JPH0884589A - 動物細胞感染用の組換えｄｎａウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポ
リＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイル
スベクター、二つのリコンビナーゼ認識配列並びにその
間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝
子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤ
ＮＡウイルスベクター、これらの組換えＤＮＡウイルス
ベクターを動物細胞に感染させ、外来遺伝子発現ユニッ
トを細胞内で自律複製させることによる外来遺伝子の細
胞内導入法、及びこの細胞内導入法を用いてヒト遺伝子
を細胞内に導入することを特徴とする遺伝子治療法。 【効果】本発明により、広範な動物細胞において自律複
製可能な形で外来遺伝子を動物細胞に導入することので
きる組換えＤＮＡウイルスベクターを提供することがで
きる。本発明の組換えＤＮＡウイルスベクターは遺伝病
の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞感染用の組換え
ＤＮＡウイルスベクターに関する。さらに詳しくは、リ
コンビナーゼ遺伝子またはこのリコンビナーゼの認識配
列をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡウイルス
ベクターと、該べクターを用いた外来遺伝子の細胞内導
入法及び遺伝子治療への使用に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】これまで
遺伝子導入のウイルスベクターとしてレトロウイルスが
良く用いられたが、このウイルスは分裂している細胞に
しか導入できないことや宿主細胞の染色体に組み込まれ
てしまうことにより、特に遺伝子治療においてはその安
全性の観点より問題があり、その応用範囲は限られてい
ると考えられている。アデノウイルスベクターは、種々
の動物培養細胞で１００％近い導入効率を示すこと、ま
たレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機
構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導
入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベク
ターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子
治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えら
れている。

【０００３】アデノウイルスベクターの利用は遺伝子治
療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝
子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ
直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接
欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo遺伝子治療の
方法として研究が精力的に進められている。既に嚢胞性
繊維症では、米国で５グループが実際に患者への実験治
療を認められており、筋ジストロフィー症、家族性高コ
レステロール血症、また脳腫瘍等に対して活発に研究さ
れるようになった。一方でアデノウイルスベクターは休
止期の細胞へも遺伝子導入が可能であり、分化した細胞
や、特に神経系への遺伝子導入方法として、初代培養や
動物個体への遺伝子導入実験が注目されている。以上よ
り、アデノウイルスベクターは、神経系を含む多くの分
化、未分化細胞への遺伝子治療導入だけでなく、動物個
体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能であるこ
とから、特に遺伝子治療への応用が期待されている。

【０００４】しかし、アデノウイルスはレトロウイルス
と異なり、積極的な染色体組み込みの機構を持たないこ
とから、発現が一時的である。その期間は１〜２週間か
ら、長くても２ヶ月程度である。そのため治療効果を継
続させる必要がある場合には、繰り返し投与による発現
の継続が必要である。しかし、繰り返し投与では抗体の
出現による治療効果の低減が懸念される。従って、本発
明の目的は、アデノウイルスベクターによって動物細胞
内に導入された外来遺伝子が、細胞内で自律複製可能な
形に変換し得るような組換えアデノウイルスベクターの
系を構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治
療用に提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記の問題を解決するために鋭意検討し、動物細胞感染
用のＤＮＡウイルスベクターとして、アデノウイルスベ
クターを用いて細胞内に導入した外来遺伝子を含む遺伝
子発現ユニットを、リコンビナーゼおよびその認識配列
を利用することにより環状分子化するとともに、そこに
複製起点を付与することにより、アデノウイルスベクタ
ーを用いて細胞内に導入した外来遺伝子を含む遺伝子発
現ユニットを、自律複製可能な形に変換することに成功
した。

【０００６】ここに、リコンビナーゼとは、特異的なＤ
ＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配
列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結
合の全工程を行う。そこで、この酵素を発現する組換え
アデノウイルスベクターと、この認識配列を同じ向きに
２コピーを持つ組換えアデノウイルスベクターを作製
し、両方を細胞に共感染させると、発現したリコンビナ
ーゼにより２つの認識配列間の再構成が起き、挟まれた
部分が環状分子として切り出される。従って、この部分
に発現ユニットと複製起点を組み込んでおけば、環状分
子は核内で複製され、細胞内において永続的に維持さ
れ、外来遺伝子の発現を続けることができる。従って、
このような組換えアデノウイルスベクターの系を遺伝子
治療に使用すれば、１回投与により、長期間の治療効果
を持続させることが可能となる。本発明は、かかる知見
に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったもの
である。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１） プロモー
ター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する
動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクター、
（２） ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイルスベク
ターである前記（１）記載の組換えＤＮＡウイルスベク
ター、（３） リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である前記
（２）記載のＤＮＡウイルスベクター、（４） 二つの
リコンビナーゼ認識配列並びにその間に動物細胞で働く
複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列
を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクタ
ー、（５） ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイルス
ベクターである前記（４）記載の組換えＤＮＡウイルス
ベクター、（６） 動物細胞で働く複製起点、プロモー
ター、外来遺伝子およびポリＡ配列が上流からこの順に
配向している前記（５）記載の組換えＤＮＡウイルスベ
クター、（７） 外来遺伝子、ポリＡ配列、動物細胞で
働く複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配
向している前記（５）記載の組換えＤＮＡウイルスベク
ター、（８） リコンビナーゼ認識配列がリコンビナー
ゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列である前記
（４）から前記（７）のいずれか１項に記載の組換えＤ
ＮＡウイルスベクター、（９） 動物細胞で働く複製起
点がウイルス由来又は動物細胞由来のものである前記
（４）から前記（８）のいずれか１項に記載の組換えＤ
ＮＡウイルスベクター、（１０） 動物細胞で働く複製
起点がパポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイ
ルス、ポックスウイルス、及びパルボウイルス由来のも
のからなる群より選ばれるものである前記（９）記載の
組換えＤＮＡウイルスベクター、（１１） プロモータ
ーおよびポリＡが、サイトメガロウイルスエンハンサ
ー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロ
ビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列か
らなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）である前記（１）〜前記（１０）のいずれか１項に
記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、（１２） プロ
モーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有
する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクター、
並びに二つのリコンビナーゼ認識配列及びその間に動物
細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子および
ポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイ
ルスベクターを動物細胞に感染させ、二つのリコンビナ
ーゼ認識配列間に存する動物細胞で働く複製起点、プロ
モーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を環状分子とし
て切り出し、細胞内で自律複製させることによる外来遺
伝子の細胞内導入法、（１３） ＤＮＡウイルスベクタ
ーがいずれもアデノウイルスベクターである前記（１
２）に記載の外来遺伝子の細胞内導入法、並びに（１
４） 遺伝子治療に際して、前記（１２）又は（１３）
記載の細胞内導入法を用いることを特徴とするヒト遺伝
子の細胞内導入法、に関する。

