
본 발명을 유전자 치료에 적용할 때, 동물 세포는 리컴비나제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 두 개의 리컴비나제 - 인식 서열을 함유하며, 그 외에 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 더 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터로 공 - 형질 감염된다. 두 벡터의 형질 감염은 동물 세포로 형질 감염되는 DNA 벡터가 1 개월 이상 안정하게 유지되기 때문에 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
세포 내로 공 - 형질 감염된 뒤에, 리컴비나제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 특정 기간 동안 리컴비나제를 계속해서 발현하고, 그럼으로 리컴비나제가 계속해서 합성된다. 합성된 리컴비나제는 두 리컴비나제 - 인식 서열을 함유하는 또 다른 공 - 형질 감염된 재조합 아데노바이러스 벡터에 작용하여 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 DNA 절편을 절단하여 환상의 DNA 분자를 형성한다. 환상의 DNA 분자는 동물 세포에서 작동할 수 있는 복제 기원을 가지며, 따라서 공 형질 감염된 세포에서 자가 복제하여 계속해서 외부 유전자가 발현된다. 따라서, 단지 1회의 두 아데노바이러스 벡터의 공 - 형질 감염으로 거의 영구히 목적의 치료 효과를 계속해서 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 유전자 치료에 매우 효과적인 것으로 여겨진다.
본 발명에 따른 유전자 치료는 고도로 분화된 인간 및 포유류의 동물 신경계 세포, 근육계 세포, 간 세포, 미분화 상피 세포 및 섬유아 세포와 같은 넓은 범위의 인간 및 동물 세포에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 구축하는 방법을 하기에 설명한다.
1. 첫번째로, 프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축 방법을 하기에 설명한다.
상기 설명한 바 대로 아데노바이러스 게놈이 그 양 끝에 공유적으로 결합된 단백질을 가지기 때문에, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 구축하는 것은 매우 어렵다.
그러므로, 본 발명에서는 리컴비나제 유전자로 리컴비나제 Cre 유전자를 참고로 한 하기 방법이 바람직하게 사용된다. 그 방법은 또한, 유사한 방법으로 다른 리컴비나제 유전자에 또한 적용할 수 있다.
(1) PCR 법에 의하여 증폭된 리컴비나제 Cre 유전자 및 플라스미드 pUC 19 (다까라 스조 사, 일본국) 를 동시에 제한효소 Pst I 및 Xba I (다까라 스조, 일본국) 으로 절단한다. 그 결과의 생성물을 혼합하고 결찰시켜 리컴비나제 Cre 유전자가 도입된 플라스미드 pUCCre 를 수득한다.
(2) SAIBO KOGAKU (세포 공학),13, 760 - 763 (1994) 에 기재된 방법에 의하여 제조된 CAG 프로모터를 함유하는 카세트 코스미드 (cassette cosmid) pADexlCAwt 를 제한 효소 SwaI (베링거 멘하임, 독일) 으로 절단한다. 절단된 생성물을 플라스미드 pUCCre 를 제한 효소 PstI 및 XbaI (다까라 스조 사 제, 일본국)으로 절단하여 수득한 생성물과 혼합하고 클레노우 효소 (다까라 스조 사 제, 일본국)를 보충한다. 그런 다음, DNA 절편을 침전시키고 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰시켜 리컴비나제 Cre 유전자가 도입된 카세트 코스미드를 수득한다.
CAG 프로모터 외에 다른 프로모터가 사용될 경우에, 먼저 온전한 길이의 아데노바이러스 게놈 (36 kb) 으로부터 복제에 필수적이지 않는 E3 부위 (1.9 kb) 및 E1A·E1B 부위 (2.9 kb) 가 결실된 약 31 kb 의 게놈 DNA 를 함유하는 카세트 코스미드를 제조한다. 한편으로 프로모터, 리컴비나제 Cre 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 플라스미드를 제조하고 그 플라스미드를 적절한 제한 효소로 절단하여 리컴비나제 Cre 유전자 발현 단위를 수득한다. 이 발현 단위를 아데노바이러스 게놈의 E1A·E1B 결실 부위에 삽입하여 카세트 코스미드를 수득한다.
(3) 그렇게 수득된 카세트 코스미드를 생체외 패키징 키트 (packaging kit) Gigapack XL (스트라타겐 사 제조, 미합중국) 의 람다를 사용하여 생체 외에서 패키징을 수행한다.
(4) 한편으로는, 아데노바이러스 DNA - 단백질 복합체 (Ad5dlX DNA - TPC) 를 제조한다. 아데노바이러스 DNA 로 벡터 Ad5dlX (사이또 일행, J. Virology, vol. 54, 711 - 719, 1985) 를 사용한다. 벡터 Ad5dlX 를 10 Roux 관의 양으로 헬라 (HeLa) 세포에 감염시키고 배양한다. 바이러스 입자를 회수하고 구아니딘 염화수소로 처리하고 초원심분리를 수행하여 DNA - TPC 복합체를 분리 회수한다.
하기 단계에서 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위하여 그렇게 수득된 Ad5dlX DNA - TPC 복합체를 충분한 양의 EcoT22I 로 처리한다.
(5) 마지막 단계로, 리컴비나제 Cre 유전자가 도입된 카세트 코스미드를 미리 EcoT22I 으로 처리한 Ad5dlX DNA - TPC 복합체와 혼합하고, 그 결과의 혼합물을 인산 칼슘 방법에 따라, Celfect kit (파마시아) 를 사용하여 293 세포로 형질 감염한다. 감염된 바이러스의 증식에 의하여 죽은 세포로부터, 바이러스 용액을 회수하여 프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 수득한다.
2. 두 리컴비나제 인식 서열 및 그 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 더 함유하는 또 다른 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축 방법이 하기에 설명된다. 용이하게 설명하기 위하여 SV 40 의 복제 기원을 사용하는 경우로 그 방법을 설명 한다.
(a) 먼저, 목적의 외부 유전자를 발현하는 카세트 코스미드를 구축한다.