【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。本
発明における動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクター
は、アデノウイルスのように細胞に感染後染色体外でし
か存在し得ないようなＤＮＡウイルス由来のベクターで
あれば、特に制限されることなく用いることができる。
例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルス
ベクター、パポパウイルスベクター等が挙げられる。以
下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ認識配列
をもつ動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターの好適
な例として、アデノウイルスベクターを用いて本発明を
説明する。

【０００９】本発明に用いられるアデノウイルスは、動
物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とする
ヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウ
イルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡで
あって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆
方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端
にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパ
ク質が共有結合しているという特異な構造をしている。

【００１０】本発明に用いられるアデノウイルスのゲノ
ムは、Ｅ１領域特にＥ１Ａ領域を欠失している。これ
は、アデノウイルスの細胞ガン化活性に関与するＥ１Ａ
領域を欠失させることにより、アデノウイルスを無毒化
し、ゲノム中に組み込んだ外来の遺伝子配列のみを発現
させるためである。必ずしもＥ１Ａ領域の全てを欠失さ
せる必要はなく、Ｅ１Ａ領域、特に１．３〜９．３％の
断片を除去すれば、目的は達成される。また、本発明に
用いられるアデノウイルスのゲノムは、Ｅ３領域も欠失
させてもよい。特に、Ｅ３領域の７９．６〜８４．８％
を欠失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製に
は不要であるからである。したがってＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺
伝子を持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２
９３細胞）を除き、宿主細胞内で増殖することができな
いという特徴を有する。

【００１１】本発明に用いられる組換えアデノウイルス
ベクター粒子は、上記の２９３細胞に接種すると野性株
同様に１０⁸ 〜１０⁹ ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍ
ｌの高力価になるまで増殖する。しかし、他の細胞や動
物組織に接種すると、このウイルス粒子は細胞内へ高率
に侵入し、ウイルスゲノムが核内へ注入されるものの、
Ｅ１Ａ遺伝子が欠失しているため、この遺伝子産物によ
り転写活性化される他のすべてのアデノウイルスプロモ
ーターは働くことができない。一方、このアデノウイル
スゲノム中に組み込まれた外来遺伝子は、ゲノムに組み
込まれた外来のプロモーターから転写され発現すること
ができる。従って、本発明に用いられる組換えアデノウ
イルス粒子を使用すれば、ベクターとしてのアデノウイ
ルスゲノムの影響を最小限に抑えて、広範な動物細胞中
で外来遺伝子を発現させることができる。

【００１２】野性株のヒトアデノウイルスが感染後増殖
できる細胞はほとんどヒト細胞に限られているにもかか
わらず、本発明に用いられる組換えアデノウイルスで発
現可能な細胞種・組織は、はるかに広い範囲にわたる。
これは、本来のアデノウイルスが増殖できない細胞で
も、本発明に用いられる組換えアデノウイルスの場合は
ウイルス粒子が感染・侵入さえできれば発現ベクターと
して充分に機能し得るからである。

【００１３】しかし、本発明に用いられる組換えアデノ
ウイルスのゲノムは、染色体外の状態では複製しないた
め、２週間〜２ヶ月にわたって核内に存在するものの、
長期間の目的遺伝子の発現が要求される場合には多数回
の投与が必要となり、抗体の出現等の弊害が予想され
る。そこで、本発明では、かかる組換えアデノウイルス
外来遺伝子として後述のリコンビナーゼ遺伝子を組み込
んだ新規組換えアデノウイルスを作製し、他方、このリ
コンビナーゼの基質となる塩基配列（認識配列）２ヶ所
に挟まれた目的の外来遺伝子を組み込んだ別の新規組換
えアデノウイルスを作製し、これら両者を動物細胞に感
染させ、リコンビナーゼ遺伝子の発現により生ずるリコ
ンビナーゼの作用によって他方の組換えアデノウイルス
を切断し、切り出された部分が環状分子となり、細胞内
で自律複製できるように他方の組換えアデノウイルスを
構築する。

【００１４】本発明に用いられるプロモーターとして
は、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺
伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ
４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン
遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモータ
ー等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが
特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなる
ハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターとし
て特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。そ
の調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平
３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および
２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉ
ｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明
に利用することができる。

【００１５】本発明に用いられるリコンビナーゼは、特
異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、
この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全工程を
行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファー
ジＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）があ
る。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abre
mskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoe
ssら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質と
する。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認
識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の
２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコン
ビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、2
9、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイ
イのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これ
はＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular
and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これら
の中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが
本発明に特に好適である。

【００１６】リコンビナーゼ遺伝子は、例えば、リコン
ビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ
１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を
用いて増幅して本発明に使用することができる。その他
のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用い
て調製することができる。この場合に使用するプライマ
ーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるよ
うに選択され、さらに組換えアデノウイルスベクターの
構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限酵
素切断配列を付加したものを使用することが好ましい。

【００１７】上記のリコンビナーゼの認識配列（基質と
なる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３
４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Ab
remskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および H
oessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法によ
り化学合成して本発明に使用することができる。

【００１８】本発明に用いられるポリＡ配列としては、
特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来の
ものが特に好ましい。

【００１９】本発明においては、リコンビナーゼ遺伝子
をアデノウイルスベクターに組み込む場合に、同時に核
移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。これは、
アデノウイルスベクターにより感染細胞の核内で発現さ
れたリコンビナーゼが核外に分泌されるため、リコンビ
ナーゼがその認識配列を有するアデノウイルスベクター
に作用するには、再び核内に移行する必要があり、核移
行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kalderon
ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。

【００２０】本発明に用いられる動物細胞で働く複製起
点としては、ウイルス由来のものおよび動物細胞由来の
ものが挙げられる。例えば、ウイルス由来のものとして
パポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、
ポックスウイルス又はパルボウイルス由来の複製起点が
挙げられる。パポバウイルス由来のものとしてＳＶ４０
由来の複製起点があげられる。これらの複製起点が本発
明の組換えアデノウイルスベクターに組み込まれるの
は、リコンビナーゼで切り出された環状分子が細胞内で
自律複製できるようにするためである。

【００２１】本発明に使用される外来遺伝子としては、
上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）あるいはその他のプロモーターにより発現すること
ができる遺伝子であれば、特に限定されるものではな
く、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正
常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジス
トロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチ
トリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガ
ラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例
えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリ
ン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、
非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ
７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配
列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−
１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等
のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシ
ンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙
げられる。

【００２２】本発明の組換えアデノウイルスベクターに
組み込まれる複製起点、プロモーター、外来遺伝子およ
びポリＡ配列は、二つのリコンビナーゼ認識配列の間に
あって上流からこの順に配向しているのが通常である。
しかし、外来遺伝子、ポリＡ配列、複製起点およびプロ
モーターが上流からこの順に配向していてもよい。環状
分子になれば上記の配列と同一になるからである。

【００２３】本発明を遺伝子治療に使用する場合は、リ
コンビナーゼを発現可能な本発明の組換えアデノウイル
スベクターと二つのリコンビナーゼ認識配列の間に動物
で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリ
Ａ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクター
とを共感染させることにより行う。感染は、同時でも、
いずれかを先に感染させてもよい。感染により動物細胞
内に注入されたＤＮＡは、１か月以上安定に存在するか
らである。リコンビナーゼ発現可能な本発明の組換えア
デノウイルスベクターは細胞内で一定期間発現を続け、
リコンビナーゼが産生される。そして、このリコンビナ
ーゼは、共感染させた他方の組換えアデノウイルスベク
ターすなわち二つのリコンビナーゼ認識配列を有する本
発明の組換えアデノウイルスベクターに作用し、二つの
リコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分を切り出し環状
分子化する。この環状分子には動物細胞で働く複製起点
が組み込まれているので、細胞内で自律複製する。従っ
て、１回の共感染により、治療効果をほぼ永続的に持続
させることができる。このように、本発明の組換えアデ
ノウイルスは、遺伝子治療に極めて有用性が高いと考え
られる。このような動物細胞としては、ヒトまたは哺乳
動物の高度に分化した神経系、筋系、肝細胞から未分化
な上皮細胞、繊維芽細胞に至る広範囲の細胞が挙げられ
る。

【００２４】次に、本発明の組換えアデノウイルスの製
造方法について説明する。 （１） まず、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子お
よびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクター
の製造方法について説明する。本発明の組換えアデノウ
イルスベクターの作成は、前述のとおりウイルスゲノム
の両端にタンパク質が共有結合しているため、一般に極
めて困難である。そこで本発明においては、以下の方法
を用いる。リコンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼ
Ｃｒｅ遺伝子を使用した場合について述べるが、他のリ
コンビナーゼ遺伝子の場合もほぼ同様である。