(1) Swa I 링커 (linker) 를 클로닝 부위에 CAG 프로모터 (니와 일행, Gene,108, 193 - 200, 1990) 를 함유하는 플라스미드 pCAGGS 로 삽입하여 플라스미드 pCAWG 를 제조한다. 플라스미드 pCAWG 를 SwaI 으로 절단하고, 염기성 포스파타제를 처리한다. 그런 다음, 목적의 외부 유전자를 그 결과의 pCAWG 와 혼합하고 리가제 (ligase) 로 처리한다. 그 생성물을 사용하여 대장균 DHI 균주 (ATCC 33849) 를 형질 전환하여 CAG 프로모터의 조절하에 외부 유전자를 발현하는 플라스미드를 수득한다.
(2) CAG 프로모터의 조절하에 외부 유전자를 발현하는 외부 유전자 발현 단위 뿐만 아니라 SV 40 복제 기원을 가지는 DNA 절편을 제조한다. 상기 (1) 에서 수득된 플라스미드를 제한 효소 SapI 및 SalI 으로 절단하고, 클레노우 효소를 보충한 뒤, 전기영동을 수행하여 목적의 DNA 절편을 수득한다. 회수된 DNA 절편을 앞서 제한 효소 SmaI 으로 절단한 플라스미드 pUC18 (다까라 스조 사 제, 일본국) 과 혼합하고, 염기성 포스파타제를 처리한다. 그 결과의 생성물을 리가제로 처리하여 외부 발현 단위 및 SV 40 복제 기원을 가지는 플라스미드를 수득한다.
(3) 외부 발현 단위 및 SV 40 복제 기원을 가지는 DNA 절편의 양쪽 끝에 loxP 서열을 붙이기 위하여 하기 절차를 수행한다.
플라스미드 pUC119 를 제한 효소 Ecll36II 로 절단한다. 염기성 포스파타제의 처리 후, 절단된 플라스미드를 양 끝에 MluI 부위 및 XhoI 부위를 가지는 loxP 서열을 포함하며, 결합 후 MluI 부위 및 XhoI 부위로부터 NruI 부위를 형성하도록 고안된 합성 DNA 절편(서열 식별 번호 3)과 결찰시킨다. 그렇게 해서, 두 합성 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 수득한다.
이러한 플라스미드를 제한효소 NruI 으로 절단하고 염기성 포스파타제로 처리 한 후에, 처리된 플라스미드를 상기 (2) 에서 구축된 플라스미드를 제한 효소 SalI 및 Ecll36II 로 절단하여 수득한 DNA 절편과 결찰시키고 보충한다. 따라서, 외부 유전자 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원과 추가로 그 양 끝에 loxP 부위를 함유하는 DNA 절편을 포함하는 플라스미드가 수득된다.
(4) 그런 후, 외부 유전자 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원과 추가로 그 양 끝에 loxP 부위를 함유하는 DNA 절편을 포함하는 재조합 코스미드를 수득하기 위하여 하기 절차를 수행한다.
먼저, 상기 (3) 에서 수득한 플라스미드를 제한 효소 SmaI 및 EcoRI 으로 절단하고, 클레노우 효소를 보충한다. 외부 유전자 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원과 추가로 그 양 끝에 loxP 부위를 함유하는 DNA 절편을 제조하기 위하여 그 산물을 전기 영동상에서 정제한다. 한편으로, 벡터 pAdexlcw [SAIBO KOGAKU (세포 공학), 13, 760 - 763, 1994] 를 제한 효소 SwaI 으로 절단한다. 상기 제조된 절편 및 카세트 코스미드를 혼합하고 침전시킨다. 그 DNA 혼합물을 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 외부 유전자 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원과 추가로 양 끝에 loxP 부위를 함유하는 DNA 절편을 포함하는 카세트 코스미드를 수득한다.
(b) 두 loxP 서열을 함유하고, 그 두 loxP 서열 사이에 위치하는 복제 기원, CAG 프로모터 및 외부 유전자를 더 함유하는 절편을 가지는 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 상기 1. 의 (3) 내지 (5) 와 동일한 방법으로 제조될 수 있다.
프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 SV 40 의 복제 기원, 외부 유전자 발현 단위 및 그 양 끝의 loxP 서열을 함유하는 또 다른 재조합 아데노바이러스 벡터는 유전적 질환을 포함하는 각종 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른두 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는 고 적정량의 바이러스 용액을 적절하게 희석하고, 희석된 용액을 적절한 경로, 즉 국소적으로 (중추 신경계, 문 정맥), 흡입에 의한 경구적으로 (장용 피복을 사용), 피하 등등으로 투여할 수 있다.
지금부터, 실시예 및 참고예를 들어 본 발명을 더욱 자세하게 설명하나, 이것은 그것을 제한하는 것은 아니다.
실시예에서, 파지, 플라스미드, DNA, 각종의 효소, 대장균, 배양세포 등을 조작하기 위한 각종의 절차들이 수행되며, 다른 지시가 없다면 마니아티스 일행의 "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory) 에 기재된 방법에 따라 수행되었다. DNA 제한 효소 및 변형 효소는 다까라 스조 사, 뉴 잉글란드 바이오랩 (NEB), 스트라타겐 또는 베링거에서 구입하여 그 지시에 따라 사용하였다.
실시예 1
리컴비나제 Cre 유전자 및 CAG 프로모터를 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축
(1) 리컴비나제 Cre 유전자를 발현하기 위한 카세트 코스미드의 구축:
1) 주형으로, 리컴비나제 Cre 유전자를 포함하는 대장균 파지 P1 DNA (ATCC 11303 - B23) 를 사용하고, 5' - 프라이머로 하기 올리고뉴클레오티드 (서열 식별 번호 : 1), 3' - 프라이머로 하기 올리고뉴클레오티드 (서열 식별 번호 : 2), 및 폴리머라제로 VentR(NEB) 를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응의 상세한 조건은하기에 설명한다. 그 산물을 아가로스 겔에서 전기 영동을 수행하고, 약 1 kb 를 가리키는 밴드를 아가로스 겔로부터 절제하여 리컴비나제 Cre 유전자를 함유하는 약 1 kb 의 DNA 절편을 수득한다.