【００２５】 ＰＣＲ法で調製したリコンビナーゼＣ
ｒｅ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）と
をそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａ
Ｉ（宝酒造製）で同時消化したのち混合・ライゲーショ
ンし、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれたプラ
スミドｐＵＣＣｒｅを得る。 細胞工学、１３、７６０−７６３（１９９４）に記
載の方法により調製したＣＡＧプロモーターを含むカセ
ットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素ＳｗａＩ
（Boehringer社製）で処理したものと、ｐＵＣＣｒｅを
制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造
製）で同時消化したのちＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）
で両端を平滑化したものとを混合する。ついでカセット
コスミドを沈澱させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合さ
せ、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセット
コスミドを得る。

【００２６】ＣＡＧプロモーター以外のプロモーターを
使用する場合は、まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋ
ｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３領域（１．９ｋ
ｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域（２．９ｋｂ）を欠失させた
約３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつカセットコスミドを作
成し、他方、使用しようとするプロモーター、リコンビ
ナーゼＣｒｅ遺伝子およびポリＡ配列を含むプラスミド
を作製し、適当な制限酵素で処理してアデノウイルスゲ
ノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位にリコンビナーゼＣｒｅ
遺伝子発現ユニットを組み込んだカセットコスミドを得
る。 次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・イン
ビトロ・パッケージングキットであるギガパックＸＬ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、インビトロ・パ
ッケージングを行う。

【００２７】 一方、アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複
合体（Ａｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製する。ア
デノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄｌＸ（I. Saito
etal., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985) ）を用
い、Ａｄ５ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本
分）に感染させ、培養を行う。ウイルス粒子を回収し、
塩酸グアニジン処理・超遠心によりＤＮＡ−ＴＰＣを分
離・回収する。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ
−ＴＰＣを次のステップの組換えアデノウイルス作製の
ため充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで処理する。

【００２８】 最後のステップとして、リコンビナー
ゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドとＥｃｏ
Ｔ２２Ｉで処理したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣを混
合し、セルフェクト（ファルマシア社製）キットを用い
てリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。
ウイルスの増殖のため細胞が死滅したものからウイルス
液を回収しプロモーター、リコンビナーゼ遺伝子および
ポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを得
る。

【００２９】（２）次に、二つのリコンビナーゼ認識配
列並びにその間に動物細胞で働く複製起点、プロモータ
ー、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノ
ウイルスベクターの製造方法について述べる。便宜上、
プロモーターおよびポリＡ配列としては前記のＣＡＧプ
ロモーターを、また複製起点としてＳＶ４０の複製起点
を使用する場合について述べる。

【００３０】（ａ）まず、目的の外来遺伝子を発現する
カセットコスミドを作製する。 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ
（Niwaら、Gene、108、193-200 (1990)) のクローン化
部位にＳｗａＩリンカーを挿入することにより得たｐＣ
ＡＷＧをＳｗａＩで切断し、アルカリホスファターゼで
処理する。ついで目的の外来遺伝子とｐＣＡＷＧを混合
し、リガーゼで処理し、大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３
８４９）を形質転換し、ＣＡＧプロモーターの制御下に
発現し得る方向に外来遺伝子が挿入されたプラスミドを
得る。

【００３１】 次に、外来遺伝子の発現ユニット（Ｃ
ＡＧプロモーターの制御下に発現し得る方向に外来遺伝
子が挿入されたもの）とＳＶ４０の複製起点とを含むＤ
ＮＡ断片を作製する。で得られたプラスミドを制限酵
素ＳａｐＩおよびＳａｌＩで同時消化し、さらにＫｌｅ
ｎｏｗ酵素により両端を平滑化し、電気泳動により目的
のＤＮＡ断片を得る。これを、制限酵素ＳｍａＩで切断
したのちアルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１８
（宝酒造製）と混合し、リガーゼで処理して外来遺伝子
発現ユニットとＳＶ４０の複製起点を組み込んだプラス
ミドを得る。

【００３２】 次に発現ユニットとＳＶ４０の複製起
点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ配列を付加するた
め以下の操作を行う。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限
酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩで切断し、アルカリホスファター
ゼ処理をした後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部
位を有し、これが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるよう
に設計されているｌｏｘＰ配列を含む合成ＤＮＡ断片
（配列番号：３）とのリガーゼ反応に付し、この合成Ｄ
ＮＡ断片が二つ挿入されたプラスミドを得る。このプラ
スミドを、制限酵素ＮｒｕＩで切断し、アルカリホスフ
ァターゼで処理した後、で得られたプラスミドを制限
酵素ＳａｌＩおよびＥｃｌ１３６ＩＩで同時消化し、平
滑化して得られたＤＮＡ断片とリガーゼにより結合し
て、外来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点
を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を
含むプラスミドを得る。

【００３３】 次に、外来遺伝子発現ユニットおよび
ＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ
部位を有する断片を含む組換えコスミドを得るため以下
の操作を行う。まず、で得られたプラスミドを制限酵
素ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで同時消化し、両端をＫｌ
ｅｎｏｗ酵素で平滑化し、電気泳動により精製して、外
来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含む
ＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を用意す
る。一方、ｐＡｄｅｘ１ｃｗ（細胞工学、１３、７６０
−７６３（１９９４））を制限酵素ＳｗａＩで切断した
ものを用意する。これら両者を混合し、カセットコスミ
ドを沈澱させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合させ、外来
遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤ
ＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を組み込ん
だカセットコスミドを得る。

【００３４】（ｂ）二つのｌｏｘＰ配列およびその間に
複製起点、ＣＡＧプロモーター、外来遺伝子を有する断
片を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターの作製 さらに、上記（１）の〜と同様な操作を行うことに
より、ＳＶ４０の複製起点、目的の外来遺伝子発現ユニ
ットおよびその両端にｌｏｘＰ配列を有する本発明の組
換えアデノウイルスベクターを作製することができる。

【００３５】本発明の方法により上記のようにして得ら
れる、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリ
Ａ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクター
およびＳＶ４０の複製起点、目的の外来遺伝子発現ユニ
ットおよびその両端にｌｏｘＰ配列を有する本発明の組
換えアデノウイルスベクターの高力価ウイルス溶液は、
適宜希釈して局所注入（中枢神経系・門脈など）、経口
（腸溶剤を用いる）投与、経気道投与、経皮投与等の投
与方法により共感染させ、遺伝病を含む各種疾患の治療
に用いることができる。

【００３６】

【実施例】以下、実施例、参考例により本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。なお、実施例中のファー
ジ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞
などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら
編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laborat
ory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限
酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指
示書に従って使用した。

【００３７】実施例１ ＜リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびＣＡＧプロモータ
ーを有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞ （１）リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現用カセットコス
ミドの作製 リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む大腸菌ファージ
Ｐ１ＤＮＡ（ＡＴＣＣ１１３０３−Ｂ２３）をテンプレ
ートとし、５’−プライマーとして下記の（配列番号：
１）のオリゴヌクレオチドを、３’−プライマーとして
下記の（配列番号：２）のオリゴヌクレオチドを、耐熱
性ポリメラーゼとしてＮＥＢ社製のＶｅｎｔ^R を用い、
以下の条件でＰＣＲ反応を行い、生成物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約１ｋｂのバンドを切り出し、リコ
ンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。 5'-CGT CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3' PstI BspHI 3'-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5' Aor51HI;XbaI （下線部分は、制限酵素の認識部位である。）

【００３８】ＰＣＲ反応条件 緩衝液： １０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、
２ｍＭのＭｇＳＯ₄ 、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００（ＮＥＢ社添付の緩衝液を使用） 耐熱性ポリメラーゼ： ２ユニット ｄＮＴＰ： ４００μＭ プライマー： １μＭ Ｐ１ファージＤＮＡ： １ｎｇ ２本鎖解離温度： １．５分間 アニーリング温度： １．５分間 伸長反応温度： ２．０分間 反応サイクル： ２０回

【００３９】この断片およびｐＵＣ１９（宝酒造製）を
それぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製製）およびＸｂａ
Ｉ（宝酒造製）により同時消化したのち、回収し、モル
比が約３：１になるように混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造製）を用いてligation 反応を行った。さら
に、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣ
Ｃ５３３２３）を形質転換した。アンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換
株を拾い、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＵＣＣｒｅを得た。

【００４０】次に、細胞工学、１３、７６０〜７６３
（１９９４）に記載の方法により調製したＣＡＧプロモ
ーターを含むカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを
ＳｗａＩで切断したもの１μｇと、ｐＵＣＣｒｅをＰｓ
ｔＩおよびＸｂａＩにより同時消化し、さらにＫｌｅｎ
ｏｗ酵素（宝酒造製）により両端を平滑化して得た約１
ｋｂの断片０．１μｇとを混合した。ここに、ＣＡＧプ
ロモーターとは、高発現ベクターとして特開平３−１６
８０８７号公報に開示されているものであり、その調製
は、同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−
１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２
頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉｎｄ
III で切り出すことにより行うことができ、本発明に利
用することができる。

【００４１】 次に、混合液にエタノールを加えてコ
スミドを沈澱させた。沈澱物を遠心分離により取得し、
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴ
Ａを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。 得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中で
ＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量７μｌで
一晩結合させた。ついで滅菌水、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆ
ｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分でリガー
ゼを熱失活させた。この際、プラズミドと異なり、コス
ミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大
分子が効率よくパッケージされる。

【００４２】 ２μｌのＳｗａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ社製）を加え、２５℃で１時間切断した。ＳｗａＩ
切断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットを
くわえ込むことなく再結合するとＳｗａｌ認識配列が再
生されるため、このステップで発現ユニットの組み込ま
れていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくす
るためである。この方法はインサートをもつカセットコ
スミドだけを選択する強力な方法である。 常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、カ
セットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲ
ル濾過を行った。 再度、Ｓｗａｌ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応
ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２
時間切断した。その理由は上記の通りである。

【００４３】 得られたコスミドの１μｌについてイ
ン・ビトロ・パッケージングを行った。即ち、ラムダ・
イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバック
ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１／４スケールで
用い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４
２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでイン
サートが入って大きくなったコスミドをある程度選択す
ることができる。本実験では、１０個のコロニーを拾え
ば大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向
き）のクローンを容易に得ることができた。コスミドの
扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：
183-187, 1989)に従って行った。

【００４４】 パッケージングされたコスミドをＤＨ
１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。即ち、３枚の
Ａｐ⁺ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌのＡ
ｐ⁺ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／２
０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、全酵
素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。
コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡｐ⁺ ＬＢ
で、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。 次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと
構造を確認した。なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、
発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失
したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡ
クローン化の最終確認をした。