5' - 프라이머
3' - 프라이머
밑줄친 부분은 제한 효소의 인식 부위를 표시한다.
PCR 조건
완충용액 : 10 mM KCl, 20 mM 트리스 - HCl (pH 8.8), 10 mM
(NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1 % 트리톤 X - 100
(NEB 로부터 제공된 완충용액 사용)
폴리머라제 : 2 단위
dNTP : 400μM
프라이머 : 1μM
P1 파지 DNA : 1 ng
이중 가닥의 분리 시간 : 1.5 분
어닐링 (annealing) 시간 : 1.5 분
사슬 확장 시간 : 2.0 분
반응 주기 : 20 회
그렇게 수득된 DNA 절편 및 pUC19 (다까라 스조 사, 일본국) 각각을 제한 효소 PstI (다까라 스조 사, 일본국) 및 XbaI (다까라 스조 사, 일본국) 으로 절단하고, 절단된 산물을 회수하여 약 3 : 1 의 몰비로 DNA 절편으로부터의 산물과 pUC19 로부터의 산물을 혼합하였다. 그 혼합물을 T4 DNA 리가제(다까라 스조 사, 일본국)를 사용하여 결찰시켰다. 그 반응 혼합물을 대장균 JM109 균주(ATCC 53323) 를 형질 전환하는데 사용하였다. 그 처리된 대장균 세포를 100 ㎍ / ml 의 암피실린이 보충된 LB 한천 배양판에 접종하고, 한천 위에 증식한 형질 전환체를 선별하여 리컴비나제 Cre 유전자를 포함하는 플라스미드 pUCCre 를 수득하였다.
다음에, SAIBO KOGAKU (세포 공학),13, 760 - 763 (1994) 에 기재된 방법에 따라 제조된 CAG 프로모터를 포함하는 카세트 코스미드 pAdexlcAwt 를 SwaI 으로 절단하였다. 그런 후, 1 ㎍ 의 절단 산물을, 플라스미드 pUCCre 를 PstI 및 XbaI 으로 절단하고 클레노우 효소 (다까라 스조 사, 일본국) 를 보충하여 수득한 약 1 kb 의 DNA 절편 0.1 ㎍ 과 혼합하였다.
여기에서 사용된 CAG 프로모터는 일본국 특허 출원 공개 번호 3(1991) - 168087 에 고 발현 벡터로 개시되어 있다. CAG 프로모터는 상기 공개 명세서의 13 쪽 20 줄 - 20 쪽 14 줄 및 22 쪽 1 줄 - 25 쪽 6 줄에 기재된 플라스미드 pCAGGS 를 제한 효소 SalI 및 HindIII 로 절단하여 제조할 수 있다. 그렇게 제조된 CAG 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다.
2) 상기 수득된 혼합물에 에탄올을 첨가하여 코스미드를 침전시켰다. 침전물을 원심분리로 회수하고, 5 배의 희석 TE 용액 (10 mM 트리스 - HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)에 용해시킨다.
3) 코스미드를 함유하는 그 결과의 용액을 완충 용액 중의 ATP 및 T4 DNA 리가제와 함께 최종 부피 7 ㎕ 로 밤새 결찰 반응시켰다.
SwaI 반응을 위한 완충용액 및 멸균수를 거기에 첨가하여 전체 부피를 48 ㎕ 로 만든다. 그런 후, 70 ℃ 에서 10 분간 열을 가하여 리가제를 불활성화시킨다.
플라스미드와 달리, 코스미드는 일반적으로 환상의 형태 대신에 선형의 직렬 형태로 서로 연결함으로 형성된 고분자 DNA 를 효율적으로 패키지할 수 있다.
4) 2 ㎕ 의 SwaI (베링거, 독일) 을 첨가한 후에 25 ℃ 에서 1 시간 동안 코스미드의 절단 반응을 수행하였다. 코스미드가 SwaI 로 절단되는 이유는 하기에 설명한다.
카세트 코스미드가 발현 단위의 함유 없이 재결찰된다면, SwaI 인식 부위는 재생될 것이다. 따라서, SwaI 로의 절단은 발현 단위를 가지지 않은 코스미드를 재절단할 수 있으며, 그 결과 어떠한 콜로니도 형성되지 않는다. 이것이 삽입 서열을 갖는 카세트 코스미드를 선별하는 잠재적인 방법이다.
5) "Molecular Cloning, vol 3, E.34" 에 기재된 종래의 방법에 따라, 카세트 코스미드에 페놀 추출법, 원심 분리 및 겔 여과법을 수행하였다.
6) SwaI 로의 절단을 다시 수행하였다. 즉, 5 ㎕ 의 SwaI 을 SwaI 반응을 위한 완충 용액에 첨가하여 코스미드를 25 ℃ 에서 2 시간 동안 절단하였다. 그 절단은 상기 설명한 이유로 수행하였다.
7) 그 결과의 코스미드(1 ㎕) 로 실험실 조건에서의 패키징을 수행하였다.
즉, 람다 생체외 패키징 키트, Gigapack XL (스트라겐 사, 미합중국) 을 1/4 범위에서 사용하였고, 그 나머지는 -80 ℃ 에서 동결하였다.
Gigapack XL 은 42 kb 이하의 코스미드에 대하여 저 패키지 효율을 나타내기 때문에, 그 키트는 삽입 서열을 포함하여 더 큰 크기가 되는 특정의 코스미드를 선별할 수 있다. 이러한 실험에서, 10 개의 콜로니를 선택하였을 때, 그 대부분은 삽입 서열을 포함하였다. 그러므로, 목적의 배향 (즉, E3 유전자 부위로부터 E1 유전자 부위의 방향을 의미하는 왼쪽 방향) 을 가지는 클론은 쉽게 수득될 수 있다.
이즈무 사이토 일행 [JIKKEN IGAKU (실험 의약), vol. 7, 183 - 187 (1989)] 이 설명한 종래의 방법에 따라 그 코스미드를 조작하였다.