【００４５】（２）アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体
（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))を用いた。Ａｄ５ ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕ
ｘ １０本分）に感染させ、培養を行った。即ち、Ａｄ
５−ｄｌＸのウイルス液（〜１０⁹ ＰＦＵ／ｍｌ）を
０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細
胞を１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集めた。ア
デノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細
胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる
利点がある。（以下の操作は非無菌的に行った。）

【００４６】 得られた細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニ
ケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。ウイルス
を細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５
回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利
である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）
を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネッ
トの中でも危険性がある。

【００４７】 得られた破砕物を遠心分離（１０ｋｒ
ｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機 ＳＷ
２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．
４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心
（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス
層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時に
もう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たし
た。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけ
た。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配
ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐ
ｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。

【００４８】 白いウイルスのバンドを分取し、等量
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウ
ムプロミドは後で除く方法が確立されていないため利用
できなかった。

【００４９】 上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣの量をＯＤ₂₆₀ から通常のＤＮＡと同様に算出し
た。 得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ス
テップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＥ
ｃｏＴ２２Ｉで２時間切断した後、−８０℃に保存し
た。

【００５０】なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシ
ウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。
１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ
−ＴＰＣを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＥｃｏＴ２２
Ｉ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠
心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存し
た。

【００５１】（３）組換えウイルスの分離と高力価ウイ
ルス液の作製 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ ＤＮＡ
の８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉ
で切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混
合し、セルフェクト（ファルマシア社製）キットを用い
て、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトラン
スフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウム
の上から混合液を滴下し、培養を続けた。一晩培養（約
１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラー
ゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希
釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり
０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく
違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２
９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。

【００５２】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られ
た上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃
に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエルは複
数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。

【００５３】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０⁷ 〜１０⁸
ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細
胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけ
を−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイ
ルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞
の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌの
cell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10
mMEDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μ
ｌの10%SDSを加えた。

【００５４】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノム
の左端までのバンドが正確に出現しているものを選択し
た。また、説明できないバンドが薄く見えるクローン
は、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃
棄した。アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，００
０コピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡ
を抽出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドを
みることができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣ
Ｇを含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パター
ンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染
２９３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であ
った。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現し
た）。

【００５５】 Ｘｈｏｌ切断で同定された目的のウイ
ルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコ
ートした１５０ｃｍ² ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９
３細胞へ感染させた。３日後に細胞が死滅したら、死細
胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２
００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイル
スを遊離させた。３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して
沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３
本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存
し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発
明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０⁹ ＰＦ
Ｕ／ｍｌ程度の高力価のものであった。なお、３次ウイ
ルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに
感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを
上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親
ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイ
ルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルス
が増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての
３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めて
やり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法によ
り、目的のウイルスを純化した。

【００５６】参考例 ＜本発明の組換えアデノウイルスの簡便力価測定法＞本
発明の組換えアデノウイルスは、以下の方法により、簡
便に測定することができる。 ２９３細胞を１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。組
換えアデノウイルス液（３次ウイルス液）を５％ＦＣＳ
添加ＤＭＥを用いて１０^-1〜１０^-4まで段階希釈する。
例えば０．９ｍｌＤＭＥ＋０．１ｍｌウイルス液。チッ
プをすべて替える。 コラーゲンコート９６穴各１枚のすべてのウエルに
５０μｌずつ５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを入れる。第１列目
に、１０^-4に希釈した組換えウイルスを２５μｌずつ加
える。８ウエル用マルチチャンネルピペットを用いて２
５μｌを２列目のウエルに移す。以下同じ操作を１１列
目まで繰り返し最後の２５μｌを捨てる。結果として３
ⁿ の段階希釈列を３¹¹×１０^-4まで作製することができ
る。１２列目は非感染細胞のコントロールとする。この
時用いるチップはその度に替える。

【００５７】実施例２ ＜二つのｌｏｘＰ配列、並びにその間にＳＶ４０の複製
起点、ＣＡＧプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルス表
面抗原（ＨＢｓ）を有する組換えアデノウイルスベクタ
ーの作製＞ （１）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）発現用カセ
ットコスミドの作製 ＨＢｓ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＨＢＶａｄｒ
４（Fujiyama et. al., Nucleic Acids Res., 11,4601-
4610,1983)を制限酵素Ｐｓｐ１４０６ＩおよびＸｈｏＩ
で同時消化した後、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端
を平滑化し、アガロースゲル電気泳動により７１０ｂｐ
の断片を回収した。

【００５８】 ＣＡＧプロモーターの制御下でＨＢｓ
ｃＤＮＡを発現させるための発現ユニットを得るために
以下の操作を行った。ＣＡＧプロモーターを含むプラス
ミドｐＣＡＧＧＳ(Niwa et. al. Gene、 Vol.108、 P193-
200) のクローン化部位にＳｗａＩリンカーを挿入する
ことにより得たｐＣＡＷＧをＳｗａＩで切断しアルカリ
ホスファターゼ処理を施した。次に、これとＩで得た断
片をモル比約１：３で混合しＴ４ＤＮＡリガーゼ反応を
行い、反応混液により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８
４９）を形質転換した。アンピシリンを添加したＬＢ寒
天プレートから形質転換体を拾い、ＣＡＧプロモーター
の制御下でＨＢｓｃＤＮＡが発現する方向に断片が挿入
されたプラスミドｐＣＡＧ・ＨＢｓを得た。

【００５９】 ＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４０の
複製起点を含むＤＮＡ断片を得るため、以下の操作を行
った。ｐＣＡＧ・ＨＢｓを制限酵素ＳａｐＩおよびＳａ
ｌＩで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端
を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により３．６
ｋｂの断片を回収した。制限酵素ＳｍａＩで切断した後
アルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１８（宝酒
造製）と３．６ｋｂ断片をモル比約１：３で混合しliga
tion反応を行い、目的とするプラスミドｐＵＣ１８ＣＡ
ＨＢｓＳを得た。

【００６０】 次にＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４
０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を
付加するため以下の操作を行った。ｐＵＣ１１９（宝酒
造製）を制限酵素Ｅｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホ
スファターゼ処理を施した後、末端にＭｌｕＩ部位およ
びＸｈｏＩ部位を有しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を
生じるように設計されているｌｏｘＰ配列を含む下記の
合成ＤＮＡ断片（配列番号：３）とのligation反応を行
い該合成ＤＮＡ断片が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬ
Ｌ２ｒを得た。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。） 上記ので得られたｐＵＣ１８ＣＡＨＢｓＳを制限酵素
ＳａｌＩおよびＥｃｌ１３６IIで同時消化し、さらにＫ
ｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化した後、アガロース
ゲル電気泳動により３．６ｋｂの断片を回収した。ｐＵ
ＬＬ２ｒを制限酵素ＮｒｕＩで切断しアルカリホスファ
ターゼ処理を施した後、３．６ｋｂ断片とのligation反
応を行い目的とするプラスミドｐＵＬＣＡ・ＨＢｓＳを
得た。

【００６１】 ＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４０の
複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有す
る断片を含む組換えコスミドを得るため次の両ＤＮＡを
調製した。 （ａ）ｐＵＬＣＡ・ＨＢｓＳを制限酵素ＳｍａＩおよび
ＥｃｏＲＩで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素によ
り両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により
回収した３．７ｋｂの断片０．３μｇ。 （ｂ）制限酵素ＳｗａＩで切断したｐＡｄｅｘｌｃｗ
（細胞工学、１３、７６０−７６３、（１９９４））１
μｇ。 両者を混合し、実施例１の（１）〜と全く同様の操
作により目的とする組換えコスミドを得た。さらに実施
例１の（２）〜（３）と同様な操作により、目的の、二
つのｌｏｘＰ配列、並びにその間にＳＶ４０の複製起
点、ＣＡＧプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルス表面
抗原（ＨＢｓ）を有する組換えアデノウイルスベクター
ＡｄｅｘｌＬＣＡＨＢｓＳＬを得た。

【００６２】実施例３（感染実験） ＣＯＳ−１細胞またはＣＶ−１細胞を、６ｃｍシャーレ
のほぼ底面を覆う程になるまで培養する。実施例１およ
び実施例２で得られたアデノウイルスベクターのそれぞ
れを、m.o.i.＝５で下記のプロトコールに従って１時間
吸着させた。３日後にハーベストしてサザン解析した。
即ち、組換えアデノウイルスベクターＡｄｅｘｌＬＣＡ
ＨＢｓＳＬは、約６．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位
を有し、また、リコンビナーゼＣｒｅによりｌｏｘＰ部
位で切断されると３．５ｋｂの環状分子となる。この環
状分子はＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を１箇所有するので、
感染後ハーベストしたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで処理し
て電位泳動にかけ、サザンブロットを行った。プローブ
は、ＨＢｓフラグメント（７１０ｂｐ）を用いた。その
結果を図１に示す。

【００６３】図１から明らかなように、実施例１および
実施例２で得られたアデノウイルスベクターの組み合わ
せで感染させた場合のみ、環状分子のＨｉｎｄＩＩＩ切
断により生じる３．５ｋｂの線状ＤＮＡが観察された
（レーン４およびレーン８）。また、実施例２で得られ
たアデノウイルスベクターとリコンビナーゼＣｒｅ遺伝
子を有しないアデノウイルスベクターとを感染させた場
合（レーン３およびレーン７）は、３．５ｋｂのバンド
は認められず、ＡｄｅｘｌＬＣＡＨＢｓＳＬからＨｉｎ
ｄＩＩＩによって切り出されて生ずる６．０ｋｂのバン
ドのみが認められる。

【００６４】さらに、レーン７とレーン８のバンドの濃
度の比較から、環状分子がＣＯＳ−１細胞内で約４０倍
に複製されたことが分かる。一方、レーン３とレーン４
のバンドの濃度がほぼ同程度であることから、ＣＶ−１
細胞内では、環状分子は複製されないことが分かる。こ
れは、ＳＶ４０由来の複製起点がＣＶ−１細胞内では働
かない事実と合致する。以上の結果は、実施例１および
実施例２で得られた本発明のアデノウイルスベクターの
組み合わせを用いて動物細胞に感染させることにより、
二つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分が細胞内
で切り出され、環状分子を形成し、かつ細胞内で自律複
製することを明らかに証拠づけるものである。