8) 패키지 코스미드를 대장균 균주 DH1 (ATCC 33849) 에 감염시켰다.
즉, 코스미드를 세개 각각의 Ap+한천 배양판 (암피실린 보충) 및 5 ml 의 Ap+LB (푸울) 에 1/200, 1/20, 1/2 및 나머지의 양으로 접종하고, 밤새 배양하였다.
푸울로부터 소량의 DNA 를 추출 제조하였다. 삽입 서열을 가지는 코스미드의 비율은 전체의 효소 절단법에 따라 조사하였다. 그 콜로니를 한천 배양판과 함께 선택하여, 1.5 ml 의 Ap+LB 에서 소량의 DNA 를 제조하기 위하여 밤새 배양하였다.
9) 코스미드에 포함된 발현 단위의 배향 및 구조는 제한 효소를 사용한 절단으로 확인하였다.
즉, 발현 단위를 포함하나 대부분의 아데노바이러스 DNA 가 결실된 플라스미드를 NruI 및 리가제를 사용하여 제조하고, cDNA 클로닝의 최종 확인을 위하여 플라스미드로부터 DNA 절편을 제조하였다.
(2) 아데노바이러스 DNA - 단백질 복합체의 제조 (Ad5 dlx DNA-TPC)
1) 아데노바이러스 DNA 로서 벡터 Ad5 dlx (사이토일행, J. Virology, vol. 54, 711 - 719, 1985) 를 사용하였다. 벡터 Ad5 dlx DNA 를 헬라 세포에 Roux 10 관의 양으로 감염시키고, 배양하였다.
즉, Ad5 - dlx 바이러스 용액(∼ 109PFU / ml) 을 0.2 ml/Roux 관의 양으로 감염시켰다. 3 일 후, 그 세포를 박리하고 1500 rpm 으로 5 분 동안 원심 분리하여 모았다. 아데노바이러스 입자의 대부분은 매질이 아니라 핵에 존재하며, 그러므로 바이러스는 감염된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다.
하기의 절차를 무균하에서 수행하였다.
2) 그렇게 수득된 세포를 20 ml 의 10 mM 트리스 - HCl(pH 8.0)에 현탁하고, 바이러스가 방출되도록 밀봉형 초음파 파쇄기를 사용하여 200 W 로 2 분간 (30 초 × 4) 세포를 초음파 파쇄하였다.
세포로부터 바이러스를 방출하기 위하여, 세포 현탁액이 5 ml 이하의 부피를 가질 때, 동결-융해의 5 회 반복이면 충분하다. 그러나, 더 큰 부피를 가질 때, 바이러스를 방출하기 위하여 초음파 파쇄기가 더 유리하다. 이러한 경우에, 차폐 뚜껑이 달린 밀봉형 초음파 파쇄기가 사용되어야만 한다. 일반적인 삽입형은 안전한 캐비넷 상에서 수행될 때조차도 위험하다.
3) 그렇게 수득된 세포 잔해물을 10 k rpm 으로 10 분간 원심 분리하여 제거하고, 상층액을 초원심 분리기 (SW 28 관) 에 부과된 염화세슘 용액 (비중 : 1.43) 15 ml 위에 두고, 원심 분리 (25 k rpm, 1 시간, 4 ℃) 로 농축하였다.
4) 경계면 바로 아래의 바이러스 밴드 (band)를 SW 5.1 관으로 옮겼다. 경계면 바로 아래의 바이러스상을 육안으로 관찰하고, 5 ml의 바이러스 밴드를 모았다. 동시에, 또 다른 관을 염화세슘 용액(비중 : 1.34)으로 채웠다.
이 관을 4 ℃ 에서 35 k rpm 으로 밤새 원심 분리하였다. 그런 후, 그렇게 형성된 바이러스를 가리키는 밴드를 모아 앞서 구배가 형성된 관으로 옮겼다. 그 관을 4 ℃ 에서 4 시간동안 35 k rpm 으로 초원심분리를 더 수행하였다.
5) 바이러스를 가리키는 밴드를 모아 동일한 양의 8 M 구아니딘 염화수소와 혼합하였다. 더욱이, 4 M 구아니딘 염화수소 포화 염화세슘을 그 혼합물에 첨가하였다. 그 결과의 혼합물을 VTi65 관에 채웠다. 그 입자 단백질을 4 M 구아니딘 염화수소로 변성시켜 분리하고, 그럼으로 DNA - TPC 복합체를 방출시켰다. 에티듐 브로미드는 사용한 에티듐 브로미드를 제거할 어떠한 절차도 현재까지 만들어져 있지 않기 때문에 이러한 실험에서 사용할 수 없다.
6) 상기 설명한 관을 55 k rpm 으로 15 ℃ 에서 밤새 초원심분리를 수행하고, 0.2 ml 씩 분획하였다. 각 분획으로부터, 1 ㎕ 를 뽑아 1 ㎍ / ml 의 에티듐 브로미드 수용액과 혼합하여 형광 염색으로 DNA 의 존재 여부를 확인하였다. DNA를 함유하는 2 내지 3 분획을 모았다.
7) 그 분획을 500 ml 의 TE 완충 용액에 밤새 2 회 투석하고 -80 ℃ 에서 저장하였다. 그렇게 수득된 Ad5dlx DNA - TPC 복합체의 양을 종래의 방법과 동일한 방식으로 OD260값을 기준으로 측정하였다.
8) 그 결과의 Ad5dlx DNA - TPC 복합체를 충분한 양의 EcoT22I 으로 2 시간 동안 절단하고, 하기 세번째 단계에서 재조합 아데노바이러스 벡터를 구축하기 위하여, -80 ℃ 에서 보관하였다.
그 동안, DNA - TPC 복합체를 제한효소로 절단, 투석 및 겔 여과시킬 수 있었으나, 전기 영동, 페놀 처리 및 에탄올 침전은 실패하였다.
단지 염화세슘 평형 원심분리가 농축 방법으로 이용 가능하였다. 그러므로, DNA - TPC 복합체는 가능한 고농도로 유지되었다. 대략 300 ㎍ 의 DNA - TPC 복합체가 10 Roux 관으로 감염된 세포로부터 수득될 수 있다.
9) DNA - TPC 복합체의 일정량을 모아, 전기영동을 위하여 BPB 완충용액 10 ㎕ 에 첨가하였다. 그런 후, 1 ㎕ 의 프로테나제 K (10 mg / ml) 를 그 혼합물에 첨가하였다. 그 결과의 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 반응시켜 DNA - TPC 복합체에서의 말단 단백질을 절단하였다. 페놀 추출 후, 상층액을 아가로스 겔 상에서 전기 영동으로 분리하여 완전한 절단을 확인하였다.
EcoT221 - 절단 DNA - TPC 에서 제한 효소 완충용액을 원심 분리성 겔 여과법으로 제거한 뒤, 그 결과의 산물을 별도로 관에 부과하고 -80 ℃ 에서 보관하였다.
(3) 재조합 바이러스의 분리 및 고적정량의 바이러스 용액의 제조
1) 6 cm 및 10 cm 직경의 페트리 접시 각각에 10 % FCS 가 보충된 DME 에 배양된 293 세포주를 부과하였다.
2) 발현 단위가 도입된 8 ㎍ (3 내지 9 ㎍ 이 적당하다.) 의 pAdexlW DNA 를 미리 EcoT22I 으로 절단한 1 ㎍ 의 Ad5dlx DNA - TPC 복합체와 혼합하고, 그 결과의 혼합물을 종래의 인산 칼슘 방법에 따라 Celfect Kit (파마시아사 제조) 를 사용하여 6 cm 의 페트리 접시상의 293 세포주로 형질 감염시켰다. 즉, 그 혼합물을 6 cm 의 페트리 접시에 적가하고, 배양을 계속하였다.
밤새 배양 후 (약 16 시간 동안), 그 배지를 다음날 아침 교환하였다. 그런 후, 그날 저녁 세포를 포함하는 배양액을 5 % FCS 함유 DME 로 0.1 ml / 웰의 양으로 3 개의 96 - 웰 콜라겐 도포 배양판 (비희석, 10 배 희석, 100 배 희석) 의 홈에 부었다. 각 배양판 상의 세포 수의 유의한 차이를 피하기 위하여, 10 cm 페트리 접시에서 수확한 293 세포의 1/3 을 두 희석된 용액판의 각각에 첨가하였다.
3) 3 내지 4 일 후 및 8 내지 10 일 후, 50 ㎕ 의 10 % FCS 함유 DME 를 각각의 웰에 더 첨가하였다. 293 세포주가 얇아지면, 10 % FCS 함유 DME 를 웰에 먼저 첨가하였다.
바이러스가 증식되고 세포가 죽은 웰을 7 내지 15 일 동안 관찰하였다. 세포가 완전히 죽은 각 웰로부터, 죽은 세포를 포함하는 배양액을 멸균한 파스퇴르 파이펫을 사용하여 1.5 ml 의 멸균 관으로 옮겼다. 그 관을 재빨리 얼리고, -80 ℃에서 보관하였다.
4) 그 관찰은 15 내지 18 일 까지 완료하였다. 비교적 늦은 시기에 죽은 세포를 함유하는 배양액을 부과한 관으로부터 약 10 개의 관을 분리하였다. 동결-융해를 6 회 반복한 뒤에, 5 k rpm 으로 10 분간 원심 분리를 수행하였다. 그 결과의 상층액을 -80 ℃ 에서 1 차 종자로 저장하였다.
초기 단계에서, 바이러스가 증식하기 시작한 웰은 많은 종의 바이러스 균주로 혼합 감염의 높은 가능성을 나타낸다.
5) 24 웰 배양판에 293 세포주를 부과하고, 5 % FCS - DME (0.4 ml / 웰) 및 10 ㎕ 의 1 차 바이러스 종자를 각 웰에 2 배수로 첨가하였다.
6) 약 3 일에 세포가 완전히 죽은 곳에서, 상기 설명한 1 차 바이러스 종자의 제조 방법과 유사한 방식인 동결-융해의 6 회 반복 및 원심분리로 2 배수의 웰 중 하나로부터 상층액을 수득하였다. 그렇게 수득한 상층액을 2 차 종자로 사용하기 위하여 -80 ℃ 에서 저장하였다. 2 차 바이러스 용액의 적정량은 대략 107내지 108PFU / ml 이었다. 2 배수 웰의 또 다른 웰의 죽은 세포를 5 k rpm 으로 5 분간 원심 분리하고, 그 상층액을 제거하였다. 그 세포만을 -80 ℃ 에서 저장하였다 (세포 팩). 10 바이러스 균주의 세포 팩을 모아, 하기 방법에 따라 감염된 세포로부터 온전한 DNA 를 추출하였다. 각각의 세포 팩에 400 ㎕ 의 TNE (50 mM 트리스 - HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA), 4 ㎕ 의 프로테나제 K (10 mg / ml) 및 4 ㎕ 의 10 % SDS 를 첨가하였다.
7) 50 ℃ 에서 1 시간 처리한 후에, 페놀 - 클로로포름으로 2 회 추출하고, 클로로포름으로 2 회 추출하고, 에탄올 침전법을 수행하였다. 에탄올 침전법으로 회수한 핵산을 20 ㎍ / ml 리보뉴클라제 함유 50 ㎕ 의 TE 에 용해하였다.
인식 부위가 CG 를 포함하는 XhoI 으로 15 ㎕ 의 용액을 절단한 후, 그 절단 산물을 발현 코스미드 카세트의 XhoI 절단 산물과 함께 약 15 cm 의 길이를 가지는 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하였다. 그렇게 수득된 경향을 비교하였다. 발현 단위의 절단 부위로부터 아데노바이러스 게놈의 왼쪽 끝의 DNA 서열을 정확히 가리키는 밴드를 가진 클론을 선별하였다. 밝혀지지 않은 DNA 서열을 가리키는 많은 밴드를 생산하는 클론은 결실을 가지는 바이러스로 오염되었을 가능성이 있기 때문에 제거하였다.