【００６５】なお、上記の感染実験は以下のように行う
のが便宜である。培地の血清がＦＣＳでない場合（例え
ばＣＳ）は、培養細胞を無血清の培地で２度を洗い培地
を除く。ウイルス液（無血清またはＦＣＳ添加の培地で
希釈）を、以下の操作中に細胞面が乾いてしまわない程
度に加える。９６穴で３０〜４０μｌ、２４穴で５０〜
７０μｌ、１０ｃｍシャーレで１００〜２００μｌくら
いであるが、ウイルス液を加える前の培地を意図的に少
し残しておき、ウイルス液を加えて、この程度の容量に
する方が実際的である。プレートを数回、シーソーのよ
うに数秒周期で振ることにより、ウイルス液を細胞にま
んべんなくいきわたらせる。この操作を２０分ごとに３
回行う。この間、細胞はＣＯ₂ インキュベートにおく。
３回目の操作が終わった後に（感染１時間後）、培養液
を通常量加えて、通常のように培養する。感染時間は通
常１時間、長くても２時間程度で充分である。

【００６６】

【発明の効果】本発明により、広範な動物細胞において
自律複製可能な形で外来遺伝子を動物細胞に導入するこ
とのできる組換えＤＮＡウイルスベクターを提供するこ
とができる。また、本発明はこの組換えＤＮＡウイルス
ベクターの簡易な製造方法を提供する。特に、本発明の
組換えアデノウイルスベクターは遺伝病の治療に有用で
ある。

【００６７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC 53

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG 38

【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各種の組換えアデノウイルスベクター
の組み合わせを用いてＣＯＳ−１細胞またはＣＶ−１細
胞に感染させた後回収されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで
処理し、電気泳動により分画し、サザンブロットで解析
した結果を示す図である。

【符号の説明】

Ｍ マーカー １ ＣＶ−１細胞に、培地のみを添加した対象区 ２ ＣＶ−１細胞に、Ｅ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域を欠失
させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベ
クターと実施例１で調製したリコンビナーゼＣｒｅ遺伝
子とＣＡＧプロモーターとを組み込んだ組換えアデノウ
イルスベクターとを感染させた区 ３ ＣＶ−１細胞に、Ａｄｅｘ１ＬＣＡＨＢｓＳＬ（実
施例２で調製したもの）とＥ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域を
欠失させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイル
スベクターとを感染させた区 ４ ＣＶ−１細胞に、Ａｄｅｘ１ＬＣＡＨＢｓＳＬ（実
施例２で調製したもの）と実施例１で調製したリコンビ
ナーゼＣｒｅ遺伝子とＣＡＧプロモーターとを組み込ん
だ組換えアデノウイルスベクターとを感染させた区 ５ ＣＯＳ−１細胞に、１と同様な処理を施した区 ６ ＣＯＳ−１細胞に、２と同様な処理を施した区 ７ ＣＯＳ−１細胞に、３と同様な処理を施した区 ８ ＣＯＳ−１細胞に、４と同様な処理を施した区

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子お
   よびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡ
   ウイルスベクター。
2. 【請求項２】 ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイル
   スベクターである請求項１記載の組換えＤＮＡウイルス
   ベクター。
3. 【請求項３】 リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
   ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である請求項
   ２記載のＤＮＡウイルスベクター。
4. 【請求項４】 二つのリコンビナーゼ認識配列並びにそ
   の間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺
   伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換え
   ＤＮＡウイルスベクター。
5. 【請求項５】 ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイル
   スベクターである請求項４記載の組換えＤＮＡウイルス
   ベクター。
6. 【請求項６】 動物細胞で働く複製起点、プロモータ
   ー、外来遺伝子およびポリＡ配列が上流からこの順に配
   向している請求項５記載の組換えＤＮＡウイルスベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 外来遺伝子、ポリＡ配列、動物細胞で働
   く複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配向
   している請求項５記載の組換えＤＮＡウイルスベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 リコンビナーゼ認識配列がリコンビナー
   ゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列である請求
   項４から請求項７のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ
   ウイルスベクター。
9. 【請求項９】 動物細胞で働く複製起点がウイルス由来
   又は動物細胞由来のものである請求項４から請求項８の
   いずれか１項に記載の組換えＤＮＡウイルスベクター。
10. 【請求項１０】 動物細胞で働く複製起点がパポバウイ
    ルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウ
    イルス、及びパルボウイルス由来のものからなる群より
    選ばれるものである請求項９記載の組換えＤＮＡウイル
    スベクター。
11. 【請求項１１】 プロモーターおよびポリＡが、サイト
    メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプ
    ロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセ
    プターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモー
    ター（ＣＡＧプロモーター）である請求項１〜請求項１
    ０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡウイルスベクタ
    ー。
12. 【請求項１２】 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子
    およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮ
    Ａウイルスベクター、並びに二つのリコンビナーゼ認識
    配列及びその間に動物細胞で働く複製起点、プロモータ
    ー、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染
    用の組換えＤＮＡウイルスベクターを動物細胞に感染さ
    せ、二つのリコンビナーゼ認識配列間に存する動物細胞
    で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリ
    Ａ配列を環状分子として切り出し、細胞内で自律複製さ
    せることによる外来遺伝子の細胞内導入法。
13. 【請求項１３】 ＤＮＡウイルスベクターがいずれもア
    デノウイルスベクターである請求項１２に記載の外来遺
    伝子の細胞内導入法。
14. 【請求項１４】 遺伝子治療に際して、請求項１２又は
    １３記載の細胞内導入法を用いることを特徴とするヒト
    遺伝子の細胞内導入法。