일반적으로 아데노바이러스는 10,000 카피 / 세포의 수준으로 증식된다. 따라서, 원래의 세포성 DNA 및 아데노바이러스 DNA 를 포함하는 전체의 DNA 를 추출하고, 제한 효소로 절단하고, 그런 후 전기 영동을 실시하여 아데노바이러스로부터 유래하는 DNA 절편을 가리키는 밴드를 관찰할 수 있다. 인식 부위에 CG 를 포함하는 XhoI 과 같은 제한 효소는 세포성 DNA 를 절단하지 못한다. 그 결과로, 전기영동을 수행하였을 때, 그 경향은 쉽게 관찰할 수 있고 구별할 수 있다. 다른 효소를 사용하였을 경우, 비감염된 293 세포주 DNA 가 인간 세포의 반복된 서열의 생성이 있기 때문에 대조군으로 요구된다. 절단된 비 감염 293 세포주 DNA 를 전기 영동을 수행하여 인간 세포의 반복 서열을 가리키는 밴드를 관찰하였다.
8) XhoI 절단으로 확인한 2 차 종자 용액을 25 ml 의 배양액을 포함하는 150㎠ 콜라겐 도포 병에 부과된 293 세포주를 0.1 ml 의 양으로 형질 감염시켰다.
3 일내에 세포가 죽은 경우, 죽은 세포를 포함하는 배양액을 멸균하에 밀봉형 초음파 파쇄기로 최대 출력 200 W 로 2 분간 초음파 파쇄하여 바이러스를 방출시켰다.
4 ℃ 에서 3 k rpm 으로 10 분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고, 수득된 상층액을 5 ml 의 동결관 13 개에 각각 2 ml 의 양으로 부과하였다. 3 차 종자 용액을 제조하기 위하여 그 관을 재빨리 드라이 아이스로 동결하여 -80 ℃ 에서 보관하였다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 함유하는 3 차 종자 용액은 109 PFU / ml 의 높은 적정량을 나타냈다.
24 - 웰 배양판에 293 세포주를 함유하는 하나의 웰에 5 ㎕ 의 3차 종자 용액을 형질 감염한 후에, 증식된 바이러스 DNA 를 제한효소로 절단하고 전기 영동을 수행하였다. 그 결과의 경향을 상기 설명한 절차에 의하여 확인하였다. 그 바이러스가 결실된 바이러스 및 그 모 바이러스와 혼합되었을 가능성이 있는 경우에, 3 차 종자 용액 모두를 버렸다. 이것은 이미 2 차 바이러스 용액에 존재하고 있을 결실된 바이러스가 빠르게 적절한 수준으로 증식될 가능성 때문이다. 그러므로, 또 다른 2 차 종자 용액으로 상기 절차를 다시 수행하였다. 그 외에, 1 차 종자 용액을 제한 희석법으로 수행하여 바이러스 용액을 정제하였다.
참조예
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 간단한 적정량 분석
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터는 하기 절차에 따라 단순한 방법으로 적정량을 분석할 수 있다.
(1) 293 세포주가 부과된 10 cm 직경의 페트리 접시 하나를 제조한다.
재조합 아데노바이러스 벡터 용액 (즉, 3 차 종자 용액) 을 5 % FCS 가 보충된 DME 를 사용하여 10-1∼ 10-4으로 연속 희석한다. 예를 들면, 0.9 ml 의 DME 와 0.1 ml 의 바이러스 용액을 사용하여 용액을 제조한다. 미세파이펫 (micropipette) 팁은 모두 교환한다.
(2) 하나의 콜라겐 도포된 96 - 웰 배양판의 모든 웰에 5 % FCS 가 보충된 DME 를 각각 50 ㎕ 씩 부과한다.
첫번째 줄의 8 개의 웰에 10-4으로 희석된 재조합 아데노바이러스 벡터 용액 25 ㎕ 씩을 부과한다.
8 웰용 다구 파이펫을 사용하여 25 ㎕ 의 벡터 용액을 두번째 줄로 옮긴다. 그런 후, 동일한 절차를 11 번째 줄까지 반복하고, 마지막 25 ㎕ 의 벡터 용액을 제거한다. 그 결과, 3n연속 희석된 용액을 311× 10-4까지 제조할 수 있다. 12 번째 줄의 용액이 대조군으로 비 감염된 세포이다.
본 실험에서 사용된 팁은 매 사용시 교환한다.
실시예 2
두 loxP 서열을 함유하고, 그 두 loxP 서열 사이에 위치하는 SV 40 의 복제 기원, CAG 프로모터 및 B 형 간염 바이러스 표면 항원 (HBs) 을 더 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축.
(1) B 형 간염 바이러스 표면 항원 (HBs) 발현용 카세트 코스미드의 구축:
1) HBs cDNA 를 갖는 플라스미드 pHBVadr4 (후지야마 일행, Nucleic Acids Res.,11, 4601 - 4610) 를 제한 효소 Psp1406I 및 XhoI 으로 절단하고, 클레노우 효소를 보충하였다. 그 결과의 절단된 플라스미드를 아가로스 겔 상에서 전기 영동을 수행하여 710 bp 의 DNA 절편을 회수하였다.
2) 하기 절차를 수행하여 CAG 프로모터의 조절하에 HBs cDNA 를 발현하는 발현 단위를 수득하였다.
CAG 프로모터를 함유하는 플라스미드 pCAGGS (니와 일행, Gene,108, 193 - 200, 1990) 의 클로닝 부위로 SwaI 링커를 삽입함으로 플라스미드 pCAWG 를 제조하였다. 플라스미드 pCAWG 를 SwaI 으로 절단하고 염기성 포스파타제를 처리하였다. 그런 후, 그 결과의 산물을 상기 1) 에서 수득한 710 bp 의 DNA 절편과 약 1 : 3 의 몰 비율로 혼합하였다. 그 혼합물을 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰시켰다. 대장균DHI 균주 (ATCC 33849) 를 반응 혼합물로 형질 감염시켰다. 그 형질 전환체를 암피실린이 보충된 LB 한천 배양판에서 선별하였다. HBs cDNA 가 CAG 프로모터의 조절하에 발현되는 방식으로 710 bp 의 DNA 절편이 올바르게 삽입된 플라스미드 pCAG·HBs 를 수득하였다.
3) HBs 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원을 갖는 DNA 절편을 수득하기 위하여 하기 절차를 수행하였다.
플라스미드 pCAG·HBs 를 SapI 및 SalI 으로 절단하고, 클레노우 효소를 보충하였다. 그런 후, 그, 결과의 산물을 아가로스 겔상에서 전기 영동을 수행하여3.6 kb 의 DNA 절편을 회수하였다. 플라스미드 pUC18 (다까라 스조 사 제, 일본국) 을 제한 효소 SmaI 으로 절단하고, 염기성 포스파타제로 처리한 뒤, 3.6 kb DNA 절편과 약 1 : 3 의 몰비율로 혼합하였다. 그 혼합물을 결찰시켜 목적의 플라스미드 pUC18CAHBsS 를 수득하였다.
4) 다음에, HBs 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원을 가지는 DNA 절편의 양 끝에 loxP 부위를 덧붙이기 위하여 하기 절차를 수행하였다.
플라스미드 pUC119 (다까라 스조 사 제조, 일본국) 를 제한 효소 Ecll36II 로 절단하고, 염기성 포스파타제를 처리하였다. 그 결과의 산물을 각 끝에 MluI 부위 및 XhoI 부위를 가지고, 결찰 후 MluI 및 XhoI 부위 각각으로부터 NruI 부위를 형성하도록 고안된, loxP 서열을 갖는 하기 합성 DNA 절편 (서열 식별 번호 : 3) 과 결찰시켰다.
따라서, 두 개의 합성 DNA 절편이 삽입된 플라스미드 pULL2r 을 수득하였다.
합성 DNA 절편
밑줄친 서열은 loxP 부위를 표시한다.
상기 3) 에서 수득된 pUC18CAHBsS 를 제한 효소 SalI 및 Ecll36II 로 절단하였다. 이 절단 산물에 클레노우 효소를 보충 한 후에, 그 결과의 산물로 아가로스 겔 상에서 전기 영동을 수행하여 3.6 kb DNA 절편을 회수하였다. 플라스미드 pULL2r 을 제한 효소 NruI 으로 절단하고, 염기성 포스파타제로 처리하였다. 그렇게 처리된 플라스미드를 3.6 kb DNA 절편과 결찰시켜 목적의 플라스미드 pULCA·HBsS 를 수득하였다.
5) 양 끝에 loxP 부위를 가지며, HBs 발현 단위 및 SV 40 의 복제 기원을 포함하는 DNA 절편을 함유하는 재조합 코스미드를 수득하기 위하여, 하기 두 DNA 를 제조하였다.
a) 플라스미드 pULCA·HBsS 를 제한 효소 SmaI 및 EcoRI 으로 절단하고, 클레노우 효소로 양 끝을 블런트 (blunt) 하였다. 그런 후, 그 산물을 아가로스 겔 상에서 전기 영동을 수행하여 0.3 ㎍ 의 3.7 kb DNA 절편을 회수하였다.
b) 플라스미드 pAdexlcw [SAIBO KOGAKU (세포 공학),13, 760 - 763, 1994] 를 제한 효소 SwaI 으로 절단하여, 1 ㎍ 의 절단 산물을 수득하였다.
상기 (a) 및 (b) 에서 수득한 두 DNA 산물을 혼합하고, 그 혼합물을 실시예 1, (1), 2) 내지 9) 의 절차와 동일한 절차로 처리하여 목적의 재조합 코스미드를 수득하였다.
두 loxP 서열을 함유하고, 그 두 loxP 서열 사이에 위치하는 SV 40 의 복제 기원, CAG 프로모터 및 B 형 간염 바이러스 표면 항원을 더 함유하는, 목적의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdexlLCAHBsSL 을 실시예 1, (2) 및 (3) 과 유사한 절차에 의하여 수득하였다.
실시예 3. 감염 실험
COS - 1 세포 또는 CV - 1 세포를 6 cm 직경의 페트리 접시에서, 접시의 바닥 표면을 완전히 덮을 때까지 배양하였다.
실시예 1 및 2 에서 수득한 아데노바이러스 벡터를 하기 실험 방법에 따라, 감염 중복도가 5 (moi = 5) 에서 1 시간 넘게 흡착시켰다. 3 일 후, 그 세포를 수확하여 서던 블럿 (Southern bloting) 분석을 수행하였다.
즉, 재조합 아데노바이러스 벡터 AdexlLCAHBsSL 은 약 6.0 kb 의 HindIII 부위를 포함하며, loxP 부위에서 리컴비나제 Cre 에 의한 절단 후에 3.5 kb 의 환상의 DNA 분자를 형성한다. 이러한 환상의 DNA 분자는 하나의 HindIII 부위를 가지기 때문에, HindIII 처리에 의하여 회수된 DNA 를 서던 블럿으로 분석하였다. A710 bp HBs 절편을 탐침으로 사용하였다.
그 결과를 제 1 도에 나타난다.
제 1 도에 명확하게 나타나는 것처럼, 실시예 1 및 2 에서 수득된 두 아데노바이러스 벡터의 조합으로 형질 감염시켰을 때인 레인 4 및 8 에서만, 환상의 DNA 분자를 HindIII 의 절단하여 제조된 3.5 kb 의 선상의 DNA 가 관찰되었다.
실시예 2 에서 수득한 아데노바이러스 벡터 및 리컴비나제 Cre 유전자를 가지지 않은 아데노바이러스 벡터로 형질 감염시켰을 경우에, 3.5 kb 의 밴드는 관찰되지 않으며, 단지 HindIII 에 의한 절단으로 생성된 AdexlLCAHBsSL 의 6.0 kb 의 밴드 만이 레인 3 및 7 에서 관찰되었다.
더욱이, 레인 7 및 8 의 밴드 강도 비교는 환상의 DNA 분자가 형질 감염된 COS - 1 세포 내에서 40 회 자가 복제되었음을 나타낸다. 한편, 레인 3 의 강도가 거의 레인 4 의 강도와 같다는 사실은 환상의 DNA 분자가 CV - 1 세포 내에서 복제하지 않았다는 것을 가리킨다. 이것은 SV 40 으로부터 유래한 복제 기원이 CV - 1세포 내에서 기능하지 못한다는 사실과 부합한다.
상기의 결과는 동물 세포가 실시예 1 및 2 에서 수득된 본 발명의 두 아데노바이러스 벡터의 조합으로 형질 감염되었을 때, 벡터 내의 두 리컴비나제 - 인식 서열사이에 위치하는 DNA 절편이 절단되어 환상의 DNA 분자를 만들고, 그 환상의 DNA 분자가 형질 감염된 세포 내에서 자가 복제한다는 것을 나타낸다.
상기 설명한 감염 실험은 하기와 같이 종래 방법으로 수행하였다.
배양액에서의 혈청이 FCS 가 아닌 경우 (즉, CS 가 사용될 경우), 배양 세포를 혈청이 없는 배양액으로 2 회 세척한다.
세포 표면이 건조하지 않을 정도의 양으로 절차 수행 중 바이러스 용액 (혈청 없는 또는 FCS 보충된 배양액으로 희석) 을 첨가한다. 그 양은 96 - 웰 미세 배양판의 경우 약 30 내지 40 ㎕, 24 - 웰 배양판의 경우 50 내지 70 ㎕, 10 cm 직경의 페트리 접시의 경우 100 내지 200 ㎕ 이다. 바이러스 용액을 보충하기 앞서 의식적으로 소량의 배양액이 남아있도록 하는 것이 실질적으로 유리하며, 남아 있는 배양액에 바이러스 용액을 첨가하여 상기 지시한 부피로 만든다.
수 초 간격으로 수 회 그 판을 전후 좌우로 흔들어 바이러스 용액을 세포에 균일하게 펼쳐지게 한다. 이러한 과정을 매 20 분 마다 3 회 수행하고, 과정 중 세포는 CO2배양기에 있도록 한다.
3 차 과정이 끝난 후 (형질감염 1 시간 후), 배양액의 일반적인 양을 첨가하여 일반적인 반응을 수행한다. 형질 감염의 시간은 일반적으로 1 시간이고, 최대약 2 시간이면 이러한 목적을 위하여 충분하다.
본 발명에 따라, 외부 유전자가 형질 감염된 동물 세포 내에서 자가적으로 복제할 수 있는 방법으로 다양한 동물 세포에 형질 감염될 수 있는 재조합 DNA 바이러스 벡터가 제공된다. 또한, 본 발명은 재조합 DNA 바이러스 벡터를 제조 하기 위한 단순한 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 DNA 바이러스 벡터는 특별히 유전적 질병의 치료에 유용하다.
제 1 도는 본 발명의 형질 도입으로 수득된 DNA를 서던 블러팅 (Southern blotting) 한 도면이다.

Claims (12)

  1. 프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 동물 세포의 형질 감염용 재조합 아데노바이러스 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 리컴비나제 유전자가 대장균 P1 파지로부터 유래하는 리컴비나제 Cre 유전자임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 프로모터 및 폴리 (A) 서열이 사이토메갈로바이러스 인핸서 (enhancer), 닭의β- 액틴 프로모터, 및 토끼β- 글로빈스 플라이싱 (splicing) 억셉터 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 하이브리드 프로모터 CAG에 포함됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  4. 두 개의 리컴비나제 - 인식 서열, 동물 세포에서 작용할 수 있는 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하며, 상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열 모두가 두 리컴비나제 - 인식 서열의 사이에 위치하는 동물 세포의 형질 감염용 재조합 아데노바이러스 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 두 리컴비나제 - 인식 서열중의 하나의 상류 (upstream) 쪽에서 상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열이 그 순서대로위치함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  6. 제 4 항에 있어서, 두 리컴비나제 - 인식 서열중의 하나의 상류쪽에서 외부 유전자, 폴리 (A) 서열, 복제 기원 및 프로모터가 그 순서대로 위치함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리컴비나제 - 인식 서열이 리컴비나제 Cre 의 기질인 loxP 를 코딩하는 DNA 서열임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  8. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 기원이 바이러스 또는 동물 세포로부터 유래함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 복제 기원이 파포바바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 천연두 바이러스 및 파르보바이러스로부터 유래하는 복제 기원으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  10. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 및 폴리 (A) 서열이 사이토메갈로바이러스 인핸서 (enhancer), 닭의β- 액틴 프로모터, 및 토끼β- 글로빈 스플라이싱 (splicing) 억셉터 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 하이브리드 프로모터 CAG 에 포함됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  11. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 외부 유전자를 인간 세포를 포함하는 동물 세포로 in vitro 에서 형질 도입하거나 외부 유전자를 인간 세포가 배제된 동물 세포로 in vivo 에서 형질도입하는 방법:
    프로모터, 리컴비나제 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 두개의 리컴비나제 - 인식 서열, 동물 세포에서 작용할 수 있는 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 포함하며 그 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열 모두는 두 리컴비나제 - 인식 서열 사이에 위치하는 재조합 아데노바이러스 벡터 모두를, 상기 동물 세포로 공 - 형질 감염시키고;
    상기 복제 기원, 프로모터, 외부 유전자 및 폴리 (A) 서열을 함유하는 DNA 절편을 절단하여 환상의 DNA 분자를 만들고;
    상기 환상의 DNA 분자를 공 - 형질 감염된 동물 세포 내에서 자가 복제시킨다.
  12. 유전자 치료에서 사용하기 위해 제 11 항에 따른 형질 감염 방법을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포로 인간 유전자를 in vitro 에서 형질 도입하는 방법.
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